JP2019050736A - 血管炎の診断用バイオマーカー - Google Patents

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高明 阿部
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覚 眞田
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Abstract

【課題】活動期のＭＰＯ−ＡＮＣＡ血管炎と、寛解期のＭＰＯ−ＡＮＣＡ血管炎とを、精度よく判定できる血管炎の診断用バイオマーカーや、結節性多発動脈炎の有無を精度よく判定できる血管炎の診断用バイオマーカーを提供すること。【解決手段】被験者から採取された末梢血単核球試料中のケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）をコードするｍＲＮＡの発現レベル、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの発現レベル、或いは、前記ＣＣＲ８タンパク質の発現レベルが、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮに罹患していない対照者と比べ、増加しているか否かを解析することにより、前記被験者が、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又は結節性多発動脈炎に罹患しているか否かを判定することができる。【選択図】なし

Description

本発明は、好中球細胞質のミエロペルオキシダーゼ（Myeloperoxidase；ＭＰＯ）に結合する抗好中球細胞質抗体（anti-neutrophil cytoplasmic antibody；ＡＮＣＡ）（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ）が陽性の活動期血管炎（ＭＰＯ−ＡＣＮＡ活動期血管炎）；及び／又は結節性多発動脈炎（Polyarteritis nodosa；ＰＡＮ又はＰＮともいう）の判定方法、判定用キット、並びに判定用バイオマーカーに関する。
血管炎症候群（単に「血管炎」ともいう）は、全身に張り巡らされている血管の壁に炎症を起こし、様々な臓器障害を引き起こす疾患群である。血管炎は、罹患血管のサイズから大型血管炎、中型血管炎、及び小型血管炎に分類される。大型血管炎は、大動脈と、四肢及び頭頸部に向かう最大級の分枝血管における炎症であり、中型血管炎は、各内臓臓器に向かう主要動脈と、その分枝血管における炎症であり、小型血管炎は、細動脈、細静脈、及び毛細血管における炎症である。中型血管炎には、ＰＡＮが含まれ、小型血管炎には、ＭＰＯ−ＡＣＮＡ血管炎や、後述するＰＲ３−ＡＮＣＡ血管炎等のＡＮＣＡ関連血管炎が含まれる。
ＭＰＯ−ＡＣＮＡ血管炎を診断又は治療判定する際、血清中に存在するＭＰＯ−ＡＮＣＡの力価が指標として用いられる。実際に、ＭＰＯ−ＡＣＮＡ血管炎の治療により寛解維持に至った例では、ＭＰＯ−ＡＣＮＡが陰性化したことが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、ＭＰＯ−ＡＣＮＡの力価と病態とが必ずしも一致しない場合もあり、ＥＵＬＡＲ（European League Against Rheumatism）recommendations及びＢＳＲ／ＢＨＰＲガイドラインには、ＭＰＯ−ＡＣＮＡの測定値と病勢との間に密接な関係はなく、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ値のみによって治療方法を調整すべきではないとも記載されている。
ＭＰＯ−ＡＣＮＡに代わるＭＰＯ−ＡＣＮＡ血管炎の診断用バイオマーカーの探索も行われており、例えば、血清中のＫＬ−６濃度は、ＡＮＣＡ関連間質性肺炎の活動性を反映することが報告されている（非特許文献２）。また、モエシンに対する自己抗体（ＭＯ−ＡＮＣＡ）は、血管炎の病態を診断できる新たなバイオマーカーとなり得ることが報告されている（特許文献１）。しかしながら、かかるＫＬ−６やＭＯ−ＡＮＣＡは、活動期のＭＰＯ−ＡＣＮＡ血管炎と、寛解期のＭＰＯ−ＡＣＮＡ血管炎とを区別できるバイオマーカーであるか否かは不明である。
一方、ＰＡＮについては、ＡＣＮＡのような自己抗体は存在せず、また、有効な診断用バイオマーカーも知られていないことから、ＰＡＮの診断は、臨床症状、一般検査所見、画像所見等を参考にして行われているのが現状である。
国際公開第２０１２／０３９１６１号パンフレット
Ara J., et al., Nephrol Dial Transplant. 1999; 14: 621-631. Iwata Y., et al., Intern Med. 2001; 40: 1093-1097.
