KR102528156B1 - 파보바이러스 비리온을 포함하는 조성물 중의 dna 불순물 - Google Patents

파보바이러스 비리온을 포함하는 조성물 중의 dna 불순물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물 내 핵산 불순물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 DNA 불순물이 파보바이러스 비리온 내에 랜덤하게 캡슐화되지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 핵산 불순물을 확인하고 정량화하는 방법에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물이 임상적으로 순수한 것인지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다.

Description

파보바이러스 비리온을 포함하는 조성물 중의 DNA 불순물{DNA IMPURITIES IN A COMPOSITION COMPRISING A PARVOVIRAL VIRION}
본 발명은 바이러스학 및 유전자 치료 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 조성물에서 과다하게 나타나는 핵산 불순물을 확인 및/또는 정량화하는 방법에 관한 것이다.
아데노 관련 바이러스(AAV)에 기반을 둔 재조합 벡터는 수많은 임상 실험에 사용되어 왔으며 인간 유전자 치료에 대한 큰 기대를 가지고 있다. rAAV의 광범위한 성공을 책임지는 원칙적 특성은 양호한 안전 특성과 함께 지속적인 트랜스진(transegene) 발현을 확립할 수 있는 능력이다. 임상 등급 rAAV의 제조는 DNA 불순물의 최소화에 중점을 두고 있으며, DNA 불순물은 잠재적으로 종양 유전자, 항생제 마커 또는 벡터의 안전성을 손상시키는 면역원성 펩타이드를 암호화할 수 있다(Wright et al., 2008, Gene Ther. 15, 840-848).
최종 산물의 순도를 보장하기 위해 rAAV의 업스트림 및 다운스트림 프로세싱 모두에 상당한 진전이 있었지만, 원하지 않는 DNA의 완전한 제거는 그러한 것으로 보이지 않는다. 세포 또는 헬퍼 벡터 DNA의 패키징은 AAV 생물학의 부산물인 것으로 보이며, 의도된 트랜스진 DNA의 캡시드화와 본질적으로 연관되어있다. 무관한 DNA가 미리 형성된 캡시드에 캡슐화되면, 그 파티클은 의도된 발현 카세트만을 함유하는 캡시드와 구별되지 않게 되고, 이들을 분리하는 것은 사실상 불가능하다.
따라서, 임상 개발을 뒷받침하고 rAAV 벡터에서 원하지 않는 DNA의 존재와 관련된 위험을 이해하기 위해서, 의도하지 않은 단백질 발현이 예를 들어, 세포성 재배열, 종양 유발성 또는 원하지 않는 면역 반응과 같은 바람직하지 않은 영향들이 잠재적으로 벡터의 안전성 및/또는 효능을 제대로 발휘되지 못하게 할 수 있는 이론적인 가능성을 배제하기 위해, 사용된 rAAV의 생체 분포 프로파일을 반영하는 세포주의 범위에서 이들 유전 요소로부터 단백질 발현 잠재성을 평가할 필요가 있다.
지금까지, rAAV 제조물을 오염시키는 DNA 불순물의 존재와 농도가 문헌으로 보고되어왔다(Blouin et al., 2004, J. Gene Med. 6 Suppl 1, S223-S228; Nony et al., 2003, J. Virol. 77, 776-781, Chadeuf et al., 2005, Mol. Ther. 12, 744-753; Wright et al., 2008, 상기 참조). 이러한 불순물의 아이덴티티는 헬퍼 플라스미드 또는 숙주세포 DNA로 거슬러 추적되었다(Wright et al., 2008, 상기 참조). 제한된 수의 연구만이 코-패키징된 잔여 DNA로부터 기원한 추정 단백질 발현의 문제를 다루었다. Wright와 동료들은 인간 간세포 또는 마우스에 rAAV가 감염된 경우에 RT-qPCR에 의한 cap, amp(r) 및 두 개의 아데노 바이러스 유전자 E2A와 E4의 발현을 분석하여 검출가능한 전사물이 없음을 확인하였다(Hauck et al., 2009, Mol Ther. 17(1) 144-152] 참조). 반면에, Miller et al.은 상보성 측정(complementation assay)을 사용하여 cap 유전자의 발현을 유도하는 DNA 불순물을 발견하였다(Halbert et al., 2011, Gene Ther. 18(4): 411-417).
생물약제 비리온 제조물에서 DNA 불순물을 분석하기 위해 선택된 현재의 방법은 qPCR이다. 이 방법을 사용하여 특정 DNA 불순물의 존재 및 양을 결정한다. 중요하게도, 당업자는 따라서 DNA 불순물이 비리온에 랜덤으로 패키징되는 당해 기술분야의 일반적인 의견 일치가 있기 때문에, 검출할 DNA 불순물을 포어핸드로, 즉 qPCR을 수행하기 전에 선택한다. 그러한 (미리 선택된) DNA 불순물은 예를 들어, 숙주 세포 DNA, Rep, Cap 또는 플라스미드 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, Thorne et al(2009, Hum. Gene Ther. 20: 707-714)에 의해 나타낸 바와 같이, 숙주 세포 DNA 불순물은 두 개의 표적을 이용하여 모니터된다: HeLA-기반 생산 시스템에 대한 안전성 평가를 위한 관련 서열로서 인간 파필로마바이러스(HPV) E6/E7 형질전환 유전자 및 민감한 일반 마커로서 리보솜 RNA(rRNA)에 대한 고 발현, 고 복사 유전자. Thorne et al(상기 참조)에 따르면, 가장 보편적으로 패키징되는 서열은 AAV rep 및 cap 그리고 박테리아와 포유류 세포 선별 마커 유전자를 포함하는 패키징 플라스미드로부터 유도된다. 또한, Ye et al.(2011, Gene Ther.18,135-144)는 HSV 패키징 플라스미드로부터의 DNA 서열이 포유류 세포주에서 rAAV 생산 중에 랜덤으로 패키징된다는 것을 개시하였다. Ye et al에 따르면, AAV 비리온은 전체 HSV 게놈에 걸쳐 랜덤 프레그먼트를 포함한다. 또한, Chadeuf et al(상기 참조)은보다 보다 작은 DNA 플라스미드의 경우, 완전한 플라스미드 및 바이러스 ITRs이 선별 마커 유전자를 포함하는 비리온 내로 캡슐화된다는 것을 보여주었다. 따라서, DNA 불순물이 파보바이러스 비리온 내로 랜덤으로 패키징되는 것으로 보임에 따라 특정 뉴클레오티드 서열을 검출할 필요가 없는 것으로 보였다.
DNA 불순물이 비리온 내로 랜덤으로 패키징된다는 일반적인 교시와는 대조적으로, 본 발명은 일부 DNA 불순물이 실제로 과표현된(overrepresented) 것을 보여준다. 결론적으로, 생물약제 조성물에서 DNA 불순물을 검출하기 위해 현재 사용되는 방법은 조성물에 존재하는 DNA 불순물의 급격한 과소평가를 이끌 수 있다. 약학 조성물에서 DNA 불순물의 이러한 과소평가는 임상적으로 충분히 순수하지 않은 조성물의 투여를 초래할 수 있어 환자에게 잠재적 안전성 건강 위험을 초래할 수 있다.
따라서, 예를 들어, 생물약제 제조물과 같은 생물학적 조성물에서 과표현된 DNA 불순물을 확인하고 정량화하기 위한 수단 및 방법이 당 업계에 요구된다. 본 발명의 목적은 이러한 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
발명의 개요
제1견지로, 본 발명은 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 과표현된 핵산 불순물을 확인하고 정량화하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
a) 상기 조성물을 핵산 시퀀싱에 적용하여 뉴클레오티드 서열의 랜덤 판독을 얻는 단계;
b) 단계 a)로부터의 랜덤 판독을 상기 조성물 생산 공정에 사용된 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열과 비교하여, 랜덤 판독과 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열 사이의 매치(match)로 핵산 불순물을 확인하는 단계;
c) 파보바이러스 벡터 당 평균 판독수를 결정하는 단계; 및
d) 과표현된 핵산 불순물의 뉴클레오티드 당 판독수를 결정하는 단계로서, 판독 분포가 랜덤하지 않고 과표현된 불순물이 상기 생물학적 성분의 평균 판독수의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 50배를 포함하거나, 또는 핵산 불순물의 뉴클레오티드 당 판독수가 파보바이러스 벡터 당 평균 판독수의 적어도 0.001, 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.0 또는 10%인 경우에, 핵산 불순물이 과표현된 불순물로서 확인되는, 과표현된 핵산 불순물의 뉴클레오티드 당 판독수를 결정하는 단계
를 포함한다.
바람직한 구현으로, 단계 (a)에서의 핵산 시퀀싱은 하이-스루풋 시퀀싱(high-throughput sequencing)을 포함한다.
바람직한 구현으로, 파보바이러스 벡터는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터이다.
바람직한 구현으로, 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포, 플라스미드, 재조합 파보 바이러스 벡터 이외의 벡터 및 헬퍼 바이러스의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되며, 바람직하게 벡터는 배큘로바이러스 벡터이다.
바람직한 구현으로, 헬퍼 바이러스는 재조합 아데노바이러스 및/또는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스이다.
바람직한 구현으로, 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열은 Rep, Cap 및/또는 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 바람직하게 생물학적 성분은 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 보다 바람직하게 생물학적 성분은 적어도 하나의 파보바이러스 ITR가 측면에 위치하는 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 그리고 여기서 가장 바람직하게 생물학적 성분은 트랜스진 측면의 각 사이드 상에 적어도 하나의 파보바이러스 ITR가 위치하는 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직한 구현으로, 과표현된 핵산 불순물은 제2 또는 추가의 조성물로 정량화된다.
제2견지로, 본 발명은 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 핵산 불순물을 정량화하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 핵산 불순물의 상대 존재량을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 핵산 불순물은 파보바이러스 ITR 서열이 상기 조성물을 생산하기 위한 공정에 사용된 생물학적 성분에 존재하는 경우에 파보바이러스 ITR 서열에 바로 인접한 1 - 8000 bp, 1 - 5000 bp, 1 - 3000 bp, 1 - 1000 bp, 1 - 500 bp, 1 - 250 bp 또는 1 - 100 bp 사이에 위치한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 그리고 상기 생물학적 성분은 상기 파보바이러스 ITR 서열의 적어도 하나의 복사체가 측면에 위치하는 트랜스진을 포함한다.
바람직한 구현으로, 생물학적 성분은 숙주 세포, 플라스미드, 재조합 파보바이러스 벡터 이외의 벡터 및 헬퍼 바이러스로 구성되는 그룹으로부터 선택되며, 여기서 바람직하게 상기 벡터는 배큘로바이러스 벡터이다.
바람직한 구현으로, 파보바이러스 벡터는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터이다.
바람직한 구현으로, 핵산 불순물의 뉴클레오티드 서열은 ITR 서열이 조성물을 생산하는 공정에 사용되는 생물학적 성분에 존재할 경우에 파보바이러스 ITR 서열의 각 사이드 상에 바로 인접하여 위치한다.
바람직한 구현으로, 상대 존재량은 파보바이러스 벡터의 뉴클레오티드 서열 및/또는 조성물의 레퍼런스 서열과 비교하여 결정된다.
바람직한 구현으로, 상대 존재량은 다음에 의해 결정된다:
a) 상기 정의된 핵산 불순물의 핵산 당 평균 판독수; 및
i) 레퍼런스 서열의 핵산 당 평균 판독수; 및/또는
ii) 조성물 중의 파보바이러스 벡터 당 평균 판독수;
여기서, 판독수는 상기 정의된 방법에 의해 결정되며; 그리고/또는
b) 상기 정의된 핵산 불순물의 증폭; 및
i) 레퍼런스 서열; 및/또는
ii) 파보바이러스 벡터의 뉴클레오티드 서열.
바람직한 구현으로, 상대 존재량은 Q-PCR 및/또는 하이-스루풋 시퀀싱에 의해 결정된다.
바람직한 구현으로, 상기 방법은 상기 정의된 바와 같은 핵산 불순물 또는 이의 보체(complement)와 올리고뉴클레오티드 프라이머의 선택적인 하이브리드화 단계를 더 포함한다.
바람직한 구현으로, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 배큘로바이러스 서열의 일부 또는 이의 보체를 포함하는 핵산 불순물에 선택적으로 하이브리드화된다.
제3견지로, 본 발명은 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물이 임상적으로 순수한 것인지 여부를 결정하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
i) 상기 정의된 파보바이러스 벡터 조성물 중의 핵산 불순물을 정량화하는 단계; 및
ii) 핵산 불순물의 상대 존재량에 의한 결정시 상기 정의된 핵산 불순물이 레퍼런스 서열 및/또는 트랜스진이 존재하는 것에 비해 적어도 10, 100, 250, 1000 배 적은 경우에 임상적으로 순수한 것으로 조성물을 결정하는 단계
를 포함한다.
바람직한 구현으로, 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 약학 조성물이다. 대안적으로, 또는 다른 바람직한 구현과의 조합으로, 본 발명의 바람직한 구현으로, 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 파보바이러스 벡터가 패키징된 파보바이러스 캡시드를 포함한다. 대안적으로, 또는 다른 바람직한 구현과의 조합으로, 본 발명의 바람직한 구현으로, 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 포유류로부터 수득되거나 수득될 수 있는 샘플을 포함하지 않으며, 포유동물은 바람직하게 비인간 영장류이다.
