JP2021516953A - 合成ｄｎａベクターおよびその使用 - Google Patents

合成ｄｎａベクターおよびその使用 Download PDF

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Abstract

異種遺伝子を含む単離されたDNAベクターであって、インビボでの持続性を抑止し得る細菌プラスミドDNAおよび／または細菌シグネチャーを欠いている該DNAベクターが、本明細書において提供される。本発明はまた、対象における異種遺伝子の長期的なエピソーム発現の誘導に使用することができる、本発明のDNAベクターを含む薬学的組成物（非免疫原性薬学的組成物）を特徴とする。本発明は、標的遺伝子の欠陥に関連する障害を処置する方法を含む、本発明のDNAベクターを投与することによって対象を処置する方法を伴う。

Description

配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、全体として参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。2019年3月13日に作成された該ASCIIコピーは、51219-012WO4_Sequence_Listing_03.13.19_ST25と命名され、18,483バイトの大きさである。
発明の分野
一般に、本発明は合成DNAベクターを特徴とする。
背景
遺伝子治療は、対象における障害の根底にある遺伝的欠陥を修正するために異種遺伝子を標的細胞に形質導入することを伴う。過去数十年にわたり、遺伝子治療に使用するために種々の形質導入アプローチが開発されてきた。例えば、従来の細菌プラスミドDNAベクターは、遺伝子送達における汎用性の高いツールであるが、細菌由来のために限界を示し得る。プラスミドDNAベクターは、抗生物質耐性遺伝子および複製開始点などの細菌遺伝子を含む。さらに、プラスミドDNAベクターは、CpGモチーフなどの細菌シグネチャーを含む。加えて、プラスミドDNAベクターを生成するための細菌発現系の使用は、エンドトキシンまたは細菌ゲノムDNAおよびRNAなどの、細菌宿主からの混入不純物を導入するリスクを伴い、これは、例えば転写サイレンシングによって、インビボでの遺伝子発現の喪失につながる可能性がある。
組換えアデノ随伴ウイルス (rAAV) ベクターは、種々のモデル系において高効率遺伝子導入の実績が確立されており、現在、幅広いヒト疾患の治療様式として試験が行われている。rAAVベクターのゲノムは、インビボで（例えば、分裂後の細胞内で）環状エピソームとして持続し得る。感染後、一本鎖rAAV DNAは、細胞核内で二本鎖環状DNAに変換され、細胞の寿命の間エピソーム形態で持続する。このように、AAVベクター系の実質的な利点は、標的細胞内で長期間持続する能力である。一方、AAVベクターは、約4.5 Kbの限られたパッケージング容量、ウイルスタンパク質の免疫原性、および製造の難しさなどの付加的な欠点を伴い得る。
したがって、大きなペイロードを可能にし、かつ有害作用（例えば、炎症）のリスクを減らしながら、rAAVによって提供されるような遺伝子発現の長期持続性を高めるための汎用的でかつ効率的な方法が、当技術分野において必要である。
概要
本発明の1つの局面において、rAAVベクターのインビボ持続性を再現する非ウイルス性の単離された環状DNAベクターが提供される。本明細書において提供されるDNAベクターは、非免疫原性であり、約4.5 KbのAAVパッケージング容量に制限されない。本発明はまた、（例えば、インビトロで、細菌発現系の非存在下で）環状DNAベクターを生成する方法、環状DNAベクターを含む薬学的組成物、ならびに、例えば、異種遺伝子の持続的なエピソーム発現を誘導するため、および欠陥遺伝子に関連する疾患を処置するために、本明細書に記載されるベクターを使用する方法を特徴とする。
1つの局面において、本発明は、1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、複製開始点（例えば、細菌の複製開始点）および／または薬物耐性遺伝子（例えば、細菌プラスミドの一部として）を欠いているDNAベクターを提供する。例えば、1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターは、複製開始点（例えば、細菌の複製開始点）を欠いてもよい。付加的にまたは代替的に、1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターは、薬物耐性遺伝子（例えば、細菌プラスミドの一部として）を欠いてもよい。いくつかの態様において、1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターは、複製開始点（例えば、細菌の複製開始点）および薬物耐性遺伝子（例えば、細菌プラスミドの一部として）を欠いてもよい。いくつかの態様において、DNA分子は細菌プラスミドDNAを欠いている。いくつかの態様において、DNAベクターは、免疫原性細菌シグネチャー（例えば、1つまたは複数の細菌関連CpGモチーフ、例えば、非メチル化CpGモチーフ、例えば、CpGアイランド）を欠いている。いくつかの態様において、DNAベクターは、RNAポリメラーゼ停止部位（例えば、RNAポリメラーゼII (RNAPII) 停止部位）を欠いている。
いくつかの態様において、単離された環状DNAベクターは、メンデル遺伝性網膜ジストロフィー（例えば、レーバー先天性黒内障 (LCA)、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、ならびにワグナー症候群）を処置するように構成された治療用タンパク質をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含む。例えば、1つまたは複数の異種遺伝子は、ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A、およびHMCN1であってよい。
別の局面において、本発明は、ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A、およびHMCN1からなる群より選択される1つまたは複数の異種遺伝子を有する単離された環状DNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いているDNAベクターを提供する。いくつかの態様において、1つまたは複数の異種遺伝子は、網膜ジストロフィー（例えば、メンデル遺伝性網膜ジストロフィー、例えば、LCA、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、ならびにワグナー症候群からなる群より選択される網膜ジストロフィー）を処置するように構成された治療用タンパク質をコードする。
別の局面では、治療用タンパク質（例えば、抗体もしくはその一部、増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、抗アポトーシス因子、サイトカイン、または抗糖尿病因子）をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を有する単離された環状DNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いているDNAベクターが、本明細書において提供される。
別の局面において、本発明は、トランススプライシング分子を含む1つまたは複数の異種遺伝子を有する単離された環状DNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いているDNAベクターを提供する。
別の局面において、本発明は、肝臓から分泌される治療用タンパク質をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いているDNAベクターを提供する。いくつかの態様において、治療用タンパク質は血液中に分泌される。
別の局面において、本発明は、1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、(a) 末端反復配列を含み；かつ (b) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いているDNAベクターを提供する。
さらに別の局面において、本発明は、複数の同一アンプリコンを有する単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が、治療用タンパク質（例えば、網膜ジストロフィー、例えば、メンデル遺伝性網膜ジストロフィーを処置するように構成された治療用タンパク質）をコードする異種遺伝子を含み、該DNA分子が、(a) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子；ならびに (b) 組換え部位を欠いている、DNA分子を提供する。いくつかの態様において、網膜ジストロフィーは、LCA、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、網膜色素変性症、加齢黄斑変性 (AMD)、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、ならびにワグナー症候群からなる群より選択される。いくつかの態様において、1つまたは複数の異種遺伝子は、ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、C3、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A、およびHMCN1からなる群より選択される。
別の局面において、本発明は、複数の同一アンプリコンを有する単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が、ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、C3、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A、およびHMCN1からなる群より選択される異種遺伝子を含み、該DNA分子が、(a) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子；ならびに (b) 組換え部位を欠いている、DNA分子を提供する。いくつかの態様において、異種遺伝子は、網膜ジストロフィー（例えば、メンデル遺伝性網膜ジストロフィー、例えば、LCA、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、網膜色素変性症、AMD、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、またはワグナー症候群）を処置するように構成された治療用タンパク質をコードする。
別の局面では、複数の同一アンプリコンを有する単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が、抗体またはその一部、凝固因子、増殖因子、ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、抗アポトーシス因子、抗腫瘍因子、サイトカイン、および抗糖尿病因子をコードする異種遺伝子を含み、該DNA分子が、(a) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子；ならびに (b) 組換え部位を欠いている、DNA分子が、本明細書において提供される。
さらに別の局面において、本発明は、複数の同一アンプリコンを有する単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が、トランススプライシング分子を含む異種遺伝子を含み、該DNA分子が、(a) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子；ならびに (b) 組換え部位を欠いている、該DNA分子を特徴とする。
別の局面において、本発明は、複数の同一アンプリコンを有する単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が、肝臓から分泌される治療用タンパク質（例えば、血液中に分泌される治療用タンパク質）をコードする異種遺伝子を含み、該DNA分子が、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている、該DNA分子を提供する。
前述の局面のいずれかのいくつかの態様において、環状DNAベクターまたは線状DNA分子は、1つまたは複数の末端反復配列（例えば、1つまたは複数の逆位末端反復 (ITR) 配列（例えば、2つのITR配列）もしくはその一部（例えば、2つのAエレメント、Bエレメント、Cエレメント、もしくはDエレメント）、または長い末端反復 (LTR) 配列（例えば、2つのLTR配列））をさらに含む。いくつかの態様において、末端反復配列は、少なくとも10塩基対 (bp) 長（例えば、10 bp〜500 bp、12 bp〜400 bp、14 bp〜300 bp、16 bp〜250 bp、18 bp〜200 bp、20 bp〜180 bp、25 bp〜170 bp、30 bp〜160 bp、または50 bp〜150 bp、例えば、10 bp〜15 bp、15 bp〜20 bp、20 bp〜25 bp、25 bp〜30 bp、30 bp〜35 bp、35 bp〜40 bp、40 bp〜45 bp、45 bp〜50 bp、50 bp〜55 bp、55 bp〜60 bp、60 bp〜65 bp、65 bp〜70 bp、70 bp〜80 bp、80 bp〜90 bp、90 bp〜100 bp、100 bp〜150 bp、150 bp〜200 bp、200 bp〜300 bp、300 bp〜400 bp、または400 bp〜500 bp、例えば、10 bp、11 bp、12 bp、13 bp、14 bp、15 bp、16 bp、17 bp、18 bp、19 bp、20 bp、21 bp、22 bp、23 bp、24 bp、25 bp、26 bp、27 bp、28 bp、29 bp、30 bp、31 bp、32 bp、33 bp、34 bp、35 bp、36 bp、37 bp、38 bp、39 bp、40 bp、41 bp、42 bp、43 bp、44 bp、45 bp、46 bp、47 bp、48 bp、49 bp、50 bp、51 bp、52 bp、53 bp、54 bp、55 bp、56 bp、57 bp、58 bp、59 bp、60 bp、61 bp、62 bp、63 bp、64 bp、65 bp、66 bp、67 bp、68 bp、69 bp、70 bp、71 bp、72 bp、73 bp、74 bp、75 bp、76 bp、77 bp、78 bp、79 bp、80 bp、81 bp、82 bp、83 bp、84 bp、85 bp、86 bp、87 bp、88 bp、89 bp、90 bp、91 bp、92 bp、93 bp、94 bp、95 bp、96 bp、97 bp、98 bp、99 bp、100 bp、101 bp、102 bp、103 bp、104 bp、105 bp、106 bp、107 bp、108 bp、109 bp、110 bp、111 bp、112 bp、113 bp、114 bp、115 bp、116 bp、117 bp、118 bp、119 bp、120 bp、121 bp、122 bp、123 bp、124 bp、125 bp、126 bp、127 bp、128 bp、129 bp、130 bp、131 bp、132 bp、133 bp、134 bp、135 bp、136 bp、137 bp、138 bp、139 bp、140 bp、141 bp、142 bp、143 bp、144 bp、145 bp、146 bp、147 bp、148 bp、149 bp、150 bp、またはそれ以上）である。いくつかの態様において、DNAベクターはDDエレメントを含む。
別の局面において、本発明は、複数の同一アンプリコンを含む単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が異種遺伝子を含み、該DNA分子が、(a) 末端反復配列（例えば、前述の末端反復配列のいずれか）を含み；かつ (b) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている、該DNA分子を特徴とする。
いくつかの態様において、環状DNAベクターは異種遺伝子(例えば、1つまたは複数の異種遺伝子)をさらに含む。いくつかの態様において、1つまたは複数の異種遺伝子は、4.5 Kb長を上回る（例えば、1つまたは複数の異種遺伝子は、一緒にまたはそれぞれ単独で、4.5 Kb〜25 Kb、4.6 Kb〜24 Kb、4.7 Kb〜23 Kb、4.8 Kb〜22 Kb、4.9 Kb〜21 Kb、5.0 Kb〜20 Kb、5.5 Kb〜18 Kb、6.0 Kb〜17 Kb、6.5 Kb〜16 Kb、7.0 Kb〜15 Kb、7.5 Kb〜14 Kb、8.0 Kb〜13 Kb、8.5 Kb〜12.5 Kb、9.0 Kb〜12.0 Kb、9.5 Kb〜11.5 Kb、または10.0 Kb〜11.0 Kb長、例えば、4.5 Kb〜8 Kb、8 Kb〜10 Kb、10 Kb〜15 Kb、15 Kb〜20 Kb長、またはそれ以上、例えば、4.5 Kb〜5.0 Kb、5.0 Kb〜5.5 Kb、5.5 Kb〜6.0 Kb、6.0 Kb〜6.5 Kb、6.5 Kb〜7.0 Kb、7.0 Kb〜7.5 Kb、7.5 Kb〜8.0 Kb、8.0 Kb〜8.5 Kb、8.5 Kb〜9.0 Kb、9.0 Kb〜9.5 Kb、9.5 Kb〜10 Kb、10 Kb〜10.5 Kb、10.5 Kb〜11 Kb、11 Kb〜11.5 Kb、11.5 Kb〜12 Kb、12 Kb〜12.5 Kb、12.5 Kb〜13 Kb、13 Kb〜13.5 Kb、13.5 Kb〜14 Kb、14 Kb〜14.5 Kb、14.5 Kb〜15 Kb、15 Kb〜15.5 Kb、15.5 Kb〜16 Kb、16 Kb〜16.5 Kb、16.5 Kb〜17 Kb、17 Kb〜17.5 Kb、17.5 Kb〜18 Kb、18 Kb〜18.5 Kb、18.5 Kb〜19 Kb、19 Kb〜19.5 Kb、19.5 Kb〜20 Kb、20 Kb〜21 Kb、21 Kb〜22 Kb、22 Kb〜23 Kb、23 Kb〜24 Kb、24 Kb〜25 Kb長、またはそれ以上、例えば、約4.5 Kb、約5.0 Kb、約5.5 Kb、約6.0 Kb、約6.5 Kb、約7.0 Kb、約7.5 Kb、約8.0 Kb、約8.5 Kb、約9.0 Kb、約9.5 Kb、約10 Kb、約11 Kb、約12 Kb、約13 Kb、約14 Kb、約15 Kb、約16 Kb、約17 Kb、約18 Kb、約19 Kb、約20 Kb長、またはそれ以上である）。
2つまたはそれ以上の異種遺伝子を有する環状DNAベクターの態様において、異種遺伝子は、同じ遺伝子であってもよいし、または異なる遺伝子であってもよい（例えば、それらは、機能的に（例えば、シグナル伝達経路の一部として）または構造的に（例えば、二量体化を介して、例えば、抗体もしくはその断片の重鎖および軽鎖）相互作用するペプチドをコードしてもよい）。
いくつかの態様において、環状DNAベクターの異種遺伝子は、1つまたは複数のトランススプライシング分子を含む。
いくつかの態様において、環状DNAベクターは、単量体環状ベクター、二量体環状ベクター、三量体環状ベクター、等である。いくつかの態様において、DNAベクターは単量体環状ベクターである。いくつかの態様において、環状DNAベクター（例えば、単量体環状ベクター）は二本鎖である。いくつかの態様において、環状DNAベクターはスーパーコイル状（例えば、単量体スーパーコイル状）である。
いくつかの態様において、環状DNAベクターは、1つまたは複数の異種遺伝子の上流にプロモーター配列を含む。付加的にまたは代替的に、環状DNAベクターは、1つまたは複数の異種遺伝子の下流にポリアデニル化部位を含み得る。したがって、いくつかの態様において、環状DNAベクターは、5'側から3'側へまたは3'側から5'側へ機能的に連結された以下のエレメント：(i) プロモーター配列；(ii) 1つまたは複数の異種遺伝子；(iii) ポリアデニル化部位；および (iv) 末端反復配列（例えば、1つまたは複数の末端反復配列（例えば、1つまたは複数の逆位末端反復 (ITR) 配列（例えば、2つのITR配列）または長い末端反復 (LTR) 配列（例えば、2つのLTR配列）））を含む。
別の局面において、本発明は、単離された環状DNAベクター（例えば、本明細書に記載される環状DNAベクターのいずれか）を生成する方法を特徴とする。本方法は、(i) 異種遺伝子および末端反復配列（例えば、1つまたは複数の末端反復配列（例えば、1つまたは複数の逆位末端反復 (ITR) 配列（例えば、2つのITR配列）または長い末端反復 (LTR) 配列（例えば、2つのLTR配列）））を含むAAVゲノム（例えば、組換えAAV (rAAV) ゲノム、例えば、AAVエピソーム）を含む環状DNA分子を含む試料を提供する段階、(ii) ポリメラーゼ（例えば、ファージポリメラーゼ）媒介性ローリングサークル増幅（例えば、等温ポリメラーゼ（例えば、ファージポリメラーゼ）媒介性ローリングサークル増幅）を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；(iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、AAVゲノムを作製する段階；ならびに (iv) AAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子および末端反復配列を含む単離されたDNAベクターを生成する段階を含む。いくつかの態様において、本方法は、単離されたDNAベクターをカラム精製して、単離されたDNAベクターからスーパーコイルDNAを精製する段階をさらに含む。スーパーコイルDNAは、単量体スーパーコイルDNAであってよい。いくつかの態様において、弛緩型開環状DNAは、カラム精製においてスーパーコイルDNAから分離され、廃棄され得る。いくつかの態様において、異種遺伝子は、任意のこれまでの局面において記載された異種遺伝子のいずれか、例えば、網膜ジストロフィー（例えば、メンデル遺伝性網膜ジストロフィー、LCA、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、網膜色素変性症、加齢黄斑変性 (AMD)、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、ならびにワグナー症候群からなる群より選択される網膜ジストロフィー）を処置するように構成された治療用タンパク質をコードする異種遺伝子；以下のうちの1つもしくは複数を含む異種遺伝子：ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、C3、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A、およびHMCN1；抗体もしくはその一部、凝固因子、増殖因子、ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、抗アポトーシス因子、抗腫瘍因子、サイトカイン、および抗糖尿病因子をコードする異種遺伝子；ならびに／またはトランススプライシング分子である異種遺伝子である。
ポリメラーゼは、好熱性ポリメラーゼ、またはGCリッチな残基（例えば、参照ポリメラーゼと比較して）による高い処理能力を有するポリメラーゼであってよい。いくつかの態様において、ポリメラーゼはファージポリメラーゼである。いくつかの態様において、ファージポリメラーゼはPhi29 DNAポリメラーゼである。
別の局面において、本発明は、以下の段階を含む、単離された環状DNAベクターを生成する方法を提供する：(i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノム（例えば、AAVエピソーム）を含む環状DNA分子を含む試料を提供する段階；(ii) 第1のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅（例えば、等温ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅）を用いてAAVゲノムを増幅して、第1の線状コンカテマーを作製する段階；(iii) 制限酵素を用いて第1の線状コンカテマーを消化して、第1のAAVゲノムを作製する段階；(iv) 第1のAAVゲノムをプラスミドベクターにクローニングする段階；(v) 末端反復配列（例えば、1つまたは複数の末端反復配列（例えば、1つまたは複数の逆位末端反復 (ITR) 配列（例えば、2つのITR配列）または長い末端反復 (LTR) 配列（例えば、2つのLTR配列）））を含むプラスミドクローンを同定する段階；(vi) 末端反復配列を含むプラスミドクローンを消化して、第2のAAVゲノムを作製する段階；(vii) 第2のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、環状DNA鋳型を生成する段階；(viii) 第2のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅（例えば、等温ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅）を用いて環状DNA鋳型を増幅して、第2の線状コンカテマーを作製する段階；(ix) 制限酵素を用いて第2の線状コンカテマーを消化して、第3のAAVゲノムを作製する段階；ならびに (x) 第3のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子および末端反復配列を含む単離されたDNAベクターを生成する段階。いくつかの態様において、環状DNAベクターを生成する方法において使用されるポリメラーゼは、ファージポリメラーゼ（例えば、Phi29 DNAポリメラーゼ）である。
別の局面において、本発明は、以下の段階を含む、治療用環状DNAベクターを生成するインビトロ方法を特徴とする：(i) 異種遺伝子および末端反復配列（例えば、1つまたは複数の末端反復配列（例えば、1つまたは複数の逆位末端反復 (ITR) 配列（例えば、2つのITR配列）または長い末端反復 (LTR) 配列（例えば、2つのLTR配列）））を含むAAVゲノム（例えば、組換えAAV (rAAV) ゲノム、例えば、AAVエピソーム）を含む環状DNA分子を含む試料を提供する段階；(ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅（例えば、等温ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅）を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；(iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、AAVゲノムを作製する段階；ならびに (iv) AAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子および末端反復配列を含む単離された環状DNAベクターを生成する段階。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、ファージポリメラーゼ（例えば、Phi29 DNAポリメラーゼ）である。いくつかの態様において、本方法は、単離されたDNAベクターをカラム精製して、単離されたDNAベクターからスーパーコイルDNAを精製する段階をさらに含む。スーパーコイルDNAは、単量体スーパーコイルDNAであってよい。いくつかの態様において、弛緩型開環状DNAは、カラム精製においてスーパーコイルDNAから分離され、廃棄され得る。
