FR2986239A1 - Biomarqueur pour les maladies inflammatoires pulmonaires chroniques - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé in vitro de diagnostic et/ou de pronostic et/ou d'évaluation de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet, utilisant le niveau d'expression du gène récepteur couplé aux protéines G GPR15, comme biomarqueur de la maladie.

Description

BIO1VIARQUEUR POUR LES MALADIES INFLAMMATOIRES PULMONAIRES CHRONIQUES L'invention concerne l'utilisation d'un nouveau biomarqueur pour diagnostiquer une maladie inflammatoire pulmonaire chronique, spécifiquement l'asthme et la broncho- pneumopathie chronique obstructive (BPCO) chez un sujet. Le biomarqueur selon l'invention permet également de déterminer la susceptibilité d'un sujet à développer une maladie inflammatoire pulmonaire chronique, et/ou de suivre l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet atteint.

Contexte de l'invention Les maladies inflammatoires pulmonaires chroniques, qui affectent à différents degrés l'appareil respiratoire, sont en forte expansion depuis plusieurs décennies, notamment dans les pays industrialisés. De nos jours, on estime à plus de 3 millions par an le nombre de décès dans le monde liés à ces maladies. Les principaux facteurs environnementaux pointés du doigt sont le tabagisme et la mauvaise qualité de l'air. Ainsi, dans les pays industrialisés, l'accroissement dans l'air de polluants chimiques participe à l'émergence de nouveaux cas et à l'aggravation des cas déjà répertoriés. Parmi ces maladies inflammatoires chroniques des voies aériennes, on trouve principalement l'asthme et la broncho-pneumopathie chronique obstructive, qui présentent toutefois des profils inflammatoires opposés. L'asthme est la maladie inflammatoire pulmonaire chronique la plus répandue dans les pays industrialisés, et qui touche toutes les classes d'âges. L'asthme est une maladie polyfactorielle, qui n'a pas nécessairement une origine génétique. Elle se caractérise principalement par des bronches inflammatoires, participant à la réduction de leur diamètre et rendant ainsi l'expiration, lors de la respiration des personnes asthmatiques, difficile. Cette inflammation est réversible, de sorte que la personne asthmatique peut, en dehors des crises d'asthme, ne présenter aucun symptôme particulier de la maladie. Suivant la cause, le nombre et la fréquence des crises d'asthme, on parle d'asthme non persistant, d'asthme persistant modéré ou d'asthme persistant sévère. En outre, selon la nature de l'asthme, chronique, allergique, à l'effort etc., le diagnostic peut être plus difficile à établir. Généralement, ce n'est qu'après la survenue de crises d'asthme répétées que l'on procède à une exploration poussée de la fonction respiratoire/ventilatoire des poumons du patient.

Les tests associés, tels que le test d'hyperréactivité bronchique, le test de réversibilité à un bronchodilatateur, sont éprouvants pour le patient et les résultats peuvent parfois être difficiles à interpréter par le personnel soignant, en fonction de la nature de l'asthme, du stade de la maladie, de l'état de santé physique du patient au moment de l'examen, etc.

La broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) quant à elle regroupe plusieurs maladies chroniques du système respiratoire, dont les bronchites chroniques et l'emphysème. La BPCO se caractérise par une diminution du débit expiratoire due principalement à une obstruction progressive et non complètement réversible des bronches. La BPCO fait partie des pathologies liées au tabagisme la plus répandue et touche entre 4 et 10% de la population mondiale adulte, avec une plus forte prévalence chez les adultes de plus de 40 ans. Généralement, les symptômes de la BPCO incluent la toux, l'expectoration et un essoufflement croissant à l'effort. Le diagnostic de sévérité est basé sur une épreuve fonctionnelle respiratoire qui mesure le degré d'obstruction bronchique. Actuellement, le dépistage de la BPCO par l'exploration fonctionnelle est limité, car cet examen est peu accessible, et on estime à plus de 40% la proportion de patients atteints non diagnostiqués. Face à la contrainte et la difficulté de ces diagnostics des maladies inflammatoires pulmonaires chroniques, le développement de biomarqueurs efficaces et fiables permettrait de diagnostiquer plus facilement ces maladies, de les dépister à un stade précoce, d'en établir un pronostic et d'améliorer la prise en charge des patients.