本発明の課題は、活動期のＭＰＯ−ＡＮＣＡ血管炎と、寛解期のＭＰＯ−ＡＮＣＡ血管炎とを、精度よく判定できる血管炎の診断用バイオマーカーや、結節性多発動脈炎の有無を精度よく判定できる血管炎の診断用バイオマーカーを提供することにある。
生体内の炎症制御には様々なサイトカインやケモカインが関与している。本発明者らは、ケモカインのレセプターの中から、近年発見されたケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）に着目し、血管炎の活動性に応じてその発現が変化する可能性を考え、検討を重ねたところ、末梢血単核球試料中のＣＣＲ８の発現レベルを指標として、活動期のＭＰＯ−ＡＮＣＡ血管炎と、寛解期のＭＰＯ−ＡＮＣＡ血管炎とを精度よく判定できることや、結節性多発動脈炎の有無を判定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする、
好中球細胞質のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対する抗体（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ）が陽性の活動期血管炎（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎）、又は
結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）
の判定方法。
（ａ）被験者から採取された末梢血単核球試料中のケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）をコードするｍＲＮＡの発現レベル、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの発現レベル、又は前記ＣＣＲ８の発現レベルを測定する工程；
（ｂ）工程（ａ）で測定した発現レベルを、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮに罹患していない対照者における発現レベルと比較する工程；
（ｃ）工程（ａ）で測定した発現レベルが、対照者における発現レベルよりも高い場合、被験者は、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮに罹患している可能性が高いと評価する工程；
〔２〕対照者が、健常者；ＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者；又は好中球細胞質のプロテイナーゼ３（ＰＲ３）に対する抗体（ＰＲ３−ＡＮＣＡ）が陽性の血管炎（ＰＲ３−ＡＮＣＡ血管炎）、抗ＧＢＭ抗体関連血管炎、血管炎を伴う全身性エリテマトーデス、及び紫斑病性腎炎からなる群から選択される血管炎に罹患した者；であることを特徴とする上記〔１〕に記載の判定方法。
〔３〕末梢血単核球試料中のケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）をコードするｍＲＮＡの発現、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー又はプローブ、若しくはそれらの標識物を含むことを特徴とする、
好中球細胞質のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対する抗体（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ）が陽性の活動期血管炎（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎）、又は
結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）
の判定用キット。
〔４〕末梢血単核球試料中のケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）に特異的に結合する抗体、又はその標識物を含むことを特徴とする、
好中球細胞質のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対する抗体（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ）が陽性の活動期血管炎（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎）、又は
結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）
の判定用キット。
〔５〕ケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）をコードするｍＲＮＡ、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、又は、前記ＣＣＲ８からなることを特徴とする、
好中球細胞質のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対する抗体（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ）が陽性の活動期血管炎（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎）、又は
結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）
の判定用バイオマーカーであって、
ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮを罹患している者から採取された末梢血単核球試料中のＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡの発現レベル、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの発現レベル、又は、前記ＣＣＲ８の発現レベルが、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮを罹患していない対照者における前記ＣＣＲ８の発現レベルと比べ、高い、
前記判定用バイオマーカー。
〔６〕対照者が、健常者；ＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者；又は好中球細胞質のプロテイナーゼ３（ＰＲ３）に対する抗体（ＰＲ３−ＡＮＣＡ）が陽性の血管炎（ＰＲ３−ＡＮＣＡ血管炎）、抗ＧＢＭ抗体関連血管炎、血管炎を伴う全身性エリテマトーデス、及び紫斑病性腎炎からなる群から選択される血管炎に罹患した者；であることを特徴とする上記〔５〕に記載の判定用バイオマーカー。
また本発明の実施の他の形態として、上記工程（ａ）〜（ｃ）を含む、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮを診断するためのデータを収集する方法；や、
上記工程（ａ）〜（ｃ）を含み、さらに、工程（ｃ）において、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮに罹患している可能性が高いと評価（診断）された被験者に対して、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮの治療を施す工程（ｐ）を任意で含む、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮの診断方法；や、
ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮの判定（診断）に用いるための、末梢血単核球試料中のＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡ、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー若しくはプローブ、又はそれらの標識物；や、
ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮの判定（診断）に用いるための、末梢血単核球試料中のＣＣＲ８に特異的に結合する抗体、又はその標識物；や、
ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮの診断（判定）方法におけるバイオマーカーとしての使用のための、ＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡ、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、又は、前記ＣＣＲ８であって、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮを罹患している者から採取された末梢血単核球試料中のＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡの発現レベル、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの発現レベル、又は、前記ＣＣＲ８の発現レベルが、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮを罹患していない対照者における前記ＣＣＲ８の発現レベルと比べ、高い、前記ＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡ、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、又は、前記ＣＣＲ８；
