JP6531306B2 - 炎症性筋疾患鑑別マーカー及びそれを用いた炎症性筋疾患と非炎症性筋疾患の鑑別方法 - Google Patents
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Description
(2)IP-10が以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である、(1)に記載の炎症性筋疾患鑑別マーカー。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつIP-10の活性を有するタンパク質、及び
(c)配列番号1で示されるアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつIP-10の活性を有するタンパク質
(3)エオタキシンが以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である、(1)に記載の炎症性筋疾患鑑別マーカー。
(a)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号3で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつエオタキシンの活性を有するタンパク質、及び
(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつエオタキシンの活性を有するタンパク質
(4)IP-10遺伝子若しくはエオタキシン遺伝子の転写産物、又はその核酸断片からなり、炎症性筋疾患を鑑別することを特徴とする炎症性筋疾患鑑別マーカー。
(5)IP-10遺伝子が以下の(a)〜(d)のいずれかの遺伝子である、(4)に記載の炎症性筋疾患鑑別マーカー。
(a)配列番号2で示される塩基配列からなる遺伝子、
(b)配列番号2で示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつIP-10の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
(c)配列番号2で示される塩基配列に対して90%以上の塩基同一性を有する塩基配列からなり、かつIP-10の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、及び
(d)配列番号2に示す塩基配列に相補的な塩基配列の一部と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつIP-10の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(6)エオタキシン遺伝子が以下の(a)〜(d)のいずれかの遺伝子である、(4)に記載の炎症性筋疾患鑑別マーカー。
(a)配列番号4で示される塩基配列からなる遺伝子、
(b)配列番号4で示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつエオタキシンの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
(c)配列番号4で示される塩基配列に対して90%以上の塩基同一性を有する塩基配列からなり、かつエオタキシンの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、及び
(d)配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列の一部と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつエオタキシンの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(7)(1)〜(3)のいずれかに記載の炎症性筋疾患鑑別マーカーを特異的に認識する抗体を少なくとも一つ含む炎症性筋疾患鑑別キット。
(8)炎症性筋疾患を鑑別する方法であって、筋疾患に罹患している被験体から採取された試料の単位量あたりに含まれる炎症性筋疾患鑑別マーカーの量を測定してその測定値を得る測定工程、前記測定工程で得られた被験体の測定値を、非炎症性筋疾患の個体群から採取された試料の単位量あたりに含まれる前記炎症性筋疾患鑑別マーカーの測定値と比較したときに、(A)被験体の測定値が前記個体群の測定値よりも統計学的に有意に高い場合、又は(B)被験体の測定値が前記個体群の測定値におけるカットオフ値よりも高い場合に被験体は炎症性筋疾患に罹患していると判定する比較判定工程を含み、前記炎症性筋疾患鑑別マーカーがIP-10若しくはエオタキシン、又はそのペプチド断片からなる、前記炎症性筋疾患の鑑別方法。
(9)IP-10が以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である、(8)に記載の炎症性筋疾患の鑑別方法。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつIP-10の活性を有するタンパク質、及び
(c)配列番号1で示されるアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつIP-10の活性を有するタンパク質
(10)エオタキシンが以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である、(8)に記載の炎症性筋疾患の鑑別方法。
(a)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号3で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつエオタキシンの活性を有するタンパク質、及び
(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつエオタキシンの活性を有するタンパク質