Résumé de l'invention La présente invention tend à pallier les difficultés liées au dépistage et au diagnostic des maladies inflammatoires pulmonaires chroniques et au suivi de l'évolution de la maladie chez les patients, en proposant l'utilisation d'un biomarqueur spécifique dont le profil d'expression est représentatif de ces maladies. Les inventeurs ont mis en évidence, de manière inattendue, que l'analyse de l'expression du gène d'un récepteur couplé aux protéines G, GPR15, est particulièrement adaptée pour la caractérisation des maladies inflammatoires pulmonaires chroniques, et tout particulièrement de l'asthme et de la BPCO. L'analyse du profil d'expression du gène GPR15 permet d'établir de manière rapide et fiable, indépendamment de facteurs extérieurs à la maladie, si un sujet est atteint d'une ou l'autre maladie inflammatoire pulmonaire chronique : les inventeurs ont découvert que les patients présentent un profil d'expression du gène GPR15 différent selon qu'ils sont atteints d'asthme ou de BPCO. Le biomarqueur selon l'invention permet donc de déterminer si un patient est atteint d'asthme ou d'une BPCO. L'utilisation du profil d'expression du gène GPR15 selon l'invention permet l'établissement d'un diagnostic à partir d'un simple échantillon biologique, et notamment un échantillon sanguin, du patient, ce qui rend un tel diagnostic simple et peu coûteux. En outre, le suivi dans le temps du profil d'expression du biomarqueur selon l'invention chez un patient atteint d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique permet d'étudier l'évolution de la maladie avec ou sans traitement, ou de pronostiquer son évolution. Notamment, le biomarqueur pourrait être utilisé pour déterminer le stade de la maladie. Enfin, l'utilisation du profil d'expression du gène GPR15 selon l'invention permet de sélectionner le traitement le plus adéquat pour les patients et/ou de sélectionner les patients nécessitant un suivi clinique particulier. Ainsi l'invention a pour objet un procédé in vitro ou ex vivo de diagnostic et/ou de pronostic et/ou d'évaluation de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet, selon lequel on mesure dans un échantillon biologique du sujet le niveau d'expression du gène GPR15. Le niveau d'expression du gène GPR15 dans l'échantillon biologique du sujet à diagnostiquer/pronostiquer est comparé à un niveau d'expression de référence. Dans un exemple particulier de l'invention, le procédé est mis en oeuvre pour diagnostiquer/pronostiquer/évaluer l'évolution de l'asthme chez un sujet, une sous- expression du gène GPR15 étant indicative de l'asthme. Dans un autre exemple particulier de l'invention, le procédé est mis en oeuvre pour diagnostiquer/pronostiquer/évaluer l'évolution d'une BPCO chez un sujet, une surexpression du gène GPR15 étant indicative d'une BPCO.

Selon l'invention, on mesure avantageusement le niveau d'expression du gène GPR15 au niveau nucléique et/ou protéique, par exemple en mesurant la quantité d'ARNm transcrit et/ou en mesurant la quantité de protéine GPR15 à l'aide d'au moins une méthode spécifique de mesure de l'expression de GPR15. Les techniques permettant de détecter l'expression du gène GPR15 au niveau nucléique sont bien connues de l'homme du métier.

La détection peut notamment être réalisée par RT-PCR quantitative en temps réel, une technique microfluidique, une puce à ADN, le séquençage à haut débit des ARNm, ou toute technique appropriée de quantification de l'ARNm, telle que puce à ARN, méthodes LCR (« Ligase Chain Reaction »), TMA (« Transcription Mediated Amplification »), PCE (« enzyme amplified immunoassay ») et ADNb (« branched DNA signal amplification »), etc. Les techniques permettant de détecter l'expression du gène GPR15 au niveau protéique sont également bien connues de l'homme du métier et peuvent notamment inclure la cytomètrie en flux, l'immunocytochimie quantitative, l'ELISA cellulaire, des puces à protéines ou anticorps couplés ou non à la spectrométrie de masse, la liaison de ligands marqués, etc. Selon un exemple de mise en oeuvre de l'invention, l'échantillon biologique est un échantillon de sang total, la détection du produit de l'expression du gène GPR15 se faisant de préférence sur la population totale leucocytaire. Un autre objet de l'invention porte sur l'utilisation d'un kit comprenant au moins un réactif spécifique du produit de l'expression du gène GPR15, choisi parmi un anticorps monoclonal ou polyclonal ou tout autre type de molécules ou macromolécules capables d'interagir de manière spécifique avec la protéine GPR15, un ligand, naturel ou synthétique, ou une séquence nucléique, capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm codant pour GPR15, pour le diagnostic et/ou le pronostic et/ou l'évaluation de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un suj et. L'invention a également pour objet l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un produit de 20 l'expression du gène de GPR15 comme biomarqueur pour le diagnostic et/ou le pronostic et/ou l'évaluation de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet. Brève description des figures 25 Figure 1 : représentation schématique de l'arbre de décisions ayant conduit à la sélection de GRP15 en tant que biomarqueur des maladies inflammatoires pulmonaires chroniques. Figure 2 : Boxplot (boîtes à moustaches) montrant le profil d'expression du gène GPR15 chez des patients atteints d'asthme ou de BPCO par rapport au profil d'expression chez des volontaires contrôles ne présentant pas ces maladies.

Figure 3 : Expression du gène GPR15 chez les patients atteints d'asthme ou de BPCO versus contrôles ne présentant pas ces maladies représentée en cycles seuil d'amplification (Ct) en fonction de l'âge.

Description détaillée de l'invention La présente invention est basée sur l'étude du profil d'expression du gène récepteur couplé aux protéines G 15 [GPR15, GPCR15, ou BOB (Brother of Bonzo)]. La famille des récepteurs couplés aux protéines G regroupe de nombreux récepteurs membranaires, dont GPR15. Le gène codant GPR15 est situé chez l'homme sur le chromosome 3q11.2-q13.1 (Heiber et al, Genomics 32, 462-465, 1995). Jusqu'à présent, un lien entre GPR15 et l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) a été mis en évidence (Blaak et al, Journal of virology, 79: 1686-1700, 2005, - Okamoto & Shikano, Journal of Biological Chemistry 286, 7171-7181, 2001). GPR15 serait un corécepteur de l'entrée du VIH dans les lymphocytes circulants.

Tel qu'utilisé dans le présent document, le terme "GPR15" fait référence au récepteur couplé aux protéines G 15. Il est décrit dans les bases de données géniques sous les références suivantes : HGNC : 4469 ; GeneID : 2838 ; RefSeq Protein : NP 005281.1 ; RefSeq ARN : NM 005290.1. De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence une corrélation entre l'expression de GPR15 et les maladies inflammatoires pulmonaires chroniques. Plus particulièrement, les inventeurs ont découvert que l'analyse du profil d'expression du gène GPR15 permet de déterminer de manière fiable si un sujet est atteint d'une maladie pulmonaire inflammatoire chronique, et avantageusement de différencier les sujets atteints d'asthme des sujets atteints d'une BPCO.