を挙げることができる。
本発明によると、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎や結節性多発動脈炎の有無を診断する上で有用な、精度の高い診断用データを取得できるため、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎及び結節性多発動脈炎を早期発見し、適切な治療を行うことができ、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎に起因する疾患（例えば、顕微鏡的多発血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎）の予防にも資するものである。
６種類の血管炎患者（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者［図中の「ＭＰＯ」］、ＰＲ３−ＡＮＣＡ血管炎患者［図中の「ＰＲ３」］、ＰＡＮ患者［図中の「ＰＡＮ」］、抗ＧＢＭ抗体関連血管炎患者［図中の「ＧＢＭ」］、血管炎を伴うＳＬＥ患者［図中の「ＳＬＥ」］、及びＨＳＰＮ患者［図中の「ＨＳＰＮ」］）、及び健常者（図中の「Control」）由来の末梢血単核球試料におけるＣＣＲ８遺伝子のｃＤＮＡの発現レベルを、定量ＰＣＲにより解析した結果を示す図である。図中の黒丸（●）は、個々の対象者を示す。図中の「＊」は、ｔ検定を行い、統計学的に有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。 ３種類のＭＰＯ−ＡＮＣＡ血管炎患者（活動期血管炎患者［図中の「活動期」］、寛解期血管患者［図中の「寛解期」］、及び感染症を合併した寛解期血管患者［図中の「寛解期＋感染症」］）由来の末梢血単核球試料におけるＣＣＲ８遺伝子のｃＤＮＡの発現レベルを、定量ＰＣＲにより解析した結果を示す図である。図中の黒丸（●）は、個々の対象者を示す。図中の「＊」は、ｔ検定を行い、統計学的に有意差（ｐ＜０．００５）があることを示す。 図３Ｂは、図１の定量ＰＣＲによる発現レベルが３．２９を示すＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者について、末梢血単核球試料中のＣＣＲ８タンパク質の発現レベルを、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。図３Ａは、図１の定量ＰＣＲによる発現レベルが１．２５を示す健常者について、末梢血単核球試料中のＣＣＲ８タンパク質の発現レベルを、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。
本発明のＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮの判定方法としては、被験者から採取された末梢血単核球試料中のケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）をコードするｍＲＮＡの発現レベル、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ（該ｍＲＮＡから合成されたcomplementary ＤＮＡ）の発現レベル、又は前記ＣＣＲ８の発現レベル（以下、これらを総称して「被験者におけるＣＣＲ８発現レベル」ということがある）を測定し、必要に応じて定量する工程（ａ）；前記工程（ａ）で測定した「被験者におけるＣＣＲ８発現レベル」を、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮに罹患していない対照者におけるＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡの発現レベル、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの発現レベル、又は前記ＣＣＲ８の発現レベル（以下、これらを総称して「対照者におけるＣＣＲ８発現レベル」ということがある）と比較する工程（ｂ）；及び、前記工程（ａ）で測定した「被験者におけるＣＣＲ８発現レベル」が、「対照者におけるＣＣＲ８発現レベル」よりも高い場合、前記被験者は、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎、及び／又はＰＡＮに罹患している可能性が高いと評価（判定）する工程（ｃ）；の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法（以下、「本件判定方法」ということがある）であれば特に制限されず、本件判定方法は、医師によるＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮの診断を補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。
また、本発明のＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮの判定用キットとしては、末梢血単核球試料中のＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡの発現、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー又はプローブ、若しくはそれらの標識物を含む、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮの判定（診断）に用いるためのキット（以下、「本件判定用キット１」ということがある）や、末梢血単核球試料中のＣＣＲ８に特異的に結合する抗体、又はその標識物を含む、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮの判定（診断）に用いるためのキット（以下、「本件判定用キット２」ということがある）であれば特に制限されず、本件判定用キット１及び２は、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮを判定（診断）するためのキットに関する用途発明であり、これらキットには、一般にこの種の診断キットに用いられる成分、例えば担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤の他、取扱説明書、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮを判定（診断）するための説明書等の添付文書が通常含まれる。
また、本発明のＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮの判定用バイオマーカーとしては、ＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡ、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、或いは、前記ＣＣＲ８からなる、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮの判定（診断）に用いるためのバイオマーカーであって、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮを罹患している者から採取された末梢血単核球試料中のＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡの発現レベル、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの発現レベル、又は、前記ＣＣＲ８の発現レベル（以下、「ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮ患者におけるＣＣＲ８発現レベル」ということがある）が、「対照者におけるＣＣＲ８発現レベル」と比べ、高い、前記バイオマーカー（以下、「本件判定用バイオマーカー」ということがある）であれば特に制限されない。