別の局面では、前述の環状DNAベクターのうちの任意の1つまたは複数、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、薬学的組成物は非免疫原性である（例えば、例えばCpGモチーフといった細菌シグネチャーなどの細菌成分を実質的に欠いている）。いくつかの態様において、薬学的組成物はウイルス粒子を実質的に欠いている。
別の局面において、本発明は、それを必要とする対象に前述の環状DNAベクターのいずれかおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物（例えば、非免疫原性薬学的組成物）を投与する段階を含む、該対象において異種遺伝子の発現（例えば、エピソーム発現）を誘導する方法を特徴とする。
さらに別の局面において、本発明は、本明細書に記載される環状DNAベクターおよび組成物（例えば、前述の局面の環状DNAベクターまたはその組成物のいずれか）を用いる処置の方法を特徴とする。本発明は、対象に前述の局面のいずれかの薬学的組成物の治療有効量を投与する段階を含む、該対象における障害（例えば、眼障害、例えば、網膜ジストロフィー、例えば、メンデル遺伝性網膜ジストロフィー）を処置する方法を含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は、反復して（例えば、1日に約2回、1日に約1回、1週間に約5回、1週間に約4回、1週間に約3回、1週間に約2回、1週間に約1回、1ヶ月に約2回、1ヶ月に約1回、6週間に約1回、2ヶ月に約1回、3ヶ月に約1回、4ヶ月に約1回、1年に約2回、1年に約1回、またはそれ未満の頻度で）投与される。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、局所的に（例えば、眼内に（例えば、硝子体内に）、肝内、脳内、筋肉内、エアロゾル化により、皮内、経皮、または皮下）投与される。いくつかの態様において、対象は、レーバー先天性黒内障 (LCA)、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、またはワグナー症候群の処置を受けている。
別の局面において、本発明は、細菌プラスミドDNAを欠いたDNA分子中に二重D (DD) エレメントを含むことによってrAAVベクターのインビボ持続性を再現する、非ウイルス性の単離されたDNAベクターを特徴とする。したがって、本明細書において提供されるDNAベクターは、非免疫原性であり、約4.5 KbのAAVパッケージング容量に制限されない。本発明はまた、DD含有DNAベクターを生成する方法、DD含有DNAベクターを含む薬学的組成物、ならびに、例えば、異種遺伝子のエピソーム発現を誘導するため、および欠陥遺伝子に関連する疾患を処置するために、本明細書に記載されるベクターを使用する方法を特徴とする。
1つの局面において、本発明は、DDエレメントを含む単離されたDNAベクターであって、複製開始点（例えば、細菌の複製開始点）および／または薬物耐性遺伝子（例えば、細菌プラスミドの一部として）を欠いているDNAベクターを提供する。例えば、DDエレメントを含む単離されたDNAベクターは、複製開始点（例えば、細菌の複製開始点）を欠いてもよい。付加的にまたは代替的に、DDエレメントを含む単離されたDNAベクターは、薬物耐性遺伝子（例えば、細菌プラスミドの一部として）を欠いてもよい。いくつかの態様において、DDエレメントを含む単離されたDNAベクターは、複製開始点（例えば、細菌の複製開始点）および薬物耐性遺伝子（例えば、細菌プラスミドの一部として）を欠いてもよい。いくつかの態様において、DNA分子は細菌プラスミドDNAを欠いている。いくつかの態様において、DNAベクターは、免疫原性細菌シグネチャー（例えば、1つまたは複数の細菌関連CpGモチーフ、例えば、非メチル化CpGモチーフ）を欠いている。いくつかの態様において、DNAベクターは、RNAポリメラーゼ停止部位（例えば、RNAポリメラーゼII (RNAPII) 停止部位）を欠いている。
別の局面において、本発明は、DDエレメントならびに細菌の複製開始点および／または薬物耐性遺伝子（例えば、細菌プラスミドの一部として）を含む単離されたDNAベクターを特徴とする。
これまでの局面のいずれかのいくつかの態様において、DNAベクターは異種遺伝子（例えば、1つまたは複数の異種遺伝子）をさらに含む。いくつかの態様において、1つまたは複数の異種遺伝子は、4.5 Kb長を上回る（例えば、1つまたは複数の異種遺伝子は、一緒にまたはそれぞれ単独で、4.5 Kb〜25 Kb、4.6 Kb〜24 Kb、4.7 Kb〜23 Kb、4.8 Kb〜22 Kb、4.9 Kb〜21 Kb、5.0 Kb〜20 Kb、5.5 Kb〜18 Kb、6.0 Kb〜17 Kb、6.5 Kb〜16 Kb、7.0 Kb〜15 Kb、7.5 Kb〜14 Kb、8.0 Kb〜13 Kb、8.5 Kb〜12.5 Kb、9.0 Kb〜12.0 Kb、9.5 Kb〜11.5 Kb、または10.0 Kb〜11.0 Kb長、例えば、4.5 Kb〜8 Kb、8 Kb〜10 Kb、10 Kb〜15 Kb、15 Kb〜20 Kb長、またはそれ以上、例えば、4.5 Kb〜5.0 Kb、5.0 Kb〜5.5 Kb、5.5 Kb〜6.0 Kb、6.0 Kb〜6.5 Kb、6.5 Kb〜7.0 Kb、7.0 Kb〜7.5 Kb、7.5 Kb〜8.0 Kb、8.0 Kb〜8.5 Kb、8.5 Kb〜9.0 Kb、9.0 Kb〜9.5 Kb、9.5 Kb〜10 Kb、10 Kb〜10.5 Kb、10.5 Kb〜11 Kb、11 Kb〜11.5 Kb、11.5 Kb〜12 Kb、12 Kb〜12.5 Kb、12.5 Kb〜13 Kb、13 Kb〜13.5 Kb、13.5 Kb〜14 Kb、14 Kb〜14.5 Kb、14.5 Kb〜15 Kb、15 Kb〜15.5 Kb、15.5 Kb〜16 Kb、16 Kb〜16.5 Kb、16.5 Kb〜17 Kb、17 Kb〜17.5 Kb、17.5 Kb〜18 Kb、18 Kb〜18.5 Kb、18.5 Kb〜19 Kb、19 Kb〜19.5 Kb、19.5 Kb〜20 Kb、20 Kb〜21 Kb、21 Kb〜22 Kb、22 Kb〜23 Kb、23 Kb〜24 Kb、24 Kb〜25 Kb長、またはそれ以上、例えば、約4.5 Kb、約5.0 Kb、約5.5 Kb、約6.0 Kb、約6.5 Kb、約7.0 Kb、約7.5 Kb、約8.0 Kb、約8.5 Kb、約9.0 Kb、約9.5 Kb、約10 Kb、約11 Kb、約12 Kb、約13 Kb、約14 Kb、約15 Kb、約16 Kb、約17 Kb、約18 Kb、約19 Kb、約20 Kb長、またはそれ以上である）。
2つまたはそれ以上の異種遺伝子を有する態様において、異種遺伝子は、同じ遺伝子であってもよいし、または異なる遺伝子であってもよい（例えば、それらは、機能的に（例えば、シグナル伝達経路の一部として）または構造的に（例えば、二量体化を介して、例えば、抗体もしくはその断片の重鎖および軽鎖）相互作用するペプチドをコードしてもよい）。
いくつかの態様において、異種遺伝子は、1つまたは複数のトランススプライシング分子を含む。
いくつかの態様において、DNAベクターは、環状ベクター（例えば、単量体環状ベクター、二量体環状ベクター、三量体環状ベクター、等）である。いくつかの態様において、DNAベクターは単量体環状ベクターである。
いくつかの態様において、DNAベクターは、1つまたは複数の異種遺伝子の上流にプロモーター配列を含む。付加的にまたは代替的に、DNAベクターは、1つまたは複数の異種遺伝子の下流にポリアデニル化部位を含み得る。したがって、いくつかの態様において、DNAベクターは、5'側から3'側へまたは3'側から5'側へ機能的に連結された以下のエレメント：(i) プロモーター配列；(ii) 1つまたは複数の異種遺伝子；(iii) ポリアデニル化部位；および (iv) DDエレメントを含む。
別の局面において、本発明は、以下の段階を含む、単離されたDNAベクター（例えば、本明細書に記載されるDNAベクターのいずれか）を生成する方法を特徴とする：(i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノム（例えば、組換えAAV (rAAV) ゲノム、例えば、AAVエピソーム）を含む環状DNA分子を含む試料を提供する段階；(ii) ポリメラーゼ（例えば、ファージポリメラーゼ）媒介性ローリングサークル増幅（例えば、等温ポリメラーゼ（例えば、ファージポリメラーゼ）媒介性ローリングサークル増幅）を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；(iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、AAVゲノムを作製する段階；ならびに (iv) AAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子およびDDエレメントを含む単離されたDNAベクターを生成する段階。ポリメラーゼは、好熱性ポリメラーゼ、またはGCリッチな残基（例えば、参照ポリメラーゼと比較して）による高い処理能力を有するポリメラーゼであってよい。いくつかの態様において、ポリメラーゼはファージポリメラーゼである。いくつかの態様において、ファージポリメラーゼはPhi29 DNAポリメラーゼである。
別の局面において、本発明は、以下の段階を含む、単離されたDNAベクターを生成する方法を提供する：(i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノム（例えば、AAVエピソーム）を含む環状DNA分子を含む試料を提供する段階；(ii) 第1のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅（例えば、等温ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅）を用いてAAVゲノムを増幅して、第1の線状コンカテマーを作製する段階；(iii) 制限酵素を用いて第1の線状コンカテマーを消化して、第1のAAVゲノムを作製する段階；(iv) 第1のAAVゲノムをプラスミドベクターにクローニングする段階；(v) DDエレメントを含むプラスミドクローンを同定する段階；(vi) DDエレメントを含むプラスミドクローンを消化して、第2のAAVゲノムを作製する段階；(vii) 第2のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、環状DNA鋳型を生成する段階；(viii) 第2のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅（例えば、等温ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅）を用いて環状DNA鋳型を増幅して、第2の線状コンカテマーを作製する段階；(ix) 制限酵素を用いて第2の線状コンカテマーを消化して、第3のAAVゲノムを作製する段階；ならびに (x) 第3のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子およびDDエレメントを含む単離されたDNAベクターを生成する段階。いくつかの態様において、ポリメラーゼはファージポリメラーゼ（例えば、Phi29 DNAポリメラーゼ）である。
別の局面において、本発明は、以下の段階を含む、治療用DNAベクターを生成するインビトロ方法を特徴とする：(i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノム（例えば、組換えAAV (rAAV) ゲノム、例えば、AAVエピソーム）を含む環状DNA分子を含む試料を提供する段階；(ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅（例えば、等温ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅）を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；(iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、AAVゲノムを作製する段階；ならびに (iv) AAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子およびDDエレメントを含む単離されたDNAベクターを生成する段階。いくつかの態様において、ポリメラーゼはファージポリメラーゼ（例えば、Phi29 DNAポリメラーゼ）である。
別の局面では、前述の局面のいずれかのDNAベクターおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、薬学的組成物は非免疫原性である（例えば、例えばCpGモチーフといった細菌シグネチャーなどの免疫原性成分を実質的に欠いている）。いくつかの態様において、薬学的組成物はウイルス粒子を実質的に欠いている。
別の局面において、本発明は、それを必要とする対象に前述の局面のいずれかのDNAベクターおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物（例えば、非免疫原性薬学的組成物）を投与する段階を含む、該対象において異種遺伝子の発現（例えば、エピソーム発現）を誘導する方法を特徴とする。いくつかの態様において、発現は対象の肝臓内で誘導される。肝臓は、異種遺伝子によってコードされる治療用タンパク質を（例えば、血液中に）分泌し得る。
さらに別の局面において、本発明は、本明細書に記載されるDNAベクターおよび組成物（例えば、前述の局面のベクターまたは組成物のいずれか）を用いる処置の方法を特徴とする。本発明は、対象に前述の局面のいずれかの薬学的組成物の治療有効量を投与する段階を含む、該対象における障害（例えば、眼障害、例えば、網膜ジストロフィー、例えば、メンデル遺伝性網膜ジストロフィー）を処置する方法を含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は、反復して（例えば、1日に約2回、1日に約1回、1週間に約5回、1週間に約4回、1週間に約3回、1週間に約2回、1週間に約1回、1ヶ月に約2回、1ヶ月に約1回、6週間に約1回、2ヶ月に約1回、3ヶ月に約1回、4ヶ月に約1回、1年に約2回、1年に約1回、またはそれ未満の頻度で）投与される。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、局所的に（例えば、眼内に（例えば、硝子体内に）、肝内、脳内、筋肉内、エアロゾル化により、皮内、経皮、または皮下）投与される。他の態様において、薬学的組成物は、全身に（例えば、静脈内に）投与される。いくつかの態様において、対象は、レーバー先天性黒内障 (LCA)、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、またはワグナー症候群の処置を受けている
図1は、AAV2の末端反復配列（この場合、二重D (DD) エレメント）の形成を示す模式図である。AAV2逆位末端反復配列 (ITR) は145-bp長であり、AAVゲノムの各末端に位置している。ITRは、塩基対合しヘアピン様構造を形成し得る逆位配列（A、B、C、およびDと称される）を含む。単一のITRは、2つの「A」、「B」、および「C」領域、ならびに単一の「D」領域を含む。2つのITRは、組換えによってDDエレメントを形成することができ、DDエレメントは165 bp長であり、単一のITRと類似しているが、今度は2つの「D」領域を含む。 図2A〜2Iは、様々なAAV血清型の例示的なITR配列を示す一連の図解であり、ITR内のA、B、C、およびDエレメントの位置および配列を示している。図2Aは、AAV1 ITRの図解である。図2Bは、AAV2 ITRの図解である。図2Cは、AAV3 ITRの図解である。図2Dは、AAV4 ITRの図解である。図2Eは、AAV5 ITRの図解である。図2Fは、AAV6 ITRの図解である。図2Gは、AAV7 ITRの図解である。図2Hは、部分的AAV8 ITRの図解である。図2Iは、部分的AAV9 ITRの図解である。 図2Aの説明を参照されたい。 図2Aの説明を参照されたい。 図2Aの説明を参照されたい。 図2Aの説明を参照されたい。 図2Aの説明を参照されたい。 図2Aの説明を参照されたい。 図2Aの説明を参照されたい。 図2Aの説明を参照されたい。 実施例に記載されるDDベクターの生成および特徴づけ過程の例示的な段階を示すフローチャートである。第1段階は、下流の機能に必要な発現カセット（例えば、異種遺伝子）を含むウイルスrAAVベクターを作製するまたは得ることである。ウイルスをインビトロで細胞に感染させ、DDエレメントを有する環状二本鎖エピソームを形成させる。第2の主要な段階では、環状rAAVゲノムを細胞からクローニングし、配列決定してDDエレメントの存在を確認する。次いでこれを用いて、プラスミドベースの鋳型を作製し、ローリングサークル増幅を用いてインビトロでDDベクターを生成することができる（段階3および4）。最終段階は、インビボ研究に進む前に、インビトロでDDベクターの遺伝子発現を確認することである。 実施例に記載される合成環状ベクターの生成および特徴づけ過程の例示的な段階を示すフローチャートである。第1段階は、下流の機能に必要な発現カセット（例えば、異種遺伝子）を含むウイルスrAAVベクターを作製するまたは得ることである。ウイルスをインビトロで細胞に感染させ、末端反復配列（この場合、DDエレメント）を有する環状二本鎖エピソームを形成させる。第2の主要な段階では、環状rAAVゲノムを細胞からクローニングし、配列決定してDDエレメントの存在を確認する。次いでこれを用いて、プラスミドベースの鋳型を作製し、ローリングサークル増幅を用いてインビトロでDDベクターを生成することができる（段階3および4）。最終段階は、インビボ研究に進む前に、インビトロでDDベクターの遺伝子発現を確認することである。 図4は、インビトロで環状rAAVゲノムを作製するための過程を示す模式図である。関心対象のrAAVゲノムを有するプラスミドを、付加的なAAV産生プラスミドと共にトランスフェクションして（三重トランスフェクション）、パッケージングされたゲノムを含むrAAVウイルスベクター（血清型2）を生成する。結果として生じたウイルスをHEK293T細胞に感染させると、その中で環状rAAVゲノムが生成される。 図5は、rAAV環状ゲノムの検出のためのローリングサークル増幅反応を示す模式図である。全細胞DNAを、AAVゲノム内で切断しない制限酵素（この場合、AVrII）で消化した。DNAを次いで、線状断片を分解するが、環状二本鎖DNAをそのままにしておくPlasmid-Safe DNaseで処理した。消化反応物は、ランダムプライマーおよびPhi29 DNAポリメラーゼを用いる線状ローリングサークル増幅の鋳型として機能した。環状AAVエピソームの増幅後に、大きな線状コンカテマーアレイが生成された。線状アレイをその後、AAVゲノムを単一点で切断するEcoRIによる制限酵素消化により、単位長単量体AAVゲノムに消化した。単位長AAVゲノムを次いで、さらなる配列解析のためにpBlueScriptベクターにクローニングした。 図6A〜6Jは、様々なAAV2末端反復配列（この場合、DDエレメント）の例示的な配列を示す一連の図解である。図6Aは、5'→3'配置で機能的に連結された、5'Dエレメント、5'Aエレメント、5'Cエレメント、3'Cエレメント、5'Bエレメント、3'Bエレメント、3'Aエレメント、および3'Dエレメントを含む標準的なDDエレメント (SEQ ID NO: 9) の図解である。図6Bは、5'→3'配置で機能的に連結された、5'Dエレメント、5'Aエレメント、5'Bエレメント、3'Bエレメント、5'Cエレメント、3'Cエレメント、3'Aエレメント、および3'Dエレメントを含む標準的なDDエレメント (SEQ ID NO: 10) の図解である。図6Cは、5'→3'配置で機能的に連結された、5'Dエレメント、5'Aエレメント、5'Cエレメント、3'Cエレメント、3'Aエレメント、および3'Dエレメントを含む、BエレメントのないDDエレメント (SEQ ID NO: 11) の図解である。図6Dは、5'→3'配置で機能的に連結された、5'Dエレメント、5'Aエレメント、5'Bエレメント、3'Bエレメント、3'Aエレメント、および3'Dエレメントを含む、CエレメントのないDDエレメント (SEQ ID NO: 12) の図解である。図6Eは、5'→3'配置で機能的に連結された、5'Dエレメント、5'Aエレメント、3'Aエレメント、および3'Dエレメントを含む、BおよびCエレメントのないDDエレメント (SEQ ID NO: 13) の図解である。図6Fは、5'→3'配置で機能的に連結された、5'Dエレメントおよび3'Dエレメントを含む、A、B、およびCエレメントのないDDエレメント (SEQ ID NO: 14) の図解である。図6Gは、5'→3'配置で機能的に連結された、5'Dエレメント、5'Aエレメント、5'Cエレメント、3'Aエレメントの代わりの核酸、および3'Dエレメントを含むDDエレメント (SEQ ID NO: 15) の図解である。図6Hは、5'→3'配置で機能的に連結された、5'Dエレメント、5'Aエレメント、重複した5'Cエレメントと3'Aエレメント、および3'Dエレメントを含むDDエレメント (SEQ ID NO: 16) の図解である。図6Iは、5'→3'配置で機能的に連結された、5'Dエレメント、部分的5'Aエレメント、部分的3'Aエレメント、および3'Dエレメントを含むDDエレメント (SEQ ID NO: 17) の図解である。図6Jは、5'→3'配置で機能的に連結された、5'Dエレメント、5'Aエレメント、部分的3'Aエレメント、および3'Dエレメントを含むDDエレメント (SEQ ID NO: 18) の図解である。 図6Aの説明を参照されたい。 図6Aの説明を参照されたい。 図6Aの説明を参照されたい。 図6Aの説明を参照されたい。 図6Aの説明を参照されたい。 図6Aの説明を参照されたい。 図6Aの説明を参照されたい。 図6Aの説明を参照されたい。 図6Aの説明を参照されたい。 図7は、プラスミド由来の環状鋳型の作製を示す略図である。プラスミドTG-18を最初にEcoRIで消化して、末端反復配列（DDエレメント；リボン型として表される）を含む線状rAAVゲノムを放出させる。線状断片の末端を共にライゲーションして、二本鎖環状物を形成する。 図8は、鋳型形成過程の異なる段階におけるDNAのバンドを含むアガロースゲルの写真である。レーン1は、pBlueScriptベクターから放出された線状DNA断片である。この断片は、CMVプロモーター、eGFP cDNA、BGHpA、および末端反復配列（DDエレメント）を含む。レーン2は、レーン1からの線状断片の自己ライゲーションの結果である。複数のDNA形態が存在し、1つまたは複数のDNA断片のライゲーションによって生じる様々なサイズの環状および線状DNAを含む。レーン3は、線状DNAを分解するが環状DNAを分解しないplasmid-safe DNaseによる処理後に残存するDNAを示す。 図9は、末端反復配列（DDエレメント）を増幅する際のPhi29忠実度を解析するための過程を示す模式図である。細菌由来の環状DDベクターは、ランダムプライマーおよびPhi29 DNAポリメラーゼを用いる線状ローリングサークル増幅の鋳型として機能する。環状AAVエピソームの増幅後に、大きな線状コンカテマーアレイが生成される。線状アレイをその後、DDエレメントの存在を評価するために、制限酵素消化により消化する。SwaI酵素は、DDエレメントの両側で切断して244-bp断片を生じる。AhdI酵素は、DDエレメント内で1回切断し、コンカテマーを2.1 Kbの単位長断片に消化する。 図10は、増幅されたDNAのSwat消化の結果を示すアガロースゲルの写真である。1 ngまたは6 ngのいずれかのTG-18プラスミド鋳型から増幅されたDNAをSwaIで消化すると、244-bpの断片が生じた（レーン2および3、矢印）。これは、元のTG-18プラスミドベクターから放出された断片（レーン1）と同じサイズである。SwaI消化を用いてTG-18からDDエレメントを除去することによって生成された、DDエレメントを欠いたプラスミド鋳型 (TG-dDD) から増幅されたDNAも含めてある（レーン4および5）。 図11は、増幅されたDNAのAhdI消化を示すアガロースゲルの写真である。AhdIは、DDエレメント内で1回切断する。1 ngまたは6 ngのいずれかのTG-18プラスミド鋳型から増幅されたDNAをAhdIで消化すると、2.1-kbの断片が生じた（レーン1および2、矢印）。DDエレメントを欠いたプラスミド鋳型 (TG-dDD) から増幅されたDNAも含めてある（レーン3および4）。このDNAはDDエレメントを含まないため、AhdIで消化されないはずである。 図12Aは、細菌プラスミド由来の鋳型の自己ライゲーションを示す模式図である。末端反復配列含有ベクター（この場合、DDエレメント含有ベクター）を有するプラスミドを最初にEcoRIで消化して、遺伝子配列内にリボン型として表される末端反復配列（DDエレメント）を含む線状rAAVゲノムを放出させる。線状断片の末端を共にライゲーションして、二本鎖環状物を形成する。 図12Bは、鋳型形成過程の異なる段階におけるDNAを示すアガロースゲルの写真である。レーン1は、pBlueScriptベクターから放出された線状DNA断片である。この断片は、CMVプロモーター、eGFP cDNA、BGHpA、およびDDエレメントを含む。レーン2は、レーン1からの線状断片の自己ライゲーションの結果である。複数のDNA形態が存在し、1つまたは複数のDNA断片のライゲーションによって生じる様々なサイズの環状および線状DNAを含む。レーン3は、線状DNAを分解するが環状DNAを分解しないplasmid-safe DNaseによる処理後に残存するDNAを示す。 図13Aは、Phi29ポリメラーゼによる線状コンカテマーの生成を示す模式図である。図11Aおよび11Bに示される細菌由来の鋳型は、ランダムプライマーおよびPhi29 DNAポリメラーゼを用いる線状RCAの鋳型として機能した。環状AAVエピソームの増幅後に、大きな線状コンカテマーアレイが生成された。線状アレイをその後、EcoRIによる制限酵素消化により、単位長単量体AAVゲノムに消化した。 図13Bは、サイズ分画された消化DNAを示すアガロースゲルの写真である。 図14Aは、線状型から環状産物に自己ライゲーションされたインビトロ由来のrAAVゲノムの略図である。図14Bは、図14Aに図示された、結果として生じた単量体環状DNAベクターを示すアガロースゲルの写真である。DNAの大部分は、単量体スーパーコイル環状DNAである。 図15Aは、図14Bにおいて特徴づけられた合成ベクターをトランスフェクトした細胞のGFP蛍光を示す顕微鏡写真である。蛍光は、Spectramax MiniMax300イメージングサイトメーターを用いて検出した。図15Bは、rAAVゲノムを含む元のプラスミドをトランスフェクトした細胞のGFP蛍光を示す顕微鏡写真である。蛍光は、Spectramax MiniMax300イメージングサイトメーターを用いて検出した。 図16は、pBS単独（レーン1）、インビトロで生成されたTG-18由来のDDベクター（レーン2）、DDエレメントのない、インビトロで生成されたTG-18由来のベクター（レーン3）、プラスミド由来のTG-18由来のDDベクター（レーン4）、およびDDエレメントのない、プラスミド由来のTG-18由来のベクター（レーン5）をトランスフェクションした細胞によるGFP発現を示すウェスタンブロットの写真である。抗チューブリン染色を示すバンドを対照として示す。 図17は、ローリングサークル増幅を用いて合成DNAベクターを生成するための例示的な過程を示す模式図である。この過程は、開環状DNA分子をスーパーコイルDNA単量体から分離するためのカラム精製を含む。
