JP6741345B2

JP6741345B2 - パルボウイルスビリオンを含む組成物におけるｄｎａ不純物

Info

Publication number: JP6741345B2
Application number: JP2017528531A
Authority: JP
Inventors: ヤツェクユベルスキ，; ヴィルヘルムステオドルスヨハネスマリアクリスチャンヘルマンス，
Original assignee: ユニキュアーアイピービー．ブイ．
Priority date: 2014-11-28
Filing date: 2015-11-27
Publication date: 2020-08-19
Anticipated expiration: 2035-11-27
Also published as: JP2017535278A; EA035747B1; EP3224376B1; SI3224376T2; ES2751919T3; US11021762B2; FI3224376T4; US20170321290A1; AU2015352469A1; EP3591070B1; DK3224376T3; EP3224376B2; SI3224376T1; CN107208142A; EA201791184A1; HK1244849B; DK3591070T3; PT3224376T; PL3224376T5; ES2751919T5

Description

本発明は、ウイルス学及び遺伝子療法の分野に関する。特に、本発明は、組成物中の過剰に存在する核酸不純物を同定する及び／又は定量する方法に関する。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく組換えベクターは、多数の臨床試験に使用されており、ヒト遺伝子治療に関して大きな可能性を有している。ｒＡＡＶが広く成功している原因の本質的な特性は、良好な安全性特性と組み合わされた、持続性の導入遺伝子発現を確立する能力である。臨床グレードｒＡＡＶの調製は、とりわけ、ベクターの安全性を損なう癌遺伝子、抗生物質マーカー又は免疫原性ペプチドを潜在的にコードし得るＤＮＡ不純物の最小化に焦点を絞っている（Ｗｒｉｇｈｔら、２００８、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１５、８４０−８４８）。

最終的な産物の純度を保証するため、ｒＡＡＶの上流と下流のプロセシングの双方において多大な進展がなされてきたにもかかわらず、望まれないＤＮＡが完全に排除されているとは思えない。細胞又はヘルパーベクターＤＮＡのパッケージングは、ＡＡＶ生物学の副産物であるように思われ、それ自体は、意図される導入遺伝子ＤＮＡのカプシド形成に本質的に関連している。無関係のＤＮＡがカプシド形成されてカプシドが前形成されると、その粒子は、意図される発現カセットのみを含有するカプシドと区別できなくなり、それらを分離することは実質的に不可能である。

したがって、臨床開発をサポートし、ｒＡＡＶベクター中の望まれないＤＮＡの存在に関連するリスクを理解するためには、使用したｒＡＡＶの生体内分布プロファイルを反映する細胞株の範囲で、これらの遺伝子エレメントからのタンパク質発現の可能性を評価して、意図されていないタンパク質発現が、ベクターの安全性及び／又は有効性に潜在的を損なう細胞の再構成、腫瘍発生又は望まれない免疫応答などの望ましくない影響がもたらされ得る理論上の可能性を除外する必要性が存在する。

これまで、ＤＮＡ不純物混入ｒＡＡＶ調製物の存在及び濃度は、文献（Ｂｌｏｕｉｎら、２００４、Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ．６Ｓｕｐｐｌ１、Ｓ２２３−Ｓ２２８；Ｎｏｎｙら、２００３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７、７７６−７８１；Ｃｈａｄｅｕｆら、２００５、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２、７４４−７５３；Ｗｒｉｇｈｔら、２００８、上記）中に報告されている。これらの不純物が、ヘルパープラスミド又は宿主細胞ＤＮＡいずれかに由来することが突き止められた（Ｗｒｉｇｈｔら、２００８、上記）。この一緒にパッケージングされた残留するＤＮＡに由来する推定上のタンパク質発現の問題点と取り組んだのは限られた数の研究に過ぎない。Ｗｒｉｇｈｔ及び同研究者は、ｒＡＡＶによるヒト肝細胞又はマウスの感染の際にＲＴ−ｑＰＣＲによってｃａｐ、ａｍｐ（ｒ）、並びに２つのアデノウイルス遺伝子Ｅ２Ａ及びＥ４の発現を分析したところ、検出可能な転写は見いだされなかった（Ｈａｕｃｋら、２００９、ＭｏｌＴｈｅｒ．１７（１）１４４−１５２）。対照的に、Ｍｉｌｌｅｒらは、相補性アッセイを用いてｃａｐ遺伝子のＤＮＡ不純物駆動性発現を見いだした（Ｈａｌｂｅｒｔら、２０１１、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１８（４）：４１１−４１７）。

生物薬剤のビリオン調製物中のＤＮＡ不純物を分析するために現在選択される方法は、ｑＰＣＲである。この方法を用いることにより、特定のＤＮＡ不純物の存在及び量が決定される。重要なことに、当業者は、このように検出されるＤＮＡ不純物を先に（すなわちｑＰＣＲを実施する前に）選択する、その理由は、当技術分野では、ＤＮＡ不純物がランダムにビリオンにパッケージングされるとの一般的なコンセンサスが存在するからである。このような（事前に選択した）ＤＮＡ不純物は、例えば、宿主細胞ＤＮＡ、Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はプラスミドヌクレオチド配列を含む可能性がある。例えば、Ｔｈｏｒｎｅら（２００９、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０：７０７−７１４）によって示される通り、宿主細胞ＤＮＡ不純物は、ＨｅＬａベースの産生系の安全性評価について関連性のある配列としてのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７形質転換遺伝子、及び感度の良い全身マーカーとしての、高度に発現され高コピーのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の遺伝子の２つの標的を用いてモニターされる。Ｔｈｏｒｎｅら（上記）によると、最も普及している一緒にパッケージングされる配列は、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐを含めて、パッケージングプラスミドに、及び細菌の及び哺乳動物の細胞選択マーカー遺伝子に由来する。さらに、Ｙｅら（２０１１、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１８、１３５−１４４）は、ＨＳＶパッケージングプラスミドからのＤＮＡ配列が、哺乳動物細胞株におけるｒＡＡＶ生産の間にランダムにパッケージングされることを開示している。Ｙｅらによると、ＡＡＶビリオンは、全ＨＳＶゲノムにわたるランダムな断片を含む。加えて、Ｃｈａｄｅｕｆら（上記）により、より小さなＤＮＡプラスミドの場合、完全なプラスミド及びウイルス性ＩＴＲが、選択マーカー遺伝子を含めて、ビリオンに封入されることが示された。したがって、ＤＮＡ不純物は、ランダムにパルボウイルスビリオンにパッケージングされるように見えるので、特定のヌクレオチド配列を検出する必要はないと思われた。

ＤＮＡ不純物が、ランダムにビリオンにパッケージングされるとの一般的な教示とは対照的に、本発明は、いくつかのＤＮＡ不純物が、実際に過剰に存在することを示す。結果として、生物薬剤組成物中のＤＮＡ不純物を検出するための現在使用される方法は、組成物中に存在するＤＮＡ不純物の劇的な過小評価に導く可能性がある。このような医薬組成物中のＤＮＡ不純物の過小評価は、臨床的に十分に純粋ではない組成物の投与をもたらす可能性があり、患者にとって潜在的な安全性健康リスクへと導く。

したがって、生物薬剤調製物などの生物学的組成物中の過剰に存在するＤＮＡ不純物を同定する及び定量する手段及び方法について当技術分野において必要性が存在する。このような手段及び方法を提供することが本発明の目的である。

第１の態様において、本発明は、パルボウイルスベクターを含む組成物中の過剰に存在する核酸不純物を同定する及び定量する方法に関し、上記方法は、以下のステップを含む：
ａ）上記組成物を核酸シークエンシングに供してヌクレオチド配列のランダムリードを得るステップ；
ｂ）ステップａ）からのランダムリードと、上記組成物を生産するためのプロセスにおいて使用される生物学的成分のヌクレオチド配列とを比較し、それによってランダムリードと生物学的成分のヌクレオチド配列の間のマッチ度が核酸不純物を同定するステップ；
ｃ）パルボウイルスベクター当たりのリードの平均数を決定するステップ；及び
ｄ）過剰に存在する核酸不純物のヌクレオチド当たりのリードの数を決定するステップであって、核酸不純物は、リードの分布が、ランダムではなく、過剰に存在する不純物が、生物学的成分のリードの平均数の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０若しくは５０倍を含む場合に、又は核酸不純物のヌクレオチド当たりのリードの数が、パルボウイルスベクター当たりのリードの平均数の少なくとも０．００１、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、５．０、７．０若しくは１０％である場合に、過剰に存在する不純物として同定されるステップ。

好ましい実施形態において、ステップ（ａ）における核酸シークエンシングは、ハイスループットシークエンシングを含む。
好ましい実施形態において、パルボウイルスベクターは、組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。

好ましい実施形態において、生物学的成分のヌクレオチド配列は、宿主細胞、プラスミド、組換えパルボウイルスベクター以外のベクター及びヘルパーウイルスのヌクレオチド配列からなる群から選択され、ここで、上記ベクターは、バキュロウイルスベクターであることが好ましい。

好ましい実施形態において、ヘルパーウイルスは、組換えアデノウイルス及び／又は組換え単純ヘルペスウイルスである。

好ましい実施形態において、生物学的成分のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ、Ｃａｐ及び／又は導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、生物学的成分は、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましく、生物学的成分は、少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲと隣接する導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むことがより好ましく、生物学的成分は、各側において少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲと隣接する導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むことが最も好ましい。

好ましい実施形態において、過剰に存在する核酸不純物は、第２又はさらなる組成物において定量される。

第２の態様において、本発明は、パルボウイルスベクターを含む組成物中の核酸不純物を定量する方法に関し、上記方法は、核酸不純物の相対存在量を決定するステップを含み、ここで、パルボウイルスＩＴＲ配列が、上記組成物を生産するプロセスに使用される生物学的成分に存在する場合、核酸不純物は、パルボウイルスＩＴＲ配列の１〜８０００ｂｐ、１〜５０００ｂｐ、１〜３０００ｂｐ、１〜１０００ｂｐ、１〜５００ｂｐ、１〜２５０ｂｐ又は１〜１００ｂｐすぐ近傍に位置するヌクレオチド配列を含み、ここで、上記生物学的成分は、少なくとも１つのコピーのパルボウイルスＩＴＲ配列と隣接する導入遺伝子を含む。

好ましい実施形態において、生物学的成分は、宿主細胞、プラスミド、組換えパルボウイルスベクター以外のベクター及びヘルパーウイルスからなる群から選択され、ここで、上記ベクターは、バキュロウイルスベクターであることが好ましい。

好ましい実施形態において、パルボウイルスベクターは、組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。

好ましい実施形態において、パルボウイルスＩＴＲ配列が、組成物を生産するプロセスに使用される生物学的成分に存在する場合、核酸不純物のヌクレオチド配列は、そのＩＴＲ配列の各側のすぐ近傍に位置する。

好ましい実施形態において、相対存在量は、パルボウイルスベクターのヌクレオチド配列及び／又は組成物における参照配列と比較して決定される。

好ましい実施形態において、相対存在量は、
ａ）上に定義されている核酸不純物の核酸当たりのリードの平均数；並びに
ｉ）参照配列の核酸当たりのリードの平均数；及び／若しくは
ｉｉ）組成物中のパルボウイルスベクター当たりのリードの平均数
によって決定され、ここで、リードの数は、上に定義されている方法によって決定される；並びに／又は
ｂ）上に定義されている核酸不純物；並びに
ｉ）参照配列；及び／若しくは
ｉｉ）パルボウイルスベクターのヌクレオチド配列
の増幅によって決定される。

好ましい実施形態において、相対存在量は、Ｑ−ＰＣＲによって及び／又はハイスループットシークエンシングによって決定される。

好ましい実施形態において、方法は、上に定義されている核酸不純物又はその相補体に対するオリゴヌクレオチドプライマーの選択的なハイブリダイゼーションのステップをさらに含む。

好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、バキュロウイルス配列又はその相補体の一部を含む核酸不純物に選択的にハイブリダイズする。

第３の態様において、本発明は、パルボウイルスベクターを含む組成物が臨床的に純粋であると考慮されるかどうかを決定する方法に関し、上記方法は以下のステップを含む：
ｉ）上に定義されているパルボウイルスベクター組成物中の核酸不純物を定量するステップ；並びに
ｉｉ）上に定義されている核酸不純物が、核酸不純物の相対存在量によって決定される場合に参照配列及び／又は導入遺伝子と比べて少なくとも１０、１００、２５０、１０００倍少なく存在するなら、組成物を臨床的に純粋であると決定するステップ。

好ましい実施形態において、パルボウイルスベクターを含む組成物は、医薬組成物である。別の好ましい実施形態の代わりに又は別の好ましい実施形態と組み合わせて、本発明の好ましい実施形態では、パルボウイルスベクターを含む組成物は、パルボウイルスカプシドを含み、ここで、パルボウイルスベクターは、パッケージングされる。別の好ましい実施形態の代わりに又は別の好ましい実施形態と組み合わせて、本発明の好ましい実施形態では、パルボウイルスベクターを含む組成物は、哺乳動物から得られた又は得られる試料を含まず、ここで、哺乳動物は、非ヒト霊長類であることが好ましい。