上記被験者としては、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮに罹患しているか否か不明な者であればよく、特に、後述する本実施例において、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎及びＰＡＮと、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎及びＰＡＮ以外の血管炎とを精度よく判定できることが具体的に示されているため、血管炎の症候又は症状を過去若しくは現在有し、かつ、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮに罹患しているか否か不明な者が好ましい。なお、上記被験者には、過去にＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎に罹患し、その後寛解した者（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者）であってＭＰＯ−ＡＮＣＡ血管炎を再発しているか否か不明な者も含まれる。
本明細書において、「ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎」とは、小型血管（毛細血管、細動脈、細静脈、小動脈、及び／又は小静脈）に、非免疫複合体性の炎症が認められ、かつ好中球細胞質のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対する自己抗体（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ）が陽性である状態を意味する。「ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎」の具体的な症候又は症状としては、例えば、網状皮斑、皮下結節、紫斑、皮膚潰瘍、指端壊死等の皮膚における症候又は症状；多発性単神経炎等の末梢神経における症候又は症状；筋痛等の筋肉における症候又は症状；関節痛等の関節における症候又は症状；壊死性（半月体形成性）糸球体腎炎等の腎臓における症候又は症状；消化管潰瘍、消化管出血等の消化管における症候又は症状；心筋炎、不整脈等の心臓における症候又は症状；肺胞出血等の肺における症候又は症状；心膜炎、胸膜炎等の漿膜における症候又は症状；網膜出血、強膜炎等の眼における症候又は症状などの小型血管炎の症候又は症状を挙げることができる。
また、上記「ＭＰＯ−ＡＮＣＡが陽性である」とは、血液中のＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価が、基準値以上であることを意味する。反対に、「ＭＰＯ−ＡＮＣＡが陰性である」とは、血液中のＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価が、基準値未満であることを意味する。かかる基準値は、診断基準や各施設、測定方法によって異なるため、一概に特定することはできないが、例えば、ＥＬＩＳＡ法により約２．０Ｕ／ｍＬである。
本明細書において、「結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）」とは、上記小型血管又は中型血管（内臓臓器に向かう主要動脈とその分枝）に、壊死性血管炎が認められ、かつ、毛細血管及び細動脈には、炎症の症候又は症状（糸球体腎炎を含む）は認められない状態や、炎症の首座が中小型血管（毛細血管、細動脈よりも中枢側の血管）であり、そこに壊死性血管炎が認められ、かつ、毛細血管及び細動脈に炎症の症候又は症状（糸球体腎炎を含む）が認められる状態を意味する。「結節性多発動脈炎」は、ＡＮＣＡ（抗好中球細胞質抗体）とは関連性はなく、通常ＡＮＣＡは陰性である。「結節性多発動脈炎」の具体的な症候又は症状としては、例えば、発熱（３８℃以上、２週間以上）；体重減少（６カ月以内に６ｋｇ以上）；高血圧；急速に進行する腎不全、腎梗塞等の腎臓における症候又は症状；脳出血、脳梗塞等の脳における症候又は症状；心筋梗塞、虚血性心疾患、心膜炎、心不全等の心臓における症候又は症状；胸膜炎等の胸膜における症候又は症状；消化管出血、腸梗塞等の消化管における症候又は症状；多発性単神経炎等の末梢神経における症候又は症状；皮下結節、皮膚潰瘍、壊疽、紫斑等の皮膚における症候又は症状；多関節痛（炎），筋痛（炎），筋力低下等の筋肉における症候又は症状を挙げることができる。
本明細書において、「末梢血単核球試料」としては、末梢血由来の単核球が含まれた試料であればよく、末梢血単核球試料中の単核球の純度は、通常６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
本明細書において、「末梢血単核球試料」は、公知の方法を用いて採取することができる。具体的には、被験者や対照者から採取された末梢血を、ヘパリンやクエン酸等の抗凝固剤で処理した後、単核球分離用に適切に比重が調整された分離剤、例えばフィコールやリンホプレップに積層するか、或いは該分離剤と混合し、遠心分離操作を行い、単核球を含む画分を、単核球以外の血球成分を含む画分から分離することにより採取することができる。
本件判定方法及び本件判定用バイオマーカーにおいて、ＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡの発現レベル、又は該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの発現レベルは、末梢血単核球試料中のＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡ、又はかかるｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡの一部若しくは全部を特異的に検出できる公知の方法を用いて測定することができる。かかる方法として、具体的には、末梢血単核球試料中の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）における全ＲＮＡを抽出・精製し、ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析する方法；上記全ＲＮＡを、ＣＣＲ８遺伝子のｍＲＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたノーザンブロッティング法で検出する方法；上記全ＲＮＡを、逆転写酵素を用いてＣＣＲ８遺伝子のｍＲＮＡの逆転写産物（ｃＤＮＡ）を合成した後、かかる逆転写産物を特異的に増幅するプライマー対を用いた、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等の定量ＰＣＲ法で検出する方法；上記ｃＤＮＡを、ＣＣＲ８遺伝子検出用プローブ（ビオチン、アビジン等の標識物質でラベルしたＣＣＲ８遺伝子のｃＤＮＡ）が、ガラス、シリコン、プラスチックなどのハイブリダイゼーションに使用可能な支持体上に固定化したものを用いたマイクロアレイで検出する方法；を挙げることができる。
本件判定方法及び本件判定用バイオマーカーにおいて、末梢血単核球試料中のＣＣＲ８タンパク質の発現レベルは、末梢血単核球試料中のＣＣＲ８タンパク質の一部又は全部を特異的に検出できる公知の方法を用いて測定することができる。かかる方法として、具体的には、ＣＣＲ８タンパク質を構成するペプチドを検出する質量分析法や、ＣＣＲ８タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法を挙げることができる。
上記免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロッティング法、フローサイトメトリー等を好適に例示することができる。フローサイトメトリーは、蛍光物質（アロフィコシアニン［ＡＰＣ］、フィコエリトリン［ＰＥ］、ＦＩＴＣ［fluorescein isothiocyanate］、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７等）で標識した、ＣＣＲ８タンパク質に特異的に結合する抗体を用いた蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により行うことができる。ＣＣＲ８タンパク質は細胞表面受容体であることから、ＰＢＭＣ中のＣＣＲ８タンパク質は、生細胞の状態で検出できる。このため、簡便性を考慮すると、フローサイトメトリーを用いることが好ましい。
本件判定方法及び本件判定用バイオマーカーにおいて、ＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡの発現レベル、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの発現レベル、又は前記ＣＣＲ８の発現レベルは、絶対値（例えば、ＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡの濃度、該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの濃度、ＣＣＲ８の濃度、ＣＣＲ８を発現する［ＣＣＲ８陽性の］ＰＢＭＣの数）であっても、相対値（例えば、内部標準に対する前記濃度の比率、全ＰＢＭＣ中のＣＣＲ８陽性のＰＢＭＣの割合）であってもよく、相対値とする場合、例えば、ＲＰＬＰ０、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ等のハウスキーピング遺伝子（内部標準）のｍＲＮＡ、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、又は前記ハウスキーピングタンパク質の発現量を基準とした相対値を挙げることができる。