詳細な説明
本発明は、AAVベクターに類似した様式で静止細胞（例えば、分裂後の細胞）の長期形質導入を提供する非ウイルス性DNAベクターを特徴とする。本発明は、一部には、等温ローリングサークル増幅およびライゲーション媒介性の環状化により（例えば、細菌発現および部位特異的組換えとは対照的に）、環状のAAV様DNAベクター（例えば、DDエレメントなどの末端反復配列を含むDNAベクター）を合成によって生成するためのインビトロ無細胞系の開発に基づいている。本発明の方法によって、環状のAAV様DNAベクターの生成における拡張可能性および製造効率の向上が可能になる。さらに、これらの方法によって生成されたベクターは、プラスミドDNAベクターに付随する問題、例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられるLu et al., Mol. Ther. 2017, 25(5): 1187-98において考察された問題の多くを克服するように設計されている。例えば、CpGアイランドおよび／またはRNAPII停止部位などの細菌プラスミドDNA配列の存在を排除するまたは減少させることにより、転写サイレンシングを減少させるまたは排除することができ、結果として異種遺伝子の持続性を増大させることができる。さらに、免疫原性成分（例えば、細菌のエンドトキシン、DNA、もしくはRNA、またはCpGモチーフなどの細菌シグネチャー）の存在を排除することにより、宿主免疫系を刺激するリスクが低下する。そのような利点は、網膜ジストロフィー（例えば、メンデル遺伝性網膜ジストロフィー）のなどのある特定の障害の処置において特に有利である。
したがって、本発明のベクターは、(i) 細菌プラスミドDNA配列（例えば、RNAPII停止部位、複製開始点、および／もしくは耐性遺伝子）およびその他の細菌シグネチャー（例えば、免疫原性CpGモチーフ）を実質的に欠いている；ならびに／または (ii) 試験管内で完全に合成および増幅することができる（例えば、細菌内での複製は不要である、例えば、細菌の複製開始点および細菌の耐性遺伝子は不要である）合成DNAベクターを含む。いくつかの態様において、ベクターは、AAVベクターに特有のDDエレメントを含む。本発明により、標的細胞（例えば、網膜細胞）を、ウイルス自体を必要とせずに、AAVウイルスDNAのように挙動する（例えば、転写サイレンシングが低くかつ持続性が増強された）、異種遺伝子を有するDNAベクターで形質導入することが可能になる。
I. 定義
特に定義されない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により、および出版された教科書を参照することにより、一般に理解されている意味と同じ意味を有し、出版された教科書は、本出願において用いられる用語の多くに対する一般的な指針を当業者に提供する。本明細書に記載される定義と参照出版物の定義との間に何らかの矛盾がある場合には、本明細書において提供される定義が優先するものとする。
本明細書で用いられる場合、「環状ベクター」または「環状DNAベクター」という用語は、環状型の核酸分子を指す。そのような環状型は、典型的には、ローリングサークル増幅により増幅してコンカテマーにすることができる。その末端において結合した鎖（例えば、例えばヘアピンループまたは他の構造により共有結合した骨格）を有する線状二本鎖核酸は、本明細書で用いられる場合、環状ベクターではない。
本明細書で用いられる場合、「メンデル遺伝性網膜ジストロフィー」は、可変的な浸透度（すなわち、完全浸透度または不完全浸透度）でメンデル遺伝パターンに従う網膜の障害を指す。メンデル遺伝性網膜ジストロフィーは、(a) 1つの対立遺伝子における単一の変異（優性遺伝障害の場合のように）または (b) 各対立遺伝子における単一の変異（劣性遺伝障害の場合のように）の結果として起こり得る。変異は、点変異、挿入、欠失、またはスプライス変種変異であってよい。例示的なメンデル遺伝性網膜ジストロフィーには、レーバー先天性黒内障 (LCA)、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、ならびにワグナー症候群が含まれる。メンデル遺伝性網膜ジストロフィーには、加齢黄斑変性 (AMD) などの、疾患を発症する可能性と共に複数の遺伝的関連を有する多因子障害は含まれない。
本明細書で用いられる場合、「末端反復配列」という用語は、核酸分子の隣接部分において反復されるヌクレオチドの配列を有する、核酸分子の部分を指す。配列は、同方向または逆方向に反復されてよい（例えば、それぞれABCDABCDまたはABCDDCBA）。いくつかの態様において、例えば、末端反復配列は、逆位末端反復配列 (ITR) もしくは長い末端反復配列 (LTR) であってよく、またはそれらに由来し得る（例えば、それらのライゲーションの産物であってよい）。ITR由来の末端反復配列は、反復されたAエレメント、Bエレメント、Cエレメント、および／またはDエレメント（A、B、C、およびDエレメントは、SEQ ID NO: 31〜37によって定義され、図2A〜2Hに示される）を有し得る。例えば、図6A〜6Jの各々は末端反復配列であり、すべてのDDエレメント（例えば、SEQ ID NO: 9または10）は末端反復配列の例である。末端反復配列は、相同組換え（例えば、分子間相同組換えまたは分子内相同組換え）の結果として生じる構造を有し得る。
「逆位末端反復」または「ITR」という用語は、Muzyczka and Berns, Fields Virology 2001, 2: 2327-2359に記載されているような、AAVの溶菌および潜伏ライフサイクルを完了するために必要な、T字型の回文構造を形成し得る、AAVおよび／または組換えAAV (rAAV) 中に存在する核酸のひと続きを指す。「二重Dエレメント」および「DDエレメント」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、5'Dエレメント（すなわち、SEQ ID NO: 1、19、21、23、25、27、29、38、および40からなる群より選択される核酸配列と少なくとも80%の相同性（例えば、80%、85%、90%、95%、または100%の相同性）を有する核酸配列）ならびに3'Dエレメント（すなわち、SEQ ID NO: 8、20、22、24、26、28、30、39、および41からなる群より選択される核酸配列と少なくとも80%の相同性（例えば、80%、85%、90%、95%、または100%の相同性）を有する核酸配列）を核酸の同一鎖上に有するDNA構造である、一種の末端反復配列を指す。いくつかの態様において、5'Dエレメントは、SEQ ID NO: 1の核酸配列と100%相同的であり、および／または3'Dエレメントは、SEQ ID NO: 8の核酸配列と100%相同的である。DDエレメントは、図1に示されるように、ライゲーションによって、同じ分子（分子内組換え）または異なる分子（分子間組換え）からの2つのAAV逆位末端反復 (ITR) を連結することによって作製され得る。そのようなライゲーションは、任意のAAV血清型のITRの間で起こり得、その例示的な構造は図2A〜2Iに示される。DDエレメントは、単一の核酸鎖上に2つのDエレメントを含み、5'Dエレメントの3'末端と3'Dエレメントの5'末端を機能的に連結する1つまたは複数のA、B、および／もしくはCエレメント、またはそれらの一部などの付加的なエレメントを含んでもよい。いくつかの態様において、5'Dエレメントの3'末端と3'Dエレメントの5'末端との間に異種遺伝子は存在しない。AAV2に由来する例示的なDDエレメントの配列は、図6A〜6Jのそれぞれによって示される。他のAAV血清型（例えば、AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、またはAAV9）に由来するDDエレメントを使用してもよい。AAV血清型1〜7からの代表的な5'および3'Dエレメントを以下に提供する。
（表１）AAV血清型1〜7からの代表的な5'および3'Dエレメント
Figure 2021516953
「異種遺伝子」という用語は、ウイルスゲノムの一部として天然に存在しない遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子は、哺乳動物遺伝子、例えば、治療用遺伝子、例えば、治療用タンパク質をコードする哺乳動物遺伝子であってよい。いくつかの態様において、異種遺伝子は、標的細胞および／または対象おいて欠陥があるかまたは存在しないタンパク質またはその一部をコードする。いくつかの態様において、異種遺伝子は、標的細胞および／または対象おいて欠陥があるかまたは存在しないタンパク質をコードする1つまたは複数のエキソンを含む。例えば、いくつかの態様において、異種遺伝子は、例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられるWO 2017/087900に記載されているような、1つまたは複数のトランススプライシング分子を含む。いくつかの態様において、異種遺伝子は、治療用RNA（例えば、マイクロRNA）などの治療用核酸を含む。
本明細書で用いられる場合、「トランススプライシング分子」は、3つの主要なエレメント：(a) トランススプライシング分子をその標的遺伝子（例えば、プレmRNA）に繋留することによって特異性を付与する結合ドメイン；(b) スプライシングドメイン（例えば、3'または5'スプライス部位を有するスプライシングドメイン）；および (c) 標的遺伝子中の1つまたは複数のエキソン（例えば、1つまたは複数の変異エキソン）を置換することができる、標的遺伝子上にトランススプライシングされるように構成されたコード配列を有する。
「プロモーター」という用語は、プロモーターに機能的に連結された異種遺伝子の転写を調節する配列を指す。プロモーターは、転写を指示するのに十分な配列、ならびに／またはRNAポリメラーゼおよび効率的な転写に必要な他の転写因子のための認識部位を提供し、細胞特異的な発現を指示することができる。本発明のプロモーター配列は、転写を指示するのに十分な配列に加えて、転写の調節に関与する他の調節エレメント（例えば、エンハンサー、コザック配列、およびイントロン）の配列もまた含み得る。当技術で公知であり、本明細書に記載されるウイルスベクターにおいて有用なプロモーターの例には、CMVプロモーター、CBAプロモーター、smCBAプロモーター、および免疫グロブリン遺伝子、SV40、または他の組織特異的遺伝子に由来するプロモーターが含まれる。公知の調節エレメントを混合し適合させることにより機能的なプロモーターを作出するための標準的な技法が、当技術分野で公知である。プロモーター断片から、または公知の調節エレメントの断片を混合し適合させることにより、「切断型プロモーター」を作製することもできる；例えば、smCBAプロモーターはCBAプロモーターの切断型である。
本明細書で用いられる場合、ベクターまたは組成物（例えば、本発明のDNAベクターを含む薬学的組成物）は、組成物が治療的に関連する用量で測定可能な炎症反応（例えば、トール様受容体シグナル伝達に関連する表現型）を誘発しない場合、免疫原性細菌シグネチャーなどの免疫原性成分を「実質的に欠いている」。免疫原性成分の存在について組成物をスクリーニングする方法には、当技術分野で公知の方法に従ったインビトロおよびインビボ動物アッセイが含まれる。いくつかの態様において、免疫原性成分を実質的に欠いているベクターまたは組成物は、非免疫原性である。
本明細書で用いられる場合、「非免疫原性」という用語は、ベクターまたは組成物が、治療的に関連する用量で測定可能な炎症反応（例えば、トール様受容体シグナル伝達に関連する表現型）を誘発しないことを意味する。免疫原性成分の存在について組成物をスクリーニングする方法には、当技術分野で公知の方法に従ったインビトロおよびインビボ動物アッセイが含まれる。例えば、ベクターまたは組成物が非免疫原性であるかどうかを判定するための適切なインビトロアッセイは、ベクターまたは組成物の存在下でヒト末梢血単核細胞 (PBMC) またはヒトPBMC由来の骨髄細胞（例えば、単球）を培養し、8時間後に培養物中のIL-1β、IL-6、および／またはIL-12の量を測定することを伴う。IL-1β、IL-6、および／またはIL-12の濃度が、陰性対照と比較して、ベクターまたは組成物を含む試料中で上昇しない場合、ベクターまたは組成物は非免疫原性である。
本明細書で用いられる場合、「コンカテマー」は、典型的には連続して連結された同一または実質的に同一の核酸配列（例えば、サブユニット）の複数コピーを含む核酸分子を指す。
本明細書で用いられる場合、「単離された」という用語は、人工的に生成されたことを意味する。いくつかの態様において、DNAベクターに関して、「単離された」という用語は、(i) 例えばローリングサークル増幅もしくはポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) により、インビトロで増幅された；(ii) 分子クローニングにより組換えで生成された；(iii) 制限エンドヌクレアーゼ切断およびゲル電気泳動分画、もしくはカラムクロマトグラフィーなどによって、精製された；または (iv) 例えば化学合成によって合成されたDNAベクターを指す。単離されたDNAベクターは、当技術分野で周知の組換えDNA技法によって容易に操作可能なものである。したがって、5'および3'制限部位が公知であるか、またはポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) プライマー配列が開示されている、ベクターに含まれるヌクレオチド配列は単離されていると見なされるが、その天然状態でその天然宿主中に存在する核酸配列は単離されていると見なされない。単離されたDNAベクターは、実質的に精製されていてもよいが、そうである必要はない。
本明細書で用いられる場合、「ベクター」は、異種遺伝子を標的細胞に運び込むことができる核酸分子を指し、標的細胞内で異種遺伝子は次いで複製、プロセシング、および／または発現され得る。標的細胞または宿主細胞がベクターのゲノムをプロセシングした後（例えば、DDエレメント作製することによって）、そのゲノムはベクターとは見なされない。
本明細書で用いられる場合、「標的細胞」は、標的遺伝子を発現し、ベクターが感染するかまたは感染することが意図される任意の細胞を指す。ベクターは、対象に存在する標的細胞（インサイチューで）または培養中の標的細胞に感染することができる。いくつかの態様において、本発明の標的細胞は分裂後の細胞である。標的細胞には、脊椎動物細胞および無脊椎動物細胞の両方（ならびに動物起源の細胞株）が含まれる。脊椎動物細胞の代表例には、哺乳動物細胞、例えば、ヒト、げっ歯類（例えば、ラットおよびマウス）、ならびに有蹄動物（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、およびブタ）などが含まれる。標的細胞には、網膜細胞などの眼球細胞が含まれる。あるいは、標的細胞は、幹細胞（例えば、多能性細胞（すなわち、その子孫がいくつかの限定された細胞型に分化し得る細胞、例えば、造血幹細胞もしくは他の幹細胞など）または全能性細胞（すなわち、その子孫が生物内の任意の細胞型になり得る細胞、例えば、胚性幹細胞、および体性幹細胞、例えば、造血細胞））であってよい。さらに他の態様において、標的細胞には、卵母細胞、卵子、胚の細胞、接合子、精子細胞、ならびに種々の器官または組織由来の体性（非幹）成熟細胞、例えば、肝細胞、神経細胞、筋肉細胞、および血液細胞（例えば、リンパ球）などが含まれる。
「宿主細胞」は、関心対象のDNAベクターを保有する任意の細胞を指す。宿主細胞は、本開示によって記載されるようなDNAベクターのレシピエントとして使用することができる。本用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で用いられる「宿主細胞」は、（例えば、本明細書に記載されるDNAベクターによって）異種遺伝子をトランスフェクトされた細胞を指し得る。単一の親細胞の子孫は、自然の、偶発的な、または意図的な変異により、形態またはゲノムもしくは全DNA補完物が元の親と必ずしも完全に同一でない可能性があることが理解される。
本明細書で用いられる場合、「対象」という用語は、本明細書に記載される処置または予防の方法を必要とする任意の哺乳動物を含む。いくつかの態様において、対象はヒトである。そのような処置または予防を必要とする他の哺乳動物には、イヌ、ネコ、または他の飼育動物、ウマ、家畜、非ヒト霊長類を含む実験動物、等が含まれる。対象は雄であってもまたは雌であってもよい。1つの態様において、対象は、標的遺伝子の変異によって引き起こされる疾患または障害を有する。別の態様において、対象は、標的遺伝子の変異によって引き起こされる疾患または障害を発症するリスクがある。別の態様において、対象は、標的遺伝子の変異によって引き起こされる疾患または障害の臨床徴候を示している。対象は、処置または予防療法が有益であり得る任意の年齢であってよい。例えば、いくつかの態様において、対象は、0〜5歳、5〜10歳、10〜20歳、20〜30歳、30〜50歳、50〜70歳であるか、または70歳を超える。
本明細書で用いられる場合、ベクターまたはその組成物の「有効量」または「有効用量」は、例えば、選択された投与の形態、経路、および／またはスケジュールに従って細胞または生物に送達される場合に、所望の生物学的および／または薬理学的効果を達成するのに十分な量を指す。当業者によって認識されるように、有効な特定のベクターまたは組成物の絶対量は、所望の生物学的または薬理学的エンドポイント、送達される薬物、標的組織、等のような要因に応じて変動し得る。当業者は、「有効量」を、単一用量でまたは複数用量の使用により、細胞と接触させるかまたは対象に投与することができることをさらに理解するであろう。
本明細書で用いられる場合、「持続性」という用語は、遺伝子が細胞内で発現可能である期間を指す。DNAベクターの持続性、またはDNAベクター内の異種遺伝子の持続性は、当技術分野で公知の任意の遺伝子発現特性決定法を用いて、細菌内で生成された対照ベクター（例えば、細菌内で生成されるか、または本発明のベクターには存在しない1つもしくは複数の細菌シグネチャーを有する環状ベクター）などの参照ベクターに対して定量化することができる。いくつかの態様において、対照ベクターはDDエレメントを欠いている。付加的にまたは代替的に、持続性は、ベクターの投与後の任意の所与の時点で定量化することができる。例えば、いくつかの態様において、本発明のDNAベクターの異種遺伝子は、ベクターの投与から6ヶ月後にその発現がインサイチューで検出される場合、投与後少なくとも6ヶ月間持続する。いくつかの態様において、遺伝子は、その転写が、投与後3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、1年、2年、またはそれ以上の時点で検出可能である場合、標的細胞内で「持続する」。いくつかの態様において、遺伝子は、投与後の所与の期間（例えば、投与後3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、1年、2年、またはそれ以上）の後に、元の発現レベルの任意の検出可能な割合（例えば、元の発現レベルの少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも70%、または少なくとも100%）が残存している場合、持続すると称される。
本明細書で用いられる場合、「変異」は、欠陥のある（例えば、非機能的な、機能が低下した、異常な機能の、通常よりも少ない産生量の）タンパク質産物を引き起こす任意の異常な核酸配列を指す。変異には、塩基対変異（例えば、一塩基多型）、ミスセンス変異、フレームシフト変異、欠失、挿入、およびスプライス変異が含まれる。
本明細書で用いられる場合、「変異に関連する障害」または「障害に関連する変異」という用語は、障害と変異との間の相関関係を指す。いくつかの態様において、変異に関連する障害は、その変異によって、完全にもしくは部分的に、または直接的にもしくは間接的に引き起こされることが公知であるかまたは疑われる。例えば、変異を有する対象は、障害を発症するリスクがある可能性があり、そのリスクは、他の（例えば、独立した）変異（例えば、同じ遺伝子もしくは異なる遺伝子における）または環境因子などの他の因子に付加的に依存し得る。
本明細書で用いられる場合、「処置」という用語またはその文法的派生語は、疾患の進行を軽減すること、疾患症状の重症度を軽減すること、疾患症状の進行を遅らせること、疾患症状を取り除くこと、または疾患の発症を遅らせることと定義される。
本明細書で用いられる場合、障害の「予防」という用語またはその文法的派生語は、疾患の発症リスクを減らすこと、例えば、変異に関連した障害を発症するリスクがある対象に対する予防療法と定義される。対象は、当技術分野で公知であるかまたは本明細書に記載される任意の適切な方法に従って、障害に関連する変異を同定することにより、障害を発症する「リスクがある」と特徴づけることができる。いくつかの態様において、障害を発症するリスクがある対象は、障害に関連する1つまたは複数の変異を有する。付加的にまたは代替的に、対象は、対象が障害の家族歴を有する場合、その障害を発症する「リスクがある」と特徴づけることができる。
本明細書に記載される方法において用いられる「投与する」という用語またはその文法的派生語は、組成物またはエクスビボで処理された細胞を、それを必要とする、例えば、標的遺伝子に変異または欠陥を有する対象に送達することを指す。例えば、眼球細胞が標的とされる1つの態様において、該方法は、光受容細胞または他の眼球細胞への網膜下注射によって組成物を送達することを伴う。別の態様では、眼球細胞への硝子体内注射または眼球細胞への眼瞼静脈を介した注射を用いてもよい。別の態様において、組成物は静脈内投与される。投与のさらに他の方法は、本開示を考慮して、当業者によって選択され得る。
「薬学的に許容される」という用語は、ヒトなどの哺乳動物への投与に安全であることを意味する。いくつかの態様において、薬学的に許容される組成物は、動物、およびより具体的にはヒトにおいて使用するために、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般に認識される薬局方に収載されている。
「担体」という用語は、本発明のベクターまたは組成物と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、または媒体を指す。適切な薬学的担体の例は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」 Mack Publishing Co., Easton, PA., 2nd edited, 2005に記載されている。
「1つの (a)」および「1つの (an)」という用語は、「1つまたは複数」を意味する。例えば、「1つの遺伝子」は、1つまたは複数のそのような遺伝子を表すと理解される。したがって、「1つの (a)」および「1つの (an)」、「1つの (a)（または1つの (an)）の1つまたは複数」、ならびに「1つの (a)（または1つの (an)）の少なくとも1つ」という用語は、本明細書で互換的に用いられる。
本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、特に指定がない限り、参照値から±10%の変動内の値を指す。
様々な情報源または参考文献の間で定義に何らかの矛盾がある場合には、本明細書において提供される定義が優先するものとする。
II. ベクター
異種遺伝子および二重D (DD) エレメントを特徴とする合成DNAベクターが、本明細書において提供される。DDエレメントを有する合成DNAベクターは、例えばAAVベクターに類似した様式で、エピソームとして細胞内で（例えば、分裂後の細胞などの静止細胞内で）持続し得る。本明細書において提供されるベクターは、ウイルスベクターに固有の成分（例えば、ウイルスタンパク質）および細菌プラスミドDNA、例えば、免疫原性成分（例えば、免疫原性細菌シグネチャー（例えば、CpGアイランドもしくはCpGモチーフ））、または持続性の低下と付加的にもしくはその他の点で関連する成分（例えば、CpGアイランドもしくはCpGモチーフ）などを欠いた裸のDNAベクターであってよい。
複製開始点および／または薬物耐性遺伝子のない、異種遺伝子を特徴とする合成環状DNAベクターがさらに提供され、これは本明細書において環状DNAベクターと称される。本発明は、合成によって生成される環状DNAベクターを提供する。
合成環状DNAベクターは、例えばAAVベクターに類似した様式で、エピソームとして細胞内で（例えば、分裂後の細胞などの静止細胞内で）持続し得る。本明細書において提供されるベクターは、ウイルスベクターに固有の成分（例えば、ウイルスタンパク質）および細菌プラスミドDNA、例えば、免疫原性成分（例えば、免疫原性細菌シグネチャー（例えば、CpGモチーフ））、または持続性の低下と付加的にもしくはその他の点で関連する成分（例えば、CpGアイランド）などを欠いた裸のDNAベクターであってよい。
前述のベクターの各々に関するいくつかの態様において、DNAベクターは、インビボで持続し得る（例えば、環状および非細菌性（すなわち、インビトロ合成による）は、DNAベクターの異種遺伝子の長期転写または発現に関連している）。いくつかの態様において、環状DNAベクターの持続性は、参照ベクター（例えば、細菌内で生成されるか、または本発明のベクターには存在しない1つもしくは複数の細菌シグネチャーを有する環状ベクター）よりも、5%〜50%高い、50%〜100%高い、その1倍〜5倍、または5倍〜10倍である（例えば、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%高い、その1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、またはそれ以上である）。いくつかの態様において、本発明の環状DNAベクターは、1週間〜4週間、1ヶ月〜4カ月、4ヶ月〜1年、1年〜5年、5年〜20年、または20年〜50年（例えば、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも1ヵ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも1年、少なくとも2年、少なくとも5年、少なくとも10年、少なくとも20年、少なくとも30年、少なくとも40年、または少なくとも50年）持続する。いくつかの態様において、DNAベクターはDDエレメントを含み、DDエレメントは持続性の増加と関連している可能性がある。