도 1. DNase I에 AAV1-트랜스진(상단 패널)과 배큘로바이러스 DNA(중간 및 하단 패널)의 저항성. DNAse 처리 없이 또는 DNAse 처리로 세 가지 다른 프라이머 세트를 사용하여 Q-PCR로 검출된 DNA의 양. 각 프라이머 세트에 대해 2개의 배치를 시험하였다. a) 및 b) 프라이머 세트 59/60, c) 및 d) 프라이머 세트 180/181, e) 및 f) 프라이머 세트 340/341.
도 2. 배큘로바이러스 플라스미드 Bac.VD의 서열 지도. 사용된 프라이머 세트 및 ITRs가 표시되어 있다.
도 3. 다른 프라이머 세트에 의해 검출된 게놈 복사체의 상대적 양. 축에 앰플리콘의 위치가 표시되어 있다. Amplicon 5214-5284는 AAV-트랜스진 카세트의 CMV 프로모터를 나타낸다. Amplicon 73555-73604는 프라이머 세트 340/341에 의해 표적화되며 AAV-트랜스진 카세트로부터 가장 멀리 위치한다. 각 점은 하나의 측정값을 나타낸다.
도 4. 트랜스진을 포함하는 rAAV를 딥-시퀀싱에 의해 분석하였다. 수득된 판독을 트랜스진 (a), 캡 카세트 (b), 또는 rep 카세트 (c)와 정렬하였다.
도 5. rAAV를 딥-시퀀싱에 의해 분석하였다. 수득된 판독을 배큘로바이러스 게놈과 정렬하였다. 배큘로바이러스 백본의 뉴클레오티드 당 판독 분포를 나타내었다. 뉴클레오티드 1은 도 2에서와 같이 우측(right) ITR이다.
도 6. rAAV 벡터의 5개의 다른 배치들을 Illumina 또는 Roche 454를 가지고 Q-PCR 또는 딥-시퀀싱을 이용하여 DNA 불순물에 대해 시험하였다.
본 발명은 DNA 불순물이 파보바이러스 비리온으로 랜덤하게 피키징되지 않는다는 발견에 관한 것이다. 대신, 비리온 조성물에서 과다발현되는 핵산 불순물이 존재한다. 따라서, 제1견지로, 본 발명은 조성물에서 핵산 불순물을 확인하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 조성물은 파보바이러스 벡터를 포함한다. 상기 방법은 바람직하게 a) 조성물을 핵산 서열 분석하여 핵산 서열의 랜덤 판독을 얻는 단계; b) 단계 a)로부터의 랜덤 판독을 상기 조성물을 생산하기 위한 공정에 사용된 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열과 비교하여, 이에 의해 랜덤 판독과 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열 간의 매치로 핵산 불순물을 확인하는 단계를 포함한다. 확인된 핵산 불순물을 정량화하기 위해, 상기 방법은 바람직하게 c) 파보바이러스 벡터 당 평균 판독수를 결정하는 단계; 및 d) 판독의 분포가 랜덤하지 않고, 과다발현되는 불순물이 생물학적 성분의 평균 판독수의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 50배인 경우, 또는 핵산 불순물의 뉴클레오티드 당 판독수가 파보바이러스 벡터 당 평균 판독수의 적어도 0.001, 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.0 또는 10%인 경우, 핵산 불순물은 과다발현된 불순물로서 확인되는, 확인된 핵산 불순물의 뉴클레오티드 당 판독수를 결정하는 단계를 더 포함한다.
따라서, 본 발명의 방법은 조성물 중의 핵산 불순물의 확인 및 정량화에 관한 것이다. 핵산 불순물은 DNA 불순물 및/또는 RNA 불순물일 수 있고, 바람직하게 핵산 불순물은 DNA 불순물이다.
용어 "핵산 불순물(nucleic acid impurity)"은 예를 들어, 조성물을 생성하는 공정에 사용된 생물학적 성분의 뉴클레오티드와 같이, 파보바이러스 비리온에 패키징되는 것으로 의도되지 않은 어느 핵산 서열을 포함하는 것으로 이해된다. 특히, 각 측에 하나의 파보바이러스 ITR이 측면에 위치하지 않는 서열은 핵산 불순물을 구성할 수 있다.
본 명세서에서 "파보 바이러스 벡터(parvoviral vector)"는 적어도 하나(그리고 보통은 2개)의 파보바이러스 역위 말단 반복 서열(들)(ITRs)이 측면에 위치한 하나 이상의 관심 대상 폴리뉴클레오티드 서열(예, 관심 대상의 생성물을 암호화하는 유전자, 즉 "트랜스진(transgene)"에 대한 발현 구조물)을 포함하는 재조합 핵산 분자를 칭한다.
"판독의 랜덤 분포(random distribution of reads)"는 조성물을 생성하는 공정에 사용된 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열의 길이에 걸쳐 동일하게 정렬하는 판독 분포로서 본 명세서에서 정의된다. 특히, 판독의 랜덤 분포는 조성물을 생성하는 공정에 사용된 하나의 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열의 길이에 걸쳐 동일하게 정렬하는 판독 분포로서 정의된다. 보다 바람직하게, 판독의 랜덤 분포는 숙주 세포, 플라스미드, 재조합 파보바이러스 벡터 이외의 벡터 및 헬퍼 바이러스의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열의 길이에 걸쳐 동일하게 정렬하는 판독 분포로서 정의되며, 여기서 바람직하게 벡터는 배큘로바이러스 벡터이다. 따라서, 가장 바람직하게, 판독의 랜덤 분포는 배큘로바이러스 벡터의 뉴클레오티드 서열의 길이에 걸쳐 동일하게 정렬하는 판독 분포로서 본 발명에서 정의된다.
본 명세서에서 동일한 정렬은, 동일한 뉴클레오티드 서열의 어느 다른 영역과 비교하여 뉴클레오티드 서열의 특정 영역에 판독이 정렬되는 동일한 가능성으로서 정의된다. 바람직하게, 동일한 정렬에서 뉴클레오티드에 정렬하는 판독수는 그 뉴클레오티드 서열에 정렬하는 평균 판독수의 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10, 15 또는 20%를 넘어 벗어나지 않는다.
"판독의 비-랜덤 분포(non-random distribution of reads)"는 조성물을 생성하는 공정에 사용된 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열의 길이에 걸쳐 동일하게 정렬되지 않는 판독 분포로서 본 명세서에서 정의된다. 특히, 판독의 비-랜덤 분포는 조성물을 생성하는 공정에서 사용된 하나의 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열의 길이에 걸쳐 동일하게 정렬하지 않는 판독 분포로 정의된다. 보다 바람직하게, 판독의 비-랜덤 분포는 숙주 세포, 플라스미드, 재조합 파보바이러스 벡터 이외의 벡터 및 헬퍼 바이러스의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열의 길이에 걸쳐 동일하게 정렬하지 않는 판독 분포로 정의되며, 여기서 바람직하게 벡터는 배큘로바이러스 벡터이다. 따라서, 가장 바람직하게, 판독의 비-랜덤 분포는 배큘로바이러스 벡터의 뉴클레오티드 서열의 길이에 걸쳐 동일하게 정렬하지 않는 판독 분포, 즉 배큘로바이러스 벡터의 다른 영역에 비해 더 많은 판독이 배큘로바이러스 벡터의 특정 영역에 정렬하는 것을 의미하는 것으로 정의된다.
바람직하게 상기 조성물은 재조합 파보바이러스 벡터가 패키징 된 (적어도) 파보바이러스 캡시드를 포함하거나 이로 구성된 (재조합) 파보바이러스 비리온을 포함하는 조성물이다. 상기 조성물 및 그 성분은 보다 바람직하게 하기에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 바람직한 구현으로, 상기 방법은 파보바이러스 비리온으로 패키징 된, 즉 비리온 내에 캡슐화된 핵산 불순물의 확인 및/또는 정량화를 위한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 핵산 불순물은 파보바이러스 비리온을 포함하는 조성물의 뉴클레아제 처리(예, RNAse 또는 DNAse 처리) 후에 분해되지 않는다.
조성물
바람직한 구현으로, 파보바이러스 벡터는 조성물에 함유된다. 바람직하게, 상기 조성물은 약학 조성물이다. 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함하는 것이 바람직하다. 어느 적절한 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제가 본 조성물에 사용될 수 있다(참조 예, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, 1997년 4월).
바람직한 약학적 형태는 멸균 생리 식염수, 덱스트로즈 용액, 또는 완충 용액, 또는 다른 약학적으로 허용되는 멸균 체액과 조합될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 마이크로담체 비드와 같은 고체 담체가 사용될 수 있다.
대안적으로, 또는 다른 바람직한 구현과 조합하여, 본 발명의 바람직한 구현으로, 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 예를 들어, 포유동물로부터 수득되거나 수득가능한 간 또는 근육 샘플과 같은 샘플을 포함하지 않는다. 보다 바람직한 구현으로, 상기 조성물은 비인간 영장류로부터 수득되거나 수득가능한 샘플을 포함하지 않는다. 보다 바람직한 구현으로, 상기 조성물은 예를 들어, 비인간 영장류와 같은 포유동물의 근육 또는 간으로부터 유래된 게놈 DNA를 포함하지 않는다.
핵산 시퀀싱
본 발명에 따른 방법에서, 조성물에서 과다하게 나타나는 핵산 불순물이 확인되고 정량화된다. 과다하게 나타나는 핵산 불순물을 확인하고 정량화하기 위한 방법은 이에 한정하는 것은 아니나, 생거(Sanger) 시퀀싱 또는 하이-스루풋 시퀀싱(high-throughput sequencing)을 포함한다.
제1구현으로, 파보바이러스 벡터 DNA는 플라스미드 내로 클로닝되고 이어서 통상적인 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)이 수행될 수 있다. 생거 시퀀싱은 본 명세서에서 시험 관내 DNA 복제 동안 DNA 폴리머라아제에 의한 사슬 종결 디데옥시뉴클레오티드의 선택적 편입에 기초한 DNA 시퀀싱 방법으로 정의된다. 본 발명에 따른 생거 시퀀싱은 소위 사슬-종결자 생거 시퀀싱 및/또는 다이(Dye)-종결자 생거 시퀀싱을 포함한다. 바람직하게, 생거 시퀀싱은 다이-종결자 생거 시퀀싱이다. 다이-종결자 시퀀싱은 사슬 종결자 ddNTPs의 라벨링을 사용한다. 특히, 다이-종결자 시퀀싱에서, 각각의 4개의 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결자는 각각 상이한 파장에서 빛을 방출하는 형광 염료로 라벨링되고, 이는 단일 반응으로 시퀀싱을 가능하게 한다. 나노포어 DNA 시퀀싱, 터널링 전류 DNA 시퀀싱, 하이브리드화에 의한 시퀀싱, 질량 분석법을 이용한 시퀀싱, 마이크로플로이드 생거 시퀀싱, 현미경 기반 기술 및 RNAP 시퀀싱과 같은 다른 DNA 시퀀싱 방법이 마찬가지로 적절할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현으로, 핵산 시퀀싱은 하이-스루풋 시퀀싱을 포함한다. 하이-스루풋 시퀀싱(차세대 시퀀싱 또는 딥 시퀀싱이라고도 함)은 비-생거-기반 하이-스루풋 DNA 시퀀싱 기술을 의미한다. 수천, 수백만 또는 심지어 수십억 개의 DNA 스트랜드를 병렬로 시퀀싱할 수 있어, 실질적으로 더욱 증가하고 게놈의 생거 시퀀싱에서 종종 사용되는 프래그먼트-클로닝 방법의 필요성이 최소화된다.
본 발명에 따른 바람직한 방법에서, 하이-스루풋 시퀀싱은 헬리스코프(Heliscope) 단일 분자 시퀀싱, 단일 분자 실시간(SMRT) 시퀀싱, 이온 토런트 시퀀싱(이온 반도체), 454 시퀀싱(파이로 시퀀싱, Roche 454 Life SciencesTM, Branford, CT), Solexa(합성에 의한 시퀀싱, Illumina, Inc, San Diego, CA) 및/또는 SOLiD 시퀀싱(라이게이션에 의한 시퀀싱, ABI, Applied Biosystems, Indianapolis, IN)을 포함한다. 본 발명의 다른 바람직한 구현으로, 핵산 시퀀싱은 SOLiD, Solexa 및/또는 454 시퀀싱을 포함한다. 가장 바람직한 구현으로, 핵산 시퀀싱은 Solexa/Illumina 또는 454 시퀀싱을 포함한다.
본 발명에 따른 방법은 현재 공지된 하이-스루풋 시퀀싱 방법으로 제한되지 않는다. 특히, 본 발명의 방법에서 사용하기에 동등하게 적합한 새로운 하이-스루풋 시퀀싱 방법이 시간이 지남에 따라 개발될 것으로 이해된다. 특히, 하이-스루풋 시퀀싱 방법, 즉 단일 실행으로 수천, 수백만 또는 수십억의 판독을 생성하는 어느 방법으로 분류하는 어느 시퀀싱 방법이 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 방법에서, 랜덤 판독은 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 핵산 시퀀싱에 적용함으로써 얻어진다. (시퀀싱) "판독(read)" 또는 "카운트(count)"는 본 명세서에서 핵산 시퀀싱 방법 동안 생성된 염기의 개별 스트링으로 정의된다. 상이한 하이-스루풋 시퀀싱 방법들은 실행(반응) 당 상이한 수의 판독 및 상이한 길이의 판독을 생성할 수 있다. 예를 들어, Illumina는 실행 당 최대 30억 개의 판독을 생성하고, 한 판독은 50-300bp의 평균 길이를 갖는다. 한편, 454 시퀀싱은 약 700bp의 평균 길이를 갖는 판독으로 실행 당 약 1백만 개의 판독을 생성한다. 판독수(실행 당 판독수)와 판독 길이(판독 당 염기의 수)는 시퀀싱 실행마다 다를 수 있으며, 판독 길이와 실행 당 판독수는 다른 하이-스루풋 시퀀싱 방법의 추가 개발에 따라 증가할 것으로 예상된다.