本件判定方法及び本件判定用バイオマーカーにおいて、「対照者におけるＣＣＲ８発現レベル」は、比較対象である「被験者におけるＣＣＲ８発現レベル」や、「ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮ患者におけるＣＣＲ８発現レベル」に対応するものを用いる。このため、「被験者におけるＣＣＲ８発現レベル」や、「ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮ患者におけるＣＣＲ８発現レベル」を、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、若しくはタンパク質、又はＣＣＲ８陽性のＰＢＭＣに基づき測定する場合、「対照者におけるＣＣＲ８発現レベル」は、それぞれｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、若しくはタンパク質、又はＣＣＲ８陽性のＰＢＭＣに基づき測定する。また、「被験者におけるＣＣＲ８発現レベル」や、「ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮ患者におけるＣＣＲ８発現レベル」が、絶対値又は相対値である場合、「対照者におけるＣＣＲ８発現レベル」は、それぞれ絶対値、相対値である。上記「対照者におけるＣＣＲ８発現レベル」は、本件判定方法を実施する際、対照者から採取された末梢血単核球試料を調製し、その都度測定してもよいが、予め測定したものを用いてもよい。また、上記対照者から採取された末梢血単核球試料は、被験者やＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮ患者由来の末梢血単核球試料と実質的に同じ方法により採取されたものが好ましい。また、「対照者におけるＣＣＲ８発現レベル」の測定に用いた方法は、「被験者におけるＣＣＲ８発現レベル」や、「ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮ患者におけるＣＣＲ８発現レベル」の測定に用いた方法と実質的に同じであることが好ましい。
上記対照者としては、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎及びＰＡＮのいずれか一方、又は両方に罹患していない者（被験者のコントロール）であればよく、健常者の他、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎及びＰＡＮ以外の血管炎に罹患した者を挙げることができ、特に、後述する本実施例において、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎及びＰＡＮの血管炎と；健常者、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎、感染症を合併したＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎、並びにＰＲ３−ＡＮＣＡ血管炎、抗ＧＢＭ抗体関連血管炎、血管炎を伴う全身性エリテマトーデス（Systemic lupus erythematosus；ＳＬＥ）、及び紫斑病性腎炎；とを精度よく判定できることが具体的に示されているため、健常者、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者（特に、感染症を合併したＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者）、並びにＰＲ３−ＡＮＣＡ血管炎、抗ＧＢＭ抗体関連血管炎、血管炎を伴うＳＬＥ、及び紫斑病性腎炎からなる血管炎群から選択される血管炎に罹患した者が好ましい。
本明細書において、「ＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎」とは、以前にＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎であった状態の活動性が、消失した状態を意味し、かかる活動性には、血管における炎症の他、血管以外の組織や臓器における炎症も含まれる。なお、「ＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎」には、ＭＰＯ−ＡＮＣＡが陽性のものも、陰性のものも含まれる。
本明細書において、「ＰＲ３−ＡＮＣＡ血管炎」とは、上述の小型血管に、非免疫複合体性の炎症が認められ、かつ好中球細胞質のプロテイナーゼ３（ＰＲ３）に対する自己抗体（ＰＲ３−ＡＮＣＡ）が陽性である状態を意味する。「ＰＲ３−ＡＮＣＡ血管炎」の具体的な症候又は症状としては、例えば、上述の小型血管炎の症候又は症状を挙げることができる。
また、上記「ＰＲ３−ＡＮＣＡが陽性である」とは、血液中のＰＲ３−ＡＮＣＡ抗体価が、基準値以上であることを意味する。かかる基準値は、診断基準や各施設、測定方法によって異なるため、一概に特定することはできないが、例えば、ＥＬＩＳＡ法により約２．０Ｕ／ｍＬである。
本明細書において、「抗ＧＢＭ抗体関連血管炎」とは、上述の小型血管に、免疫複合体性の炎症が認められ、かつ糸球体基底膜（Glomerular basement membrane；ＧＢＭ）に対する抗体（抗ＧＢＭ抗体）が陽性である状態を意味する。かかる免疫複合体性の炎症は、抗ＧＢＭ抗体が、上述の小型血管の血管壁に沈着することによって生じる。「抗ＧＢＭ抗体関連血管炎」の具体的な症候又は症状としては、例えば、上述の小型血管炎の症候又は症状を挙げることができる。
また、上記「抗ＧＢＭ抗体が陽性である」とは、血液中の抗ＧＢＭ抗体価が、基準値以上であることを意味する。かかる基準値は、診断基準や各施設、測定方法によって異なるため、一概に特定することはできないが、例えば、ＥＬＩＳＡ法により約３．５Ｕ／ｍＬである。
上記「約○○Ｕ／ｍＬ」における「約」の範囲とは、通常±０．５Ｕ／ｍＬの範囲内、好ましくは±０．４Ｕ／ｍＬの範囲内、より好ましくは±０．３Ｕ／ｍＬの範囲内、さらに好ましくは±０．２Ｕ／ｍＬの範囲内、最も好ましくは±０．１Ｕ／ｍＬの範囲内を意味する。
本明細書において、「紫斑病性腎炎（Henoch-Schonlein purpura nephritis；ＨＳＰＮ）」とは、全身性の血管炎であるHenoch-Schonlein紫斑病（Henoch-Schonleinpurpura；ＨＳＰ）に伴い、腎糸球体の毛細血管において、免疫複合体性の炎症が認められた状態を意味する。
本件判定方法の工程（ｂ）において、「被験者におけるＣＣＲ８発現レベル」を、「対照者におけるＣＣＲ８発現レベル」と比較し、「被験者におけるＣＣＲ８発現レベル」が、「対照者におけるＣＣＲ８発現レベル」よりも高い場合、被験者は、（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎ではなく）ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮに罹患している可能性が高いと評価（判定）し、「被験者におけるＣＣＲ８発現レベル」が、「対照者におけるＣＣＲ８発現レベル」よりも高くない場合、被験者は、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮに罹患している可能性が低いと評価（判定）する。「被験者におけるＣＣＲ８発現レベル」が、「対照者におけるＣＣＲ８発現レベル」よりも高いか否かを判定するために、閾値（カットオフ値）は任意のものを設定することができ、かかる閾値としては、例えば、「対照者におけるＣＣＲ８発現レベル」の平均値、「平均値＋標準偏差（ＳＤ）」、「平均値＋２ＳＤ」、「平均値＋３ＳＤ」、中央値、「中央値＋ＳＤ」、「中央値＋２ＳＤ」、「中央値＋３ＳＤ」等を挙げることができる。また、閾値は、感度（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者又はＰＡＮ患者を、正しく陽性と判定できる割合）及び特異度（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮに罹患していない者を、正しく陰性と判定できる割合）が高くなるように、「被験者におけるＣＣＲ８発現レベル」のデータと、「対照者におけるＣＣＲ８発現レベル」のデータを基に、統計解析ソフトウェアを用いたＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を用いて算出することもできる。