DNAベクターは環状DNAベクターであってよい。環状DNAベクターは、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、等であってよい。好ましくは、環状DNAベクターは単量体である。他の好ましい態様において、環状DNAベクターは単量体スーパーコイル環状DNA分子である。いくつかの態様において、DNAベクターはニックが入っている。いくつかの態様において、DNAベクターは開環状である。いくつかの態様において、DNAベクターは二本鎖の環状である。
付加的にまたは代替的に、DNAベクターはDDエレメントを含み得る。ある特定の態様において、DNAベクター（例えば、環状DNAベクター、例えば、単量体環状DNAベクター）は、5'から3'方向に機能的に連結された (i) 5'Dエレメント、(ii) 異種遺伝子、および (iii) 3'Dエレメントを含む。いくつかの態様において、DNAベクターは、5'から3'方向に機能的に連結された (i) 5'Dエレメント、(ii) プロモーター、(iii) 異種遺伝子、および (iv) 3'Dエレメントを含む。いくつかの態様において、DNAベクターは、5'から3'方向に機能的に連結された (i) 5'Dエレメント、(ii) プロモーター、(iii) 異種遺伝子、(iv) ポリアデニル化部位、および (v) 3'Dエレメントを含む。
例えば、DNAベクターは、5'から3'方向に機能的に連結された (i) 5'Aエレメント、(ii) 5'Dエレメント、(iii) 異種遺伝子、(iv) 3'Dエレメント、および (v) 5'Aエレメントを含み得る。いくつかの態様において、DNAベクターは、5'から3'方向に (i) 5'Aエレメント、(ii) 5'Dエレメント、(iii) プロモーター、(iv) 異種遺伝子、(v) 3'Dエレメント、および (vi) 5'Aエレメントを含む。いくつかの態様において、DNAベクターは、5'から3'方向に (i) 5'Aエレメント、(ii) 5'Dエレメント、(iii) プロモーター、(iv) 異種遺伝子、(v) ポリアデニル化部位、(vi) 3'Dエレメント、および (vii) 5'Aエレメントを含む。いくつかの態様において、DNAベクターは、5'から3'方向に (i) 5'Cエレメント、(ii) 5'Aエレメント、(iii) 5'Dエレメント、(iv) 異種遺伝子、(v) 3'Dエレメント、(vi) 3'Aエレメント、および (vii) 3'Bエレメントを含む。いくつかの態様において、DNAベクターは、5'から3'方向に (i) 5'Cエレメント、(ii) 5'Aエレメント、(iii) 5'Dエレメント、(iv) プロモーター、(v) 異種遺伝子、(vi) 3'Dエレメント、(vii) 3'Aエレメント、および (viii) 3'Bエレメントを含む。いくつかの態様において、DNAベクターは、5'から3'方向に (i) 5'Cエレメント、(ii) 5'Aエレメント、(iii) 5'Dエレメント、(iv) プロモーター、(v) 異種遺伝子、(vi) ポリアデニル化部位、 (vii) 3'Dエレメント、(viii) 3'Aエレメント、および (ix) 3'Bエレメントを含む。
いくつかの態様において、DNAベクターは、同じ核酸（例えば、DNA）鎖上に少なくとも5'Dエレメントおよび3'Dエレメントを有する核酸配列を有するDDエレメントを含む。例えば、いくつかの態様において、DNAベクターは、5'から3'方向に機能的に連結された (i) 異種遺伝子および (ii) DDエレメントを含む。いくつかの態様において、DNAベクターは、5'から3'方向に (i) プロモーター、(ii) 異種遺伝子、および (iii) DDエレメントを含む。いくつかの態様において、DNAベクターは、5'から3'方向に (i) 異種遺伝子、(ii) ポリアデニル化部位、および (iii) DDエレメントを含む。いくつかの態様において、DNAベクターは、5'から3'方向に (i) プロモーター、(ii) 異種遺伝子、(iii) ポリアデニル化部位、および (iv) DDエレメントを含む。
末端反復配列
本発明のいくつかの態様において、本明細書において提供されるベクターおよび組成物は末端反復配列を含み、これは、例えば環状化の結果として、例えば、ITR、LTR、または他の末端構造に由来し得る。末端反復配列は、少なくとも10塩基対 (bp) 長（例えば、10 bp〜500 bp、12 bp〜400 bp、14 bp〜300 bp、16 bp〜250 bp、18 bp〜200 bp、20 bp〜180 bp、25 bp〜170 bp、30 bp〜160 bp、または50 bp〜150 bp、例えば、10 bp〜15 bp、15 bp〜20 bp、20 bp〜25 bp、25 bp〜30 bp、30 bp〜35 bp、35 bp〜40 bp、40 bp〜45 bp、45 bp〜50 bp、50 bp〜55 bp、55 bp〜60 bp、60 bp〜65 bp、65 bp〜70 bp、70 bp〜80 bp、80 bp〜90 bp、90 bp〜100 bp、100 bp〜150 bp、150 bp〜200 bp、200 bp〜300 bp、300 bp〜400 bp、または400 bp〜500 bp、例えば、10 bp、11 bp、12 bp、13 bp、14 bp、15 bp、16 bp、17 bp、18 bp、19 bp、20 bp、21 bp、22 bp、23 bp、24 bp、25 bp、26 bp、27 bp、28 bp、29 bp、30 bp、31 bp、32 bp、33 bp、34 bp、35 bp、36 bp、37 bp、38 bp、39 bp、40 bp、41 bp、42 bp、43 bp、44 bp、45 bp、46 bp、47 bp、48 bp、49 bp、50 bp、51 bp、52 bp、53 bp、54 bp、55 bp、56 bp、57 bp、58 bp、59 bp、60 bp、61 bp、62 bp、63 bp、64 bp、65 bp、66 bp、67 bp、68 bp、69 bp、70 bp、71 bp、72 bp、73 bp、74 bp、75 bp、76 bp、77 bp、78 bp、79 bp、80 bp、81 bp、82 bp、83 bp、84 bp、85 bp、86 bp、87 bp、88 bp、89 bp、90 bp、91 bp、92 bp、93 bp、94 bp、95 bp、96 bp、97 bp、98 bp、99 bp、100 bp、101 bp、102 bp、103 bp、104 bp、105 bp、106 bp、107 bp、108 bp、109 bp、110 bp、111 bp、112 bp、113 bp、114 bp、115 bp、116 bp、117 bp、118 bp、119 bp、120 bp、121 bp、122 bp、123 bp、124 bp、125 bp、126 bp、127 bp、128 bp、129 bp、130 bp、131 bp、132 bp、133 bp、134 bp、135 bp、136 bp、137 bp、138 bp、139 bp、140 bp、141 bp、142 bp、143 bp、144 bp、145 bp、146 bp、147 bp、148 bp、149 bp、150 bp、またはそれ以上）であってよい。
本発明のいくつかの態様において、合成ベクターの末端反復配列は、DDエレメント（例えば、ITRに由来する、および／またはITRの1つもしくは複数の部分を含むDDエレメント）であってよい。DDエレメントは、単一のDNA分子上に2つのDエレメントを含む。いくつかの態様において、2つのDエレメントは、約125個の核酸によって分離されている。DDエレメントは、任意の血清型のAAV、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、またはAAV9に由来し得る。
いくつかの態様において、DDエレメントは、例えば図6Fに示される構成において、互いに直接連結された2つのDエレメントを含む。したがって、いくつかの態様において、DDエレメントは、SEQ ID NO: 14の核酸配列を有する。いくつかの態様において、DDエレメントは、SEQ ID NO: 14の核酸配列と80%、82.5%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、または100%相同的である。
他の態様において、本発明のDDエレメントは、5'Dエレメントを3'Dエレメントから分離する少なくとも1つの付加的なエレメント、例えば、1つもしくは複数のAエレメント；1つもしくは複数のBエレメント；および／または1つもしくは複数のCエレメントなどを有し、これらは任意の適切な順序で配置されてよい。例えば、いくつかの態様において、DDエレメントは、5'→3'配置で機能的に連結された (i) 5'Dエレメント（すなわち、SEQ ID NO: 1、19、21、23、25、27、29、38、または40のうちのいずれか1つの核酸配列と少なくとも80%の相同性（例えば、80%、85%、90%、95%、または100%の相同性）を有する核酸配列）；(ii) 1つまたは複数の内部核酸（例えば、非異種核酸）、および (iii) 3'Dエレメント（すなわち、SEQ ID NO: 8、20、22、24、26、28、30、39、または41のうちのいずれか1つの核酸配列と少なくとも80%の相同性（例えば、80%、85%、90%、95%、または100%の相同性）を有する核酸配列）を含む。いくつかの態様において、(ii) の1つまたは複数の核酸は、1〜125個の核酸、2〜100個の核酸、5〜80個の核酸、または10〜50個の核酸、例えば、1〜20個の核酸、20〜40個の核酸、40〜60個の核酸、60〜80個の核酸、80〜100個の核酸、または100〜125個の核酸、例えば、1〜5個の核酸、5〜10個の核酸、10〜15個の核酸、15〜20個の核酸、20〜25個の核酸、25〜30個の核酸、30〜35個の核酸、35〜40個の核酸、40〜45個の核酸、45〜50個の核酸、50〜55個の核酸、55〜60個の核酸、60〜65個の核酸、65〜70個の核酸、70〜75個の核酸、75〜80個の核酸、80〜85個の核酸、85〜90個の核酸、90〜95個の核酸、95〜100個の核酸、100〜105個の核酸、105〜110個の核酸、110〜115個の核酸、115〜120個の核酸、120〜125個の核酸、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、または125個の核酸である。
いくつかの態様において、DDエレメントは、2つのAエレメント（例えば、5'Aエレメント（例えば、SEQ ID NO: 2）および3'Aエレメント（例えば、SEQ ID NO: 7）)、2つのBエレメント（例えば、5'Bエレメント（例えば、SEQ ID NO: 5）および3'Bエレメント（例えば、SEQ ID NO: 6）)、ならびに2つのCエレメントに加えて、2つのDエレメント（例えば、5'Dエレメント（例えば、SEQ ID NO: 1、19、21、23、25、27、29、38、または40）および3'Dエレメント（例えば、SEQ ID NO: 8、20、22、24、26、28、30、39、または41））、例えば、SEQ ID NO: 1〜8を含む。SEQ ID NO: 1〜8の核酸配列は、例えば図6Aに示されるように、5'から3'方向に順に機能的に連結されてよい。したがって、いくつかの態様において、DDエレメントはSEQ ID NO: 9の核酸配列を含む。あるいは、SEQ ID NO: 1〜8は、任意の適切な順序で機能的に連結され得る。例えば、いくつかの態様において、DDエレメントはSEQ ID NO: 10の核酸配列を含む。特定の態様において、SEQ ID NO: 1および8（すなわち、2つのDエレメント）は、Dエレメントの内側で残りのエレメントおよび／または核酸と隣接している。
SEQ ID NO: 1〜8のエレメントは、それぞれ互いに直接連結され得るか、または間接的に連結（例えば、機能的に連結）され得、例えば、SEQ ID NO: 1〜8は、5'から3'方向に機能的に連結され得る。あるいは、図6Aおよび6Bに示されるように、1つまたは複数の機能的に連結されたエレメントを分離する1つまたは複数の核酸が存在してもよい。いくつかの態様において、DDエレメントは、5'Dエレメントと3'Dエレメントとの間に（例えば、エレメントの以下の対：5'Dエレメントと5'Aエレメント、5'Dエレメントと5'Bエレメント、5'Dエレメントと3'Bエレメント、5'Dエレメントと5'Cエレメント、5'Dエレメントと3'Cエレメント、5'Dエレメントと3'Aエレメント、5'Dエレメントと3'Dエレメント、5'Aエレメントと5'Bエレメント、5'Aエレメントと3'Bエレメント、5'Aエレメントと5'Cエレメント、5'Aエレメントと3'Cエレメント、5'Aエレメントと3'Aエレメント、5'Aエレメントと3'Dエレメント、5'Bエレメントと3'Bエレメント、5'Bエレメントと5'Cエレメント、5'Bエレメントと3'Cエレメント、5'Bエレメントと3'Aエレメント、5'Bエレメントと3'Dエレメント、3'Bエレメントと5'Cエレメント、3'Bエレメントと3'Cエレメント、3'Bエレメントと3'Aエレメント、3'Bエレメントと3'Dエレメント、5'Cエレメントと3'Cエレメント、5'Cエレメントと3'Aエレメント、5'Cエレメントと3'Dエレメント、3'Cエレメントと3'Aエレメント、3'Cエレメントと3'Dエレメント、または3'Aエレメントと3'Dエレメントのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の間に）配置された1〜100個の付加的な核酸（例えば、3〜50個の核酸、例えば、3〜10個の核酸、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個、またはそれ以上の付加的な核酸）を含む。
付加的な核酸は、例えば、図6Aおよび6BにおけるAhdI部位によって示されるように、制限部位として役立ち得る。
いくつかの態様では、エレメントA、B、またはC（例えば、SEQ ID NO: 2〜7）のうちの1つまたは複数が存在しない。例えば、図6Cは、BエレメントのないAAV2由来のDDエレメントを示す。したがって、いくつかの態様において、本発明のDDエレメントは、SEQ ID NO: 11と80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の相同性を有する核酸配列を有してよい。同様に、図6Dは、CエレメントのないDDエレメントを示す。したがって、いくつかの態様において、本発明のDDエレメントは、SEQ ID NO: 12と80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の相同性を有する核酸配列を有してよい。いくつかの態様において、DDエレメントは、図6Eに示されるように、BエレメントもCエレメントも含まない。したがって、いくつかの態様において、本発明のDDエレメントは、SEQ ID NO: 13と80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の相同性を有する核酸配列を有してよい。
あるいは、エレメントA、B、またはC（例えば、SEQ ID NO: 2〜7）のうちの1つまたは複数は、その3'Aエレメントの代わりに異なる核酸配列を有する適切なDDエレメントを示す図6Gのように、異なる核酸配列で置換されもよい。したがって、いくつかの態様において、DDエレメントはSEQ ID NO: 1〜3および8を含む。いくつかの態様において、本発明のDDエレメントは、SEQ ID NO: 15と80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の相同性を有する核酸配列を有してよい。
いくつかの態様では、1つまたは複数の（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれ以上の）核酸が、2つの隣接するエレメントの間で重複する。例えば、第1エレメントの3'末端の1つまたは複数の核酸が、その3'末端に連結された第2エレメントの5'末端の1つまたは複数の核酸と一致する場合のいくつかの態様において、重複する核酸は反復される必要はない。そのようなDDエレメントの例は図6Hに示されており、この場合、5'Cエレメントの3'末端が3'Aエレメントの5'末端と重複している。したがって、いくつかの態様において、本発明のDDエレメントは、SEQ ID NO: 16と80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の相同性を有する核酸配列を有してよい。
5'Dエレメントと3'Dエレメントとの間の核酸配列は、5'もしくは3'Aエレメント、5'もしくは3'Bエレメント、または5'もしくは3'Cエレメントのうちの任意の1つまたは複数の部分であってよい。特定の態様において、DDエレメントは、図6Iおよび6Jに示されるように、1つまたは複数の部分的Aエレメントを含む。部分的Aエレメントは、SEQ ID NO: 2または7と6個またはそれ以上の連続した一致する核酸（例えば、6〜40個、8〜35個、10〜30個、または15〜25個、例えば、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40個の連続した一致するする核酸）を有する核酸配列を含み得る。いくつかの態様において、本発明のDDエレメントは、SEQ ID NO: 17と80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の相同性を有する核酸配列を有してよい。いくつかの態様において、本発明のDDエレメントは、SEQ ID NO: 18と80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の相同性を有する核酸配列を有してよい。
AAV2由来のDDエレメントおよびそのサブエレメントの例示的な核酸配列を、以下の表2に提供する。
（表２）DDエレメントおよびそのサブエレメントの例示的な核酸配列
Figure 2021516953
異種遺伝子
本発明のベクター（例えば、DDエレメントを含む、環状構造を有する、またはその両方であるDNAベクター）のいずれかを使用して、異種遺伝子を標的細胞に挿入することができる。本明細書において開示されるように、本発明のベクターによって、広範囲の異種遺伝子を標的細胞に送達することができる。いくつかの態様において、異種遺伝子は、異種遺伝子、例えば、例えば標的細胞および／または対象において欠陥があるかまたは存在しないタンパク質などの治療用タンパク質をコードする遺伝子の発現によって処置され得る疾患に関連する変異を有する標的細胞にトランスフェクトするように構成される。そのような例において、異種遺伝子は、眼球タンパク質、例えば、CEP290、ABCA4、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、C3、IFT172、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、SNRNP200、RP 1、MYO7A、PRPF8、VCAN、USH2A、およびHMCN1などのすべてまたは一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）をコードし得る。他の例示的な治療用タンパク質には、増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、抗アポトーシス因子、サイトカイン、抗糖尿病因子、抗アポトーシス剤、凝固因子、抗腫瘍因子からなる群より選択される1つまたは複数のポリペプチドが含まれる。治療用タンパク質には、BDNF、CNTF、CSF、EGF、FGF、G-SCF、GM-CSF、ゴナドトロピン、IFN、IFG-1、M-CSF、NGF、PDGF、PEDF、TGF、VEGF、TGF-B2、TNF、プロラクチン、ソマトトロピン、XIAP1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-10、ウイルス性IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、および／またはIL-18が含まれ得る。
本発明のベクターの一部として、関心対象のポリペプチドをコードする他の異種遺伝子を含めることができ、これには、例えば、トランスジェニック動物の成長を促進するための成長ホルモン、またはインスリン様増殖因子 (IGF)、α-アンチトリプシン、エリスロポエチン (EPO)、血液凝固系の第VIII因子、第IX因子、第X因子、および第XI因子、LDL受容体、GATA-1、等が含まれる。核酸配列には、例えばアポトーシスまたはアポトーシス関連酵素をコードする自殺遺伝子、およびAIF、Apaf（例えば、Apaf-1、Apaf-2、またはApaf-3）、APO-2 (L)、APO-3 (L)、アポパイン、Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-x.sub.L、Bcl-x.sub.S、bik、CAD、カルパイン、カスパーゼ、例えば、カスパーゼ-1、カスパーゼ-2、カスパーゼ-3、カスパーゼ-4、カスパーゼ-5、カスパーゼ-6、カスパーゼ-7、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、カスパーゼ-10、カスパーゼ-11、またはグランザイムB、ced-3、ced-9、セラミド、c-Jun、c-Myc、CPP32、crm A、シトクロムc、D4-GDP-DI、Daxx、CdR1、DcR1、DD、DED、DISC、DNA-PK.sub.CS、DR3、DR4、DR5、FADD/MORT-1、FAK、Fas、FasリガンドCD95／fas（受容体）、FLICE/MACH、FLIP、フォドリン、fos、G-アクチン、Gas-2、ゲルゾリン、グルココルチコイド／グルココルチコイド受容体、グランザイムA/B、hnRNP C1/C2、ICAD、ICE、JNK、ラミンA/B、MAP、MCL-1、MdM-2、MEKK-1、MORT-1、NEDD、NF-κB、NuMa、p53、PAK-2、PARP、パーフォリン、PITSLRE、PKC-δ、pRb、プレセニリン、prICE、RAIDD、Ras、RIP、スフィンゴミエリナーゼ、SREBP、単純ヘルペス由来のチミジンキナーゼ、TNF-α、TNF-α受容体、TRADD、TRAF2、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、トランスグルタミナーゼ、U1 70 kDa snRNP、YAMA、等を含む遺伝子が含まれ得る。
いくつかの態様において、異種遺伝子は、抗体、またはその一部、断片、もしくは変種をコードする。抗体には、抗原に結合し得る断片、例えば、Fv、一本単鎖Fv (scFv)、Fab、Fab'、di-scFv、sdAb（単一ドメイン抗体）、および (Fab')2（化学的に連結されたF(ab')2を含む）が含まれる。抗体のパパイン消化によって、それぞれが単一の抗原結合部位を有する、「Fab」断片と称される2つの同一の抗原結合断片、およびその名称が容易に結晶化するその能力を反映する残りの「Fc」断片が生じる。ペプシン処理によって、2つの抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋し得るF(ab')2断片が得られる。抗体には、キメラ抗体およびヒト化抗体もまた含まれる。さらに、本明細書において提供されるすべての抗体構築物について、他の生物からの配列を有する変種もまた企図される。したがって、抗体のヒトバージョンが開示される場合、当業者は、ヒト配列に基づく抗体をどのようにマウス、ラット、ネコ、イヌ、ウマ、等の配列に変換するかを認識するであろう。抗体断片には、一本鎖scFv、タンデムdi-scFv、ダイアボディ、タンデムtri-sdcFv、ミニボディ、等のいずれかの配向性も含まれる。抗体がscFvである場合などのいくつかの態様において、異種遺伝子の単一ポリヌクレオチドは、共に連結された重鎖および軽鎖の両方を含む単一ポリペプチドをコードする。抗体断片には、ナノボディ（例えば、sdAb、一対の重鎖可変ドメインなどの単一の単量体ドメインを有し、軽鎖のない抗体）もまた含まれる。多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体、等）が当技術分野で公知であり、本発明の異種遺伝子の発現産物として企図される。
いくつかの態様において、異種遺伝子はレポーター配列を含み、これは、例えば特定の細胞および組織における異種遺伝子の発現を検証するのに有用であり得る。導入遺伝子に提供され得るレポーター配列には、非限定的に、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ （LacZ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ (CAT)、ルシフェラーゼ、および当技術分野で周知の他のものをコードするDNA配列が含まれる。レポーター配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントと関連している場合、酵素アッセイ、放射線アッセイ、比色アッセイ、蛍光アッセイ、または他の分光学的アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、ならびに酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA)、ラジオイムノアッセイ (RIA)、および免疫組織化学的検査を含む免疫学的アッセイを含む、従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がLacZ遺伝子である場合、そのシグナルを保有するベクターの存在は、β-ガラクトシダーゼ活性のアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、そのシグナルを保有するベクターは、ルミノメーターで色または光の生成により視覚的に測定され得る。
いくつかの態様において、異種遺伝子はコード配列を含まない。shRNA、プロモーター、エンハンサー、DNAを標識するための配列（例えば、抗体認識のため）、PCR増幅部位、制限酵素部位を規定する配列、部位特異的リコンビナーゼ認識部位、核酸に結合するおよび／または核酸を修飾するタンパク質によって認識される配列、ならびにリンカーなどの非コード配列をベクターに含めてもよい。異種遺伝子がトランススプライシング分子である例では、非コード配列は、標的イントロンと結合する結合ドメインを含む。