Aussi, l'invention propose d'utiliser un produit de l'expression du gène GPR15 comme biomarqueur, notamment pour diagnostiquer une maladie inflammatoire pulmonaire chronique, mais également pour le pronostic et le suivi de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique. Plus particulièrement, l'invention propose un procédé in vitro ou ex vivo de diagnostic et/ou de pronostic et/ou d'évaluation de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet selon lequel on mesure dans un échantillon biologique du sujet le niveau d'expression du gène récepteur couplé aux protéines G 15 (GPR15). Dans le contexte de la présente invention, un « sujet » ou un « patient » inclut tout sujet ou patient mammifère, et de préférence un sujet ou un patient humain, incluant notamment les enfants et les adultes. Par « maladies inflammatoires pulmonaires chroniques », on entend les maladies inflammatoires chroniques des voies aériennes, et plus spécifiquement l'asthme et la broncho-pneumopathie chronique obstructive, incluant les bronchites chroniques et 1 ' emphysème. Dans le contexte de l'invention, le « diagnostic » a pour objet la détection et/ou identification chez un sujet d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique, quelque soit son stade. Notamment, le diagnostic permet de déterminer si un sujet est atteint 15 d'asthme ou d'une BPCO. Le « pronostic » s'entend de l'évaluation de la maladie quant à la susceptibilité de développer la maladie, et/ou quant à la susceptibilité d'évolution vers un stade/degré plus avancé, et/ou quant aux risques de complications et d'exacerbations, et/ou quant à son issue, etc. 20 L' « évaluation de l'évolution de la maladie » correspond à l'analyse dans le temps de l'évolution de la maladie préalablement diagnostiquée ou pronostiquée. Un tel suivi dans le temps peut permettre de sélectionner, de valider et/ou d'adapter un traitement. Il permet également de déterminer l'intensité du suivi clinique nécessaire pour le patient. Ce suivi permet de déterminer à tout moment si un traitement est nécessaire. 25 L'invention propose également une méthode pour fournir des informations pouvant être utiles pour diagnostiquer et/ou pronostiquer et/ou évaluer l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet, selon laquelle on mesure dans un échantillon biologique du sujet le niveau d'expression du gène GPR15. Selon l'invention, GPR15 peut être utilisé comme biomarqueur pour le pronostic et/ou le 30 diagnostic d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique, et plus spécifiquement l'asthme et la BPCO.

De même, GPR15 peut être utilisé comme biomarqueur pour le suivi d'un sujet diagnostiqué comme présentant une maladie inflammatoire pulmonaire chronique et/ou pronostiqué comme susceptible de développer une telle maladie et/ou de développer une maladie de stade plus avancé/sévère et/ou de développer des complications et/ou des exacerbations. Un tel biomarqueur peut également être utilisé pour la sélection de sujets atteints d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique susceptibles de bénéficier d'un traitement particulier et/ou pour évaluer l'évolution de la maladie chez des sujets atteints d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique au cours d'un traitement. GPR15 peut ainsi servir de biomarqueur pour la sélection, l'évaluation et l'adaptation du traitement d'un sujet atteint d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique. Selon l'invention, GPR15 est utilisé comme biomarqueur des maladies inflammatoires pulmonaires chroniques, et plus spécifiquement l'asthme et la BPCO.

Le profil d'expression du gène GPR15 peut être réalisé de différentes manières, notamment en mesurant, en déterminant ou en dosant la quantité du produit d'expression de ce gène à partir d'un échantillon biologique du sujet. L'échantillon est de préférence un échantillon cellulaire provenant d'un fluide biologique du sujet, tel que le sang. Dans un mode de réalisation préféré, l'échantillon du sujet est un échantillon contenant des leucocytes. Les méthodes selon la présente invention peuvent comprendre une étape de prélèvement et/ou une étape de préparation/purification de l'échantillon. Le produit d'expression du gène GPR15 correspond à un produit transcrit ou traduit de ce gène, tel que l'ARNm ou le récepteur couplé aux protéines G GPR15 lui-même.

La quantité de la protéine GPR15 peut être déterminée par toute méthode connue de l'homme de l'art. De manière classique, ces méthodes comprennent une étape de mise en contact de l'échantillon avec un ligand sélectif de la protéine GPR15, tel qu'un anticorps dirigé contre des épitopes spécifiques de GPR15, un fragment ou un dérivé de cet anticorps, ou un ligand endogène ou une petite molécule se liant au récepteur avec une forte affinité. D'une manière générale, les anticorps anti-GPR15 utilisés dans la présente invention sont des anticorps ou toute molécule protéique ou autre se liant spécifiquement à GPR15 avec une affinité submicromolaire. Ce sont par exemple des anticorps monoclonaux ou des anticorps polyclonaux monospécifiques, c'est à dire qui ne reconnaissent spécifiquement qu'un épitope. De préférence, les anticorps seront spécifiques de la partie extracellulaire du récepteur. Ces anticorps peuvent notamment être obtenus par toute méthode de production conventionnelle. Notamment, un anticorps anti-GPR15 peut être obtenu par immunisation d'un animal non humain (lapin, souris, etc.) à l'aide du GPR15 ou d'une séquence antigénique de celui-ci, prélèvement puis épuisement de l'antisérum obtenu par exemple sur un immunoadsorbant contenant GPR15, selon des méthodes connues de l'homme du métier.