デオキシリボヌクレアーゼＩに対するＡＡＶ１導入遺伝子（上のパネル）及びバキュロウイルスＤＮＡ（中央及び下のパネル）の耐性を示す図である。３つの異なるプライマーを用いるＱ−ＰＣＲによって検出させるＤＮＡの量は、デオキシリボヌクレアーゼ処理の存在下又は非存在下のいずれかに設定される。各プライマーセットについて、２つのバッチを検査した。図１Ａ及び図１Ｂプライマーセット５９／６０、図１Ｃ及び図１Ｄプライマーセット１８０／１８１、図１Ｅ及び図１Ｆプライマーセット３４０／３４１。デオキシリボヌクレアーゼＩに対するＡＡＶ１導入遺伝子（上のパネル）及びバキュロウイルスＤＮＡ（中央及び下のパネル）の耐性を示す図である。３つの異なるプライマーを用いるＱ−ＰＣＲによって検出させるＤＮＡの量は、デオキシリボヌクレアーゼ処理の存在下又は非存在下のいずれかに設定される。各プライマーセットについて、２つのバッチを検査した。図１Ａ及び図１Ｂプライマーセット５９／６０、図１Ｃ及び図１Ｄプライマーセット１８０／１８１、図１Ｅ及び図１Ｆプライマーセット３４０／３４１。デオキシリボヌクレアーゼＩに対するＡＡＶ１導入遺伝子（上のパネル）及びバキュロウイルスＤＮＡ（中央及び下のパネル）の耐性を示す図である。３つの異なるプライマーを用いるＱ−ＰＣＲによって検出させるＤＮＡの量は、デオキシリボヌクレアーゼ処理の存在下又は非存在下のいずれかに設定される。各プライマーセットについて、２つのバッチを検査した。図１Ａ及び図１Ｂプライマーセット５９／６０、図１Ｃ及び図１Ｄプライマーセット１８０／１８１、図１Ｅ及び図１Ｆプライマーセット３４０／３４１。デオキシリボヌクレアーゼＩに対するＡＡＶ１導入遺伝子（上のパネル）及びバキュロウイルスＤＮＡ（中央及び下のパネル）の耐性を示す図である。３つの異なるプライマーを用いるＱ−ＰＣＲによって検出させるＤＮＡの量は、デオキシリボヌクレアーゼ処理の存在下又は非存在下のいずれかに設定される。各プライマーセットについて、２つのバッチを検査した。図１Ａ及び図１Ｂプライマーセット５９／６０、図１Ｃ及び図１Ｄプライマーセット１８０／１８１、図１Ｅ及び図１Ｆプライマーセット３４０／３４１。デオキシリボヌクレアーゼＩに対するＡＡＶ１導入遺伝子（上のパネル）及びバキュロウイルスＤＮＡ（中央及び下のパネル）の耐性を示す図である。３つの異なるプライマーを用いるＱ−ＰＣＲによって検出させるＤＮＡの量は、デオキシリボヌクレアーゼ処理の存在下又は非存在下のいずれかに設定される。各プライマーセットについて、２つのバッチを検査した。図１Ａ及び図１Ｂプライマーセット５９／６０、図１Ｃ及び図１Ｄプライマーセット１８０／１８１、図１Ｅ及び図１Ｆプライマーセット３４０／３４１。デオキシリボヌクレアーゼＩに対するＡＡＶ１導入遺伝子（上のパネル）及びバキュロウイルスＤＮＡ（中央及び下のパネル）の耐性を示す図である。３つの異なるプライマーを用いるＱ−ＰＣＲによって検出させるＤＮＡの量は、デオキシリボヌクレアーゼ処理の存在下又は非存在下のいずれかに設定される。各プライマーセットについて、２つのバッチを検査した。図１Ａ及び図１Ｂプライマーセット５９／６０、図１Ｃ及び図１Ｄプライマーセット１８０／１８１、図１Ｅ及び図１Ｆプライマーセット３４０／３４１。バキュロウイルスプラスミドＢａｃ．ＶＤ．の配列マップを示す図である。使用したプライマーセット及びＩＴＲが示される。異なるプライマーセットによって検出されたゲノムコピーの相対量を示す図である。軸上に、単位複製配列の位置が示される。単位複製配列５２１４−５２８４は、ＡＡＶ導入遺伝子カセットのＣＭＶプロモーターを表す。単位複製配列７３５５５−７３６０４は、プライマーセット３４０／３４１が標的とし、ＡＡＶ導入遺伝子カセットから最も遠くに位置する。各点は１つの測定を表す。導入遺伝子を含むｒＡＡＶが、ディープシークエンシングによって分析されたことを示す図である。得られたリードを、導入遺伝子（図４Ａ）、ｃａｐカセット（図４Ｂ）、又はｒｅｐカセット（図４Ｃ）に対して整列させた。導入遺伝子を含むｒＡＡＶが、ディープシークエンシングによって分析されたことを示す図である。得られたリードを、導入遺伝子（図４Ａ）、ｃａｐカセット（図４Ｂ）、又はｒｅｐカセット（図４Ｃ）に対して整列させた。導入遺伝子を含むｒＡＡＶが、ディープシークエンシングによって分析されたことを示す図である。得られたリードを、導入遺伝子（図４Ａ）、ｃａｐカセット（図４Ｂ）、又はｒｅｐカセット（図４Ｃ）に対して整列させた。ｒＡＡＶが、ディープシークエンシングによって分析されたことを示す図である。得られたリードを、バキュロウイルスゲノムに対して整列させた。バキュロウイルス骨格の一ヌクレオチド当たりのリードの分布が図示される。ヌクレオチド１は、図２に示される通り右ＩＴＲである。ｒＡＡＶベクターの５つの異なるバッチが、Ｑ−ＰＣＲ又はＩｌｌｕｍｉｎａ若しくはＲｏｃｈｅ４５４でディープシークエンシングを用いてＤＮＡ不純物について検査されたことを示す図である。

本発明は、ＤＮＡ不純物が、パルボウイルスビリオンにランダムにパッケージングされないとの発見に関する。代わりに、ビリオン組成物中には過剰に存在する核酸不純物がある。したがって、第１の態様において、本発明は、組成物中の核酸不純物を同定する方法に関する。組成物は、パルボウイルスベクターを含むことが好ましい。方法は、以下のステップを含むことが好ましい：ａ）組成物を核酸シークエンシングに供してヌクレオチド配列のランダムリードを得るステップ；ｂ）ステップａ）からのランダムリードと、組成物を生産するためのプロセスにおいて使用される生物学的成分のヌクレオチド配列とを比較し、それによってランダムリードと生物学的成分のヌクレオチド配列の間のマッチ度が核酸不純物を同定するステップ。同定された核酸不純物を定量するために、方法は、以下のステップを含むことがさらに好ましい：ｃ）パルボウイルスベクター当たりのリードの平均数を決定するステップ；及びｄ）同定された核酸不純物のヌクレオチド当たりのリードの数を決定するステップであって、核酸不純物は、リードの分布が、ランダムではなく、過剰に存在する不純物が、生物学的成分のリードの平均数の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又は５０倍を有する場合に、或いは核酸不純物のヌクレオチド当たりのリードの数が、パルボウイルスベクター当たりのリードの平均数の少なくとも０．００１、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、５．０、７．０又は１０％である場合に、過剰に存在する不純物として同定されるステップ。

したがって、本発明の方法は、組成物中の核酸不純物の同定及び定量に関する。核酸不純物は、ＤＮＡ不純物及び／又はＲＮＡ不純物であってもよい、核酸不純物は、ＤＮＡ不純物であることが好ましい。

「核酸不純物」という用語は、組成物を生産するためのプロセスにおいて使用される生物学的成分のヌクレオチド配列などの、パルボウイルスビリオンにパッケージングされることが意図されない任意の核酸配列を含むと理解される。特に、各側において１つのパルボウイルスＩＴＲと隣接しない配列は、核酸不純物を構成し得る。

本明細書で使用される「パルボウイルスベクター」は、少なくとも１つの（及び通常２つの）パルボウイルス末端逆位反復配列（複数可）（ＩＴＲ）と隣接する対象の１つ又は複数のポリヌクレオチド配列（例えば、対象の生産物をコードする遺伝子、すなわち「導入遺伝子」のための発現構築物）を含む組換え核酸分子を指す。

「リードのランダム分布」は、組成物を生産するためのプロセスに使用される生物学的成分のヌクレオチド配列の長さにわたって一様に整列されるリードの分布と本明細書で定義される。特に、「リードのランダム分布」は、組成物を生産するためのプロセスに使用される１つの生物学的成分のヌクレオチド配列の長さにわたって一様に整列されるリードの分布と定義される。「リードのランダム分布」は、宿主細胞、プラスミド、組換えパルボウイルスベクター以外のベクター（上記ベクターは、バキュロウイルスベクターであることが好ましい）及びヘルパーウイルスのヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の長さにわたって一様に整列されるリードの分布と本明細書で定義されることがより好ましい。したがって、リードのランダム分布は、バキュロウイルスベクターのヌクレオチド配列の長さにわたって一様に整列されるリードの分布と本発明で定義されることが最も好ましい。

等しいアラインメントは、リードが、同じヌクレオチド配列の任意の他の領域と比較してヌクレオチド配列の特定の領域に対して整列される、同等の確率と本明細書で定義される。等しいアラインメントにおいて、あるヌクレオチドに対して整列されるリードの数は、そのヌクレオチド配列に対して整列されるリードの平均数の０．１、０．２、０．５、１．０、２．０、５．０、１０、１５又は２０％超逸脱しないことが好ましい。

「リードの非ランダム分布」は、組成物を生産するためのプロセスに使用される生物学的成分のヌクレオチド配列の長さにわたって一様に整列されないリードの分布と本明細書で定義される。特に、「リードの非ランダム分布」は、組成物を生産するためのプロセスに使用される１つの生物学的成分のヌクレオチド配列の長さにわたって一様に整列されないリードの分布と定義される。「リードの非ランダム分布」は、宿主細胞、プラスミド、組換えパルボウイルスベクター以外のベクター（上記ベクターは、バキュロウイルスベクターであることが好ましい）及びヘルパーウイルスのヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の長さにわたって一様に整列されないリードの分布と本明細書で定義されることがより好ましい。したがって、リードの非ランダム分布は、バキュロウイルスベクターのヌクレオチド配列の長さにわたって一様に整列されないリードの分布と本発明で定義され、すなわち、バキュロウイルスベクターの他の領域と比較してバキュロウイルスベクターの特定の領域と、より多くのリードが整列されることを意味することが最も好ましい。

組成物は、組換えパルボウイルスベクターが、パッケージングされた（少なくとも）パルボウイルスカプシドを含む又はからなる（組換え）パルボウイルスビリオンを含む組成物であることが好ましい。組成物及びその構成物は、以下に定義されるものであることがさらに好ましい。

本発明の好ましい実施形態において、方法は、パルボウイルスビリオンにパッケージングされる、すなわち、ビリオン内に封入される核酸不純物を同定する及び／又は定量するためのものである。特に、本発明による核酸不純物は、パルボウイルスビリオンを含む組成物のヌクレアーゼ処理（例えば、ＲＮＡｓｅ又はデオキシリボヌクレアーゼ処理）後に分解されない。

組成物
好ましい実施形態において、パルボウイルスベクターは、組成物中に含有される。組成物は、医薬組成物であることが好ましい。医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含むことがさらに好ましい。任意の適切な薬学的に許容される担体又は賦形剤を、本発明の組成物において使用することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ、ＡｌｆｏｎｓｏＲ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄｉｔｏｒ）ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、Ａｐｒｉｌ１９９７を参照されたい）。

好ましい医薬形態は、無菌の塩類溶液、デキストロース溶液、又は緩衝液、又は他の薬学的に許容される無菌の流体との組合せであろう。代わりに、マイクロキャリアビーズなどの固体担体を使用してもよい。

別の好ましい実施形態の代わりに又は別の好ましい実施形態と組み合わせて、本発明の好ましい実施形態では、パルボウイルスベクターを含む組成物は、哺乳動物から得られた又は得られる試料、例えば肝臓又は筋肉試料を含まない。さらにより好ましい実施形態において、組成物は、非ヒト霊長類から得られた又は得られる試料を含まない。より好ましい実施形態において、組成物は、哺乳動物からの、例えば非ヒト霊長類からの筋肉又は肝臓からのゲノムＤＮＡを含まない。

核酸シークエンシング
本発明による方法では、組成物中の過剰に存在する核酸不純物が、同定及び定量される。過剰に存在する核酸不純物を同定する及び定量する方法は、サンガーシークエンシング又はハイスループットシークエンシングを含むが、これらに限定されない。