いくつかの態様において、異種遺伝子は、0.1 Kb〜100 Kb長である（例えば、異種遺伝子は、0.2 Kb〜90 Kb、0.5 Kb〜80 Kb、1.0 Kb〜70 Kb、1.5 Kb〜60 Kb、2.0 Kb〜50 Kb、2.5 Kb〜45 Kb、3.0 Kb〜40 Kb、3.5 Kb〜35 Kb、4.0 Kb〜30 Kb、4.5 Kb〜25 Kb、4.6 Kb〜24 Kb、4.7 Kb〜23 Kb、4.8 Kb〜22 Kb、4.9 Kb〜21 Kb、5.0 Kb〜20 Kb、5.5 Kb〜18 Kb、6.0 Kb〜17 Kb、6.5 Kb〜16 Kb、7.0Kb〜15 Kb、7.5 Kb〜14 Kb、8.0 Kb〜13 Kb、8.5 Kb〜12.5 Kb、9.0 Kb〜12.0 Kb、9.5 Kb〜11.5 Kb、または10.0 Kb〜11.0 Kb長、例えば、0.1 Kb〜0.5 Kb、0.5 Kb〜1.0 Kb、1.0 Kb〜2.5 Kb、2.5 Kb〜4.5 Kb、4.5 Kb〜8 Kb、8 Kb〜10 Kb、10 Kb〜15 Kb、15 Kb〜20 Kb長、またはそれ以上、例えば0.1 Kb〜0.25 Kb、0.25 Kb〜0.5 Kb、0.5 Kb〜1.0 Kb、1.0 Kb〜1.5 Kb、1.5 Kb〜2.0 Kb、2.0 Kb〜2.5 Kb、2.5 Kb〜3.0 Kb、3.0 Kb〜3.5 Kb、3.5 Kb〜4.0 Kb、4.0 Kb〜4.5 Kb、4.5 Kb〜5.0 Kb、5.0 Kb〜5.5 Kb、5.5 Kb〜6.0 Kb、6.0 Kb〜6.5 Kb、6.5 Kb〜7.0 Kb、7.0 Kb〜7.5 Kb、7.5 Kb〜8.0 Kb、8.0 Kb〜8.5 Kb、8.5 Kb〜9.0 Kb、9.0 Kb〜9.5 Kb、9.5 Kb〜10 Kb、10 Kb〜10.5 Kb、10.5 Kb〜11 Kb、11 Kb〜11.5 Kb、11.5 Kb〜12 Kb、12 Kb〜12.5 Kb、12.5 Kb〜13 Kb、13 Kb〜13.5 Kb、13.5 Kb〜14 Kb、14 Kb〜14.5 Kb、14.5 Kb〜15 Kb、15 Kb〜15.5 Kb、15.5 Kb〜16 Kb、16 Kb〜16.5 Kb、16.5 Kb〜17 Kb、17 Kb〜17.5 Kb、17.5 Kb〜18 Kb、18 Kb〜18.5 Kb、18.5 Kb〜19 Kb、19 Kb〜19.5 Kb、19.5 Kb〜20 Kb、20 Kb〜21 Kb、21 Kb〜22 Kb、22 Kb〜23 Kb、23 Kb〜24 Kb、24 Kb〜25 Kb長、またはそれ以上、例えば、約4.5 Kb、約5.0 Kb、約5.5 Kb、約6.0 Kb、約6.5 Kb、約7.0 Kb、約7.5 Kb、約8.0 Kb、約8.5 Kb、約9.0 Kb、約9.5 Kb、約10 Kb、約11 Kb、約12 Kb、約13 Kb、約14 Kb、約15 Kb、約16 Kb、約17 Kb、約18 Kb、約19 Kb、長さ約20 Kb長、またはそれ以上である)。
制御エレメント
末端反復配列（例えば、DDエレメント）および異種遺伝子に加えて、本発明のDNAベクター（例えば、本明細書に記載される環状DNAベクター)は、標的細胞における転写、翻訳、および/または発現を可能にする様式で異種遺伝子に機能的に連結されている、必要な従来の制御エレメントを含み得る。
発現制御配列には、適切な転写開始、終止、プロモーター、およびエンハンサー配列；効率的なRNAプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリA）シグナルなど；細胞質mRNAを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を高める配列；ならびにコードされる産物の分泌を高める配列が含まれる。天然、構成的、誘導性、および／または組織特異的であるプロモーターを含む様々な発現制御配列が当技術分野で公知であり、本発明の一部として利用され得る。プロモーター領域がその遺伝子の転写に影響を及ぼすことができ、その結果、結果として生じた転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得る場合、プロモーター領域は異種遺伝子に機能的に連結されている。本明細書に記載されるDNAベクターの一部として有用なプロモーターには、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターが含まれる。構成的プロモーターの例には、サイトメガロウイルス (CMV) プロモーター（任意にCMVエンハンサーを伴う）、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス (RSV) LTRプロモーター（任意にRSVエンハンサーを伴う）、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ (PGK) プロモーター、およびEF1 aプロモーターが含まれる。
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度などの環境因子、もしくは特定の生理学的状態の存在、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態により、または複製細胞においてのみ調節され得る。誘導性プロモーターおよび誘導系は、種々の商業的供給源から入手可能である。他の多くの系が記載されており、当業者によって容易に選択され得る。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン (MT) プロモーター、デキサメタゾン誘導性マウス乳癌ウイルスプロモーター、T7ポリメラーゼプロモーター系、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制系、テトラサイクリン誘導系、RU486誘導系、およびラパマイシン誘導系が含まれる。この文脈で有用であり得るさらに他の種類の誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態により、または複製細胞においてのみ調節されるものである。
別の態様では、異種遺伝子の天然プロモーターが使用される。異種遺伝子の発現が天然発現を模倣することが望ましい場合、天然プロモーターが好ましいと考えられる。異種遺伝子の発現が、時間的もしくは発生的に、または組織特異的な様式で、または特定の転写刺激に応答して調節されなければならない場合、天然プロモーターが使用され得る。さらなる態様では、天然発現を模倣するために、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、またはコザックコンセンサス配列などの他の天然の発現制御エレメントもまた使用され得る。
タンパク質をコードする異種遺伝子に関して、ポリアデニル化 (pA) 配列は、異種遺伝子の後かつ末端反復配列の前に挿入され得る。本開示において有用な異種遺伝子はまた、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と異種遺伝子との間に位置するイントロンを含み得る。イントロンおよび他の一般的なベクターエレメントの選択は慣習的であり、多くのそのような配列が利用可能である。
宿主細胞における遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種、組織、または細胞型によって変動し得るが、一般に、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する5'非転写配列および5'非翻訳配列、例えば、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列、エンハンサーエレメント、および同様のものなどを含むものとする。特に、そのような5'非転写調節配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列はまた、所望により、エンハンサー配列または上流の活性化配列を含み得る。本開示のベクターは、任意に、5'リーダー配列またはシグナル配列を含み得る。
III. 生成の方法
合成DNAベクター（例えば、本明細書に記載される環状DNAベクター、および／またはDDエレメントを有するDNAベクター）を生成する方法が、本明細書において提供される。特に、本明細書において提供される方法は、細菌細胞合成によるのではなく、インビトロ合成（例えば、細胞の非存在下）を伴う。DNAベクター（例えば、本明細書に記載される環状DNAベクター、および／またはDDエレメントを含むDNAベクター）のインビトロ合成は、ファージポリメラーゼ（例えば、Phi29ポリメラーゼ）などのポリメラーゼを使用する効果的な複製に依存する。いくつかの態様において、Phi29ポリメラーゼは、DDエレメントなどの末端反復配列の複製を処理するのに特に有用である。本明細書で用いられるポリメラーゼは、GCリッチな残基による高い処理能力を有する好熱性ポリメラーゼであってよい。いくつかの態様において、DDエレメントを複製（例えば、増幅）するために用いられるポリメラーゼは、Phi29ポリメラーゼである。本発明のDNAベクターを生成する特定の方法は、以下の実施例に詳細に記載されている。
一般に、本発明のDNAベクター（例えば、本明細書に記載される環状DNAベクター）の生成は、異種遺伝子および末端反復配列（例えば、DDエレメント）を有するAAVゲノム（例えば、rAAVゲノム）を含む環状DNA分子を有する試料を提供することから始めることができる。例えば、試料は、AAVベクター（例えば、rAAVベクター）に感染した細胞（例えば、哺乳動物細胞）からの溶解物または他の調製物であってよい。二本鎖環状DNAは、標準的なDNA抽出／単離技法を用いて細胞から得ることができる。いくつかの態様では、例えばplasmid-safe DNaseを用いて線状DNAを特異的に分解して、環状DNAを精製する。
次に、DNAをポリメラーゼ（例えば、ファージポリメラーゼ、例えば、Phi29 DNAポリメラーゼ；TempliPhiキット、GE Healthcare）、プライマー（例えば、ランダムプライマー）、ならびにヌクレオチド混合物（例えば、dNTP、例えば、dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP）と共にインキュベートすることにより、AAVゲノムを有する二本鎖環状DNAをインビトロで、無細胞調製物中で増幅することができる。ポリメラーゼ（例えば、ファージポリメラーゼ、例えば、Phi29ポリメラーゼ）は、ローリングサークル増幅（例えば、等温ローリングサークル増幅）によってAAVゲノム（例えば、インタクトな末端反復配列、例えばDDエレメントを含むAAVゲノム）を増幅して、複数のAAVゲノムコピーを有する線状コンカテマーを作製する。適切なポリメラーゼには、好熱性ポリメラーゼ、およびGCリッチな残基による高い処理能力を特徴とするポリメラーゼが含まれる。
結果として生じたコンカテマーを制限酵素を用いて消化してゲノム内で1回切断し、異種遺伝子および末端反復配列（例えば、DDエレメント）を含む単位長線状AAVゲノムを作製することができる。この線状DNA分子の自己ライゲーションにより、異種遺伝子およびインタクトな末端反復配列（例えば、DDエレメント）を備えた、本発明の環状の合成DNAベクターが得られる。あるいは、自己ライゲーションの前に、公知の技法に従って線状DNA分子をプラスミドベクターにクローニングし、以下の実施例において例証されるように、最終的なDNAベクター（例えば、本明細書に記載されるような環状ベクター、および／またはDD含有DNAベクター）を形成するための自己ライゲーションの前に特徴づけることができる。
ゲノムの複製および増幅は、無細胞条件下でポリメラーゼを用いて実施可能であるため、合成DNAベクターを、それがクローニングされたプラスミドの細菌成分から単離することができ、細菌CpGモチーフなどの細菌シグネチャーは、単離されたベクターには存在しない。
IV. 薬学的組成物
薬学的に許容される担体中に、本明細書に記載されるDNAベクター（例えば、合成DNAベクター）（例えば、DDエレメントを含むDNAベクター、および／または上記の環状DNAベクター）のいずれかを含む薬学的組成物が、本明細書において提供される。本明細書に記載される薬学的組成物は、ウイルス粒子、ウイルスキャプシドタンパク質、またはそのペプチド断片などの混入物を実質的に欠いている。いくつかの態様において、本明細書において提供される薬学的組成物は、非免疫原性である。例えば、非免疫原性の薬学的組成物は、自然免疫系の細胞によって認識可能な病原体関連分子パターンを実質的に欠いている可能性がある。そのような病原体関連分子パターンには、CpGモチーフ（例えば、非メチル化CpGモチーフまたは低メチル化CpGモチーフ）、エンドトキシン（例えば、リポ多糖 (LPS)、例えば、細菌LPS）、フラジェリン、リポテイコ酸、ペプチドグリカン、および二本鎖RNAなどのウイルス核酸分子が含まれる。
本明細書に記載される薬学的組成物は、従来法により混入について評価し、適切な投与経路を意図した薬学的組成物に製剤化することができる。DNAベクターを含むさらに他の組成物を、適切な担体と共に、同様に製剤化してもよい。そのような製剤化は、特に標的細胞への投与を対象にした、薬学的および／または生理学的に許容される媒体または担体の使用を伴う。1つの態様において、標的細胞への投与に適した担体には、緩衝生理食塩水、等張塩化ナトリウム溶液、またはpHを適切な生理学的レベルに維持するための他の緩衝液、例えばHEPES、および任意に、他の薬剤、薬学的物質、安定剤、緩衝液、担体、補助剤、または希釈剤が含まれる。
いくつかの態様において、担体は注射用液である。例示的な生理学的に許容される担体には、無菌でパイロジェンフリーの水および無菌でパイロジェンフリーのリン酸緩衝生理食塩水が含まれる。種々のそのような公知の担体は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,629,322号に提供されている。1つの態様において、担体は等張塩化ナトリウム溶液である。別の態様において、担体は平衡塩溶液である。1つの態様において、担体にはtweenが含まれる。ベクターを長期間貯蔵しようとする場合には、それをグリセロールまたはTween20の存在下で凍結することができる。
他の態様において、本明細書に記載されるベクターを含む組成物は、界面活性剤を含む。プルロニックF68（ポロキサマー188、LUTROL（登録商標）F68としても公知である）などの有用な界面活性剤は、AAVが不活性表面に付着するのを防ぎ、従って所望の用量の送達を確実にするため、これを含めてもよい。担体は、等張塩化ナトリウム溶液であり、界面活性剤プルロニックF68を含む。
本開示の組成物を適切な宿主細胞に導入するために、リポソーム、ナノ粒子、微粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、小胞、および同様のものなどの送達媒体を使用することができる。特に、DNAベクターは、脂質粒子、リポソーム、小胞、またはナノ粒子中に封入することにより、送達用に製剤化することができる。いくつかの態様において、DNAベクターは、ポロキサマーおよび／またはポリカチオン性物質などの送達媒体と複合化される。
本発明のDNAベクター（例えば、本明細書に記載される環状DNAベクター、および/またはDDエレメントを含むDNAベクター）のいずれかを有する薬学的組成物は、10μg〜10 mgのDNA（例えば、25μg〜5.0 mg、50μg〜2.0 mg、または100μg〜1.0 mgのDNA、例えば、10μg〜20μg、20μg〜30μg、30μg〜40μg、40μg〜50μg、50μg〜75μg、75μg〜100μg、100μg〜200μg、200μg〜300μg、300μg〜400μg、400μg〜500μg、500μg〜1.0 mg、1.0 mg〜5.0 mg、または5.0 mg〜10 mgのDNA、例えば、約10μg、約20μg、約30μg、約40μg、約50μg、約60μg、約70μg、約80μg、約90μg、約100μg、約150μg、約200μg、約250μg、約300μg、約350μg、約400μg、約450μg、約500μg、約600μg、約700μg、約750μg、約1.0 mg、約2.0 mg、約2.5 mg、約5.0 mg、約7.5 mg、または約10 mgのDNA）の量を含む単位用量を含み得る。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、少なくとも約0.01重量%のDNAベクターを含む。例えば、薬学的組成物は、0.01重量%〜80重量%のDNAベクター（例えば、0.05重量%〜50重量%、0.1重量%〜10重量%、0.5重量%〜5重量%、または1重量%〜2.5重量%のDNAベクター、例えば、0.01重量%〜0.05重量%、0.05重量%〜0.1重量%、0.1重量%〜0.5重量%、0.5重量%〜1.0重量%、1.0重量%〜2重量%、2重量%〜3重量%、3重量%〜5重量%、5重量%〜10重量%、10重量%〜20重量%、または20重量%〜50重量%のDNAベクター）を含み得る。
本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載される合成環状DNAベクターのいずれかを単量体型で含み得る（例えば、50%超の単量体、60%超の単量体、70%超の単量体、80%超の単量体、90%超の単量体、95%超の単量体、97%超の単量体、98%超の単量体、または99%超の単量体）。いくつかの態様において、薬学的組成物中の合成環状DNAベクター分子の70%〜99.99%が単量体である（例えば、薬学的組成物中の合成環状DNAベクター分子の70%〜99.9%、70%〜99.5%、70%〜99%、75%〜99.9%、75%〜99.5%、75%〜99%、80%〜99.9%、80%〜99.5%、80%〜99%、85%〜99.9%、85%〜99.5%、85%〜99%、90%〜99.9%、90%〜99.5%、90%〜99%、95%〜99.9%、95%〜99.5%、または95%〜99%が単量体である、例えば、薬学的組成物中の合成環状DNAベクター分子の約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、または99.9%が単量体である)。
V. 使用方法
本明細書に記載されるDNAベクター（例えば、本明細書に記載される環状DNAベクター、および／もしくはDDエレメントを含むDNAベクター）またはその薬学的組成物のいずれかを対象に投与することにより、（例えば、遺伝子治療レジメンの一部として）それを必要とする対象において異種遺伝子の発現（例えば、エピソーム発現）を誘導する方法が、本明細書において提供される。異種遺伝子を含む対象の細胞は、宿主細胞の核酸配列（例えば、RNA配列、例えば、mRNA配列）をサザンブロッティングまたはPCR解析などによって調べて、ベクター中に含まれる異種遺伝子の存在についてアッセイすることにより、特徴づけることができる。あるいは、対象における異種遺伝子の発現は、異種遺伝子に対応する標的遺伝子の欠陥または変異に関連する疾患の進行をモニターすることによって、（例えば、定量的または定性的に）特徴づけることができる。いくつかの態様において、異種遺伝子の発現（例えば、エピソーム発現）は、疾患に関連する1つまたは複数の症状の減退を観察することによって確認される。
したがって、本発明は、本明細書に記載されるDNAベクター（例えば、本明細書に記載される環状DNAベクター、および／もしくはDDエレメントを含むDNAベクター）またはその薬学的組成物のいずれかを対象に投与することにより、標的遺伝子（例えば、異種遺伝子に対応する遺伝子）の欠陥に関連する対象の疾患を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、疾患は眼疾患である。いくつかの態様において、対象は、異種CEP290遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、レーバー先天性黒内障（LCA、例えば、LCA 10)の処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種ABCA4遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、シュタルガルト病の処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種ABCC6遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、弾性線維性仮性黄色腫の処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種RIMS1遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、杆体錐体ジストロフィー（例えば、杆体錐体ジストロフィー7)の処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種LRP5遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、滲出性硝子体網膜症の処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種CC2D2A遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、ジュベール症候群の処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種TRPM1遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、CSNB-1Cの処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種C3遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、加齢黄斑変性の処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種IFT172遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、網膜色素変性症71の処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種COL11A1遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、スティックラー症候群（例えば、スティックラー症候群2）の処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種TUBGCP6遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、小頭症および網脈絡膜症の処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種KIAA1549遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、網膜色素変性症（例えば、劣性RP）の処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種CACNA1F遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、CSNB 2の処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種MYO7A遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、アッシャー症候群（例えば、アッシャー症候群1B型）の処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種VCAN遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、ワグナー症候群の処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種USH2A遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、アッシャー症候群2A型の処置を受けている。いくつかの態様において、対象は、異種HMCN1遺伝子またはその一部（例えば、トランススプライシング分子の一部として）を有するDNAベクターを用いて、AMD 1の処置を受けている。
本発明のベクター（例えば、本明細書に記載される環状DNAベクター、および/またはDDエレメントを含むDNAベクター）のいずれかを、10μg〜10 mgのDNA（例えば、25μg〜5.0 mg、50μg〜2.0 mg、または100μg〜1.0 mgのDNA、例えば、10μg〜20μg、20μg〜30μg、30μg〜40μg、40μg〜50μg、50μg〜75μg、75μg〜100μg、100μg〜200μg、200μg〜300μg、300μg〜400μg、400μg〜500μg、500μg〜1.0 mg、1.0 mg〜5.0 mg、または5.0 mg〜10 mgのDNA、例えば、約10μg、約20μg、約30μg、約40μg、約50μg、約60μg、約70μg、約80μg、約90μg、約100μg、約150μg、約200μg、約250μg、約300μg、約350μg、約400μg、約450μg、約500μg、約600μg、約700μg、約750μg、約1.0 mg、約2.0 mg、約2.5 mg、約5.0 mg、約7.5 mg、または約10 mgのDNA）の投薬量で対象に投与することができる
いくつかの態様において、本発明のDNAベクター（例えば、本明細書に記載される環状DNAベクター、および/もしくはDDエレメントを含むDNAベクター）またはその組成物の投与は、非免疫原性であるか、または他の遺伝子治療ベクター（例えば、プラスミドDNAベクターおよびウイルスベクター）の投与と比較して、対象において免疫応答を誘導する可能性が低い。ベクターの免疫原性を評価する方法は、上記されている。
本明細書において提供される合成DNAベクター（例えば、本明細書に記載される環状DNAベクター、および／またはDDエレメントを含むDNAベクター）は、上記のように、免疫応答を誘発せずに、またはAAVベクターと比較して減少した免疫応答を誘導して、標的細胞を感染させる能力に起因して、反復投与に適していると考えられる。したがって、本発明は、本明細書に記載されるベクターおよび薬学的組成物を反復投与する方法を提供する。前述の投与量のいずれかを、適切な頻度および期間で反復することができる。いくつかの態様において、対象は、1日に約2回、1日に約1回、1週間に約5回、1週間に約4回、1週間に約3回、1週間に約2回、1週間に約1回、1ヶ月に約2回、1ヶ月に約1回、6週間に約1回、2ヶ月に約1回、3ヶ月に約1回、4ヶ月に約1回、1年に2回、1年に1回、またはそれ未満の頻度で用量を受け取る。いくつかの態様において、用量の数および頻度は、標的細胞の代謝回転率に対応する。本明細書に記載されるベクターを用いてトランスフェクトされた長寿命の分裂後の標的細胞において、ベクターの単一用量は、標的細胞内で異種遺伝子の発現を実質的な期間維持するのに十分であり得ることが理解されるであろう。したがって、他の態様において、本明細書において提供されるDNAベクターは、単一用量で対象に投与してもよい。異種核酸が対象に送達される機会の数は、臨床的（例えば、治療的）利点を維持するために必要とされるものであり得る。