上記ＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡとしては、具体的に、配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（ヒトＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡ［NCBI Reference Sequence：NM_005201］）、或いは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するポリヌクレオチドを挙げることができる。
また、上記ＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡとしては、具体的に、配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（ヒトＣＣＲ８をコードするｃＲＮＡ）、或いは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するポリヌクレオチド（ヒトＣＣＲ８をコードするｃＲＮＡのバリアント）を挙げることができる。
また、上記ＣＣＲ８としては、具体的に、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ヒトＣＣＲ８［NCBI Reference Sequence：NP_005192］）、或いは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ対照者と比較して被験者における発現が増加するタンパク質を挙げることができる。
上記「１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列」とは、通常１〜１０個の範囲内、好ましくは１〜７個の範囲内、より好ましくは１〜６個の範囲内、さらに好ましくは１〜５個の範囲内、より好ましくは１〜４個の範囲内、さらに好ましくは１〜３個の範囲内、より好ましくは１〜２個の範囲内、最も好ましくは１個の数のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列を意味する。
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、通常１〜１０個の範囲内、好ましくは１〜７個の範囲内、より好ましくは１〜６個の範囲内、さらに好ましくは１〜５個の範囲内、さらにより好ましくは１〜４個の範囲内、特に好ましくは１〜３個の範囲内、特により好ましくは１〜２個の範囲内、最も好ましくは１個の数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。
本件判定用キット１におけるプライマーとしては、末梢血単核球試料中のＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡ、又は該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの上流若しくは下流の配列の一部とアニーリングしうる相補的なプライマーセット（便宜上、それぞれ「フォワードプライマー及びリバースプライマー」という）であれば、プライマー配列の長さ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとアニーリングする部位、増幅するｃＤＮＡの長さ等は、ｃＤＮＡの増幅効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。例えば、プライマー配列の長さとしては、通常１０〜１００塩基長であり、好ましくは１０〜４０塩基長であり、より好ましくは１０〜３０塩基長であり、さらに好ましくは１５〜３０塩基長である。
上記フォワードプライマー及びリバースプライマーは、通常、鋳型ＤＮＡである上記ヒトＣＣＲ８をコードするｃＲＮＡ、又はそのバリアントが特異的に生成されるように選択される。すなわち、上記ヒトＣＣＲ８をコードするｃＲＮＡ、又はそのバリアントにおいて、ヌクレオチド配列の１番目を上流とし、末尾を下流とした場合、フォワードプライマーの３’末端におけるヌクレオチドは、フォワードプライマーとリバースプライマーによる二本鎖ＤＮＡ形成（プライマーダイマー形成）による擬陽性を回避することも考慮すると、通常、リバースプライマーの３’末端におけるヌクレオチドよりも少なくとも上流にアニールするように選択される。
上記フォワードプライマー及びリバースプライマーは、その少なくとも一部が鋳型ＤＮＡ（上記ヒトＣＣＲ８をコードするｃＲＮＡ、又はそのバリアント）の一部とアニール（ハイブリダイズ）し、かつ、ＰＣＲにより増幅産物を生成できるものであればよく、ここでフォワードプライマー又はリバースプライマーの「少なくとも一部」とは、通常、フォワードプライマー又はリバースプライマーのヌクレオチド配列に対して６０％以上を意味し、好ましくは６５％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは７５％以上であり、さらにより好ましくは８０％以上であり、特に好ましくは８５％以上であり、最も好ましくは９０％以上を意味する。
本件判定用キット１におけるプローブとしては、末梢血単核球試料中のＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡ、又は該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの一部又は全部がハイブリダイゼーションするプローブであれば、プローブの長さ、ハイブリダイズする部位等は、ハイブリダイゼーションの効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。例えば、プローブの長さは、通常５０〜２０００塩基長であり、好ましくは１００〜１５００塩基長であり、より好ましくは２００〜１０００塩基長であり、さらに好ましくは３００〜８００塩基長である。
上記プローブは、通常、鋳型ＤＮＡである上記ヒトＣＣＲ８をコードするｃＲＮＡ、又はそのバリアントにアニール（ハイブリダイズ）するように選択される。この場合、上記プローブは、その少なくとも一部が鋳型ＤＮＡ（上記ヒトＣＣＲ８をコードするｃＲＮＡ、又はそのバリアント）の一部とアニール（ハイブリダイズ）できるものであればよく、ここでプローブの「少なくとも一部」とは、通常、プローブのヌクレオチド配列に対して６０％以上を意味し、好ましくは６５％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは７５％以上であり、さらにより好ましくは８０％以上であり、特に好ましくは８５％以上であり、最も好ましくは９０％以上を意味する。
本件判定用キット２における抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの抗体であってもよく、また、この中には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）２などの抗体の一部からなる抗体断片も含まれる。
本件判定用キット１や２の標識物における標識物質としては、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein；ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescence Protein；ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescence Protein；ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescence Protein；ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Red Fluorescence Protein；ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（luciferase）等の蛍光タンパク質、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質を挙げることができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
１．ＣＣＲ８が、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎及びＰＡＮの判定用バイオマーカーであることの確認
１−１ 方法
［定量ＰＣＲ］