第１の実施形態において、パルボウイルスベクターＤＮＡを、プラスミドにクローン化し、次に従来のサンガーシークエンシングしてもよい。サンガーシークエンシングは、インビトロでのＤＮＡ複製の間のＤＮＡポリメラーゼによる連鎖終結ジデオキシヌクレオチドの選択的な取り込みに基づくＤＮＡシークエンシングの方法と本明細書で定義される。本発明によるサンガーシークエンシングは、いわゆるチェーンターミネーターサンガーシークエンシング及び／又はダイターミネーターサンガーシークエンシングを含む。サンガーシークエンシングは、ダイターミネーターサンガーシークエンシングであることが好ましい。ダイターミネーターシークエンシングは、チェーンターミネーターｄｄＮＴＰｓの標識化を利用する。特に、ダイターミネーターシークエンシングでは、それぞれの４種のジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーターは、蛍光色素で標識され、そのそれぞれは、異なる波長で光を放射し、単一反応におけるシークエンシングを可能にする。他のＤＮＡシークエンシング法は、同等に適切であり得、例えば、ナノポアＤＮＡシークエンシング、トンネル電流ＤＮＡシークエンシング、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、質量分析でのシークエンシング、微小流体サンガーシークエンシング、顕微鏡観察ベースの技術及びＲＮＡＰシークエンシングである。

本発明の好ましい実施形態において、核酸シークエンシングは、ハイスループットシークエンシングを含む。ハイスループットシークエンシング（次世代シークエンシング又はディープシークエンシングとも称される）は、非サンガーベースのハイスループットＤＮＡシークエンシング技術を指す。数千、数百万、又はさらに数十億のＤＮＡ鎖を並行して配列決定することができ、実質的により多くの処理量が実現され、またゲノムのサンガーシークエンシングにしばしば使用される断片クローニング法の必要性を最小限にする。

本発明による好ましい方法において、ハイスループットシークエンシングは、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ一分子シークエンシング、一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シークエンシング、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔシークエンシング（ｉｏｎｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、４５４シークエンシング（パイロシーケンシング、Ｒｏｃｈｅ４５４ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ^ＴＭ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）、Ｓｏｌｅｘａ（合成によるシークエンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）及び／又はＳＯＬｉＤシークエンシング（ライゲーションによるシークエンシング、ＡＢＩ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含む。本発明のさらに好ましい実施形態において、核酸シークエンシングは、ＳＯＬｉＤ、Ｓｏｌｅｘａ及び／又は４５４シークエンシングを含む。最も好ましい実施形態において、核酸シークエンシングは、Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ又は４５４シークエンシングを含む。

本発明による方法は、現在公知のハイスループットシークエンシング法に限定されない。特に、新規のハイスループットシークエンシング法は、時間が経てば本発明の方法における使用のために同等に適切なものが開発されることが理解される。特に、ハイスループットシークエンシング法として分類される任意のシークエンシング法、すなわち、数千、数百万、又は数十億のリードを単回の実施で生成する任意の方法が、本発明による方法に使用されてもよい。

本発明による好ましい方法において、ランダムリードは、パルボウイルスベクターを含む組成物を核酸シークエンシングに供するステップにより得られる。シークエンシング「リード」又は「カウント」は、核酸シークエンシング法の間に産生される塩基の個々のストリングと本明細書で定義される。異なるハイスループットシークエンシング法は、一実施（反応）当たり異なる数のリード及び異なる長さのリードを生成することができる。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａは一実施当たり三十億リードまで生成し、１つのリードは５０〜３００ｂｐの平均長を有する。他方、４５４シークエンシングは、一実施当たり約１百万リードを生成し、リードは約７００ｂｐの平均長を有する。リード数（一実施当たりのリードの数）及びリード長（一リード当たりの塩基の数）は、一シークエンシング実施当たりで変動させることができ、一実施当たりのリード長並びにリード数は、異なるハイスループットシークエンシング法がさらに開発された後に、増加することが予想される。

過剰に存在する核酸不純物の同定
本発明の実施形態において、上に記載されている通り得たランダムリードは、組成物を生産するためのプロセスに使用される生物学的成分のヌクレオチド配列と比較され、ここで、ランダムリードと上記生物学的成分からのヌクレオチド配列の比較は、過剰に存在する核酸不純物の同定をもたらす。生物学的成分のこのヌクレオチド配列は、疑われる又は疑われていない供給源のヌクレオチド配列であってもよい。

ヌクレオチド配列の疑われる供給源は、宿主細胞、プラスミド、ベクター及びヘルパーウイルスのヌクレオチド配列からなる群から選択され得る。ヘルパーウイルスはアデノウイルス及び／又は単純ヘルペスウイルスである及び／又はベクターはバキュロウイルスベクターであることが好ましい。好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列の疑われる供給源は、バキュロウイルスベクターである。本発明による方法において、ランダムリードは、このようにヌクレオチド配列の疑われる供給源に対して整列され又は比較され、過剰に存在する核酸不純物の同定が導かれる。

以前の実施形態の代わりに又は以前の実施形態と組み合わせて、ヌクレオチド配列の供給源は、ヌクレオチド配列の疑われていない供給源であり、すなわち、ヌクレオチド配列の供給源は、あらかじめ定められない。ヌクレオチド配列の疑われていない供給源は、本発明の方法により得られたランダムリードをデノボアセンブリ（ｄｅｎｏｖｏａｓｓｅｍｂｌｙ）させ、これらのアセンブリされたヌクレオチド配列とヌクレオチド配列データベースとを比較することによって取得することができる。このようなヌクレオチド配列データベースは、非公開又は公衆に利用可能なヌクレオチド配列データベースであってもよい。公衆に利用可能なヌクレオチド配列データベースの例は、ＵＣＳＣＧｅｎｏｍｅＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪ、ＥＮＡなどを含むが、これらに限定されるものではない。アセンブリさせた配列と非公開又は公衆に利用可能なデータベースおける配列とを比較することにより、核酸不純物の同定を導くことができるであろう。

本発明の好ましい方法において、組成物を生産するためのプロセスに使用される生物学的成分のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の疑われる供給源である。特に、好ましい実施形態において、生物学的成分のヌクレオチド配列は、宿主細胞、プラスミド、組換えパルボウイルスベクター以外のベクター及びヘルパーウイルスのヌクレオチド配列からなる群から選択される。特に、生物学的成分のヌクレオチド配列は、パルボウイルスベクターのヌクレオチド配列を含まない。

本発明による宿主細胞は、組成物を生産するためのプロセスに使用される任意の細胞であり得る。宿主細胞は、植物細胞、細菌細胞、酵母細胞及び動物細胞からなる群から選択され得る。宿主細胞は動物細胞であることが好ましい及び宿主細胞は哺乳動物宿主細胞又は昆虫宿主細胞であることがより好ましい。本発明の最も好ましい実施形態において、宿主細胞は、昆虫宿主細胞である。組成物を生産するためのプロセスに使用される宿主細胞のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ及び／又はミトコンドリアＤＮＡを含む。宿主細胞のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡを含むことが好ましい。ゲノムＤＮＡは、導入遺伝子、Ｒｅｐをコードする遺伝子、Ｃａｐをコードする遺伝子及び組成物を生産するためのヘルパー機能を有するタンパク質又はＲＮＡをコードする遺伝子からなる遺伝子の群から選択される遺伝子を含み得る。組成物を生産するためのヘルパー機能を有するタンパク質又はＲＮＡをコードする遺伝子は、動物ウイルス、例えば、アデノウイルス及び／又は単純ヘルペスウイルス又は昆虫ウイルス、例えば、バキュロウイルスに由来してもよい。代わりに又は組み合わせて、ゲノムＤＮＡは、ＩＴＲ配列を含んでいてもよい。好ましい実施形態において、宿主細胞のゲノムＤＮＡは少なくとも１つのＩＴＲと隣接する導入遺伝子を含み、導入遺伝子は各側においてＩＴＲと隣接することが好ましい。

本発明によるプラスミドは、組成物を生産するためのプロセスに使用される任意のプラスミドであり得る。プラスミドは、耐性遺伝子、導入遺伝子、Ｒｅｐをコードする遺伝子、Ｃａｐをコードする遺伝子及び組成物を生産するためのヘルパー機能を有するタンパク質又はＲＮＡをコードする遺伝子からなる遺伝子の群から選択される遺伝子を含むことが好ましい。代わりに又は組み合わせて、プラスミドは、ＩＴＲ配列を含んでいてもよい。好ましい実施形態において、プラスミドは少なくとも１つのＩＴＲと隣接する導入遺伝子を含み、導入遺伝子は各側においてＩＴＲと隣接することが好ましい。

本発明によるベクターは、組成物を生産するためのプロセスに使用される任意のベクターであり得る。ベクターは、プラスミド、ウイルス性ベクター、コスミド及び人工染色体からなる群から選択されてもよい。本発明の好ましい実施形態において、ベクターは、ウイルス性ベクターである。最も好ましい実施形態において、ベクターは、バキュロウイルスベクターである。組成物を生産するためのプロセスに使用されるバキュロウイルスベクターは、導入遺伝子、Ｒｅｐをコードする遺伝子、Ｃａｐをコードする遺伝子及び組成物を生産するためのヘルパー機能を有するタンパク質をコードする遺伝子からなる遺伝子の群から選択される遺伝子を含み得る。代わりに又は組み合わせて、バキュロウイルスベクターは、ＩＴＲ配列を含んでいてもよい。好ましい実施形態において、バキュロウイルスベクターは少なくとも１つのＩＴＲと隣接する導入遺伝子を含み、導入遺伝子は各側においてＩＴＲと隣接することが好ましい。

本発明によるヘルパーウイルスは、組成物を生産するためのプロセスに使用される任意のウイルスであり得る。好ましい実施形態において、ヘルパーウイルスは、パルボウイルスビリオンを生産するプロセスに使用される。さらに好ましい実施形態において、ヘルパーウイルスは、組換えアデノ関連ビリオン（ｒＡＡＶ）を生産するプロセスに使用される。より好ましい実施形態において、ヘルパーウイルスは、アデノウイルス及び／又は単純ヘルペスウイルスである。最も好ましい実施形態において、ヘルパーウイルスは、組換えアデノウイルス及び／又は組換え単純ヘルペスウイルスである。さらなる実施形態において、ヘルパーウイルスは、導入遺伝子、Ｒｅｐをコードする遺伝子、Ｃａｐをコードする遺伝子及び組成物を生産するためのヘルパー機能を有するタンパク質をコードする遺伝子からなる遺伝子の群から選択される遺伝子を含む。代わりに又は組み合わせて、ヘルパーウイルスは、ＩＴＲ配列を含んでいてもよい。好ましい実施形態において、ヘルパーウイルスは少なくとも１つのＩＴＲと隣接する導入遺伝子を含み、導入遺伝子は各側においてＩＴＲと隣接することが好ましい。

好ましい実施形態において、組成物を生産するプロセスに使用される生物学的成分のヌクレオチド配列は、バキュロウイルスベクターからのものである。最も好ましい実施形態において、生物学的成分からのヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＩＴＲと隣接する導入遺伝子を含むバキュロウイルスベクターからのものであり、導入遺伝子は２つのＩＴＲと隣接することが好ましい。

上のものと組み合わせて又はその代わりに、生物学的成分のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ、Ｃａｐ及び／又は導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、生物学的成分は、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましく、生物学的成分は、少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲと隣接する導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むことがより好ましく、生物学的成分は、各側において少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲと隣接する導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むことが最も好ましい。

核酸シークエンシングを用いる過剰に存在する核酸不純物の定量
本発明は、組成物中の過剰に存在する核酸不純物を同定する及び定量する方法を開示し、上記方法は、組成物を核酸シークエンシングに供してヌクレオチド配列のランダムリードを得るステップを含む。核酸不純物は、上に示される通り同定され得る。同定された核酸不純物は、その後、組成物中の過剰に存在する核酸不純物の核酸当たりのリードの数を決定するステップによって定量され得る。

核酸当たりのリードの数は、特定の核酸のヌクレオチド配列に対して整列させるリードの数と本明細書で定義される。したがって、組成物中の核酸不純物の核酸当たりのリードの数は、核酸不純物の核酸に対して特異的に整列させるリードの数と理解される。

ヌクレオチド配列の特定の核酸に対して整列されるリードの数は頻度に換算され、この特定の核酸は組成物中に存在する。したがって、特定の核酸に対して整列される多数のリードは、組成物中に大量にある核酸と理解される。代わりに、特定の核酸に対して整列されるごく少数のリードがある場合、核酸の存在は組成物中に乏しいことが理解される。

本発明の方法によると、リードの分布がランダムではなく、過剰に存在する不純物が生物学的成分のリードの平均数の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又は５０倍を含む場合に、又は核酸不純物の核酸当たりのリードの数が、パルボウイルスベクターの核酸当たりのリードの平均数の少なくとも０．０００５、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０又は１０％である場合に、核酸不純物は過剰に存在する。

パルボウイルスベクター当たりのリードの平均数は、パルボウイルスベクターに対して整列されるリードの総数をパルボウイルスベクターのヌクレオチドの総数で割ったものと本明細書で定義される。パルボウイルスベクターの２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００又は５００最も上流のヌクレオチドのリード及びヌクレオチド及び／又はパルボウイルスベクターの２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００又は５００最も下流のヌクレオチドのリード及びヌクレオチドは、パルボウイルスベクター当たりのリードの平均数を決定する場合は考慮されないことが好ましい。これらのリードは、パルボウイルスベクターの最も上流及び／又は最も下流のヌクレオチド（すなわち、ベクターの端）に対して整列させるリードの数における人為的な減少が存在するので、パルボウイルスベクター当たりのリードの平均数に関する代表的なものではないであろう。