과표현된 핵산 불순물 확인
본 발명의 일 구현으로, 상술한 바와 같이 얻어진 랜덤 판독은 조성물을 생성하는 공정에서 사용된 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열과 비교되며, 여기서 생물학적 성분으로부터의 뉴클레오티드 서열에 대한 랜덤 판독의 비교는 과표현된 핵산 불순물의 확인을 일으킨다. 생물학적 성분의 이 뉴클레오티드 서열은 의심되거나 의심되지 않은 공급원의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
의심되는 공급원의 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포, 플라스미드, 벡터 및 헬퍼 바이러스의 뉴클레오타이드 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 여기서 상기 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스 및/또는 헤르페스 심플렉스 바이러스이고/또는, 여기서 상기 벡터는 배큘로바이러스 벡터이다. 바람직한 구현으로, 의심되는 공급원의 뉴클레오티드 서열은 배큘로바이러스 벡터이다. 따라서, 본 발명에 따른 방법에서, 랜덤 판독은 의심되는 공급원의 뉴클레오티드 서열과 정렬되거나 비교되며, 이는 과표현된 핵산 불순물의 확인을 이끈다.
대안적으로 또는 이전 구현과 조합하여, 뉴클레오티드 서열의 공급원은 의심되지 않은 공급원의 뉴클레오티드 서열이다. 즉, 뉴클레오티드 서열의 공급원은 미리정해지지 않는다. 의심되지 않은 공급원의 뉴클레오티드는 본 발명의 방법에 따라 얻어진 랜덤 판독의 데노보(de novo) 어셈블리 및 이러한 어셈블리된 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 서열 데이터베이스와 비교함으로써 검색(retrieved)될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열 데이터베이스는 사적으로 또는 공개적으로 이용가능한 뉴클레오티드 서열 데이터베이스일 수 있다. 공개적으로 이용가능한 뉴클레오티드 서열 데이터베이스의 예는 이에 한정하는 것은 아니나, UCSC Genome Bioinformatics, GenBank, DDBJ, ENA, 등을 포함한다. 어셈블리된 서열을 사적으로 또는 공개적으로 이용가능한 데이터베이스의 서열과 비교하면 핵 산성 불순물의 확인이 이루어질 수 있다.
본 발명의 바람직한 방법으로, 조성물을 생성하는 공정에 사용된 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열은 의심되는 공급원의 뉴클레오티드 서열이다. 특히, 바람직한 구현으로, 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포, 플라스미드, 재조합 파보바이러스 벡터 이외의 벡터 및 헬퍼 바이러스의 뉴클레오타이드 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 특히, 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열은 파보바이러스 벡터의 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 숙주 세포는 조성물을 생성하는 공정에 사용된 어느 세포일 수 있다. 숙주 세포는 식물 세포, 박테리아 세포, 효모 세포 및 동물 세포로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 숙주 세포는 동물 세포이고, 더욱 바람직하게 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포 또는 곤충 숙주 세포이다. 본 발명의 가장 바람직한 구현으로, 숙주 세포는 곤충 숙주 세포이다. 조성물을 생성하는 공정에 사용된 숙주 세포의 뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA 및/또는 미토콘드리아 DNA를 포함한다. 바람직하게, 숙주 세포의 뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA를 포함한다. 게놈 DNA는 트랜스진, Rep를 암호화하는 유전자, Cap을 암호화하는 유전자 및 단백질을 암호화하는 유전자 또는 조성물을 생성하는 헬퍼 기능을 갖는 RNA로 구성되는 유전자의 그룹으로부터 선택된 유전자를 포함할 수 있다. 조성물을 생성하기 위한 이러한 단백질을 암호화하는 유전자 또는 헬퍼 기능을 갖는 RNA는 아데노바이러스 및/또는 헤르페스 심플렉스 바이러스와 같은 동물 바이러스 또는 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스로부터 유도될 수 있다. 대안적으로 또는 조합하여, 게놈 DNA는 ITR 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 구현으로, 숙주 세포의 게놈 DNA는 적어도 하나의 ITR 측면에 위치하는 트랜스진을 포함하고, 바람직하게 트랜스진은 각 사이드 상의 ITR 측면에 위치한다.
본 발명에 따른 플라스미드는 조성물의 생산 공정에 사용된 어느 플라스미드일 수 있다. 상기 플라스미드는 바람직하게 저항성 유전자, 트랜스진, Rep를 암호화하는 유전자, Cap을 암호화하는 유전자 및 단백질을 암호화하는 유전자 또는 상기 조성물을 생산하는 헬퍼 기능을 갖는 RNA로 구성되는 그룹으로부터 선택된 유전자를 포함한다. 대안적으로 또는 조합하여, 플라스미드는 ITR 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 구현으로, 플라스미드는 적어도 하나의 ITR 측면에 위치하는 트랜스진을 포함하고, 바람직하게 트랜스진은 각 사이드 상의 ITR 측면에 위치한다.
본 발명에 따른 벡터는 조성물의 생산 공정에 사용된 어느 벡터일 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드 및 인공 염색체로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현으로, 벡터는 바이러스 벡터이다. 가장 바람직한 구현으로, 벡터는 배큘로바이러스 벡터이다. 상기 조성물의 생산 공정에 사용되는 배큘로바이러스 벡터는 트랜스진, Rep를 암호화하는 유전자, Cap을 암호화하는 유전자 및 상기 조성물을 생산하는 헬퍼 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 유전자를 포함할 수있다. 대안적으로 또는 조합하여, 배큘로바이러스 벡터는 ITR 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 구현으로, 배큘로바이러스 벡터는 적어도 하나의 ITR 측면에 위치하는 트랜스진을 포함하고, 바람직하게 트랜스진은 각 사이드 상의 ITR 측면에 위치한다.
본 발명에 따른 헬퍼 바이러스는 조성물의 생산 공정에 사용된 어느 바이러스일 수 있다. 바람직한 구현으로, 헬퍼 바이러스는 파보바이러스 비리온을 생산하는 공정에 사용된다. 추가의 바람직한 구현으로, 헬퍼 바이러스는 재조합 아데노 관련 비리온(rAAV)을 생산하는 공정에 사용된다. 보다 바람직한 구현으로, 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스 및/또는 헤르페스 심플렉스 바이러스이다. 가장 바람직한 구현으로, 헬퍼 바이러스는 재조합 아데노바이러스 및/또는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스이다. 추가의 구현으로, 헬퍼 바이러스는 트랜스진, Rep를 암호화하는 유전자, Cap을 암호화하는 유전자 및 조성물을 생산하는 헬퍼 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 유전자를 포함한다. 대안 적으로 또는 조합하여, 헬퍼 바이러스는 ITR 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 구현으로, 헬퍼 바이러스는 적어도 하나의 ITR 측면에 위치하는 트랜스진을 포함하고, 바람직하게 트랜스진은 각 사이드 상의 ITR 측면에 위치한다.
바람직한 구현으로, 상기 조성물을 생산하는 공정에 사용된 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열은 배큘로바이러스 벡터로부터 유래된 것이다. 가장 바람직한 구현으로, 생물학적 성분으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 ITR 측면에 위치하는 트랜스진, 그리고 바람직하게는 두 개의 ITRs 측면에 위치하는 트랜스진을 포함하는 배큘로바이러스 벡터로부터 유래된 것이다.
상기와 조합하여 또는 대안적으로, 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열은 Rep, Cap 및/또는 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 바람직하게 생물학적 성분은 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 보다 바람직하게 생물학적 성분은 적어도 하나의 파보바이러스 ITR 측면에 위치하는 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 그리고 가장 바람직하게 생물학적 성분은 각 사이드 상의 적어도 하나의 파보바이러스 ITR 측면에 위치하는 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
핵산 시퀀싱을 이용한 과표현된 핵산 불순물 정량화
본 발명은 조성물에서 과표현된 핵산 불순물을 확인하고 정량화하는 방법을 개시하며, 여기서 상기 방법은 상기 조성물을 핵산 시퀀싱에 적용하여 뉴클레오티드 서열의 랜덤 판독을 얻는 단계를 포함한다. 핵산 불순물은 상기한 바와 같이 확인될 수 있다. 확인된 핵산 불순물은 조성물 중의 과표현된 핵산 불순물의 핵산 당 판독수를 결정함으로써 연속적으로 정량화될 수 있다.
핵산 당 판독수는 본 명세서에서 뉴클레오티드 서열의 특정 핵산에 정렬하는 판독수로서 정의된다. 따라서, 조성물 중의 핵산 불순물의 핵산 당 판독수는 핵산 불순물의 핵산에 특이적으로 정렬하는 판독수로서 이해된다.
뉴클레오티드 서열의 특정 핵산에 정렬하는 판독수는 이 특정 핵산이 조성물 중에 존재하는 빈도로 변환된다. 따라서, 특정 핵산에 정렬되는 많은 수의 판독은 조성물에 풍부하게 존재하는 핵산으로 이해된다. 대안적으로, 단지 몇몇의 판독이 특정 핵산에 정렬되면, 그 핵산의 존재는 조성물 중에 드문 것으로 이해된다.
본 발명의 방법에 따르면, 핵산 불순물은 판독 분포가 랜덤하지 않고 과표현된 불순물이 생물학적 성분의 평균 판독수의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 50배를 포함하는 경우, 또는 핵산 불순물의 핵산 당 판독수가 파보바이러스 벡터의 핵산 당 평균 판독수의 적어도 0.0005, 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 또는 10%인 경우에 핵산 불순물이 과표현된다.
파보바이러스 벡터 당 평균 판독수는 본 명세서에서 파보바이러스 벡터의 뉴클레오티드의 총 수로 나눈 파보바이러스 벡터에 정렬되는 총 판독수로서 정의된다. 바람직하게, 파보바이러스 벡터의 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400 또는 500개의 가장 상류의 뉴클레오티드의 판독 및 뉴클레오티드 및/또는 파보바이러스 벡터의 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400 또는 500개의 가장 하류의 뉴클레오티드의 판독 및 뉴클레오티드는 파보바이러스 벡터 당 평균 판독수를 결정할 때 고려되지 않는다. 이러한 판독은 파보 바이러스 벡터의 가장 상류 및/또는 가장 하류의 뉴클레오티드, 즉 벡터의 말단에 정렬되는 판독수의 인위적 감소가 있기 때문에 파보바이러스 벡터 당 평균 판독수를 대표하지 않을 수 있다.
생물학적 성분의 평균 판독수는 본 명세서에서 생물학적 성분에 정렬되는 총 판독수를 생물학적 성분의 뉴클레오티드의 총수로 나눈 것으로 정의된다. 생물학적 성분은 조성물을 생성하는 공정에 사용된 하나의 생물학적 성분을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게, 생물학적 성분은 숙주 세포, 플라스미드, 재조합 파보바이러스 벡터 이외의 벡터 및 헬퍼 바이러스로 구성되는 그룹으로부터 선택되며, 여기서 바람직하게 벡터는 배큘로바이러스 벡터이다. 가장 바람직하게, 생물학적 성분은 배큘로바이러스 벡터이다.
본 발명의 일 구현으로, 파보바이러스 벡터의 뉴클레오티드의 수는 예를 들어, ITR 서열, 프로모터 서열, 트랜스진 서열, 및 좌측-ITR과 우측-ITR 사이의 어느 다른 서열을 포함하는, 파보바이러스 벡터의 완전한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 보다 바람직한 구현으로, 파보바이러스 벡터의 뉴클레오티드 서열의 일부는 파보바이러스 벡터의 평균 판독수를 결정하도록 선택된다. 파보바이러스 벡터의 이러한 부분은 ITR 뉴클레오티드 서열, 프로모터 서열 및/또는 트랜스진 서열을 포함할 수 있다. 가장 바람직한 구현으로, 트랜스진의 서열은 파보바이러스 벡터의 핵산 당 평균 판독수를 결정하기 위해 선택된다. 즉, 트랜스진에 정렬하는 판독수를 트랜스진의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드의 수로 나눈다.
본 발명의 또 다른 구현으로, 과표현된 핵산 불순물은 제2 또는 추가의 조성물에서 정량화된다. 제1 조성물에서 과표현된 핵산 불순물을 확인하고 정량화한 후에, 과표현된 핵산 불순물은 추가의 조성물에서 정량화될 수 있다. 제2 또는 추가의 조성물에서 과표현된 핵산 불순물의 정량화는 상기 개요적으로 서술한 바와 같이 결정될 수 있다. 대안적으로, 제2 또는 추가의 조성물에서 과표현된 핵산 불순물의 정량화는 핵산 불순물의 양을 결정하기에 적합한 어느 다른 방법에 의해 결정될 수 있다. 특정 DNA 프래그먼트를 정량화하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 제2 또는 추가의 조성물에서 과표현된 핵산 불순물을 정량화하는데 동등하게 적용된다. 이러한 방법은 이에 한정하는 것은 아니나, 하이-스루풋, Q-PCR, 제한된 사이클 PCR, 하이브리다이제이션 분석, 마이크로-어레이 및 아가로오즈 전기영동을 포함한다.