(11)前記カットオフ値が90パーセンタイルである、(8)〜(10)のいずれかに記載の炎症性筋疾患の鑑別方法。
(12)前記試料が血漿である、(8)〜(11)のいずれかに記載の炎症性筋疾患の鑑別方法。
1−1.概要
本発明の第1の態様は炎症性筋疾患鑑別マーカーである。本発明の炎症性筋疾患鑑別マーカーは、筋疾患に罹患している被験体において炎症性筋疾患を鑑別することができるバイオマーカーである。本発明の炎症性筋疾患鑑別マーカーによれば、従来困難であった炎症性筋疾患と非炎症性筋疾患の罹患の鑑別が可能となる。それによって、それぞれの疾患に対する適切な治療薬の処方又は処置が可能になる。
「筋疾患」は、骨格筋に生じる異常により筋力低下等の筋症状を呈する筋原性疾患である。筋断裂等の物理的な要因による筋傷害は含まれないが、本明細書においても「筋疾患」は、筋原性疾患のみを意味する狭義の疾患とする。筋疾患は、病因によって炎症性筋疾患と非炎症性筋疾患に大別することができる。
本発明の炎症性筋疾患鑑別マーカーは、IP-10若しくはエオタキシン、又はそのペプチド断片、あるいはIP-10遺伝子若しくはエオタキシン遺伝子の転写産物、又はその核酸断片からなる。
「IP-10(インターフェロンγ誘導タンパク質10:Interferon Gamma Inducible Protein 10)」は、CXCL10とも呼ばれる炎症性サイトカインの一種である。IP-10は、IFNγ又はその他の炎症性サイトカインや刺激に応答して単球、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞等の細胞から誘導され、単球・マクロファージ、T細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞に対する化学誘導、T細胞の内皮細胞への接着、抗ガン活性、及び血管新生の阻害等において機能する。
「エオタキシン(Eotaxin:Eotaxin-1)」は、CCL11とも呼ばれるCCケモカインの一種である。エオタキシンは、線維芽細胞、血管内皮細胞、上皮細胞から産生され、好酸球の細胞表面に発現するCCケモカイン受容体CCR3に特異的に結合し、好酸球の遊走を誘導することによりアレルギー反応に関与することが知られている。
2−1.概要
本発明の第2の態様は、炎症性筋疾患鑑別方法である。本発明は、第1態様に記載の炎症性筋疾患鑑別マーカーを用いて、筋疾患に罹患した被験体における炎症性筋疾患の罹患を鑑別することができる。それによって、被験体が炎症性筋疾患罹患個体であるか非炎症性筋疾患罹患個体であるかの診断を補助することが可能となる。本発明の鑑別方法を用いることで、被験体を、その被験体が罹患している筋疾患に適した治療法で処置することができる。
本発明の鑑別方法は、測定工程及び比較判定工程を含む。以下、各工程について具体的に説明をする。
「測定工程」とは、筋疾患に罹患している被験体から採取された試料の単位量あたりに含まれる第1態様に記載の炎症性筋疾患鑑別マーカーを定量するため、その量を測定して測定値を得る工程である。
本明細書において「被験体」とは、本発明の鑑別方法に供される動物個体をいう。ここでいう動物は、哺乳動物又は鳥類が該当する。本発明の鑑別方法に供される哺乳動物には、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウサギ、フェレット、ハムスター、マウス等が挙げられる。好ましくはヒト、イヌ、ネコ、及びウマであり、より好ましくはヒトである。 本明細書において「筋疾患に罹患している被験体」とは、筋疾患の症状を呈する被験体であって、原則として医師又は獣医師により筋疾患と診断された個体をいう。被験体がヒトの場合は、筋疾患患者が該当する。筋疾患の診断は、主として問診、臨床経過、身体診察所見、及び筋病理所見等を組み合わせて行われる。本明細書における筋疾患に罹患している被検体は、健常体ではなく、炎症性筋疾患又は非炎症性筋疾患に罹患していることを前提とする。いずれに罹患しているかは明らかでなくともよい。なお、本明細書では、「筋疾患に罹患している被験体」をしばしば単に「被験体」として表記する。
炎症性筋疾患鑑別マーカーがIP-10若しくはエオタキシン、又はそのペプチド断片の場合、その測定方法は、公知のペプチド定量方法であればよく、特に限定はしない。例えば、免疫学的検出法、アプタマー解析法、又は質量分析法が挙げられる。また、炎症性筋疾患鑑別マーカーがIP-10 mRNA若しくはエオタキシンmRNA、又はその核酸断片の場合、その測定方法は、公知の核酸定量方法であればよく、特に限定はしない。例えば、核酸増幅法、ハイブリダイゼーション法、又はRNaseプロテクション法が挙げられる。以下、各測定方法について説明をする。
「免疫学的検出法」は、抗原である標的分子と特異的に結合する抗体又は抗体断片を用いて、標的分子を定量する方法である。本発明では、炎症性筋疾患鑑別マーカーであるIP-10若しくはエオタキシン、又はそのペプチド断片が標的分子に該当する。
「アプタマー解析法」は、アプタマーを用いて、標的分子を定量する方法である。アプタマーは、立体構造によって標的物質と強固、かつ特異的に結合し、標的物質の機能を特異的に抑制する能力を持つリガンド分子であり、その分子の種類により、核酸アプタマーとペプチドアプタマーに大別することができるが、いずれのアプタマーであってもよい。好ましくは核酸アプタマーである。本発明では、炎症性筋疾患鑑別マーカーであるIP-10若しくはエオタキシン、又はそのペプチド断片がアプタマーの標的分子となる。
「質量分析法(Mass Spectrometry)」は、試料を高真空下でイオン化し、そのイオンを電磁的に分離して試料中の物質を分析する方法である。試料中の検出すべき標的分子が明らかな場合、その標的分子を標品とした質量スペクトルと試料の質量スペクトルを比較することにより、視聴中の標的分子の検出及び定量を行うことができる。本発明では、炎症性筋疾患鑑別マーカーであるIP-10若しくはエオタキシン、又はそのペプチド断片が標的分子に該当する。
「核酸増幅法」は、フォワード/リバースプライマーセット用いて、標的核酸の特定の領域を核酸ポリメラーゼによって増幅させる方法をいう。例えば、PCR法(RT-PCR法を含む)、NASBA法、ICAN法、LAMP(登録商標)法(RT-LAMP法を含む)が挙げられる。好ましくはPCR法である。本方法で用いる炎症性筋疾患鑑別マーカーは、IP-10 mRNA若しくはエオタキシン mRNA又はその核酸断片であることから、通常は、逆転写反応(RT反応)を介した核酸増幅法、例えば、RT-PCR法又はRT-LAMP法が採用される。特に本発明では、筋細胞等の試料中に存在する炎症性筋疾患鑑別マーカー量を測定する必要があるため、リアルタイムRT-PCR法のような定量的核酸増幅法を用いることが好ましい。
「ハイブリダイゼーション法」は、検出すべき標的核酸の塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列を有する核酸断片をプローブとして用い、その核酸と該プローブ間の塩基対合を利用して、標的核酸若しくはその断片を検出、定量する方法である。ハイブリダイゼーション法には、検出手段の異なるいくつかの方法が知られているが、本発明では、標的核酸がmRNAであることから、例えば、ノザンハイブリダイゼーション法(ノザンブロットハイブリダイゼーション法)、RNAマイクロアレイ法、表面プラズモン共鳴法又は水晶振動子マイクロバランス法が好ましい。表面プラズモン共鳴法又は水晶振動子マイクロバランス法については、前述のとおりである。
「比較判定工程」とは、前記測定工程で得られた被験体の測定値と、非炎症性筋疾患の個体群における測定値を比較して、その結果に基づいて、筋疾患に罹患している被検体が炎症性筋疾患に罹患していることを判定する工程である。
本明細書において「カットオフ値」とは、測定値を陽性、陰性に分類するための境界値をいう。ここでいう陽性とは、炎症性筋疾患に罹患している可能性が高いことを、また陰性とは非炎症性筋疾患に罹患している可能性が高いことを、それぞれ示す。カットオフ値の設定法は特に限定しない。例えば、非炎症性筋疾患の個体群における測定値をパーセンタイルで分類し、その分類に用いたパーセンタイル値をカットオフ値とすることができる。具体的には、個体群の測定値の90パーセンタイルで被検体の測定値の陽性又は陰性を分類した場合、90パーセンタイルがカットオフ値となる。
陽性に分類された場合、その被験体は炎症性筋疾患に罹患している可能性が高いと判定する。例えば、被検体におけるIP-10の測定値が非炎症性筋疾患の個体群の測定値の90パーセンタイルより大きい値を示した場合、その被検体は、炎症性疾患に罹患している可能性が高いと判定する。一方、90パーセンタイル以下の値を示した場合、その被検体は、非炎症性疾患に罹患している可能性が高いと判定する。他にも、Akobeng AKActa, 2007, Paediatr, 96:644-647に記載の算出方法に基づいて設定することができる。
本態様の判定方法では、前記測定工程において、第1態様に記載の炎症性筋疾患鑑別マーカーのいずれか1つを使用すればよいが、2つ以上を組み合わせて測定することもできる。複数の炎症性筋疾患鑑別マーカーを組み合わせて測定することによって、炎症性筋疾患の鑑別精度を一層高めることができる。
3−1.概要
本発明の第3の態様は、炎症性筋疾患鑑別キットである。本発明のキットは、筋疾患に罹患している被験体が炎症性筋疾患又は非炎症性筋疾患のいずれに罹患しているかを、医師や獣医師の手を介することなく、簡便かつ高精度に鑑別することができる。
本発明の炎症性筋疾患鑑別キットは、必須の構成物として第1態様に記載の炎症性筋疾患鑑別マーカーの少なくとも一つを検出するための試薬を含む。
1.検体の収集と試料の採取
本発明の炎症性筋疾患鑑別マーカーを選択するための検体は、研究目的での使用に書面で同意が得られ、国立精神・神経医療研究センター(東京、日本)に送られた炎症性筋疾患患者100名及び非炎症性筋疾患患者50名の血液から得られた凍結保存血漿を対象にした。表1に筋疾患患者150例についての検体情報を示す。
各炎症性筋疾患患者と非炎症性筋疾患患者の血漿について、Bio-Plex Pro Human Cytokine Group I Panel 27-Plex in Bio-Plex 200 system(Bio-Rad社)を用いて27種類のサイトカイン濃度を測定した。測定方法については、添付のプロトコルに従った。具体的には、既定の希釈液で血漿を4倍希釈し、ウェル内で各種サイトカインに対する抗体と結合したビーズ(2種の蛍光色素とその量比によって識別可能)と反応させた。その後、ビオチン標識検出用抗体、次いで蛍光標識ストレプトビオチンと反応させレポーターとした。赤色レーザー(635 nm)によってビーズを標識している蛍光色素を励起させ、それを検出することでサイトカインの種類を識別し、また緑色レーザー(525 nm)によって励起させたレポーターの蛍光強度を測定し、検量線(標準曲線)をもとに各サイトカインの濃度を算定した。ここでは一検体に対し二重測定を行い、その平均値を解析した。
表2、図1及び図2に示すように、IP-10及びエオタキシンの血漿中濃度が各炎症性筋疾患において非炎症性筋疾患群より統計学的に有意に高値を示した(P<0.01)。
Claims (12)
- インターフェロンγ誘導タンパク質10若しくはエオタキシン、又はそのペプチド断片からなり、非炎症性筋疾患と炎症性筋疾患とを識別することを特徴とする炎症性筋疾患鑑別マーカー。
- インターフェロンγ誘導タンパク質10が以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である、請求項1に記載の炎症性筋疾患鑑別マーカー。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターフェロンγ誘導タンパク質10の活性を有するタンパク質、及び
(c)配列番号1で示されるアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインターフェロンγ誘導タンパク質10の活性を有するタンパク質 - エオタキシンが以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である、請求項1に記載の炎症性筋疾患鑑別マーカー。
(a)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号3で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつエオタキシンの活性を有するタンパク質、及び
(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつエオタキシンの活性を有するタンパク質 - インターフェロンγ誘導タンパク質10遺伝子若しくはエオタキシン遺伝子の転写産物、又はその核酸断片からなり、非炎症性筋疾患と炎症性筋疾患とを識別することを特徴とする炎症性筋疾患鑑別マーカー。
- インターフェロンγ誘導タンパク質10遺伝子が以下の(a)〜(d)のいずれかの遺伝子である、請求項4に記載の炎症性筋疾患鑑別マーカー。
(a)配列番号2で示される塩基配列からなる遺伝子、
(b)配列番号2で示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつインターフェロンγ誘導タンパク質10の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
(c)配列番号2で示される塩基配列に対して90%以上の塩基同一性を有する塩基配列からなり、かつインターフェロンγ誘導タンパク質10の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、及び
(d)配列番号2に示す塩基配列に相補的な塩基配列の一部と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつインターフェロンγ誘導タンパク質10の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子 - エオタキシン遺伝子が以下の(a)〜(d)のいずれかの遺伝子である、請求項4に記載の炎症性筋疾患鑑別マーカー。
(a)配列番号4で示される塩基配列からなる遺伝子、
(b)配列番号4で示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつエオタキシンの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
(c)配列番号4で示される塩基配列に対して90%以上の塩基同一性を有する塩基配列からなり、かつエオタキシンの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、及び
(d)配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列の一部と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつエオタキシンの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載の炎症性筋疾患鑑別マーカーを特異的に認識する抗体を少なくとも一つ含む炎症性筋疾患鑑別キット。
- 炎症性筋疾患を鑑別する方法であって、
筋疾患に罹患している被験体から採取された試料の単位量あたりに含まれる炎症性筋疾患鑑別マーカーの量を測定してその測定値を得る測定工程、
前記測定工程で得られた被験体の測定値を、非炎症性筋疾患の個体群から採取された試料の単位量あたりに含まれる前記炎症性筋疾患鑑別マーカーの測定値と比較したときに、(1)被験体の測定値が前記個体群の測定値よりも統計学的に有意に高い場合、又は
(2)被験体の測定値が前記個体群の測定値におけるカットオフ値よりも高い場合に
被験体は炎症性筋疾患に罹患していると判定する比較判定工程を含み、
前記炎症性筋疾患鑑別マーカーがインターフェロンγ誘導タンパク質10若しくはエオタキシン、又はそのペプチド断片からなる、前記炎症性筋疾患の鑑別方法。 - インターフェロンγ誘導タンパク質10が以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である、請求項8に記載の炎症性筋疾患の鑑別方法。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターフェロンγ誘導タンパク質10の活性を有するタンパク質、及び
(c)配列番号1で示されるアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインターフェロンγ誘導タンパク質10の活性を有するタンパク質 - エオタキシンが以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である、請求項8に記載の炎症性筋疾患の鑑別方法。
(a)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号3で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつエオタキシンの活性を有するタンパク質、及び
(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつエオタキシンの活性を有するタンパク質 - 前記カットオフ値が90パーセンタイルである、請求項8〜10のいずれか一項に記載の炎症性筋疾患の鑑別方法。
- 前記試料が血漿である、請求項8〜11のいずれか一項に記載の炎症性筋疾患の鑑別方法。
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