生物学的成分のリードの平均数は、生物学的成分に対して整列されるリードの総数を生物学的成分のヌクレオチドの総数で割ったものと本明細書で定義される。生物学的成分は、組成物を生産するためのプロセスに使用される１つの生物学的成分を含んでいてもよい。生物学的成分は、宿主細胞、プラスミド、組換えパルボウイルスベクター以外のベクター及びヘルパーウイルスのヌクレオチド配列からなる群から選択されることがより好ましく、ここで、上記ベクターは、バキュロウイルスベクターであることが好ましい。生物学的成分は、バキュロウイルスベクターであることが最も好ましい。

本発明の一実施形態において、パルボウイルスベクターのヌクレオチドの数は、例えば、ＩＴＲ配列、プロモーター配列、導入遺伝子配列、並びに左ＩＴＲと右ＩＴＲの間の任意の他の配列を含む、パルボウイルスベクターの完全なヌクレオチド配列を含んでいてもよい。より好ましい実施形態において、パルボウイルスベクターのヌクレオチド配列の一部が選択されて、パルボウイルスベクターのリードの平均数が決定される。このようなパルボウイルスベクターの一部は、ＩＴＲヌクレオチド配列、プロモーター配列及び／又は導入遺伝子配列を含んでいてもよい。最も好ましい実施形態において、導入遺伝子の配列が選択されて、パルボウイルスベクターの核酸当たりのリードの平均数が決定される、すなわち、導入遺伝子に対して整列されるリードの数を導入遺伝子のヌクレオチド配列のヌクレオチドの数で割る。

本発明の別の実施形態において、過剰に存在する核酸不純物は、第２又はさらなる組成物において定量される。第１の組成物中の過剰に存在する核酸不純物の同定及び定量の後、過剰に存在する核酸不純物は、その後、さらなる組成物において定量されてもよい。第２又はさらなる組成物中の過剰に存在する核酸不純物の定量は、上に概説される通り決定されてもよい。代わりに、第２又はさらなる組成物中の過剰に存在する核酸不純物の定量は、核酸不純物の量を決定するため適切な任意の他の方法によって決定され得る。特定のＤＮＡ断片を定量する方法は、当技術分野において周知されており、第２又はさらなる組成物中の過剰に存在する核酸不純物を定量するため等しく適用される。これらの方法は、ハイスループットシークエンシング、Ｑ−ＰＣＲ、限定サイクルＰＣＲ（ｌｉｍｉｔｅｄ−ｃｙｃｌｅＰＣＲ）、ハイブリダイゼーションアッセイ、マイクロアレイ及びアガロース電気泳動法を含むが、これらに限定されない。

パルボウイルスビリオン
本発明の好ましい実施形態において、組成物は、パルボウイルスベクターを含む。特に、本発明による好ましい方法において、パルボウイルスベクターは、組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。パルボウイルス科のウイルスはスモールＤＮＡ動物ウイルスである。パルボウイルス科は、２つの亜科：脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）、及び昆虫に感染するデンソウイルス亜科（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ）に分けることができる。パルボウイルス亜科のメンバーは、本明細書ではパルボウイルスと称され、ディペンドウイルス属を含む。それらの属の名称から推定することができる通り、ディペンドウイルスのメンバーは、通常、細胞培養物において増殖性感染するためにはアデノウイルス又はヘルペスウイルス等のヘルパーウイルスとの同時感染を必要とするという点で独特である。ディペンドウイルス属には、通常ヒトに感染するＡＡＶ（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類に感染するＡＡＶ（例えば、血清型１及び４）、及び他の温血動物に感染する関連ウイルス（例えば、ウシアデノ随伴ウイルス、イヌアデノ随伴ウイルス、ウマアデノ随伴ウイルス、及びヒツジアデノ随伴ウイルス）が含まれる。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のメンバーに関するさらなる情報は、ＫｅｎｎｅｔｈＩ．Ｂｅｒｎｓ、”Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：ＴｈｅＶｉｒｕｓｅｓａｎｄＴｈｅｉｒＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，” Ｃｈａｐｔｅｒ６９ｉｎＦｉｅｌｄｓＶｉｒｏｌｏｇｙ（３ｄＥｄ．１９９６）に記載されている。

全ての公知のＡＡＶ血清型のゲノム組織化は、非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）の長さ未満である、直鎖状、一本鎖ＤＮＡ分子である。末端逆位反復配列（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質についての独特なヌクレオチドコード配列に隣接する。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、−２及び−３）は、カプシドを形成する。末端の１４５ｎｔは、自己相補的であり、Ｔ状ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二重鎖を形成できるように組織化される。これらのヘアピン構造は、ウイルス性ＤＮＡ複製についての起点として機能し、細胞のＤＮＡポリメラーゼ複合体についてのプライマーとして役立つ。哺乳動物細胞における野生型（ｗｔ）ＡＡＶ感染後に、Ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）は、それぞれＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現され、双方のＲｅｐタンパク質は、ウイルス性ゲノムの複製において機能を有している。ＲｅｐＯＲＦにおけるスプライシングイベントにより、実際に４つのＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）の発現がもたらされる。しかし、哺乳動物細胞においてＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする未スプライスのｍＲＮＡが、ＡＡＶベクター生産について十分であることが示されている。また、昆虫細胞においてＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質は、ＡＡＶベクター生産について十分である。

本明細書で「パルボウイルス又はＡＡＶベクター」（又は「ｒＡＡＶベクター」）は、少なくとも１つのパルボウイルス又はＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）と隣接する対象の１つ又は複数のポリヌクレオチド配列（例えば、対象の生産物をコードする遺伝子、すなわち「導入遺伝子」のための発現構築物）を含む核酸分子を指す。このようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子産物及びｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶのＲｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞に存在する場合、複製され、感染性ビリオンにパッケージングされ得る。パルボウイルス又はＡＡＶベクターは、組換え核酸分子、すなわち、天然に生じない且つこの組合せ及び／又は順序で天然では生じない配列エレメントを組み合わせることによって構成される核酸分子であることが好ましい。

ｒＡＡＶベクターをより大きな核酸構築物（例えば、染色体、又は、クローニング若しくはトランスフェクションのために使用されるプラスミド若しくはバキュロウイルス等の別のベクター）に組み込む場合には、ｒＡＡＶベクターは、一般には、「プロベクター（ｐｒｏ−ｖｅｃｔｏｒ）」と称され、ＡＡＶパッケージング機能及び必要なヘルパー機能の存在下での複製及びカプシド形成によって「レスキュー」することができる。

対象の遺伝子産物は、いずれかの側においてＡＡＶＩＴＲと隣接することが好ましい。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及び／又はＡＡＶｒｈ１０からのＩＴＲを含む、任意のＡＡＶＩＴＲが本発明の方法に使用されてもよい。ＡＡＶ２のＩＴＲが最も好ましい。本発明の好ましい核酸構築物における使用のための好ましいＩＴＲ配列の例は、配列番号１（左又は上流のＩＴＲ）及び配列番号２（右又は下流のＩＴＲ）において示されている。

ＡＡＶは、いくつかの哺乳動物細胞に感染できる。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．５：３２５１−３２６０）及びＧｒｉｍｍら（１９９９、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１０：２４４５−２４５０）を参照されたい。しかし、ヒト滑膜の線維芽細胞のＡＡＶ導入は、類似するマウス細胞におけるよりも有意により効率的であり（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｅｓ、３：１（２００１））、ＡＡＶの細胞向性は血清型の中で異なっている。例えば、ＡＡＶ向性の改変に対するアプローチについて論じているＧｏｎｃａｌｖｅｓ、２００５、ＶｉｒｏｌＪ．２（１）：４３を参照されたい。

本発明の方法に使用するためのｒＡＡＶベクターは、哺乳動物細胞又は昆虫細胞のいずれかにおいて生産され得る。両方の方法は、当技術分野に記載される。例えば、Ｇｒｉｍｍら（２００３ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ７（６）：８３９−８５０）は、ヘルパーウイルスフリー且つ光学的に制御可能な様式でＡＡＶベクターを生産する戦略を開示しており、これは僅か２種のプラスミドの２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションに基づいている。その著者らは、ＡＡＶ２Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ＩＴＲ及びＡＡＶ５カプシドタンパク質を含むハイブリッドＡＡＶベクターの生産の方法を開示している。この引例は、その全体が本明細書に含まれる。さらなる情報は、Ｂｌｉｔｓら（２０１０）（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄｓ１８５（２）：２５７−２６３）において見出すことができる。

「ハイブリッド」及び「シュードタイピングされた」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｒｅｐタンパク質、ＩＴＲ及び／又はカプシドタンパク質が異なる血清型のものであるベクターを示すために使用される。例えば、ＩＴＲ及びＲｅｐタンパク質はＡＡＶ２のものであり、カプシドタンパク質はＡＡＶ５のものである。「キメラ」という用語は、本明細書では、単一の遺伝子、例えば、カプシドが、異なる血清型に由来する少なくとも２つの配列から構成されることを記載するために使用される。

ＡＡＶ生産法
本発明による組成物におけるｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶについての古典的な生産法を用いて生産され得る。このような古典的な生産法は、標的／プロデューサー細胞の一過性トランスフェクションプロトコールに基づいている（Ｍｅｒｔｅｎら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ、２００６，１２：Ｓ５１−Ｓ６１）。これは、トランス相補性及び一過性トランスフェクションベースのアプローチであり、以下の遺伝子エレメントを必要としている：（ｉ）ｒＡＡＶゲノムの配列。ｒＡＡＶゲノムの配列は、プラスミド（いわゆるウイルス性ベクタープラスミド）にクローン化することができる。通常、このウイルス性ベクタープラスミドは、少なくとも１つのＩＴＲ及び導入遺伝子の発現のための発現カセットを含む；（ｉｉ）ｒｅｐ及びｃａｐをコードする配列、並びに（ｉｉｉ）天然の補助的なウイルス、例えば、アデノウイルス及び／又は単純ヘルペスウイルスによってコードされる、必要とされるヘルパー機能。

例えば、ｒＡＡＶは、以下の方法による哺乳動物細胞において生産することができるが、これに限定されない：ベクターゲノムは、ＡＡＶ血清型２に由来する２つの末端逆位反復（ＩＴＲ）と隣接する、導入遺伝子発現カセットを含有する。ウイルス性ベクターゲノムの全体の長さは、効率的なパッケージング効率を維持するために、４．７ｋＢの野生型ゲノムサイズを超えないことがある。単一カプシドは、１：１：１０の比で、ＶＰ１（６２ｋＤａ）、ＶＰ２（７３ｋＤａ）、又はＶＰ３（８７ｋＤａ）のいずれかの６０ウイルス性タンパク質から構成される。ＡＡＶベクターの製造プロセスは、ローラーボトル（８５０ｃｍ^２表面領域）中での２種のプラスミドをヒト胚性腎臓産生細胞（ＨＥＫ２９３）にＣａ（ＰＯ４）２トランスフェクションし、次にカプシド形成したベクターゲノムを濾過及びクロマトグラフィー技術によって精製することに基づく。第１のプラスミドは、ウイルス性ベクタープラスミドであり、ＡＡＶ２ＩＴＲと隣接する発現構築物を含有する。第２のプラスミドは、パッケージングプラスミドであり、所望の血清型のＡＡＶｒｅｐタイプ２及びｃａｐタイプ５遺伝子並びにアデノウイルス早期ヘルパー遺伝子Ｅ２Ａ、ＶＡ、Ｅ４（配列番号３に開示されるｐＤＰ５；ヌクレオチド配列）をコードする。産生細胞株のゲノムは、ヘルパー機能を提供するためにアデノウイルスＥ１を含む。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＩｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）における２つのプラスミドでの同時トランスフェクション後に、細胞は、三日間、無血清改変ダルベッコイーグル培地（ＤＭＥＭ）においてインキュベートされてベクター産生を生じさせる。ローラーボトル中でのベクター産生は、平均して、一細胞当たり３ｘ１０^３ベクターゲノム又は１つのローラーボトル当たり４ｘ１０^１１ベクターゲノムの収量をもたらす（ｑＰＣＲによって定量される）。その後、細胞培養物は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含有する緩衝液によって溶解され、細胞片は、低速度遠心分離によって除去される。清澄化したバルクは、ＡＶＢセファロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製され、４００ｋＤａ中空繊維モジュール（例えば、ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いる濃縮及びダイアフィルトレーションによってＰＢＳ／５％スクロース中に調製される。

代わりに、本発明による組成物中のｒＡＡＶは、主にトランスフェクション非依存性の方法において生産され得る。このような方法は、誘導後にｒＡＡＶを生産する、パッケージング／プロデューサー細胞株の使用又はバキュロウイルス／昆虫細胞系の使用のいずれかに基づいている可能性がある。

パッケージング細胞は、全ての必要なＡＡＶ遺伝子エレメント、例えば、ＡＡＶヘルパー配列ｒｅｐ及びｃａｐの一部を保持することができる。パッケージング細胞株からのｒＡＡＶ生産の続いての誘導は、ｒＡＡＶ配列を含有するプラスミド（ウイルス性ベクタープラスミド）のトランスフェクション、次に（複製欠損）アデノウイルス又は単純ヘルペスウイルスでの感染などの、必要とされるヘルパー機能をコードする配列の導入によって行い得る。プロデューサー細胞株は、完全なトランス相補性システムであってもよく、これはＡＡＶヘルパー配列（ｒｅｐ−ｃａｐ）と一緒にウイルス性ベクター配列を有する、それらのゲノムに組み込まれた全ての必要なＡＡＶ由来成分を保持する。ｒＡＡＶ生産の誘導は、必要とされるヘルパー機能をコードする配列の導入の後に生じさせることができる。