파보바이러스 비리온
본 발명의 바람직한 구현으로, 조성물은 파보바이러스 벡터를 포함한다. 특히, 본 발명에 따른 바람직한 방법으로, 파보바이러스 벡터는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터이다. 파보비리데(Parvoviridae) 과의 바이러스는 작은 DNA 동물 바이러스이다. 파보비리데 과는 두 개의 아과로 나눌 수 있는데, 척추 동물을 감염시키는 파보비리나에(Parvovirinae)와 곤충을 감염시키는 덴소비리나에(Densovirinae)이다. 파보비리나에 아과의 구성원은 본 명세서에서 파보바이러스로 지칭되며, 데펜도바이러스(Dependovirus) 속을 포함한다. 이들의 속의 이름에서 추론될 수 있듯이, 데펜도바이러스의 구성원은 대개 세포 배양에서 생산적인 감염을 위해 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스와의 동시 감염이 필요하다는 점에서 독특하다. 데펜도바이러스 속은 사람(예, 혈청형 1, 2, 3A, 3B, 4, 5 및 6) 또는 영장류(예, 혈청형 1 및 4)에 일반적으로 감염되는 AAV와 다른 온혈 동물을 감염시키는 관련 바이러스가 포함된다(예, 보바인, 캐닌, 이퀸 및 오빈 아데노-관련 바이러스). 파보바이러스 및 파보비리데의 다른 구성원에 대한 자세한 내용은 Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", Fields Virology의 제69장(3d Ed. 1996)에 설명되어 있다.
알려진 모든 AAV 혈청형의 게놈 조직은 매우 유사하다. AAV의 게놈은 길이가 약 5,000 뉴클레오티드(nt) 미만인 선형의 단일 스트랜드 DNA 분자이다. 역위 말단 반복(ITR)은 비-구조적 복제(Rep) 단백질 및 구조적(VP) 단백질에 대한 고유한 코딩 뉴클레오티드 서열 측면에 위치한다. VP 단백질(VP1, -2 및 -3)은 캡시드를 형성한다. 말단 145nt는 자기 상보적이고 T-형 헤어핀을 형성하는 에너지적으로 안정한 분자내 듀플렉스가 형성되도록 구성된다. 이러한 헤어핀 구조는 바이러스 DNA 복제의 오리진으로 기능하여 세포 DNA 폴리머라아제 복합체에 대한 프라이머로서 역할을 한다. 포유동물 세포에서 야생형(wt) AAV 감염 후, Rep 유전자(즉, Rep78 및 Rep52)는 각각 P5 프로모터 및 P19 프로모터로부터 발현되고, 두 Rep 단백질은 바이러스 게놈의 복제에서 기능을 갖는다. Rep ORF의 스플라이싱 이벤트는 실제로 4개의 Rep 단백질(즉, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)의 발현을 초래한다. 그러나, 포유류 세포에서 Rep78 및 Rep52 단백질을 암호화하는 스플라이싱되지 않은 mRNA는 AAV 벡터 생산에 충분하다는 것이 밝혀졌다. 곤충 세포에서도 Rep78 및 Rep52 단백질은 AAV 벡터 생산에 충분하다.
본 명세서에서 "파보바이러스 또는 AAV 벡터"(또는 "rAAV 벡터")는 관심있는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 관심있는 생성물을 암호화하는 유전자에 대한 발현 구조물, 즉 "트랜스진")을 포함하는 핵산 분자를 지칭하며, 이는 적어도 하나의 파보바이러스 또는 AAV 역위 말단 반복 서열(ITRs) 측면에 위치한다. 이러한 rAAV 벡터는 AAV rep 및 cap 유전자 생성물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는 숙주 세포에 존재할 경우에, 감염성 비리온으로 복제 및 패키징될 수 있다. 파보바이러스 또는 AAV 벡터는 바람직하게 재조합 핵산 분자, 즉 자연적으로 발생하지 않고, 이 조합물 및/또는 오더에서 자연적으로 발생하지 않는 서열 요소를 조합함으로써 구성된 핵산 분자이다.
rAAV 벡터가 더 큰 핵산 구조물(예, 염색체 또는 클로닝이나 형질감염에 사용되는 플라스미드 또는 배큘로바이러스와 같은 다른 벡터)에 편입되면, rAAV 벡터는 전형적으로 "프로-벡터(pro-vector)"로 지칭되며, 이는 AAV 패키징 기능 및 필요한 헬퍼 기능의 존재하에서 복제 및 캡슐화에 의해 "구출(rescued)"될 수 있다.
바람직하게, 관심있는 유전자 산물은 어느 한 측면상의 AAV ITRs 측면에 위치한다. AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 및/또는 AAVrh10으로부터의 ITRs을 포함하는 어느 AAV ITR이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. AAV2의 ITRs가 가장 바람직하다. 본 발명의 바람직한 핵산 구조물에서 사용하기 위한 바람직한 ITR 서열의 예는 SEQ ID NO: 1(좌측 또는 상류 ITR) 및 SEQ ID NO: 2(우측 또는 하류 ITR)에 주어진다.
AAV는 많은 포유동물 세포를 감염시킬 수 있다. 참조 예, Tratschin et al.(1985, Mol. Cell Biol. 5:3251-3260) 및 Grimm et al.(1999, Hum. Gene Ther., 10:2445-2450). 그러나, 인간 시노비알(synovial) 섬유아세포의 AAV 형질도입은 유사한 뮤린(murine) 세포에서보다 현저히 더 효율적이며(Jennings et al., Arthritis Res, 3:1(2001)), 그리고 AAV의 세포 영양성은 혈청형 사이에서 다르다. 참조 예, Goncalves, 2005, Virol J. 2(1):43(AAV 트로피즘의 변형에 대한 접근법에 대해 논의됨)
본 발명의 방법에 사용하기 위한 rAAV 벡터는 포유동물 세포 또는 곤충 세포에서 생산될 수 있다. 두 방법 모두 이 기술 분야에 기술되어있다. 예, Grimm et al.(2003 Molecular Therapy 7(6):839-850)에는 단지 2개의 플라스미드를 293T 세포로 형질감염시키는 것에 기초한 헬퍼 바이러스가 없고 광학적으로 제어가능한 방식으로 AAV 벡터를 생산하는 전략이 개시되어 있다. 그들은 AAV2 Rep 단백질, AAV2 ITRs 및 AAV5 캡시드 단백질을 포함하는 하이브리드 AAV 벡터의 생산 방법을 개시하고 있다. 이 참고문헌은 본 명세서에 그 전문이 포함된다. 더 자세한 정보는 Blits et al.(2010)(Journal of Neuroscience methods 185(2):257-263)에서 찾아볼 수 있다.
용어 "하이브리드" 및 "슈도타입(pseudotyped)"은 본 명세서에서 상호 호환 적으로 사용되며, Rep 단백질, ITR 및/또는 캡시드 단백질이 상이한 혈청형의 벡터를 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, ITRs 및 Rep 단백질은 AAV2이고 캡시드 단백질은 AAV5이다. "키메릭(chimeric)"이라는 용어는 본 명세서에서 예를 들어 캡시드와 같은 단일 유전자가 다른 혈청형에서 유래된 적어도 두 개의 서열을 포함하여 구성되는 것을 나타내는 것으로 사용된다.
AAV 생산 방법
본 발명에 따른 조성물 중의 rAAV 벡터는 rAAV의 고전적인 생산방법을 사용하여 생산될 수 있다. 이러한 고전적 생산방법은 표적/생산 세포의 일시적인 형질감염 프로토콜을 기반으로 한다(Merten et al, Gene Ther, 2006, 12: S51 - S61). 이는 트랜스-컴플리멘테이션 및 일시적 형질감염 기반 접근법이며, 다음의 유전 요소를 필요로 한다: (i) rAAV 게놈의 서열. rAAV 게놈의 서열을 플라스미드(소위 바이러스 벡터 플라스미드) 내로 클로닝할 수 있다. 이 바이러스 벡터 플라스미드는 일반적으로 적어도 하나의 ITR 및 트랜스진의 발현을 위한 발현 카세트를 포함한다; (ii) rep 및 cap을 암호화하는 서열, 및 (iii) 아데노바이러스 및/또는 헤르페스 심플렉스 바이러스와 같은 천연 보조 바이러스에 의해 암호화되는 필수 헬퍼 기능.
예를 들어, rAAV는 하기 방법에 따라 포유동물 세포에서 생산될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다: 벡터 게놈은 AAV 혈청형 2로부터 유래된 2개의 역위 말단 반복(ITRs) 측면에 위치한 트랜스진 발현 카세트를 함유한다. 바이러스 벡터 게놈의 총 길이는 효율적인 패키징 효율을 유지하기 위해 4.7 kB의 야생형 게놈 크기를 초과할 수 없다. 단일 캡시드는 1:1:10의 비율로 VP1(62kDa), VP2(73kDa) 또는 VP3(87kDa)의 60가지 바이러스 단백질을 포함하여 구성된다. AAV 벡터의 제조 과정은 롤러 병(850 ㎠ 표면적) 내에서 인간 배아 신장 생산 세포(HEK293)에 두 개의 플라스미드를 Ca(PO4)2 형질감염시킨 후, 여과 및 크로마토그래피 기술로 캡시화된 벡터 게놈을 정제하는 것에 기초한다. 제1 플라스미드는 바이러스 벡터 플라스미드이며, AAV2 ITRs 측면에 위치하는 발현 구조물을 함유한다. 제2 플라스미드는 패키징 플라스미드이며, 원하는 혈청형 및 아데노바이러스 초기 헬퍼 유전자인 E2A, VA, E4의 AAV rep 타입 2 및 cap 타입 5 유전자(pDP5; SEQ ID NO: 3에 기재된 뉴클레오티드 서열)를 암호화한다. 생산 세포주의 게놈은 헬퍼 기능을 제공하는 아데노바이러스 E1을 포함한다. 10% 소 태아 혈청(FCS)을 함유한 Iscove`s Modified Dulbecco`s Medium(IMDM)에서 두 개의 플라스미드로 동시-감염(co-transfection) 한 후, 세포를 혈청이 없는 Dulbecco modified Eagle's medium(DMEM)에서 3일 동안 배양하여 벡터 생산이 일어나도록 한다. 롤러 병에서 벡터 생산은 평균적으로 세포당 3x103 벡터 게놈 또는 롤러 병당 4x1011 벡터 게놈(qPCR로 정량화)의 결과를 산출한다. 이어서, 세포 배양물을 Triton-X-100을 함유하는 완충액으로 라이싱하고, 저속 원심분리에 의해 세포 데브리스(cell debris)를 제거한다. 정화된 벌크를 AVB 세파로스 친화성 크로마토그래피로 정제하고 400 kDa의 중공 섬유 모듈(예, Spectrum Laboratories)을 사용하여 농축 및 디아필터 여과에 의해 PBS/5% 수크로오스로 제형화하였다.
대안적으로, 본 발명에 따른 조성물에서 rAAV는 우세하게 형질감염 독립적인 방법으로 생산될 수 있다. 이러한 방법은 유도 후 rAAV를 생산하는 포장/생산 세포주의 사용, 또는 배큘로바이러스/곤충세포 시스템의 사용에 기반하여 할 수 있다.
패키징 세포는 AAV 헬퍼 서열 rep 및 cap과 같은 필요한 모든 AAV 유전 요소의 일부를 포함할 수 있다. 패키징 세포주로부터 rAAV 생산의 연속적인 유도는 rAAV 서열을 함유하는 플라스미드(바이러스 벡터 플라스미드)의 형질감염, 이어서 (복제 결핍성) 아데노바이러스 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스를 이용한 감염과 같이, 필요한 헬퍼 기능을 암호화하는 서열의 도입에 의해 수행될 수 있다. 생산자 세포주는 필요한 모든 AAV 유래 성분이 이들의 게놈, 즉 바이러스 벡터 서열과 함께 AAV 헬퍼 서열(rep-cap)을 포함하는 완전한 트랜스-컴플리먼팅 시스템일 수 있다. rAAV 생산의 유도는 필요한 헬퍼 기능을 암호화하는 서열의 도입 후에 발생할 수 있다.
한편, 적어도 하나의 ITR 및 트랜스진의 발현을 위한 발현 카세트를 포함하는 rAAV 게놈의 서열은, 아데노바이러스 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스의 게놈에 내장될 수 있으며, 이는 각각 rAAV/Ad-하이브리드 시스템(Thorne et al., 2009; Hum. Gene Ther. 20; 707-714) 또는 rAAV/HSV-하이브리드 시스템(Clement et al., 2009; Hum. Gene ther. 20; 796-806.; Ye et al., 2014; Hum. Gene Ther. 15;1-6)을 생성한다.
대안적으로, 본 발명의 방법에 사용되는 AAV 벡터는 Urabe 등(Journal of Virology 2006 80(4):1874-1885)이 이전에 기술한 바와 같이 곤충세포에서 생산될 수있다. 이 시스템에서, rAAV 게놈의 서열은 재조합 배큘로바이러스 내로 클로닝될 수 있다.