６種類の血管炎患者（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者３２名、ＰＲ３−ＡＮＣＡ血管炎患者４名、ＰＡＮ患者８名、抗ＧＢＭ抗体関連血管炎患者３名、血管炎を伴うＳＬＥ患者５名、及びＨＳＰＮ患者１０名）、及び健常者２５名から、ＢＤバキュテイナＣＰＴ採血管（Becton Dickinson社製）を用いて末梢血を採取し、密度勾配遠心分離法により末梢血単核球（Peripheral Blood Mononuclear Cells；ＰＢＭＣ）を単離した。単離したＰＢＭＣよりNucleoSpin RNA Blood（TaKaRa社製）を用いて添付のプロトコールにしたがってトータルＲＮＡを精製した。ＲＮＡの精度をバイオアナライザー（Agilent社製）にて確認した後、PrimeScript RT reagent（TaKaRa社製）を用いてｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡを鋳型としてSYBR Premix Ex Taq（TaKaRa社製）と、ＣＣＲ８遺伝子検出用プライマーセット及び内部コントロールであるＲＰＬＰ０遺伝子検出用プライマーセット（いずれも、Fasmac社製の合成オリゴＤＮＡ）とを用い、定量ＰＣＲを行った。デルタデルタＣｔ法により、ＲＰＬＰ０遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物のＣｔ値を基準としたＣＣＲ８遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物のＣｔ値の相対値（図１の縦軸「ＣＣＲ８発現レベル」に相当）を定量化した。
［フローサイトメトリー］
ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者及び健常者由来のＰＢＭＣを、上記［定量ＰＣＲ］の項目に記載の方法にしたがって単離し、蛍光物質で標識したＣＣＲ８に対する抗体（human/Rat CCR8 PE-conjugated Antibody；R&D Systems社製）、又は蛍光物質で標識したラットＩｇＧコントロール抗体（Rat IgG PE-conjugated Antibody；R&D Systems社製）を用いて３０分間、４℃条件下で抗原抗体反応を行った。次いで、細胞核を、１０μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ（Life Technologies社製）で染色し、ＣＣＲ８陽性のＰＢＭＣの割合（図３中の「Ｐ５」の領域）を、フローサイトメーター（FACSCantII、BD Biosciences社製）を用いて解析した。なお、図３中の「Ｐ４」の領域は、ラットＩｇＧコントロール抗体で検出される非特異的な蛍光シグナルを有するＰＢＭＣ（ＣＣＲ８陰性のＰＢＭＣ）を示す。
１−２ 結果
［定量ＰＣＲ］
ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者、及びＰＡＮ患者由来のＰＢＭＣ試料におけるＣＣＲ８遺伝子のｃＤＮＡの発現レベルは、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎及びＰＡＮ以外の血管炎患者（ＰＲ３−ＡＮＣＡ血管炎患者、抗ＧＢＭ抗体関連血管炎患者、血管炎を伴うＳＬＥ患者、及びＨＳＰＮ患者）や健常者と比べ、高いことが示された（図１参照）。例えば、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者由来のＰＢＭＣにおけるＣＣＲ８遺伝子のｃＤＮＡの発現レベルは、３．３８±２．０６（平均値±標準誤差）であり、健常者由来のＰＢＭＣにおける発現レベル（１．１０±０．４２）と比べ、３．１倍増加していた。
この結果は、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者及びＰＡＮ患者由来のＰＢＭＣ試料におけるＣＣＲ８遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の発現レベルは、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎及びＰＡＮに罹患していない者における発現レベルと比べ、高いことを示している。
図１の定量ＰＣＲで得られた、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者及び健常者における発現レベルを基に、ＲＯＣ曲線を作成したところ、ＡＵＣ（area under the curve）値は、０．９２３と高い値を示した。また、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者と、健常者とを区別するためのカットオフ値として、２．１を設定したところ、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎の感度（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者中で検査陽性者の割合）及び特異度（健常者中で検査陰性者の割合）は、それぞれ８７．５％及び１００％であった。また、すべてのＰＡＮ患者におけるＣＣＲ８遺伝子のｃＤＮＡの発現レベルは、２．１よりも高かった。
これらの結果は、ＰＢＭＣ試料中のＣＣＲ８遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の発現レベルを測定し、適切なカットオフ値を設定すると、かかる発現レベルを指標として、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎やＰＡＮを判定（診断）できることを示している。
［フローサイトメトリー］
ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者由来のＰＢＭＣ試料におけるＣＣＲ８陽性のＰＢＭＣの割合は、１５．５％であり、健常者におけるＣＣＲ８陽性のＰＢＭＣの割合（２．９％）と比べ、高いことが示された（図３参照）。
この結果は、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者由来のＰＢＭＣ試料におけるＣＣＲ８タンパク質の発現レベルは、健常者における発現レベルと比べ、高いことを示しており、上記定量ＰＣＲの結果を支持している。
２．ＣＣＲ８が、活動期特異的なＭＰＯ−ＡＮＣＡ血管炎の判定用バイオマーカーであることの確認
２−１ 方法
３種類のＭＰＯ−ＡＮＣＡ血管炎患者（活動期血管炎患者３２名、寛解期血管炎患者３６名、及び感染症を合併した寛解期血管患者１３名）から、実施例１の項目「１−１ 方法［定量ＰＣＲ］」に記載の方法に従って、ＰＢＭＣ試料におけるＣＣＲ８遺伝子のｃＤＮＡの発現レベルを測定した。
２−２ 結果
ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者由来のＰＢＭＣ試料におけるＣＣＲ８遺伝子のｃＤＮＡの発現レベルは、３．７４±２．１２（平均値±標準誤差）であり、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者、及び感染症を合併したＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者における発現レベル（それぞれ１．２１±０．６３及び１．１１±０．４２）と比べ、それぞれ３倍以上高かった（図２参照）。
この結果は、活動期のＭＰＯ−ＡＮＣＡ血管炎患者由来のＰＢＭＣ試料におけるＣＣＲ８遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の発現レベルは、寛解期のＭＰＯ−ＡＮＣＡ血管炎患者（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者や、感染症を合併したＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管患者）における発現レベルと比べ、高いことを示している。
図２の定量ＰＣＲで得られた、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者及びＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者における発現レベルを基に、ＲＯＣ曲線を作成したところ、ＡＵＣ値は、０．９０７と高い値を示した。また、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者と、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者とを区別するためのカットオフ値として、２．１を設定したところ、活動期のＭＰＯ−ＡＮＣＡ血管炎の感度（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者中で検査陽性者の割合）及び特異度（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者中で検査陰性者の割合）は、それぞれ８７．５％及び９１．７％であった。