他方、少なくとも１つのＩＴＲ及び導入遺伝子の発現のための発現カセットを含む、ｒＡＡＶゲノムの配列は、アデノウイルス又は単純ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスのゲノムに埋め込まれ得、それぞれ、ｒＡＡＶ／Ａｄハイブリッド系（Ｔｈｏｒｎｅら、２００９；Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０；７０７−７１４）又はｒＡＡＶ／ＨＳＶハイブリッド系（Ｃｌｅｍｅｎｔら、２００９；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔｈｅｒ．２０；７９６−８０６．；Ｙｅら、２０１４；Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１５；１−６）を生成する。

代わりに、本発明の方法に使用するためのＡＡＶベクターは、Ｕｒａｂｅら（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ２００６８０（４）：１８７４−１８８５）によって以前に記載されている通り昆虫細胞において生産され得る。この系において、ｒＡＡＶゲノムの配列は、組換えバキュロウイルスにクローン化してもよい。

パルボウイルスベクターを含む組成物中のＤＮＡ不純物は、組成物を生産するためのプロセスに使用される任意の生物学的成分に由来し得る。組成物は、上に概説される通り任意の方法に従って生産され得る。

本発明による方法において、生物学的成分のヌクレオチド配列は、宿主細胞、プラスミド、ベクター及びヘルパーウイルスのヌクレオチド配列からなる群から選択されることが好ましい。好ましい実施形態において、生物学的成分は、以下のうちの少なくとも１つの遺伝子エレメントを含む：（ｉ）少なくとも１つのＩＴＲ及び導入遺伝子の発現のための発現カセットを含むことが好ましい、ｒＡＡＶゲノムの配列；（ｉｉ）ｒｅｐ及び／又はｃａｐをコードする配列、及び／又は（ｉｉｉ）補助的なウイルス、例えば、アデノウイルス及び／又は単純ヘルペスウイルスによって天然でコードされる、必要とされるヘルパー機能をコードする配列。生物学的成分は、少なくとも１つのＩＴＲ及び導入遺伝子の発現のための発現カセットを含むことがより好ましい。

本発明による好ましい方法において、ベクターは、バキュロウイルスベクターである。バキュロウイルス科は、大きいエンベロープを有するＤＮＡウイルスのファミリーである。バキュロウイルスは、鱗翅目の目に入る大多数の許容的な種を有する節足動物に優先的に感染する。インビトロでのバキュロウイルス繁殖を可能にする、幾つかの連続的な細胞株、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１又はＨｉｇｈＦｉｖｅは、商業的に利用可能であり、本発明による組成物の生産のために使用することができる。

アウトグラファ・カリフォルニカマルチ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に由来する組換えバキュロウイルスは、特に、組換えタンパク質の又はウイルス様粒子（ウイルス性核酸を欠くＶＬＰｉｅシェル）の生産のため、バイオテクノロジーにおいて最も一般に使用される。

バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）に基づく生産の主な利点は、以下の通りまとめることができる：（ｉ）遺伝子サイズの制限なしで大量の異種性タンパク質の生産を可能にする非常に強いプロモーター（ポリヘドリン又はｐ１０）の存在；（ｉｉ）昆虫細胞は、主要な翻訳後修飾を実施し、それにより生物学的に活性なタンパク質の生産を可能にする、能力を持つ；並びに（ｉｉｉ）バキュロウイルス技術は容易に実行することができ、スケールアップが容易に達成可能であり、細胞は懸濁下で増殖し、様々な無血清培地は商業的に利用可能である。

ウイルス性粒子をアセンブリさせることは、単一タンパク質を発現させることよりも複雑なプロセスである。しかし、ＨＢＶに基づくＶＬＰ、Ｂ１９パルボウイルス、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルスが、ＢＥＶＳで首尾よく生産することができることが示されている。さらに、バキュロウイルス発現ベクター系は、ｒＡＡＶの生産に使用することができる（Ｍｅｒｔｅｎら、ｓｕｐｒａ、Ｕｒａｂｅら、２００２）。

したがって、本発明の方法において、パルボウイルスビリオンは、哺乳動物細胞における又は昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現ベクター系を用いて生産され得る。パルボウイルスビリオンは、昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現ベクター系を用いて生産されることが好ましい。

本発明の好ましい実施形態において、バキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ、Ｃａｐ及び／又は導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、バキュロウイルスベクターは、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましく、バキュロウイルスベクターは、少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲと隣接する導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むことがより好ましく、バキュロウイルスベクターは、各側において少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲと隣接する導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むことが最も好ましい。

また、以前に開示されているＲｅｐ並びにＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３配列における改変は、本発明において用いることができ、例えば、国際公開第２００７／０４６７０３号、国際公開第２００７／１４８９７１号、国際公開第２００９／０１４４４５号、国際公開第２００９／１０４９６４号及び／又は国際公開第２０１１／１１２０８９号に開示されている。

ｒＡＡＶベクターの生産のための、本発明の方法に使用されてもよいＡＡＶＩＴＲ及びＲｅｐ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来し得る。一般に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで有意に相同性のゲノム配列を有する。これにより、同一セットの遺伝的な機能が提供されて、本質的に物理的及び機能的な均等物であるビリオンが生産される。様々なＡＡＶ血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の概要については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９７、Ｊ．Ｖｉｒ．７１：６８２３−３３）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８３、Ｊ．Ｖｉｒ．４５：５５５−６４）；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９、Ｊ．Ｖｉｒ．７３：１３０９−１３１９）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅら（１９９８、Ｊ．Ｖｉｒ．７２：３０９−３１９）；並びにＷｕら（２０００、Ｊ．Ｖｉｒ．７４：８６３５−４７）を参照されたい。ｒＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２は、本発明の文脈における使用のためのＡＡＶヌクレオチド配列の供給源として使用することができる。ｒＡＡＶ血清型１、２、３、４及び５は、ＡＡＶヌクレオチド配列の好ましい供給源である。本発明の文脈におけるＡＡＶＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ５に由来することが好ましい。本発明の方法におけるＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ＩＴＲであることがより好ましい。同様に、Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８／６８及びＲｅｐ５２／４０）コード配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ５に由来することが好ましく、ＡＡＶ２に由来することがより好ましい。

ＡＡＶＲｅｐ及びＩＴＲ配列は、大部分の血清型の中で特に保存されている。様々なＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は、例えば、８９％超同一であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、及びＡＡＶ６の間のゲノムレベルでの全体のヌクレオチド配列同一性は、約８２％である（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３（２）：９３９−９４７）。さらに、多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列及びＩＴＲは、哺乳動物細胞におけるＡＡＶ粒子の生産において他の血清型からの対応配列を、効率的に交差相補する（すなわち、機能的に置換える）ことが知られている。ＡＡＶＲｅｐ及びＩＴＲ配列はまた、昆虫細胞における他のＡＡＶＲｅｐ及びＩＴＲ配列を効率的に交差相補することを米国特許出願公開第２００３１４８５０６号は報告している。

ＡＡＶＶＰタンパク質は、ＡＡＶビリオンの細胞向性を決定することが知られている。ＶＰタンパク質コード配列は、Ｒｅｐタンパク質及び異なるＡＡＶ血清型の中の遺伝子よりも有意に低度に保存されている。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＶＰ１タンパク質を含む。他の血清型の対応する配列を交差相補するＲｅｐ及びＩＴＲ配列の能力により、１つの血清型（例えば、ＡＡＶ５）のカプシドタンパク質並びに別のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）のＲｅｐ及び／又はＩＴＲ配列を含むシュードタイピングされたｒＡＡＶ粒子の生産が可能になる。このようなシュードタイピングされたｒＡＡＶ粒子は、本発明の方法の一部である。本明細書では、シュードタイピングされたｒＡＡＶ粒子は、タイプ「ｘ／ｙ」（ここで、「ｘ」は、ＩＴＲの供給源を示す及び「ｙ」は、カプシドの血清型を示す）であると称されてもよい、例えば、２／５ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２からのＩＴＲ及びＡＡＶ５からのカプシドを有する。

改変された「ＡＡＶ」配列はまた、例えば、昆虫細胞におけるｒＡＡＶベクターの生産のため、本発明の文脈において使用することができる。このような改変された配列は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９ＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％以上のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列同一性を有する配列（例えば、約７５％〜約９９％ヌクレオチド配列同一性を有する配列）を含み、野生型ＡＡＶＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰ配列の代わりに使用することができる。

ＩＴＲ、Ｒｅｐ及びＣａｐ配列を所望される通り改変して、昆虫細胞などの細胞においてｒＡＡＶ又はシュードタイピングされたｒＡＡＶベクターの効率的な生産を得ることができる。例えば、（昆虫）細胞におけるｒＡＡＶベクターの生産を改善するために、例えば、国際公開第２００７／０４６７０３号、国際公開第２００７／１４８９７１号及び／又は国際公開第２００９／０１４４４５号に開示されている通り、Ｒｅｐ配列の開始コドンを改変することができる、ＶＰスプライス部位を改変又は排除することができる、及び／又はＶＰ１開始コドンを改変することができる。例えば、ＡＡＶ５のＶＰ１が、ＡＡＶ２に由来するＶＰ１によって部分的に又は完全に置き換えられ、ＶＰ２及び３がＡＡＶ５に由来する、キメラＡＡＶカプシドも本発明に含まれる（Ｕｒａｂｅら２００６；国際公開第２０００／０２８００４号）。好ましいアデノウイルスベクターは、Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０００、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２５７３−２６０４）によって総説が記述されている通り、又は米国特許出願公開第２００８０００８６９０号に並びにＺａｌｄｕｍｂｉｄｅ及びＨｏｅｂｅｎ（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２００８：２３９−２４６）によって記載される通り、宿主応答を減少させるために、改変される。

本発明による遺伝子治療ベクター内に含まれるＡＡＶＲｅｐタンパク質は、ＡＡＶ血清型２Ｒｅｐタンパク質であることが好ましい。配列番号４の核酸配列及び／又は配列番号５によるアミノ酸配列を有するＲｅｐ７８タンパク質が本発明において用いられること並びに配列番号６の核酸配列を有するＲｅｐ５２タンパク質が本発明において用いられることがさらにより好ましい。

過剰に存在する核酸不純物の定量
代わりに又は上に定義されている通り任意の実施形態と組み合わせて、本発明は、過剰に存在する核酸不純物の定量にさらに関する。特に、本発明は、特定のＤＮＡ不純物が、パルボウイルスベクターを含む組成物中に過剰に存在するとの発見に関する。これらのＤＮＡ不純物は、パルボウイルスビリオンの生産プロセスの間にパルボウイルスヌクレオチド配列のＩＴＲにすぐに隣接するヌクレオチド配列を含む。したがって、例えば、パルボウイルスの左ＩＴＲの配列上流及び／又はパルボウイルスの右ＩＴＲの配列下流は、パルボウイルスビリオンにおいて過剰に存在する。

したがって、別の態様において、発明は、パルボウイルスベクターを含む組成物中の核酸不純物を定量する方法に関し、上記方法は、核酸不純物の相対存在量を決定するステップを含み、ここで、パルボウイルスＩＴＲ配列が、上記組成物を生産するプロセスに使用される生物学的成分に存在する場合、核酸不純物は、パルボウイルスＩＴＲ配列の１〜８０００ｂｐ、１〜５０００ｂｐ、１〜３０００ｂｐ、１〜１０００ｂｐ、１〜５００ｂｐ、１〜２５０ｂｐ又は１〜１００ｂｐすぐ近傍に位置するヌクレオチド配列を含み、ここで、上記生物学的成分は、少なくとも１つのコピーのパルボウイルスＩＴＲ配列と隣接する導入遺伝子を含む。別の実施形態において、発明は、パルボウイルスベクターを含む組成物中の核酸不純物を定量する方法に関し、上記方法は、核酸不純物の相対存在量を決定するステップからなり、ここで、パルボウイルスＩＴＲ配列が、上記組成物を生産するプロセスに使用される生物学的成分に存在する場合、核酸不純物は、パルボウイルスＩＴＲ配列の１〜８０００ｂｐ、１〜５０００ｂｐ、１〜３０００ｂｐ、１〜１０００ｂｐ、１〜５００ｂｐ、１〜２５０ｂｐ又は１〜１００ｂｐすぐ近傍に位置するヌクレオチド配列を含み、ここで、上記生物学的成分は、少なくとも１つのコピーのパルボウイルスＩＴＲ配列と隣接する導入遺伝子を含む。