La quantité de protéine GPR15 peut être mesurée en utilisant des techniques de cytométrie en flux, des tests immunologiques (ELISA, EIA, RIA, etc.), des tests radioimmunologiques, chemiluminescents ou fluorescents, des immunoélectrophorèses, immunoprécipitations, l'utilisation de la spectrométrie de masse, etc. Le procédé comporte le plus souvent une étape de révélation du marquage, tel qu'un marquage fluorescent, radioactif, enzymatique, ou par molécule colorée, ou plus généralement tout marquage permettant de mettre en évidence la formation du complexe antigène/anticorps ou toute méthode biophysique permettant de mettre en évidence l'interaction entre GPR15 et une molécule soit protéique soit synthétique (aptamére, ligand, ...) Selon l'invention, les ARNm du gène GPR15 peuvent être détectés par toute méthode connue de l'homme de l'art. Généralement, ces méthodes requièrent une première étape d'extraction des acides nucléiques contenus dans l'échantillon biologique, par des techniques bien connues de l'homme du métier, utilisant par exemple des enzymes lysant, des solutions chimiques adaptées ou des résines d'extraction spécifiques. On procède ensuite à la mise en contact desdits ARNm avec une sonde d'acide nucléique, avantageusement marquée, spécifique des ARNm de GPR15, dans des conditions permettant l'hybridation avec lesdits ARNm, suivie d'un dosage des formes hybrides obtenues, avantageusement marquées. Les ARNm extraits peuvent également être préalablement amplifiés (par exemple par la technique de RT-PCR). Les techniques de RTPCR (« reverse transcription polymerase chain reaction ») et notamment la RT-PCR quantitative en temps réel, sont particulièrement préférées. Alternativement, d'autres méthodes de détection d'acides nucléiques peuvent être employées, telles que les méthodes LCR (« Ligase Chain Reaction »), TMA (« Transcription Mediated Amplification »), PCE (« enzyme amplified immunoassay »), ADNb (« branched DNA signal amplification ») et séquençage à haut débit. Typiquement, la détection d'ARN du gène GPR15 est réalisée par - l'obtention d'ARN totaux ou messagers à partir d'un échantillon biologique, tel qu'un échantillon de sang total, - la synthèse d'ADNc par reverse transcription, - une amplification par PCR de l'ADNc en présence d'amorces d'oligonucléotides spécifiques du gène GPR15, - la quantification du produit de la PCR, en particulier par mise contact avec une sonde d'acide nucléique, avantageusement marquée, spécifique des ARNm de GPR15 (détection indirecte), en particulier dans d es conditions permettant l'hybridation, suivie d'un dosage des form es hybrides obtenues, avantageusement marquées. Selon un mode particulier de l'invention, le profil d'expression d'un produit du gène GPR15 dans un échantillon biologique d'un patient est comparé au profil d'expression de référence d'un produit du gène GPR15. Ce profil d'expression de référence peut être celui obtenu à partir d'un échantillon biologique témoin. Bien entendu, le profil d'expression témoin peut correspondre à une moyenne ou une médiane des profils d'expression obtenus pour un panel d'échantillons biologiques témoins. Les niveaux d'expression obtenus dans les échantillons des sujets à analyser et dans les échantillons témoins sont avantageusement normalisés en utilisant le niveau d'expression de protéines connues pour avoir un niveau d'expression stable chez les sujets présentant une maladie inflammatoire pulmonaire chronique et chez les sujets sains, tel que HPRT1 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase 1), TBP (TATA binding protein) ou TFRC (Transferrin receptor protein 1) pour l'ARNm des leucocytes humains et tel que la 13-actine pour les échantillons protéiques. Préférentiellement, les produits du gène GPR15 analysés pour réaliser le profil d'expression du patient dans un échantillon biologique et pour réaliser le profil d'expression témoin sont identiques, de même que la nature des échantillons utilisés. Ils peuvent cependant comporter d'éventuelles mutations qui seront mises en évidence par séquençage. Dans un exemple de réalisation, le profil d'expression de référence est réalisé à partir d'échantillons biologiques de sujets non susceptibles de présenter une maladie inflammatoire pulmonaire chronique. Un tel profil d'expression de référence permet notamment de diagnostiquer une maladie inflammatoire pulmonaire chronique à un stade très précoce de la maladie. Dans un autre exemple de réalisation, le profil d'expression de référence est réalisé à partir d'échantillons biologiques de sujets présentant une maladie inflammatoire pulmonaire chronique diagnostiquée, et dont le stade/degré est avantageusement connu. Il peut être particulièrement intéressant de réaliser des profils d'expression de référence, à partir d'échantillons biologiques de sujets diagnostiqués comme présentant une maladie inflammatoire pulmonaire chronique, pour chacun des stades de la maladie. De tels profils peuvent être notamment utiles pour le suivi de l'évolution de la maladie chez un sujet, afin notamment d'évaluer les risques de complication et/ou d'exacerbation, et/ou de sélectionner, adapter, modifier, débuter ou cesser un traitement. Par exemple, dans le cas de l'asthme, il est possible de réaliser des profils d'expression de référence à partir de sujets diagnostiqués comme présentant un asthme qualifié de « contrôlé » ou de « non controlé » selon la classification GINA (« global initiative for asthma ») (2006, 2011), ou selon des stades de sévérité : intermittent ou persistant léger, modéré ou sévère (GINA 2002). L'asthme peut également être qualifié en fonction de facteurs favorisants comme l'allergie, on parle alors d'asthme allergique ou non allergique. De même, dans le cas de la BPCO, il est possible de réaliser des profils d'expression de référence à partir de sujets diagnostiqués comme présentant des bronchites chroniques, à partir de sujets diagnostiqués comme présentant un emphysème, et à partir de sujets diagnostiqués comme présentant des bronchites chroniques et un emphysème. Il est également possible de tenir compte du degré d'obstruction bronchique (indice de Tiffeneau : VEMS/CVF < 70%). Par exemple, il est possible de réaliser des profils d'expression de référence à partir de sujets présentant une bronchite chronique légère (VEMS>80%), modérée (50%<VEMS<80%), sévère (30%<VEMS<50%) et très sévère (VEM<30%). De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence une corrélation entre le niveau d'expression de GPR15 et l'âge du sujet. Cette observation a été étendue à l'ensemble des patients atteints d'asthme, de ceux atteints de BPCO et pour tous les sujets contrôles. Des profils d'expression de référence peuvent donc être réalisés en fonction de l'âge des sujets témoins. Le niveau d'expression de GPR15 pour un patient est alors avantageusement comparé au niveau de référence de témoins de la même classe d'âge (âge du patient ± 2,5 ans).