파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 DNA 불순물은 조성물을 생산하는 공정에서 사용된 어느 생물학적 성분으로부터 유래될 수 있다. 상기 조성물은 상기 개요한 바와 같은 어느 방법에 따라 생산될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서, 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포, 플라스미드, 벡터 및 헬퍼 바이러스의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 구현으로, 생물학적 성분은 하기 유전 요소 중 적어도 하나를 포함한다: (i) rAAV 게놈의 서열, 바람직하게는 적어도 하나의 ITR 및 트랜스진의 발현을 위한 발현 카세트를 포함하는 rAAV 게놈의 서열; (ii) rep 및/또는 cap을 암호화하는 서열, 및/또는 (iii) 아데노바이러스 및/또는 헤르페스 심플렉스 바이러스와 같은 보조 바이러스에 의해 자연적으로 암호화되는 필수 헬퍼 기능을 암호화하는 서열. 보다 바람직하게, 생물학적 성분은 적어도 하나의 ITR 및 트랜스진의 발현을 위한 발현 카세트를 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 방법으로, 벡터는 배큘로바이러스 벡터이다. 배큘로비리데(Baculoviridae)는 큰 과(family)의 엔벨로프 DNA 바이러스이다. 배큘로바이러스는 레피도프테라(Lepidoptera) 목(order)에 속하는 대단히 많은 퍼미시브(permissive) 종으로 우선적으로 절지 동물을 감염시킨다. 시험관 내 배큘로바이러스 증식을 가능하게 하는 Sf9, Sf21 또는 High Five와 같은 여러 연속 세포주가 상업적으로 이용가능하며 본 발명에 따른 조성물의 생산에 사용될 수 있다.
오토그래파 캘리포니카 멀티뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica multinuclear polyhedrosis virus)(AcMNPV)에서 유래된 재조합 배큘로바이러스는 생명공학, 특히 재조합 단백질 또는 바이러스 유사 파티클(VLP, 즉 바이러스 핵산이 없는 껍질)의 생산에 가장 일반적으로 사용된다.
배큘로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)에 기초한 생산의 주요 이점은 다음과 같이 요약될 수 있다: (i) 매우 강한 프로모터(폴리헤드린 또는 p10)의 존재는 유전자 크기 제한 없이 대량의 이종 단백질의 대량 생산을 가능하게 한다; (ii) 곤충세포는 주된 번역-후 변형을 수행하여 생물학적 활성 단백질의 생산을 가능하게 하는 능력을 갖는다; 그리고 (iii) 배큘로바이러스 기술을 쉽게 구현할 수 있고, 스케일 업을 용이하게 달성할 수 있고, 세포를 현탁 배양하고, 다양한 무-혈청 배지를 상업적으로 이용할 수 있다.
바이러스 파티클 어셈블링은 단일 단백질을 발현하는 것보다 더 복잡한 과정이다. 그러나, HBV, B19 파보바이러스, 로타바이러스, 휴먼 파필로마바이러스에 기초한 VLP가 BEVS로 성공적으로 생산될 수 있는 것으로 나타났다. 또한, rAAV의 생산을 위해 배큘로바이러스 발현 벡터 시스템을 사용할 수 있다(Merten et al, supra, Urabe et al., 2002).
따라서, 본 발명의 방법에서, 파보바이러스 비리온은 포유동물 세포 또는 곤충세포에서 배큘로바이러스 발현 벡터 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 바람직하게, 파보바이러스 비리온은 곤충세포에서 배큘로바이러스 발현 벡터 시스템을 사용하여 생산된다.
본 발명의 바람직한 구현으로, 배큘로바이러스 벡터는 Rep, Cap 및/또는 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 바람직하게 배큘로바이러스 벡터는 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 보다 바람직하게 배큘로바이러스 벡터는 적어도 하나의 파보바이러스 ITR 측면에 위치하는 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 그리고 가장 바람직하게 배큘로바이러스 벡터는 각 사이드 상의 적어도 하나의 파보바이러스 ITR 측면에 위치하는 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또한, 예를 들어, 국제공개 WO 2007/046703, WO 2007/148971, WO 2009/014445, WO 2009/104964 및/또는 WO 2011/112089에 개시된 바와 같이, 앞서 개시된 Rep 및 VP1, VP2 및 VP3 서열의 변형이 본 발명에 사용될 수 있다.
rAAV 벡터의 생산을 위해 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 AAV ITR 및 Rep 서열은 어느 AAV 혈청형의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, AAV 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 현저한 상동성의 게놈 서열을 갖는다. 이것은 본질적으로 물리적 및 기능적으로 동등한 비리온을 생산하는 동일한 유전적 기능의 세트를 제공한다. 다양한 AAV 혈청형의 게놈 서열 및 게놈 유사성에 대한 개요는 예를 들어, GenBank 수탁번호 U89790; GenBank 수탁번호 J01901; GenBank 수탁번호 AF043303; GenBank 수탁번호 AF085716; Chiorini et al.(1997, J. Vir. 71: 6823-33); Srivastava et al.(1983, J. Vir. 45:555-64); Chiorini et al.(1999, J. Vir. 73:1309-1319); Rutledge et al.(1998, J. Vir. 72:309-319); 및 Wu et al.(2000, J. Vir. 74: 8635-47)를 참조바란다. rAAV 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12는 본 발명의 정황에 사용되는 AAV 뉴클레오티드 서열의 공급원으로서 사용될 수 있다. rAAV 혈청형 1, 2, 3, 4 및 5가 AAV 뉴클레오티드 서열의 바람직한 공급원이다. 바람직하게, 본 발명의 정황에서 AAV ITR 서열은 AAV1, AAV2 및/또는 AAV5로부터 유래된다. 보다 바람직하게, 본 발명의 방법에서 ITR 서열은 AAV2 ITR이다. 유사하게, Rep(Rep78/68 및 Rep52/40) 코딩 서열은 바람직하게 AAV1, AAV2 및/또는 AAV5, 보다 바람직하게는 AAV2로부터 유래된다.
AAV Rep 및 ITR 서열은 대부분의 혈청형 중에서 특히 보존되어있다. 다양한 AAV 혈청형의 Rep78 단백질들은 예를 들어, 89% 이상의 동일성을 가지며, AAV2, AAV3A, AAV3B 및 AAV6 사이의 게놈 수준에서 총 뉴클레오티드 서열 동일성은 약 82%이다(Bantel-Schaal et al., 1999, J. Virol., 73(2):939-947). 또한, 많은 AAV 혈청형의 Rep 서열 및 ITRs는 포유동물 세포에서 AAV 파티클의 생산에서 다른 혈청형으로부터의 상응하는 서열을 효율적으로 교차-보체(즉, 기능적으로 치환)하는것으로 알려져 있다. US2003148506에는 AAV Rep 및 ITR 서열이 또한 곤충 세포에서 다른 AAV Rep 및 ITR 서열을 효율적으로 교차-보체한다는 것이 보고되어 있다.
AAV VP 단백질은 AAV 비리온의 세포 영양가치(cellular tropicity)를 결정하는 것으로 알려져 있다. VP 단백질-암호화하는 서열은 다른 AAV 혈청형 중에서 Rep 단백질 및 유전자보다 현저히 덜 보존되어있다. 바람직한 구현으로, rAAV 벡터는 VP1 단백질을 포함한다. Rep 및 ITR 서열이 다른 혈청형의 상응하는 서열을 교차-보체하는 능력은 한 혈청형(예, AAV5)의 캡시드 단백질 및 또 다른 AAV 혈청형(예, AAV2)의 Rep 및/또는 ITR 서열을 포함하는 슈도타입 rAAV 파티클의 생산을 가능하게 한다. 이러한 슈도타입 rAAV 파티클은 본 발명의 방법의 일부이다. 여기서, 슈도타입 rAAV 파티클은 타입 "x/y"인 것으로서 지칭될 수 있으며, 여기서 "x"는 ITRs의 공급원을 나타내고, "y"는 캡시드의 혈청형을 나타낸다. 예를 들어, 2/5 rAAV 파티클은 AAV2로부터의 ITRs 및 AAV5로부터의 캡시드를 갖는다.
또한, 변형된 "AAV" 서열이, 예를 들어, 곤충 세포에서 rAAV 벡터의 생산을 위한 것과 같이, 본 발명의 정황에 사용될 수 있다. 그러한 변형된 서열은 예를 들어. AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 또는 AAV9 ITR, Rep 또는 VP에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열(예, 약 75% 내지 약 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함하며, 와일드 타입 AAV ITR, Rep 또는 VP 서열 대신에 사용될 수 있다.
곤충 세포와 같은 세포에서 rAAV 또는 슈도타입 rAAV 벡터의 효율적인 생산을 얻기 위해 ITR, Rep 및 Cap 서열을 원하는 대로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, Rep 서열의 개시 코돈은 변형될 수 있고, VP 스플라이싱 부위는 변형되거나 제거될 수 있고, 그리고/또는 VP1 개시 코돈은 예를 들어, WO 2007/046703, WO 2007/148971 및/또는 WO 2009/014445에 개시되어 있는 바와 같이, (곤충) 세포에서 rAAV 벡터의 생산을 개선하도록 변형될 수 있다. 또한, 예를 들어, AAV5의 VP1이 부분적으로 또는 완전히 AAV2 유래의 VP1으로 대체되고, VP2 및 3이 AAV5에서 유래된 키메릭 AAV 캡시드가 본 발명에 포함된다(Urabe et al., 2006; WO 2000/028004). 바람직한 아데노바이러스 벡터는 Russell(2000, J. Gen. Virol. 81:2573-2604)에 의해 리뷰되거나 US20080008690 및 Zaldumbide and Hoeben(Gene Therapy 2008:239-246)에 기재된 바와 같이 숙주 반응을 감소시키도록 변형된다.
바람직하게 본 발명에 따른 유전자 치료 벡터 내에 포함된 AAV Rep 단백질은 AAV 혈청형 2 Rep 단백질이다. 더욱 바람직하게, SEQ ID NO: 4의 핵산 서열 및/또는 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열을 갖는 Rep78 단백질이 본 발명에 사용되고, SEQ ID NO: 6의 핵산 서열을 갖는 Rep52 단백질이 본 발명에 사용된다.
과표현된 핵산 불순물 정량화
대안적으로 또는 상술한 바와 같은 어느 구현과의 조합으로, 본 발명은 또한 과표현된 핵산 불순물의 정량화에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 특정 DNA 불순물이 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 과표현된다는 발견에 관한 것이다. 이러한 DNA 불순물은 파보바이러스 비리온의 생산 공정 중에 파보바이러스 뉴클레오티드 서열의 ITRs에 바로 측면에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 좌측 파보바이러스 ITR의 서열 상류 및/또는 우측 파보바이러스 ITR의 서열 하류는 파보바이러스 비리온에서 과표현된다.
따라서, 다른 견지로, 본 발명은 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 핵산 불순물을 정량화하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은 핵산 불순물의 상대 존재량을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 불순물은 ITR 서열이 상기 조성물을 생산하는 공정에 사용된 생물학적 성분에 존재하는 경우에 파보바이러스 ITR 서열에 1 - 8000 bp, 1 - 5000 bp, 1 - 3000 bp, 1 - 1000 bp, 1 - 500 bp, 1 - 250 bp 또는 1 - 100 bp 사이로 바로 인접하여 위치한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 그리고 여기서 상기 생물학적 성분은 파보바이러스 ITR 서열의 적어도 하나의 복사체 측면에 위치하는 트랜스진을 포함한다. 또 다른 구현으로, 본 발명은 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 핵산 불순물을 정량화하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은 핵산 불순물의 상대 존재량을 결정하는 단계로 구성되며, 상기 핵산 불순물은 ITR 서열이 상기 조성물을 생산하는 공정에 사용된 생물학적 성분에 존재하는 경우에 파보바이러스 ITR 서열에 1 - 8000 bp, 1 - 5000 bp, 1 - 3000 bp, 1 - 1000 bp, 1 - 500 bp, 1 - 250 bp 또는 1 - 100 bp 사이로 바로 인접하여 위치한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 그리고 여기서 상기 생물학적 성분은 파보바이러스 ITR 서열의 적어도 하나의 복사체 측면에 위치하는 트랜스진을 포함한다.
상기한 바와 같이, 파보바이러스 비리온의 생산 공정 중에 파보바이러스 서열이 숙주 세포, 플라스미드, 벡터 및/또는 헬퍼 바이러스에 존재할 수 있으며, 여기서 바람직한 벡터는 배큘로바이러스 벡터이다. 파보바이러스 서열은 ITR의 적어도 하나의 복사체 및 트랜스진의 발현을 위한 발현 카세트를 포함할 수 있다. 과표현된 DNA 불순물은 게놈 서열, 플라스미드 서열, 벡터 서열 또는 헬퍼 바이러스의 서열과 같은 파보 바이러스 ITR 또는 ITRs에 바로 측면에 위치하는 어느 서열을 포함할 수 있다. 따라서, DNA 불순물의 타입은 파보바이러스 비리온의 생산 중에 ITR 측면에 위치하는 서열에 따라 달라진다. 예를 들어, 적어도 하나의 ITR의 복사체 및 바람직하게는 트랜스진을 포함하는 파보바이러스 서열이 배큘로바이러스 벡터에 존재하는 경우, ITR 또는 ITRs에 바로 측면에 위치하는 배큘로바이러스 서열은 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 오버리프리젠팅될 것이다.
본 발명의 일 구현으로, 핵산 불순물은 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 정량화된다. 핵산 불순물을 정량화하는 방법은 핵산을 정량화하기 위한 당 업계에 공지된 어느 방법을 포함할 수 있다. 그러한 방법은 이에 한정하는 것은 아니나, 하이-스루풋 시퀀싱, Q-PCR, 제한된 사이클 PCR, 하이브리다이제이션 분석, 마이크로-어레이 및 아가로오즈 전기영동을 포함한다.