上に示される通り、パルボウイルスビリオンの生産プロセスの間に、パルボウイルス配列は、宿主細胞、プラスミド、ベクター及び／又はヘルパーウイルスに存在することができ、ここで、好ましいベクターは、バキュロウイルスベクターである。パルボウイルス配列は、少なくとも１つのコピーのＩＴＲ及び導入遺伝子の発現のための発現カセットを含んでいてもよい。過剰に存在するＤＮＡ不純物は、ゲノム配列、プラスミド配列、ベクター配列又はヘルパーウイルスの配列などの、パルボウイルスＩＴＲ（複数可）にすぐに隣接する、任意の配列を含んでいてもよい。したがって、ＤＮＡ不純物のタイプは、パルボウイルスビリオンの生産の間にＩＴＲと隣接する配列に依存的である。例えば、少なくとも１つのコピーのＩＴＲ及び好ましくは導入遺伝子を含む、パルボウイルス配列が、バキュロウイルスベクターに存在する場合、ＩＴＲ（複数可）にすぐに隣接するバキュロウイルス配列は、パルボウイルスベクターを含む組成物に過剰に存在する。

本発明の実施形態において、核酸不純物は、パルボウイルスベクターを含む組成物において定量される。核酸不純物を定量するための方法は、核酸を定量するために当技術分野において知られている任意の方法を含んでいてもよい。このような方法は、ハイスループットシークエンシング、Ｑ−ＰＣＲ、限定サイクルＰＣＲ（ｌｉｍｉｔｅｄ−ｃｙｃｌｅＰＣＲ）、ハイブリダイゼーションアッセイ、マイクロアレイ及びアガロース電気泳動法を含むが、これらに限定されない。

さらなる実施形態において、生物学的成分は、上に示される通り定義される。特に、生物学的成分は、宿主細胞、プラスミド、組換えパルボウイルスベクター以外のベクター及びヘルパーウイルスからなる群から選択される。生物学的成分はパルボウイルス配列を含むことが好ましく、ここで、パルボウイルス配列は少なくとも１つのＩＴＲ及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。生物学的成分は、各側において少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲと隣接する、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むことが最も好ましい。

最も好ましい実施形態において、生物学的成分はベクターであり、ここで、ベクターはバキュロウイルスベクターである。バキュロウイルスベクターは、パルボウイルス配列を含むことが好ましい。このパルボウイルス配列は、少なくとも１つのＩＴＲ及び導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。バキュロウイルスベクターは、各側において少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲと隣接する、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むことが最も好ましい。

本発明による方法において、核酸不純物は、組成物を生産するためのプロセスにおいて使用される生物学的成分中に存在する場合、パルボウイルスＩＴＲ配列の１〜１００００ｂｐ、１〜９０００ｂｐ、１〜８０００ｂｐ、１〜７０００ｂｐ、１〜６０００ｂｐ、１〜５０００ｂｐ、１〜４０００ｂｐ、１〜３０００ｂｐ、１〜２０００ｂｐ、１〜１０００ｂｐ、１〜８００ｂｐ、１〜６００ｂｐ、１〜５００ｂｐ、１〜４００ｂｐ、１〜２５０ｂｐ又は１〜１００ｂｐすぐ近傍に位置するヌクレオチド配列を含む。ＤＮＡ不純物の長さは、他のランダムにパッケージングされたＤＮＡ不純物の存在に及び／又は導入遺伝子のサイズに依存的であり得る、その理由は、パルボウイルスビリオンの最大のパッケージング能力が存在するからである。しかし、パルボウイルスビリオンが、自身のゲノムの長さがある、より長いＤＮＡ配列を組み込み得ることが知られている（Ｇｒｉｅｇｅｒら、ＪＶｉｒｏｌ．２００５７９（１５）：９９３３−４４）。

本発明の好ましい実施形態において、パルボウイルスベクターは、上に記載される通りの組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。さらに、ｒＡＡＶビリオンは、以前に記載されている通りの任意の生産方法を用いて生産され得る。

別の実施形態において、パルボウイルスＩＴＲ配列が、組成物を生産するプロセスに使用される生物学的成分に存在する場合、核酸不純物のヌクレオチド配列は、そのＩＴＲ配列の各側のすぐ近傍に位置する。生物学的成分に存在するパルボウイルス配列は、導入遺伝子の各側において少なくとも１つのＩＴＲと隣接する導入遺伝子を含んでいてもよい。このようなケースにおいて、核酸不純物は、ＩＴＲの１つの側、すなわち、左ＩＴＲ（複数可）のすぐ近傍のみ又は右ＩＴＲ（複数可）のすぐ近傍のみ、に存在するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。代わりに、核酸不純物のヌクレオチド配列は、ＩＴＲの両側に存在するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。

本発明の実施形態において、核酸不純物は、パルボウイルスＩＴＲ配列が、組成物を生産するプロセスに使用される生物学的成分に存在する場合、そのＩＴＲ配列のすぐ近傍に位置するヌクレオチド配列を含む。「すぐ近傍」は、本明細書で以下の通り定義される：導入遺伝子のＩＴＲ上流のケースにおいて、「すぐ近傍」は、ＩＴＲの少なくとも０、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、又は５０ｂｐ上流で終わる任意のヌクレオチド配列を意味する。ＩＴＲが導入遺伝子の下流に位置するケースにおいて、「すぐ近傍」は、ＩＴＲの少なくとも０、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、又は５０ｂｐ下流で始まる任意のヌクレオチド配列を意味する。

相対存在量
本発明の実施形態において、方法は、核酸不純物の相対存在量を決定するステップを含む。相対存在量は、同じ又は別の組成物における、第１の核酸分子の（一部の）存在と比較した第２の核酸分子の（一部の）存在と本明細書で定義される。相対存在量が２つ以上の組成物の間で決定されるケースにおいて、第２の核酸分子は、第１の核酸分子と同じ又は別のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。相対存在量が１つの組成物において決定されるケースにおいて、第１及び第２の核酸分子は、少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列を含む。

本発明の方法において、核酸不純物と第２の核酸分子の間の相対存在量は同じ組成物において決定されることが好ましいが、核酸不純物の相対存在量が異なる組成物の間で決定されることも本発明の実施形態である。本発明の好ましい方法において、相対存在量は、パルボウイルスベクターのヌクレオチド配列及び／又は組成物における参照配列と比較して決定される。導入遺伝子及び／又は参照配列は、核酸不純物と同じ組成物に存在することが好ましい。

パルボウイルスベクターのヌクレオチド配列は、完全なパルボウイルスベクター、又は導入遺伝子のヌクレオチド配列（の一部）、プロモーター又はＩＴＲ（複数可）などの、パルボウイルスベクターの任意の配列を含んでいてもよい。しかし、パルボウイルスベクターの任意の他のヌクレオチド配列は、本発明の方法において使用するため等しく適切であり得る。

参照配列は、任意の適切なヌクレオチド配列（の一部）であり得る。参照配列は、ハウスキーピング遺伝子の配列（の一部）、生物学的成分のヌクレオチド配列であること及び／又は参照配列は、組成物にスパイク添加するために使用される核酸の配列であることが好ましい。

参照配列が生物学的成分の配列であるケースにおいて、配列は、パルボウイルスＩＴＲとすぐに隣接しなく、参照配列は、宿主細胞、プラスミド又は組成物を生産するためのプロセスに使用されるベクターに由来することが好ましい。参照配列は、導入遺伝子及び少なくとも１つのＩＴＲを含む同じ生物学的成分に由来することが好ましい。参照配列は、組成物を生産するためのプロセスに使用され導入遺伝子及び少なくとも１つのＩＴＲを含む、バキュロウイルスベクターからの配列を含むことがより好ましく、参照バキュロウイルス配列は、パルボウイルスＩＴＲにすぐに隣接しない。

参照配列が組成物にスパイク添加するために使用される核酸であるケースにおいて、この核酸が、組成物の生産後に存在しないが、後の時点、しかし、核酸不純物の相対存在量を決定する前に、加えられることが意図される。組成物にスパイク添加するために使用される核酸分子は、任意の適切な核酸分子、例えば、小さい直鎖状又は環状の少なくとも１０、３０、５０、１００、１５０、２００、５００、１０００以上の塩基対のＲＮＡ若しくはＤＮＡ分子であってもよい。このような核酸分子は、コード及び／又は非コード領域を含んでいてもよい。

本発明のさらなる実施形態において、相対存在量は、
ａ）上に定義されている核酸不純物の核酸当たりのリードの平均数；並びに
ｉ）参照配列の核酸当たりのリードの平均数；及び／若しくは
ｉｉ）組成物中のパルボウイルスベクター当たりのリードの平均数
によって決定され、ここで、リードの数は、上に概説されている任意の方法によって決定される；並びに／又は
ｂ）上に定義されている核酸不純物；並びに
ｉ）参照配列；及び／若しくは
ｉｉ）パルボウイルスベクターのヌクレオチド配列
の増幅によって決定される。

好ましい実施形態において、リードの平均数は、上に示される通り定義される。加えて、パルボウイルスベクターは、完全なパルボウイルスベクター、或いは導入遺伝子、プロモーター又はＩＴＲ（複数可）のヌクレオチド配列の僅か（一部）などの、パルボウイルスベクターの任意の配列に関連してもよい。さらに、パルボウイルスベクターの任意の他のヌクレオチド配列は、本発明の方法において使用するため等しく適切であり得る。

さらなる実施形態において、核酸不純物の相対存在量は、上に示される通り核酸分子の量を決定するための適切な任意の方法によって決定することができる。相対存在量は、Ｑ−ＰＣＲによって及び／又はハイスループットシークエンシングによって決定されることがより好ましい。核酸の定量をもたらす任意のＱ−ＰＣＲ法又はハイスループットシークエンシング法は、本発明の方法において使用するため適切である。Ｑ−ＰＣＲ法（リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）は、当技術分野において周知されており、その技術は、非特異的な蛍光色素又はハイブリダイゼーションプローブのいずれかを使用することができる。本発明の好ましい実施形態において、Ｑ−ＰＣＲは、特異的なハイブリダイゼーションプローブで実施される。

方法は、上に定義されている核酸不純物に対するオリゴヌクレオチドプライマーの選択的なハイブリダイゼーションのステップをさらに含むことが好ましい。

核酸不純物に対するオリゴヌクレオチドプライマーの選択的なハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドが、核酸不純物と増殖性又は陽性二重鎖を形成することを意味すると理解される。このような増殖性又は陽性二重鎖の形成は、Ｑ−ＰＣＲアッセイにおける単位複製配列の形成によって検出することができる、オリゴヌクレオチドと核酸不純物の間の二重鎖の形成と理解される。実際、これは、オリゴヌクレオチドプライマーの終わりが核酸不純物と、オリゴヌクレオチドがポリメラーゼによって伸長することができる又は近傍において塩基対を形成したポリ若しくはオリゴヌクレオチド分子にライゲーションされ得るように、二重鎖を形成することを意味する。本明細書では、「単位複製配列」は、ＰＣＲ手順などの増幅手順からもたらされる定義されたサイズ及び配列を有する二本鎖核酸セグメントと関連する。単位複製配列のサイズは、オリゴヌクレオチドプライマーが結合する核酸二重鎖の２つの鎖における部位によって支配されている。米国特許第４，６８３，１９５号に説明されている通り、その産物核酸のセグメントは、小数の増幅サイクル後に増幅手順の優勢な産物になる。加えて、配列は、所与の実験状況において使用される条件下で、それが標的配列に効果的にハイブリダイズする限り、核酸不純物に「特異的」又は「選択的」であるが、上に定義されている核酸不純物ではないいかなる配列にもハイブリダイズしない。

好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、バキュロウイルス配列又はその相補体の一部を含む核酸不純物に選択的にハイブリダイズする。第１の配列の「相補体」又は「相補的な配列」という用語は、Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃに対する相補的な配列がＣ−Ａ−Ｔ−Ｇであることなどの、塩基対をマッチングさせることによって第１の配列と、二本鎖構造又は二重鎖を形成することができる第２の配列を意味すると本明細書において理解される。

したがって、核酸不純物は、組成物を生産するためのプロセスに使用されるバキュロウイルスベクターに由来することが好ましい。特に、このようなバキュロウイルスベクターは、少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲと隣接する導入遺伝子を含むことが好ましい。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、パルボウイルスＩＴＲ配列がバキュロウイルスベクター中に存在する場合、パルボウイルスＩＴＲ配列の１〜１００００ｂｐ、１〜９０００ｂｐ、１〜８０００ｂｐ、１〜７０００ｂｐ、１〜６０００ｂｐ１〜５０００ｂｐ、１〜４０００ｂｐ、１〜３０００ｂｐ、１〜２０００ｂｐ、１〜１０００ｂｐ、１〜８００ｂｐ、１〜６００ｂｐ、１〜５００ｂｐ、１〜４００ｂｐ、１〜２５０ｂｐ又は１〜１００ｂｐすぐ近傍に位置するバキュロウイルス由来ヌクレオチド配列を含む核酸不純物と選択的にハイブリダイズする。