L'apparition des symptômes de la maladie se faisant tardivement pour les patients atteints de BPCO (>40 ans) et plus précocement pour les malades asthmatiques, l'âge de la population témoin s'étage préférentiellement de 18 à 80 ans. Une telle classification en fonction de la classe d'âges peut être particulièrement intéressante pour le diagnostic ou le pronostic de maladies pulmonaires chroniques connues pour se déclarer à un âge particulier. Cette classification peut également s'avérer utile pour l'évaluation de l'évolution de la maladie, et notamment pour les BPCO, dont l'évolution en fonction de l'âge du patient peut être rapide et/ou critique. Les différents critères exposés ci-dessus pour la réalisation de profils d'expression témoins ne sont pas exclusifs les uns des autres. Par exemple, il peut être particulièrement intéressant de réaliser des profils d'expression de référence en fonction du stade de la maladie et de l'âge des sujets. Les inventeurs ont découvert que les patients atteints d'asthme présentent un profil d'expression du gène GPR15 opposé au profil d'expression des patients atteints d'une BPCO. Ainsi, l'utilisation du biomarqueur GPR15 se révèle particulièrement pertinente pour déterminer de manière fiable si un sujet est atteint de l'une ou l'autre de ces deux maladies pulmonaires chroniques. Plus précisément, les sujets atteints d'asthme présentent une diminution de l'expression du produit du gène GPR15 par rapport à l'expression du produit du gène GPR15 chez un sujet témoin, non atteint de cette maladie. A l'inverse les sujets atteints d'une BPCO présentent une surexpression du produit du gène GPR15 par rapport à l'expression du produit du gène GPR15 chez un sujet témoin, non atteint de cette maladie. Dans un exemple de mise en oeuvre de l'invention, le procédé comprend une étape pour déterminer si le niveau d'expression du produit du gène GPR15 chez un sujet est élevé ou faible par rapport au niveau d'expression de référence. Dans un exemple de mise en oeuvre, on considère que le niveau d'expression de référence correspond à un niveau d'expression normal du produit du gène GPR15, c'est-à-dire hors toute maladie inflammatoire pulmonaire chronique. Le niveau d'expression chez le sujet est considéré comme élevé, et donc présente une surexpression, si ledit niveau est par exemple au moins supérieur de 50% au niveau d'expression de référence après normalisation, et préférentiellement au moins supérieur de 100%, 150% ou 200%. A l'inverse, le niveau d'expression chez le sujet est considéré comme faible, et donc présente une sous-expression, si ledit niveau est par exemple au moins inférieur de 50% au niveau d'expression de référence après normalisation, et préférentiellement au moins inférieur de 100%, 150% ou 200%. Le propre niveau d'expression du produit du gène GPR15 du patient à un temps t donné peut servir de niveau d'expression de référence pour le suivi de l'évolution de la maladie dudit patient à un temps t+1. Une surexpression ou une sous- expression du produit du gène GPR15 du patient à t+1 par rapport au niveau d'expression du produit du gène GPR15 du patient au temps t peut être indicative d'une amélioration ou d'une dégradation de l'état de santé dudit patient en fonction de la maladie observée. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un kit comprenant au moins un réactif spécifique du produit de l'expression du gène GPR15, choisi parmi un anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre GPR15 ou toute molécule protéique ou autre se liant spécifiquement à GPR15 avec une affinité submicromolaire, une sonde capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm ou de l'ADNc codant pour GPR15, et au moins une paire d'amorces d'acide nucléique spécifiques de l'ARNm ou de l'ADNc codant pour GPR15, pour le diagnostic et/ou le pronostic et/ou l'évaluation de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet. Dans un exemple de réalisation particulier de l'invention, le kit peut comporter un moyen pour détecter le complexe formé entre la protéine GPR15 et le ligand, et/ou un moyen pour détecter l'hybridation d'au moins une sonde spécifique à un fragment de l'ARNm ou de l'ADNc codant pour GPR15 et/ou des moyens pour amplifier et/ou détecter ledit ARNm ou ADNc. D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront dans la partie expérimentale suivante, qui doit être regardée à titre illustratif, ne limitant en aucune façon l'étendue de la protection recherchée.