추가의 구현으로, 생물학적 성분은 상기한 바와 같이 정의된다. 특히, 생물학적 성분은 숙주 세포, 플라스미드, 재조합 파보바이러스 벡터 이외의 벡터 및 헬퍼 바이러스로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게, 생물학적 성분은 파보바이러스 서열을 포함하며, 여기서 바람직하게 파보바이러스 서열은 적어도 하나의 ITR 및 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 가장 바람직하게, 생물학적 성분은 각 사이드 상에 적어도 하나의 파보바이러스 ITR 측면에 위치하는 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
가장 바람직한 구현으로, 생물학적 성분은 벡터이며, 그리고 여기서 상기 벡터는 배큘로바이러스 벡터이다. 배큘로바이러스 벡터는 바람직하게 파보바이러스 서열을 포함한다. 이 파보바이러스 서열은 바람직하게 적어도 하나의 ITR 및 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 가장 바람직하게, 배큘로바이러스 벡터는 각각의 측면 상에 적어도 하나의 파보바이러스 ITR 측면에 위치하는 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 방법에서, 핵산 불순물은 상기 조성물을 생산하는 공정에 사용된 생물학적 성분에 존재하는 경우에 파보바이러스 ITR 서열에 1 - 10000 bp, 1 - 9000 bp, 1 - 8000 bp, 1 - 7000 bp, 1 - 6000 bp, 1 - 5000 bp, 1 - 4000 bp, 1 - 3000 bp, 1 - 2000 bp, 1 - 1000 bp, 1 - 800 bp, 1 - 600 bp, 1 - 500 bp, 1 - 400 bp, 1 - 250 bp 또는 1 - 100 bp 사이로 바로 인접하여 위치한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. DNA 불순물의 길이는 다른 랜덤 패키징된 DNA 불순물의 존재 및/또는 파보바이러스 비리온의 최대 패키징 용량이 있는 트랜스진의 크기에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 파보바이러스 비리온은 이들 자신의 게놈의 길이보다 긴 DNA 서열을 편입할 수 있는 것으로 알려져 있다(Grieger et al, J Virol. 2005 79(15):9933-44).
본 발명의 바람직한 구현으로, 파보바이러스 벡터는 상술한 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터이다. 또한, rAAV 비리온은 상술한 어느 제조방법을 사용하여 제조할 수 있다.
또 다른 구현으로, 핵산 불순물의 뉴클레오티드 서열은, ITR 서열이 조성물을 생산하는 공정에 사용된 생물학적 성분에 존재할 경우에, 파보바이러스 ITR 서열의 각 사이드 상에 바로 인접하여 위치한다. 생물학적 성분에 존재하는 파보바이러스 서열은 트랜스진의 각 사이드 상의 적어도 하나의 ITR 측면에 위치하는 트랜스진을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 핵산 불순물은 ITRs의 한쪽 측면 상에 존재하는, 즉 단지 좌측 ITR(s)에 바로 인접하거나 또는 단지 우측 ITR(s)에 바로 인접한, 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 핵산 불순물의 뉴클레오티드 서열은 ITRs의 양 측면 상에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현으로, 핵산 불순물은 ITR 서열이 조성물을 생산하는 공정에 사용된 생물학적 성분에 존재할 경우에, 파보바이러스 ITR 서열에 바로 인접하여 위치한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 명세서에서 "바로 인접한(immediately adjacent)"은 다음과 같이 정의된다: 트랜스진의 ITR 상류의 경우, "바로 인접한"은 상기 ITR의 적어도 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 또는 50 bp 상류에 끝나는 어느 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 ITR이 트랜스진의 하류에 위치한 경우, "바로 인접한"은 상기 ITR의 적어도 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 또는 50 bp 하류에 시작하는 어느 뉴클레오티드를 의미한다.
상대 존재량
본 발명의 일 구현으로, 상기 방법은 핵산 불순물의 상대 존재량을 결정하는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 상대 존재량은 동일하거나 또 다른 조성물에서의 제2 핵산 분자의 (일부의) 존재와 비교하여 제1 핵산 분자의 (일부의) 존재로서 정의된다. 상대 존재량이 둘 이상의 조성물 사이에서 결정되는 경우, 제2 핵산 분자는 제1 핵산 분자와 동일하거나 또 다른 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상대 존재량이 하나의 조성물에서 결정되는 경우, 제1 및 제2 핵산 분자는 적어도 부분적으로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 방법에서, 핵산 불순물과 제2 핵산 분자 사이의 상대 존재량은 바람직하게 동일한 조성물에서 결정되나, 또한 본 발명의 일 구현으로 핵산 불순물의 상대 존재량은 다른 조성물들 사이에서 결정된다. 본 발명의 바람직한 방법에서, 상대 존재량은 파보바이러스 벡터의 뉴클레오티드 서열 및/또는 조성물 중의 레퍼런스 서열과 비교하여 결정된다. 바람직하게, 트랜스진 및/또는 레퍼런스 서열은 핵산 불순물과 동일한 조성물에 존재한다.
파보바이러스 벡터의 뉴클레오티드 서열은 완전한 파보바이러스 벡터와 같은 파보바이러스 벡터의 어느 서열, 또는 트랜스진, 프로모터 또는 ITR(s)의 뉴클레오티드 서열(의 일부)을 포함할 수 있다. 그러나, 파보바이러스 벡터의 어느 다른 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 방법에 사용하기에 동등하게 적합할 수 있다.
레퍼런스 서열은 어느 적절한 뉴클레오티드 서열(의 일부)일 수 있다. 바람직하게, 레퍼런스 서열은 하우스 키핑 유전자의 서열(의 일부), 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열이며 그리고/또는 레퍼런스 서열은 조성물을 스파이크시키는데 사용되는 핵산 서열이다.
레퍼런스 서열이 생물학적 성분의 서열인 경우, 서열은 파보 바이러스 ITR에 바로 측면에 위치하지 않으며, 레퍼런스 서열은 바람직하게 조성물을 생산하는 공정에서 사용된 숙주 세포, 플라스미드 또는 벡터로부터 유래된다. 바람직하게, 레퍼런스 서열은 트랜스진 및 적어도 하나의 ITR을 포함하는 동일한 생물학적 성분으로부터 유래된다. 더욱 바람직하게, 레퍼런스 서열은 배큘로바이러스 벡터로부터의 서열을 포함하며, 배큘로바이러스 벡터는 트랜스진 및 적어도 하나의 ITR을 포함하는 조성물을 생성하는 공정에 사용되며, 그리고 레퍼런스 배큘로바이러스 서열은 파보바이러스 ITR에 바로 측면에 위치하지 않는다.
레퍼런스 서열이 조성물을 스파이크시키는데 사용되는 핵산인 경우, 이 핵산은 조성물 제조 후에 존재하지 않지만 추후 시점에서 첨가되나, 핵산 불순물의 상대 존재량을 결정하기 전에 첨가되는 것으로 의도된다. 조성물에 스파이크를 일으키기 위해 사용되는 핵산 분자는 적어도 10, 30, 50, 100, 150, 200, 500, 1000 이상의 염기쌍의 작은 선형 또는 원형 RNA 또는 DNA 분자와 같은 어느 적절한 핵산 분자일 수 있다. 이러한 핵산 분자는 암호화 영역 및/또는 비-암호화 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 구현으로, 상대 존재량은 다음에 의해 결정된다:
a) 상기 정의된 핵산 불순물의 핵산 당 평균 판독수; 및
i) 레퍼런스 서열의 핵산 당 평균 판독수; 및/또는
ii) 조성물 중의 파보바이러스 벡터 당 평균 판독수;
여기서, 판독수는 상기 개요한 바와 같은 어느 방법에 의해 결정되며; 그리고/또는
b) 상기 정의된 핵산 불순물의 증폭; 및
i) 레퍼런스 서열; 및/또는
ii) 파보바이러스 벡터의 뉴클레오타이드 서열.
바람직한 구현으로, 평균 판독수는 상기 나타낸 바와 같이 정의된다. 또한, 파보바이러스 벡터는 완전한 파보바이러스 벡터와 같은 파보바이러스 벡터의 어느 서열, 또는 트랜스진, 프로모터 또는 ITR(s)의 뉴클레오티드 서열(의 일부)에만 관련될 수 있다. 또한, 파보바이러스 벡터의 어느 다른 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 방법에 사용하기에 동등하게 적합할 수 있다.
추가의 구현으로, 핵산 불순물의 상대 존재량은 상기 나타낸 바와 같은 핵산 분자의 양을 결정하기에 적절한 어느 방법에 의해 결정될 수 있다. 보다 바람직하게, 상대 존재량은 Q-PCR 및/또는 하이-스루풋 시퀀싱에 의해 결정된다. 핵산의 정량화를 이끄는 어느 Q-PCR 방법 또는 하이-스루풋 시퀀싱 방법은 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다. Q-PCR 방법(실시간 폴리머라아제 연쇄 반응)은 당 업계에 공지되어 있으며, 이 기술은 비특이적 플루오로크롬 또는 하이브리드화 프로브를 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현 예에서, Q-PCR은 특이적 하이브리드화 프로브로 수행된다.
바람직하게, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드 프라이머를 상기 정의된 바와 같은 핵산 불순물에 선택적 하이브리드화하는 단계를 더 포함한다.
핵산 불순물에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 선택적인 하이브리드화는 올리고 뉴클레오티드가 핵산 불순물과 생산적 또는 파지티브 듀플렉스를 형성함을 의미하는 것으로 이해된다. 그러한 생산적 또는 파지티브 듀플렉스의 형성은 Q-PCR 분석에서 앰플리콘의 형성에 의해 검출될 수 있는 올리고뉴클레오티드와 핵산 불순물 사이의 듀플렉스의 형성으로 이해된다. 실제로 이것은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 말단이 핵산 불순물과 듀플렉스를 형성하여, 올리고뉴클레오티드가 폴리머라아제에 의해 연장되거나 인접한 염기쌍의 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드 분자에 라이게이션될 수 있음을 의미할 것이다. 본 명세서에서 사용되는 '앰플리콘(amplicon)'은 PCR 절차와 같은 증폭 절차로부터 기인한 한정된 크기 및 서열을 갖는 이중 스트랜드 핵산 세그먼트에 관한 것이다. 앰플리콘의 크기는 올리고뉴클레오티드 프라이머가 바이니딩하는 핵산 듀플렉스의 두 스트랜드 상의 부위에 의해 좌우된다. 미국 특허 제 4,683,195 호에 예시된 바와 같이, 산물 핵산의 세그먼트는 적은 수의 증폭 사이클 후에 증폭 절차의 일반적인 산물이 된다. 또한, 서열은 주어진 실험 환경에서 사용된 조건하에, 표적 서열과 효과적으로 하이브리드화되나, 상기 정의된 바와 같은 핵산 불순물이 아닌 어느 서열과는 하이브리드화되지 않는 한, 핵산 불순물에 대해 '특이적' 또는 '선택적'이다.
바람직한 구현으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 배큘로바이러스 서열의 일부 또는 이의 보체를 포함하는 핵산 불순물에 선택적으로 하이브리드화된다. 제1 서열의 '보체(complement)'또는 '보체 서열(complementary sequence)'이란 용어는 본 명세서에서 염기쌍을 일치시킴으로써 제1 서열과 이중 스트랜드 구조 또는 듀플렉스를 형성할 수 있는 제2 서열을 의미하는 것으로 이해되며, 예를 들어, G-T-A-C에 대한 보체 서열은 C-A-T-G이다.
따라서, 핵산 불순물은 조성물의 생산 공정에 사용되는 배큘로바이러스 벡터로부터 유래하는 것이 바람직하다. 특히, 그러한 배큘로바이러스 벡터는 적어도 하나의 파보바이러스 ITR 측면에 위치하는 트랜스진을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 구현으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 핵산 불순물에 선택적으로 하이브리드화되며, 여기서 핵산 불순물은 파보바이러스 ITR 서열이 배큘로바이러스 벡터에 존재하는 경우, 파보바이러스 ITR 서열의 바로 인접한 1 - 10000 bp, 1 - 9000 bp, 1 - 8000 bp, 1 - 7000 bp, 1 - 6000 bp, 1 - 5000 bp, 1 - 4000 bp, 1 - 3000 bp, 1 - 2000 bp, 1 - 1000 bp, 1 - 800 bp, 1 - 600 bp, 1 - 500 bp, 1 - 400 bp, 1 - 250 bp 또는 1 - 100 bp 사이에 위치하는 배큘로바이러스 유래 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
임상 적용
파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물은, 특히 조성물이 의학적 치료에 사용되는 경우에 높은 수준의 핵산 불순물을 함유하지 않아야 한다. 특히, 이러한 핵산 불순물은 보통 이미 취약한 환자에게 부작용을 일으킬 수 있어 심각한 합병증을 유발할 수 있다. 본 발명은 DNA 불순물이 파보바이러스 비리온 내에 랜덤으로 캡슐화되지 않는다는 발견에 관한 것이다. 대신에, 파보바이러스 비리온의 생산 동안 ITR 측면에 위치하는 서열들이 과표현된다. 따라서, 다른 견지로, 본 발명은 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물이 임상적으로 순수한 것인지 여부를 결정하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은
i) 상기 개요한 바와 같은 어느 방법에 따라 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 핵산 불순물을 정량화하는 단계; 및
ii) 상기 정의된 바와 같은 핵산 불순물이 핵산 불순물의 상대 존재량에 의한 결정시, 레퍼런스 서열 및/또는 트랜스진에 대해 적어도 10, 100, 250, 1000 배 적은 경우에 임상적으로 순수한 것으로 조성물을 결정하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서 임상적으로 순수한 것은 동물에게 투여하기에 안전한 것으로 간주되는 조성물인 약학적 고품질의 제품으로 정의되며, 바람직하게는 약학적 고품질의 제품은 포유류에 투여하기에 안전한 것으로 간주되는 제품이며, 가장 바람직하게 상기 조성물이 인간에게 투여하기에 안전한 것으로 간주되는 제품이다.