臨床応用
パルボウイルスベクターを含む組成物は、特に組成物が薬物療法に使用される場合、高い程度の核酸不純物を含有すべきでない。特に、このような核酸不純物は、通常の既に脆弱な患者における有害な反応の原因となり、重篤な合併症に導かれるであろう。本発明は、ＤＮＡ不純物が、パルボウイルスビリオン内にランダムに封入されないとの発見に関する。代わりに、パルボウイルスビリオンの生産の間にＩＴＲに隣接する配列は、過剰に存在する。別の態様において、本発明は、パルボウイルスベクターを含む組成物が臨床的に純粋であると考慮されるかどうかを決定する方法に関し、上記方法は以下のステップを含む：
ｉ）上に概説されている任意の方法に従って、パルボウイルスベクターを含む組成物中の核酸不純物を定量するステップ；並びに
ｉｉ）上に定義されている核酸不純物が、核酸不純物の相対存在量によって決定される場合に参照配列及び／又は導入遺伝子と比べて少なくとも１０、１００、２５０、１０００倍少なく存在するなら、組成物を臨床的に純粋であると決定するステップ。

臨床的に純粋は、動物への投与について安全であると考慮される組成物である、薬学的に高品質な産物と本明細書で定義され、薬学的に高品質な産物は、哺乳動物への投与について安全であると考慮される産物であることが好ましく、組成物は、ヒトへの投与について安全であると考慮されることが最も好ましい。

本発明の好ましい実施形態において、上に定義されている核酸不純物は、導入遺伝子又は参照配列よりも、少なくとも１０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１０．０００又は１００．０００倍少なく存在する。核酸不純物及び導入遺伝子又は参照配列の存在は、特定のＤＮＡ配列を定量するための任意の従来の方法によって定量することができる。

臨床的に純粋は、パルボウイルスベクターを含む組成物が、臨床処置について十分に純粋であると考慮されることと本明細書においてさらに理解される。特に、本発明による臨床的に純粋な組成物は、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＨａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎｏｆＴｅｃｈｎｉｃａｌＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒＲｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓｆｏｒＨｕｍａｎＵｓｅ（ＩＣＨ）品質及び安全性ガイドラインによって要求されているような低い程度のＤＮＡ不純物を含む。ＤＮＡ不純物のレベルは、患者において任意の有害作用の原因となるレベル未満であることが好ましい。

本文書及びその特許請求の範囲では、「含む」という動詞及びその活用は、その単語の次に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が排除されるものではないということを意味する、非限定的な意味で使用されている。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」によって要素に言及することにより、文脈が僅か１つのその要素があるということを明らかに必要としている場合を除き、その要素が２つ以上存在する可能性は排除されない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。

本明細書において引用されている全ての特許及び文献参照は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

以下の実施例は、単に例示的な目的で提供されており、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１：製造されたｒＡＡＶベクター中のＤＮＡ不純物
１．１．材料及び方法
残留ＤＮＡがＡＡＶ１粒子においてパッケージングされるかどうかを調べるために、残留ＤＮＡがデオキシリボヌクレアーゼ耐性であるかどうかを検査した。試料をベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（９Ｕ／ｍＬ）で処理し、ＤＮＡの量をＱ−ＰＣＲを用いて分析した。

ＤＮＡを、試料から単離し、次に３つの異なるプライマーセット（５９／６０、１８０／１８１、３４０／３４１）を用いてＱ−ＰＣＲした。バキュロウイルスＤＮＡのデオキシリボヌクレアーゼ耐性を研究するため、いくつかの試料については、デオキシリボヌクレアーゼステップを省略した（デオキシリボヌクレアーゼなしと示される）。データを、ＰＬＡ分析を用いて分析し、各試料について、異なるプライマーセットによって増幅されたＤＮＡの量の比を決定した。

ＡＡＶ１ＤＮＡの量を、ＡＡＶ１導入遺伝子ベクターのＣＭＶプロモーターを標的とするプライマーセット５９／９０でのＱ−ＰＣＲを用いて決定した。残留バキュロウイルスＤＮＡの定量を、バキュロウイルス特異的プライマーでのＱ−ＰＣＲを用いて実施した。２つの異なるプライマーセット；ＡＡＶ導入遺伝子カセットに近いバキュロウイルスＤＮＡのＯＲＦ１６２９を標的とするプライマーセット１８０／１８１及びＡＡＶ１導入遺伝子カセットから遠くに位置するバキュロウイルスＤＮＡを検出する、バキュロウイルスのｈｒ３配列を標的とするプライマーセット３４０／３４１を用いて実験を実施した。これらの実験について、２つの標準：プラスミド標準系統（ｐＶＤ）及びクローンＶＤの精製バキュロウイルスＤＮＡを含めた。

プライマーセット１８０／１８１を用いてバキュロウイルスＤＮＡの量を決定するために、プライマーセット１８０／１８１でのｐＶＤを標準として使用した。ｐＶＤの濃度を、ＯＤ測定で決定した。プライマーセット３４０／３４１を用いてバキュロウイルスＤＮＡの量を決定するために、プライマーセット３４０／３４１でのＢａｃＶＤを標準として使用した。標準系統に対するＢａｃＶＤの量を、ｐＶＤを標準として、プライマーセット１８０／１８１を用いるＱ−ＰＣＲによって決定した。

ＤＮＡ（ｇｃ／ｍＬ）の量を、以下の式を用いて算出した：
［ＤＮＡ］＝Ｓ・Ｄ・Ｃ
式中：
Ｓ＝測定された平均量（ｇｃ）
Ｄ＝ウイルス性ＤＮＡの希釈係数（５００倍又は１０００倍のいずれか）
Ｃ＝１０μｌ試料から１ｍＬ試料で算出される補正係数（１００）

μｇ／ｍＬにおけるＤＮＡの量を算出するため、式を以下のものに拡張した：
式中：
Ｘ＝ｇからμｇに関する換算係数（１０^６）
Ａ＝アボガドロ数（６．０２２ｘ１０^２３）
Ｍｗ＝ＤＮＡのモル重量。バキュロウイルスゲノムは、１３５ｋｂｐ二本鎖ＤＮＡからなる。一ｂｐ当たりの平均モル重量は、６４９Ｄａである。バキュロウイルスＤＮＡ（プライマーセット１８０／１８１又は３４０／３４１を用いる決定後）についてのＭｗとして、１３５０００・６４９のＭｗ＝８．７６ｘ１０^７Ｄａを使用した。
ＡＡＶ１ゲノムは、３６３０ｂｐ一本鎖ＤＮＡからなる。ＡＡＶ１ＤＮＡの量を計算するため、３６３０ｂｐ・３４０ＤａのＭｗ＝１．２３ｘ１０^６Ｄａを使用した。

１．２結果
バキュロウイルスＤＮＡの量を、２つの異なるプライマーセットを用いるＱ−ＰＣＲで決定した。プライマーセット１８０／１８１はＡＡＶ導入遺伝子カセットに近いＯＲＦ１６２９中の配列を検出し、プライマーセット３４０／３４１に関する配列はカセットから遠くに位置する。表１中の結果は、２つのプライマーセットが、バキュロウイルスＤＮＡのｇｃ／ｍＬの量について非常に異なる値を与えることを示す（プライマーセット１８０／１８１は、プライマーセット３４０／３４１によって得られるよりも平均２０倍高い値を与える）。

Ｂａｃ．ＶＤ標準の濃度をＱ−ＰＣＲを用いて補正したので、この差が標準に関連するものであることが排除される。したがって、これらのデータは、ＩＴＲに近いバキュロウイルスＤＮＡ（プライマーセット１８０／１８１で検出される）が、ＩＴＲから遠いＤＮＡ（プライマーセット３４０／３４１によって検出される）よりもはるかにより存在することを示す。

実施例２：Ｑ−ＰＣＲを用いる核酸不純物の決定
２．１．材料及び方法
バキュロウイルスゲノムのどの部分が試料中に存在していたのか、また異なる配列の量における可能な差違をさらに調べるために、異なるプライマーセット（図２を参照されたい）でＱ−ＰＣＲを実施した。各プライマーセットについて、標準系統を実験に含めた。導入遺伝子コピーの量を、プライマーセット５９／６０を用いて決定した。その後、導入遺伝子コピーと比較してゲノムコピーの相対量を決定した。ＡＡＶ粒子が自身のゲノムの長さよりも長いＤＮＡ配列を組み込み得ることが公知であるので（Ｇｒｉｅｇｅｒら２００５、Ａｌｌｏｃｃａら２００８）、導入遺伝子カセットに隣接するＯＲＦの開始部及び終了部並びにＩＴＲの１０ｋｂ上流及び下流にプライマーを選択した。

２．２結果
バキュロウイルスＤＮＡの量を、バキュロウイルスのｈｒ３配列近くに位置する単位複製配列７３５５５−７３６０４を増幅するプライマーセット３４０／３４１を用いて決定した。これらのプライマーで決定されたゲノムコピーの量が、全バキュロウイルスゲノムのものを代表することが推定された。しかし、ＡＡＶ導入遺伝子カセットにより近い異なるプライマーセットターゲティング配列を用いる類似する実験により、単位複製配列がＩＴＲを含有するＡＡＶ導入遺伝子カセットのより近くに位置する場合、多数のゲノムコピーが見いだされたことが示された（図３）。ＡＡＶがより大きなＤＮＡ配列（８．９ｋｂまで、おそらくさらに大きい（Ａｌｌｏｃｃａら、２００８））をパッケージし得ることが知られているので、本発明者らは、これらの配列が粒子の内側にパッケージングされることを期待する。これは、以下の２種類の残留バキュロウイルスＤＮＡ配列が存在することを示唆している；
１）本発明者らがプライマーセット３４０／３４１で決定し、導入遺伝子のゲノムコピーの量の僅か０．１％に見いだされる、ランダム配列及び
２）導入遺伝子ゲノムコピーの量の１％と２．５％の間に見いだされる、導入遺伝子カセットから１０ｋｂ内（ＡＡＶパッケージング限度の範囲内）のバキュロウイルス配列。両方の配列は、おそらくＡＡＶ１粒子の内側にパッケージングされる又はカプシドと会合する。

実施例３：次世代シーケンシングを用いる核酸不純物の決定
３．１．材料及び方法
製造されたｒＡＡＶベクターにおけるＤＮＡ不純物の程度及び起源を調べるために、ディープシークエンシングによって４つの異なるバッチのｒＡＡＶベクターを分析した。ＤＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ抽出ＩＩキット（ＭａｃｈｅｒｅｙＮａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてこれらのｒＡＡＶベクターから単離した。

このＤＮＡを使用して、ディープシークエンシングライブラリーを調製した。

別個のシークエンシング特性を創るために、イン・シチューハイブリダイゼーションが実施される。クラスターは、初期材料の限界希釈法によって達成される。ＤＮＡ断片が融解され、単一鎖が、プライマーの歯状ローン（ｄｅｎｓｌａｗｎ）によって覆われたフローセルの内側にトラップされる。続いて局所性の増幅（ブリッジＰＣＲ）により、一平方マイクロメータ当たりおよそ１０００の同一分子のクラスターの形成が導かれる。塩基の取り込みは、プライマー、ポリメラーゼ及び４つのフルオロフォア標識デオキシヌクレオチド三リン酸を加えることによって開始される。ｄＮＴＰｓは可逆的なターミネーターとして作用する、つまり、各サイクルにおいて一分子当たり一塩基のみ加えられる。クラスター蛍光が測定されて、どの塩基が組み込まれてきたかが同定される。グリーンレーザーは、塩基Ｇ及びＴの取り込みを識別し、レッドレーザーは、塩基Ａ及びＣを識別する。２つの異なるフィルターを使用して、それぞれＧ／ＴとＡ／Ｃの間が区別される。シグナル検出後、フルオロフォア及びヌクレオチドの終結修飾は、除去される（Ｄｏｈｍ、Ｊ．Ｃ．、Ｌｏｔｔａｚ、Ｃ．、Ｂｏｒｏｄｉｎａ、Ｔ．、ａｎｄＨｉｍｍｅｌｂａｕｅｒ、Ｈ．（２００８）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３６、ｅ１０５；Ｓｈｅｎｄｕｒｅ、Ｊ．ａｎｄＪｉ、Ｈ．（２００８）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６、１１３５−１１４５；Ｒｏｔｈｂｅｒｇ、Ｊ．Ｍ．ａｎｄＬｅａｍｏｎ、Ｊ．Ｈ．（２００８）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６、１１１７−１１２４；Ｋａｈｖｅｊｉａｎ、Ａ．、Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ、Ｊ．、ａｎｄＴｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ．Ｆ．（２００８）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６、１１２５−１１３３）。この方法は、不純物としてどんなタイプの配列が存在するか及び特定の配列集団の間の比がどれほどであるかを決定するため特に有用であり得る。分析を、ＳｅｒｖｉｃｅＸＳ（Ｌｅｉｄｅｎ）によって実施した。

標準の次世代シーケンシング実験により、２千万超の短いリードがもたらされ、これは参照配列に対して整列される又はコンティグを生産するためにデノボアセンブリさせられることを必要とする。ここでは、全内容のシークエンシングに際して、リードをいくつかの参照配列に対して整列させた。これらの参照配列は、ｒＡＡＶベクター調製物中に存在することが知られているＤＮＡ分子を代表する。これには、意図されるゲノム及び生産関連ＤＮＡ不純物が含まれる。アラインメントを、ＣＬＣ＿ｂｉｏアライナーによって実施した。実験において塩基ごとに読まれる頻度により、その相対的な出現についての、他の測定された配列と比較した情報が提供される。ヌクレオチド当たりのリードを、各参照配列について取得した（図４）。参照配列のヌクレオチドが８〜１２倍超読まれる場合、配列情報は高い信頼度を有することが一般に受け入れられている（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｓ．Ｃ．（２００８）、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ５、１６−１８）。