EXPERIMENTATIONS Matériel et méthode Caractéristiques des patients Les patients asthmatiques et leurs contrôles génétiquement appariés (ascendant, descendant, fratrie) sont recrutés aux services de pneumologie à l'hôpital de Nantes (Pr A.

Magnan) et de Marseille (Pr P. Chanez). Les caractéristiques de ces volontaires sont décrites dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1 : Caractéristiques des patients asthmatiques et leurs contrôles apparentés N° du Sexe Age Fumeur Ancienneté Stade % VEMS de base PD20 Dernière Phadiatop sujet (paquets- (nombre de (pg MCh) exacerbation années) d'année) . gravite A101 F 65 NFu 20 Sévère 75 ND 20/04/08 Négatif A102 F 48 EX 1 20 Sévère 45 ND 1/05/08 Négatif A1002 F 71 NFu 51 Sévère 53 ND Nombreuses Négatif A1003 H 19 NFu 18 Sévère 65 ND 5 dans l'année Pos (der.p) précédente A1004 F 41 NFu 23 Sévère 55 ND 6 dans l'année Positif précédente A1005 H 20 NFu 19 Sévère 100 Positive Aucune Positif A1006 F 54 Fu 19 Sévère 72 ND 10 dans l'année Négatif A3006 F 63 NFu 63 Sévère 67 ND 20/06/10 Négatif A3007 F 55 NFu 33 Sévère 79 ND 30/03/09 Positif (IgE chat) C101 H 39 NFu 100 ND Négatif C102 F 48 EX 20 100 > 500 Négatif C1001 H 52 NFu 103 > 3100 Négatif C1003 H 47 EX 97 > 3100 Négatif C1004 F 18 ? 114 > 3100 Négatif C1005 F 52 EX 20 100 Négatif Négatif C1006 F 24 Fu 10 102 > 500 Négatif C3004 F 42 NFu 90 > 1600 Négatif C3005 H 43 Fu 10 104 > 1600 Négatif C3006 H 65 NFu 76 > 1600 Négatif F = Femme ; H = Homme ; Fu = Fumeur ; NFu = Non Fumeur ; Ex = Ex-Fumeur ; ND = Non Déterminé VEMS = Volume expiratoire maximum seconde.

PD20 = Dose de métacholine provoquant une chute de 20% du VEMS. Dernière exacerbation : dernière hospitalisation due à une infection respiratoire liée à une amplification des symptômes de la maladie Phadiatop : test d'évaluation allergique Les patients atteints de bronchopneumopathie chronique obstructive ou BPCO et leurs contrôles environnementaux appariés (conjoint, voisin) sont recrutés au service de pneumologie des hôpitaux universitaires de Strasbourg (Pr R. Kessler). Les caractéristiques de ces volontaires sont décrites dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 : Caractéristiques des patients BPCO et leurs contrôles environnementaux appariés N° du Sexe Age Fumeur Ancienneté VEMS VEMS/C VF (%) Stade de gravité PD20 Dernière Phadiatop sujet (paquets- (nombre (%) (pg MCh) exacerbation années) d'année) B2003 H 67 Fu 40 9 65 46 Modéré Sep-08 ND B2004 H 69 EX 80 1 61 38 Modéré Juin-08 Négatif B2005 H 80 Ex 10 7 42 52 Sévère 2007 Négatif B2006 F 57 Fu 40 2 89 62 Modéré nov-09 Positif B2007 F 47 EX 30 3 66 51 Modéré juil-09 Négatif B2009 F 80 Fu 90 ND 59 62 Modéré oct-09 Négatif B2010 H 72 EX 50 1 51 41 Modéré fev-2010 Positif B2014 F 58 Fu 30 4 70 61 Modéré 2009 Négatif B2015 H 62 Fu 40 2 57 41 Modéré ND Négatif B2016 F 63 EX 80 3 75 54 Modéré 6/07/07 Négatif C2001 F 75 Passif 141 84 > 1500 ND C2002 F 37 Fu 20 121 87 > 3100 ND C2003 F 67 Passif 99 82 > 2080 ND C2004 F 62 Passif 115 83 > 3100 Négatif C2006 F 51 EX 30 99 86 > 3100 Négatif C2007 F 48 NFu 105 88 > 3100 Négatif C2008 F 62 NFu 121 87 > 3100 Négatif C2010 F 68 Fu 30 129 78 > 1500 Négatif C2014 H 37 Fu 15 96 77 > 3100 Négatif C2016 F 74 NFu 115 74 > 3100 Négatif F = Femme ; H = Homme ; Fu = Fumeur NFu = Non Fumeur ; Ex = Ex-Fumeur ; Passif = Tabagisme Passif VEMS = Volume expiratoire maximum seconde.