また、図２の定量ＰＣＲで得られた、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者及び感染症を合併したＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者における発現レベルを基に、ＲＯＣ曲線を作成したところ、ＡＵＣ値は、０．９２４と高い値を示した。また、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者と、感染症を合併したＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者とを区別するためのカットオフ値として、２．１を設定したところ、活動期のＭＰＯ−ＡＮＣＡ血管炎の感度（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎患者中で検査陽性者の割合）及び特異度（感染症を合併したＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者中で検査陰性者の割合）は、それぞれ８７．５％及び１００％であった。
これらの結果は、ＰＢＭＣ試料中のＣＣＲ８遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の発現レベルを測定し、適切なカットオフ値を設定すると、かかる発現レベルを指標として、活動期特異的なＭＰＯ−ＡＮＣＡ血管炎を判定（診断）できることを示している。
本発明は、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎及び結節性多発動脈炎の診断や治療の他、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎に起因する疾患（例えば、顕微鏡的多発血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎）の予防に資するものである。

Claims (6)

  1. 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする、
    好中球細胞質のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対する抗体（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ）が陽性の活動期血管炎（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎）、又は
    結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）
    の判定方法。
    （ａ）被験者から採取された末梢血単核球試料中のケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）をコードするｍＲＮＡの発現レベル、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの発現レベル、又は前記ＣＣＲ８の発現レベルを測定する工程；
    （ｂ）工程（ａ）で測定した発現レベルを、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮに罹患していない対照者における発現レベルと比較する工程；
    （ｃ）工程（ａ）で測定した発現レベルが、対照者における発現レベルよりも高い場合、被験者は、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮに罹患している可能性が高いと評価する工程；
  2. 対照者が、健常者；ＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者；又は好中球細胞質のプロテイナーゼ３（ＰＲ３）に対する抗体（ＰＲ３−ＡＮＣＡ）が陽性の血管炎（ＰＲ３−ＡＮＣＡ血管炎）、抗ＧＢＭ抗体関連血管炎、血管炎を伴う全身性エリテマトーデス、及び紫斑病性腎炎からなる群から選択される血管炎に罹患した者；であることを特徴とする請求項１に記載の判定方法。
  3. 末梢血単核球試料中のケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）をコードするｍＲＮＡの発現、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー又はプローブ、若しくはそれらの標識物を含むことを特徴とする、
    好中球細胞質のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対する抗体（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ）が陽性の活動期血管炎（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎）、又は
    結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）
    の判定用キット。
  4. 末梢血単核球試料中のケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）に特異的に結合する抗体、又はその標識物を含むことを特徴とする、
    好中球細胞質のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対する抗体（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ）が陽性の活動期血管炎（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎）、又は
    結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）
    の判定用キット。
  5. ケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）をコードするｍＲＮＡ、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、又は、前記ＣＣＲ８からなることを特徴とする、
    好中球細胞質のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対する抗体（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ）が陽性の活動期血管炎（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎）、又は
    結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）
    の判定用バイオマーカーであって、
    ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮを罹患している者から採取された末梢血単核球試料中のＣＣＲ８をコードするｍＲＮＡの発現レベル、若しくは該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの発現レベル、又は、前記ＣＣＲ８の発現レベルが、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ活動期血管炎又はＰＡＮを罹患していない対照者における前記ＣＣＲ８の発現レベルと比べ、高い、
    前記判定用バイオマーカー。
  6. 対照者が、健常者；ＭＰＯ−ＡＮＣＡ寛解期血管炎患者；又は好中球細胞質のプロテイナーゼ３（ＰＲ３）に対する抗体（ＰＲ３−ＡＮＣＡ）が陽性の血管炎（ＰＲ３−ＡＮＣＡ血管炎）、抗ＧＢＭ抗体関連血管炎、血管炎を伴う全身性エリテマトーデス、及び紫斑病性腎炎からなる群から選択される血管炎に罹患した者；であることを特徴とする請求項５に記載の判定用バイオマーカー。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023229050A1 (ja) * 2022-05-24 2023-11-30 国立研究開発法人 産業技術総合研究所 診断用マーカー
WO2024004580A1 (ja) * 2022-06-30 2024-01-04 国立大学法人千葉大学 血管炎への罹患状態またはｃｏｖｉｄ－１９の重症化リスクを検査する方法、検査用キット、コンパニオン診断薬、および検査用マーカー

Non-Patent Citations (1)

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Title
SILKE R. BRIX ET AL.: ""CC Chemokine Ligand 18 in ANCA-Associated Crescentic GN"", J AM SOC NEPHROL, vol. 26, no. 9, JPN6021021378, 2015, pages 2105 - 2117, ISSN: 0004654787 *

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