본 발명의 바람직한 구현으로, 상기 정의된 핵산 불순물은 트랜스진 또는 레퍼런스 서열보다 적어도 10, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10,000 또는 100,000 배 덜 존재한다. 핵산 불순물 및 트랜스진의 존재는 특정 DNA 서열을 정량화하기 위한 어느 통상적인 방법으로 정량화될 수 있다.
본 명세서에서 임상적으로 순수한 것은 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물이 임상적 치료를 위해 충분히 순수한 것으로 간주된다는 것이 또한 이해된다. 특히, 본 발명에 따른 임상적으로 순수한 조성물은 인체에 사용을 위한 의약품 등록을 위한 기술 요건의 조화에 관한 국제 회의(International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)(ICH) 품질 및 안전 지침에 의해 요구되는 낮은 수준의 DNA 불순물을 포함한다. 바람직하게, DNA 불순물의 수준은 환자에게 어느 악영향을 일으키는 수준 아래이다.
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본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌 참조는 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것 일뿐 본 발명의 범위를 어느 방식으로 한정되는 것은 아니다.
참고문헌
Figure 112017061140206-pct00001
Figure 112017061140206-pct00002
Figure 112017061140206-pct00003

실시예
실시예 1: 제조된 rAAV 벡터 중에 DNA 불순물
1.1 재료 및 방법
잔류 DNA가 AAV1 파티클에 패키징되었는지 여부를 조사하기 위해, 잔류 DNA가 DNAse 저항성이었는지 여부를 시험하였다. 샘플들을 Benzonase(9U/mL)로 처리하고 DNA의 양을 Q-PCR로 분석하였다.
샘플들로부터 DNA를 분리한 후 3가지 상이한 프라이머 세트(59/60, 180/181, 340/341)를 사용하여 Q-PCR을 수행하였다. 배큘로바이러스 DNA의 DNAse 저항성을 조사하기 위해 일부 샘플의 경우 DNAse 단계를 생략하였다(DNAse가 없는 것으로 표시됨). PLA 분석을 사용하여 데이터를 분석하고, 각 샘플에 대해 상이한 프라이머 세트에 의해 증폭된 DNA의 양의 비를 결정하였다.
AAV1 DNA의 양은 AAV1-트랜스진 벡터의 CMV 프로모터를 표적으로 하는 프라이머 세트 59/90으로 Q-PCR을 사용하여 결정하였다. 잔류 배큘로바이러스 DNA의 정량화는 배큘로바이러스 특이적 프라이머를 이용한 Q-PCR을 사용하여 수행하였다. 실험은 2개의 상이한 프라이머 세트를 사용하여 수행하였으며; 프라이머 세트 180/181은 AAV-트랜스진 카세트에 가까운 배큘로바이러스 DNA의 ORF 1629를 표적으로하고, 프라이머 세트 340/341은 AAV1-트랜스진 카세트로부터 먼 위치에 있는 배큘로바이러스 DNA를 검출하는 배큘로바이러스의 hr3 서열을 표적으로 한다. 이 실험을 위해 플라스미드 스탠다드 라인(pVD) 및 클론 VD의 정제된 배큘로바이러스 DNA의 두 가지 스탠다드가 포함되었다.
프라이머 세트 180/181을 사용하여 배큘로바이러스 DNA의 양을 결정하기 위해, 프라이머 세트 180/181을 갖는 pVD를 스탠다드로 사용하였다. pVD의 농도를 OD 측정으로 결정하였다. 프라이머 세트 340/341을 사용하여 배큘로바이러스 DNA의 양을 결정하기 위해, 프라이머 세트 340/341을 갖는 BacVD를 스탠다드로 사용하였다. 스탠다드 라인에 대한 BacVD의 양은 스탠다드로서 pVD를 갖는 프라이머 세트 180/181을 이용한 Q-PCR에 의해 결정되었다.
DNA의 양(gc/ mL)은 다음 공식을 사용하여 계산되었다.
Figure 112017061140206-pct00004
상기 식에서:
S = 측정된 평균 양(gc)
D = 바이러스 DNA의 희석 계수(500배 또는 1000배)
C = 10 μl 샘플에서 1 mL 샘플까지 계산할 보정 계수(100)
μg/mL로 DNA의 양을 계산하기 위해 식은 다음과 같이 확장되었다.
Figure 112017061140206-pct00005
상기 식에서:
X = g에서 μg으로의 변환 계수(106)
A = 아보가드로의 수(6.022×1023)
Mw = DNA의 몰 중량. 배큘로바이러스 게놈은 135kbp 이중 스트랜드 DNA로 구성된다. 1bp 당 평균 분자량은 649Da이다. (프라이머 세트 180/181 또는 340/341을 이용한 결정 후) 배큘로바이러스 DNA에 대한 Mw로서, 135000·649 = 8.76×107Da의 MW이 사용되었다.
AAV1 게놈은 3630bp 단일 스트랜드 DNA로 구성된다. AAV1 DNA의 양을 계산하기 위해, 3630bp·340Da = 1.23 × 106Da의 Mw가 사용되었다.
1.2 결과
배큘로바이러스 DNA의 양은 2개의 상이한 프라이머 세트를 사용하여 Q-PCR로 결정되었다. 프라이머 세트 180/181은 AAV-트랜스진 카세트에 가까운 ORF 1629에서의 서열을 검출하나, 프라이머 세트 340/341에 대한 서열은 카세트로부터 먼 곳에 위치한다. 표 1의 결과는 상기 2개의 프라이머 세트가 배큘로바이러스 DNA의 gc/mL의 양에 대해 매우 상이한 값을 산출함을 보여준다(프라이머 세트 180/181은 프라이머 세트 340/341에 의해 수득된 것보다 평균 20배 더 높은 값을 산출함).
[표 1]
의도된 rAAV 게놈 및 오염 DAN 의 농도
Figure 112017061140206-pct00006

Bac.VD 스탠다드의 농도는 Q-PCR을 사용하여 보정되었으며, 이러한 차이가 스탠다드와 관련이 있다는 것을 배제할 수 있다. 따라서, 이러한 데이터는 ITRs에 가까운 배큘로바이러스 DNA(프라이머 세트 180/181로 검출된)가 상기 ITRs 로부터 떨어진 DNA(프라이머 세트 340/341에 의해 검출된)보다 훨씬 더 많이 존재함을 나타낸다.
실시예 2: Q- PCR 을 이용한 핵산 불순물 결정
2,1 재료 및 방법
배큘로바이러스 게놈의 어느 부분이 샘플에 존재하는지 그리고 상이한 서열들의 양에 있어서 가능한 차이를 조사하기 위해, 상이한 프라이머 세트(도 2 참조)를 이용한 Q-PCR을 수행하였다. 각 프라이머 세트에 대해 스탠다드 라인을 실험에 포함시켰다. 트랜스진 복사체의 양은 프라이머 세트 59/60을 사용하여 결정하였다. 후속적으로, 트랜스진 복사체와 비교하여 게놈 복사체의 상대적 양을 결정하였다. AAV 파티클은 그 자신의 게놈의 길이보다 더 긴 DNA 서열을 포함할 수 있는 것으로 알려져 있기 때문에(Grieger et al., 2005, Allocca et al., 2008) 트랜스진 카세트 및 ITRs의 10kb 업스트림 및 다운스트림 측면에 위치한 ORF의 시작과 끝에서 프라이머를 선택하였다.
2.2 결과
배큘로바이러스 DNA의 양은 배큘로바이러스의 hr3 서열에 가까운 위치에 있는 앰플리콘 73555-73604을 증폭시키는 프라이머 세트 340/341을 사용하여 결정하였다. 이들 프라이머로 결정된 게놈 복사체의 양은 전체 배큘로바이러스 게놈을 대표하는 것으로 가정하였다. 그러나, AAV-트랜스 카세트에 더 가까운 서열을 표적으로 하는 상이한 프라이머 세트를 사용한 유사한 실험은, 앰플리콘이 ITRs을 함유하는 AAV-트랜스진 카세트에 더 가깝게 위치할 때 더 많은 수의 게놈 복사체가 발견된다는 것을 나타내었다(도 3). AAV가 더 큰 DNA 서열(최대 8.9kb, 아마도 더 높은 것도 가능함(Allocca et al., 2008))을 패키징할 수 있는 것으로 알려져 있기 때문에, 본 발명자들은 이들 서열이 파티클 내부에 패키징되는 것으로 기대한다. 이것은 2종류의 잔류 배큘로바이러스 DNA 서열이 있음을 의미한다; 1) 트랜스진의 게놈 복사체의 양의 0.1%에서만 발견되는, 프라이머 세트 340/341로 결정한 바와 같은 랜덤 서열 및 2) 트랜스진 게놈 복사체의 양의 1 내지 2.5%에서 발견되는, 트랜스진 카세트로부터 10kb 내의 배큘로바이러스 서열(AAV 패키징 제한 범위 내). 두 서열 모두 아마도 AAV1 파티클 내부에 패키징되거나 또는 캡시드와 관련되어있을 것으로 추정된다.
실시예 3: 차세대 시퀀싱을 이용한 핵산 불순물 결정
3.1 재료 및 방법
제조된 rAAV 벡터에서 DNA 불순물의 정도 및 기원을 조사하기 위해, 4가지 상이한 rAAV 벡터 배치를 딥 시퀀싱(deep-sequencing)으로 분석하였다. Nucleospin 추출물 II 키트(Macherey Nagel, Duren, Germany)를 사용하여 이들 rAAV 벡터로부터 DNA를 분리하였다.
이 DNA는 딥 시퀀싱 라이브러리를 준비하는데 사용되었다.
별도의 시퀀싱 특징을 생성하기 위해 원 위치(in situ) 하이브리드화를 수행한다. 클러스터는 초기 물질의 희석을 제한함으로써 완수된다. DNA 프래그먼트가 멜팅되고, 단일 스트랜드가 프라이머의 조밀한 론(lawn)으로 덮여있는 플로우 셀 안에 갇히게 된다. 후속적인 국소 증폭(브릿지 PCR)은 평방 마이크로 미터 당 약 1000 개의 동일 분자의 클러스터 형성을 유도한다. 염기 편입은 프라이머, 폴리머 라제 및 4개의 플루오로포어-표지된 데옥시뉴클레오티드트리포스페이트를 첨가함으로써 시작된다. dNTPs는 가역성 종결자로서 작용한다. 즉, 각 사이클에서 분자 당 단일 염기만 첨가된다. 클러스터 플루오런스는 어떤 염기가 편입되었는지를 확인하기 위해 측정된다. 녹색 레이저는 염기 G와 T의 편입을 확인하고, 판독 레이저는 염기 A와 C를 확인한다. G/T와 A/C를 구별하기 위해 두 개의 상이한 필터가 각각 사용된다. 신호 검출 후, 플루우로포어 및 뉴클레오티드의 말단 변형이 제거된다(Dohm, JC, Lottaz, C., Borodina, T. and Himmelbauer, H.(2008), Nucleic Acids Res. 36, e105; Shendure, J and Ji, H.(2008), Nat.Biotechnol.26, 1135-1145; Rothberg, JM and Leamon, JH (2008), Nat.Biotechnol.26, 1117-1124; Kahvejian, A., Quackenbush, J., and Thompson, JF(2008), Nat. Biotechnol. 26, 1125-1133). 이 방법은 어떤 유형의 서열이 불순물로서 존재하는지, 그리고 특정 서열 집단 간의 비율이 어떤지를 결정하는데 특히 유용할 수 있다. 분석은 ServiceXS(Leiden)에 의해 수행되었다.
스탠다드 차세대 시퀀싱 실험은, 콘틱(contigs)을 생성하기 위해 레퍼런스 서열과 정렬되거나 또는 데 노보(de novo) 어셈블링될 필요가 있는 2천만 개가 넘는 짧은 판독들을 형성한다. 여기서, 전체 내용물의 시퀀싱시 판독은 다수의 레퍼런스 서열과 정렬되었다. 이러한 레퍼런스 서열은 rAAV 벡터 제조물에 존재하는 것으로 알려진 DNA 분자를 나타낸다. 이는 의도된 게놈 및 생산 관련 DNA 불순물을 포함한다. 정렬은 CLC_bio aligner로 수행되었다. 실험에서 모든 염기가 판독되는 빈도는 다른 측정된 서열과 비교하여 이의 상대적인 발생에 대한 정보를 제공한다. 뉴클레오티드 당 판독은 각 레퍼런스 서열에 대해 검색되었다(도 4). 레퍼런스 서열의 뉴클레오티드들이 8-12 회 넘게 판독될 때, 그 서열 정보는 높은 신뢰 수준을 갖는 것으로 일반적으로 받아들인다(Schuster, S.C.(2008), Nat. Methods 5, 16-18).
3.2 결과
총 DNA 시퀀싱을 사용하여 상이한 AAV 배치의 DNA 조성을 분석하였다. 분석은 Ilumina GAI-II의 단일 판독 시퀀싱 절차에 따라 Baseclear(Leiden, The Netherlands)에 의해 수행되었다. 결과적으로 얻어진 퀄러티 트리밍된 로(raw) 서열 데이터는 CLC_bio 생물정보 소프트웨어의 도움으로 분석되었다. 판독은 rAAV 벡터 제조물, 즉 배큘로바이러스 백본, 캡 특이적, rep 특이적 및 트랜스진 특이적 DNA에서 가능성 있게 존재하는 DNA 분자를 나타내는 레퍼런스 서열상에 레퍼런스 어셈블리되었다. 예상대로 99.7%가 넘는 대다수의 생성된 ~2천만 판독이 의도된 DNA 트랜스진 카세트 및 알려진 생산 관련 DNA 불순물들에 어셈블리되었다. 상기 언급된 어느 레퍼런스 서열에 어셈블리되지 않은 다른 모든 서열들(0.3% 미만)은 시퀀싱 에러, 링커 멀티머화, 저품질 판독 및 다른 DNA 서열들을 나타낼 수 있다.
트랜스진 카세트, 캡 카세트, rep 카세트 및 배큘로바이러스 게놈에 대해 뉴클레오티드 당 카운트를 검색하고, 뉴클레오티드 번호에 대해 플로팅하였다(도 4 및 5 참조). 뉴클레오티드 당 판독 빈도의 분포는 상이한 배치 제조물들 간에 매우 일관되었다. 더욱이, 배큘로바이러스 게놈의 분포가 랜덤이 아니라는 것이 분명해졌다. ITRs 측면에 위치한 게놈 세그먼트들이 명확히 오버리프리젠팅되었다(도 5).
[표 2]
5개의 상이한 rAAV 배치들(lot#)에서 평균 판독 분포(S)
Figure 112017061140206-pct00007

표 2는 주어진 서열 당 검색된 평균 빈도(S)를 보여준다. 이러한 빈도는 샘플 내의 메인 DNA, 즉 표 3의 트랜스진 카세트(transgene cassette)와 관련하여 나타난다. 주어진 불순물의 퍼센트는 하기 나타낸 식에 따라 트랜스진 카세트와 관련하여 계산되고, 크기 보정 계수를 고려한다.
Xbac = Sbac/Stransgene * Cbac * 100%
여기서:
Xbac - 트랜스진 카세트와 관련된 배큘로바이러스의 DNA 불순물의 퍼센트
Sbac - 배큘로바이러스 백본에 대해 검색된 평균 카운트
Stransgene - 트랜스진 카세트에 대해 검색된 평균 카운트
Cbac - 분자 길이 보정 계수, 여기서 Cbac = 배큘로바이러스 백본 길이(nt)/트랜스진 카세트 길이(nt)
[표 3]
트랜스진 카세트에 비해 다양한 DNA 불순물의 상대 존재량. 상이한 분자들의 평균 카운트 분포(S)는 카운트 분포 트랜스진(Stransgene)과 관련하여 나타난다.
Figure 112017061140206-pct00008

[표 4]
lpl 카세트와 관련하여 다양한 AAV 배치들에 존재하는 다양한 불순물의 퍼센트(본문에 기술된 식에 기초함).
Figure 112017061140206-pct00009

실시예 4: DNA 불순물의 비-랜덤 분포
4.1 재료 및 방법
다음 단계는 배큘로바이러스에서 얻은 DNA 불순물의 정확한 기원을 결정하는 것이었다. 이를 위해, 상기한 바와 같이 Illumina 플랫폼상에서 rAAV 벡터의 상이한 배치들을 딥-시퀀싱 하였다. 배큘로바이러스 게놈에 대한 판독의 정렬은 딥-시퀀싱 라이브러리에서 각 (배큘로바이러스-유래) 뉴클레오티드의 빈도를 조사하는 수단을 제공하였다. 또한 평균 빈도는 배클로바이러스 게놈에 매핑된 총 판독수를 뉴클레오티드의 수로 나누어 계산되었다.
4.2 결과
도 5는 딥-시퀀싱 후 배큘로바이러스 게놈에 대한 판독의 정렬을 보여준다. DNA 불순물이 배큘로바이러스 게놈으로부터 랜덤하게 유도되는 경우, 비교적 균일 한 분포가 뉴클레오티드 당 약 1200 판독으로 관찰되어야한다. 배큘로바이러스 게놈의 중간에 균일한 분포가 실제로 나타난다. 그러나, 배큘로바이러스 게놈의 시작과 끝에서 판독수의 강한 증가가 관찰된다. 이것은 rAAV에서 이러한 영역이 DNA 불순물로서 오버리프리젠팅되어 있음을 나타낸다.
실시예 5: Q- PCR 또는 딥-시퀀싱을 사용한 품질 관리 평가
5.1 재료 및 방법
rAAV 벡터에서 DNA 불순물의 수준을 시험하기 위해 3가지 상이한 기술을 조사하였다. 도 6에서 볼 수 있듯이, 3가지 기술은 서로 매우 상관관계에 있어 rAAV 벡터에서 DNA 불순물을 검출하기 위해 나란히 사용할 수 있다.
도 6에서 볼 수 있듯이, NGS 분석은 정량적 PCR을 위한 DNA 앰플리콘의 랜덤 선택이 벡터 제조물에서 특정 DNA 불순물의 부정확한 측정을 초래할 수 있음을 분명히 보여준다. 주어진 DNA 불순물의 존재는 조사된 DNA 분자(때로는 136000 bp 길이, 예를 들어, 배큘로바이러스 백본)의 모든 부분이 동일한 빈도로 분포된다는 가정하에 앰플리콘 측정에 기초하여 계산된다. 여기에 나타난 분석은 예를 들어, 배큘로 바이러스 게놈과 같이 긴 DNA 분자의 다양한 세그멘트가 상이한 DNA 서열들의 불균일한 패키징으로 인해 상이한 빈도로 벡터 제조물을 오염시킬 수 있음을 분명히 나타낸다.
[표 5]
Figure 112017061140206-pct00010
Figure 112017061140206-pct00011
Figure 112017061140206-pct00012
SEQUENCE LISTING <110> uniQure IP B.V. <120> DNA impurities in a composition comprising a parvoviral virion <130> p6042305pct <160> 34 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 145 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <220> <221> misc_feature <223> upstream ITR <400> 1 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcct 145 <210> 2 <211> 183 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <220> <221> misc_feature <223> downstream ITR <400> 2 gcgcggtacc ccatggagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct 60 cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg 120 gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca agatatccca tggggtaccg 180 cgc 183 <210> 3 <211> 2203 <212> DNA <213> adeno-associated virus 5 <220> <221> misc_feature <223> pDP5 <400> 3 atgtcttttg ttgatcaccc tccagattgg ttggaagaag ttggtgaagg tcttcgcgag 60 tttttgggcc ttgaagcggg cccaccgaaa ccaaaaccca atcagcagca tcaagatcaa 120 gcccgtggtc ttgtgctgcc tggttataac tatctcggac ccggaaacgg tctcgatcga 180 ggagagcctg tcaacagggc agacgaggtc gcgcgagagc acgacatctc gtacaacgag 240 cagcttgagg cgggagacaa cccctacctc aagtacaacc acgcggacgc cgagtttcag 300 gagaagctcg ccgacgacac atccttcggg ggaaacctcg gaaaggcagt ctttcaggcc 360 aagaaaaggg ttctcgaacc ttttggcctg gttgaagagg gtgctaagac ggcccctacc 420 ggaaagcgga tagacgacca ctttccaaaa agaaagaagg ctcggaccga agaggactcc 480 aagccttcca cctcgtcaga cgccgaagct ggacccagcg gatcccagca gctgcaaatc 540 ccagcccaac cagcctcaag tttgggagct gatacaatgt ctgcgggagg tggcggccca 600 ttgggcgaca ataaccaagg tgccgatgga gtgggcaatg cctcgggaga ttggcattgc 660 gattccacgt ggatggggga cagagtcgtc accaagtcca cccgaacctg ggtgctgccc 720 agctacaaca accaccagta ccgagagatc aaaagcggct ccgtcgacgg aagcaacgcc 780 aacgcctact ttggatacag caccccctgg gggtactttg actttaaccg cttccacagc 840 cactggagcc cccgagactg gcaaagactc atcaacaact actggggctt cagaccccgg 900 tccctcagag tcaaaatctt caacattcaa gtcaaagagg tcacggtgca ggactccacc 960 accaccatcg ccaacaacct cacctccacc gtccaagtgt ttacggacga cgactaccag 1020 ctgccctacg tcgtcggcaa cgggaccgag ggatgcctgc cggccttccc tccgcaggtc 1080 tttacgctgc cgcagtacgg ttacgcgacg ctgaaccgcg acaacacaga aaatcccacc 1140 gagaggagca gcttcttctg cctagagtac tttcccagca agatgctgag aacgggcaac 1200 aactttgagt ttacctacaa ctttgaggag gtgcccttcc actccagctt cgctcccagt 1260 cagaacctgt tcaagctggc caacccgctg gtggaccagt acttgtaccg cttcgtgagc 1320 acaaataaca ctggcggagt ccagttcaac aagaacctgg ccgggagata cgccaacacc 1380 tacaaaaact ggttcccggg gcccatgggc cgaacccagg gctggaacct gggctccggg 1440 gtcaaccgcg ccagtgtcag cgccttcgcc acgaccaata ggatggagct cgagggcgcg 1500 agttaccagg tgcccccgca gccgaacggc atgaccaaca acctccaggg cagcaacacc 1560 tatgccctgg agaacactat gatcttcaac agccagccgg cgaacccggg caccaccgcc 1620 acgtacctcg agggcaacat gctcatcacc agcgagagcg agacgcagcc ggtgaaccgc 1680 gtggcgtaca acgtcggcgg gcagatggcc accaacaacc agagctccac cactgccccc 1740 gcgaccggca cgtacaacct ccaggaaatc gtgcccggca gcgtgtggat 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1825 Leu Cys Tyr Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr 590 595 600 605 gcc tgc gat ctg gtc aat gtg gat ttg gat gac tgc atc ttt gaa caa 1873 Ala Cys Asp Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln 610 615 620 taa 1876 <210> 5 <211> 621 <212> PRT <213> adeno-associated virus 2 <400> 5 Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp 1 5 10 15 Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu 20 25 30 Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile 35 40 45 Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu 50 55 60 Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val 65 70 75 80 Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val Leu Val Glu 85 90 95 Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile 100 105 110 Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro Thr Leu 115 120 125 Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly 130 135 140 Asn Lys Val Val Asp Glu 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Claims (24)

  1. 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 과표현된 핵산 불순물을 확인하고 정량화하는 방법이며, 여기서 상기 방법은
    a) 상기 조성물을 핵산 시퀀싱에 적용하여 뉴클레오티드 서열의 랜덤 판독을 얻는 단계로서, 여기서 핵산 시퀀싱은 하이-스루풋 시퀀싱(high-throughput sequencing)을 포함하는, 단계;
    b) 단계 a)로부터의 랜덤 판독을 상기 조성물 생산 공정에 사용된 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열과 비교하여, 랜덤 판독과 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열 사이의 매치(match)로 핵산 불순물을 확인하는 단계;
    c) 파보바이러스 벡터 당 평균 판독수를 결정하는 단계; 및
    d) 과표현된 핵산 불순물의 뉴클레오티드 당 판독수를 결정하는 단계로서, 판독 분포가 랜덤하지 않고 과표현된 불순물이 상기 생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열의 평균 판독수의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 50배를 포함하거나, 또는 핵산 불순물의 뉴클레오티드 당 판독수가 파보바이러스 벡터 당 평균 판독수의 적어도 0.001, 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.0 또는 10%인 경우에, 핵산 불순물이 과표현된 불순물로서 확인되는, 과표현된 핵산 불순물의 뉴클레오티드 당 판독수를 결정하는 단계
    를 포함하는, 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 과표현된 핵산 불순물을 확인하고 정량화하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    파보바이러스 벡터는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터인, 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 과표현된 핵산 불순물을 확인하고 정량화하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포, 플라스미드, 재조합 파보바이러스 벡터 이외의 벡터 및 헬퍼 바이러스의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되며, 여기서 재조합 파보바이러스 벡터 이외의 벡터는 배큘로바이러스 벡터인, 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 과표현된 핵산 불순물을 확인하고 정량화하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    헬퍼 바이러스는 재조합 아데노바이러스 및 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 중 적어도 하나인, 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 과표현된 핵산 불순물을 확인하고 정량화하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    생물학적 성분의 뉴클레오티드 서열은 Rep, Cap 및 트랜스진 중 적어도 하나를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 생물학적 성분은 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 여기서 생물학적 성분은 적어도 하나의 파보바이러스 ITR가 측면에 위치하는 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 여기서 생물학적 성분은 트랜즈진 측면의 각 사이드 상에 적어도 하나의 파보바이러스 ITR가 위치하는 트랜스진을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 과표현된 핵산 불순물을 확인하고 정량화하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    과표현된 핵산 불순물은 제2의 또는 추가 조성물에서 정량화되는, 파보바이러스 벡터를 포함하는 조성물에서 과표현된 핵산 불순물을 확인하고 정량화하는 방법.
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