Indice de Tiffeneau : rapport VEMS/CVF (Capacité Vitale Forcée) en pourcentage. Chez un patient obstructif : VEMS/CVF < 70% PD20 = Dose de métacholine provoquant une chute de 20% du VEMS. Stade de gravité = stade modéré : 80 à 50% de la valeur théorique du VEMS ; Stade sévère : 50 à 30% de la valeur théorique du VEMS Dernière exacerbation : dernière hospitalisation due à une infection respiratoire liée à une amplification des symptômes de la maladie Phadiatop : test d'évaluation de la sensibilisation aux pneumallergènes communs L'étude a été réalisée après saisine du Comité Consultatif de Protection des Personnes se prêtant à la Recherche Biomédicale (CCPPRB) Alsace N°1 en date du 14 juin 2005, conformément à la loi Huriet N°88-1138 du 20 décembre 1988 modifiée du code de la santé publique, et a été déclarée auprès de la Haute Autorité de Santé. Les amendements au protocole (promotion, investigateurs complémentaires) ont été saisis par le comité de protection des personnes (CPP Est n'IV). Obtention des leucocytes Les leucocytes totaux sont obtenus à partir du sang total (20 ml) prélevé sur EDTA. Six ml de sang sont injectés à travers un filtre microporeux LeukoLOCKTM (Fractionation Stabilization Kit, Life TechnologiesTM) retenant les leucocytes. Le filtre est rincé à l'aide de PBS, puis de RNAlater® permettant la conservation des ARN et stocké à -80°C jusqu'à l'extraction de l'ARN. Extraction et purification des ARN Après décongélation, la solution de RNAlater est éliminée par injection d'air dans le filtre à l'aide d'une seringue. Une solution Lysing/Binding solution concentrate (Total RNA isolation Kit, LeukoLOCKTM) permettant la lyse des cellules est ajoutée au filtre. Le lysat est récupéré dans un tube Falcon 15 ml et traité par la protéinase K du kit. Les ARN sont fixés sur des billes par ajout de RNA Binding Beads et centrifugés. Le surnageant est éliminé, les billes lavées 3 fois par une solution contenant de l'isopropanol puis de l'éthanol. Les ARN sont alors élués (50111; solution d'élution, LeukoLOCKTM) dans un tube Eppendorf qui peut être conservé à -80°C. Les ARN totaux sont purifiés par centrifugation sur gel de silice qui présente une affinité élevée pour l'ARN (RNeasy® mini kit, Qiagen), élués par eau DEPC (50 .il) et récupérés dans un tube Eppendorf qui est stocké à -80°C.

Quantification et qualité de l'ARN Les ARN totaux sont quantifiés par deux techniques différentes : 1) spectrophotomètre NanoDrop® (Thermo Scientific) de grande précision permettant l'analyse de microvolumes (1 .il) résultant en un spectre d'absorption de 230 à 350 nm ; un ARN de bonne qualité est défini par des rapports A260/A280 proche de 2 et A230/A260 compris entre 1,8 et 2,2 ; 2) mesure de fluorescence (Fluoromètre QubitTM, Qiagen) grâce à un intercalant fluorescent Quant-itTM RNA assay Kit (Qiagen). Le résultat est exprimé en concentration d'ARN proportionnelle à la fluorescence émise. Cette concentration est comparée à celle obtenue sur le NanoDrop®. Un rapport compris entre 0,9 et 1,1 permet l'acceptation de l'ARN pour la poursuite de l'analyse. Dans le cas contraire, l'ARN est éliminé (Figure 1). Intégrité des ARN L'intégrité de l'ARN est mesurée par électrophorèse capillaire automatisée (Bioanalyzer 2100, Agilent Technologies) utilisant des puces "RNA 6000 Nano LabChip" (Agilent Technologies). Un agent fluorescent se liant à l'ARN est ajouté ; l'ARN est soumis à un champ électrique et la fluorescence émise est mesurée. La qualité de l'ARN est évaluée par le rapport ARNr 28S / ARNr 18S et par l'analyse d'un électrophorégramme complet incluant les ARN dégradés de petite taille, résultant en une valeur de RIN (RNA Integrity Number). L'intégrité de l'ARN est validée par un rapport 28S/18S > 1,8 et un RIN > 7 (Figure 1). Contamination par l'ADN génomique L'analyse des RCPGs en PCR quantitative nécessite la vérification de l'absence d'ADN génomique résiduel qui pourrait interférer. Cette validation est réalisée par amplification d'un gène hautement exprimé sur les échantillons d'ARN à l'aide d'un couple d'amorces dessinées sur un seul exon (TaqMan® Gene Expression Assay). Une absence d'amplification lors de la PCR valide l'absence d'ADN génomique dans l'échantillon. Les ARN ne satisfaisant pas à cette étape sont éliminés (Figure 1). Transcription inverse Lors de la transcription inverse, une expérience permettant de valider l'absence d'inhibiteurs de PCR dans les échantillons d'ARN est mise en place. Elle implique l'introduction d'un ARN étranger ne comportant aucune séquence homologue d'ARN eucaryote (Alien®, Stratagene) dans les échantillons. Les ARN totaux (1 1.1g) ayant passé le crible Go-NoGo représenté sur le schéma 1 sont additionnés de l'ARN Alien® (2 !al, 106 copies) et soumis à transcription inverse à 37°C pendant 2h en présence d'une transcriptase inverse d'origine virale la Murine Leukemia Virus reverse transcriptase (MuLV, Life TechnologiesTM). Le mélange réactionnel (commercialisé par Life TechnologiesTM) comprend la MuLV, les désoxynucléotides triphosphate, les amorces dégénérées, des inhibiteurs de RNase dans le tampon RT du kit dans un volume final de 100 Validation de l'absence d'inhibiteurs de PCR L'amplification par PCR en temps réel est réalisée en plaques 96 puits sur ABI PRISM® 7000 (Life Technologies). L'ADNc Alien® en présence d'ADNc d'intérêt est amplifié à l'aide d'amorces Alien® (Stratagène). Les valeurs de cycle seuil d'amplification (Ct) d'Alien sont comparées en présence et en absence d'échantillons d'ADNc à différentes dilutions. La dilution permettant l'amplification de l'ADNc Alien® non modifiée correspond à une dilution au 1/3e de l'échantillon d'ADNc d'intérêt. Cette dilution correspond à une dilution suffisante des résidus de traitement des échantillons (phénol, éthanol, guanidine, EDTA) jouant le rôle d'inhibiteurs de PCR. Quantification de l'expression génique des RCPGs La quantification de l'expression génique des RCPGs par PCR quantitative en temps réel est réalisée sur ABI PRISM® 7900 (Life TechnologiesTM) en carte microfluidique 384 puits « TaqMan() Low Density Array » (TLDA, Life TechnologiesTM). Chaque puits de la carte TLDA contient une sonde TaqMan® lyophilisée et un couple d'amorces spécifiques. Parmi les 384 couples d'amorces, 360 sont spécifiques des gènes RCPGs, 20 de gènes domestiques et 4 d'un gène contrôle, le 18S. L'amplification se déroule pendant 2 h dans un volume réactionnel final de 2 Les résultats d'expression du gène biomarqueur mis en évidence sont confirmés par PCR quantitative en plaque 96 puits sur ABI PRISM® 7000.

