JP2003511037A

JP2003511037A - ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むアデノウイルスを使用する組換えＡＡＶの産生

Info

Publication number: JP2003511037A
Application number: JP2001528613A
Authority: JP
Inventors: ハイフェンチェン，; ギャリーカーツマン，
Original assignee: ジェノボ，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2003-03-25
Also published as: AU7841400A; EP1222299A1; CA2385823A1; WO2001025462A1; WO2001025462A9

Abstract

(57)【要約】本発明は、外因性ＤＮＡ挿入物を含む高力価の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生に有用な新規のアデノウイルス、およびこれらのアデノウイルスを作製する方法に関する。これらのアデノウイルスは、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含み、これは、ｒｅｐのｐ５プロモーターが最小プロモーターまたはプロモーターなしによって置換される。本発明はまた、ｒＡＡＶの実質的に同種の調製物および組成物として高レベルのｒＡＡＶを産生する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の技術的分野）本発明は、外因性ＤＮＡ挿入物を含む高力価の組み換えアデノ随伴ウイルス（
ｒＡＡＶ）の産生に有用な新規のアデノウイルス、およびこれらのアデノウイル
スを作製する方法に関する。これらのアデノウイルスは、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子を
含み、これは、ｒｅｐのｐ５プロモーターが最小プロモーターまたはプロモータ
ーなしによって置換される。本発明はまた、ｒＡＡＶの実質的に同種の調製物お
よび組成物として高レベルのｒＡＡＶを産生する方法を提供する。

【０００２】（発明の背景）外因性ＤＮＡ挿入物を保有する組換えウイルスは、細胞に遺伝子を送達するた
めに使用され得る。この遺伝子は、所望ならば、発現されてインビトロまたはイ
ンビボで組換えタンパク質の産生、ヒトおよび非ヒト哺乳動物のワクチン接種、
またはヒトもしくは非ヒト哺乳動物における疾患もしくは遺伝的欠損の処置もし
くは改善を可能にする。いくらか効果的なレベルの正常遺伝子産物、増加したレ
ベルの遺伝子産物を提供することによってか、またはその発現が細胞または生物
に有害である遺伝子の内因性産生をブロックすることによって、疾患もしくは遺
伝的欠損が処置もしくは改善され得る。

【０００３】哺乳動物細胞に外因性遺伝子を送達する方法は、哺乳動物ウイルスベクター（
例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイ
ルス、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、ハイブリッドウイルス（例えば、
ハイブリッドアデノウイルス−ＡＡＶ、米国特許第５，８５６，１５２号を参照
のこと）など由来のウイルスベクター）の使用を含む。他の方法は、ＤＮＡの直
接注入、ＤＮＡの微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）投与、エレクトロポーレーシ
ョン、リン酸カルシウム沈殿、ならびにリガンド−ＤＮＡ結合体、ＤＮＡのリポ
ソーム結合体、ポリカチオン−ＤＮＡ複合体またはアデノウイルス−リガンド−
ＤＮＡ結合体を利用する投与の方法を含む。

【０００４】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の系は、導入遺伝子の送達に活用され得る多く
の利点を有する。ＡＡＶは、Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属するヘルパー依存
性ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶは、生産的感染を生じるためにヘルパー
機能を必要とする。ヘルパー機能は、多くの因子によって提供され得るが、一般
に無関係のヘルパーウイルス（アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシ
ニアウイルスのいずれか）との同時感染が使用される。このような同時感染が存
在しない場合、ＡＡＶは、宿主細胞染色体へのそのゲノムの挿入によって潜伏性
状態を樹立する。引き続くヘルパーウイルスによる感染は、感染性ウイルス子孫
を産生するために次いで複製し得る組み込まれたコピーをレスキューする。ＡＡ
Ｖは、広範な宿主範囲を有し、そしてこのような細胞の適切なヘルパーウイルス
での首尾良い同時感染が存在する限り、細胞に置いて任意の種から複製され得る
。ＡＡＶは、ヒト疾患または動物疾患のいずれとも関連せず、そして組込みに際
して宿主細胞の生物学的特性を変化しないようである。ＡＡＶの総説については
、ＢｅｒｎｓおよびＢｅｈｅｎｚｋｙ（１９８７）ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＶ
ｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，）３
２：２４３−３０７を参照のこと。

【０００５】ＡＡＶは、しばしば（ではあるが、必要ではない）１４５ヌクレオチド長であ
る反転末端反復（ＩＴＲ）を含む、約４．７ｋｂ長のゲノムを有する。ＡＡＶゲ
ノムは、ｒｅｐおよびｃａｐの２つの遺伝子をコードする。これらの各々は、別
々のオープンリーディングフレームからの関連したタンパク質のファミリーを発
現し、そして選択的ｍＲＮＡスプライシングおよび異なる転写開始部位および翻
訳開始部位によって産生される。Ｒｅｐポリペプチド（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８
、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）は、ＡＡＶゲノムの複製、レスキューおよび組
込みに関する。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、同一のアミノ末端配列を有し、
かつ同一のプロモーターｐ５を共有するが、Ｒｅｐ７８は、ｒｅｐ６８から選択
的にスプライスアウトされるエクソンを含む。同様に、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ
４０は、同一のアミノ末端配列を有し、そしてｐ５プロモーターの下流にあるｐ
１９プロモーターを共有するが、ｒｅｐ５２は、ｒｅｐ６８において選択的にス
プライスアウトされるエクソンを含む。Ｃａｐタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およ
びＶＰ３）は、ビリオンカプシドを形成する。Ｃａｐ遺伝子転写は、ｐ４０プロ
モーターによって駆動される。ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにプロモ
ーターｐ５、ｐ１９およびｐ４０の略図について、図２Ｂを参照のこと。ＩＴＲ
は、ＡＡＶゲノムの５’末端および３’末端でｒｅｐおよびｃａｐのオープンリ
ーディングフレームに隣接する。特定のＡＡＶゲノムにおいて、ＩＴＲは、１４
５ヌクレオチド長であり、この最初の１２５ｂｐは、Ｙ−形状の二重構造または
Ｔ−形状の二重構造を形成し得る。ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸の全体
は、切除され得、導入遺伝子で置換され得る［Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，「Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋｏｆＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ編、ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ、第１５５〜１６８頁（１９９０）］。他の供給源のｒｅｐおよび
ｃａｐが提供される場合、ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの複製、レスキュー、パッケ
ージングおよび組込みに必要とされる最小限の配列を示す。

【０００６】ＡＡＶがヒト細胞を感染する場合、ウイルスゲノムは、染色体１９に組み込ま
れ、細胞の有害な感染を生じる。ヘルパーウイルスでの感染によるような細胞へ
のヘルパー機能の導入に際して、ＡＡＶプロウイルスは、レスキューされかつ増
幅される。レスキューされたＡＡＶゲノムは、予備形成されたタンパク質カプシ
ド（直径約２０ｎｍの対称性の正二十面体）にパッケージングされ、そしてパッ
ケージされた（＋）または（−）のいずれかの単鎖ＤＮＡゲノムを有する感染性
ビリオンとして、細胞融解に続いて放出される。

【０００７】ｒｅｐ配列およびｃａｐ配列を所望の導入遺伝子で置換することによって、標
的宿主細胞に導入遺伝子を送達し得るｒＡＡＶを得る。現在の方法において、欠
失されたｒｅｐ配列およびｃａｐ配列は、一過性にか安定にかで発現される他の
ウイルスまたはプラスミドによって宿主細胞に供給される。ｒｅｐおよびｃａｐ
を安定的に発現する数多くの細胞株はまた、存在する。宿主細胞はまた、ｒＡＡ
Ｖを複製して宿主細胞ゲノムから切除するためにヘルパー機能を必要とする。通
常ヘルパー機能は、ヘルパーウイルス（野生型ウイルスもしくは不具のウイルス
のいずれか）、ヘルパーウイルス機能を含むプラスミド、または物理的方法によ
って提供される。

【０００８】ｒｅｐがＡＡＶの複製および切除に必要とされることは公知であるが、効果的
なｒＡＡＶ産生に必要とされるＲｅｐタンパク質の量は、未だ明らかではない。
米国特許第５，３５４，６７８号は、Ｒｅｐタンパク質が特定の細胞株に対して
毒性であり得ることを示し、ＷＯ９７／０６２７２、ＷＯ９８／４６７２８およ
びＬｉらは、Ｒｅｐ７８／６８産生の減弱がより高レベルのｒＡＡＶの産生を生
じることを示唆する。対照的に、他の技術（例えば、Ｒｅｐタンパク質の高発現
を明白に示す米国特許第５，６５８，７７６号、「ａｒｅｓｕｌｔｏｆｒ
ｅｐｌａｃｉｎｇｔｈｅｎａｔｉｖｅｐ５ｐｒｏｍｏｔｏｒｗｉｔｈ
ａｓｔｒｏｎｇｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｓｕｃｈａｓｔｈｅｈｕｍａｎ
ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎａ
ｌｒｅｐｅａｔ（ＨＩＶＬＴＲ）」）は、ｒＡＡＶの高レベル発現を生じる
。同様に、米国特許第５，８３７，４８４号は、ｐ５プロモーターが、Ｒｅｐ自
身の転写による強力なフィードバック阻害を克服するために、強力な構成的プロ
モーターまたは誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）
によって置換されるべきであることを示す。従って、米国特許第５，６５８，７
７６号および同５，８３７，４８４号は、Ｒｅｐ７８／６８の高発現が効果的な
ｒＡＡＶ産生に必要とされることを示唆する。

【０００９】組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを産生するために使用されてきた１つの方
法は、真核生物細胞をｒＡＡＶ配列を含むプラスミド（ｃｉｓプラスミド）とｒ
ｅｐおよびｃａｐを含むプラスミド（ｔｒａｎｓプラスミド）とで同時感染する
工程、ならびにヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイ
ルス）でこれらの細胞を感染する工程を包含する。米国特許第５，７５３，５０
０号を参照のこと。Ｌｉら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５２３６−５２４３，１９
９７）は、ｔｒａｎｓプラスミド中のＲｅｐ７８／６８タンパク質の翻訳開始コ
ドンを変更することによって、この方法を改変して、Ｒｅｐタンパク質の翻訳を
減少しかつｒＡＡＶの産生を増加した。しかし、ヘルパーウイルスによる感染と
ともに２つのプラスミドを同時トランスフェクションすることは不十分であり、
このことは、貧弱な生産性を示し得、偽の野生型複製コンピテントなＡＡＶ（ｒ
ｃＡＡＶ）の作製を生じ得、そしてｒＡＡＶの工業的生産に容易に拡大され得な
い、ということが、米国特許第５，７５３，５００号およびＬｉらによって教示
される方法の不利益である。ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が導入遺伝子の欠
失を生じるその導入遺伝子に隣接するＩＴＲと再結合する場合、ＩＴＲによって
隣接されるｒｅｐおよびｃａｐを含むｒｃＡＡＶは、産生される。

【００１０】ｒＡＡＶを産生するために使用されてきた第二の方法は、３つのプラスミドの
真核生物細胞への同時トランスフェクションを含む。この方法において、１つの
プラスミドは、導入遺伝子およびＩＴＲを保有し（ｃｉｓプラスミド）、第二の
プラスミドは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードし（ｔｒａｎｓプラス
ミド）、そして第三のプラスミドは、ヘルパーウイルス機能をコードする（すな
わち、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよびＥ４のようなアデノウイルス遺伝子（ヘル
パープラスミド）。第一の方法の不利益は、この方法と共有される。

【００１１】第三の方法は、パッケージング細胞株の使用を含み、例えば、ＡＡＶを含む細
胞株はｒｅｐおよびｃａｐを機能する。米国特許第５，６５８，７８５号および
同５，８３７，４８４号ならびにＰＣＴＵＳ９８／１９４６３を参照のこと。
パッケージング細胞株は、導入遺伝子およびＩＴＲを含むｃｉｓプラスミドでト
ランスフェクトされ得、そして野生型アデノウイルス（Ａｄ）ヘルパーによって
感染され得る。米国特許第５，６５８，７８５号を参照のこと。あるいは、パッ
ケージング細胞株は、ハイブリッドＡｄベクターはＥ１座でｃｉｓプラスミドを
保有するハイブリッドＡｄ／ＡＡＶによって（米国特許第５，８５６，１５２号
）、そしてＥ１を供給する野生型Ａｄまたは変異Ａｄによって同時感染され得る
。参考文献７を参照のこと。この方法の不利益は、十分なレベルのｒｅｐおよび
ｃａｐを発現する細胞株を作製する工程を必要とし、そしてｒＡＡＶを産生する
ために多彩な成分（細胞株、ｒＡＡＶゲノム、アデノウイルスを含む）を必要と
し、下流の製造工程を用意にかつ簡便にはしない。さらに、これらのパッケージ
ング細胞株のいくつかは、高レベルのｒＡＡＶを産生しない。

【００１２】第四の方法は、米国特許第５，３５４，６７８号の予言的例示によって提供さ
れる。この方法は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をヘルパーウイルス機能に
必要でないアデノウイルスゲノムの一部と置換する組換えアデノウイルスを使用
する工程を含む。この方法において、ｒＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ／ＥＢＶプラ
スミドベクターは、細胞に導入されてｒＡＡＶ生産細胞を産生する。ｒｅｐ遺伝
子は、そのネイティブなｐ５プロモーターかまたは強力な誘導性プロモーターに
よって駆動されることが推定される。次いで、ｒｅｐおよびｃａｐを含む組換え
アデノウイルスは、細胞に導入されて、そして、これらの産生は、ｒＡＡＶがこ
れらの細胞によって産生されるように誘導される。米国特許第５，３５４，６７
８号は、たとえあったとしても、この方法によって産生されるｒＡＡＶのレベル
を開示しない。

【００１３】上記のように、現在のｒＡＡＶ産生方法は、慣用的な様式での薬学的適用のた
めに十分なｒＡＡＶの産生について受容されない。しかし、大規模な工業的生産
に適用可能な効果的方法によって、高レベルの実質的に同種な複製欠損ｒＡＡＶ
を再現可能に作製することの問題は、本発明によって解決される。

【００１４】（発明の要旨）本発明は、高収量のｒＡＡＶベクターを生じ、そして大規模な工業的適用に受
容可能な代替の生産方法を提供する。本発明は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝
子を含む新規なアデノウイルスを提供し、従って、１つの成分においてＡＡＶｒ
ｅｐおよびｃａｐならびにアデノウイルスヘルパー機能を提供する。本発明のア
デノウイルスベクターにおいて、ｒｅｐの上流のネイティブなＡＡＶｐ５プロモ
ーターは除去され、そして最小プロモーターかまたはプロモーターなしと置換さ
れる。この新規なベクターは、ＡＡＶＩＴＲによって隣接される導入遺伝子を
含む核酸配列を含む細胞に感染される場合、高レベルのｒＡＡＶの産生を生じる
。ＡＡＶＩＴＲによって隣接される導入遺伝子を含む核酸配列は、宿主細胞染
色体への安定な組込み、アデノウイルスもしくはＩＴＲによって隣接される導入
遺伝子を保有する他のウイルスベクターでの二次感染（例えば、米国特許第５，
８５６，１５２号を参照のこと）、導入遺伝子を含むｒＡＡＶでの感染、または
当該分野において公知の他の任意の方法（例えば、ＩＴＲによって隣接される導
入遺伝子を含むプラスミドＤＮＡのトランスフェクション、リポフェクションも
しくはマイクロインジェクション）によって宿主細胞において樹立され得る。

【００１５】本発明の１つの実施形態において、最小プロモーターかまたはプロモーターな
しに制御可能に連結されたｒｅｐは、アデノウイルスのＥ１領域またはＥ３領域
のいずれかに挿入される。アデノウイルスは、Ｅ１またはＥ３を単独または両方
の組み合わせにおいて欠失される。別の実施形態において、アデノウイルスベク
ターはさらに、Ｅ４において欠失される。この実施形態において、ｒｅｐ配列は
Ｅ４において挿入され得るが、これらのｒｅｐ配列の上流にプロモーターはない
かまたは最小プロモーターが存在し得る。好ましい実施形態において、ｃａｐは
、ｒｅｐ遺伝子とともにアデノウイルスベクターに挿入される。本発明の別の局
面において、最小プロモーターを含むかプロモーターのないｒｅｐを含むアデノ
ウイルスベクターは、ｒＡＡＶを産生するための方法において使用される。この
方法の利点は、ｒＡＡＶの工業的生産について容易に拡大されることである。