３．２結果
全ＤＮＡシークエンシングを使用して、異なるＡＡＶバッチのＤＮＡ組成物を分析した。分析を、ＩｌｕｍｉｎａＧＡＩ−ＩＩの単一のリードシークエンシング手順に基づくＢａｓｅｃｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ、ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって実施した。生じた品質トリムした生の配列データ（ｑｕａｌｉｔｙｔｒｉｍｍｅｄｒａｗｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａ）を、ＣＬＣ＿ｂｉｏバイオインフォマティクソフトウェアの支援のもとで分析した。リードを、ｒＡＡＶベクター調製物中の潜在的に存在するＤＮＡ分子、すなわち、バキュロウイルス骨格、ｃａｐ特異的、ｒｅｐ特異的及び導入遺伝子特異的なＤＮＡを表す参照配列に参照アセンブリした。予想どおり、生成された約２千万のリードのうちの大多数、９９．７％超が、意図されるＤＮＡ導入遺伝子カセットに対して及び公知の生産関連ＤＮＡ不純物に対してアセンブリした。任意の言及された参照配列に対してアセンブリさせられない、全ての他の配列（０．３％未満）は、シークエンシングエラー、リンカー多量体化、低品質リード及び他のＤＮＡ配列を表すことがある。

ヌクレオチド当たりのカウントを、導入遺伝子カセット、ｃａｐカセット、ｒｅｐカセット及びバキュロウイルスゲノムについて取得し、ヌクレオチド数に対してプロットした（図４及び図５を参照されたい）。ヌクレオチド当たりのリード頻度の分布は、異なるバッチ調製物の間で高度に一致していた。さらに、バキュロウイルスゲノムの分布が、ランダムではないことが明らかとなった。ＩＴＲ．ｓに隣接するゲノムセグメントは、明らかに過剰に存在していた（図５）。

本発明者らは、ｒＡＡＶ調製物において見出される様々なＤＮＡ配列の相対的な出現を算出するためのインプットとしてシークエンシング実験から取得されたリードの平均分布を使用した（表２）。

表２は、所与の配列当たりの取得された平均頻度（複数可）を示す。これらの頻度は、試料中の主なＤＮＡ、すなわち、表３における導入遺伝子カセットと関連させて提示される。所与の不純物のパーセンテージは、以下に提示される式に従い、サイズ補正係数を考慮して、導入遺伝子カセットと関連させて算出される。
Ｘ_ｂａｃ＝Ｓ_ｂａｃ／Ｓ_{導入遺伝子}＊Ｃ_ｂａｃ＊１００％
式中：
Ｘ_ｂａｃ − 導入遺伝子カセットと関連したバキュロウイルスのＤＮＡ不純物のパーセンテージ
Ｓ_ｂａｃ − バキュロウイルス骨格について取得された平均カウント
Ｓ_{導入遺伝子} − 導入遺伝子カセットについて取得された平均カウント
Ｃ_ｂａｃ − 分子長補正係数、ここで、Ｃ_ｂａｃ＝バキュロウイルス骨格長（ｎｔ）／導入遺伝子カセット長（ｎｔ）

実施例４：ＤＮＡ不純物の非ランダム分布
４．１．材料及び方法
次のステップは、バキュロウイルスから得られたＤＮＡ不純物の正確な起源を決定することであった。この目的を達するために、異なるバッチのｒＡＡＶベクターを、上に記載される通りＩｌｌｕｍｉｎａプラットホームでディープシークエンシングした。バキュロウイルスゲノムに対するリードのアラインメントにより、ディープシークエンシングライブラリー中の各（バキュロウイルス由来）ヌクレオチドの頻度を検査するための手段が提供される。加えて、平均頻度を、バキュロウイルスゲノムにマップされるリードの総数をヌクレオチドの数で割ることによって算出した。

４．２結果
図５は、ディープシークエンシング後のバキュロウイルスゲノムに対するリードのアラインメントを図示する。ＤＮＡ不純物がランダムにバキュロウイルスゲノムから由来する場合、相対的に一様な分布が、ヌクレオチド当たり約１２００リードで観察されるであろう。一様な分布は、バキュロウイルスゲノムの中央に実際にみられる。しかし、バキュロウイルスゲノムの始めに及び終わりで、リード数における激しい増加が観察される。これにより、これらの領域が、ｒＡＡＶにおけるＤＮＡ不純物として過剰に存在することが示される。

実施例５：Ｑ−ＰＣＲ又はディープシークエンシングを用いる品質管理評価
５．１．材料及び方法
異なるＮＧＳ法（すなわち、Ｓｏｌｅｘａ及び４５４Ｒｏｃｈｅ）の定量的な性能を調べるために、得られたＮＧＳリード分布を、ｑＰＣＲでのバキュロウイルスゲノムにわたって位置する様々な標的の測定値と比較した（図６）。ＱＰＣＲ標的は、高度に過剰に存在する（１８０／１８１）、平均分布にマッチングする（４２６／４２７、４２８／４２９；１０１８／１０１９；１０２０／１０２１；１０２４／１０２５）及び過少に存在する（３４０／３４１）領域を表す。後者の領域を、全ての他の測定値についてのキャリブレーターとして使用した。

５．２結果
３つの異なる技術を、ｒＡＡＶベクターにおけるＤＮＡ不純物のレベルを試験するため調べた。図６にされる通り、３つの技術は互いによく相関することから、ｒＡＡＶベクターにおけるＤＮＡ不純物の検出のために並列して使用することができる。

図６に示される通り、ＮＧＳ分析は、定量的なＰＣＲについてのＤＮＡ単位複製配列のランダム選択が、ベクター調製物中の特定のＤＮＡ不純物の不正確な測定を導くことがあることを明らかに実証する。所与のＤＮＡ不純物の存在は、調べたＤＮＡ分子の全ての部分（これは時には１３６０００ｂｐ長であり、例えば、バキュロウイルス骨格である）が、同じ頻度で分布するとの推定下で単位複製配列測定に基づいて算出される。ここで提示される分析は、バキュロウイルスゲノムなどの長いＤＮＡ分子の様々なセグメントが、異なるＤＮＡ配列の不均等なパッケージングにより異なる頻度で、ベクター調製物に混入され得ることを明らかに示す。

参照文献
1. Fujita, R., Matsuyama, T., Yamagishi,J., Sahara, K., Asano, S., and Bando, H. (2006) Expression of Autographacalifornica multiple nucleopolyhedrovirus genes in mammalian cells andupregulation of the host beta-actin gene, J. Virol. 80, 2390-2395.
2. Liu, C. Y., Wang, C. H., Wang, J. C.,and Chao, Y. C. (2007) Stimulation of baculovirus transcriptome expression inmammalian cells by baculoviral transcriptional activators, J. Gen. Virol. 88,2176-2184.
3. Laakkonen, J. P., Kaikkonen, M. U.,Ronkainen, P. H., Ihalainen, T. O., Niskanen, E. A., Hakkinen, M., Salminen,M., Kulomaa, M. S., Yla-Herttuala, S., Airenne, K. J., and Vihinen-Ranta, M.(2008) Baculovirus-mediated immediate-early gene expression and nuclearreorganization in human cells, Cell Microbiol. 10, 667-681.
4. Blouin, V., Brument, N., Toublanc, E.,Raimbaud, I., Moullier, P., and Salvetti, A. (2004) Improving rAAV productionand purification: towards the definition of a scaleable process, J. Gene Med. 6Suppl 1, S223-S228
5. Nony, P., Chadeuf, G., Tessier, J.,Moullier, P., and Salvetti, A. (2003) Evidence for packaging of rep-capsequences into adeno-associated virus (AAV) type 2 capsids in the absence ofinverted terminal repeats: a model for generation of rep-positive AAVparticles, J. Virol. 77, 776-781.
6. Chadeuf, G., Ciron, C., Moullier, P.,and Salvetti, A. (2005) Evidence for encapsidation of prokaryotic sequencesduring recombinant adeno-associated virus production and their in vivopersistence after vector delivery, Mol. Ther. 12, 744-753.
7. Wright, J. F. (2008) Manufacturing andcharacterizing AAV-based vectors for use in clinical studies, Gene Ther. 15,840-848.
8. Arsalan Haseeb Zaidi, Patrick J. Bakkes,Jacek Lubelski, Herfita Agustiandari, Oscar P. Kuipers, and Arnold J. M.Driessen (2008) The ABC-Type Multidrug Resistance Transporter LmrCD IsResponsible for an Extrusion-Based Mechanism of Bile Acid Resistance inLactococcus lactis Journal of Bacteriology, 7357-7366
9. Jean - Marie Rouillard, Michael Zukerand Erdogan Gulari (2003) OligoArray 2.0: Design of oligonucleotide probes forDNA microarrays using a thermodynamic approach, Nucleic Acids Research, Vol.31, No. 12 3057-3062
10. Van Hijum SA., de la Nava GJ, TrellesO., Kok J., Kuipers OP., (2003) MicroPreP: a cDNA microarray datapre-processing framework. Appl Bioinformatics, 2(4):241-4
11. P. Baldi and A.D. Long, (2001) ABayesian Framework for the Analysis of Microarray Expression Data: Regularizedt-Test and Statistical Inferences of Gene Changes, Bioinformatics, 17, 6,509-519.
12. Krappa, R., Roncarati, R.,Knebel-Morsdorf, D., (1995) Expression of PE38 and IE2, Viral members of theC3HC4 finger family, during baculovirus infection: PE38 and IE2 localize todistint nuclear regions, J Virol, 5287-5293.
13. Gerhard Schwarz, Stefan BaEumler,Annette Block, Friedrich G. Felsenstein and Gerhard Wenzel (2004) Determinationof detection and quantification limits for SNP allele frequency estimation inDNA pools using real time PCR Nucleic Acids Research, Vol. 32, No. 3 e24
14. Yaffe David, Saxel Ora, (1977) Serialpassaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mousemuscle, Nature 270, 725-727
15. Manno, CS, Pierce, GF, Arruda, VR,Glader, B, Ragni, M, Rasko, J et al. (2006). Successful transduction of liverin hemophilia by AAV-factor IX and limitations imposed by the host immune response. Nat Med 12: 342-347.
16. Mingozzi, F, Maus, MV, Hui, DJ, Sabatino,DE, Murphy, SL, Rasko, JE et al. (2007). CD8+ T-cellresponses to adeno-associated virus capsid in humans. Nat Med 13:419-422.
17. Christine L. Halbert*, Michael J.Metzger*, Siu-Ling Lam, and A. Dusty Miller (2011) Capsid-expressing DNA in AAVvectors and its elimination by use of an oversize capsid gene for vectorproduction. Gene Ther. 18(4): 411-417
18. Bernd Hauck, Samuel L Murphy, Peter HSmith, Guang Qu, Xingge Liu, Olga Zelenaia, Federico Mingozzi, Jurg M Sommer,Katherine A High and J Fraser Wright (2009) Undetectable Transcription ofcap in a Clinical AAV Vector: Implications for Preformed Capsid in ImmuneResponses. Mol Ther. 17(1) 144-152

Claims

パルボウイルスベクターを含む組成物中の過剰に存在する核酸不純物を同定する及び定量する方法であって、
ａ）前記組成物を核酸シークエンシングに供してヌクレオチド配列のランダムリードを得るステップであって、前記核酸シークエンシングが、ハイスループットシークエンシングを含む、ステップ；
ｂ）ステップａ）からのランダムリードと、前記組成物を生産するためのプロセスにおいて使用される生物学的成分のヌクレオチド配列とを比較し、それによってランダムリードと生物学的成分のヌクレオチド配列の間のマッチ度が核酸不純物を同定するステップ；
ｃ）パルボウイルスベクター当たりのリードの平均数を決定するステップ；及び
ｄ）過剰に存在する核酸不純物のヌクレオチド当たりのリードの数を決定するステップであって、核酸不純物は、リードの分布が、ランダムではなく、過剰に存在する不純物が、前記生物学的成分のヌクレオチド配列のリードの平均数の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０若しくは５０倍を含む場合に、又は核酸不純物のヌクレオチド当たりのリードの数が、パルボウイルスベクター当たりのリードの平均数の少なくとも０．００１、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、５．０、７．０若しくは１０％である場合に、過剰に存在する不純物として同定されるステップ
を含む方法。
パルボウイルスベクターが、組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項１に記載の方法。
生物学的成分のヌクレオチド配列が、宿主細胞、プラスミド、組換えパルボウイルスベクター以外のベクター及びヘルパーウイルスのヌクレオチド配列からなる群から選択され、前記ベクターが、バキュロウイルスベクターである、請求項１又は２に記載の方法。
ヘルパーウイルスが、組換えアデノウイルス及び／又は組換え単純ヘルペスウイルスである、請求項３に記載の方法。
前記生物学的成分のヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ、Ｃａｐ及び／又は導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記生物学的成分が、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記生物学的成分が、少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲと隣接する導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
前記生物学的成分が、各側において少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲと隣接する導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
過剰に存在する核酸不純物が、第２又はさらなる組成物において定量される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。