本発明の方法は、任意の適切な経路を介した、DNAベクター（例えば、本明細書に記載される環状DNAベクター、および／もしくはDDエレメントを含むDNAベクター）またはその薬学的組成物の投与を含む。DNAベクターまたはその薬学的組成物は、全身にまたは局所的に、例えば、静脈内に、眼内に（例えば、硝子体内に、網膜下に、点眼により、眼球内に、眼窩内に）、筋肉内に、硝子体内に（例えば、硝子体内注射により）、皮内に、肝内に、脳内に、筋肉内に、経皮的に (percutaneously)、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、くも膜下腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、腫瘍内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、経口的に、局所に、経皮的に (transdermally)、吸入により、エアロゾル化により、注射により（例えば、ジェット注射により）、エレクトロポレーションにより、埋め込みにより、注入により（例えば、持続注入により）、標的細胞を直接浸す局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリーム中で、または脂質組成物中で投与することができる。
付加的にまたは代替的に、ベクターを、個々の患者から細胞を外植するなどしてエクスビボで宿主細胞に投与し、その後、例えばベクターを組み込んだ細胞を選択した後に、宿主細胞を患者に再移植することができる。したがって、いくつかの局面において、本開示は、疾患を処置するためのトランスフェクトされた宿主細胞およびその投与方法を提供する。
本明細書に記載されるベクターのいずれかのトランスフェクション効率の評価は、当技術分野で公知であるかまたは本明細書に記載される任意の方法を用いて行うことができる。トランスフェクトされた細胞の単離もまた、標準的な技法に従って行うことができる。例えば、異種遺伝子を含む細胞は、異種遺伝子を含む1つまたは複数の細胞の同定および単離に役立つ、異種遺伝子の配列によってコードされる、蛍光タンパク質（例えば、GFP）または他のレポータータンパク質などの可視マーカーを発現し得る。異種遺伝子を含む細胞はまた、該遺伝子から選択可能なマーカーを発現し得る。例えば、細胞毒性物質への曝露、または通常生存に必要とされる栄養素もしくは基質の欠乏といった、ある特定の条件下での細胞の生存は、選択可能なマーカーの発現または発現の欠如に依存し得る。したがって、そのような条件下での細胞の生存または生存の欠如により、異種遺伝子を含む細胞または細胞のコロニーの同定および単離が可能になる。異種遺伝子を含む細胞はまた、宿主細胞の核酸配列（例えば、RNA配列、例えば、mRNA配列）をサザンブロッティングまたはPCR解析などによって調べて、ベクター中に含まれる異種遺伝子の存在についてアッセイすることにより、特徴づけることができる。
以下の実施例は、本明細書に記載される態様の範囲を限定しない。当業者は、以下の実施例において、本発明の精神および範囲によって包含されることが意図される改変を行うことができることを認識するであろう。
組換えAAV (rAAV) ベクターは、種々のモデル系において高効率遺伝子導入の実績が確立されており、現在、幅広いヒト疾患の治療様式として試験が行われている。動物およびヒトにおける研究により、rAAVベクターゲノムが主に環状エピソームとしてインビボで持続することが示されている。本発明は、環状DNAベクターを生成するために合成技法を用いて、そのような持続性を再現することができるという発見に基づく。動物およびヒトの両方から単離されたrAAVエピソームゲノムの分子解析により、これらの環状ゲノムが末端反復配列を含むことが明らかになる。以下の実施例のいくつかにおいて、rAAVエピソームゲノム内で同定された末端反復配列は、二重D（DD） エレメントを含み、これは、図1に示されるように、線状AAVゲノムの各末端に位置する逆位末端反復 (ITR) の組換えの結果である。細菌内で生成されたDNAは、インビボでのプラスミドおよび遺伝子発現の喪失を引き起こし得る固有の細菌シグネチャー（CpGモチーフ）ならびに細菌自体からの不純物（エンドトキシン、細菌ゲノムDNAおよびRNA）を含むため、そのような合成DNAベクターは、細菌内で作製されたベクターと比較して、宿主における免疫原性および炎症を軽減することができる。
実施例1. DDエレメントを有するDNAベクターの合成による生成
段階1−rAAV2-eGFPウイルスの生成およびその後の細胞形質導入
eGFPタンパク質を駆動するCMVエンハンサー／プロモーターとBGHpAシグナルからなる発現カセットに隣接するAAV2 ITRを含むプラスミドpAAV-BASIC-EGFPを入手した（Vector Biolabs、Malvern, PA）。このプラスミドをHEK293T細胞における三重トランスフェクション戦略で使用して、rAAV2-eGFPウイルスベクターを生成した。三重トランスフェクションで使用した他の2種類のプラスミドは、AAVヘルパープラスミドpRep-Cap2（Part No. 0912；Applied Viromics、Fremont，CA）およびpHELP（Part No. 0913；Applied Viromics、Fremont，CA）であった。細胞は、リン酸カルシウムキット（Profection哺乳動物トランスフェクションシステム、Part No. TM012；Promega、Madison, WI）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、細胞を凍結／融解によって溶解し、ベンゾナーゼで処理して粗製ウイルス溶解物を作製した。粗製溶解物中のウイルス力価は、qPCRにより5.3×1012個のDNase耐性粒子 (DRP)/mLと決定された。環状rAAVゲノムを作製するために、HEK293T細胞にrAAV2-eGFPウイルスを1×105の感染多重度 (MOI) で感染させた。図4はこの過程を要約している。
段階2‐DDエレメントを有するrAAVゲノムのクローニングおよび特徴づけ
DDエレメントを有するrAAVゲノムのクローニングおよび特徴づけの要約を、図5に示す。感染細胞を感染の7日後に収集し、DNeasy血液および組織キット（Qiagen；Germantown, MD）を用いて全細胞DNAを細胞から抽出した。残存する線状rAAVゲノムを除去するために、線状DNAを特異的に分解し、二本鎖環状rAAVゲノムをそのままにしておくplasmid-safe DNase（Lucigen、Middleton, WI）でDNAを処理した。残存する環状rAAVゲノムを、TEMPLIPHI（商標）キット（Part No. 25640010、GE Healthcare；Pittsburgh, PA）を用いて増幅した。TEMPLIPHI（商標）キットは、バクテリオファージPhi29 DNAポリメラーゼを使用する環状DNAの指数関数的増幅のために等温ローリングサークル増幅 (RCA) を用いるPhi29ポリメラーゼを含む。Phi29増幅の結果は、DNAの長い線状コンカテマーである。このDNAを次いで、rAAVゲノム内で1回切断する酵素 (EcoRI) で消化して単位長ゲノムを生成し、これをpBlueScript II KS+プラスミド（Part No. 212207、Agilent Technologies；Chicago, IL）にクローニングする。
結果として生じたクローン内のDDエレメントを配列決定し、クローン「TG-18」は、165 bp長のインタクトなDDエレメント（欠失も再構成もない）を有すると同定された。クローンTG-18の配列を図6Aに示す。
段階3‐DDベクター生成用の鋳型の作製
DDエレメントを含むrAAVゲノム（クローンTG-18）が同定されたため、次の段階は、DDベクターの下流生成のための環状鋳型を生成することであった。プラスミドTG-18を制限酵素EcoRIで消化し、プラスミド骨格から線状の単位長rAAVゲノムを放出させた。線状断片を次いで自己ライゲーションさせて（DNAの異種片とライゲーションさせるのではなく）、環状rAAVゲノムを再構築した。環状産物を形成するようにライゲーションされなかった任意の線状断片は、plasmid-safe DNase処理によって除去した。この過程の図解を図7に示す。
段階4‐試験管内でのDDベクターの生成
段階3で生成された環状rAAVゲノムは、細菌に由来し、宿主において持続性を低下させる、かつ／または免疫原性である可能性を有する細菌シグネチャーを含む。段階4では、試験管内でこの環状鋳型を増幅して、細菌シグネチャーおよび混入物を欠いた、より多くのrAAVゲノムを作製する。これは、細菌内で生成される従来の遺伝子導入ベクターに勝る利点である。試験管生成のために、環状鋳型を、TEMPLIPHI（商標）キット（Part# 25640010、GE Healthcare、Pittsburgh, PA）を用いて増幅する。TEMPLIPHI（商標）キットは、バクテリオファージPhi29 DNAポリメラーゼを使用する環状DNAの指数関数的増幅のために等温ローリングサークル増幅 (RCA) を用いるPhi29ポリメラーゼを含む。Phi29増幅の結果は、DNAの長い線状コンカテマーである。DDエレメントがPhi29 DNAポリメラーゼで忠実に複製されたかどうかを確かめるために、増幅されたDNAを調べた。結果を図8に示す。
増幅されたDNAを最初に、DDエレメントの両側で切断して（図9）244 bp長の断片を放出するSwaIで消化した。増幅DNAからのSwaI断片は、元のTG-18 pBlueScriptプラスミドからのSwaI断片と同じ大きさであり（図10、矢印）、Phi29がDDエレメントを増幅できることが示された。増幅されたDDエレメントの完全性を、DDエレメント内で切断するAhdIによる消化によってさらに解析した。AhdIは、DDベクター内で1回切断し、図11（矢印）において実証されるように、コンカテマーDNAを2.1 kbの単位長ゲノムに消化する。
DDベクター内のDDエレメントが忠実に増幅され得ることが実証されたため、次の段階は、最終的な環状DDベクター産物を作製することであった。生成戦略の概要を図12〜14に示す。段階3で生成された環状rAAVゲノムを、バクテリオファージPhi29 DNAポリメラーゼを使用する環状DNAの指数関数的増幅のために等温RCAを用いるPhi29ポリメラーゼを使用して増幅する。Phi29増幅の結果は、DNAの長い線状コンカテマーである（図13A）。このDNAを次いで、rAAVゲノム内で1回切断する酵素 (EcoRI) で消化して、AAVゲノム（すなわち、単位長AAVゲノム；図13A）を生成する。このAAVゲノムを次いで自己ライゲーションさせて、環状rAAVゲノムを再構築する（図14A）。環状産物を形成するようにライゲーションされなかった任意の線状断片は、plasmid-safe DNase処理によって除去した。
段階5‐DDベクターの遺伝子発現の確認
インビトロ生成過程における最後の段階は、DDベクターが生物学的に活性がある（すなわち、培養細胞において導入遺伝子を発現する）ことを確認することである。eGFP発現カセットを異種遺伝子として含むDD含有DNAベクターを、Lipofectamine2000（Life Technologies、Carlsbad, CA）を用いてHEK293T細胞にトランスフェクトした。細胞を、48時間後に、免疫蛍光（図15Aおよび15B）またはウェスタンブロッティング（図16）によりGFP発現について解析した。
実施例2. 環状DNAベクターの合成による生成
細菌プラスミドDNA配列を含まず、試験管内で完全に合成された（細菌内での複製を必要としない）単量体DNAベクターが生成された。したがって、合成DNAベクターは、ウイルス自体を必要とせずに、AAVウイルスDNAのように挙動する導入遺伝子DNAを所与の標的細胞に付与することができる。この戦略は、ウイルスベクターに勝るいくつかの利点をもたらす。第一に、一般的なウイルスベクターにパッケージングするには大きすぎる遺伝子を送達することが可能になる。さらに、免疫反応を誘発して別のウイルスベクターの反復投与を妨げるウイルスタンパク質がないため、反復投与が可能になる。加えて、インビトロ合成過程は、他のウイルスベクターと比較して、より効率的な製造のためのより大きな可能性を有する。
合成環状DNAベクターを作製するための例示的な過程を図17に示す。phi29ポリメラーゼを用いてスーパーコイル単量体DNA鋳型の増幅を行い、反復するDNA断片間の境界を規定する制限部位を有する線状コンカテマーDNAを作製した。コンカテマーを、DNAを単位長断片に切断する制限酵素を用いて消化した。次に、DNAリガーゼを添加してDNA断片の自己ライゲーションを誘導し、弛緩型開環状DNA単量体およびスーパーコイルDNA単量体を含むDNA構造の混合物を作製した。この混合物を、プラスミドDNAのスーパーコイル状共有結合閉環型を開環型から分離することができる選択性を有するチオフィリック芳香族吸着クロマトグラフィー樹脂（Plasmidselect Xtra、GE Healthcare 28-4024-01）を用いてカラム精製した。この精製から得られたスーパーコイルDNA単量体を回収したが、これは、本明細書に記載される方法において使用することができ、または代替的に、さらなる増幅のための鋳型として役立ち得る。
実施例3. インビボ持続性の特徴づけ‐GFP発現
本発明の合成環状DNAベクターの持続性の程度を特徴づけるために、マウスに、それぞれ異なるDNAベクター：(1) 持続性の陰性対照としてのプラスミドCAG-GFP (SEQ ID NO: 42)；(2) ΔDD CAG-GFP（DDエレメントを欠いた合成環状DNAベクター）；および (3) DD CAG-GFP（DDエレメントを有する合成環状DNAベクター）を含む3種の組成物を投与する。各群は合計32匹のマウス（各時点につき8匹のマウス）を含み、各組成物を水圧注射によりマウス1匹当たり10μgのDNAで投与する。各群からのマウス8匹を、以下の時点：2週間、4週間、8週間、および16週間のそれぞれにおいて屠殺し、各時点で肝組織を収集し処理する。肝細胞におけるGFPの発現を、公知の方法に従って定量化し、各時点において群間で比較する。合成環状CAG-GFPを投与されたマウスからの肝細胞が、プラスミドCAG-GFPを投与されたマウスからの肝細胞と比較してより高レベルのGFPを発現する場合、合成環状CAG-GFPは持続性が高いと判断される。
実施例4. インビボ持続性の特徴づけ‐mSEAP発現
本発明の合成環状DNAベクターの持続性の程度を特徴づけるための別の研究は、マウスでは内因的に発現されないマウス分泌アルカリホスファターゼ (mSEAP) の異種発現を伴う。この実験では、マウスに、それぞれ異なるDNAベクター：(1) 持続性の陰性対照としてのプラスミドCAG-mSEAP；(2) CpGモチーフを欠くプラスミドCAG-mSEAP-ΔCpG；(3) DDエレメントおよびCpGモチーフを欠くΔDD CAG-mSEAP-ΔCpG；ならびに (4) DDエレメントを含み、CpGモチーフを欠くDD CAG-mSEAP ΔCpGを含む4種の組成物を投与する。各群は12匹のマウスを含み、各組成物を水圧注射によりマウス1匹当たり20μgのDNAで投与する。各群からのマウス2匹を、以下の時点：2週間、4週間、8週間、12週間、16週間、および24週間のそれぞれにおいて屠殺し、200μLの血液を採取する。mSEAPの血清濃度を、公知の方法に従って各試料中で定量化し、各時点において群間で比較する。
実験群間でmSEAP濃度を比較することにより、持続性に及ぼすCpGモチーフおよび／またはDDエレメントの効果を定量化する。例えば、血清mSEAPレベルは、初期の時点では実験群間でほぼ同等である；しかしながら、より高い持続性を有するベクターを投与されたマウスは、後期の時点でより高いmSEAP濃度を示す。
態様の列挙
本明細書に記載される技術のいくつかの態様は、以下の番号付けされた項目のいずれかに従って規定され得る：
1. 二重D (DD) エレメントを含む単離されたDNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いているDNA分子。
2. 細菌プラスミドDNAを欠いている、項目1のDNAベクター。
3. 免疫原性細菌シグネチャーおよび／またはRNAポリメラーゼ停止部位を欠いている、項目1または2のいずれか一つのDNAベクター。
4. DDエレメントならびに細菌の複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を含む、単離されたDNAベクター。
5. 1つまたは複数の異種遺伝子をさらに含む、項目1〜4のいずれか一つのDNAベクター。
6. 異種遺伝子が4.5 Kb長を上回る、項目5のDNAベクター。
7. 環状ベクターである、項目1〜6のいずれか一つのDNAベクター。
8. 環状ベクターが単量体環状ベクターである、項目7のDNAベクター。
9. 1つまたは複数の異種遺伝子の上流にプロモーター配列を含む、項目6〜8のいずれか一つのDNAベクター。
10. 1つまたは複数の異種遺伝子の下流にポリアデニル化部位を含む、項目6〜9のいずれか一つのDNAベクター。
11. 1つまたは複数の異種遺伝子がトランススプライシング分子を含む、項目10のDNAベクター。
12. 以下のエレメント：(i) プロモーター配列；(ii) 1つまたは複数の異種遺伝子；(iii) ポリアデニル化部位；および (iv) DDエレメント、が5'から3'方向に機能的に連結されている、項目10または11のDNAベクター。
13. 以下の段階を含む、単離されたDNAベクターを生成する方法：(i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノムを含む環状DNA分子を含む試料を提供する段階、(ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；(iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、単位長線状DNA分子を作製する段階；ならびに (iv) 単位長線状DNA分子を自己ライゲーションさせて、異種遺伝子およびDDエレメントを含む単離されたDNAベクターを生成する段階。
14. 以下の段階を含む、単離されたDNAベクターを生成する方法：(i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノムを含む環状DNA分子を含む試料を提供する段階；(ii) 第1のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、第1の線状コンカテマーを作製する段階；(iii) 制限酵素を用いて第1の線状コンカテマーを消化して、第1の単位長線状DNA分子を作製する段階；(iv) 第1の単位長線状DNA分子をプラスミドベクターにクローニングする段階；(v) DDエレメントを含むプラスミドクローンを同定する段階；(vi) DDエレメントを含むプラスミドクローンを消化して、第2の単位長線状DNA分子を作製する段階；(vii) 第2の単位長線状DNA分子を自己ライゲーションさせて、環状DNA鋳型を生成する段階；(viii) 第2のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いて環状DNA鋳型を増幅して、第2の線状コンカテマーを作製する段階；(ix) 制限酵素を用いて第2の線状コンカテマーを消化して、第3の単位長線状DNA分子を作製する段階；ならびに (x) 第3の単位長線状DNA分子を自己ライゲーションさせて、異種遺伝子およびDDエレメントを含む単離されたDNAベクターを生成する段階。
15. ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅が等温ローリングサークル増幅である、項目13または14の方法。
16. ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、項目13〜15のいずれか一つの方法。
17. 以下の段階を含む、治療用DNAベクターを生成するインビトロ方法：(i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノムを含む環状DNA分子を含む試料を提供する段階；(ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；(iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、単位長線状DNA分子を作製する段階；ならびに (iv) 単位長線状DNA分子を自己ライゲーションさせて、異種遺伝子およびDDエレメントを含む治療用DNAベクターを生成する段階。
18. ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅が等温ローリングサークル増幅である、項目17の方法。
19. ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、項目17または18の方法。
20. 項目1〜12のいずれか一つのDNAベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
21. 非免疫原性である、項目20の薬学的組成物。
22. それを必要とする対象に項目1〜11のいずれか一つの単離されたDNAベクターまたは項目20もしくは21の薬学的組成物を投与する段階を含む、該対象において異種遺伝子のエピソーム発現を誘導する方法。
23. 対象に項目1〜12のいずれか一つの単離されたDNAベクターまたは項目20もしくは21の薬学的組成物の治療有効量を投与する段階を含む、該対象における障害を処置する方法。
24. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が反復投与される、項目22または23の方法。
25. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が局所投与される、項目22〜24のいずれか一つの方法。
26. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が硝子体内に投与される、項目25の方法。
27. 障害が眼障害である、項目22〜26のいずれか一つの方法。
28. 眼障害が、レーバー先天性黒内障 (LCA)、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、またはワグナー症候群である、項目22〜27のいずれか一つの方法。
以下の番号付けされた付加的な項目は、本明細書に記載される本発明のいくつかの態様をさらに規定する：
1. 1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いているDNAベクター。
2. 細菌プラスミドDNAを欠いている、項目1のDNAベクター。
3. 免疫原性細菌シグネチャーおよび／またはRNAポリメラーゼ停止部位を欠いている、項目1または2のいずれか一つのDNAベクター。
4. CpGアイランドを実質的に欠いている、項目1〜3のいずれか一つのDNAベクター。
5. 末端反復配列をさらに含む、項目1〜4のいずれか一つのDNAベクター。
6. 末端反復配列が少なくとも10 bp長である、項目5のDNAベクター。
7. 異種遺伝子が4.5 Kb長を上回る、項目1〜6のいずれか一つのDNAベクター。
8. 二本鎖である、項目1〜7のいずれかつのDNAベクター。
9. 二本鎖ベクターが単量体である、項目8のDNAベクター。
10. 1つまたは複数の異種遺伝子の上流にプロモーター配列を含む、項目1〜9のいずれか一つのDNAベクター。
11. 1つまたは複数の異種遺伝子の下流にポリアデニル化部位を含む、項目1〜10のいずれか一つのDNAベクター。
12. 1つまたは複数の異種遺伝子がトランススプライシング分子を含む、項目1〜11のいずれか一つのDNAベクター。
13. 以下のエレメント：(i) プロモーター配列；(ii) 1つまたは複数の異種遺伝子；(iii) ポリアデニル化部位；および (iv) 末端反復配列、が5'から3'方向に機能的に連結されている、項目11または12のDNAベクター。
14. 以下の段階を含む、単離されたDNAベクターを生成する方法：(i) 異種遺伝子を含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階、(ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；(iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、複数のAAVゲノムを作製する段階；および (iv) 複数のAAVゲノムの各々を自己ライゲーションさせて、異種遺伝子を含む単離されたDNAベクターを生成する段階。
15. AAVゲノムが末端反復配列を含む、項目14の方法。
16. 異種遺伝子を含む単離されたDNAベクターをカラム精製して、単離されたDNAベクターからスーパーコイルDNAを精製する段階をさらに含む、項目14または15の方法。
17. 以下の段階を含む、単離されたDNAベクターを生成する方法：(i) 異種遺伝子および末端反復配列を含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；(ii) 第1のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、第1の線状コンカテマーを作製する段階；(iii) 制限酵素を用いて第1の線状コンカテマーを消化して、第1のAAVゲノムを作製する段階；(iv) 第1のAAVゲノムをプラスミドベクターにクローニングする段階；(v) 末端反復配列を含むプラスミドクローンを同定する段階；(vi) 末端反復配列を含むプラスミドクローンを消化して、第2のAAVゲノムを作製する段階；(vii) 第2のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、環状DNA鋳型を生成する段階；(viii) 第2のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いて環状DNA鋳型を増幅して、第2の線状コンカテマーを作製する段階；(ix) 制限酵素を用いて第2の線状コンカテマーを消化して、第3のAAVゲノムを作製する段階；ならびに (x) 第3のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子および末端反復配列を含む単離されたDNAベクターを生成する段階。
18. ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅が等温ローリングサークル増幅である、項目14〜17のいずれか一つの方法。
19. ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、項目14〜18のいずれか一つの方法。
20. 以下の段階を含む、治療用DNAベクターを生成するインビトロ方法：(i) 異種遺伝子を含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；(ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；(iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、AAVゲノムを作製する段階；および (iv) AAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子を含む治療用DNAベクターを生成する段階。
21. 異種遺伝子を含む単離されたDNAベクターをカラム精製して、単離されたDNAベクターからスーパーコイルDNAを精製する段階をさらに含む、項目20の方法。
22. ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅が等温ローリングサークル増幅である、項目20または21の方法。
23. ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、項目20〜22のいずれか一つの方法。
24. 項目1〜13のいずれか一つのDNAベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
25. 非免疫原性である、項目24の薬学的組成物。
26. それを必要とする対象に項目1〜13のいずれか一つの単離されたDNAベクターまたは項目24もしくは25の薬学的組成物を投与する段階を含む、該対象において異種遺伝子のエピソーム発現を誘導する方法。
27. 対象に項目1〜13のいずれか一つの単離されたDNAベクターまたは項目24もしくは25の薬学的組成物の治療有効量を投与する段階を含む、該対象における障害を処置する方法。
28. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が反復投与される、項目26または27の方法。
29. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が局所投与される、項目26〜28のいずれか一つの方法。
30. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が硝子体内に投与される、項目29の方法。
31. 障害が眼障害である、項目26〜30のいずれか一つの方法。
32. 眼障害が、LCA、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、またはワグナー症候群である、項目31の方法。
33. 二重D (DD) エレメントを含む単離されたDNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いているDNAベクター。
34. 細菌プラスミドDNAを欠いている、項目33のDNAベクター。
35. 免疫原性細菌シグネチャーおよび／またはRNAポリメラーゼ停止部位を欠いている、項目33または34のいずれか一つのDNAベクター。
36. DDエレメントならびに細菌の複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を含む、単離されたDNAベクター。
37. 1つまたは複数の異種遺伝子をさらに含む、項目33〜36のいずれか一つのDNAベクター。
38. 異種遺伝子が4.5 Kb長を上回る、項目36のDNAベクター。
39. 環状ベクターである、項目33〜38のいずれか一つのDNAベクター。
40. 環状ベクターが単量体環状ベクターである、項目39のDNAベクター。
41. 1つまたは複数の異種遺伝子の上流にプロモーター配列を含む、項目38〜40のいずれか一つのDNAベクター。
42. 1つまたは複数の異種遺伝子の下流にポリアデニル化部位を含む、項目38〜41のいずれか一つのDNAベクター。
43. 1つまたは複数の異種遺伝子がトランススプライシング分子を含む、項目42のDNAベクター。
44. 以下のエレメント：(i) プロモーター配列；(ii) 1つまたは複数の異種遺伝子；(iii) ポリアデニル化部位；および (iv) DDエレメント、が5'から3'方向に機能的に連結されている、項目42または43のDNAベクター。
45. 以下の段階を含む、単離されたDNAベクターを生成する方法：(i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階、(ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；(iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、複数のAAVゲノムを作製する段階；ならびに (iv) 複数のAAVゲノムの各々を自己ライゲーションさせて、異種遺伝子およびDDエレメントを含む単離されたDNAベクターを生成する段階。
46. 以下の段階を含む、単離されたDNAベクターを生成する方法：(i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；(ii) 第1のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、第1の線状コンカテマーを作製する段階；(iii) 制限酵素を用いて第1の線状コンカテマーを消化して、第1のAAVゲノムを作製する段階；(iv) 第1のAAVゲノムをプラスミドベクターにクローニングする段階；(v) DDエレメントを含むプラスミドクローンを同定する段階；(vi) DDエレメントを含むプラスミドクローンを消化して、第2のAAVゲノムを作製する段階；(vii) 第2のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、環状DNA鋳型を生成する段階；(viii) 第2のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いて環状DNA鋳型を増幅して、第2の線状コンカテマーを作製する段階；(ix) 制限酵素を用いて第2の線状コンカテマーを消化して、第3のAAVゲノムを作製する段階；ならびに (x) 第3のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子およびDDエレメントを含む単離されたDNAベクターを生成する段階。
47. ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅が等温ローリングサークル増幅である、項目45または46の方法。
48. ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、項目45〜47のいずれか一つの方法。
49. 以下の段階を含む、治療用DNAベクターを生成するインビトロ方法：(i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；(ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；(iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、AAVゲノムを作製する段階；ならびに (iv) AAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子およびDDエレメントを含む治療用DNAベクターを生成する段階。
50. ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅が等温ローリングサークル増幅である、項目49の方法。
51. ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、項目49または50の方法。
52. 項目33〜44のいずれか一つのDNAベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
53. 非免疫原性である、項目52の薬学的組成物。
54. それを必要とする対象に項目33〜45のいずれか一つのDNAベクターまたは項目52もしくは53の薬学的組成物を投与する段階を含む、該対象において異種遺伝子のエピソーム発現を誘導する方法。
55. 対象に項目33〜44のいずれか一つのDNAベクターまたは項目52もしくは53の薬学的組成物の治療有効量を投与する段階を含む、該対象における障害を処置する方法。
56. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が反復投与される、項目54または55の方法。
57. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が局所投与される、項目54〜56のいずれか一つの方法。
58. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が硝子体内に投与される、項目57の方法。
59. 障害が眼障害である、項目54〜58のいずれか一つの方法。
60. 眼障害が、レーバー先天性黒内障 (LCA)、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、またはワグナー症候群である、項目54〜59のいずれか一つの方法。
以下の番号付けされた付加的な項目は、本明細書に記載される本発明のいくつかの態様をさらに規定する：
1. メンデル遺伝性網膜ジストロフィーを処置するように構成された治療用タンパク質をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている該DNAベクター。
2. メンデル遺伝性網膜ジストロフィーが、レーバー先天性黒内障 (LCA)、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、ならびにワグナー症候群からなる群より選択される、項目1のDNAベクター。
3. 1つまたは複数の異種遺伝子が、ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A、およびHMCN1からなる群より選択される、項目1または2のDNAベクター。
4. ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A、およびHMCN1からなる群より選択される1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている該DNAベクター。
5. 1つまたは複数の異種遺伝子が、LCA、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、ならびにワグナー症候群からなる群より選択されるメンデル遺伝性網膜ジストロフィーを処置するように構成された治療用タンパク質をコードする、項目4のDNAベクター。
6. 抗体もしくはその一部、増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、抗アポトーシス因子、サイトカイン、および抗糖尿病因子からなる群より選択される治療用タンパク質をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている該DNAベクター。
7. トランススプライシング分子を含む1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている該DNAベクター。
8. 肝臓から分泌される治療用タンパク質をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている該DNAベクター。
9. 治療用タンパク質が血液中に分泌される、項目8のDNAベクター。
10. 末端反復配列を含む、項目1〜9のいずれか一つのDNAベクター。
11. 末端反復配列が少なくとも10 bp長である、項目10のDNAベクター。
12. 1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、
(a) 末端反復配列を含み；かつ
(b) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている、
該DNAベクター。
13. 細菌プラスミドDNAを欠いている、項目1〜12のいずれか一つのDNAベクター。
14.(a) 免疫原性細菌シグネチャー；および／または
(b) RNAポリメラーゼ停止部位
を欠いている、項目1〜13のいずれか一つのDNAベクター。
15. CpGアイランドを実質的に欠いている、項目1〜14のいずれか一つのDNAベクター。
16. 異種遺伝子が4.5 Kb長を上回る、項目1〜15のいずれか一つのDNAベクター。
17. 二本鎖である、項目1〜15のいずれか一つのDNAベクター。
18. 二本鎖ベクターが単量体である、項目17のDNAベクター。
19. 1つまたは複数の異種遺伝子の上流にプロモーター配列を含む、項目1〜18のいずれか一つのDNAベクター。
20. 1つまたは複数の異種遺伝子の下流にポリアデニル化部位を含む、項目1〜19のいずれか一つのDNAベクター。
21. 以下のエレメント：
(i) プロモーター配列；
(ii) 1つまたは複数の異種遺伝子；
(iii) ポリアデニル化部位；および
(iv) 末端反復配列
が5'から3'方向に機能的に連結されている、項目20のDNAベクター。
22. 複数の同一アンプリコンを含む単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が、網膜ジストロフィーを処置するように構成された治療用タンパク質をコードする異種遺伝子を含み、該DNA分子が、(a) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子；ならびに (b) 組換え部位を欠いている、該DNA分子。
23. メンデル遺伝性網膜ジストロフィーが、LCA、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、網膜色素変性症、加齢黄斑変性 (AMD)、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、ならびにワグナー症候群からなる群より選択される、項目22のDNA分子。
24. 1つまたは複数の異種遺伝子が、ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、C3、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A、およびHMCN1からなる群より選択される、項目22または23のDNA分子。
25. 複数の同一アンプリコンを含む単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が、ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、C3、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A、およびHMCN1からなる群より選択される異種遺伝子を含み、該DNA分子が、(a) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子；ならびに (b) 組換え部位を欠いている、該DNA分子。
26. 異種遺伝子が、LCA、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、網膜色素変性症、AMD、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、ならびにワグナー症候群からなる群より選択されるメンデル遺伝性網膜ジストロフィーを処置するように構成された治療用タンパク質をコードする、項目25のDNA分子。
27. 複数の同一アンプリコンを含む単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が、抗体またはその一部、凝固因子、増殖因子、ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、抗アポトーシス因子、抗腫瘍因子、サイトカイン、および抗糖尿病因子をコードする異種遺伝子を含み、該DNA分子が、(a) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子；ならびに (b) 組換え部位を欠いている、該DNA分子。
28. 複数の同一アンプリコンを含む単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が、トランススプライシング分子を含む異種遺伝子を含み、該DNA分子が、(a) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子；ならびに (b) 組換え部位を欠いている、該DNA分子。
29. 複数の同一アンプリコンを含む単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が、肝臓から分泌される治療用タンパク質をコードする異種遺伝子を含み、該DNA分子が複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている、該DNA分子。
30. 治療用タンパク質が血液中に分泌される、項目29のDNA分子。
31. 同一アンプリコンの各々が末端反復配列を含む、項目22〜30のいずれか一つのDNA分子。
32. 複数の同一アンプリコンを含む単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が異種遺伝子を含み、該DNA分子が、(a) 末端反復配列を含み；かつ (b) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている、該DNA分子。
33. 末端反復配列が少なくとも10 bp長である、項目31または32のDNA分子。
34. 末端反復配列がDDエレメントである、項目31〜33のいずれか一つのDNA分子。
35. 単離されたDNAベクターを生成する方法であって、
(i) 異種遺伝子を含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；
(ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；
(iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、複数のAAVゲノムを作製する段階；および
(iv) 複数のAAVゲノムの各々を自己ライゲーションさせて、異種遺伝子を含む単離されたDNAベクターを生成する段階
を含み、
該異種遺伝子が、
(a) メンデル遺伝性網膜ジストロフィーを処置するように構成された治療用タンパク質をコードし；
(b) ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、C3、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A、およびHMCN1からなる群より選択され；
(c) 抗体もしくはその一部、凝固因子、増殖因子、ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、抗アポトーシス因子、抗腫瘍因子、サイトカイン、および抗糖尿病因子をコードし；
(d) トランススプライシング分子であり；ならびに／または
(e) 肝臓から分泌される治療用タンパク質をコードする、
該方法。
36. AAVゲノムが末端反復配列を含む、項目35の方法。
37. 異種遺伝子を含む単離されたDNAベクターをカラム精製して、該単離されたDNAベクターからスーパーコイルDNAを精製する段階をさらに含む、項目35または36の方法。
38. 以下の段階を含む、単離されたDNAベクターを生成する方法：
(i) 異種遺伝子および末端反復配列を含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；
(ii) 第1のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、第1の線状コンカテマーを作製する段階；
(iii) 制限酵素を用いて第1の線状コンカテマーを消化して、第1のAAVゲノムを作製する段階；
(iv) 第1のAAVゲノムをプラスミドベクターにクローニングする段階；
(v) 末端反復配列を含むプラスミドクローンを同定する段階；
(vi) 末端反復配列を含むプラスミドクローンを消化して、第2のAAVゲノムを作製する段階；
(vii) 第2のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、環状DNA鋳型を生成する段階；
(viii) 第2のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いて環状DNA鋳型を増幅して、第2の線状コンカテマーを作製する段階；
(ix) 制限酵素を用いて第2の線状コンカテマーを消化して、第3のAAVゲノムを作製する段階；ならびに
(x) 第3のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子および末端反復配列を含む単離されたDNAベクターを生成する段階。
39. ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅が等温ローリングサークル増幅である、項目35〜38のいずれか一つの方法。
40. ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、項目35〜39のいずれか一つの方法。
41. 以下の段階を含む、治療用DNAベクターを生成するインビトロ方法：
(i) 異種遺伝子を含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；
(ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；
(iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、AAVゲノムを作製する段階；および
(iv) AAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子を含む治療用DNAベクターを生成する段階。
42. 異種遺伝子を含む単離されたDNAベクターをカラム精製して、単離されたDNAベクターからスーパーコイルDNAを精製する段階をさらに含む、項目41の方法。
43. ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅が等温ローリングサークル増幅である、項目41または42の方法。
44. ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、項目41〜43のいずれか一つの方法。
45. 項目1〜21のいずれか一つのDNAベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
46. 非免疫原性である、項目45の薬学的組成物。
47. それを必要とする対象に項目1〜21のいずれか一つの単離されたDNAベクターまたは項目45もしくは46の薬学的組成物を投与する段階を含む、該対象において異種遺伝子のエピソーム発現を誘導する方法。
48. 対象に項目1〜21のいずれか一つの単離されたDNAベクターまたは項目43もしくは44の薬学的組成物の治療有効量を投与する段階を含む、該対象における障害を処置する方法。
49. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が反復投与される、項目47または48の方法。
50. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が局所投与される、項目47〜49のいずれか一つの方法。
51. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が硝子体内に投与される、項目50の方法。
52. 障害が眼障害である、項目47〜51のいずれか一つの方法。
53. 眼障害がメンデル遺伝性網膜ジストロフィーである、項目52の方法。
54. 眼障害が、LCA、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、またはワグナー症候群である、項目53の方法。
55. 二重D (DD) エレメントを含む単離されたDNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている該DNAベクター。
56. 細菌プラスミドDNAを欠いている、項目55のDNAベクター。
57. 免疫原性細菌シグネチャーおよび／またはRNAポリメラーゼ停止部位を欠いている、項目55または56のいずれか一つのDNAベクター。
58. DDエレメントならびに細菌の複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を含む、単離されたDNAベクター。
59. 1つまたは複数の異種遺伝子をさらに含む、項目55〜57のいずれか一つのDNAベクター。
60. 異種遺伝子が4.5 Kb長を上回る、項目59のDNAベクター。
61. 環状ベクターである、項目55〜60のいずれか一つのDNAベクター。
62. 環状ベクターが単量体環状ベクターである、項目61のDNAベクター。
63. 1つまたは複数の異種遺伝子の上流にプロモーター配列を含む、項目60〜62のいずれか一つのDNAベクター。
64. 1つまたは複数の異種遺伝子の下流にポリアデニル化部位を含む、項目60〜63のいずれか一つのDNAベクター。
65. 1つまたは複数の異種遺伝子がトランススプライシング分子を含む、項目64のDNAベクター。
66. 以下のエレメント：
(i) プロモーター配列；
(ii) 1つまたは複数の異種遺伝子；
(iii) ポリアデニル化部位；および
(iv) DDエレメント
が5'から3'方向に機能的に連結されている、項目64または65のDNAベクター。
67. 以下の段階を含む、単離されたDNAベクターを生成する方法：
(i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；
(ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；
(iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、複数のAAVゲノムを作製する段階；ならびに
(iv) 複数のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子およびDDエレメントを含む単離されたDNAベクターを生成する段階。
68. 以下の段階を含む、単離されたDNAベクターを生成する方法：
(i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；
(ii) 第1のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、第1の線状コンカテマーを作製する段階；
(iii) 制限酵素を用いて第1の線状コンカテマーを消化して、第1のAAVゲノムを作製する段階；
(iv) 第1のAAVゲノムをプラスミドベクターにクローニングする段階；
(v) DDエレメントを含むプラスミドクローンを同定する段階；
(vi) DDエレメントを含むプラスミドクローンを消化して、第2のAAVゲノムを作製する段階；
(vii) 第2のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、環状DNA鋳型を生成する段階；
(viii) 第2のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いて環状DNA鋳型を増幅して、第2の線状コンカテマーを作製する段階；
(ix) 制限酵素を用いて第2の線状コンカテマーを消化して、第3のAAVゲノムを作製する段階；ならびに
(x) 第3のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子およびDDエレメントを含む単離されたDNAベクターを生成する段階。
69. ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅が等温ローリングサークル増幅である、項目67または68の方法。
70. ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、項目67〜69のいずれか一つの方法。
71. 以下の段階を含む、治療用DNAベクターを生成するインビトロ方法：
(i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；
(ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；
(iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、AAVゲノムを作製する段階；ならびに
(iv) AAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子およびDDエレメントを含む治療用DNAベクターを生成する段階。
72. ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅が等温ローリングサークル増幅である、項目71の方法。
73. ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、項目71または72の方法。
74. 項目55〜66のいずれか一つのDNAベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
75. 非免疫原性である、項目74の薬学的組成物。
76. それを必要とする対象に項目55〜66のいずれか一つの単離されたDNAベクターまたは項目74もしくは75の薬学的組成物を投与する段階を含む、該対象において異種遺伝子のエピソーム発現を誘導する方法。
77. 対象に項目55〜66のいずれか一つの単離されたDNAベクターまたは項目74もしくは75の薬学的組成物の治療有効量を投与する段階を含む、該対象における障害を処置する方法。
78. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が反復投与される、項目76または77の方法。
79. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が局所投与される、項目76〜78のいずれか一つの方法。
80. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が硝子体内に投与される、項目79の方法。
81. 障害が眼障害である、項目76〜80のいずれか一つの方法。
82. 眼障害がメンデル遺伝性網膜ジストロフィーである、項目81の方法。
83. 眼障害が、LCA、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、またはワグナー症候群である、項目76〜82のいずれか一つの方法。
他の態様
本明細書において言及される出版物、特許、および特許出願はすべて、それぞれ個々の出版物または特許出願が具体的にかつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明をその特定の態様に関連して説明したが、本発明はさらなる改変が可能であること、ならびに本出願が、一般に本発明の原理に従い、かつ本発明が属する技術分野内で公知のまたは慣例的な実施内に入る、および本明細書に上記される本質的特徴に適用され得る、および添付の特許請求の範囲に従う本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変更、使用、または適合を包含するよう意図されることが、理解されるであろう。
他の態様は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (86)

  1. メンデル遺伝性網膜ジストロフィーを処置するように構成された治療用タンパク質をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている該DNAベクター。
  2. メンデル遺伝性網膜ジストロフィーが、シュタルガルト病、レーバー先天性黒内障 (LCA)、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、ならびにワグナー症候群からなる群より選択される、請求項1記載のDNAベクター。
  3. 1つまたは複数の異種遺伝子が、ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A、およびHMCN1からなる群より選択される、請求項1記載のDNAベクター。
  4. ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A、およびHMCN1からなる群より選択される1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている該DNAベクター。
  5. 1つまたは複数の異種遺伝子が、シュタルガルト病、LCA、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、ならびにワグナー症候群からなる群より選択されるメンデル遺伝性網膜ジストロフィーを処置するように構成された治療用タンパク質をコードする、請求項4記載のDNAベクター。
  6. 抗体もしくはその一部、増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、抗アポトーシス因子、サイトカイン、および抗糖尿病因子からなる群より選択される治療用タンパク質をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている該DNAベクター。
  7. トランススプライシング分子を含む1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている該DNAベクター。
  8. 肝臓から分泌される治療用タンパク質をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている該DNAベクター。
  9. 治療用タンパク質が血液中に分泌される、請求項8記載のDNAベクター。
  10. 末端反復配列を含む、請求項1記載のDNAベクター。
  11. 末端反復配列が少なくとも10 bp長である、請求項10記載のDNAベクター。
  12. 1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、
    (a) 末端反復配列を含み；かつ
    (b) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている、
    該DNAベクター。
  13. 細菌プラスミドDNAを欠いている、請求項1記載のDNAベクター。
  14. (a) 免疫原性細菌シグネチャー；および／または
    (b) RNAポリメラーゼ停止部位
    を欠いている、請求項1記載のDNAベクター。
  15. CpGアイランドを実質的に欠いている、請求項1記載のDNAベクター。
  16. 異種遺伝子が4.5 Kb長を上回る、請求項1記載のDNAベクター。
  17. 二本鎖である、請求項1記載のDNAベクター。
  18. 二本鎖ベクターが単量体である、請求項17記載のDNAベクター。
  19. 1つまたは複数の異種遺伝子の上流にプロモーター配列を含む、請求項1〜18のいずれか一項記載のDNAベクター。
  20. 1つまたは複数の異種遺伝子の下流にポリアデニル化部位を含む、請求項1記載のDNAベクター。
  21. 以下のエレメント：
    (i) プロモーター配列；
    (ii) 1つまたは複数の異種遺伝子；
    (iii) ポリアデニル化部位；および
    (iv) 末端反復配列
    が5'から3'方向に機能的に連結されている、請求項20記載のDNAベクター。
  22. 複数の同一アンプリコンを含む単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が、網膜ジストロフィーを処置するように構成された治療用タンパク質をコードする異種遺伝子を含み、該DNA分子が、(a) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子；ならびに (b) 組換え部位を欠いている、該DNA分子。
  23. メンデル遺伝性網膜ジストロフィーが、シュタルガルト病、LCA、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、網膜色素変性症、加齢黄斑変性 (AMD)、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、ならびにワグナー症候群からなる群より選択される、請求項22記載のDNA分子。
  24. 1つまたは複数の異種遺伝子が、ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、C3、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A、およびHMCN1からなる群より選択される、請求項22または23記載のDNA分子。
  25. 複数の同一アンプリコンを含む単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が、ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、C3、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A、およびHMCN1からなる群より選択される異種遺伝子を含み、該DNA分子が、(a) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子；ならびに (b) 組換え部位を欠いている、該DNA分子。
  26. 異種遺伝子が、シュタルガルト病、LCA、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、網膜色素変性症、AMD、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、ならびにワグナー症候群からなる群より選択されるメンデル遺伝性網膜ジストロフィーを処置するように構成された治療用タンパク質をコードする、請求項25記載のDNA分子。
  27. 複数の同一アンプリコンを含む単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が、抗体またはその一部、凝固因子、増殖因子、ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、抗アポトーシス因子、抗腫瘍因子、サイトカイン、および抗糖尿病因子をコードする異種遺伝子を含み、該DNA分子が、(a) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子；ならびに (b) 組換え部位を欠いている、該DNA分子。
  28. 複数の同一アンプリコンを含む単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が、トランススプライシング分子を含む異種遺伝子を含み、該DNA分子が、(a) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子；ならびに (b) 組換え部位を欠いている、該DNA分子。
  29. 複数の同一アンプリコンを含む単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が、肝臓から分泌される治療用タンパク質をコードする異種遺伝子を含み、該DNA分子が複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている、該DNA分子。
  30. 治療用タンパク質が血液中に分泌される、請求項29記載のDNA分子。
  31. 同一アンプリコンの各々が末端反復配列を含む、請求項22〜30のいずれか一項記載のDNA分子。
  32. 複数の同一アンプリコンを含む単離された線状DNA分子であって、該複数の同一アンプリコンの各々が異種遺伝子を含み、該DNA分子が、(a) 末端反復配列を含み；かつ (b) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている、該DNA分子。
  33. 末端反復配列が少なくとも10 bp長である、請求項31または32記載のDNA分子。
  34. 末端反復配列がDDエレメントである、請求項31〜33のいずれか一項記載のDNA分子。
  35. 単離されたDNAベクターを生成する方法であって、
    (i) 異種遺伝子を含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；
    (ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；
    (iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、複数のAAVゲノムを作製する段階；および
    (iv) 複数のAAVゲノムの各々を自己ライゲーションさせて、異種遺伝子を含む単離されたDNAベクターを生成する段階
    を含み、
    該異種遺伝子が、
    (a) メンデル遺伝性網膜ジストロフィーを処置するように構成された治療用タンパク質をコードし；
    (b) ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、C3、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A、およびHMCN1からなる群より選択され；
    (c) 抗体もしくはその一部、凝固因子、増殖因子、ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、抗アポトーシス因子、抗腫瘍因子、サイトカイン、および抗糖尿病因子をコードし；
    (d) トランススプライシング分子であり；ならびに／または
    (e) 肝臓から分泌される治療用タンパク質をコードする、
    該方法。
  36. AAVゲノムが末端反復配列を含む、請求項35記載の方法。
  37. 異種遺伝子を含む単離されたDNAベクターをカラム精製して、該単離されたDNAベクターからスーパーコイルDNAを精製する段階をさらに含む、請求項35または36記載の方法。
  38. 以下の段階を含む、単離されたDNAベクターを生成する方法：
    (i) 異種遺伝子および末端反復配列を含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；
    (ii) 第1のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、第1の線状コンカテマーを作製する段階；
    (iii) 制限酵素を用いて第1の線状コンカテマーを消化して、第1のAAVゲノムを作製する段階；
    (iv) 第1のAAVゲノムをプラスミドベクターにクローニングする段階；
    (v) 末端反復配列を含むプラスミドクローンを同定する段階；
    (vi) 末端反復配列を含むプラスミドクローンを消化して、第2のAAVゲノムを作製する段階；
    (vii) 第2のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、環状DNA鋳型を生成する段階；
    (viii) 第2のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いて環状DNA鋳型を増幅して、第2の線状コンカテマーを作製する段階；
    (ix) 制限酵素を用いて第2の線状コンカテマーを消化して、第3のAAVゲノムを作製する段階；ならびに
    (x) 第3のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子および末端反復配列を含む単離されたDNAベクターを生成する段階。
  39. ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅が等温ローリングサークル増幅である、請求項35〜38のいずれか一項記載の方法。
  40. ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、請求項35〜39のいずれか一項記載の方法。
  41. 以下の段階を含む、治療用DNAベクターを生成するインビトロ方法：
    (i) 異種遺伝子を含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；
    (ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；
    (iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、AAVゲノムを作製する段階；および
    (iv) AAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子を含む治療用DNAベクターを生成する段階。
  42. 異種遺伝子を含む単離されたDNAベクターをカラム精製して、単離されたDNAベクターからスーパーコイルDNAを精製する段階をさらに含む、請求項41記載の方法。
  43. ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅が等温ローリングサークル増幅である、請求項41または42記載の方法。
  44. ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、請求項41〜43のいずれか一項記載の方法。
  45. 請求項1〜21のいずれか一項記載のDNAベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  46. 非免疫原性である、請求項45記載の薬学的組成物。
  47. それを必要とする対象に請求項1〜21のいずれか一項記載の単離されたDNAベクターまたは請求項45もしくは46記載の薬学的組成物を投与する段階を含む、該対象において異種遺伝子のエピソーム発現を誘導する方法。
  48. 対象に請求項1〜21のいずれか一項記載の単離されたDNAベクターまたは請求項43もしくは44記載の薬学的組成物の治療有効量を投与する段階を含む、該対象における障害を処置する方法。
  49. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が反復投与される、請求項47または48記載の方法。
  50. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が局所投与される、請求項47〜49のいずれか一項記載の方法。
  51. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が硝子体内に投与される、請求項50記載の方法。
  52. 障害が眼障害である、請求項47〜51のいずれか一項記載の方法。
  53. 眼障害がメンデル遺伝性網膜ジストロフィーである、請求項52記載の方法。
  54. 眼障害が、LCA、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、またはワグナー症候群である、請求項53記載の方法。
  55. 二重D (DD) エレメントを含む単離されたDNAベクターであって、複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を欠いている該DNAベクター。
  56. 細菌プラスミドDNAを欠いている、請求項55記載のDNAベクター。
  57. 免疫原性細菌シグネチャーおよび／またはRNAポリメラーゼ停止部位を欠いている、請求項55または56のいずれか一項記載のDNAベクター。
  58. DDエレメントならびに細菌の複製開始点および／または薬物耐性遺伝子を含む、単離されたDNAベクター。
  59. 1つまたは複数の異種遺伝子をさらに含む、請求項55〜57のいずれか一項記載のDNAベクター。
  60. 異種遺伝子が4.5 Kb長を上回る、請求項59記載のDNAベクター。
  61. 環状ベクターである、請求項55〜60のいずれか一項記載のDNAベクター。
  62. 環状ベクターが単量体環状ベクターである、請求項61記載のDNAベクター。
  63. 1つまたは複数の異種遺伝子の上流にプロモーター配列を含む、請求項60〜62のいずれか一項記載のDNAベクター。
  64. 1つまたは複数の異種遺伝子の下流にポリアデニル化部位を含む、請求項60〜63のいずれか一項記載のDNAベクター。
  65. 1つまたは複数の異種遺伝子がトランススプライシング分子を含む、請求項64記載のDNAベクター。
  66. 以下のエレメント：
    (i) プロモーター配列；
    (ii) 1つまたは複数の異種遺伝子；
    (iii) ポリアデニル化部位；および
    (iv) DDエレメント
    が5'から3'方向に機能的に連結されている、請求項64または65記載のDNAベクター。
  67. 以下の段階を含む、単離されたDNAベクターを生成する方法：
    (i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；
    (ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；
    (iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、複数のAAVゲノムを作製する段階；ならびに
    (iv) 複数のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子およびDDエレメントを含む単離されたDNAベクターを生成する段階。
  68. 以下の段階を含む、単離されたDNAベクターを生成する方法：
    (i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；
    (ii) 第1のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、第1の線状コンカテマーを作製する段階；
    (iii) 制限酵素を用いて第1の線状コンカテマーを消化して、第1のAAVゲノムを作製する段階；
    (iv) 第1のAAVゲノムをプラスミドベクターにクローニングする段階；
    (v) DDエレメントを含むプラスミドクローンを同定する段階；
    (vi) DDエレメントを含むプラスミドクローンを消化して、第2のAAVゲノムを作製する段階；
    (vii) 第2のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、環状DNA鋳型を生成する段階；
    (viii) 第2のポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いて環状DNA鋳型を増幅して、第2の線状コンカテマーを作製する段階；
    (ix) 制限酵素を用いて第2の線状コンカテマーを消化して、第3のAAVゲノムを作製する段階；ならびに
    (x) 第3のAAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子およびDDエレメントを含む単離されたDNAベクターを生成する段階。
  69. ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅が等温ローリングサークル増幅である、請求項67または68記載の方法。
  70. ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、請求項67〜69のいずれか一項記載の方法。
  71. 以下の段階を含む、治療用DNAベクターを生成するインビトロ方法：
    (i) 異種遺伝子およびDDエレメントを含むAAVゲノムを含む環状DNAベクターを含む試料を提供する段階；
    (ii) ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅を用いてAAVゲノムを増幅して、線状コンカテマーを作製する段階；
    (iii) 制限酵素を用いてコンカテマーを消化して、AAVゲノムを作製する段階；ならびに
    (iv) AAVゲノムを自己ライゲーションさせて、異種遺伝子およびDDエレメントを含む治療用DNAベクターを生成する段階。
  72. ポリメラーゼ媒介性ローリングサークル増幅が等温ローリングサークル増幅である、請求項71記載の方法。
  73. ポリメラーゼがPhi29 DNAポリメラーゼである、請求項71または72記載の方法。
  74. 請求項55〜66のいずれか一項記載のDNAベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  75. 非免疫原性である、請求項74記載の薬学的組成物。
  76. それを必要とする対象に請求項55〜66のいずれか一項記載の単離されたDNAベクターまたは請求項74もしくは75記載の薬学的組成物を投与する段階を含む、該対象において異種遺伝子のエピソーム発現を誘導する方法。
  77. 対象に請求項55〜66のいずれか一項記載の単離されたDNAベクターまたは請求項74もしくは75記載の薬学的組成物の治療有効量を投与する段階を含む、該対象における障害を処置する方法。
  78. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が反復投与される、請求項76または77記載の方法。
  79. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が局所投与される、請求項76〜78のいずれか一項記載の方法。
  80. 単離されたDNAベクターまたは薬学的組成物が硝子体内に投与される、請求項79記載の方法。
  81. 障害が眼障害である、請求項76〜80のいずれか一項記載の方法。
  82. 眼障害がメンデル遺伝性網膜ジストロフィーである、請求項81記載の方法。
  83. 眼障害が、LCA、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、杆体錐体ジストロフィー、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、CSNB-1C、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性症、CSNB 2、アッシャー症候群、またはワグナー症候群である、請求項76〜82のいずれか一項記載の方法。
  84. エピソーム発現が対象の肝臓内で誘導される、請求項76〜80のいずれか一項記載の方法。
  85. 肝臓が、異種遺伝子によってコードされる治療用タンパク質を分泌する、請求項84記載の方法。
  86. 肝臓が治療用タンパク質を血液中に分泌する、請求項85記載の方法。
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