【００１６】本発明の方法において、宿主細胞は、ｒＡＡＶゲノムを供給され、そして最小
プロモーターを含むかプロモーターのないｒｅｐを含むアデノウイルスは、細胞
に感染される。本発明の１つの実施形態において、宿主細胞は、同時にかまたは
連続的にかのいずれかで、２つのアデノウイルスで同時感染され、ここで、１つ
のアデノウイルスは、上記のように最小プロモーターかプロモーターなしから駆
動されるｃａｐおよびｒｅｐを含み、そして他のアデノウイルスは、ｒＡＡＶゲ
ノムを含む。別の実施形態において、最小プロモーターかプロモーターなしから
駆動されるｃａｐおよびｒｅｐを含むアデノウイルスは、安定に発現されるｒＡ
ＡＶゲノムを含む宿主細胞を感染するために使用される。

【００１７】本発明の好ましい実施形態において、方法は、高力価の実質的に同種のｒＡＡ
Ｖ溶解物およびストックが達成される方法である。

【００１８】これらの実施形態のいずれもにおいて、宿主細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐを含
むアデノウイルスから欠失されるこれらのアデノウイルス配列を安定に発現し得
る。例えば、細胞株（例えば、Ｅ１を発現する２９３細胞、Ｅ１およびＥ４を発
現する８４−３１細胞（参考文献１）またはＥ１およびＥ４ＯＲＦ６を発現する
１０−３細胞（参考文献１１））が使用され得る。あるいは、第二のヘルパーウ
イルスは、宿主細胞に同時感染され、そしてｒｅｐおよびｃａｐを含むアデノウ
イルスから欠失されるこれらのアデノウイルス配列を発現する。例えば、導入遺
伝子カセットを含む第二のアデノウイルスが宿主細胞を感染するために使用され
る場合、このアデノウイルスは、欠失されたアデノウイルス配列を供給し得た。

【００１９】本発明の別の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子を保有する組換えウイルスは、
ｒｅｐがその複製を緩衝するウイルスのいずれかであり得る。この実施形態にお
いて、組換えウイルスベクターは、ｒｅｐ遺伝子を含み、ここで、ｒｅｐのネイ
ティブなｐ５プロモーターは除去されかつ最小プロモーターかまたはプロモータ
ーなしと置換される。

【００２０】（発明の詳細な説明）本発明は、新規アデノウイルスベクターおよびこのベクターを用いてｒＡＡＶ
の高力価ストックを産生するための方法に関する。このアデノウイルスベクター
は、ｒｅｐ遺伝子を含み、この遺伝子において、ｒｅｐコード配列の上流のネイ
ティブなＡＡＶｐ５プロモーターは、欠失されているかまたは変異もしくは部
分欠失によって効果的に不活性にされ、そして最小プロモーターによって置換さ
れるかまたはプロモーターが無い。

【００２１】Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８の最大の産生を減少することは、ｒＡＡＶ産生を
増加し得る（ＷＯ９７／０６２７２およびＷＯ９８／４６７２８を参照のこ
と）が、ｐ５プロモーターをＲｅｐ７８／６８の基底の発現のみを促進する最小
プロモーターによって置換するかまたはプロモーターなしのいずれかに置換する
（すなわち、プロモーター全体を取り除き、そしてｒｅｐをアデノウイルスに組
み込む）場合に、ｒＡＡＶ産生を得ることができるという証拠はなかった。

【００２２】好ましい実施形態において、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、最小プロモータ
ー駆動のｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８発現を含むアデノウイルスで感染された２
９３細胞または他のＥ１補完細胞株において、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０より
も十分に低いレベルで産生される。例えば、実施例９および図１０を参照のこと
。別の好ましい実施形態において、宿主細胞は、任意のプロモーターが無いｒｅ
ｐ遺伝子を含むアデノウイルスベクターで感染される。ｒｅｐコード配列の上流
に任意のプロモーターが無いアデノウイルスによって感染された宿主細胞中で発
現される、Ｒｅｐ７８タンパク質およびＲｅｐ６８タンパク質の正確な量は、未
知であるが、Ｒｅｐ７８タンパク質レベルおよびＲｅｐ６８タンパク質レベルが
、感染の間に、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０よりも十分に低いレベルまたは野生
型ＡＡＶによって発現されるよりも十分に低いレベルで、この組換えアデノウイ
ルスから発現されることが予想される。

【００２３】本発明の１つの実施形態において、Ｒｅｐ７８タンパク質およびＲｅｐ６８タ
ンパク質の総量は、この感染細胞中で産生されるＲｅｐ５２およびＲｅｐ４０の
総量の、８０％未満、より好ましくは５０％未満である。より好ましい実施形態
において、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８の総量は、この感染細胞中で産生される
Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０の総量の、２５％未満である。さらにより好ましい
実施形態において、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８の総量は、この感染細胞中で産
生されるＲｅｐ５２およびＲｅｐ４０の総量の、１５％未満、より好ましくは１
０％、より好ましくは５％未満である。当該分野で公知の任意の方法によって、
Ｒｅｐタンパク質の量を測定し得る。これらの方法としては、代謝的に標識され
たＲｅｐタンパク質の免疫沈降、続くＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動上
での分離および標識タンパク質の定量、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬ
ＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、感染細胞の免疫蛍光、ならびに放
射性標識または酵素標識の抗Ｒｅｐ抗体を用いる定量的ウエスタンブロット分析
が挙げられるが、これらに限定されない。

【００２４】プロモーターが無いｒｅｐ遺伝子を含むアデノウイルスベクターを用いて実施
される実験は、感染宿主細胞もまたｒＡＡＶを産生することを示す。任意の理論
に束縛されることを望まないが、ｒｅｐの上流にプロモーターが無い場合に、Ｒ
ｅｐ７８およびＲｅｐ６８の低いレベルの転写が、アデノウイルスの上流ＩＴＲ
またはｒｅｐ遺伝子の上流であるＩＴＲの下流の配列から生じ得ることは、可能
である。

【００２５】本発明は、ネイティブなｐ５プロモーターを有するｒｅｐ遺伝子を含むアデノ
ウイルスベクターは、宿主細胞へ感染される場合に不安定であるが、最小プロモ
ーターを有するかまたはプロモーターがないｒｅｐ遺伝子を含むアデノウイルス
ベクターは、宿主細胞中で安定に増殖することを示す。実施例４ならびに図３Ａ
および３Ｂを参照のこと。実施例４は、Ａｄ−ｐ５−ＲＣ（これは、アデノウイ
ルスベクターのＥ１部位にｐ５、ｒｅｐおよびｃａｐを含むアデノウイルスであ
る）が、２９３細胞中で継代される場合に、アデノウイルスベクターのｒｅｐ−
ｃａｐＤＮＡ配列において再配列事象または欠失事象を引き起こすことを示す
。対照的に、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣ（これは、最小限熱ショックタンパク質プロモ
ーター（ＨＳＰ）、ｒｅｐおよびｃａｐを含む）が、アデノウイルスゲノムのＥ
１座への挿入後に安定であり、そしてこの同じ細胞中で継代される場合に、再配
列を引き起こし得るようではないことを示す。好ましい実施形態において、本発
明の最小プロモーターｒｅｐを含有するアデノウイルスまたはプロモーターが無
いｒｅｐを含有するアデノウイルスは、２９３細胞のような規定された宿主細胞
系における増殖に対して安定であるアデノウイルスである。

【００２６】ｒｅｐおよびｃａｐの欠失または再配列は、実施例８〜９および図８〜１０に
よってさらに支持される。サザンブロット分析は、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよびＡ
ｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺ（ＡＡＶＩＴＲによって隣接されるｌａｃＺを含む導入
遺伝子カセットがアデノウイルスのＥ１に挿入されたアデノウイルスベクター）
で同時感染された２９３細胞由来のＨｉｒｔＤＮＡは、ＡＡＶ複製形態（ＲＦ
）ＤＮＡ中にＬａｃＺＤＮＡ配列を含むが、Ａｄ−ｐ５−ＲＣおよびＡｄ−Ａ
ＡＶ−ＬａｃＺで同時感染された２９３細胞由来のＨｉｒｔＤＮＡは、ＡＡＶ
ＲＦＤＮＡ中にＬａｃＺＤＮＡ配列を含まないことを示す。さらに、２９
３細胞は、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺで同時感染される
場合Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質を発現する（図１０のレーン５を
参照のこと）が、Ａｄ−ｐ５−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺで同時感染さ
れる場合、これらのタンパク質を発現しない（図１０のレーン４を参照のこと）
。

【００２７】Ａｄ−ｐ５−ＲＣ中の欠失または再配列の効果は、このアデノウイルスベクタ
ーを用いて産生されたｒＡＡＶのレベルによって示される。複製ｒＡＡＶは、Ａ
ｄ−ｐ５−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺで同時感染された細胞中でほとん
どまたは全く産生されないが、複製ｒＡＡＶは、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよびＡｄ
−ＡＡＶ−ＬａｃＺで同時感染された２９３細胞中で観察される。実施例８なら
びに図８、９Ａおよび９Ｂを参照のこと。同様に、十分な量の複製ｒＡＡＶが、
プロモーターが無い下流にｒｅｐ配列を含むアデノウイルスベクターを用いて感
染された細胞中で産生される。

【００２８】（定義および一般技術）他に規定されない限り、本明細書中に使用される全ての技術用語および科学用
語は、本発明が属する当業者によって通常理解される意味を有する。本発明の実
施は、他に示されない限り、従来の、化学技術、分子生物学技術、微生物学技術
、組換えＤＮＡ技術、遺伝的技術、ウイルス学技術および免疫学技術を用いる。
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２、Ｈａｒ
ｌｏｗら、１９８９（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照の
こと。

【００２９】「組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ゲノム」は、全てのＡＡＶゲノムま
たは一部分のＡＡＶゲノムを含み、ここで、このウイルスゲノムは、野生型であ
っても、点変異または欠失を含んでもよく、そして必要に応じて、発現制御配列
に作動可能に連結された導入遺伝子を含んでもよい。この導入遺伝子は、シスま
たはトランスで調節され得る。好ましい実施形態において、このｒＡＡＶゲノム
は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する導入遺伝子を含む。本発明
のｒＡＡＶゲノムは、アデノウイルスベクターのゲノム中に組み込まれて、ハイ
ブリッドＡｄ／ＡＡＶを形成し得る。米国特許第５，５８６，１５２号（本明細
書中に参考として援用される）を参照のこと。あるいは、このｒＡＡＶゲノムは
、当該分野で公知の任意の経路によって宿主細胞中へ導入され得る。このｒＡＡ
Ｖゲノムは、宿主細胞中で一過性または安定に発現され得る。

【００３０】「組換えアデノ随伴ウイルス」または「ｒＡＡＶ」は、上記のｒＡＡＶゲノム
から誘導されたＡＡＶである。このｒＡＡＶは、好ましくは導入遺伝子を含む。
導入遺伝子を含むｒＡＡＶは、哺乳動物細胞を形質転換し得、そして導入遺伝子
をそこへ送達し得る。

【００３１】「隣接エレメント」または「隣接核酸」は、導入遺伝子に隣接した位置に配置
される場合、この導入遺伝子のｒＡＡＶへのパッケージングを可能にする核酸配
列である。ＡＡＶの隣接エレメントは、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）である。
隣接エレメントは、ＡＡＶ血清型１〜６のうちのいずれか１つ由来の天然に存在
するＩＴＲであり得るか、または同じもしくは等価なパッケージング機能を有す
る人工核酸エレメント（例えば、ＩＴＲの変異配列）であり得る。

【００３２】「導入遺伝子」は、哺乳動物細胞に送達されるかまたは哺乳動物細胞へ移入さ
れる核酸配列である。導入遺伝子は、マーカー分子、レポーター分子または治療
分子として有用である、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドをコードし得
る。この導入遺伝子はまた、選択遺伝子（例えば、抗生物質耐性のための選択遺
伝子）であり得る。導入遺伝子はまた、タンパク質産生、診断アッセイまたはイ
ンビトロもしくはインビボでの任意の一過性遺伝子移入もしくは安定遺伝子移入
に有用である、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードし得る。ある
いは、導入遺伝子は、タンパク質をコードし得ず、むしろセンス分子もしくはア
ンチセンス分子、リボザイムまたは他の調節核酸として使用されて、相補体であ
る核酸の複製、転写または翻訳を調節するか、あるいは分解に関する相補体ｍＲ
ＮＡを標的化する。

【００３３】「発現制御配列」は、目的の遺伝子に作動可能に連結することによって遺伝子
発現を調節する核酸配列である。

【００３４】「作動可能に連結された」配列は、目的遺伝子を制御するための、目的遺伝子
に連結する発現制御配列およびトランスで作用するかもしくは距離をおいて作用
する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列は、以下を含む：適切な転写開始
配列、転写終了配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率的なＲＮ
Ａプロセシングシグナル（例えば、スプライシングシグナルおよびポリアデニル
化シグナル）；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（す
なわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；お
よび所望される場合、タンパク質分泌を促進する配列。

【００３５】「導入遺伝子カセット」は、発現制御配列に作動可能に連結された導入遺伝子
を含む核酸配列であり、ここで、この導入遺伝子および発現制御配列は、ＡＡＶ
隣接配列に隣接する。好ましい実施形態において、この隣接配列は、ＡＡＶＩ
ＴＲである。

【００３６】「アデノウイルスゲノム」は、アデノウイルス粒子の核酸分子骨格である。こ
のアデノウイルスゲノムは、ヌクレオチドの点変異、欠失または挿入を含み得る
。このアデノウイルスゲノムは、外来遺伝子をさらに含み得る。

【００３７】「アデノウイルス」は、哺乳動物細胞へ結合し、そしてこのアデノウイルスゲ
ノムを細胞の核へ送達し得る、被包性アデノウイルスゲノムである。用語「アデ
ノウイルス」は、組換えアデノウイルスおよび非組換えアデノウイルスの両方を
含む。用語「アデノウイルス」はまた、野生型アデノウイルスおよび変異アデノ
ウイルスの両方を含む。

【００３８】「組換えアデノウイルス」は、野生型アデノウイルスに対して外来である１つ
以上の遺伝子を含むアデノウイルスである。組換えアデノウイルスとしては、ｒ
ｅｐおよび／もしくはｃａｐのような外来遺伝子を含むアデノウイルス、ならび
にｒＡＡＶゲノムを含むアデノウイルスが挙げられるが、これらに限定されない
。

【００３９】「アデノウイルスベクター」は、１つ以上の外来遺伝子を含む組換えアデノウ
イルスであり、ここで、このアデノウイルスベクターは、哺乳動物細胞へ結合し
、そしてこの外来遺伝子を細胞の核へ送達し得る。この外来遺伝子としては、ｒ
ｅｐおよびｃａｐのような遺伝子、ｒＡＡＶゲノム、例えば、導入遺伝子および
発現制御配列、またはｒＡＡＶの産生を増加する際に有用である任意の外来遺伝
子が挙げられるが、これらに限定されない。

【００４０】「座」は、特定の遺伝子が通常に存在するウイルス内の部位である。例えば、
「アデノウイルスＥｌ座」は、アデノウイルス中のＥ１が存在する部位である。
外来遺伝子または外来核酸が座に挿入される場合、これらは、そこに存在する遺
伝子を置換し得るか、またはこれらは、そこに存在する遺伝子に加えてその部位
に挿入され得るかのいずれかである。

【００４１】「ＡＡＶｐ５プロモーター」または「ｐ５プロモーター」は、ＡＡＶ血清型
１〜６を含む任意のＡＡＶ血清型、ならびに非ヒト種を感染する任意のＡＡＶ（
例えば、鳥類ＡＡＶおよびウシＡＡＶ）から誘導されるものである。ＡＡＶ−２
のｐ５プロモーターは、ｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８の発現を指向し、そしてＲ
ｅｐタンパク質によってダウンレギュレートされ、そして特定のアデノウイルス
プロモーター（Ｅ１を含む）によってアップレギュレートされる。

【００４２】本明細書中に使用される場合、用語「欠失ｐ５プロモーター」は、ＡＡＶゲノ
ムから完全に欠失されたｐ５プロモーターまたは効果的に欠失もしくは減弱され
たｐ５プロモーター（その結果、野生型ｐ５プロモーターが導入された細胞にお
いてその野生型ｐ５プロモーターが転写を促進する際と比較した場合に、このｐ
５プロモーターはより少ない活性である）をいう。このｐ５プロモーターは、以
下を含むがこれらに限定されない任意の方法によって、効果的に欠失または減弱
され得る：十分な数のヌクレオチドを除去または変異して、このｐ５プロモータ
ーをほとんど活性でないかまたは不活性にすること、あるいは、プロモーターが
ほとんど活性でないようにｒｅｐのコード配列に対してこのプロモーターを異動
させること。代替の実施形態において、プロモーター活性を減少するために、ｒ
ｅｐ遺伝子のｐ５プロモーターと開始コドンとの間の距離を広げ得る。例えば、
ｐ５プロモーターをｒｅｐ遺伝子の下流に移動させ得るか、またはｐ５プロモー
ターと下流のＡＴＧ開始コドンとの間にヌクレオチド配列を挿入し得る。変異さ
れたかまたは部分的に欠失されたｐ５プロモーターに作動可能に連結された遺伝
子の転写を測定し、そしてこの遺伝子の転写をプロモーターが無い構築物中の遺
伝子の転写と比較することによって、ｐ５プロモーターが効果的に欠失されたか
否かを測定し得る。

【００４３】好ましい実施形態において、ｐ５プロモーターは、野生型ｐ５プロモーター活
性の８０％未満で促進する場合、より好ましくは野生型ｐ５プロモーター活性の
５０％未満で促進する場合、効果的に欠失されている。より好ましい実施形態に
おいて、ｐ５プロモーターは、野生型ｐ５プロモーター活性の２５％未満で促進
する場合、効果的に欠失されている。なおより好ましい実施形態において、ｐ５
プロモーターは、野生型ｐ５プロモーター活性の１５％未満を促進、より好まし
くは野生型ｐ５プロモーター活性の１０％未満を促進、そしてより好ましくは野
生型ｐ５プロモーター活性の５％未満を促進する場合、効果的に欠失されている
。別の好ましい実施形態において、ｐ５プロモーターは、ｒｅｐ遺伝子（これに
、ｐ５プロモーターが作動可能に連結される）が、効果的に欠失されたｐ５プロ
モーターおよびｒｅｐ遺伝子を含むアデノウイルスが宿主細胞（例えば、２９３
細胞）中へ感染される際に、再配列または欠失されない場合、効果的に欠失され
ている。別の好ましい実施形態において、ｐ５プロモーターは、ｒｅｐおよび欠
失ｐ５プロモーターを含むアデノウイルスで感染された宿主細胞が高い力価でｒ
ＡＡＶを産生する場合、効果的に欠失されている。好ましい実施形態において、
この力価は、１細胞あたり少なくとも１０²粒子；好ましくは、１細胞あたり少
なくとも１０³粒子；より好ましくは、１細胞あたり少なくとも１０⁴粒子；およ
び、なおより好ましくは、１細胞あたり少なくとも１０⁵粒子または１０⁶粒子で
ある。一般的に、１形質転換単位（ＴＵ）あたり約１×１０³〜３×１０³粒子で
ある。１ＴＵを産生するために必要とされる粒子数は、導入遺伝子、精製方法お
よびアッセイ方法に依存して変化する。

【００４４】「最小プロモーター」は、基本的にＴＡＴＡボックスのみを含み、そして非常
に低いレベルまたは基底レベルのｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８の転写のみを促進
するプロモーターである。プロモーターは、細胞の転写機構によって特定部位に
おける転写開始を促進するヌクレオチド配列である。

【００４５】好ましい実施形態において、最小プロモーターは、野生型ｐ５プロモーターの
８０％未満、より好ましくは野生型ｐ５プロモーターの５０％未満、なおより好
ましくは野生型ｐ５プロモーターの２５％未満である転写を促進する。より好ま
しい実施形態において、最小プロモーターは、野生型ｐ５プロモーターの２０％
未満、なおより好ましくは野生型ｐ５プロモーターの１５％未満である転写を促
進するプロモーターである。なおより好ましい実施形態において、最小プロモー
ターは、野生型ｐ５プロモーターの１０％未満、なおより好ましくは５％未満、
なおより好ましくは野生型ｐ５プロモーターの１％未満、である転写を促進する
プロモーターである。

【００４６】最小プロモーターはまた、機能測定によって規定され得る。最小プロモーター
は、ｒｅｐ遺伝子（これに最小プロモーターが作動可能に連結される）が、最小
プロモーターおよびｒｅｐ遺伝子を含むアデノウイルスが宿主細胞（例えば、２
９３細胞）中へ感染される場合に、再配列または欠失されない、プロモーターで
ある。最小プロモーターは、ｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８の転写を調節する最小
プロモーターを含むアデノウイルスで感染される宿主細胞が高い力価でｒＡＡＶ
を産生する、最小プロモーターである。好ましい実施形態において、この力価は
、１細胞あたり少なくとも１０²粒子；好ましくは、１細胞あたり少なくとも１
０³粒子；より好ましくは、１細胞あたり少なくとも１０⁴粒子；および、なおよ
り好ましくは、１細胞あたり少なくとも１０⁵粒子または１０⁶粒子である。

【００４７】多くの最小プロモーターが当該分野で公知である。あるいは、人工最小プロモ
ーターが、ＴＡＴＡボックスの配列またはＴＡＴＡボックスのコンセンサス配列
を用い、ヌクレオチド配列をこのＴＡＴＡボックスの５’末端および３’末端に
付加することによって構築され得る。この最小プロモーターの活性は、人工最小
プロモーターの転写を測定し、これを天然の最小プロモーター（例えば、Ｄｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａ熱ショックタンパク質プロモーター）と比較することによって、
測定され得る。

【００４８】Ｒｅｐ７８／６８は、ｐ５プロモーターが、上記で規定されるように欠失また
は効果的に欠失され、そしてプロモーターがその場所に挿入されない場合、「プ
ロモーターが無い」かまたは「プロモーターを有さない」。あるいは、ｒｅｐ７
８／６８は、ｐ５プロモーターが欠失され、そして宿主細胞（これにアデノウイ
ルスが感染される）における転写を促進しない異種プロモーターによって置換さ
れる場合、プロモーターが無い。例えば、ｒｅｐ７８／６８は、ｐ５が例えば細
菌細胞または昆虫細胞中では活性であったが哺乳動物宿主細胞において不活性で
あったプロモーターによって置換される場合、プロモーターが無いとみなされる
。別の実施形態において、ｒｅｐ７８／６８は、ｐ５プロモーターが欠失され、
そして低いレベルのｒｅｐ７８／６８発現を可能にする誘導可能なプロモーター
によって置換される場合、プロモーターが無い。

【００４９】（アデノウイルスベクター）多数のアデノウイルスおよびアデノウイルスベクターが公知であり、これらに
は、ヒトアデノウイルス１型〜４６型、チンパンジーアデノウイルス、イヌアデ
ノウイルス、ウシアデノウイルス（これらは全て、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２
２０９から入手可能である）、およびヒツジアデノウイルス（Ｂｏｔｈら、ＷＯ
９７／０６８２６Ａｌ）が挙げられる。これらのアデノウイルスのうちのい
ずれかが本発明に使用され得、ただし、そのアデノウイルスは、標的宿主細胞を
感染し得る。例えば、ヒトアデノウイルスは、一般的にヒト細胞を感染するため
に使用され、一方、ウシアデノウイルスは、ウシ細胞を感染するために使用され
る。

【００５０】１つの実施形態において、アデノウイルスベクターは、最小プロモーターの下
流にＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含むかプロモーターがないＡＡＶｒｅｐ遺伝子を
含み（これは、代替的に、最小プロモーターＡＡＶｒｅｐ遺伝子またはプロモ
ーターが無いＡＡＶｒｅｐ遺伝子と呼ばれる）、そして宿主細胞中におけるｒ
ＡＡＶ産生のための十分なヘルパーウイルス機能を含む。好ましい実施形態にお
いて、アデノウイルスベクターは、ＡＡＶｃａｐ遺伝子をさらに含む。ｒＡＡ
Ｖゲノムの複製および被包に必要とされるアデノウイルス配列の型は、宿主細胞
が任意のヘルパー機能を発現するか否か、または他のベクターもしくはウイルス
がヘルパー機能を発現する宿主細胞中に導入されるか否かに依存する。例えば、
アデノウイルスが使用されてＥ１を発現する細胞株（例えば、２９３細胞株）を
感染する場合、アデノウイルスベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐを含み得、そし
てまた、Ｅ１に加えて必要とされるヘルパーウイルス機能（例えば、Ｅ２ａ、Ｅ
４ＯＲＦ６およびＶＡＩＲＮＡ）を含み得る。アデノウイルスを使用してＥ１
およびＥ４を発現する８４〜３１のような細胞株を感染する場合、アデノウイル
スベクターは、ｒｅｐ、ｃａｐ、Ｅ２ａおよびＶＡＩＲＮＡを発現し得る。ア
デノウイルスを使用していずれのヘルパー機能も発現しない細胞株を感染する場
合、アデノウイルスベクターは、少なくともＥ１（Ｅ１ａおよびＥ１ｂの両方）
およびＥ２ａを含み得、そして必要に応じて、Ｅ４ＯＲＦ６およびＶＡＩＲＮ
Ａを含み得る。代替の実施形態において、ヘルパー機能は、化学的方法もしくは
物理的方法によって、または他のヘルパーウイルスによって供給され得る。

【００５１】最小プロモーターの下流にｒｅｐ遺伝子を含むかプロモーターが無いｒｅｐ遺
伝子を含む組換えアデノウイルスは、当該分野で公知の任意の方法によって産生
され得る。１つの好ましい方法において、本発明の組換えアデノウイルスは、相
同組換えを使用して産生される。別の好ましい方法において、組換えアデノウイ
ルスは、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換えを使用して産生される（１２）。

【００５２】代替的な実施形態において、いくつかまたは全てのヘルパーウイルス機能は、
宿主細胞へ導入される核酸配列によって提供され得る。例えば、宿主細胞は、必
要とされるウイルス機能のいくらかまたは全てを発現する第２のウイルス（例え
ば、アデノウイルス）を用いて同時感染され得る。好ましい実施形態において、
第２のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子カセットを含み、そしてさらに、
宿主細胞またはｒｅｐ遺伝子を含むアデノウイルスのいずれによっても発現され
ないヘルパー機能を含む。例えば、実施例６〜８を参照のこと。あるいは、ヘル
パーウイルス機能のいくらかまたは全ては、上記に議論されるようなトランスフ
ェクションまたは直接注入などの当該分野で公知の任意の方法によって、提供さ
れ得る。

【００５３】この記載に基づいて、アデノウイルスベクターの他の実施形態は、当業者に容
易に明らかである。Ｒｅｐがウイルス複製を妨げる他のウイルスベクターがまた
、使用され得る。

【００５４】（Ｒｅｐ核酸およびＣａｐ核酸）ＡＡＶの生活環において、ｒｅｐとｃａｐとの両方が、組換えウイルスゲノム
の切除、複製および感染性の組換えベクターまたはウイルスへのカプシド化のた
めに必要とされる。Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質は、ＡＡＶの任意
の血清型（血清型１〜６を含む）由来の天然に存在する配列を有し得る。１つの
好ましい実施形態において、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、同じＡＡＶ血
清型由来である。別の好ましい実施形態において、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺
伝子は、異なるＡＡＶ血清型由来であり、偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）ｒＡ
ＡＶの産生を可能にする。偽型ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶが遺伝子治療ベクターとし
て患者に投与されるべきであり、そして１つのＡＡＶ血清型のカプシドタンパク
質に対する中和抗体がその患者の血清内に存在し、そして別のＡＡＶ血清型に対
しては存在しない場合に、所望である。抗体応答が存在する血清型由来のｃａｐ
遺伝子は、抗体応答が存在しないＡＡＶの異なる血清型由来のｃａｐ遺伝子によ
って、交換され得る。例えば、ＡＡＶ−２由来のｒｅｐ遺伝子が、ＡＡＶ−１由
来のｃａｐ遺伝子とともに使用されて、偽型ｒＡＡＶ−２を産生し得るか、また
はその逆である。

【００５５】代替の実施形態において、Ｒｅｐタンパク質および／またはＣａｐタンパク質
は、変異Ｒｅｐタンパク質および／またはＣａｐタンパク質がこれらのそれぞれ
の切除、複製およびカプシド化の機能を維持する限り、特定のアミノ酸残基の挿
入、欠失、フラグメントまたは点変異を含む変異配列を有し得る。好ましい実施
形態において、ＡＡＶ−２由来の天然に存在するＲｅｐアミノ酸配列およびＣａ
ｐアミノ酸配列が使用される。１つの実施形態において、単一のアデノウイルス
は、Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする核酸配列を含む。別
の実施形態において、Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする核
酸配列は、１つのアデノウイルス内の単一の部位に挿入される。例えば、ｒｅｐ
とｃａｐとの両方が、アデノウイルスのＥ１、Ｅ３またはＥ４において挿入され
る。あるいは、ＲｅｐおよびＣａｐをそれぞれコードする核酸配列は、アデノウ
イルスゲノムにおける異なる遺伝子座に各々挿入される。例えば、Ｒｅｐをコー
ドする核酸配列はＥ１に存在し得、そしてＣａｐをコードする核酸配列はＥ４に
存在し得、そしてその他の組み合わせ。あるいは、ｃａｐ遺伝子を含む細胞株が
使用され得、この場合には、ｒｅｐ遺伝子のみが、アデノウイルスベクターにお
いて必要とされる。例えば、ＷＯ９８／２７２０４を参照のこと。

【００５６】Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８の発現を調節する最小のプロモーターは、宿主細
胞においてｒｅｐ遺伝子の基本的な発現のみを促進する任意のプロモーターであ
り得る。一般に、このプロモーターは、本質的にＴＡＴＡボックスをその唯一の
調節エレメントとして含むプロモーターである。好ましい実施形態において、最
小のプロモーターは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ熱ショックプロモーター（ＨＳＰ）
である。別の好ましい実施形態において、最小のプロモーターは、基本的なプロ
モーター活性のみを提供するアデノウイルスＥ１ｂ遺伝子由来の最小のプロモー
ターである。別の好ましい実施形態において、最小のプロモーターは、アデノウ
イルスｐＩＸ遺伝子の上流のプロモーター領域由来の７０ヌクレオチドのＤＮＡ
エレメントである。最小のｐＩＸプロモーターは、ＴＡＴＡボックスおよびＳｐ
ｌボックスを含み、そしてＡｄ５においては、ヌクレオチド３５１１〜３５８０
に対応する。他の多くのアデノウイルス血清型は、ｐＩＸ遺伝子およびその上流
プロモーターを同様に含み、そしてこれらのｐＩＸプロモーター由来の最小プロ
モーターは、同様に本発明に含まれる。他の最小プロモーターは、当該分野にお
いて周知であり、そして本発明の実施において使用され得る。別の好ましい実施
形態において、ｐ５プロモーターは、ともに欠失され、そしていずれのプロモー
ターによっても全く置換されない。

【００５７】本発明の別の実施形態において、Ｒｅｐ７８／６８タンパク質の活性は、ｒｅ
ｐ７８／６８遺伝子を変異させて野生型Ｒｅｐ７８／６８より活性の低いＲｅｐ
７８／６８タンパク質を産生することによって、弱められる。このことは、Ｒｅ
ｐ７８／６８タンパク質の活性を低くするように、Ｒｅｐ７８／６８タンパク質
のコード配列を変化させることによって、なされ得る。あるいは、この遺伝子に
よってコードされるＲＮＡを不安定化させ、従って産生されるＲｅｐ７８／６８
タンパク質の量を減少させるように、ｒｅｐ７８／６８のＤＮＡ配列を変更し得
る。

【００５８】ＤＮＡ配列が最小のプロモーターとしての使用に適切であるか否かを、ｒｅｐ
７８／６８のＡＴＧコドンの上流のＤＮＡ配列をプラスミド構築物またはアデノ
ウイルスベクターに挿入し、そしてｒＡＡＶゲノムを含む宿主細胞をそれぞれト
ランスフェクトまたは感染し、この宿主細胞をｒＡＡＶが産生される条件下でイ
ンキュベートし、産生されたｒＡＡＶの力価を測定し、そしてこの力価を、発現
が最小プロモーターによって調節されるｒｅｐ遺伝子を含むコントロールプラス
ミドまたはアデノウイルスを使用して産生されたものの力価と比較することによ
って、決定し得る。この宿主細胞は、このｒＡＡＶゲノムを、安定に含んでも一
時的に含んでもよい。あるいは、感染後にこの宿主細胞において産生されたＲｅ
ｐ７８およびＲｅｐ６８のレベルを測定して、十分に低レベルのＲｅｐ７８およ
びＲｅｐ６８が産生されたか否かを決定し得る。

【００５９】（ヘルパー機能）上で議論したように、ＡＡＶは、ＡＡＶの切除、複製およびカプシド化のため
に、ヘルパー機能を必要とする。ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルス、ヘル
ペスウイルス［単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）または２型（ＨＳＶ−
２）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）を
含む］によってか、または細胞を異なる化学的因子もしくは物理的因子に曝露す
ることによって、提供され得る。あるいは、当業者は、本明細書中に開示される
組成物および方法を使用して、ｒＡＡＶを産生することによって、どのヘルパー
機能が必要とされるかを決定し得る。

【００６０】高レベルのｒＡＡＶ産生のためにはどのヘルパー機能が必要とされるかを同定
するために、ｒＡＡＶゲノムを含む宿主細胞を、ｒｅｐおよびｃａｐを含むプラ
スミドでトランスフェクトし得、次いで種々の潜在的なヘルパー機能をコードす
る核酸の１つでトランスフェクトして、どの潜在的なヘルパー機能がｒＡＡＶ産
生のために必要とされるかを決定し得る。ｒＡＡＶゲノムは、宿主細胞に安定に
取り込まれ得るか、または当該分野において公知の方法によって、宿主細胞にト
ランスフェクトもしくは感染され得る。潜在的なヘルパー機能をコードする核酸
で宿主細胞をトランスフェクトした後に、次いで、産生されたｒＡＡＶの力価を
測定して、その核酸がヘルパー機能をコードするか否かを決定し得る。

【００６１】好ましい実施形態において、ヘルパー機能は、ウイルス由来の核酸である。よ
り好ましい実施形態において、ヘルパー機能は、アデノウイルス２型もしくは５
型、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶまたはＰＲＶに由来する。なおさらに好ま
しい実施形態において、ヘルパー機能は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４ＯＲＦ
６タンパク質、およびアデノウイルス由来のＶＡＩＲＮＡである。別の好まし
い実施形態において、この核酸は、ＨＳＶ（ＵＬ５、ＵＬ８およびＵＬ５２）と
ＨＳＶの主要な一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＵＬ２９）とのヘリカーゼ−プラ
イマーゼ複合体由来のヘルパー機能をコードする。あるいは、組換えＡＡＶのた
めのヘルパー機能は、化学的因子または物理的因子（紫外線、シクロヘキシミド
、ヒドロキシウレアおよび種々の発癌物質が挙げられる）によって、提供され得
る。

【００６２】ｒＡＡＶの産生のために必要とされるヘルパー機能は、当該分野において公知
の任意の方法によって、宿主細胞に送達され得る。ヘルパー機能は、プラスミド
のようなベクターを用いるトランスフェクションによるか、ヘルパー機能を含む
ウイルスベクターを用いる感染によるか、または上で議論したものを含む当該分
野において公知の任意の他の方法（例えば、ＤＮＡの生体分解（ｂｉｏｌｉｓｔ
ｉｃ）注射、ＤＮＡ結合体の使用など）によって、送達され得る。トランスフェ
クションまたは感染は、安定であっても一時的であってもよい。あるいは、細胞
株は、（染色体外エピソーム上でかまたは細胞のゲノムへの取り込みを介してか
のいずれかで）ヘルパー機能を安定に発現し得る。さらに、ヘルパー機能のいく
つかは、哺乳動物細胞株によって発現され得、一方で他のヘルパー機能は、ベク
ターによって導入される。従って、２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５７３）
（これは、アデノウイルスＥ１ａタンパク質およびアデノウイルスＥ１ｂタンパ
ク質を構成的に産生する）におけるｒＡＡＶの産生のためには、Ｅ２ａ、Ｅ４Ｏ
ＲＦ６およびＶＡＩのみが、ベクターのトランスフェクションまたは感染によっ
て、宿主細胞に導入されなければならない。

【００６３】好ましい実施形態において、ヘルパー機能は、アデノウイルスによって宿主細
胞に形質導入される。より好ましい実施形態において、ヘルパー機能のいくらか
または全てが、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子を含むアデノウイルス
によって、宿主細胞に形質導入される。好ましい実施形態において、ネイティブ
のヘルパー機能配列が使用される。しかし、変異されたヘルパー機能配列がそれ
らのヘルパー機能活性を維持する限り、変異されたヘルパー機能配列が使用され
得る。ヘルパー機能核酸は、そのネイティブのプロモーターを補充され得るか、
あるいは当該分野において公知であるかまたは上で議論されるように、構造的ま
たは誘導的な種々のプロモーター（例えば、それぞれＣＭＶ即時性初期プロモー
ター／エンハンサーまたは亜鉛誘導的メタロチオネリンプロモーター）の調節制
御下にあり得る。

【００６４】（ｒＡＡＶ導入遺伝子カセット）導入遺伝子を含むｒＡＡＶを製造するために、本発明の方法は、所望の導入遺
伝子で開始し、次いでこの導入遺伝子を適切な発現調節配列（ＥＲＳ）（例えば
、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化部位）と会合させ、次いでこの
ＥＲＳ−導入遺伝子構築物をＡＡＶ隣接配列（例えば、ＩＴＲ）の間に、通常そ
こに見出されるｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の代わりに挿入する。このＥＲ
Ｓ−導入遺伝子カセットの長さがＡＡＶｒｅｐ配列およびＡＡＶｃａｐ配列
より短く、そしてこのより短い長さが適切なパッケージングに対する妨害を呈す
る場合には、任意のスペーサーまたは「詰め物（ｓｔｕｆｆｅｒ）」配列が、パ
ッケージングのための適切な長さを維持するために、挿入され得る。次いで、Ａ
ＡＶ隣接配列と境界を接するＥＲＳ−導入遺伝子からなる導入遺伝子カセットは
、ｒｅｐ遺伝子を有するものとは別のアデノウイルスベクターに埋包され得る。
あるいは、導入遺伝子カセットは、プラスミドベクターに挿入され得、そして宿
主細胞にトランスフェクトされ得る。導入遺伝子カセットは、宿主細胞ゲノムへ
の取り込みによってかエピソームとしてかのいずれかで、宿主細胞内に安定に維
持され得るか、あるいはハイブリッドＡｄ／ＡＡＶウイルスでの感染によっての
ように一時的に導入され得る。例えば、実施例３および６〜８を参照のこと。導
入遺伝子カセットの各エレメントを、以下にさらに記載する。

【００６５】（導入遺伝子）導入遺伝子とは、目的のタンパク質をコードする核酸である；これは、遺伝選
択もしくは薬物選択を可能にする遺伝子（例えば、抗生物質に対する耐性を与え
る遺伝子）であり得るか、または例えば、緑色蛍光タンパク質を使用する場合に
は色によって、検出を可能にするレポーター遺伝子であり得る。あるいは、導入
遺伝子は、矯正的な適用のために有用な遺伝子であり得る。例えば、導入遺伝子
は、患者の欠損遺伝子の機能を置換または増大する正常な遺伝子であり得る。導
入遺伝子は、疾患の効果（例えば、置換または増大する遺伝子とは異なる遺伝子
の導入および発現）を阻止するが、欠損遺伝子の機能と同じ機能を有するかまた
はその機能と競合する遺伝子であり得る。導入遺伝子は、機能不全遺伝子、変異
遺伝子、またはウイルス遺伝子の発現を、患者においてブロックまたは抑制し、
これによって矯正的な効果を惹起する遺伝子であり得る。導入遺伝子はまた、保
護遺伝子（例えば、細胞のアポトーシス、傷害、毒性または死を予防する遺伝子
）であり得る。導入遺伝子はまた、動物において免疫原性応答を誘発することに
よる、種々の因子に対する免疫のために使用され得る。従って、患者への治療導
入遺伝子の送達は、欠損のいくらかのレベルの矯正を生じるか、または疾患の予
防のために有用である。導入遺伝子はまた、細胞傷害性を生じる因子に対する感
受性を与える遺伝子であり得る（例えば、ガンシクロビルに対する感受性を与え
るＨＳＶチミジンキナーゼの導入）。導入遺伝子はまた、インビトロでのタンパ
ク質の産生のため（例えば、治療タンパク質の大規模産生のため）に有用な遺伝
子であり得る。

【００６６】多くの遺伝子治療方法は、患者における遺伝子の発現において欠損を克服する
ために、外因性遺伝子を供給することを包含する。これらの欠損のうちのいくら
かは、先天的であり、そして患者の全ての細胞における特定の遺伝子の変異に起
因する。例えば、嚢胞性線維症においては、１つ以上の変異が、嚢胞性線維症膜
貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子において存在し、
このことは、ＣＦＴＲタンパク質が特性を機能させることを防ぐ。他の場合にお
いては、遺伝子発現における欠損は、患者の生活の間に起こる事故または疾患に
起因する。例えば、Ｉ型真性糖尿病においては、βランゲルハンス島細胞（これ
は、インスリンを産生する）が破壊され、その結果、この疾患を患う患者は、も
はやインスリンを合成し得ない。他の場合において、内因性遺伝子は構造的に正
常であり得るが、疾患、医療処置もしくは他の環境条件、または内因性遺伝子の
調節エレメントの変異に起因して、十分に高い量では転写および／または翻訳さ
れない。例えば、赤血球の産生が不十分である多くの血液障害（例えば、貧血）
が存在し、これは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはＥＰＯをコードする導入
遺伝子によって処置され得る。対照的に、遺伝子治療方法は、特定の遺伝子の過
剰発現が疾患状態を生じる場合に、使用され得る。例えば、免疫グロブリン重鎖
プロモーターによるｃ−ｍｙｃの過剰発現は、白血病を生じる。導入遺伝子はま
た、遺伝的免疫のため（すなわち、ヒトを含む動物において病原体に対する免疫
応答を惹起するため）に使用され得る。例えば、導入遺伝子は、ウイルス病原体
、細菌病原体または真菌病原体（例えば、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不
全ウイルス（ＨＩＶ）、またはヒト型結核菌）由来の配列を含み得る。

【００６７】細胞における発現のために適切な遺伝子としては、通常は細胞において発現さ
れるが、過剰発現または過少発現に起因してその産物が異常な量で産生される遺
伝子が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、発現のための適切な遺
伝子は、欠損遺伝子産物を置換する正常な遺伝子産物を発現するか、変異遺伝子
から発現される変異細胞ＲＮＡを修復もしくは破壊するリボザイムもしくはアン
チセンス分子をコードするか、またはウイルスＲＮＡを改変または破壊する、遺
伝子である。インビトロでタンパク質の産生のために使用される導入遺伝子は、
分泌因子（ホルモン、増殖因子および酵素を含む）のようなタンパク質を含む。

【００６８】導入遺伝子配列の組成物は、得られるｒＡＡＶについての意図される用途に依
存する。例えば、導入遺伝子配列の１つの型は、レポーター配列またはマーカー
配列を含み、これは、発現の際に、検出可能なシグナルを発生する。このような
レポーター配列またはマーカー配列としては、以下をコードするＤＮＡ配列が挙
げられるが、それらに限定されない：Ｅ．ｃｏｌｉ β−ラクタマーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、ＨＳＶチミジンキナー
ゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、細菌性クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ホタルルシフェラーゼ、真核生物膜結合タンパク質
（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質、
およびそれに対する高親和性の抗体が存在するかまたは慣用的に作製され得る当
該分野において周知の他のものを含む）、ならびに融合タンパク質（とりわけ赤
血球凝集素またはｍｙｃ由来の抗原タグドメインに適切に融合した膜結合タンパ
ク質を含む）。

【００６９】これらの配列は、これらの発現を駆動する調節エレメントと会合する場合に、
従来の手段（酵素アッセイ、Ｘ線アッセイ、比色定量アッセイ、蛍光アッセイま
たは他の分光学的アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイおよび免疫学的アッセ
イ（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよび免疫組織化学を含む）が挙げられる）によって検
出可能なシグナルを提供する。例えば、導入遺伝子がＬａｃＺ遺伝子である場合
には、ｒＡＡＶの存在は、β−ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによっ
て、検出される。同様に、導入遺伝子がルシフェラーゼである場合には、ｒＡＡ
Ｖ遺伝子発現は、照度計において光発生によって測定され得る。

【００７０】しかし、望ましくは、導入遺伝子は、この方法によって産生されるｒＡＡＶを
介して細胞または動物に送達され得る、非マーカー遺伝子である。導入遺伝子は
、生物学および医学において有用な広範な種々の遺伝子産物（例えば、タンパク
質、センス核酸もしくはアンチセンス核酸（例えば、ＲＮＡ）、または触媒ＲＮ
Ａ）から選択され得る。本発明は、正常な遺伝子が発現されるが正常より多いか
または正常より少ないレベルで発現される遺伝子欠損を、補正または改善するた
めに使用され得、そしてまた、機能的遺伝子産物が発現されない遺伝子欠損を、
矯正または改善するために使用され得る。好ましい型の導入遺伝子配列は、宿主
細胞において疾患を改善する（部分的改善を含む）に十分なレベルで所望の矯正
的遺伝子産物を発現する、治療遺伝子である。これらの治療核酸配列は、代表的
に、発現の際に遺伝したかもしくは遺伝していない遺伝欠損を矯正、補償もしく
は競合し得るか、または後成の障害もしくは疾患を処置し得る産物を、コードす
る。しかし、選択された導入遺伝子は、研究のために望ましい任意の産物をコー
ドし得る。導入遺伝子配列の選択は、本発明の限定ではない。導入遺伝子配列の
選択は、本願の教示に従って、当業者の技術の範囲内である。

【００７１】本発明はまた、ｒＡＡＶおよびその組成物を生成する方法を含み、この組成物
は、マルチサブユニットタンパク質によって引き起こされる遺伝子欠損を補正ま
たは改善するために使用され得る。特定の状況においては、異なる導入遺伝子が
、そのタンパク質の各サブユニットをコードするために使用され得る。このこと
は、このタンパク質サブユニットをコードするＤＮＡの大きさが大きい場合に（
例えば、免疫グロブリンまたは血小板由来の増殖因子レセプターに関して）、望
ましくあり得る。細胞がマルチサブユニットタンパク質を産生するために、細胞
は、異なるサブユニットの各々を発現するｒＡＡＶで感染される。

【００７２】あるいは、そしてより好ましくは、タンパク質の異なるサブユニットが、同じ
導入遺伝子によってコードされ得る。この場合には、単一の導入遺伝子が、これ
らのサブユニットの各々をコードするＤＮＡを含み、各サブユニットに対するＤ
ＮＡが、内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）によって分離される。ＩＲＥＳを
使用することにより、多重遺伝子またはポリシストロニックｍＲＮＡの作製が可
能となる。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化ｃａｐ依存性翻訳のリボソーム
走査モデルを回避し得、そして内部の部位において翻訳を開始し得る（Ｐｅｌｌ
ｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。例えば、Ｃ型肝炎およびピ
コルナウイルス科のファミリーのメンバー（例えば、ポリオおよび脳心筋炎）由
来のＩＲＥＳエレメントが、哺乳動物ｍＲＮＡ由来のＩＲＥＳと同様に、記載さ
れている（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ、１９９１）。ＩＲＥＳエレメン
トは、異種オープンリーディングフレームに連結され得る。ＩＲＥＳエレメント
によって、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のために、リボソ
ームにアクセス可能である。従って、複数の遺伝子が、単一のプロモーター／エ
ンハンサーを使用して効率的に発現されて、単一のメッセージを転写し得る。こ
のことは、サブユニットの各々をコードするＤＮＡの大きさが十分に小さく、こ
れらのサブユニットをコードするＤＮＡとＩＲＥＳとの合計が、そのウイルスが
含み得るＤＮＡインサートの最大の大きさ以下である場合に、好ましい。例えば
、ｒＡＡＶについては、このインサートの大きさは、約４．８キロベース以下で
あり得る；しかし、そのヘルパー機能の全てを欠くアデノウイルスについては、
このインサートの大きさは、約２８キロベースである。

【００７３】有用な遺伝子産物としては、ホルモンならびに増殖因子および分化因子が挙げ
られ、これには以下が挙げられるが、それらに限定されない：インスリン、グル
カゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、
成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、副腎皮質刺
激ホルモン（ＡＣＴＨ）、プロラクチン、メラトニン、バソプレシン、β−エン
ドルフィン、ｍｅｔ−エンケファリン、リューエンケファリン、プロラクチン放
出因子、プロラクチン抑制因子、コルチコトロピン放出ホルモン、甲状腺刺激ホ
ルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、小胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン
（ＬＨ）、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ア
ンギオポエチン、アンギオスタチン、エンドスタチン、顆粒球コロニー刺激因子
（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦ２、酸性線維芽細胞増殖因子
（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスホーミング増殖因子α（ＴＧ
Ｆα）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ
（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦβ
）スーパーファミリー（ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、または骨形態発生
タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１〜１５のいずれかを含む）のいずれかのもの、増
殖因子のヒレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）フ
ァミリーのいずれかのもの、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来の神経栄養因子（
ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３、ＮＴ−４／５およびＮＴ−６、シリ
ア線毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経膠細胞株由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ
）、ニュールツイン（ｎｅｕｒｔｕｉｎ）、ペルセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ
）、アグリン、セマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）／コラプシンのファミリ
ーの任意のもの、ネトリン−１およびネトリン−２、肝実質細胞増殖因子（ＨＧ
Ｆ）、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ）、ノギン、ソニックヘッジホッグおよびチロシ
ンヒドロキシラーゼ。

【００７４】他の有用な遺伝子産物としては、免疫系を調節するタンパク質が挙げられ、こ
れには、以下が挙げられるが、それらに限定されない：サイトカインおよびリン
ホカイン（例えば、トロンボポエチン（ＴＰＯ））、インターロイキン（ＩＬ）
ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６
、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ
−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、およびＩＬ−１７、単球化学誘
導タンパク（ＭＣＰ−１）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、顆粒球マクロファージ
コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、
単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよび
β（ＴＮＦαおよびＴＮＦβ）、インターフェロン（ＩＦＮ）ＩＦＮ−α、ＩＦ
Ｎ−βおよびＩＦＮ−γ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド。免疫系
によって産生された遺伝子産物もまた、本発明に含まれる。これらとしては、限
定されないが、以下が挙げられる：免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｉ
ｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞レセ
プター、キメラＴ細胞レセプター、単鎖Ｔ細胞レセプター、クラスＩおよびクラ
スＩＩのＭＨＣ分子、ならびに単鎖ＭＨＣ分子を含む操作されたＭＨＣ分子。有
用な遺伝子産物はまた、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊加速因子（ＤＡＦ
）、ＣＲ１、ＣＲ２およびＣＤ５９のような、相補的調節タンパク質を含む。

【００７５】さらに他の有用な遺伝子産物としては、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、
リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質についてのレセプターの
いずれか１つが挙げられる。このようなレセプターの例としては、とりわけ、以
下が挙げられる：ｆｌｔ−１、ｆｌｋ−１、ＴＩＥ−２；ｔｒｋファミリーのレ
セプター（例えば、ＴｒｋＡ）、ＭｕＳＫ、Ｅｐｈ、ＰＤＧＦレセプター、ＥＧ
Ｆレセプター、ＨＥＲ２、インスリンレセプター、ＩＧＦ−１レセプター、ＦＧ
Ｆファミリーのレセプター、ＴＧＦβレセプター、インターロイキンレセプター
、インターフェロンレセプター、セロトニンレセプター、α−アドレナリン作動
性レセプター、β−アドレナリン作動性レセプター、ＧＤＮＦレセプター、ｐ７
５ニューロトロフィンレセプター。本発明は、細胞外マトリックスタンパク質（
例えば、インテグリン）についてのレセプター、細胞内接着分子（例えば、ＩＣ
ＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３およびＩＣＡＭ−４）、血管細胞接着分
子（ＶＣＡＭ）およびセレクチン（Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＬ−
セレクチン）のような膜結合タンパク質の対レセプター（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅ
ｃｅｐｔｏｒ）を含む。本発明は、コレステロール調節についてのレセプター（
ＬＤＬレセプター、ＨＤＬレセプター、ＶＬＤＬレセプターが挙げられる）およ
びスカベンジャーレセプターを含む。本発明は、これらのレセプターについての
アポリポタンパク質リガンド（ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶおよびＡｐｏＥが挙げ
られる）を含む。本発明はまた、ステロイドホルモンレセプタースーパーファミ
リー（グルココルチコイドレセプターおよびエストロゲンレセプターが挙げられ
る）、ビタミンＤレセプターならびに他の核レセプターのような遺伝子産物を含
む。さらに、有用な遺伝子産物としては、以下が挙げられる：抗菌ペプチド（例
えば、ディフェンシンおよびマガイニン（ｍａｇｉｎｉｎ））、転写因子（例え
ば、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、Ａ
Ｐ−２、ｍｙｂ、ＭＲＧ１、ＣＲＥＭ、Ａｌｘ４、ＦＲＥＡＣ１、ＮＦ−κＢ）
、ロイシンジッパーファミリーのメンバー、Ｃ２Ｈ４ジンクフィンガータンパク
質（Ｚｉｆ２６８、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２が挙げられる）、Ｃ６ジンクフィンガー
タンパク質（グルココルチコイドおよびエストロゲンのレセプターが挙げられる
）、ＰＯＵドメインタンパク質（Ｐｉｔ１により例示される）、ホメオドメイン
タンパク質（ＨＯＸ−１が挙げられる）、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリック
スタンパク質（ｍｙｃ、ＭｙｏＤおよびミオゲニンが挙げられる）、ＥＴＳボッ
クス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴ
Ｆ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡ
ＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）、ウ
ィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス
結合タンパク質（例えば、ＧＡＴＡ−３）、ならびにフォークヘッドファミリー
のウィング化ヘリックスタンパク質（ｗｉｎｇｅｄｈｅｌｉｘｐｒｏｔｅｉ
ｎ）。

【００７６】他の有用な遺伝子産物としては、以下が挙げられる：カルバモイルシンテター
ゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ
、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒ
ドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α−１アンチトリプシン、グ
ルコース−６−ホスファターゼ、ポルホルビリノーゲンデアミナーゼ、第ＶＩＩ
因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ
Ｉ因子、第ＸＩ因子、フォン・ビルブラント因子、スーパーオキシドジスムター
ゼ、グルタチオンペルオキシダーゼおよびレダクターゼ、ヘムオキシゲナーゼ、
アンジオテンシン変換酵素、エンドセリン−１、心房性ナトリウム利尿ペプチド
、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ、プラスミノゲンアクチベーター、ヘパリン
補因子ＩＩ、活性化タンパク質Ｃ（第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ）、プロテインＣ、抗
トロンビン、シスタチオンβ−シンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、
アルブミン、イソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカル
ボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナ
ーゼ、インスリン、β−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホス
ホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ（Ｐプロテ
インともよばれる）、Ｈプロテイン、Ｔ−プロテイン、メンケズ病タンパク質、
腫瘍サプレッサ（例えば、ｐ５３）、嚢胞性線維症膜貫通レギュレーター（ＣＦ
ＴＲ）、ウィルソン病遺伝子の産物ＰＷＤ、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスム
ターゼ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、アセ
チルコリンシンテターゼ、プロホルモンコンバターゼ、プロテアーゼインヒビタ
ー、ラクターゼ、リパーゼ、トリプシン、胃腸管酵素（キモトリプシンおよびペ
プシンが挙げられる）、アデノシンデアミナーゼ、α１アンチトリプシン、メタ
ロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）、ＧＬＵＴ−１、ＧＬＵＴ−
２、トレハロースホスフェートシンターゼ、ヘキソキナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩ
Ｉ、グルコキナーゼ、以下の個々の鎖またはタイプのうちの任意の１つ以上：コ
ラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、ビトロネクチ
ンおよびテネイシン、ならびに自殺遺伝子（例えば、チミジンキナーゼおよびシ
トシンデアミナーゼ）。他の有用なタンパク質としては、リソソームにおける蓄
積症（ｌｙｓｏｓｏｍａｌｓｔｏｒａｇｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）に関与する
もの（酸−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼａ、α−−１−イズロニダー
ゼ、イズロン酸スルファターゼ、リソソームの酸αグルコシダーゼ、スフィンゴ
ミエリナーゼ、ヘキソサミナーゼ／ヘキソサミダーゼＡ、ヘキソサミニダーゼＡ
およびＢ、アリールスルファターゼＡ、酸リパーゼ、酸セラミダーゼ、ガラクト
シルセラミダーゼ、α−フコシダーゼ、α−マンノシドーシス、β−マンノシド
ーシス、アスパルチルグルコサミニダーゼ、ノイラミニダーゼ、ガラクトシルセ
ラミダーゼ、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニ
ダーゼ、アセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニダーゼＮ−アセチルトランスフ
ェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ、Ｎ−アセチル
ガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、β−グ
ルクロニダーゼ、ならびにヘキソサミニダーゼＡおよびＢ）が挙げられる。

【００７７】他の有用な導入遺伝子としては、天然に存在しないポリペプチドが挙げられる
（例えば、キメラまたはハイブリッドのポリペプチド、またはアミノ酸の挿入、
欠失もしくは置換を含む、天然に存在しないアミノ酸配列を有するポリペプチド
）。例えば、単鎖の操作された免疫グロブリンは、特定の免疫無防備状態の患者
において有用であり得る。他の有用なタンパク質としては、膜貫通ドメインおよ
び細胞質ドメインを欠く短縮化レセプターが挙げられる。これらの短縮化レセプ
ターは、レセプターによる付随するシグナル伝達なしで、リガンドに結合するこ
とによりそれらそれぞれのリガンドの機能を拮抗するために用いられ得る。他の
型の天然に存在しない遺伝子配列としては、センス分子およびアンチセンス分子
、ならびに触媒性核酸（例えば、リボザイム）が挙げられ、これらは、遺伝子の
発現を調節するために用いられ得る。

【００７８】他の有用な導入遺伝子としては、免疫応答を生成し得る抗原性ペプチドをコー
ドする導入遺伝子が挙げられる。これれらの導入遺伝子を含む組換えベクターは
、遺伝子免疫のために用いられ得る。有用な導入遺伝子としては、以下に特異的
なペプチドをコードする導入遺伝子が挙げられる：エプスタインバーウイルス；
ＨＩＶ；シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩお
よびＩＩ（ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩ）；Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝
炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎およびＳＥＮのウイルス；仮性狂犬病ウイルス；狂犬病
ウイルス；サイトメガロウイルス；ＲＳウイルス；パラインフルエンザウイルス
１型〜４型；流行性耳下腺炎ウイルス；風疹ウイルス；ポリオウイルス；麻疹ウ
イルス；インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型およびＣ型；ロタウイルス；単純ヘ
ルペスウイルス１型および２型；水痘−帯状疱疹ウイルス；ヒトヘルペスウイル
ス６型、７型および８型；ハンタ熱ウイルス；デング熱ウイルス；シンドビスウ
イルス；アデノウイルス；Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｃｈｌ
ａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；非定型的
なマイコバクテリア；ネコ白血病ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス；ウシ免疫不
全ウイルス；ウマ伝染性貧血ウイルス；ヤギ関節炎−脳脊髄炎ウイルス；ビスナ
ウイルス；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
種。導入遺伝子はまた、腫瘍および癌についての免疫を提供するために、腫瘍抗
原由来のペプチドに対して指向される。

【００７９】（発現制御配列）非常に多くの発現制御配列（ネイティブ、構成性、誘導性、および／または組
織特異的）が当該分野で公知であり、そして導入遺伝子ならびにｒＡＡＶの複製
およびキャプシド化機能をコードする核酸配列、ヘルパー機能およびリガンドの
発現を駆動するために利用され得る。発現制御配列の選択は、所望される発現の
型に依存する。真核生物細胞については、発現制御配列としては、代表的には、
プロモーター、エンハンサー（例えば、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイ
トメガロウイルスなどに由来するもの）、およびポリアデニル化配列が挙げられ
る。このポリアデニル化配列は、一般に、導入遺伝子配列の後ろ、かつ導入遺伝
子の３’隣接配列の前に挿入される。本発明において有用な導入遺伝子保有分子
はまた、イントロン（望ましくは、プロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝
子との間に位置する）を含み得る。１つの可能なイントロン配列はまた、ＳＶ４
０由来であり、そして後期１６Ｓ／１９Ｓイントロンとよばれる。使用され得る
別のベクターエレメントは、上記のように、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ
）である。ＩＲＥＳエレメントは、単一の転写物から１つを超えるポリペプチド
を生成するために使用され得る。ＩＲＥＳエレメントは、導入遺伝子、または複
製およびキャプシド化ポリペプチド、ヘルパー機能もしくはリガンドをコードす
る他の核酸配列のいずれかのために使用され得る。これらおよび他の一般的なベ
クターエレメントの選択は、従来どおりであり、そして多くのこのような配列が
利用可能である［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（例えば、３．１８−３．２６頁
および１６．１７−１６．２７頁）およびそこで引用された参考文献、ならびに
Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ
，１９８９を参照のこと］。

【００８０】１つの実施形態において、高レベルの構成性発現が所望される。このようなプ
ロモーターの例としては、レトロウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬ
ＴＲプロモーター／エンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロ
モーター／エンハンサー［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら，Ｃｅｌｌ，４１：５２１
−５３０（１９８５）を参照のこと］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レ
ダクターゼプロモーター、細胞質β−アクチンプロモーターおよびホスホグリセ
ロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない
。

【００８１】別の実施形態において、誘導性プロモーターが所望され得る。誘導性プロモー
ターは、外因的に供給された化合物によりシスまたはトランスのいずれかで調節
されるプロモーターであり、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：亜鉛誘導性メタロチオネイン（ｚｉｎｃ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｍ
ｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモーター；デキサメタゾン（Ｄｅ
ｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７ポリメラー
ゼプロモーター系［ＷＯ９８／１００８８］；エクジソン昆虫プロモーター［Ｎ
ｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３
５１（１９９６）］；テトラサイクリン抑制系［Ｇｏｓｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２）］
；テトラサイクリン誘導系［Ｇｏｓｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６
６−１７６９（１９９５）；Ｈａｒｖｅｙら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８（１９９８）もまた参照のこと］；ＲＵ４８６
誘導系［Ｗａｎｇら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３（１９
９７）およびＷａｎｇら，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，４：４３２−４４１（１９９
７）］；ならびにラパマイシン誘導系［Ｍａｇａｒｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２（１９９７）；Ｒｉｖｅｒａら，Ｎａｔ
．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２：１０２８−１０３２（１９９６）］。この状況におい
て有用であり得る他の型の誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態（例えば
、温度、急性相）により、または細胞を複製することのみにおいて調節されるプ
ロモーターである。

【００８２】別の実施形態において、目的の導入遺伝子または核酸配列についてネイティブ
なプロモーターが用いられ得る。このネイティブなプロモーターは、導入遺伝子
または核酸配列の発現がネイティブな発現を模倣することが望まれる場合に好ま
しくあり得る。このネイティブなプロモーターは、導入遺伝子または他の核酸配
列の発現が一時的にもしくは発生的に、または組織特異的様式で、または特定の
転写刺激に応答して調節されねばならない場合に用いられ得る。さらなる実施形
態において、他のネイティブな発現制御配列（例えば、エンハンサーエレメント
、ポリアデニル化部位またはコザックコンセンサス配列）はまた、ネイティブな
発現を模倣するために用いられ得る。

【００８３】１つの実施形態において、組換えウイルスゲノムは、組織特異的プロモーター
に作動可能に連結された導入遺伝子を含む。例えば、骨格筋における発現が望ま
れる場合、筋肉において活性なプロモーターが使用され得る。これらとしては、
骨格筋α−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナ
ーゼ、ならびに天然に存在するプロモーターより高い活性を有する合成筋肉プロ
モーター［Ｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１−２４５（１９９
９）を参照のこと］をコードする遺伝子に由来するプロモーターが挙げられる。
組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、以下について公知である：肝
臓［アルブミン，Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３
２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター，Ｓａｎｄｉｇら，Ｇｅｎ
ｅＴｈｅｒ．，３：１００２−９（１９９６）；α−フェトプロテイン（ＡＦ
Ｐ），Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，７：１５０３−
１４（１９９６）］、骨［オステオカルシン，Ｓｔｅｉｎら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６（１９９７）；骨シアロタンパク質、Ｃｈｅｎ
ら，Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４（１９９６）］
、リンパ球［ＣＤ２，Ｈａｎｓａｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６
３−８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞レセプターα鎖］，神経性［
ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター，Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃ
ｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５（１９９３）；神
経線維軽鎖遺伝子，Ｐｉｃｃｉｏｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．８８：５６１１−５（１９９１）；ニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子
，Ｐｉｃｃｉｏｌｉら，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４（１９９５）］。

【００８４】当然のことながら、全てのベクターおよび発現制御配列が、本発明の導入遺伝
子または他の核酸配列の全てを発現するために十分に等しく機能するわけではな
い。しかし、当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、これらの発現制御配
列の中から選択し得る。選択した適切な宿主細胞において機能する適切なプロモ
ーター／エンハンサー配列は、本出願により提供される手引きを用いて当業者に
より選択され得る。このような選択は、慣用的な事項であり、そして分子の制限
でもなく、構築物の制限でもない。

【００８５】当業者は、１以上の発現制御配列を選択し、そして調節される核酸配列に発現
制御配列を作動可能に連結することにより、所望の導入遺伝子についての適切な
を同定し得る。次いで、当業者は、アデノウイルスベクターのゲノムに、発現制
御配列および調節配列を含む、これらの作動可能に連結された配列を挿入し得る
。１つの実施形態において、当業者は、発現制御配列および導入遺伝子を含む組
換えウイルスゲノムを、本発明のベクターに挿入し得る。本明細書中において教
示されるように、以下のｒＡＡＶを生成およびパッケージングする方法の後に、
当業者は、インビトロまたはインビボで適切な細胞を感染させ得る。細胞におけ
る導入遺伝子のコピー数は、サザンブロッティングまたは定量的ＰＣＲによりモ
ニターされ得；ＲＮＡ発現のレベルは、ノザンブロッティングまたは定量的ＲＴ
−ＰＣＲによりモニターされ得；そしてタンパク質発現のレベルは、ウェスタン
ブロッティング、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、インビトロもしくはイン
ビボでの導入遺伝子の遺伝子産物の生物学的活性の試験、または遺伝子欠損の矯
正または改善についての試験によりモニターされ得る。

【００８６】（隣接エレメント）天然に存在するＡＡＶＩＴＲは、反復配列、すなわち、通常（しかし、必要
ではない）ＡＡＶゲノムの５’末端および３’末端で約１４５ヌクレオチド長か
らなる。このＡＡＶＩＴＲは、野生型および組換えＡＡＶビリオン両方の複製
、切断およびキャプシド化に必要である。このＩＴＲは、ＡＡＶＤＮＡが宿主
細胞染色体に組み込まれる場合に、導入遺伝子に隣接している。ｒＡＡＶが宿主
染色体からレスキューされる場合、ＩＴＲは、導入遺伝子とともに切断され、そ
してビリオンへのパッケージングに適切な形態で、レスキューされたＤＮＡを取
り囲む隣接位置に保持される。このＩＴＲは、公知のアデノ随伴ウイルス（ＡＡ
Ｖ血清型１〜６を含む）のいずれか１つに由来し得る。本発明の好ましい実施形
態において、このｒＡＡＶは、発現調節配列およびＡＡＶ隣接エレメントに作動
可能に連結した、選択された導入遺伝子を含む。

【００８７】（宿主細胞）細胞培養に適合され得る哺乳動物細胞の任意の型は、組換えウイルスゲノムを
生成するための宿主細胞として用いられ得る。一般に、本発明において用いられ
る宿主細胞は、本発明のアデノウイルスベクターにより感染し得る細胞である。
宿主細胞の別の好ましい特徴は、高レベルでｒＡＡＶを複製し得る細胞である。

【００８８】適切な宿主細胞としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＨ
Ｏ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫおよび種々のマウス細胞（例えば、１０Ｔ１／２およびＷ
ＥＨＩ細胞）、アフリカミドリザル細胞（例えば、ＶＥＲＯ、ＣＯＳ１、ＣＯ
Ｓ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０）、ならびにヒト細胞
（例えば、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ヒト胚性網膜芽細胞（ＨＥＲ）、ヒ
ト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ）、ヒト胚性肺細胞（ＨＥＬ）およびＨＴ１０８０細胞
）。好ましい実施形態において、適切な細胞としては、以下が挙げられる：２９
３細胞（アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂタンパク質を発現するヒト胚性腎臓
細胞）、９１１またはＰＥＲ．Ｃ６細胞（アデノウイルスＥ１を発現するヒト胚
性網膜芽細胞；ＷＯ９７／００３２６を参照のこと）、Ｂ５０細胞（ＡＡＶｒ
ｅｐおよびｃａｐを発現するＨｅＬａ細胞，ＰＣＴＵＳ９８／１９４６３を参
照のこと）、８４−３１細胞（アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂおよびＥ４を発現
する２９３ベースの細胞、Ｒｅｆ．４）、１０−３細胞（アデノウイルスＥ１ａ
、Ｅ１ｂおよびＥ４ＯＲＦ６を発現する２９３ベースの細胞、Ｒｅｆ．１１）、
３Ｔ３細胞（マウス胚性線維芽細胞株）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（３Ｔ３細胞の亜系
）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝臓癌腫細胞株）、Ｓａｏｓ−２細胞（ヒト骨原性肉
腫細胞株）、ＨｕＨ７細胞またはＨｅＬａ細胞（ヒト癌腫細胞株）。

【００８９】上記に列挙した宿主細胞に加えて、他の宿主細胞が使用され得る。当業者は、
細胞株が、ｒｅｐ、ｃａｐおよび全ての必要なヘルパー機能の存在下で本発明の
アデノウイルスを細胞株に感染させ、ｒＡＡＶが生成される条件下でこの細胞を
培養し、次いで、感染性ｒＡＡＶの力価を測定することにより、哺乳動物宿主細
胞としての使用に適切であるか否かを決定し得る。次いで、当業者は、潜在的な
宿主細胞において生成された感染性ｒＡＡＶの力価と、他の宿主細胞により生成
された力価とを比較して、この細胞株がｒＡＡＶ生成に良好であるか否かを決定
し得る。

【００９０】（アデノウイルスから組換えアデノ随伴ウイルスを生成する方法）本発明の別の局面は、本発明のアデノウイルスからｒＡＡＶを生成する方法で
ある。この方法は、以下の工程を包含する：１．ｒＡＡＶゲノムを含む宿主細胞に、最小のプロモーターの調節制御下で
またはプロモーターなしで、ｒｅｐ遺伝子を含むアデノウイルスを感染させる工
程；２．この感染した宿主細胞を、ｒＡＡＶゲノムが切断され、複製され、そし
てキャプシド化される条件下で増殖させる工程；および３．この哺乳動物宿主細胞から上記のｒＡＡＶを回収する工程。

【００９１】この宿主細胞は、当該分野で公知または本明細書中で記載される任意の哺乳動
物宿主細胞であり得る。この宿主細胞は、ｒｅｐ遺伝子を含むアデノウイルスで
感染させる前に、以下の遺伝子エレメントの１つ以上を発現する細胞であり得る
：１）ｃａｐ遺伝子、２）いくつかまたは全ての必要なヘルパー機能（例えば、
２９３細胞）、および／または３）ｒＡＡＶゲノム。あるいは、この宿主細胞は
、アデノウイルスで感染させる前に、これらの遺伝子エレメントのいずれも含ん
でいなくてもよい。この場合に、この遺伝子エレメントは、ｒｅｐ遺伝子、他の
ウイルスベクター、および／またはプラスミドを含むアデノウイルスにより供給
される。

【００９２】この宿主細胞は、当該分野で公知または本明細書中に記載のいずれかの方法に
よりアデノウイルスで感染され得る。宿主細胞にアデノウイルスを感染させる方
法は、当該分野で周知であり、そして本明細書中でも記載される。一旦、この宿
主細胞が感染されると、ヘルパー機能は活性化され、そしてｒｅｐおよびｃａｐ
が生成される。ｐ５プロモーターが哺乳動物プロモーターで置換され、またはプ
ロモーターなしであるので、低レベルのＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８が生成され
る。これは、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０のレベル（ともに、アデノウイルスｐ
１９プロモーターから発現される）、ならびにキャプシドタンパク質（ＡＡＶ
ｐ４０プロモーターから発現される）と組み合わせると、高力価のｒＡＡＶを生
成するに十分である。

【００９３】Ｒｅｐがウイルス複製を妨害する他のウイルスベクターを用いてｒＡＡＶを生
成する方法はまた、本明細書中の教示に従って行われ得る。

【００９４】このｒＡＡＶは、宿主細胞により生成された上清から、または当該分野で公知
または本明細書中に記載の任意の方法による細胞溶解物から精製され得る。ｒＡ
ＡＶを回収し、そして精製する方法は、実施例５および６に記載される。

【００９５】この方法は、工業的生産に対して容易に増減される。なぜなら、これは、ｒＡ
ＡＶを生成するために多数の宿主細胞のトランスフェクションを必要としないか
らである。好ましい実施形態において、宿主細胞のアデノウイルスによる単一の
感染のみが、高力価で大量のｒＡＡＶを生成するために必要である。例えば、実
施例５を参照のこと。別の好ましい実施形態において、宿主細胞は、２つの異な
るアデノウイルス（一方は、最小のプロモーターの下流に（またはプロモーター
なしで）ｒｅｐ、およびｃａｐを含み、そして他方は、ｒＡＡＶゲノムを含むア
デノウイルス）で同時感染される。宿主細胞のアデノウイルスによる感染は、非
常に効率的であり、そして多数の細胞に対して容易に増減され得る。

【００９６】本明細書中に記載した方法は、高力価でｒＡＡＶを生成する。好ましい実施形
態において、この力価は、少なくとも１０²粒子／細胞；好ましくは、少なくと
も１０³粒子／細胞；より好ましくは、１０⁴粒子／細胞；およびなおより好まし
くは、１０⁵または１０⁶粒子／細胞である。本発明はまた、ｒＡＡＶを含む宿主
細胞の溶解物および上清を含む。これらの溶解物および上清は、濃縮することな
く、高力価のｒＡＡＶがそこに含まれるので、先行技術の方法により生成された
ものとは異なる。

【００９７】（ｒＡＡＶ組成物）本発明の方法により生成されたｒＡＡＶは、インビボおよびインビトロにおい
て一時的かつ安定な遺伝子移入の任意の形態について使用のために薬学的組成物
または薬理学的組成物として処方され得る。この組成物は、少なくともｒＡＡＶ
および薬学的に受容可能なキャリアを含む。このｒＡＡＶは、インビボおよびエ
キソビボでの遺伝子治療、遺伝子免疫、インビトロでのタンパク質生成および診
断アッセイのために使用され得る。

【００９８】遺伝子治療については、ｒＡＡＶは、エキソビボまたはインビボで細胞に導入
され得る。ウイルスがエキソビボで細胞に導入される場合、このｒＡＡＶは、イ
ンビトロで細胞に感染させるために用いられ得、次いで、所望ならば、続いてこ
の細胞を哺乳動物に（例えば、門脈にまたは脾臓に）導入され得る。あるいは、
このｒＡＡＶは、哺乳動物に直接（例えば、静脈内または腹腔内で）投与され得
る。徐放性デバイス（例えば、埋め込み式のポンプ）は、細胞へのウイルス送達
を容易にするために用いられ得る。このウイルスが哺乳動物に投与される場合、
感染される特定の細胞は、送達方法を制御することにより標的化され得る。例え
ば、ｒＡＡＶの門脈または肝臓の動脈への血管内投与は、肝臓細胞にｒＡＡＶを
標的化することを容易にするために用いられ得る。

【００９９】上記に記載の方法により産生されたｒＡＡＶは、好ましくは、生物学的に適合
する溶液または薬学的に受容可能な送達ビヒクル中に懸濁されて患者に投与され
得る。適切なビヒクルは、滅菌生理食塩水を含む。薬学的に受容可能なキャリア
であることが知られ、そして当業者に周知であるその他の水性および非水性滅菌
懸濁液がこの目的のために採用され得る。

【０１００】このｒＡＡＶは、所望の細胞を感染するに十分な量で投与され、そして、選択
された移入遺伝子（またはワクチンの場合ウイルス遺伝子産物）の十分なレベル
の形質導入および発現を提供し、過度の副作用なくしてか、または医療的に受容
可能な生理学的効果とともに、医療分野の当業者により決定され得る特定レベル
の矯正効果を提供する。従来および薬学的に受容可能な投与の経路は、標的器官
、組織または部位への直接投与；鼻内；静脈内；筋肉内；皮下；皮内；経口およ
びその他の非経口経路を含む。投与の経路は、所望であれば組み合わされ得る。

【０１０１】ｒＡＡＶの投与量は、主に、処置される症状および選択された遺伝子のような
因子に依存する。この投与量はまた、患者の年齢、体重および健康に依存して変
化し得る。例えば、ｒＡＡＶの有効なヒト投与量は、一般に、投与される用量あ
たり、１×１０⁷または１×１０⁸または１×１０⁹または１×１０¹⁰または１×
１０¹¹または１×１０¹²または１×１０¹³または１×１０¹⁴または１×１０¹⁵ま
たは１×１０¹⁶粒子の濃度でｒＡＡＶを含む、約０．５ｍｌ〜５０ｍｌの範囲の
生理食塩水である。この投与量は、任意の副作用に対して矯正利益を釣り合わせ
るために調節され得る。選択された遺伝子の発現のレベルがモニターされて、投
与量の投与のタイプおよび頻度を決定し得る。

【０１０２】本発明の以下の実施例は例示のみであり、そして本発明の範囲を限定する意図
ではない。

【０１０３】（実施例１：細胞株とウイルスおよびそれらの維持と増殖）すべての細胞株は、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および５０μｇ／ｍｌの
ペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１０μｇ／ｍｌのネ
オマイシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を補填した、ダルベッコの改変イーグル培地
（ＤＭＥＭ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中で維持される。ヒト胚腎臓細胞株２９３は
、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ１５７３）から得られる。アデノウイルスＥ１／Ｅ４または
ｆ６タンパク質を発現する２９３由来８４−３１細胞（１）、およびネイティブ
ｐ５プロモーターからＡＡＶ−２ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を発現するＨ
ｅＬａ由来Ｂ５０細胞（７）は、ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＨｕｍａｎＧ
ｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎ
ｉａのＧｕａｎｇｐｉｎｇＧａｏ博士から得られる。２９３−ＣＧ３は、マー
カー遺伝子としてＧＦＰに隣接するＡＡＶＩＴＲの安定に組み込まれたコピー
を保持する２９３由来細胞株である（Ｃｈｅｎら、非公開データ）。５型ヒトア
デノウイルス（ＡＴＣＣＶＲ−５）およびそれに由来する組換えアデノウイル
スは、２９３細胞上で増殖され、そしてＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋの改変法（
２）に従って、ＣｓＣｌグラジエント遠心分離により精製される。

【０１０４】（実施例２：プラスミドの構築および組換えアデノウイルスの生成）標準的な組換えＤＮＡ技法を採用して組換えプラスミドを作成する（３）。Ｄ
ｒａＩＩＩ部位（ＡＡＶ−２ｐ５プロモーターの上流、ヌクレオチド２４１）と
、ＮｃｏＩ部位（ポリＡシグナルの下流、ヌクレオチド４４８９）との間にｐＡ
Ｖ２のｒｅｐおよびｃａｐ配列を含むＤＮＡ（ＡＴＣＣ３７２１６）を、切り出
し、そして複数のクローニング工程で、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター
の転写制御下にあるＧＦＰ、およびＳＶ４０ポリＡシグナルの上流を含むＤＮＡ
カセットで置き換え、ｐＡＶ２シスＥＦＧＦＰを作成する（図１）。このＡＡＶ
−２ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、ＤｒａＩＩＩ部位（ｐ５プロモーターの上
流、ヌクレオチド２４１）と、ＢｓａＩ部位（ポリＡシグナルの下流、ヌクレオ
チド４４６４）との間に位置し、さらにサブクローン化されてｐＡｄ−ｐ５−Ｒ
Ｃを得る（図１）。ｐ５プロモーターを含むｐＡｄ−ｐ５−ＲＣのヌクレオチド
２４１と２８７との間の小ＤＮＡフラグメントを取り出し、そしてｐＩＮＤ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ
最小熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーターで置き換え、ｐＡｄ−ＨＳＰ
−ＲＣを作成する（図１）。組換えアデノウイルスＡｄ−ｐ５−ＲＣおよびＡｄ
−ＨＳＰ−ＲＣ（図２）は、当該分野で公知の標準的なプロトコールに従って生
成される（例えば、参考文献４および１２を参照のこと）。この組換えアデノウ
イルスは、適切な哺乳動物細胞上を５〜６回継代され、ｒＡＡＶの産生に用いら
れる組換えアデノウイルスのストックを生成する。

【０１０５】（実施例３：２９３細胞のトランスフェクションおよび２９３−ＣＧ３安定細
胞株の選択）２９３細胞を、６ｃｍの組織培養デッシュ中約７０％の集密度まで増殖させ、
そしてリン酸カルシウムトランスフェクション法によって、１μｇのｐＩＲＥＳ
１ｎｅｏおよび１０μｇのｐＡＶ２シス（ｃｉｓ）ＥＦＧＦＰを用いても一晩、
同時トランスフェクトする。単層に、１０％ＦＢＳ０含む新鮮培地を補給し、そ
して２４時間培養する。トリプシン処理の後、細胞を、１０％ＦＢＳを含む新鮮
培地中に１：２０希釈で接種する。さらに２４時間インキュベーションした後、
１，２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含む新鮮培地を、Ｇ
４１８耐性細胞の遺伝的選択のためにこの細胞単層に添加する。Ｇ４１８を含む
培地を、３〜４日毎に置換し、Ｇ４１８耐性細胞コロニーの形成を可能にする。
合計５０のコロニーを釣り上げ、そのうち６つが構成的なＧＦＰ発現を示す。こ
れら６つのクローンを増殖させ、そしてアデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、
およびＶＡＩ遺伝子ならびにＡＡＶｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子を保持するプラスミ
ドであるｐＢＶ−ＥｉＯＶ−ＲＣを用いたトランスフェクションによる機能的ｒ
ＡＡＶをレスキューするそれらの能力について試験する。１つの細胞クローン２
９３−ＣＧ３は、高効率のｒＡＡＶレスキューを示し、そして増殖させ、そして
さらなる実験に用いる。

【０１０６】（実施例４：アデノウイルスゲノム中に挿入されたＡＡＶ−２ｒｅｐおよび
ｃａｐ遺伝子のＰＣＲ分析）アデノウイルスゲノム中に組換えられたＡＡＶ−２ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝
子の組み込みを決定するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを採
用する。ＡＡＶ−２ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする完全ＤＮＡ配列を
重複させる４セットのプライマー対、ならびにアデノウイルスとｒｅｐ−ｃａｐ
配列との間の接続部を合成する。これらのプライマーは以下のようである：ＨＣ＃３０（５’−ＣＧＴＡＡＣＣＧＡＧＴＡＡＧＡＴＴＴＧＧ−３’；配列番
号１）、ＨＣ＃３１（５’−ＡＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＡＣ−３’
；配列番号２）、ＨＣ＃３２（５’−ＴＧＧＡＣＣＡＧＡＡＡＴＧＣＡＡＧＴＣ
Ｃ−３’；配列番号３）、ＨＣ＃３３（５’−ＡＧＣＣＴＴＧＡＣＴＧＣＧＴＧ
ＧＴＧＧＴ−３’；配列番号４）、ＨＣ＃３４（５’−ＧＴＡＣＣＴＧＴＡＴＴ
ＡＣＴＴＧＡＧＣＡ−３’；配列番号５）、ＨＣ＃３５（５’−ＡＣＧＡＧＴＣ
ＡＧＧＴＡＴＣＴＧＧＴＧＣ−３’；配列番号６）、ＨＣ＃３６（５’−ＧＧＡ
ＣＴＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＣＡＣＴＡ−３’；配列番号７）、およびＨＣ＃３７
（５’−ＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＣＴＧＡＣＧＡ−３’；配列番号８）。

【０１０７】ＰＣＲアッセイのためにアデノウイルスＤＮＡを得るため、ミニプレップ法を
採用する。簡単に述べれば、２９３細胞を１０ｃｍデッシュ中でほぼ集密まで生
育させ、そして次いでＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣまたはＡｄ−ｐ５−ＲＣのいずれかで
３日間の間感染する。感染させた細胞を回収し、ペレット化し、そしてＤＯＣ溶
解緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、２０％エタノール、０
．４％デオキシコール酸ナトリウム）中で溶解する。細胞の核酸をスペルミン−
ＨＣｌによって沈殿させ、そして上清液を集める。次いで、この上清液をＲＮａ
ｓｅＡおよびプロナーゼで処理し、その後フェノール−クロロホルム抽出する。
上清液中のアデノウイルスＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、そしてＴＥ／
ＲＮａｓｅ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、２０μｇ／ｍｌＲＮａｓｅ）中に溶解する。

【０１０８】ＰＣＲアッセイを、ＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒＧｒａｄｉｅｎｔ９６サーマル
サイクラー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施し、ＰＣＲ産物を１％アガロ
ースゲル上で分離し、そしてＤＮＡを臭化エチジウムで染色する。図３に示され
るように、テンプレートとしてＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣＤＮＡを用いるとき、すべ
ての４つの予期されたＤＮＡＰＣＲ産物が得られ、この組換え体のゲノム中に
完全長ＡＡＶ−２ｒｅｐ−ｃａｐＤＮＡが存在することを示す。しかし、８
８０ｂｐのＰＣＲ産物ＩＩＩは、Ａｄ−ｐ５−ＲＣＤＮＡから増幅されず、こ
の組換え体のｒｅｐ−ｃａｐＤＮＡ配列中の再配列または欠失事象を示唆する
。これらの結果は、アデノウイルスゲノムのＥ１遺伝子座中への挿入後、ＨＳＰ
−ｒｅｐ−ｃａｐＤＮＡの一体性および安定性を示し、そして同じ遺伝子座中
に挿入されたｐ５−ｒｅｐ−ｃａｐＤＮＡ配列は不安定であることを指摘する
。

【０１０９】（実施例５：Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣでの２９３−ＣＧ３細胞の感染によるｒＡＡ
Ｖの産生）Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣは、完全長ＡＡＶ−２ｒｅｐ−ｃａｐＤＮＡ配列を含
むことが示されているので、ｒＡＡＶを産生するその有用性が分析される。２９
３−ＣＧ３細胞を、６ウェルプレート中に１．０×１０⁶細胞／ウェルの密度で
接種する。１２〜１５時間の後、培養培地を細胞単層から除き、そして０．５ｍ
ｌの血清フリーのＤＭＥＭＡ中のｄ−ＨＳＰ−ＲＣウイルスの希釈物をこの細胞
に添加する。３０分のインキュベーションの後、１０％ＦＢＳを含む２．５ｍｌ
のさらなるＤＭＥＭを添加し、そして感染を合計３日間進行させる。感染細胞を
回収し、そしてペレット化する。細胞ペレットを、１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１．０ｍＭＭｇＣｌ₂、０．５％ＤＯＣ
）中、３×１分間の音波処理で溶解する。細胞残渣を、ＢｅｃｋｍａｎＧＳ−
６Ｒ遠心分離を用い、３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により除去する。
溶解液上清液を、ｒＡＡＶの滴定のために回収する。

【０１１０】この溶解液中のｒＡＡＶを滴定するために、８４−３１細胞（１）を、２４ウ
ェルプレート上で、使用の３〜４時間前に２×１０⁵細胞／ウェルの密度のプレ
ートとする。ｒＡＡＶ溶解液を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で希釈し、そし
て５６℃で６０分間加熱し、汚染しているＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣを不活性化する。
このｒＡＡＶ溶解液を単層に添加し、細胞を約２４時間インキュベートし、そし
てＧＦＰ発現細胞を形質導入単位（ＴＵ）としてスコアする。

【０１１１】図４に示されるように、結果は、ｒＡＡＶが２９３−ＣＧ３細胞の組換えＡｄ
−ＨＳＰ−ＲＣでの感染により首尾良く生成されることを示す。このｒＡＡＶ力
価は、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣの感染の多重度（ＭＯＩ）を増加することにより増加
する。２５０粒子／細胞のＭＯＩを用い、７０ＴＵ／細胞のｒＡＡＶが産生され
る。しかし、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣウイルスのＭＯＩをさらに増加することは、ｒ
ＡＡＶの収率を増加しない。その代わりに、おそらくは、より高いＭＯＩのＡｄ
−ＨＳＰ−ＲＣウイルスにともなう増加した細胞傷害性に起因する、ｒＡＡＶ収
率におけるわずかな減少が観察される。

【０１１２】（実施例６：Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺでの２９３細
胞の同時感染によるｒＡＡＶの産生）先の実施例では、ＡＡＶベクター配列は宿主細胞染色体中に安定に組み込まれ
るが、それらのレスキューおよびｒＡＡＶ中へのパッケージングに必要なｒｅｐ
−ｃａｐ機能はＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣにより提供される。Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣ組換
え体の機能性を決定する別の尺度として、ＡＡＶベクター配列が２９３細胞中に
外因的に送達され、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣでの感染後、それらがレスキューされ、
かつｒＡＡＶ粒子中にパッケージングされるか否かを決定する。この実験を実施
するため、２９３細胞を６ウェルプレート上に１×１０⁶細胞／ウェルの密度で
接種する。１２〜１５時間後、細胞を、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ
−ＬａｃＺ、Ｅ１遺伝子座中に挿入されたＡＡＶ−２ＩＴＲによって隣接され
るＥ．ｃｏｌｉｌａｃＺ遺伝子（４）を含むＥ１欠失アデノウイルスで同時感
染する。

【０１１３】いずれかのウイルスのＭＯＩを変えることのｒＡＡＶ収率に対する影響をさら
に調査するために、以下の実験を行う。異なる量の２つのウイルス（５０〜４５
０粒子／細胞）を、一定の５００粒子／細胞で総接種材料を維持しながらともに
混合する（図５）。このウイルス混合物を、種々の粒子／細胞比率（５０：４５
０、１００：４００、２００：３００、３００：２００、４００：１００、およ
び４５０：５０）で、０．５ｍｌの血清フリーＤＭＥＭ中で希釈し、そして上記
の細胞単層に添加する。３０分後、１０％ＦＢＳを含む２．５ｍｌのさらなるＤ
ＭＥＭを添加し、そして細胞をウイルス接種材料の存在下、さらに３日間インキ
ュベートする。

【０１１４】感染した細胞を回収し、溶解し、そしてｒＡＡＶ形質導入が、標準的プロトコ
ール（５）に従うＸ−ｇａｌ染色によるスコアされた細胞であることを除いて、
実施例５に記載のように、ｒＡＡＶを滴定する。この実験におけるｒＡＡＶは、
移入遺伝子としてｌａｃＺを保持するので、細胞染色が可能である。簡単に述べ
れば、このｒＡＡＶ形質導入細胞を、最初、０．５ｍｌの０．０５％グルタルア
ルデヒドで１０分間固定し、次いで３×０．５ｍｌのＰＢＳですすぐ。固定され
た細胞を、０．５ｍｌのＸ−ｇａｌ溶液を用いて室温で一晩染色する。Ｘ−ｇａ
ｌ溶液を除き、０．５ｍｌの７０％エタノールを添加して反応を終わらせ、そし
て青色に染色する細胞を形質導入単位としてスコアする。

【０１１５】図５に示されるように、結果は、２つの組換え体アデノウイルスＡｄ−ＨＳＰ
−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺによる２９３細胞の同時感染が２９３細胞
における高力価のｒＡＡＶを生成し得ることを明確に示す。このデータは、減少
するＭＯＩのＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよび増加するＭＯＩのＡｄ−ＡＡＶ−Ｌａｃ
Ｚを用い、生成されるｒＡＡＶの収率は、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣＭＯＩが１００
粒子／細胞以下に到達するまで比較的安定なままであることを示す。Ａｄ−ＨＳ
Ｐ−ＲＣのＭＯＩのさらなる減少は、おそらくは、より低いＭＯＩで産生される
低レベルのＲｅｐおよびＣａｐタンパク質に起因して、このｒＡＡＶ収率を劇的
に低減する。その一方、Ａｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺのＭＯＩを増加することは、こ
のｒＡＡＶ収率を増加しない。プラスミド同時トランスフェクションを用いるｒ
ＡＡＶ産生のための従来方法は、そのｒＡＡＶの収率が制限されるが、本発明は
は、高収率のｒＡＡＶを容易かつ効率的に産生する手段を提供する。

【０１１６】（実施例７：Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺを用いる２９
３細胞の同時感染によるｒＡＡＶ産生の時間経過および粒子比率研究）Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺを用いる２９３細胞の同時
トランスフェクションによるｒＡＡＶの最適産生に必要な条件をさらに研究する
ために、別の時間経過およびＭＯＩ研究を実施する。２９３細胞を実施例６に記
載のように６ウェルプレート中に接種し、そして両方のウイルスで、異なる時間
間隔の間、または異なる粒子／細胞比率で感染する。感染した細胞を回収および
溶解し、そして実施例６に記載のようにｒＡＡＶを滴定する。時間経過研究には
、各々１００粒子／細胞のＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺを
用いて２９３細胞を種々の時間の間感染する。

【０１１７】図６に示されるように、結果は、ｒＡＡＶが、２つのウイルスによる感染後、
２４時間程度の初期に検出されるが、そのレベルは、感染後７２時間にピークと
なることを示す。２００ＴＵ／細胞より多いｒＡＡＶが２つのウイルスによる感
染後４８〜９６時間の間に生産される。高レベルのｒＡＡＶ生産のために必要な
２つのウイルスの最適ＭＯＩを決定するために、２９３細胞を、等しいＭＯＩの
２つのウイルスにより７２時間感染し、そして回収し、そしてｒＡＡＶ力価を決
定する。図７に示されるように、増加するインプットのＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよ
びＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺウイルスにより、ｒＡＡＶの収率が、各ウイルスの１
２５粒子／細胞のＭＯＩまで増加することは明らかである。インプットアデノウ
イルスＭＯＩをさらに増加することは、ｒＡＡＶ収率を増加せず、そしてその代
わりにｒＡＡＶ収率のわずかな減少を生じる。これは、インプットアデノウイル
スのより高いＭＯＩから生じるより高い細胞変性効果に起因し得、これは次に感
染細胞からのｒＡＡＶ収率に影響し得る。

【０１１８】（実施例８：Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺを用いた２９
３細胞の同時感染後のｒＡＡＶＤＮＡの分析）Ａｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺハイブリッドゲノムからのｒＡＡＶＤＮＡの切除お
よび複製を分析するために、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺ
により同時感染された２９３細胞中の染色体外ＤＮＡをＨｉｒｔ（６）の方法を
用いて分析する。ｒＡＡＶＤＮＡレスキューおよび複製のポジティブコントロ
ールとして、高力価でｒＡＡＶを生成することが先に示されている別のシステム
を平行してアッセイする。コントロール系は、Ｂ５０細胞株の使用に基づき、こ
れは、先に、ＨｅＬａ細胞中に、内因性ＡＡＶ−２プロモーターを利用するｒｅ
ｐ／ｃａｐ含有プラスミド（７）を安定にトランスフェクトすることによって作
成された。この細胞株におけるｒＡＡＶ生産は、２ステッププロセスで生じる：
Ｂ５０細胞は、最初、アデノウイルスのＥ２ｂ遺伝子中の温度感受性変異体ｓｕ
ｂ１００ｒで感染され、ｒｅｐおよびｃａｐ発現を誘導し、そしてヘルパー機能
を提供する。２４時間後、細胞を、ＡＡＶベクター配列が複製欠損アデノウイル
スのＥ１領域中にクローン化されるハイブリッドＥ１欠失アデノウイルスによっ
て感染する。この細胞により発現されるＲｅｐおよびＣａｐタンパク質、および
ｓｕｂ１００ｒから発現されるアデノウイルスヘルパー機能の存在下、ハイブリ
ッドベクターにより送達されるｒＡＡＶゲノムはレスキューされ、複製され、そ
してｒＡＡＶ粒子にカプシド化される（７）。

【０１１９】２９３細胞は、１０ｃｍディシュ中でほぼ集密まで生育させ、そしてＡｄ−Ｈ
ＳＰ−ＲＣプラスＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺまたはＡｄ−ｐ５−ＲＣプラスＡｄ−
ＡＡＶ−ＬａｃＺのいずれかを各ウイルス２００粒子／細胞で同時感染する。ポ
ジティブコントロールＢ５０／ｓｕｂ１００ｒ実験は、Ａｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺ
がｓｕｂ１００ｒの添加後２４時間でＢ５０細胞に添加される（各々１，０００
粒子／細胞）ことを除いて同様の様式で実施される。ネガティブコントロールは
、Ａｄ−ｐ５−ＲＣ、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣまたはＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺ単独の
いずれかを用いた２９３細胞の単一ウイルス感染を含む。感染細胞を、感染後７
２時間で回収し、そして０．８５ｍｌのＨｉｒｔ溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭＥＤＴＡ、０．６％ＳＤＳ）中で溶解する。溶
解液を０．２５ｍｌの５ＭＮａＣｌと混合し、そして４℃で一晩インキュベー
トする。１４，０００ＲＰＭで４０分間のＳｏｒｖａｌｌ遠心分離機中の遠心分
離後、上清液を集め、そしてフェノール−クロロホルムで３回抽出する。低分子
量ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、ＴＥ／ＲＮａｓｅ緩衝液中に溶解し、
０．８％アガロースゲル上の電気泳動により分画し、そして臭化エチジウムで染
色する。

【０１２０】この実験の結果を図８に示す。Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−Ｌａ
ｃＺによる２９３細胞の同時感染は、ｒＡＡＶＤＮＡのモノマーおよび複製す
るダイマー形態に対応する４．８および９．６ｋｂのバンドを生じる（図８のレ
ーン４）。ボジティブコントロールもまた、ｓｕｂ１００ｒおよびＡｄ−ＡＡＶ
−ＬａｃＺでのＢ５０細胞の感染後、同じ２つのＤＮＡ種を示す（図８のレーン
６）。２９３細胞が、Ａｄ−ｐ５−ＲＣ（図８のレーン１）、Ａｄ−ＨＳＰ−Ｒ
Ｃ（図８のレーン２）、またはＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺ（図８のレーン３）いず
れか単独で感染されるネガティブコントロールでは、いずれのＤＮＡバンドも観
察されない。さらに、Ａｄ−ｐ５−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺによる２
９３細胞の同時感染はまた、いずれのｒＡＡＶＤＮＡ種も形成せず（図８のレ
ーン５）、Ａｄ−ｐ５−ＲＣがｒＡＡＶＤＮＡのレスキューまたは複製のため
のそのｒｅｐ／ｃａｐ機能が欠損していることを示す。

【０１２１】図８で検出された４．８および９．６ｋｂ染色体外ＤＮＡ種が実際にｌａｃＺ
移入遺伝子を含むことを確認するため、そしてこのようなＤＮＡ種の小量が実際
にネガティブコントロールレーンに存在しないことを確認するため、サザンブロ
ット分析を実施する。Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺにより
同時感染された２９３細胞またはｓｕｂ１００ｒおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺ
により感染されたＢ５０細胞のいずれかから単離されたＨｉｒｔ抽出ＤＮＡを、
０．８％アガロースゲル上で分離する（図９Ａ）。このゲルをニトロセルロース
メンブレンにトランスファーし、そしてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍからのＤｉＧＨｉｇｈＰｒｉｍｅＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＤｅｔｅ
ｃｔｉｏｎＳｔａｒｔｅｒＫｉｔＩＩを用いて、ジゴキシゲニン標識され
たｌａｃＺＤＮＡプローブとハイブリダイズする（図９Ｂ）。細菌プラスミド
から単離されたｌａｃＺＤＮＡフラグメントを、サザンブロットのためのポジ
ティブコントロールとして用いる（図９Ａおよび９Ｂ、レーン１）。

【０１２２】Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺにより同時感染された２９
３細胞（図９Ａおよび９Ｂ、レーン５）またはｓｕｂ１００ｒおよびＡｄ−ＡＡ
Ｖ−ＬａｃＺにより感染されたＢ５０細胞（図９Ａおよび９Ｂ、レーン７）のい
ずれかから単離されたｒＡＡＶＤＮＡのモノマーおよび複製するダイマー形態
の両方がｌａｃＺプローブにハイブリダイズする。サザンブロッティングは、Ａ
ｄ−ｐ５−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺによる２９３細胞の同時感染後（
図９Ａおよび９Ｂ、レーン６）、または、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣ（図９Ａおよび９
Ｂ、レーン２）、Ａｄ−ｐ５−ＲＣ（図９Ａおよび９Ｂ、レーン３）、またはＡ
ｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺ（図９Ａおよび９Ｂ、レーン４）いずれかにより単独感染
された２９３細胞からのＨｉｒｔＤＮＡを含むネガティブコントロールからは
、複製されたｒＡＡＶＤＮＡ種を検出しない。一緒に考慮して、これらの結果
は、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺによる２９３細胞の同時
感染がＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺゲノムからｒＡＡＶＤＮＡのレスキューおよび
複製を生じ、しかも複製するｒＡＡＶＤＮＡが実際にｌａｃＺ移入遺伝子を含
むことを示す。さらに、Ａｄ−ｐ５−ＲＣおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺによる
２９３細胞の同時感染後の複製ｒＡＡＶＤＮＡの欠如は、Ａｄ−ｐ５−ＲＣが
実際にｒＡＡＶＤＮＡのレスキューまたは複製のためのそのｒｅｐ／ｃａｐ機
能欠損であるという先の観察を支持する。

【０１２３】（実施例９：Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣウイルスで感染された２９３細胞におけるＲ
ｅｐ／Ｃａｐタンパク質発現の分析）Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣウイルスによって感染された細胞におけるＲｅｐタンパク
質およびＣａｐタンパク質の発現を分析するために、ウエスタンブロッティング
を実施する。２９３細胞を１０ｃｍディッシュ中でサブコンフルエントにまで増
殖し、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣ、Ａｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺまたはＡｄ−ｐ５−ＲＣの
いずれかで、各ウイルス２００粒子／細胞を使用して感染する。感染の７２時間
後に、細胞を収集し、ペレット化し、そしてＸｉａｏら（８）に記載されるよう
に処理する。簡単には、１つの１０ｃｍディッシュからの感染した細胞ペレット
を、０．５ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、１
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ＳＤＳおよび１５０ｍＭＮａＣｌを含む
）中で、超音波処理によって溶解する。サンプルを、４〜２０％勾配のポリアク
リルアミドゲル上でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によ
って分離し、そしてニトロセルロース膜に転写する。Ｒｅｐタンパク質を、モノ
クローナル抗体３０３．９を使用して検出し、そしてＣａｐタンパク質を、モノ
クローナル抗体Ｂ１（ＡｍｅｒｉｃａｎＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ
，Ｉｎｃ．）を使用して検出する（両方とも１：２０の希釈で）。タンパク質−
抗体複合体を、ＥＣＬ^TMウエスタンブロッティング分析システム（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）を使用して可視化する。

【０１２４】図１０に示されるように、Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質は、Ａｄ
−ＨＳＰ−ＲＣ単独で感染されるか（レーン３）、またはＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣと
Ａｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺとで同時感染される（レーン５）２９３細胞において発
現されるが、Ａｄ−ｐ５−Ｒｃ単独（レーン１）、Ａｄ−ｐ５−ＲＣに加えてＡ
ｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺ（レーン２）もしくはＡｄ−ｐ５−ＲＣに加えてＡｄ−Ａ
ＡＶ−ＬａｃＺ（レーン４）で感染される２９３細胞では発現されない。Ａｄ−
ＨＳＰ−ＲＣ感染に続いて発現したＲｅｐ５２タンパク質およびＲｅｐ４０タン
パク質のレベルは、産生された高レベルのｒＡＡＶに寄与する以前に報告された
事象（９）であるＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８のタンパク質発現よりも非常に高
い。ＨＳＰプロモーターの低い基底の転写活性は、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣ組換えア
デノウイルスを首尾よく作製するに重要な役割を実際に担い得る。なぜなら、Ａ
ＡＶＲｅｐタンパク質の発現は、アデノウイルス複製を干渉し得ることが公知
であるからである（１０）。これらのタンパク質の低レベルの発現は、この干渉
を最小化し得るが、ｒＡＡＶゲノムの切除および複製についてのＲｅｐの機能を
十分に提供し得る。

【０１２５】本明細書中に列挙される全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または
特許出願各々が参考として援用されるべく特定にかつ個々に示された場合は、本
明細書中に参考として援用される。前述の発明は、理解を明らかにするための図
解および例示の目的でいくらか詳細に記載されたが、添付の特許請求の範囲の精
神または範囲から逸脱することなく特定の変化および改変がなされ得ることは、
本発明の教示の観点で当業者には容易に明らかである。

【０１２６】（参考文献）

【０１２７】

【化１】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、組換えシャトルプラスミドｐＡＶ２ｃｉｓＥＧＦＰ、ｐＡｄ−ｐ５−
ＲＣおよびｐＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣの構築物を示す。

【図２】図２Ａは、親のＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスのゲノムを示す。図２Ｂは、Ａ
ｄ−ｐ５−ＲＣまたはＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣを作製するための、それぞれｐ５−ｒ
ｅｐ−ｃａｐＤＮＡ配列またはＨＳＰ−ｒｅｐ−ｃａｐＤＮＡ配列の、親ウ
イルスゲノムのＥ１座への挿入を示す、組換えアデノウイルスＡｄ−ｐ５−ＲＣ
およびＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣの例示的図表を示す。

【図３】図３Ａは、ウイルスゲノムならびに予期されるＰＣＲＤＮＡ産物Ｉ、ＩＩ、
ＩＩＩおよびＩＶに関するＰＣＲプライマーの位置を示す、Ａｄ−ｐ５−ＲＣま
たはＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣのＥ１座へのｒｅｐ−ｃａｐ挿入物の例示的図表を示す
。ＰＣＲ分析を使用して、アデノウイルスゲノム中に挿入されたＡＡＶｒｅｐ
−ｃａｐＤＮＡ配列の補完性を決定する。図３Ｂは、位置を図３Ａに示したプ
ライマーを使用したＰＣＲ産物のエチジウムブロマイド染色したアガロースゲル
を示す。レーン１、３、５、７は、Ａｄ−ｐ５−ＲＣのウイルスＤＮＡからのＰ
ＣＲ産物である。レーン２、４、６、８は、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣのウイルスＤＮ
ＡからのＰＣＲ産物である。Ｍは、１ｋｂＤＮＡラダーサイズマーカー（Ｇｉ
ｂｃｏＢＲＬ）である。

【図４】図４は、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣでの２９３−ＣＧ３細胞の感染後のｒＡＡＶの産
生を示す。

【図５】図５は、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣとＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺとでの２９３−ＣＧ３
細胞の同時感染後のｒＡＡＶの産生を示す。

【図６】図６は、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣとＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺとでの２９３細胞の同
時感染後のｒＡＡＶの産生の経時的研究を示す。

【図７】図７は、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣとＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺとでの２９３細胞の同
時感染後のｒＡＡＶ産生の感染の多様性の研究を示す。

【図８】図８は、２９３細胞（レーン１〜５）またはコントロールＢ５０細胞（レーン
６）におけるｒＡＡＶＤＮＡ複製を検出するために分画した、ＨｉｒｔＤＮ
Ａのエチジウムブロマイド染色したアガロースゲルを示す。レーン１、２９３細
胞のＡｄ−ｐ５−ＲＣでの感染；レーン２、２９３細胞のＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣで
の感染；レーン３、２９３細胞のＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺでの感染；レーン４、
２９３細胞のＡｄ−ＨＳＴ−ＲＣとＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺとでの同時感染；レ
ーン５、２９３細胞のＡｄ−ｐ５−ＲＣとＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺとでの同時感
染；レーン６、Ｂ５０細胞のｓｕｂ１００ｒおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺの段
階的感染。Ｍは、１ｋｂＤＮＡラダーサイズマーカー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）
である。

【図９】図９Ａは、２９３細胞からのＨｉｒｔＤＮＡサンプル（レーン２〜６）また
はコントロールＢ−５０細胞からのＤＮＡサンプル（レーン７）の、エチジウム
ブロマイド染色したアガロースゲルを示す。図９Ｂは、図９Ａにおいて示したゲ
ルの、ｌａｃＺＤＮＡプローブとのサザンブロット分析を示す。レーン１、陽
性コントロールとしてのｌａｃＺＤＮＡフラグメント；レーン２、２９３細胞
のＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣでの感染；レーン３、２９３細胞のＡｄ−ｐ５−ＲＣでの
感染；レーン４、２９３細胞のＡｄ−ＡＡＶＬａｃＺでの感染；レーン５、２９
３細胞のＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣとＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺとでの同時感染；レーン
６、２９３細胞のＡｄ−ｐ５−ＲＣとＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺとでの同時感染；
レーン７、Ｂ５０細胞のｓｕｂ１００ｒおよびＡｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺの段階的
感染。Ｍは、１ｋｂＤＮＡラダーサイズマーカー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）であ
る。

【図１０】図１０は、Ａｄ−ｐ５−ＲＣウイルスまたはＡｄ−ＨＳＰ−ＲＣウイルスで感
染した、２９３細胞でのＲｅｐタンパク質発現およびＣａｐタンパク質発現のウ
エスタンブロット分析を示す。レーン１、Ａｄ−ｐ５−ＲＣ単独；レーン２、Ａ
ｄ−ｐ５−ＲＣ＋Ａｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺ；レーン３、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣ単独
；レーン４、Ａｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺ単独；レーン５、Ａｄ−ＨＳＰ−ＲＣ＋Ａ
ｄ−ＡＡＶ−ＬａｃＺ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者カーツマン，ギャリーアメリカ合衆国ペンシルベニア 19010，ブリンマー，ヒルブルックロード 500 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA32 CA03 CA04 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA03 HA08 HA09 4B065 AA90X AA95X AA95Y AB01 AC20 BA01 BA02 BA23 CA44 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 BA35 CA01 CA53 MA13 MA17 MA22 MA23 MA52 MA57 MA59 MA66 NA03 NA05 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA09 CA12 CA20 MA13 MA17 MA22 MA23 MA52 MA55 MA57 MA59 MA60 MA66 NA03 NA05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ｒＡＡＶを製造するためのアデノウィルスベクターであって
、該アデノウィルスベクターがＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含み、そしてＡＡＶｐ
５プロモーターが、該ＡＡＶｒｅｐ遺伝子の上流で欠失される、アデノウィル
スベクター。
【請求項２】前記ＡＡＶｒｅｐ遺伝子が、前記ｐ５プロモーターの代わ
りに最小プロモーターを含む、請求項１に記載のアデノウィルスベクター。
【請求項３】前記ＡＡＶｒｅｐ遺伝子が、前記ｐ５プロモーターの代わ
りにプロモーターを含まない、請求項１に記載のアデノウィルスベクター。
【請求項４】前記アデノウィルスベクターが、ＡＡＶｃａｐ遺伝子をさ
らに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアデノウィルスベクター。
【請求項５】前記最小プロモーターが、ＴＡＴＡボックスを含む、請求項
２に記載のアデノウィルスベクター。
【請求項６】前記最小プロモーターが、最小限のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ熱
ショックプロモーターである、請求項２に記載のアデノウィルスベクター。
【請求項７】前記最小プロモーターが、最小限のアデノウィルスＥ１ｂプ
ロモーターである、請求項２に記載のアデノウィルスベクター。
【請求項８】前記ｒｅｐ遺伝子および前記ｃａｐ遺伝子が、前記アデノウ
ィルスベクターの位置に、１つ以上のアデノウィルスのＥ１遺伝子、Ｅ３遺伝子
、またはＥ４遺伝子の少なくとも一部の代わりに挿入される、請求項４に記載の
アデノウィルスベクター。
【請求項９】前記ｒｅｐ遺伝子および前記ｃａｐ遺伝子の両方が、前記ア
デノウィルスベクターの同じ位置内に挿入される、請求項８に記載のアデノウィ
ルスベクター。
【請求項１０】前記ｒｅｐ遺伝子および前記ｃａｐ遺伝子が、前記アデノ
ウィルスベクターの異なる位置内に挿入される、請求項８に記載のアデノウィル
スベクター。
【請求項１１】前記ｒｅｐ遺伝子および前記ｃａｐ遺伝子が、それぞれ異
なるＡＡＶ血清型に由来する、請求項４に記載のアデノウィルスベクター。
【請求項１２】組換えｒＡＡＶを産生するための方法であって、以下の工
程：ａ）請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアデノウィルスベクターを、ｒＡＡ
Ｖゲノムを含む宿主細胞に感染させる工程；ｂ）ｒＡＡＶが産生される条件下で該宿主細胞を増殖させる工程；およびｃ）該宿主細胞から該ｒＡＡＶを収集する工程、を包含する、方法。
【請求項１３】前記ｒＡＡＶゲノムが、前記宿主細胞の染色体に安定に組
み込まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】アデノウィルスベクターが前記ｒＡＡＶゲノムを含み、か
つｒｅｐ遺伝子を含む前記アデノウィルスベクターと前記宿主細胞に同時感染さ
れる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】前記アデノウィルスベクターが、ｒＡＡＶ産生について必
要なヘルパー機能を提供する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】前記宿主細胞が２９３細胞である、請求項１２に記載の方
法。
【請求項１７】前記ｒＡＡＶを精製する工程をさらに含む、請求項１２〜
１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞
、１０Ｔ１／２細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４
０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５
４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ
３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨＥＲ細胞、
ＨＥＫ細胞、ＨＥＬ細胞、またはＨｅＬａ細胞から選択される、請求項１２に記
載の方法。
【請求項１９】請求項１２〜１６または請求項１８のいずれか１項に記載
の方法により産生された、前記ｒＡＡＶを含む溶解物または上清。
【請求項２０】請求項１９に記載の方法により産生された、精製されたｒ
ＡＡＶ。
【請求項２１】請求項２０に記載のｒＡＡＶおよび薬学的に受容可能なキ
ャリアをさらに含む、薬学的組成物。
【請求項２２】請求項２０に記載のｒＡＡＶで哺乳動物細胞を感染させる
工程を包含する、所望の導入遺伝子の、該哺乳動物細胞への一過性または安定な
遺伝子転移のための、方法。
【請求項２３】前記一過性または安定な遺伝子転移が、インビトロ、イン
ビボ、またはエキソビボでの遺伝的免疫、遺伝的欠損の修復、またはタンパク質
の産生のためである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】前記ヘルパー機能が、アデノウィルス遺伝子Ｅ１Ａ、Ｅ１
Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、およびＶＡＩからなる群より選択される少なくとも
１つの遺伝子産物によりコードされるか、またはＨＳＶ１型遺伝子ＵＬ５、ＵＬ
８、ＵＬ５２、およびＵＬ２９からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝
子産物によりコードされる、請求項１５に記載のベクター。