Analyse statistique et expression des résultats Les résultats des amplifications sont délivrés pour chaque gène en valeur de cycle seuil d'amplification (Ct) par le logiciel RQ Study intégré à l'ABI PRISM® 7900. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le tableur Excel et le logiciel R.

RESULTATS ET ANALYSE Les valeurs de l'expression de GPR15 chez les contrôles asthme et les contrôles BPCO ne sont pas significativement différentes (p= 0.20728197) ; les deux ensembles contrôles ont donc été fusionnés pour constituer l'ensemble « contrôle », augmentant ainsi la puissance 25 d'analyse. Les résultats de l'expression de GPR15 sont représentés graphiquement : i) en boîtes à moustaches (Figure 2), ii) en dispersion point-par-point du Ct en fonction de l'âge des patients et une droite résumant la variation en fonction de l'âge pour chaque groupe (Figure 3). 30 Les valeurs d'expression de GPR15 pour les patients BPCO et le groupe contrôle sont significativement différents (p= 0.00164019) (figure 2). Les valeurs d'expression de GPR15 pour les patients Asthmatiques et le groupe contrôle sont aussi significativement différents (p= 0.02535037) (figure 2).

L'analyse de l'expression de GPR15 dans le groupe contrôle montre une corrélation de l'expression avec l'âge du patient (r2=0.32) de même que dans le groupe BPCO (r2=0.51). La figure 3 illustre cette dépendance de la valeur d'expression de GPR15 dans les différents groupes de patients avec la variable âge.

Trois valeurs atypiques sont observées dans le groupe BPCO : il s'agit d'un asthmatique fumeur (A1006), pour lequel le diagnostic est à confirmer ; un sujet contrôle fumeur (C2010, 30 paquets/année) ; et un sujet contrôle non fumeur (C1001) avec un indice de Tiffeneau (VEMS/CVF%) à 78 et qu'il faudra revoir.10

Claims (11)

1. REVENDICATIONS1- Procédé in vitro de diagnostic et/ou de pronostic et/ou d'évaluation de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet, selon lequel on mesure dans un échantillon biologique du sujet le niveau d'expression du gène du récepteur couplé aux protéines G 15 (GPR15).
2. 2- Procédé in vitro selon la revendication 1, selon lequel on compare le niveau d'expression du gène GPR15 à un niveau d'expression de référence.
3. 3- Procédé in vitro selon la revendication 2, pour diagnostiquer et/ou pronostiquer et/ou évaluer l'évolution de l'asthme chez un sujet, une sous-expression de GPR15 étant indicative de l'asthme.
4. 4- Procédé in vitro selon la revendication 2, pour diagnostiquer et/ou pronostiquer et/ou évaluer l'évolution d'une broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) chez un sujet, une surexpression de GPR15 étant indicative d'une BPCO.
5. 5- Procédé in vitro selon l'une des revendications 1 à 4, selon lequel le niveau d'expression du gène GPR15 est déterminé en mesurant la quantité de protéine GPR15.
6. 6- Procédé in vitro selon la revendication 5, selon lequel la quantité de protéine GPR1 5 est mesurée par immunofluorescence, chemiluminescence, immunohistochimie, immunocytochimie, ELISA, puce à protéines ou anticorps.
7. 7- Procédé in vitro selon l'une des revendications 1 à 4, selon lequel le niveau d'expression du gène GPR15 est déterminé en mesurant la quantité d'ARNm codant la protéine GPR15.
8. 8- Procédé in vitro selon la revendication 7, selon lequel la quantité d'ARNm de GPR15 est mesurée par la technique de RT-PCR quantitative en temps réel, par technique microfluidique, puce à ARN, méthodes LCR, TMA, PCE ,ADNb ou séquençage à haut débit.
9. 9- Procédé in vitro selon l'une des revendications 1 à 8, selon lequel l'échantillon biologique est un échantillon sanguin, le produit de l'expression du gène GPR15 étant détecté dans les leucocytes.
10. 10- Utilisation d'un kit comprenant au moins un réactif spécifique du produit de l'expression du gène GPR15, choisi parmi un anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre le GPR15, un ligand naturel ou synthétique du GPR15, une séquence nucléique, capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm codant la protéine GPR15, pour le diagnostic et/ou le pronostic et/ou l'évaluation de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet.
11. 11- Utilisation in vitro d'un produit de l'expression du gène GPR15 pour le diagnostic et/ou le pronostic et/ou l'évaluation de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet.