JP2023002483A - 昆虫細胞におけるアデノ随伴ウイルスベクターの産生 - Google Patents

昆虫細胞におけるアデノ随伴ウイルスベクターの産生 Download PDF

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Abstract

【課題】大量の強力なｒＡＡＶ粒子の産生を可能にする効率的かつ改良された方法を提供する。【解決手段】組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのインビトロでの効力を増大させるための方法であって、昆虫細胞を、各々が異種配列を含む１つまたは複数の組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびにｒＡＡＶベクターのインビトロでの効力が、参照標準と比較して１０％～５００％の間となり、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピングが６５％以下となり、かつＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下となる、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが上記指定の割合となるように、昆虫細胞を適切な条件下で培養する時間を最適化するステップを含む方法である。【選択図】なし

Description

配列表の参照
本願は配列表を有しており、これはＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、ここで参照によってその全体が組み込まれる。２０２２年５月５日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、ＰＣ０７２６５２ＡＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、５９，３４６バイトのサイズである。
本発明の分野
本開示は、昆虫細胞における組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの産生の最適化に関する。特に、本開示は、ウイルスカプシド（ｃａｐ）タンパク質の完全性が向上し、産生されたｒＡＡＶベクターの効力が付随して増大しているｒＡＡＶベクターを産生するための、組成物および方法を提供する。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、それらの低い病原性能力、ならびに分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染するそれらの能力を理由として、遺伝子療法送達のための主要なプラットフォームである。最も一般的には、ｒＡＡＶベクターは、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞）で産生される。しかし、哺乳動物細胞におけるｒＡＡＶベクターの大規模製造は依然として課題のままであり、ヒトにおける臨床的使用へのｒＡＡＶベクターの本格的な導入における限定要因である。
バキュロウイルスの昆虫細胞に感染する能力に基づくｒＡＡＶベクター産生系もまた開発されている（Ｕｒａｂｅら、２００２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１９３５～１９４３；Ｋｏｔｉｎら、ＵＳ２００３／０１４８５０６；Ｋｏｔｉｎら、ＵＳ２００４／０１９７８９５、およびＫｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒ、ＵＳ２００６／０１６６３６３）。例えば、昆虫細胞を、１つ目のバキュロウイルスはＡＡＶレプリカーゼ（ＲＥＰ）タンパク質を産生し、２つ目のバキュロウイルスはＡＡＶウイルスの構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）を産生するためのｃａｐ機能を提供し、そして、３つ目のバキュロウイルスは目的の導入遺伝子を含む、３つの異なる組換えバキュロウイルスに感染させる。このバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）系は、昆虫細胞において大量のｒＡＡＶベクターを産生し得る。しかし、得られたｒＡＡＶベクターの効力に対するバキュロウイルス感染の影響は、詳細には調べられていない。研究によると、バキュロウイルスカテプシン（ｖ－ＣＡＴＨ）がいくつかのＡＡＶ血清型に対して活性であり、その結果、ＡＡＶのｃａｐタンパク質であるＶＰ１およびＶＰ２が部分的に分解され、それに付随して、ｒＡＡＶ感染性が低下することが示された（Ｇａｌｉｂｅｒｔ Ｌ、Ｓａｖｙ Ａ、Ｄｉｃｋｘ Ｙ、Ｂｏｎｎｉｎ Ｄ、Ｂｅｒｔｉｎ Ｂ、Ｍｕｓｈｉｍｉｙｉｍａｎａ Ｉら（２０１８）Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｒＡＡＶ８ ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １３（１１）：ｅ０２０７４１４）。
ＵＳ２００３／０１４８５０６ ＵＳ２００４／０１９７８９５ ＵＳ２００６／０１６６３６３ 米国特許第７，９０６，１１１号 ＷＯ００／２８０６１ ＷＯ９９／６１６０１ ＷＯ９８／１１２４４ ＷＯ２０１３／０６３３７９ ＷＯ２０１４／１９４１３２ ＷＯ２０１５／１２１５０１ 米国特許第６，１５６，３０３号 米国特許第６，４９１，９０７号 ＷＯ２００６／０６６０６６ ＷＯ２０１０／０９３７８４ ＷＯ２０１４／１４４２２９ ＷＯ２１０３／０２９０３０ ＷＯ２０１５／０１３３１３ ＷＯ２００７／１２０５４２ ＷＯ２０１６／２１０１７０ 米国特許第７，１７２，８９３号 米国特許第８，７８４，７９９号 ＷＯ２０１５／０５４６５３ 米国特許第６，２０４，０５９号 ＷＯ２０１７／０７４５２６
Ｕｒａｂｅら、２００２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１９３５～１９４３ Ｇａｌｉｂｅｒｔ Ｌ、Ｓａｖｙ Ａ、Ｄｉｃｋｘ Ｙ、Ｂｏｎｎｉｎ Ｄ、Ｂｅｒｔｉｎ Ｂ、Ｍｕｓｈｉｍｉｙｉｍａｎａ Ｉら（２０１８）Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｒＡＡＶ８ ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １３（１１）：ｅ０２０７４１４ ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｚｋｙ（１９８７）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：２４３～３０７ ＧｒｉｅｇｅｒおよびＳａｍｕｌｓｋｉ（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１５）：９９３３～９９４４ Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（２）：７９１～８０１ Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａら（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５ Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３ Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９ Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９ Ｘｉａｏら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４ Ｍｕｒａｍａｔｓｕら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８ Ｓｈａｄｅら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１ Ｇａｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４ Ｍｏｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：３７５～３８３ Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８（９）：４４２１～４４３２ Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９（６）：１０７０～１０７８ ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２６６巻：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６）、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ． Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３～１８７（１９９７） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３～４５３（１９７０） １９８１、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２～４８９ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１２７～１４９頁、１９８８、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ． Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７、４５６６～４５７９、１９９３ Ｍａｒｓｉｃら（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（１１）：１９００～１９０９ ＭｃＣａｒｔｙ（２００８）Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒａｐｙ １６（１０）：１６４８～１６５６ ＭｃＣａｒｔｙら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１２４８～１２５４ ＭｃＣａｒｔｙら（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２１１２～２１１８ Ｆｉｅｌｄｓら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｇａｏら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１ Ｌｙｋｋｅｎら（２０１８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｄｅｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．１０：１６ Ｚｈａｎｇら、ＭＡｂｓ．２０２０年１月～１２月、１２（１）：１７８３０６２ Ｚｈａｎｇら、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ ｗｉｔｈ Ｌａｓｅｒ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓ ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ－Ｆｒｉｅｎｄｌｙ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｔｙ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０２１年１月２２日 ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｒｉｃｈａｒｄ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９５） Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４） Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２～８（１９８９） Ｋａｊｉｇａｙａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４６４６～５０（１９９１） Ｒｕｆｆｉｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒ．６６：６９２２～３０（１９９２） Ｋｉｒｎｂａｕｅｒら、Ｖｉｒ．２１９：３７～４４（１９９６） Ｚｈａｏら、Ｖｉｒ．２７２：３８２～９３（２０００） Ｋｉｔｔｓら（１９９０）Ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１（１９）、５６６７～７２ Ｋｉｔｔｓら（１９９３）Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４、８１０ Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９６）Ｎｅｗ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ．Ｆｏｃｕｓ １７、５３ Ｚａｄｏｒｉ Ｚ、Ｓｚｅｌｅｉ Ｊ、Ｌａｃｏｓｔｅ ＭＣ、Ｌｉ Ｙ、Ｇａｒｉｅｐｙ Ｓ、Ｒａｙｍｏｎｄ Ｐ、Ａｌｌａｉｒｅ Ｍ、Ｎａｂｉ ＩＲ、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｐ． Ａ ｖｉｒａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ． Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ．２００１、１（２）：２９１～３０２ Ｇｉｒｏｄ Ａ、Ｗｏｂｕｓ ＣＥ、Ｚａｄｏｒｉ Ｚ、Ｒｉｅｄ Ｍ、Ｌｅｉｋｅ Ｋ、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｐ、Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ ＪＡ、Ｈａｌｌｅｋ Ｍ． Ｔｈｅ ＶＰ１ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ａ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２００２、８３（Ｐｔ ５）：９７３～９７８．ｄｏｉ：１０．１０９９／００２２－１３１７－８３－５－９７３ Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＰＬら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｍｕｔａｎｔｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９８４、５１（２）：３２９～３９ Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｓら、Ａ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｃａｐｓｉｄ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｈｉｄｄｅｎ ＶＰ１ Ｎ ｔｅｒｍｉｎｉ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００５、７９（９）：５２９６～３０３ Ｇｒｉｅｇｅｒ ＪＣ、Ｓｎｏｗｄｙ Ｓ、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ． Ｓｅｐａｒａｔｅ ｂａｓｉｃ ｒｅｇｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００６、８０（１１）：５１９９～２１０ Ａｌｂｒｉｇｈｔ ＢＨ、Ｓｉｍｏｎ ＫＥ、Ｐｉｌｌａｉ Ｍ、Ｄｅｖｌｉｎ ＧＷ、Ａｓｏｋａｎ Ａ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１９；９３（１１） Ｚｈａｎｇ Ｒ、Ｃａｏ Ｌ、Ｃｕｉ Ｍ、Ｓｕｎ Ｚ、Ｈｕ Ｍ、Ｚｈａｎｇ Ｒ、Ｓｔｕａｒｔ Ｗ、Ｚｈａｏ Ｘ、Ｙａｎｇ Ｚ、Ｌｉ Ｘ、Ｓｕｎ Ｙ、Ｌｉ Ｓ、Ｄｉｎｇ Ｗ、Ｌｏｕ Ｚ、Ｒａｏ Ｚ． Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｉｔｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＡＡＶＲ． Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１９、４（４）：６７５～６８２ Ｈｕａｎｇ ＬＹ、Ｐａｔｅｌ Ａ、Ｎｇ Ｒ、Ｍｉｌｌｅｒ ＥＢ、Ｈａｌｄｅｒ Ｓ、ＭｃＫｅｎｎａ Ｒ、Ａｓｏｋａｎ Ａ、Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ １ ａｎｄ ６ Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１６、９０（１１）：５２１９～５２３０ Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ、Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ Ｊ． ＡＡＶ ｃａｐｓｉｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１、８０７：４７～９２ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．、Ｃｈａｎｇ，Ｌ．Ｓ．、およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８９）．Ｈｅｌｐｅｒ－ｆｒｅｅ ｓｔｏｃｋｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ｎｏｒｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｒｅｑｕｉｒｅ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３、３８２２～３８２８ ＭｃＣａｒｔｙ，Ｍ．（１９４６）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂｅｅｆ ｐａｎｃｒｅａｓ． Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９、１２３～１３９ Ｓｏｍｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｈ．、Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ，Ｓ．、Ｉｓａａｃｓ，Ｊ．、Ｖｉｊａｙ，Ｓ．、Ｋｉｅｒａｎ，Ｊ．ら（２００３）．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｅｍｐｔｙ ｃａｐｓｉｄｓ ｂｙ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７、１２～１２８ Ｐｉｅｄｒａ，Ｊ．、Ｏｎｔｉｖｅｒｏｓ，Ｍ．、Ｍｉｒａｖｅｔ，Ｓ．、Ｐｅｎａｌｖａ，Ｃ．、Ｍｏｎｆａｒ，Ｍ．、およびＣｈｉｌｌｏｎ，Ｍ．（２０１５）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒａｐｉｄ，ｒｏｂｕｓｔ，ａｎｄ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｔｉｔｅｒ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６、３５～４２ Ｓｏｎｄｈｉ，Ｄ．、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．、Ｇｉａｎｎａｒｉｓ，Ｅ．Ｌ．、Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｃ．Ｔ．、Ｍｅｎｄｅｚ，Ｂ．Ｓ．、Ｄｅ，Ｂ．ら（２００５）．ＡＡＶ２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＣＬＮ２ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｒｏｄｅｎｔ ａｎｄ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｂｒａｉｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ＴＰＰ－Ｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＬＩＮＣＬ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２、１６１８～１６３２ Ｄ’Ｃｏｓｔａ，Ｓ．、Ｂｌｏｕｉｎ，Ｖ．、Ｂｒｏｕｃｑｕｅ，Ｆ．、Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．、Ｆｃｒａｎｏｉｓ，Ａ．、Ｐｅｒｅｚ，Ｉ．Ｃ．ら（２０１６）．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ：ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅｓ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｒｅｅ ＩＴＲ ｑＰＣＲ． Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．３：１６０１９ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９７年４月
ＢＥＶ系の上記の深刻な制約に照らして、大量の強力なｒＡＡＶ粒子の産生を可能にする効率的かつ改良された方法を開発することが依然として必要とされている。
本明細書において、昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現ベクター系を使用するｒＡＡＶベクターの最適な大規模産生のための組成物および方法が開示および例示される。当業者は、通常の実験、本明細書において記載される発明の具体的な実施形態の多くの均等物さえ使用すればよいことを認識するか、または確認することができる。このような均等物は、以下の実施形態（Ｅ）によって包含されるものである。
Ｅ１．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生するための方法であって、
昆虫細胞を、各々が異種配列を含む１つまたは複数の組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに
野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが１５％以下であるｒＡＡＶベクターを産生するために十分な時間にわたり、適切な条件下で昆虫細胞を培養するステップ
を含む方法。
Ｅ２．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生するための方法であって、
昆虫細胞を、各々が異種配列を含む１つまたは複数の組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに
野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピングが６５％以下であり、かつＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下である、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが上記指定の割合であるｒＡＡＶベクターを産生するために十分な時間にわたり、適切な条件下で昆虫細胞を培養するステップ
を含む方法。
Ｅ３．組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのインビトロでの効力を増大させるための方法であって、
昆虫細胞を、各々が異種配列を含む１つまたは複数の組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに
ｒＡＡＶベクターのインビトロでの効力が、参照標準と比較して１０％～５００％の間となり、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが１５％以下となるように、昆虫細胞を適切な条件下で培養する時間を最適化するステップ
を含む方法。
Ｅ４．組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのインビトロでの効力を増大させるための方法であって、
昆虫細胞を、各々が異種配列を含む１つまたは複数の組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、および
ＡＡＶベクターのインビトロでの効力が、参照標準と比較して１０％～５００％の間となり、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピングが６５％以下となり、かつＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下となる、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが上記指定の割合となるように、昆虫細胞を適切な条件下で培養する時間を最適化するステップ
を含む方法。
Ｅ５．昆虫細胞が、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間、ならびにＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが７５％以下であるｒＡＡＶベクターを産生するために十分な時間にわたり培養される、Ｅ１からＥ４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ６． ｒＡＡＶベクターが、参照標準と比較して少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、または少なくとも２００％のインビトロでの効力を有する、Ｅ１からＥ５のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ７．インビトロでの効力が、比色アッセイ、発色アッセイ、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ、定量ＰＣＲ、および／またはウェスタンブロットを使用して測定される、Ｅ６に記載の方法。
Ｅ８． ｒＡＡＶベクターが、参照標準と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、または少なくとも２００％のインビボでの効力を有する、Ｅ１からＥ７のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ９．インビボでの効力が動物モデルにおいて測定される、Ｅ８に記載の方法。
Ｅ１０．昆虫細胞が、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に２４時間、２日間、３日間、４日間、４．１日間、４．２日間、４．３日間、４．４日間、４．５日間、４．６日間、４．７日間、４．８日間、４．９日間、５日間、５．１日間、５．２日間、５．３日間、５．４日間、５．５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間培養される、Ｅ１からＥ９のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１１．昆虫細胞が、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に少なくとも４．１日間、しかし１０日間以下培養される、Ｅ１からＥ１０のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１２．昆虫細胞が、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に約４日間、４．１日間、４．２日間、４．３日間、４．４日間、４．５日間、４．６日間、４．７日間、４．８日間、４．９日間、５日間、５．１日間、５．２日間、５．３日間、５．４日間、または５．５日間培養される、Ｅ１からＥ１０のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１３．昆虫細胞が、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に約９６時間から約１２８時間、またはｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に約１０８±５時間培養される、Ｅ１からＥ１２のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１４． ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に測定されたゲノム力価が、少なくとも１×１０１０ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍｌである、Ｅ１からＥ１３のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１５． ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収した後に測定されたゲノム力価が、少なくとも５×１０９ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍｌである、Ｅ１からＥ１４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１６．ゲノム力価が定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって測定される、Ｅ１４またはＥ１５に記載の方法。
Ｅ１７．昆虫細胞が、
（ｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質および／またはＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードする異種配列を各々が含む１つまたは２つのヘルパー組換えバキュロウイルス、ならびに
（ｉｉｉ）導入遺伝子をコードする異種配列を２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間に含むベクター組換えバキュロウイルス
と接触させられる、Ｅ１からＥ１６のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１８． 野生型ＡＡＶ６のＶＰ１タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下のｒＡＡＶベクター、または、アミノ酸残基１８９Ｇおよび１９０Ｅの間のクリッピングが６５％以下であり、かつＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下である、もしくは別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが上記指定の割合であるｒＡＡＶベクターを産生する昆虫細胞を培養するための適切な条件が、
（ｉ）昆虫細胞を培養する温度、
（ｉｉ）昆虫細胞と接触させるヘルパー組換えバキュロウイルスの量、
（ｉｉｉ）昆虫細胞と接触させるベクター組換えバキュロウイルスベクターの量、および／または
（ｉｖ）細胞培養培地中の溶解した酸素の量
を含む、Ｅ１７に記載の方法。
Ｅ１９．昆虫細胞が３７℃未満の温度で培養される、Ｅ１からＥ１８のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２０．昆虫細胞が、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、または約３１℃の温度で培養される、Ｅ１９に記載の方法。
Ｅ２１．昆虫細胞が、約２８℃の温度で培養される、Ｅ２０に記載の方法。
Ｅ２２．昆虫細胞と接触させるヘルパー組換えバキュロウイルスの量が、全培養容積に対して約０．００２２％～約０．０１７８％の間の容積である、Ｅ１８からＥ２１のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２３．昆虫細胞と接触させるベクター組換えバキュロウイルスの量が、全培養容積に対して約０．００２２％～約０．０１７８％の間の容積である、Ｅ１８からＥ２２のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２４．培養培地中の溶解した酸素の量が、空気飽和の約２０％～約１００％である、Ｅ１８～Ｅ２３のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２５．昆虫細胞が細胞培養培地中で培養され、細胞培養培地の容積が少なくとも２Ｌ、少なくとも１０Ｌ、少なくとも２５０Ｌ、または少なくとも２０００Ｌである、Ｅ１からＥ２４のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２６． ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質でのクリッピングが、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、質量分析（多特性質量分析を含む）、および／またはウェスタンブロットアッセイによって測定される、Ｅ１からＥ２５のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２７．昆虫細胞が、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、またはＨｉ５細胞である、Ｅ１から２６のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２８．昆虫細胞が懸濁培養物中にある、Ｅ１からＥ２７のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ２９．昆虫細胞が接着性である、Ｅ１からＥ２７のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ３０．昆虫細胞が無血清培養培地中で増殖させられるかまたは維持される、Ｅ１からＥ２９のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ３１．昆虫細胞がローラーボトルまたは大型ローラーボトル内で増殖させられるかまたは維持される、Ｅ１からＥ３０のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ３２．昆虫細胞がバイオリアクター内で増殖させられる、Ｅ１からＥ３０のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ３３．昆虫細胞がバッグまたはフラスコ内で増殖させられる、Ｅ１からＥ３０のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ３４．昆虫細胞がＷＡＶＥバイオリアクター内で増殖させられる、Ｅ３２に記載の方法。
Ｅ３５．細胞が、撹拌されているタンクバイオリアクター内で増殖させられる、Ｅ３２に記載の方法。
Ｅ３６．導入遺伝子が、野生型または機能的バリアントの血液凝固因子、ミニジストロフィン、Ｃ１エステラーゼインヒビター、銅輸送Ｐ型ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰ７Ｂ）、銅－亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、またはミオシン結合タンパク質Ｃ３をコードする、Ｅ１７からＥ３５のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ３７．野生型または機能的バリアントの血液凝固因子が、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、または因子ＩＸである、Ｅ３６に記載の方法。
Ｅ３８．野生型または機能的バリアントの血液凝固因子が因子ＶＩＩＩである、Ｅ３７に記載の方法。
Ｅ３９． ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ３ａ、ｒＡＡＶ３ｂ、ｒＡＡＶ６、またはｒＡＡＶ８である、Ｅ１からＥ３８のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ４０．野生型ＡＡＶ６のＶＰ１タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが１５％以下である精製された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む組成物。
Ｅ４１．野生型ＡＡＶ６のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下であり、かつＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のアミノ酸残基１８９Ｇおよび１９０Ｅの間のクリッピングが６５％以下である、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが上記指定の割合である精製された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む組成物。
Ｅ４２． ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ３ａ、ｒＡＡＶ３ｂ、ｒＡＡＶ６、またはｒＡＡＶ８である、Ｅ４０からＥ４１のいずれか一項に記載の組成物。
Ｅ４３． ｒＡＡＶベクターが目的の導入遺伝子を含む、Ｅ４０からＥ４２のいずれか一項に記載の組成物。
Ｅ４４．目的の導入遺伝子が、野生型または機能的バリアントの血液凝固因子、ミニジストロフィン、Ｃ１エステラーゼインヒビター、銅輸送Ｐ型ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰ７Ｂ）、銅－亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、またはミオシン結合タンパク質Ｃ３をコードする、Ｅ４３に記載の組成物。
Ｅ４５．野生型または機能的バリアントの血液凝固因子が、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、または因子ＩＸである、Ｅ４４に記載の組成物。
Ｅ４６．野生型または機能的バリアントの血液凝固因子が因子ＶＩＩＩである、Ｅ４５に記載の組成物。
Ｅ４７． ｒＡＡＶベクターが、参照標準と比較して少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、または少なくとも２００％のインビトロでの効力を有する、Ｅ４０からＥ４６のいずれか一項に記載の組成物。
Ｅ４８．インビトロでの効力が、比色アッセイ、発色アッセイ、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ、定量ＰＣＲ、および／またはウェスタンブロットを使用して測定される、Ｅ４７に記載の組成物。
Ｅ４９． ｒＡＡＶベクターが、参照標準と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、または少なくとも２００％のインビボでの効力を有する、Ｅ４０からＥ４８のいずれか一項に記載の組成物。
Ｅ５０．インビボでの効力が動物モデルにおいて測定される、Ｅ４９に記載の組成物。
Ｅ５１． ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質でのクリッピングが、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、質量分析（多特性質量分析を含む）、および／またはウェスタンブロットアッセイによって測定される、Ｅ４０からＥ５０のいずれか一項に記載の組成物。
Ｅ５２．参照標準と比較して約１０％～５００％のインビトロでの効力を有し、ＶＰ１タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下の、野生型または機能的バリアントの血液凝固因子ＶＩＩＩをコードする導入遺伝子を含む精製された組換えアデノ随伴ウイルス６（ｒＡＡＶ６）ベクターを含む組成物。
Ｅ５３．参照標準と比較して約１０％～５００％のインビトロでの効力を有し、アミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下であり、かつＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のアミノ酸残基１８９Ｇおよび１９０Ｅの間のクリッピングが６５％以下である、野生型または機能的バリアントの血液凝固因子ＶＩＩＩをコードする導入遺伝子を含む精製された組換えアデノ随伴ウイルス６（ｒＡＡＶ６）ベクターを含む組成物。
Ｅ５４．血液凝固因子ＶＩＩＩを含む組換えアデノ随伴ウイルス６（ｒＡＡＶ６）ベクターを産生するための方法であって、
（ｉ）Ｓｆ９細胞を、ＡＡＶ６のＲｅｐタンパク質および／またはＡＡＶ６のＣａｐタンパク質をコードする異種配列を各々が含む１つまたは２つのヘルパー組換えバキュロウイルス、ならびに血液凝固因子ＶＩＩＩをコードする異種配列を２つのＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間に含むベクター組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに
（ｉｉ）Ｓｆ９細胞を適切な条件下で１０８±５時間培養して、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下のｒＡＡＶ６ベクターを産生するステップ
を含む方法。
Ｅ５５．血液凝固因子ＶＩＩＩを含む組換えアデノ随伴ウイルス６（ｒＡＡＶ６）ベクターを産生するための方法であって、
（ｉ）Ｓｆ９細胞を、ＡＡＶ６のＲｅｐタンパク質および／またはＡＡＶ６のＣａｐタンパク質をコードする異種配列を各々が含む１つまたは２つのヘルパー組換えバキュロウイルス、ならびに血液凝固因子ＶＩＩＩをコードする異種配列を２つのＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間に含むベクター組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに
（ｉｉ）Ｓｆ９細胞を適切な条件下で１０８±５時間培養して、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピングが６５％以下であり、かつＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下であるｒＡＡＶ６ベクターを産生するステップ
を含む方法。
Ｅ５６．血液凝固因子ＶＩＩＩを含む組換えアデノ随伴ウイルス６（ｒＡＡＶ６）ベクターを産生するための方法であって、
（ｉ）Ｓｆ９細胞を、ＡＡＶ６のＲｅｐタンパク質および／またはＡＡＶ６のＣａｐタンパク質をコードする異種配列を各々が含む１つまたは２つのヘルパー組換えバキュロウイルス、ならびに血液凝固因子ＶＩＩＩをコードする異種配列を２つのＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間に含むベクター組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに
（ｉｉ）Ｓｆ９細胞を適切な条件下で１０８±５時間培養して、参照標準と比較して５０～１５０％の間のインビトロでの効力を有し、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下のｒＡＡＶ６ベクターを産生するステップ
を含む方法。
Ｅ５７．血液凝固因子ＶＩＩＩを含む組換えアデノ随伴ウイルス６（ｒＡＡＶ６）ベクターを産生するための方法であって、
（ｉ）Ｓｆ９細胞を、ＡＡＶ６のＲｅｐタンパク質および／またはＡＡＶ６のＣａｐタンパク質をコードする異種配列を各々が含む１つまたは２つのヘルパー組換えバキュロウイルス、ならびに血液凝固因子ＶＩＩＩをコードする異種配列を２つのＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間に含むベクター組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに
（ｉｉ）Ｓｆ９細胞を適切な条件下で１０８±５時間培養して、参照標準と比較して５０～１５０％の間のインビトロでの効力を有し、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピングが６５％以下であり、かつＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下であるｒＡＡＶ６ベクターを産生するステップ
を含む方法。
インビトロでの効力と２０００Ｌスケールでの感染後のバッチ期間との間の負の相関を示すグラフを示す図である。 インビトロでの効力とアミノ酸残基Ｇ１８９およびＥ１９０の間のＶＰ１／ＶＰ２カプシドタンパク質のクリッピングとの間の逆相関を示すグラフを示す図である。 感染後のバッチ期間に応じてＶＰ１／ＶＰ２のクリッピングが増大することを示すグラフを示す図である。 ＦＶＩＩＩ活性を測定するために使用されるアッセイの略図である。 野生型ＡＡＶ１（配列番号１）、ＡＡＶ３Ａ（配列番号２）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番号３）、ＡＡＶ６（配列番号４）、およびＡＡＶ８（配列番号５）のアラインメントを示す図である。 野生型ＡＡＶ１（配列番号１）、ＡＡＶ３Ａ（配列番号２）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番号３）、ＡＡＶ６（配列番号４）、およびＡＡＶ８（配列番号５）のアラインメントを示す図（図５－１の続き）である。 インビトロでの因子ＶＩＩＩの活性と、（Ａ）撹拌されているタンクリアクター（ＳＴＲ）の温度、（Ｂ）空気飽和に対するパーセンテージとして表される溶解した酸素の量、（Ｃ）ヘルパー組換えバキュロウイルスの容積、および（Ｄ）ベクター組換えバキュロウイルスの容積との間の定量的な関係を示すグラフを示す図である。 インビトロでの因子ＶＩＩＩの活性と、（Ｅ）感染後のバッチ期間との間の定量的な関係を示すグラフを示す図である。
バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）系を使用して昆虫細胞において産生されたｒＡＡＶベクターの分析は、ｒＡＡＶベクターのインビトロでの効力値と感染後の時間（すなわち、本明細書において感染後のバッチ期間とも呼ばれる、ｒＡＡＶベクターを回収する前の、昆虫細胞を組換えバキュロウイルスと接触させた後の日数）との間の逆相関を示した。具体的には、ｒＡＡＶベクターのインビトロでの効力が感染後の時間と共に、特に約１０３時間から１６３時間の間に低下することが観察された（例えば図１を参照されたい）。
インビトロでの効力のこの変化の原因を理解するために行ったさらなる研究によって、ある特性、すなわち、クリッピングされた形態の、ＡＡＶカプシドタンパク質、すなわちＶＰ１およびＶＰ２タンパク質が同定された。データは、クリッピングされたＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のレベルと、相対的なインビトロでの効力との間の逆相関を示し、この場合、クリッピングされたＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のレベルが感染後の時間と共に増大するにつれ、インビトロでの効力は低下した。感染後の時間に伴うクリッピングされたＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のこの増大およびインビトロでの効力の付随する低下は、大規模産生（２０００Ｌ）および小規模産生（２Ｌ、１０Ｌ、または２００Ｌ）の両方で見られた。
したがって、本開示は、産生されたｒＡＡＶベクターが最低レベルのクリッピングされたＶＰ１およびＶＰ２タンパク質ならびに最大のインビトロでの効力を有するように感染後の時間を最適化することによってｒＡＡＶベクターを産生するための方法を提供する。本開示はまた、最少のクリッピングされたＶＰ１およびＶＰ２タンパク質ならびに最大のインビトロでの効力を有する精製されたｒＡＡＶベクターを含む組成物も提供する。
本明細書において使用される節の見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、記載されている主題を限定するものとして解釈されるものではない。
特許出願、特許公報、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号を含む、本明細書において引用される全ての参考文献は、個々の参考文献の各々が参照によってその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示は、以下の本発明の典型的な実施形態の詳細な説明およびそれに含まれる実施例を参照することによって、より容易に理解され得る。
本発明の態様または実施形態がマーカッシュグループまたは他の代替的なグルーピングで記載されている場合、本発明は、列挙されたグループ全体を丸ごと包含するだけではなく、グループの各メンバーを個別に、およびメイングループの全ての考えられるサブグループを、また、グループメンバーの１つまたは複数を欠いたメイングループも包含する。本発明はまた、特許請求の範囲に記載の発明においていずれかのグループメンバーの１つまたは複数を明確に排除することも想定する。
定義
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態のみを記載することを目的としており、本発明を限定することを意図したものではない。本発明の明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から別段のことが明らかに示されていない限り、複数形も含むことを意図している。
本明細書において使用される場合、用語「約」または「およそ」は、（限定はしないが）クリッピングされたＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質の量、インビトロでの効力、感染後の時間、温度、用量、ゲノム力価、ヘルパー組換えバキュロウイルスの量、ベクター組換えバキュロウイルスの量、生物学的活性、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さ、ならびにこれらに類するものなどの測定可能な値を指し、また、別段の記載がない限り、内容から別段のことが明らかでない限り、またはこのような数値が考えられる値の１００％を超える場合を除いて、特定された量のいずれかの方向への（それを上回る、またはそれを下回る）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変動を包含することを意味する。
本明細書において使用される場合、用語「および／または」は、関連する列挙された事項の１つまたは複数の任意のおよび全ての考えられる組み合わせ、ならびに、代替的な意味（「または」）で解釈される場合には組み合わせの欠如を指し、包含する。
本明細書において使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス」および／または「ＡＡＶ」は、直鎖状の一本鎖ＤＮＡゲノムおよびそのバリアントを有するパルボウイルスを指す。この用語は、別段のことが必要である場合を除いて、全てのサブタイプ、ならびに天然形態および組換え形態の両方を網羅する。野生型ゲノムは、４６８１塩基（ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｚｋｙ（１９８７）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：２４３～３０７）を含み、各末端に、ウイルスのＤＮＡ複製起点およびパッケージングシグナルとしてシスで機能する末端反復配列（例えば、逆方向末端反復（ＩＴＲ））を含む。ゲノムは、それぞれＡＡＶ複製（「ＡＡＶ ｒｅｐ」または「ｒｅｐ」）遺伝子およびカプシド（「ＡＡＶ ｃａｐ」または「ｃａｐ」または「ＡＡＶ構造タンパク質」）遺伝子として知られている２つの大きなオープンリーディングフレームを含む。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐはまた、本明細書において、ＡＡＶの「パッケージング遺伝子」とも呼ばれ得る。これらの遺伝子は、ウイルスゲノムの複製およびパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする。
野生型ＡＡＶウイルスにおいて、３つのカプシド遺伝子ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、単一のオープンリーディングフレーム内で互いにオーバーラップし、選択的スプライシングによって、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３が産生される（ＧｒｉｅｇｅｒおよびＳａｍｕｌｓｋｉ（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１５）：９９３３～９９４４）。単一のＰ４０プロモーターが、３つのカプシドタンパク質全てがＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３についてそれぞれ約１：１：１０の比率で発現することを可能にし、これがＡＡＶカプシドの産生を補う。さらに具体的には、ＶＰ１は完全長タンパク質であり、ＶＰ２およびＶＰ３は、Ｎ末端のトランケーションが増えることに起因して徐々に短くなっていく。周知の例は、米国特許第７，９０６，１１１号において記載されているようなＡＡＶ９のカプシドであり、これにおいて、ＶＰ１は配列番号１２３のアミノ酸残基１～７３６を含み、ＶＰ２は配列番号１２３のアミノ酸残基１３８～７３６を含み、そしてＶＰ３は配列番号１２３のアミノ酸残基２０３～７３６を含む。本明細書において使用される場合、用語「ＡＡＶカプシド」または「ＡＡＶ Ｃａｐ」、または「ｃａｐ」は、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、ならびにこれらのバリアントおよび類似体を指す。
Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０という少なくとも４つのウイルスタンパク質がＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子から合成され、これらは、それらの見かけの分子量に従って名付けられている。本明細書において使用される場合、「ＡＡＶ ｒｅｐ」または「ｒｅｐ」は、ＡＡＶ複製タンパク質であるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、および／またはＲｅｐ４０、ならびにこれらのバリアントおよび類似体を意味する。本明細書において使用される場合、ｒｅｐおよびｃａｐは、野生型および組換え（例えば、修飾されたキメラ、およびそれに類するもの）の双方のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにそれらがコードするポリペプチドを指す。一部の実施形態において、ｒｅｐをコードする核酸は、２つ以上のＡＡＶ血清型のヌクレオチドを含む。例えば、ｒｅｐをコードする核酸は、ＡＡＶ２血清型のヌクレオチドおよびＡＡ３血清型のヌクレオチドを含み得る（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（２）：７９１～８０１）。
本明細書において使用される場合、用語「組換えアデノ随伴ウイルスベクター」、「ｒＡＡＶ」、および／または「ｒＡＡＶベクター」は、野生型ＡＡＶウイルスゲノムのｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子がウイルスゲノムから除去されており、そして、ＡＡＶ由来ではないまたは完全にＡＡＶ由来ではないポリヌクレオチド配列（例えば、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）で置換されているベクターゲノムを含むＡＡＶを指す。規準的なＡＡＶのｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が除去されているまたは存在しない場合（ならびに、限定はしないが、カプシドがＡＡＶ２ではない場合のＡＡＶ２ ＩＴＲなど、隣接するＩＴＲが、異なる血清型のＩＴＲに典型的に由来する場合）、任意のＩＴＲおよびこれらの間の任意の核酸を含む、ＡＡＶ内の核酸は、「ベクターゲノム」と呼ばれる。したがって、ｒＡＡＶベクターという用語は、カプシドおよび異種核酸、すなわち、本明細書において「ベクターゲノム」とも呼ばれる、天然のカプシドには元々存在しない核酸を含む、ｒＡＡＶウイルス粒子を包含する。したがって、「ｒＡＡＶベクターゲノム」（または「ベクターゲノム」）は、必ずしもそうではないがＡＡＶカプシド内に含まれ得る、異種ポリヌクレオチド配列（少なくとも１つのＩＴＲを含み、必ずしもそうではないが典型的には、ＩＴＲは、オリジナルのＡＡＶに存在するオリジナルの核酸と関連しない）を指す。ｒＡＡＶベクターゲノムは、二本鎖（ｄｓＡＡＶ）、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）、および／または自己相補的（ｓｃＡＡＶ）であり得る。
本明細書において使用される場合、用語「ｒＡＡＶベクター，」、「ｒＡＡＶウイルス粒子」、および／または「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質からなる（しかし典型的には、カプシドタンパク質の全て、例えば、ＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、またはこれらのバリアントが存在する）、ならびにオリジナルのＡＡＶカプシドには元々存在しない異種核酸配列を含むベクターゲノムを有する、ＡＡＶカプシドを指す。これらの用語は、カプシドがｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードするウイルスゲノムを有し、アデノウイルスおよび／もしくは単純ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスならびに／またはこれらに由来する所要のヘルパー遺伝子も含む細胞内に存在する場合には複製が可能である、組換えではない「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶウイルス」からは区別される。したがって、ｒＡＡＶベクター粒子の産生は、組換えＤＮＡ技術を使用する組換えベクターゲノムの産生を必ず含み、これにより、このベクターゲノムは、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルス粒子、またはｒＡＡＶベクター粒子を形成するためにカプシド内に含有される。
共に天然に存在する、様々な血清型のＡＡＶのゲノム配列、ならびに、逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列、ならびに／またはこれらの突然変異およびバリアントは、当技術分野において公知である。このような配列は、文献において、またはＧｅｎＢａｎｋなどの公共データベースにおいて見ることができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ－００２０７７（ＡＡＶ－１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ－１）、ＮＣ－００１４０１（ＡＡＶ－２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ－２）、ＮＣ－００１７２９（ＡＡＶ－３）、ＮＣ＿０１８６３（ＡＡＶ－３Ｂ）、ＮＣ－００１８２９（ＡＡＶ－４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ－４）、ＮＣ－００６１５２（ＡＡＶ－５）、ＡＦ０２８７０４（ＡＡＶ－６）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ－７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ－８）、およびＮＣ－００６２６１（ＡＡＶ－８）。これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。また、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａら（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９；Ｘｉａｏら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：３７５～３８３；国際特許出願公開第ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４、ＷＯ２０１３／０６３３７９、ＷＯ２０１４／１９４１３２、ＷＯ２０１５／１２１５０１、ならびに米国特許第６，１５６，３０３号および米国特許第７，９０６，１１１号も参照されたい。
本明細書において使用される場合、用語「改善する」は、対象の疾患、障害、もしくは状態、またはこれらの症候、または根底にある細胞応答における、検出可能なまたは測定可能な向上を意味する。検出可能なまたは測定可能な向上としては、疾患、障害、もしくは状態の発生、頻度、重症度、進行、もしくは期間、疾患、障害、もしくは状態によって生じるまたはこれらに伴う合併症における、主観的または客観的な減少、低減、阻害、抑制、制限、または制御；疾患、障害、または状態の症候の向上；あるいは疾患、障害、または状態の好転が含まれる。
本明細書において使用される場合、用語「コード配列」または「コード核酸」は、タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列を指し、適切な調節配列の制御下にある（作動可能に連結している）場合にインビトロまたはインビボでポリペプチドに転写（ＤＮＡのケースでは）および翻訳（ｍＲＮＡのケースでは）される配列を示す。コード配列の境界は一般に、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列には、限定はしないが、原核細胞または真核細胞のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、原核細胞または真核細胞のＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列が含まれ得る。
本明細書において使用される場合、用語「キメラ」は、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれるＲａｂｉｎｏｗｉｔｚら、米国特許第６，４９１，９０７号において記載されているように、異なるパルボウイルス、好ましくは異なるＡＡＶ血清型のカプシド配列を有するウイルスカプシドを指す。Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８（９）：４４２１～４４３２も参照されたい。一部の実施形態において、キメラウイルスカプシドは、ＷＯ２００６／０６６０６６において記載されているＡＡＶ２．５カプシド、ＷＯ２０１０／０９３７８４において記載されているＡＡＶ２ｉ８、ＷＯ２０１４／１４４２２９において記載されているＡＡＶ２Ｇ９およびＡＡＶ８Ｇ９、ならびにＡＡＶ９．４５（Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９（６）：１０７０～１０７８）、ＷＯ２１０３／０２９０３０において記載されているＡＡＶ－ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＡＡＶ－ＬＫ０１からＡＡＶ－ＬＫ０１９、ＷＯ２０１５／０１３３１３において記載されているＲＨＭ４－１およびＲＨＭ１５－１からＲＨＭ１５－６、ＷＯ２００７／１２０５４２において記載されているＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－ＤＪ／９である。
本明細書において使用される場合、用語「保存的な置換」は、生物学的に、化学的に、または構造的に類似の残基による１つのアミノ酸の置換を指す。生物学的に類似とは、置換が生物学的活性を破壊しないことを意味する。構造的に類似とは、アミノ酸が、アラニン、グリシン、およびセリンなどのように、類似の長さの側鎖を有すること、または類似のサイズであることを意味する。化学的類似性は、残基が同一の電荷を有すること、または共に親水性もしくは疎水性であることを意味する。特定の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンなどの疎水性残基の、別の残基での置換、または、１つの極性残基の、別の極性残基への置換、例えば、アルギニンからリジンへの置換、グルタミン酸からアスパラギン酸への置換、グルタミンからアスパラギンへの置換、セリンからスレオニンへの置換、およびそれに類するものが含まれる。保存的な置換の特定の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンなどの疎水性残基から互いへの置換、極性残基から別の極性残基への置換、例えば、アルギニンからリジンへの置換、グルタミン酸からアスパラギン酸への置換、またはグルタミンからアスパラギンへの置換、およびそれに類するものが含まれる。保存的なアミノ酸置換としては、典型的には、例えば、以下の群：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンの中での置換が含まれる。「保存的な置換」としてはまた、置換されていない親アミノ酸の代わりに置換されたアミノ酸を使用することも含まれる。
本明細書において使用される場合、用語「隣接した」は、他のエレメントが隣接している配列を指し、配列に対して上流および／または下流での、すなわち５’および／または３’での、１つまたは複数の隣接するエレメントの存在を示す。用語「隣接した」は、配列が必ず連続していることを示しているわけではない。例えば、導入遺伝子をコードする核酸と隣接するエレメントとの間に介在配列があってもよい。２つの他のエレメント（例えばＩＴＲ）が「隣接する」配列（例えば導入遺伝子）は、１つのエレメントが配列の５’側に位置し、他方が配列の３’側に位置することを示している。しかし、これらの間に介在配列があってもよい。
本明細書において使用される場合、用語「断片」は、全体のうちの個別の一部分を含むが全体では見られる１つまたは複数の部分を欠いている構造を有する、材料または実体を指す。一部の実施形態において、断片は、個別の一部分からなる。一部の実施形態において、断片は、全体では見られる特徴的な構造エレメントまたは部分からなるかまたはそれを含む。一部の実施形態において、ポリマー断片は、ポリマー全体では見られる少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、またはそれを超えるモノマー単位（例えば、アミノ酸残基、ヌクレオチド）を含むかまたはそれからなる。
本明細書において使用される場合、用語「機能的」は、生体分子を特徴付ける特質および／または活性を示す形態にある生体分子を指す。生体分子は、２つの機能（すなわち二官能性）または多くの機能（すなわち多官能性）を有し得る。
本明細書において使用される場合、用語「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードし得る少なくとも１つのオープンリーディングフレームを有するポリヌクレオチドを指す。「遺伝子移入」または「遺伝子送達」は、外来ＤＮＡを宿主細胞に確実に挿入するための方法または系を指す。このような方法によって、組み込まれていない移入されたＤＮＡの一過性発現、移入されたレプリコン（例えばエピソーム）の染色体外での複製および発現、ならびに／または宿主細胞のゲノムＤＮＡへの移入された遺伝物質の組み込みが生じ得る。
本明細書において使用される場合、用語「異種」または「外因性」核酸は、細胞内へのベクター介在性の核酸の移入／送達を目的とした、ベクター（例えば、ｒＡＡＶベクターまたは組換えバキュロウイルス）に挿入された核酸を指す。異種核酸は、ベクター（例えば、ＡＡＶ、バキュロウイルス）の核酸とは典型的に異なり、すなわち、異種核酸は、天然で見られるウイルス（例えば、ＡＡＶ、バキュロウイルス）核酸に対してネイティブではない。細胞内に導入（例えば形質導入）または送達されると、ベクターが有する異種核酸は発現され得る（例えば、適切な場合、転写および翻訳される）。あるいは、ベクターが有する、細胞内に移入（形質導入）または送達された異種核酸は、発現されなくてもよい。用語「異種」は、核酸に関して本明細書において常に使用されるわけではないが、核酸への言及は、修飾語「異種」が不在であっても、異種核酸を含むものである。例えば、異種核酸は、野生型または機能的バリアントの血液凝固因子、ミニジストロフィン、Ｃ１エステラーゼインヒビター、銅輸送Ｐ型ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰ７Ｂ）、銅－亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、またはミオシン結合タンパク質Ｃ３をコードする核酸である。
本明細書において使用される場合、用語「相同」または「相同性」は、所与の領域または部分にわたり少なくとも部分的な同一性を有する、２つ以上の参照実体（例えば、核酸またはポリペプチド配列）を指す。例えば、２つのペプチド内のあるアミノ酸位置に同一のアミノ酸が存在する場合、ペプチドはその位置で相同である。特に、相同なペプチドは、未修飾のペプチドまたは参照ペプチドに伴う活性または機能を保持し、修飾されたペプチドは一般に、未修飾配列のアミノ酸配列と「実質的に相同な」アミノ酸配列を有する。ポリペプチド、核酸、またはこれらの断片に言及する場合、「実質的な相同性」または「実質的な類似性」は、適切な挿入または欠失を伴って別のポリペプチド、核酸（もしくはその相補鎖）、またはこれらの断片と最適にアラインされた場合に、配列の少なくとも約９５％～９９％において配列同一性があることを意味する。２つの配列の間の相同性（同一性）の程度は、コンピュータプログラムまたは数学的アルゴリズムを使用して確認することができる。配列相同性（または同一性）のパーセントを計算するこのようなアルゴリズムは、一般に、比較領域または区域にわたる配列のギャップおよびミスマッチを示す。典型的なプログラムおよびアルゴリズムを以下に示す。
本明細書において使用される場合、用語「宿主細胞」、「宿主細胞系」、および「宿主細胞培養物」は区別せずに使用され、外因性の核酸が導入されている細胞を指し、またこれには、このような細胞の子孫が含まれる。宿主細胞には、継代数にかかわらず、トランスフェクトされた、形質転換された、または形質導入された初代細胞、およびこれらに由来する子孫を含む「トランスフェクタント」、「形質転換体」、「形質転換細胞」、および「形質導入細胞」が含まれる。一部の実施形態において、宿主細胞は、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞などの、ｒＡＡＶベクターを産生するためのパッケージング細胞である。
本明細書において使用される場合、用語「同一性」または「に同一」は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間ならびに／またはポリペプチド分子間の全体的な関係を指す。一部の実施形態において、ポリマー分子は、これらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上同一であれば、互いに「実質的に同一」であるとみなされる。
２つの核酸またはポリペプチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較のために２つの配列をアラインすることによって行うことができる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２の配列の一方または両方にギャップを導入することができ、また、比較のために、同一ではない配列は無視することができる）。ある特定の実施形態において、比較のためにアラインされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。対応する位置にあるヌクレオチドが次いで比較される。第１の配列における位置に、第２の配列における対応する位置と同一の残基（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）がある場合、分子は、その位置で同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列が共有する同一の位置の数に応じる。配列の比較、および２つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。
同一性パーセントまたは相同性を決定するために、配列は、ワールドワイドウェブでｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で入手可能なＢＬＡＳＴを含む方法およびコンピュータプログラムを使用してアラインすることができる。別のアラインメントアルゴリズムは、米国、ウィスコンシン州、マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージで入手可能なＦＡＳＴＡである。アラインメントのための他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２６６巻：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６）、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．において記載されている。特に興味深いものは、配列内のギャップを許可するアラインメントプログラムである。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメントにおいてギャップを許可するアルゴリズムの１つのタイプである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３～１８７（１９９７）を参照されたい。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアラインメント方法を使用するＧＡＰプログラムを利用して、配列をアラインすることもできる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３～４５３（１９７０）を参照されたい。
また、配列同一性を決定するための、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２～４８９）の局所相同性アルゴリズムを使用するＢｅｓｔＦｉｔプログラムも興味深い。ギャップ生成ペナルティーは通常１～５の範囲であり、通常は２～４であり、一部の実施形態においては３となる。ギャップ伸長ペナルティーは通常約０．０１～０．２０の範囲であり、一部の場合では０．１０となる。プログラムは、比較するためにインプットされる配列によって決定されるデフォルトパラメータを有する。好ましくは、配列同一性は、プログラムによって決定されるデフォルトパラメータを使用して決定される。このプログラムは、米国、ウィスコンシン州、マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージからも入手可能である。
興味深い別のプログラムは、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１２７～１４９頁、１９８８、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．において記載されている。配列同一性のパーセントは、以下のパラメータ：ミスマッチペナルティー：１．００；ギャップペナルティー：１．００；ギャップサイズペナルティー：０．３３；および結合ペナルティー：３０．０に基づいて、ＦａｓｔＤＢによって計算される。
本明細書において使用される場合、用語「増大する」、「向上する」、または「減少する」、「低減する」は、ベースライン測定値に対する値を示す。例えば、インビトロでの効力の増大または向上は、本明細書において記載される方法によって産生されていないｒＡＡＶベクターのインビトロでの効力の値と比較して測定され得る。
本明細書において使用される場合、用語「逆方向末端反復」、「ＩＴＲ」、「末端反復」、および「ＴＲ」は、ほとんど相補的な対称的に配置された配列を含む、ＡＡＶゲノムの末端または末端の近くにあるパリンドローム末端反復配列を指す。これらのＩＴＲは、フォールディングして、ＤＮＡ複製の開始の際のプライマーとして機能するＴ状のヘアピン構造を形成し得る。これらはまた、宿主ゲノム内へのウイルスゲノムの組み込み、宿主ゲノムからのレスキュー、および成熟ビリオンへのウイルス核酸のカプシド形成に必要である。ＩＴＲは、ベクターゲノムの複製およびウイルス粒子へのそのパッケージングのために、シスにおいて必要である。「５’ＩＴＲ」は、ＡＡＶゲノムの５’末端および／または組換え導入遺伝子の５’にあるＩＴＲを指す。「３’ＩＴＲ」は、ＡＡＶゲノムの３’末端および／または組換え導入遺伝子の３’にあるＩＴＲを指す。野生型ＩＴＲは、およそ１４５ｂｐの長さである。修飾されたまたは組換えのＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列の断片または一部を含み得る。当業者は、連続ラウンドのＤＮＡ複製の間に、ＩＴＲ配列がスワップし得、その結果、５’ＩＴＲが３’ＩＴＲになり、また逆の場合も同様であることが理解されよう。一部の実施形態において、少なくとも１つのＩＴＲが、組換えベクターゲノムの５’および／または３’末端に存在し、その結果、ベクターゲノムはカプシド内にパッケージングされ得、ベクターゲノムを含むｒＡＡＶベクター（本明細書において「ｒＡＡＶベクター粒子」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」とも呼ばれる）が産生される。
本明細書において使用される場合、用語「単離された」は、１）人の手によって設計された、産生された、調製された、および／もしくは製造された、ならびに／または２）最初に産生された際に（天然でおよび／もしくは実験設定で）それが伴っていた成分の少なくとも１つから分離された物質または組成物を指す。一般に、単離された組成物は、それらが通常は天然で伴う１つまたは複数の材料、例えば、１つまたは複数のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、および／または細胞膜を実質的に有さない。用語「単離された」は、人為的な組み合わせ、例えば、組換え核酸、組換えベクターゲノム（例えば、ｒＡＡＶベクターゲノム）、ベクターゲノムをパッケージングする、例えばカプシド形成するｒＡＡＶベクター粒子（例えば、限定はしないが、ＡＡＶ６カプシドを含むｒＡＡＶベクター粒子など）、および医薬製剤を排除しない。用語「単離された」はまた、代替的な物理的形態の組成物、例えば、ハイブリッド／キメラ、多量体／オリゴマー、修飾体（例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質化）、バリアントもしくは誘導体化された形態、または人工的な宿主細胞において発現した形態も排除しない。
単離された物質または組成物は、それらが最初に伴っていた他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離され得る。一部の実施形態において、単離された作用剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超の純度である。本明細書において使用される場合、物質は、他の成分を実質的に有さない場合、「純粋」である。一部の実施形態において、当業者によって理解されるように、物質は、ある特定の他の成分、例えば、１つまたは複数の担体または賦形剤（例えば、バッファー、溶媒、水など）などと組み合わされた後でも、依然として「単離されている」またはさらには「純粋である」とみなされ得る。このような実施形態において、物質の単離または純度のパーセントは、このような担体または賦形剤を含めずに計算される。
本明細書において使用される場合、用語「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、および「ポリヌクレオチド」は、同義的に、ホスホジエステル結合によって結合しているモノマーヌクレオチドからなるまたはこれを含むあらゆる分子を指す。核酸は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。核酸配列は、５’から３’の方向で本明細書において提示されている。本開示の核酸配列（すなわちポリヌクレオチド）は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得、全ての形態の核酸、例えば、二本鎖分子、一本鎖分子、低分子または短鎖のヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子または短鎖の干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランス－スプライシングＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、移入ＲＮＡ、リボソームＲＮＡを指す。ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である場合、分子は、遺伝子、ｃＤＮＡ、アンチセンス分子、またはこれらの分子のいずれかの断片であり得る。ヌクレオチドは、一文字記号コード：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）、およびウラシル（Ｕ）によって、本明細書において示されている。ヌクレオチド配列は、化学的に修飾されていても人工のものでもよい。ヌクレオチド配列としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノ、およびロック核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が含まれる。これらの配列の各々は、分子骨格の変化によって、天然のＤＮＡまたはＲＮＡから区別される。また、ホスホロチオエートヌクレオチドが使用され得る。他のデオキシヌクレオチド類似体には、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’－Ｐ５’－ホスホロアミデート、およびオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエート、ならびに本開示のヌクレオチド配列において使用され得るこれらの２’－Ｏ－アリル類似体および２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートが含まれる。
本明細書において使用される場合、用語「核酸構築物」は、組換えＤＮＡ技術の使用の結果得られる非天然の核酸分子（例えば組換え核酸）を指す。核酸構築物は、天然では見られない様式で組み合わされているまたは配置されている核酸配列のセグメントを含むように修飾されている、一本鎖または二本鎖の核酸分子である。核酸構築物は、「ベクター」（例えば、プラスミド、ｒＡＡＶベクターゲノム、発現ベクターなど）、すなわち、外因的に生じたＤＮＡを宿主細胞に送達するように設計された核酸分子であり得る。
本明細書において使用される場合、用語「作動可能に連結している」は、機能的関係にある核酸配列（またはポリペプチド）エレメントの連結を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、作動可能に連結している。例えば、プロモーターまたは他の転写調節配列（例えばエンハンサー）は、それがコード配列の転写に影響するならば、コード配列に作動可能に連結している。一部の実施形態において、作動可能に連結しているとは、連結している核酸配列が連続的であることを意味する。一部の実施形態において、作動可能に連結しているとは、核酸配列が連続的に連結していることを意味するのではなく、むしろ、介在配列が、連結されている核酸配列の間にあることを意味する。
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容できる」および「生理学的に許容できる」は、１つまたは複数の投与経路、インビボ送達、または接触に適した生物学的に許容できる製剤、気体、液体、もしくは固体、またはこれらの混合物を指す。
本明細書において使用される場合、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチド」、または「核酸配列によってコードされる」（すなわち、ポリヌクレオチド配列によってコードされる、ヌクレオチド配列によってコードされる）は、天然のタンパク質と同様な完全長のネイティブな配列、ならびに、ネイティブな完全長タンパク質のある程度の機能性を保持する限りの、機能的部分配列、修飾形態、または配列バリアントを指す。本開示の方法および使用において、核酸配列によってコードされるこのようなポリペプチド、タンパク質、およびペプチドは、欠陥のある、またはその発現が不十分な、または遺伝子療法で処置される対象において不完全な内因性タンパク質に同一であり得るが、必ずしもそうではない。
本明細書において使用される場合、用語「予防する」または「予防」は、特定の疾患、障害、または状態（例えばカナバン病）の１つまたは複数の徴候または症候の発病の遅延、ならびに／または頻度および／もしくは重症度の低減を指す。一部の実施形態において、予防は集団を基準として評価され、その結果、特定の疾患、障害、または状態の１つまたは複数の徴候または症候の発生、頻度、および／または強度における統計的に有意な減少が、当該疾患、障害、または状態に罹患しやすい集団において見られるならば、作用剤は当該疾患、障害、または状態を「予防する」とみなされる。予防は、疾患、障害、または状態の発病が所定の期間にわたり遅延した場合に、完了したとみなされ得る。
本明細書において使用される場合、用語「組換え」は、クローニングステップ、制限ステップ、もしくはライゲーションステップ（例えば、これに含まれるポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する）の様々な組み合わせの、および／または天然で見られる生成物と異なる構築物を生じさせる他の手順の生成物である、ベクター、ポリヌクレオチド（例えば組換え核酸）、ポリペプチド、または、細胞を指す。組換えウイルスまたはベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター、組換えバキュロウイルス）は、組換え核酸（例えば、導入遺伝子および１つまたは複数の調節エレメントを含む核酸）を含むベクターゲノムを含む。これらの用語は、オリジナルのポリヌクレオチド構築物の複製物およびオリジナルのウイルス構築物の子孫をそれぞれ含む。
本明細書において使用される場合、用語「対象」は、生物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類、霊長類、実験動物、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、ネコ、イヌ）を指す。一部の実施形態において、ヒト対象は、成人、青年、または小児の対象である。一部の実施形態において、対象は、疾患、障害、または状態に罹患しているか、またはこれらに罹患しやすい。一部の実施形態において、罹患しやすい対象は、疾患、障害、または状態を発症するリスクが増大する傾向があるおよび／または増大している（参照対象または集団で見られる平均リスクと比較して）。一部の実施形態において、対象は、疾患、障害、または状態の１つまたは複数の症候を示す。一部の実施形態において、対象は、疾患、障害、または状態の特定の症候（例えば、疾患の臨床的兆候）または特徴を示さない。一部の実施形態において、対象は、疾患、障害、または状態のいかなる症候も特徴も示さない。一部の実施形態において、対象は、ヒト患者である。例えば、限定はしないが、対象は、血友病（例えば、血友病ＡもしくはＢ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ウィルソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）、ポンペ病、またはＭＹＢＰＣ３突然変異によって生じる肥大型心筋症に罹患している場合がある。
本明細書において使用される場合、用語「実質的に」は、目的の特徴または特質の範囲または程度の全体またはほぼ全体を示すことの質的条件を指す。当業者には、生物学的および化学的現象が完了すること、および／または完了もしくは達成もしくは完全な結果に向かうことは、もしあったとしても稀であることが理解されよう。用語「実質的に」は、したがって、多くの生物学的および化学的現象に固有の、完了の潜在的な欠如を捕捉するために、本明細書において使用される。
本明細書において使用される場合、用語「症候が低減する」または「症候を低減させる」は、特定の疾患、障害、または状態の１つまたは複数の症候が規模（例えば、強度、重症度など）および／または頻度において低減する場合を指す。明確にする目的で、特定の症候の発病の遅延は、その症候の頻度の低減の１つの形態であるとみなされる。
本明細書において使用される場合、用語「治療用ポリペプチド」は、標的細胞（例えば単離細胞）または生物（例えば対象）におけるタンパク質の不在または欠陥の結果生じる症候を軽減し得るまたは低減させ得る、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（例えば、酵素、構造タンパク質、膜貫通タンパク質、輸送タンパク質）である。導入遺伝子によってコードされる治療用ポリペプチドまたはタンパク質は、例えば遺伝的欠陥を修正する、発現または機能に関連する遺伝子における不完全性を修正する利益を対象に付与するものである。同様に、「治療用導入遺伝子」は、治療用ポリペプチドをコードする導入遺伝子である。一部の実施形態において、宿主細胞において発現した治療用ポリペプチドは、導入遺伝子（すなわち、宿主細胞に導入されている外因性の核酸）から発現した酵素である。一部の実施形態において、治療用ポリペプチドは、野生型または機能的バリアントの血液凝固因子、ミニジストロフィン、Ｃ１エステラーゼインヒビター、銅輸送Ｐ型ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰ７Ｂ）、銅－亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、またはミオシン結合タンパク質Ｃ３である。
本明細書において使用される場合、用語「治療有効量」は、当該量が投与される目的である所望の治療効果をもたらす量を指す。一部の実施形態において、当該用語は、疾患、障害、または状態に罹患しているまたはこれらに罹患しやすい集団に、治療投与レジメンに従って投与された場合に、当該疾患、障害、または状態を処置するために十分な量を指す。一部の実施形態において、治療有効量は、疾患、障害、および／もしくは状態の１つもしくは複数の症候の発生および／もしくは重症度を低減させる、ならびに／または、前記症候の発病を遅延させる量である。当業者には、用語「治療有効量」が、特定の個体において成功裏の処置が達成されることを実際には必要としないことが理解されよう。むしろ、治療有効量は、このような処置を必要とする患者に投与された場合に、多数の対象において特定の所望の薬理学的応答をもたらす量であり得る。
本明細書において使用される場合、用語「導入遺伝子」は、宿主細胞、標的細胞、もしくは生物（例えば対象）への送達、および／または宿主細胞、標的細胞、もしくは生物（例えば対象）における発現のための任意の異種ポリヌクレオチドを意味するために使用される。このような「導入遺伝子」は、ベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター、組換えバキュロウイルス）を使用して宿主細胞、標的細胞、または生物に送達され得る。導入遺伝子は、プロモーターなどの制御配列に作動可能に連結していてよい。当業者には、発現制御配列が宿主細胞、標的細胞、または生物における導入遺伝子の発現を促進する能力に基づいて選択され得ることが理解されよう。一般に、導入遺伝子は、天然で導入遺伝子と関連している内因性プロモーターに作動可能に連結していてよいが、より典型的には、導入遺伝子は、導入遺伝子が天然で関連していないプロモーターに作動可能に連結している。導入遺伝子の例は、治療用ポリペプチド、例えば、因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸなどの血液凝固因子をコードする核酸であり、典型的なプロモーターは、因子ＶＩＩＩまたはＩＸを天然でコードするヌクレオチドに作動可能に連結していないものである。このような非内因性プロモーターには、当技術分野において公知の他の多くの中でも、最小のトランスサイレチンプロモーターが含まれ得る。
目的の核酸は、トランスフェクションおよび形質導入を含む、当技術分野において周知の広範な技術によって、宿主細胞に導入することができる。
「トランスフェクション」は、ウイルスベクターを使用することなく外因性の核酸を細胞に導入するための技術として一般に知られている。本明細書において使用される場合、用語「トランスフェクション」は、ウイルスベクターを使用することなく組換え核酸（例えば発現プラスミド）を細胞（例えば宿主細胞）に移入することを指す。組換え核酸が導入されている細胞は、「トランスフェクト細胞」と呼ばれる。トランスフェクト細胞は、組換えＡＡＶベクターを産生するための発現プラスミド／ベクターを含む宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、Ｐｒｏ１０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｓｆ９細胞）であり得る。一部の実施形態において、トランスフェクト細胞（例えばパッキング細胞）は、導入遺伝子を含むプラスミド、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、ならびにヘルパー遺伝子を含むプラスミドを含み得る。多くのトランスフェクション技術が当技術分野において公知であり、これには、限定はしないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性またはアニオン性リポソーム、および核局在化シグナルと組み合わせたリポソームが含まれる。
本明細書において使用される場合、用語「形質導入」は、ウイルスベクターによる、細胞への核酸（例えばベクターゲノム）の移入（例えば、標的細胞へのｒＡＡＶベクターによる移入、または昆虫細胞への組換えバキュロウイルスによるその異種ヌクレオチドの移入）を指す。ウイルスまたはウイルスベクターによって導入遺伝子が導入されている細胞は、「形質導入細胞」と呼ばれる。一部の実施形態において、形質導入細胞は単離細胞であり、形質導入はエクスビボで生じる。一部の実施形態において、形質導入細胞は生物（例えば対象）内の細胞であり、形質導入はインビボで生じる。形質導入細胞は、ポリヌクレオチドを発現するように組換えＡＡＶベクターによって形質導入されている、生物の標的細胞であり得る。
形質導入され得る細胞としては、任意の組織もしくは器官タイプの、または任意の由来源（例えば、中胚葉、外胚葉、もしくは内胚葉）の細胞が含まれる。細胞の非限定的な例としては、肝臓（例えば、肝細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（例えば、ベータ膵島細胞、外分泌腺）、肺、脳（例えば、神経細胞もしくは上衣細胞、オリゴデンドロサイト）または脊椎などの中枢または末梢神経系、腎臓、眼（例えば網膜）、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、隔膜、心臓、筋肉もしくは腰筋、または消化管（例えば内分泌腺）、脂肪組織（白色、褐色、もしくはベージュ）、筋肉（例えば、線維芽細胞、筋細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳神経細胞、あるいは造血（例えば、血球もしくはリンパ）細胞が含まれる。さらなる例としては、肝臓（例えば、肝細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（例えば、ベータ膵島細胞、外分泌腺細胞）、肺、脳（例えば、神経細胞もしくは上衣細胞、オリゴデンドロサイト）または脊椎などの中枢または末梢神経系、腎臓、眼（例えば網膜）、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、隔膜、心臓、筋肉もしくは腰筋、または消化管（例えば内分泌腺）、脂肪組織（白色、褐色、もしくはベージュ）、筋肉（例えば、線維芽細胞、筋細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳神経細胞、あるいは造血（例えば、血球またはリンパ）細胞に発生または分化する万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）前駆細胞などの幹細胞が含まれる。
本明細書において使用される場合、用語「処置」は、特定の疾患、障害、および／もしくは状態の１つもしくは複数の症候、特徴、および／もしくは原因の発病を部分的にもしくは完全に軽減する、改善する、緩和する、阻害する、遅延させる、これらの重症度を低減させる、および／またはこれらの発生を低減させる、治療法の投与を指す。
本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、核酸（例えば組換え核酸）の挿入または組み込みによって操作され得るプラスミド、ウイルス（例えば、ｒＡＡＶ、組換えバキュロウイルス）、コスミド、バクミド、または他の媒体を指す。ベクターは、例えば、核酸を細胞に導入／移入して、挿入された核酸を細胞内で転写または翻訳させるための遺伝子操作（例えばクローニングベクター）を含む、様々な目的に使用することができる。一部の実施形態において、ベクター核酸配列は、細胞内で増殖するための少なくとも１つの複製起点を有する。一部の実施形態において、ベクター核酸としては、異種核酸配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、選択マーカー（例えば抗生物質耐性）、ポリアデノシン（ポリＡ）配列、および／またはＩＴＲが含まれる。一部の実施形態において、ベクター核酸は、ＡＡＶ Ｃａｐ発現カセットおよび／またはＡＡＶ Ｒｅｐ発現カセットを含む。一部の実施形態において、宿主細胞に送達されると、核酸配列は増殖する。一部の実施形態において、インビトロまたはインビボで宿主細胞に送達されると、細胞は、異種核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現する。一部の実施形態において、宿主細胞に送達されると、核酸配列または核酸配列の一部分は、カプシドにパッケージングされる。宿主細胞は、単離細胞、または宿主生物内の細胞であり得る。ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列（例えば導入遺伝子）に加えて、さらなる配列（例えば調節配列）が同一のベクター内に（すなわち、遺伝子に対してシスで）存在し得、遺伝子に隣接し得る。一部の実施形態において、調節配列は、遺伝子の発現を調節するためにトランスで作用する別個の（例えば第２の）ベクター上に存在し得る。プラスミドベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれ得る。
一部の実施形態において、ベクターは、昆虫細胞に適合するベクター（すなわち、昆虫細胞への異種核酸の形質導入を促進するベクター）である。一部の実施形態において、昆虫細胞に適合するベクターは、組換えバキュロウイルス（例えば、バクミドシャトルベクター（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７、４５６６～４５７９、１９９３）など））である。組換えバキュロウイルスは、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞およびエスケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞において優先的に複製し得る。ＢＡＣレプリコンを有するあらゆるウイルスバキュロウイルスを使用することができる。特定の実施形態において、組換えバキュロウイルスゲノムはバクミドである。本明細書において記載される方法において使用され得る適切なバキュロウイルスとしては、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）（マルチカプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）（Ｂｍ）ＮＰＶ、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）（Ｈｅａｒ）ＮＰＶ）、またはシロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）（Ｓｅ）ＭＮＰＶが含まれる。特に、組換えバキュロウイルスは、ＡｃＭＮＰＶクローンＣ６（ゲノム配列：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１６２３．１）またはＥ２（Ｓｍｉｔｈ＆ａｍｐ、Ｓｕｍｍｅｒｓ、１９７９）に由来し得る。
本明細書において使用される場合、用語「ベクターゲノム」は、ｒＡＡＶベクターまたは組換えバキュロウイルスを形成するためにパッケージングまたはカプシド形成される組換え核酸配列を指す。典型的には、ベクターゲノムは、異種ポリヌクレオチド配列、例えば、ＡＡＶまたはバキュロウイルスに元々は存在しない導入遺伝子、調節エレメント、ＩＴＲを含む。組換えプラスミドが組換えベクター（例えばｒＡＡＶベクター）の構築または製造に使用されるケースでは、ベクターゲノムは、プラスミド全体は含まず、むしろ、ウイルスベクターによって送達することを意図した配列のみを含む。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、典型的には「プラスミド骨格」と呼ばれ、これは、組換えウイルスベクター産生の拡大に必要なプロセスである、プラスミドのクローニング、選択、および増幅に重要であるが、これ自体はｒＡＡＶベクター内にパッケージングまたはカプシド形成されない。
本明細書において使用される場合、用語「ウイルスベクター」は一般に、核酸送達媒体として機能するウイルス粒子を指し、これは、ウイルス粒子（すなわちカプシド）内にパッケージングされたベクターゲノムを含み（例えば、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸の代わりに導入遺伝子を含む）、またこれとしては、例えば、ＡＡＶ血清型およびバリアント（例えばｒＡＡＶベクター）を含むレンチウイルスおよびパルボウイルスが含まれる。
ＡＡＶおよびｒＡＡＶベクター
ＡＡＶ
本開示は、昆虫細胞においてｒＡＡＶベクターを産生するための組成物および方法に関する。上記で論じたように、用語「アデノ随伴ウイルス」および／または「ＡＡＶ」は、直鎖状の一本鎖ＤＮＡゲノムおよびそのバリアントを有するパルボウイルスを指す。この用語は、別段のことが必要である場合を除いて、全てのサブタイプ、ならびに天然の形態および組換え形態の両方を網羅する。ＡＡＶを含むパルボウイルスは、細胞に侵入し得、核酸（例えば導入遺伝子）を核内に導入し得るため、遺伝子療法ベクターとして有用である。一部の実施形態において、導入された核酸（例えばｒＡＡＶベクターゲノム）は、形質導入細胞の核内にエピソームとして存続する環状のコンカテマーを形成する。一部の実施形態において、導入遺伝子は、宿主細胞ゲノム内の特異的部位に、例えばヒト１９番染色体上の一部位に挿入される。部位特異的な組み込みは、ランダムな組み込みとは対照的に、予測可能な長期の発現プロファイルをもたらす可能性が高いと考えられている。ヒトゲノム内へのＡＡＶの挿入部位は、ＡＡＶＳ１と呼ばれる。細胞内に導入されると、核酸によってコードされるポリペプチドは細胞によって発現され得る。ＡＡＶはヒトにおけるいずれの病原性疾患とも関連していないため、ＡＡＶによって送達される核酸は、ヒト対象における疾患、障害、および／または状態の処置のための治療用ポリペプチドを発現させるために使用され得る。
複数の血清型のＡＡＶが天然で存在しており、これまでに、少なくとも１５の野生型血清型がヒトから同定されている（すなわち、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１５）。天然血清型およびバリアント血清型は、他のＡＡＶ血清型と血清学的に異なるタンパク質カプシドを有することによって区別される。ＡＡＶ１型（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ３Ａ型（ＡＡＶ３Ａ）およびＡＡＶ３Ｂ型（ＡＡＶ３Ｂ）を含むＡＡＶ３型（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ１０型（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ１２型（ＡＡＶ１２）、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４（ＷＯ２０１６／２１０１７０を参照されたい）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、ならびにヒツジＡＡＶ、ならびに組換えによって産生されたバリアント（例えば、挿入、欠失、および置換を有するカプシドバリアントなど）、例えば、とりわけ、ＡＡＶ２ｉ８型（ＡＡＶ２ｉ８）、ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＤＪ、ＤＪ／８、ＤＪ／９、ＬＫ３、ＲＨＭ４－１と呼ばれるバリアント。「霊長類ＡＡＶ」は霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」はウシ哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、また他も同様である。血清型の特色は、別のＡＡＶと比較した、１つのＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。このような交差反応性の違いは、通常、カプシドタンパク質配列および抗原決定基の違いに起因する（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３配列の違いに起因する）。しかし、一部の天然のＡＡＶまたは人工的なＡＡＶ突然変異体（例えば組換えＡＡＶ）は、現在分かっている血清型のいずれとも血清学的な違いを示さない可能性がある。これらのウイルスは、したがって、対応する型のサブグループ、または、より単純にはバリアントＡＡＶとみなすことができる。したがって、本明細書において使用される場合、用語「血清型」は、血清学的に異なるウイルス、例えばＡＡＶと、血清学的に異ならないが所与の血清型のサブグループまたはバリアントに含まれ得るウイルス、例えばＡＡＶとの両方を指す。
公知のＡＡＶ血清型のカプシドのアミノ酸配列の包括的なリストおよびアラインメントは、Ｍａｒｓｉｃら（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（１１）：１９００～１９０９、特に補足的な図１によって提供されている。
様々な血清型のＡＡＶのゲノム配列、ならびに、ネイティブな末端反復（ＩＴＲ）、ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は、当技術分野において公知である。このような配列は、文献または公共のデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋで見ることができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７（ＡＡＶ１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ１）、ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１７２９（ＡＡＶ３）、ＮＣ＿００１８６３（ＡＡＶ３Ｂ）、ＮＣ＿００１８２９（ＡＡＶ４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２（ＡＡＶ５）、ＮＣ＿００１８６２（ＡＡＶ６）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ８）、およびＮＣ＿００６２６１（ＡＡＶ８）を参照されたく、これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。また、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａら（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９；Ｘｉａｏら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：３７５～３８３；国際特許出願公開第ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４、ＷＯ２０１３／０６３３７９、ＷＯ２０１４／１９４１３２、ＷＯ２０１５／１２１５０１、ならびに米国特許第６，１５６，３０３号および米国特許第７，９０６，１１１号も参照されたい。例示的な目的にすぎないが、野生型ＡＡＶ２は、オーバーラップしている配列を有する３つのタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、全部で６０のカプシドタンパク質がＡＡＶカプシドを構成している）からなる小さな（２０～２５ｎｍ）二十面体のＡＡＶウイルスカプシドを含む。タンパク質ＶＰ１（７３５アミノ酸、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号第ＡＡＣ０３７８０）、ＶＰ２（５９８アミノ酸、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号第ＡＡＣ０３７７８）、およびＶＰ３（５３３アミノ酸、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号第ＡＡＣ０３７７９）は、１：１：１０の比率でカプシド内に存在する。すなわち、ＡＡＶでは、ＶＰ１は完全長タンパク質であり、ＶＰ２およびＶＰ３は、ＶＰ１の次第に短くなっているバージョンであり、ＶＰ１と比較してＮ末端のトランケーションが増大している。
組換えＡＡＶ
上記で論じたように、「組換えアデノ随伴ウイルス」または「ｒＡＡＶ」は、非ネイティブ配列での内因性ウイルスゲノムの全てまたは一部の置換によって、野生型ＡＡＶから区別される。ウイルス内での非ネイティブ配列の組み込みは、ウイルスベクターを「組換え」ベクター、したがって「ｒＡＡＶベクター」と規定する。ｒＡＡＶベクターは、所望のタンパク質またはポリペプチド（例えば血液凝固因子）をコードする異種ポリヌクレオチド（すなわち導入遺伝子）を含み得る。組換えベクター配列はＡＡＶカプシドにカプシド形成またはパッケージングされ得、「ｒＡＡＶベクター」、「ｒＡＡＶベクター粒子」、「ｒＡＡＶウイルス粒子」、または単純に「ｒＡＡＶ」と呼ばれる。
ｒＡＡＶベクターの産生のために、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の所望の比率は、約１：１：１から約１：１：１００の範囲、好ましくは約１：１：２から約１：１：５０の範囲、さらに好ましくは約１：１：５から約１：１：２０の範囲である。ＶＰ１：ＶＰ２の所望の比率は１：１であるが、ＶＰ１：ＶＰ２の比率の範囲は１：５０～５０：１で変化し得る。
ｒＡＡＶベクターに含まれる導入遺伝子には、少なくとも１つの、および時として２つのＡＡＶ末端反復配列（例えば、逆方向末端反復（ＩＴＲ））が隣接している場合がある。ＩＴＲが隣接する導入遺伝子（本明細書において「ベクターゲノム」とも呼ばれる）は、目的のポリペプチドまたは目的の遺伝子（「ＧＯＩ」）、例えば、治療的処置の標的（例えば、血友病ＡまたはＢの処置のための因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸなどの血液凝固因子をコードする核酸）を典型的にはコードする。対象（例えば患者）へのｒＡＡＶベクターの送達または投与は、コードされるタンパク質およびペプチドを対象に提供する。したがって、ｒＡＡＶベクターは、例えば様々な疾患、障害、および状態の処置のために発現させるための導入遺伝子を移入する／送達するために使用され得る。
導入遺伝子によってコードされるタンパク質には、治療用タンパク質が含まれる。非限定的な例としては、血液凝固因子（例えば、因子ＸＩＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩａ、もしくはタンパク質Ｃ）、ミニジストロフィン、Ｃ１エステラーゼインヒビター、銅輸送Ｐ型ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰ７Ｂ）、銅－亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、ミオシン結合タンパク質Ｃ３（ＭＹＢＰＣ３）、ａｐｏＥ２、アルギニノコハク酸シンターゼ、酸性アルファグルコシダーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、ＣＩインヒビターセリンプロテアーゼインヒビター、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通調節因子タンパク質）、抗体、網膜色素上皮特異的な６５ｋＤａのタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属トランスポーター（ＡＴＰ７ＡもしくはＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、リソソーム蓄積症に関与する酵素（ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ホルモン、増殖因子（例えば、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、神経増殖因子、神経栄養因子－３および－４、脳由来神経栄養因子、グリア由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子αおよびβなど）、サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、自殺遺伝子産物（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、シトクロムＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子など）、薬剤耐性タンパク質（例えば、がんの治療法において使用される薬剤に対する耐性をもたらすもの）、腫瘍抑制因子タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１、ＮＦ１、フォン・ヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）、大腸腺腫性ポリポーシス（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ）（ＡＰＣ））、免疫調節特質を有するペプチド、寛容原性もしくは免疫原性ペプチドもしくはタンパク質ＴレジトープもしくはｈＣＤＲ１、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ－ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（コロイデレミア）、ＬＣＡ５（ＬＣＡ－レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（脳回転状萎縮症）、レチノスキシン１（Ｘ染色体連鎖性網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ染色体連鎖性網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＲＰ：網膜色素変性症のＡＲ形態）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ２、３、および４（色覚異常）、ＰＫＤ－１もしくはＰＫＤ－２（多発性嚢胞腎）、リソソーム蓄積症の原因となる遺伝子欠損（例えば、スルファターゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－ｌ－ホスフェートトランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２－ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化剤タンパク質など）、ゲノム編集のための１つもしくは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはゲノム編集のための修復鋳型として使用されるドナー配列が含まれる。一部の実施形態において、導入遺伝子は因子ＶＩＩＩをコードする。一部の実施形態において、導入遺伝子は配列番号９を含む。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクター内に含まれる導入遺伝子は、転写されると転写産物を産生する。このような転写産物は、阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、低分子もしくは単鎖のヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子もしくは単鎖の干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡ）などのＲＮＡであり得る。
非限定的な例としては、以下のもの発現を阻害する阻害的核酸：歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症に関連する遺伝子であるハンチントン（ＨＴＴ）遺伝子（例えば、アトロフィン１、ＡＴＮ１）；球脊髄性筋萎縮症におけるＸ染色体上のアンドロゲン受容体；脊髄小脳失調症（１型、２型、３型、６型、７型、８型、１２型、１７型）における、ヒトアタキシン－１、－２、－３、および－７、（ＣＡＣＮＡ１Ａ）によってコードされるＣａｖ２．１ Ｐ／Ｑ電圧依存性のカルシウムチャネル、ＴＡＴＡ結合タンパク質、ＡＴＸＮ８ＯＳとしても知られているアタキシン８逆鎖、セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａの５５ｋＤａの調節性サブユニットＢベータアイソフォーム；脆弱Ｘ症候群におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）；脆弱Ｘ関連振戦／失調症候群におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）；脆弱ＸＥ精神遅滞におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞２）もしくはＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２；筋強直性ジストロフィーにおけるミオトニンプロテインキナーゼ（ＭＴ－ＰＫ）；フリードライヒ失調症におけるフラタキシン；筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の突然変異体；パーキンソン病および／もしくはアルツハイマー病の発症に関与する遺伝子；高コレステロール血症におけるアポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）およびプロタンパク質コンベルターゼサブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）；ＨＩＶ感染における、ＨＩＶ Ｔａｔ、すなわち、ヒト免疫不全ウイルスの転写遺伝子トランスアクチベーター；ＨＩＶ感染における、ＨＩＶ ＴＡＲ、すなわち、ヒト免疫不全ウイルストランスアクチベーター応答エレメント遺伝子；ＨＩＶ感染におけるＣ－Ｃケモカイン受容体（ＣＣＲ５）；ＲＳＶ感染におけるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ヌクレオカプシドタンパク質；Ｃ型肝炎ウイルス感染における、肝臓特異的なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１２２）；急性腎障害もしくは移植後腎機能障害もしくは腎障害急性腎不全におけるｐ５３；進行性、再発性、もしくは転移性の固形悪性腫瘍におけるプロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）；転移性黒色腫における、プロテアソームサブユニットベータ９型（ＰＳＭＢ９）としても知られているＬＭＰ２；転移性黒色腫における、プロテアソームサブユニットベータ８型（ＰＳＭＢ８）としても知られているＬＭＰ７；転移性黒色腫における、プロテアソームサブユニットベータ１０型（ＰＳＭＢ１０）としても知られているＭＥＣＬ１；固形腫瘍における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；充実性腫瘍におけるキネシン紡錘体タンパク質；慢性骨髄性白血病における、アポトーシスサプレッサーＢ細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ－２）；充実性腫瘍におけるリボヌクレオチドレダクターゼＭ２（ＲＲＭ２）；充実性腫瘍におけるフーリン；肝臓腫瘍におけるポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）；Ｃ型肝炎感染におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）；家族性腺腫性ポリポーシスにおけるベータカテニン；緑内障におけるベータ２アドレナリン受容体；糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）もしくは加齢性黄斑変性における、ＤＮＡ損傷誘導性転写産物４タンパク質としても知られているＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄ１；加齢性黄斑変性もしくは脈絡膜血管新生における、血管内皮増殖因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）、非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２；先天性爪甲硬厚症における、ケラチン６Ａ Ｎ１７Ｋ突然変異タンパク質；インフルエンザ感染における、インフルエンザＡウイルスゲノム／遺伝子配列；ＳＡＲＳ感染における、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスゲノム／遺伝子配列；呼吸器合胞体ウイルス感染における、呼吸器合胞体ウイルスゲノム／遺伝子配列；エボラ感染における、エボラフィロウイルスゲノム／遺伝子配列；ＢおよびＣ型肝炎感染におけるＢおよびＣ型肝炎ウイルスゲノム／遺伝子配列；ＨＳＶ感染における単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム／遺伝子配列；コクサッキーウイルスＢ３感染における、コクサッキーウイルスＢ３ゲノム／遺伝子配列；原発性ジストニアにおける、トルシンＡ（ＴＯＲ１Ａ）のような遺伝子の病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子特異的なサイレンシング）；移植片において特異的なｐａｎ－クラスＩおよびＨＬＡ対立遺伝子；常染色体優性遺伝の網膜色素変性症（ａｄＲＰ）における突然変異ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）；または、前述の遺伝子もしくは配列のいずれかの転写産物に結合する阻害的核酸が含まれる。
ｒＡＡＶベクターゲノムは一般に、ウイルスのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を置換した異種核酸配列に対してシスの１４５塩基のＩＴＲを保持している。このようなＩＴＲは、組換えＡＡＶベクターを産生するために必要である。しかし、合成配列を部分的にまたは完全に含む、修飾されたＡＡＶ ＩＴＲおよび非ＡＡＶ末端反復もまた、この目的を果たすことができる。ＩＴＲはヘアピン構造を形成し、例えば、感染後の宿主細胞介在性の相補的ＤＮＡ鎖合成のためのプライマーとして働くように機能する。ＩＴＲはまた、ウイルスのパッケージング、組み込みなどにおいても役割を有する。ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの複製およびｒＡＡＶベクターへのパッケージングングのためにシスである必要がある、唯一のＡＡＶウイルスエレメントである。ｒＡＡＶベクターゲノムは、異種配列（例えば、限定はしないが、アンチセンスおよびｓｉＲＮＡ、とりわけＣＲＩＳＰＲ分子を含む、目的の遺伝子または目的の核酸配列をコードする導入遺伝子）を含むベクターゲノムの５’および３’末端に通常ある２つのＩＴＲを含んでいてもよい。５’および３’ＩＴＲは共に同一の配列を含み得るか、または各々が異なる配列を含み得る。ＡＡＶ ＩＴＲは、限定はしないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１を含むあらゆるＡＡＶ、またはあらゆる他のＡＡＶに由来し得る。一部の実施形態において、ＩＴＲはＡＡＶ２に由来する。
本開示のｒＡＡＶベクターは、カプシドの血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＯｌｉｇ００１）と異なるＡＡＶ血清型（例えば、野生型ＡＡＶ２、これらの断片またはバリアント）のＩＴＲを含み得る。１つの血清型の少なくとも１つのＩＴＲを含むが、異なる血清型のカプシドを含む、このようなｒＡＡＶベクターは、ハイブリッドウイルスベクターと呼ぶことができる（米国特許第７，１７２，８９３号を参照されたい）。ＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ＩＴＲ配列全体を含み得るか、またはそのバリアント、断片、もしくは修飾体であり得るが、機能性は保持する。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、直鎖状であり、一本鎖であり、そしてＡＡＶ ＩＴＲが隣接している。異種遺伝子の転写および翻訳の前に、およそ４７００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡゲノムは、第２の鎖の合成を開始するための一方のセルフプライミングＩＴＲの遊離３’－ＯＨを使用して、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、形質導入細胞内のＤＮＡポリメラーゼ）によって、二本鎖形態に変換されなければならない。一部の実施形態において、完全長の一本鎖ベクターゲノム（すなわち、センスおよびアンチセンス）は、アニーリングされて、完全長の二本鎖ベクターゲノムとなる。これは、異極性のゲノム（すなわち、センスまたはアンチセンス）を有する複数のｒＡＡＶベクターが同時に同一の細胞に形質導入される場合に生じ得る。二本鎖ベクターゲノムが一度形成されると、それらがどのようにして産生されるかにかかわらず、細胞は二本鎖ＤＮＡを転写および翻訳することができ、異種遺伝子を発現することができる。
ｒＡＡＶベクターからの導入遺伝子の発現の効率は、発現の前に一本鎖ｒＡＡＶゲノム（ｓｓＡＡＶ）を二本鎖ＤＮＡに変換する必要性によって妨げられ得る。このステップは、ＤＮＡ合成または複数のベクターゲノム間での塩基対合を必要とすることなく二本鎖ＤＮＡにフォールディングすることができる逆反復ゲノムをパッケージングし得る自己相補的ＡＡＶゲノム（ｓｃＡＡＶ）を使用することによって回避される（ＭｃＣａｒｔｙ（２００８）Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒａｐｙ １６（１０）：１６４８～１６５６；ＭｃＣａｒｔｙら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１２４８～１２５４；ＭｃＣａｒｔｙら（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２１１２～２１１８）。ｓｃＡＡＶベクターの制約は、カプシドにパッケージングされる固有の導入遺伝子、調節エレメント、およびＩＲＴのサイズが、ｓｓＡＡＶベクターゲノム（すなわち、２つのＩＴＲを含めて約４９００ヌクレオチド）のおよそ半分のサイズ（すなわち、そのうち２２００ヌクレオチドが導入遺伝子および調節エレメントであり得る約２５００ヌクレオチドと、それに加えて、約１４５ヌクレオチドのＩＴＲの２つのコピー）であることである。
ｓｃＡＡＶベクターゲノムは、末端分離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）（ＴＲＳ）を含まない核酸を使用することによって、またはＴＲＳを改変することによって、ベクター、例えば、ベクターゲノムを含むプラスミドの１つのｒＡＡＶ ＩＴＲから作製され、これによって、その末端からの複製の開始が予防される（米国特許第８，７８４，７９９号を参照されたい）。宿主細胞内でのＡＡＶの複製は、ｓｃＡＡＶベクターゲノムの野生型ＩＴＲで開始され、末端分離部位を欠くまたは改変された末端分離部位を含むＩＴＲを通り、次いでゲノム全体を戻るように継続することで相補鎖を生じさせる。結果として得られた相補的な単一核酸分子は、したがって、突然変異した（分離されていない）ＩＴＲを中央に、および野生型ＩＴＲを各末端に有するベクターゲノムを生じさせる自己相補的核酸分子である。一部の実施形態において、ＴＲＳを欠くまたは改変されたＴＲＳを含む突然変異ＩＴＲは、ベクターゲノムの５’末端にある。一部の実施形態において、分離されていない（切断されていない）、ＴＲＳを欠くまたは改変されたＴＲＳを含む突然変異ＩＴＲは、ベクターゲノムの３’末端にある。
理論に拘束されることは望まないが、ｓｃＡＡＶゲノムの半分同士は相補的であるが、塩基の多くが内部カプシドシェルのアミノ酸残基と接触しており、リン酸骨格が中央の方に閉じ込められているため、カプシド内で実質的な塩基対合はないと思われる（ＭｃＣａｒｔｙ，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１６（１０）：１６４８～１６５６）。脱殻の際に、ｓｃＡＡＶゲノムの半分同士はアニーリングして、共有結合的によって閉じたＩＴＲを一方の末端に有し、末端が開いた２つのＩＴＲを他方の末端に有するｄｓＤＮＡヘアピン分子を形成する可能性が考えられる。ＩＴＲは、とりわけ導入遺伝子およびそれに対してシスの調節エレメントをコードする二本鎖領域に隣接する。
本明細書において記載される方法において使用されるｒＡＡＶベクターのウイルスカプシドは、野生型ＡＡＶまたはバリアントＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４（ＷＯ２０１６／２１０１７０を参照されたい）、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＲＨＭ４－１（ＷＯ２０１５／０１３３１３の配列番号５）、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶｈｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２９Ｇ、ＡＡＶ２．８Ｇ９、ＡＶＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、およびこれらのバリアントのものであり得る（例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照されたい）。カプシドは、米国特許第７，９０６，１１１号；Ｇａｏら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１；Ｍｏｒｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３：３７５；ＷＯ２０１３／０６３３７９；ＷＯ２０１４／１９４１３２において開示されているいくつかのＡＡＶ血清型に由来し得、ＷＯ２０１５／１２１５０１において開示されている真のタイプのＡＡＶ（ＡＡＶ－ＴＴ）バリアント、ならびに、ＷＯ２０１５／０１３３１３において開示されているＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１からＲＨＭ１５－６、およびこれらのバリアントを含む。当業者には、同一のまたは類似の機能を果たすことがまだ同定されていない他のＡＡＶバリアントが存在する可能性があることが認知されよう。ＡＡＶ ｃａｐタンパク質の完全な一式には、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３が含まれる。ＡＡＶのＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の完全な一式は含まないか、またはＡＡＶ ｃａｐタンパク質の完全な一式が提供され得る。
別の実施形態において、本開示は、治療的なインビボ遺伝子療法において使用するための祖先ＡＡＶベクターの使用を提供する。具体的には、インシリコ由来の配列をデノボ合成し、生物学的活性について特徴付けることができる。祖先配列の予測および合成は、ｒＡＡＶベクターへのアセンブリに加えて、その内容が参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０５４６５３において記載されている方法を使用して行うことができる。特に、祖先ウイルス配列からアセンブリされたｒＡＡＶベクターは、現在のウイルスまたはその一部分と比較して弱い、ヒト集団における既存の免疫性に対する感受性を示し得る。
一部の実施形態において、２つ以上のＡＡＶ血清型（例えば、野生型ＡＡＶ血清型、バリアントＡＡＶ血清型）に由来するヌクレオチド配列によってコードされるカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶベクターは、「キメラベクター」または「キメラカプシド」と呼ばれる（その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，４９１，９０７号を参照されたい）。一部の実施形態において、キメラカプシドタンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるＡＡＶ血清型に由来する核酸配列によってコードされる。一部の実施形態において、組換えＡＡＶベクターには、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ２ｉ８、またはこれらのバリアントに由来するカプシド配列が含まれ、前述のＡＡＶ血清型のいずれかに由来するアミノ酸の組み合わせを含むキメラカプシドタンパク質を生じさせる（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（２）：７９１～８０１を参照されたい）。あるいは、キメラカプシドは、１つの血清型のＶＰ１、異なる血清型のＶＰ２、さらに異なる血清型のＶＰ３、およびこれらの組み合わせの混合物を含み得る。例えば、キメラウイルスカプシドは、１つのＡＡＶ１ ｃａｐタンパク質またはサブユニット、および少なくとも１つのＡＡＶ２ ｃａｐタンパク質またはサブユニットを含み得る。キメラカプシドは、例えば、１つまたは複数のＢ１９ ｃａｐサブユニットを有するＡＡＶカプシドを含み得、例えば、ＡＡＶ ｃａｐタンパク質またはサブユニットは、Ｂ１９ ｃａｐタンパク質またはサブユニットで置換することができる。例えば、一実施形態において、ＡＡＶカプシドのＶＰ３サブユニットをＢ１９のＶＰ２サブユニットによって置換することができる。
一部の実施形態において、キメラベクターは、改変された向性、または特定の組織もしくは細胞型への向性を示すように操作されている。用語「向性」は、ある特定の細胞もしくは組織型へのウイルスの優先的な侵入、ならびに／またはある特定の細胞もしくは組織型への侵入を促進する細胞表面との優先的な相互作用を指す。ＡＡＶの向性は一般に、個別のウイルスカプシドタンパク質とそれらの同族細胞受容体との間の特異的な相互作用によって決定される（Ｌｙｋｋｅｎら（２０１８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｄｅｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．１０：１６）。好ましくは、ウイルスまたはウイルスベクターが細胞に侵入すると、ベクターゲノム（例えば、ｒＡＡＶベクターゲノム）が有する配列（例えば、導入遺伝子などの異種配列）が発現する。
一部の実施形態において、本明細書において記載される方法において使用されるｒＡＡＶベクターのウイルスカプシドは、野生型ＡＡＶまたはバリアントＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ８のものであり得る。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、疾患、障害、または状態を処置または予防するために有用である。一部の実施形態において、疾患、障害、または状態としては（限定はしないが）、血友病（例えば、血友病ＡもしくはＢ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ウィルソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）、ポンペ病、またはＭＹＢＰＣ３突然変異によって生じる肥大型心筋症が含まれる。
方法および組成物
本開示は、昆虫細胞内のバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）系におけるｒＡＡＶベクターの産生を増強するための組成物および方法に関する。上記で論じたように、クリッピングされたＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のレベルと、相対的なインビトロでの効力との間で逆相関が見られ、この場合、クリッピングされたＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のレベルが感染後の時間と共に増大するにつれ、インビトロでの効力は低下した。感染後の時間に伴うクリッピングされたＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のこの増大およびインビトロでの効力の付随する低下は、大規模産生（２０００Ｌ）および小規模産生（２Ｌ、１０Ｌ、または２００Ｌ）の両方で見られた。
具体的には、２つの形態のクリッピングされたＶＰ１およびＶＰ２タンパク質が同定された。第１のクリッピングされた分子種は、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１アミノ酸残基Ｇｌｙ１１５とＡｒｇ１１６との間のタンパク質分解性の切断の後に残っているＣ末端ペプチドに対応する。第２のクリッピングされた分子種は、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のタンパク質分解性の切断後に残っているＣ末端ペプチドに対応する。
したがって、一部の態様において、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生するための方法が提供される。本方法は、昆虫細胞を、各々が異種配列を含む１つまたは複数の組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１アミノ酸残基Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６の間、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが１５％以下であるｒＡＡＶベクターを産生するために十分な時間にわたり、適切な条件下で昆虫細胞を培養するステップを含む。したがって、本方法は、ウイルスカプシドの全ＶＰ１タンパク質の１５％以下がアミノ酸残基Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６の間でクリッピングされているｒＡＡＶベクターを産生する。
一部の態様において、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生するための方法が提供される。本方法は、昆虫細胞を、各々が異種配列を含む１つまたは複数の組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピングが６５％以下であり、かつＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下である、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが上記指定の割合であるｒＡＡＶベクターを産生するために十分な時間にわたり、適切な条件下で昆虫細胞を培養するステップを含む。
また、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのインビトロでの効力を増大させるための方法も、本明細書において開示されている。本方法は、昆虫細胞を、各々が異種配列を含む１つまたは複数の組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに、ｒＡＡＶベクターのインビトロでの効力が１０％～５００％の間となり、ＶＰ１タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下となるように、昆虫細胞を適切な条件下で培養する時間を最適化するステップを含む。
一部の態様において、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのインビトロでの効力を増大させるための方法が提供される。本方法は、昆虫細胞を、各々が異種配列を含む１つまたは複数の組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに、ｒＡＡＶベクターのインビトロでの効力が１０％～５００％の間となり、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピングが６５％以下となり、かつＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下となる、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが上記指定の割合となるように、昆虫細胞を適切な条件下で培養する時間を最適化するステップを含む。
限定はしないが、野生型ＡＡＶまたはバリアントＡＡＶのカプシド、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４（ＷＯ２０１６／２１０１７０を参照されたい）、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＲＨＭ４－１（ＷＯ２０１５／０１３３１３の配列番号５）、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶｈｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２９Ｇ、ＡＡＶ２．８Ｇ９、ＡＶＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、およびこれらのバリアント（例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照されたい）を含む、あらゆるウイルスＡＡＶカプシド（例えば、野生型またはバリアント）を、本明細書において記載される方法において使用することができる。一部の実施形態において、カプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６、および／またはＡＡＶ８に由来する。一部の実施形態において、カプシドはＡＡＶ６に由来する。
当業者は、様々なＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質（ＶＰ１およびＶＰ２）のアミノ酸配列の比較に基づいて、「野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基」および「野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基」が任意の所与のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２カプシドタンパク質のどこにあるかを容易に確認することができる。野生型（天然）の血清型ＡＡＶ１（配列番号１）、ＡＡＶ３Ａ（配列番号２）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番号３）、ＡＡＶ６（配列番号４）、およびＡＡＶ８（配列番号５）の間の、およびこれらにわたるアミノ酸位置を提供する野生型ＡＡＶの配列番号１～５のアラインメントについて、図５も参照されたい。
一部の実施形態において、産生されたｒＡＡＶベクターは、ＶＰ１タンパク質の総量に対して１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１アミノ酸残基Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６の間、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングを有する。一部の実施形態において、産生されたｒＡＡＶベクターは、ＶＰ１タンパク質の総量に対して約１２％から約１５％の間の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１アミノ酸残基Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６の間、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングを有する。一部の実施形態において、産生されたｒＡＡＶベクターは、ＶＰ１タンパク質の総量に対して５％未満の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１アミノ酸残基Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６の間、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングを有する。一部の実施形態において、産生されたｒＡＡＶベクターは、ＶＰ１タンパク質の総量に対して約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、または約５％の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１アミノ酸残基Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６の間、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングを有する。
一部の実施形態において、産生されたｒＡＡＶベクターは、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質の総量と比較して６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、２％以下、または１％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基Ｇｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０の間、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングを有する。一部の実施形態において、産生されたｒＡＡＶベクターは、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質の総量と比較して約３０％～約６０％の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基Ｇｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０の間、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングを有する。
一部の実施形態において、産生されたｒＡＡＶベクターは、４０％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基Ｇｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０の間のクリッピング、ならびに、２％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１アミノ酸残基Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６の間のクリッピング、または、上記指定の割合の、別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングを有する。
一部の実施形態において、産生されたｒＡＡＶベクターは、４８％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基Ｇｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０の間のクリッピング、ならびに、２．５％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１アミノ酸残基Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６の間のクリッピング、または、上記指定の割合の、別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングを有する。
一部の実施形態において、産生されたｒＡＡＶベクターは、５２％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基Ｇｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０の間のクリッピング、ならびに、１１％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１アミノ酸残基Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６の間のクリッピング、または、上記指定の割合の、別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングを有する。
一部の実施形態において、産生されたｒＡＡＶベクターは、４７％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基Ｇｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０の間のクリッピング、ならびに、９％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１アミノ酸残基Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６の間のクリッピング、または、上記指定の割合の、別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングを有する。
一部の実施形態において、産生されたｒＡＡＶベクターは、４３％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基Ｇｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０の間のクリッピング、ならびに、９％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６の間のクリッピング、または、上記指定の割合の、別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングを有する。
一部の実施形態において、産生されたｒＡＡＶベクターは、４９％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基Ｇｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０の間のクリッピング、ならびに、１３％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１アミノ酸残基Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６の間のクリッピング、または、上記指定の割合の、別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングを有する。
一部の実施形態において、産生されたｒＡＡＶベクターは、３７％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基Ｇｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０の間のクリッピング、ならびに、９％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１アミノ酸残基Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６の間のクリッピング、または、上記指定の割合の、別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングを有する。
一部の実施形態において、昆虫細胞は、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質でのクリッピングが７５％以下の（すなわち、両分子種で見られた総クリッピングが７５％以下である）ｒＡＡＶベクターを産生するために十分な時間にわたり培養される。一部の実施形態において、産生されたｒＡＡＶは、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、２％以下、または１％以下の、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質でのクリッピングを有する。一部の実施形態において、産生されたｒＡＡＶは、約３５％から約５５％の間の、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質での全クリッピングを有する。
ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質でのクリッピングは、限定はしないが、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、質量分析（多特性質量分析を含む）、および／またはウェスタンブロットアッセイなどの、当技術分野において周知のアッセイを使用して決定することができる。例えば、タンパク質分解性の消化に基づく多特性方法（ＭＡＭ）と、その後の液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）とによって、生成物の品質特性の同時の部位特異的な検出および定量が可能となる（例えば、Ｚｈａｎｇら、ＭＡｂｓ．２０２０年１月～１２月、１２（１）：１７８３０６２を参照されたい）。本方法は、変性、還元、アルキル化、バッファー交換を含むサンプル調製と、その後のトリプシン消化とを伴う。得られたペプチドは次いで、ペプチドマップを作成するために、緩やかな溶出勾配を伴う逆相液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を使用して分離される。ＨＰＬＣはまた、アミノ酸修飾を解明するために、高解像度の質量分析計と組み合わせることができる。ＭａｓｓＡｎａｌｙｚｅｒなどの特注のソフトウェアを使用してデータを処理して、ピーク検出、保持時間のアラインメント、ピークの同定および定量を行うことができる。
同様に、キャピラリーゲル電気泳動を使用して、大きく向上した正確度、精度、および感度でカプシドタンパク質の純度を分析することができる（Ｚｈａｎｇら、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ ｗｉｔｈ Ｌａｓｅｒ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓ ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ－Ｆｒｉｅｎｄｌｙ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｔｙ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０２１年１月２２日）。
「昆虫細胞を１つまたは複数の組換えバキュロウイルスと接触させる」は、１つまたは複数の組換えバキュロウイルスを昆虫細胞の十分近くに導入して、組換えバキュロウイルスによる昆虫細胞の形質導入を可能にすることを含む。組換えバキュロウイルスを使用して昆虫細胞にｒＡＡＶベクターを産生させる実現可能性は、Ｕｒａｂｅら（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３：１９３５～４３（２００２））、Ｋｏｔｉｎら（ＵＳ２００４／０１９７８９５）、およびＫｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒ（ＵＳ２００６／０１６６３６３）によって実証されている。ＡＡＶの複製を可能にする、および培養で維持され得るあらゆる昆虫細胞を、本明細書において記載される方法において使用することができる。例えば、使用される細胞系は、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、例えばＳｆ９もしくはＳｆ２１細胞系、ショウジョウバエ細胞系、または蚊細胞系、例えば、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来の細胞系のものであり得る。異種タンパク質の発現のための昆虫細胞の使用は、核酸、例えばベクター、例えば昆虫細胞に適合するベクターをこのような細胞に導入する方法、およびこのような細胞を培養において維持する方法と同様、文献に良く記載されている。例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｒｉｃｈａｒｄ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９５）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２～８（１９８９）；Ｋａｊｉｇａｙａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４６４６～５０（１９９１）；Ｒｕｆｆｉｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒ．６６：６９２２～３０（１９９２）；Ｋｉｒｎｂａｕｅｒら、Ｖｉｒ．２１９：３７～４４（１９９６）；Ｚｈａｏら、Ｖｉｒ．２７２：３８２～９３（２０００）；およびＳａｍｕｌｓｋｉら、米国特許第６，２０４，０５９号を参照されたい。好ましい細胞系は、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞系である。
組換えバキュロウイルス（例えば、異種核酸を含むように修飾されたバキュロウイルス）を産生する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、限定はしないが、ｆｌａｓｈＢＡＣ、ＢＡＣＰＡＫ６、またはｂａｃ－ｔｏ－ｂａｃ部位特異的転位系である（例えば、Ｋｉｔｔｓら（１９９０）Ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１（１９）、５６６７～７２；Ｋｉｔｔｓら（１９９３）Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４、８１０；およびＡｎｄｅｒｓｏｎら（１９９６）Ｎｅｗ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ．Ｆｏｃｕｓ １７、５３を参照されたい）。一部の実施形態において、本明細書において記載される方法において使用される組換えバキュロウイルスは、精製された組換えバキュロウイルスである。一部の実施形態において、本明細書において記載される方法において使用される組換えバキュロウイルスは、組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞（ＢＩＩＣとも呼ばれる）である。
組換えバキュロウイルスは、異種配列を含む。異種配列は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８／６８、Ｒｅｐ５２／４０）および／またはＡＡＶ Ｃａｐタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）をコードする核酸配列を含み得る。ＡＡＶ Ｒｅｐおよび／またはＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードする核酸配列を含むバキュロウイルスは、ヘルパー組換えバキュロウイルスと呼ばれる。異種配列はまた、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接する目的の遺伝子（例えば導入遺伝子）をコードする核酸配列を含み得る。このような導入遺伝子をコードする核酸配列を含むバキュロウイルスは、ベクター組換えバキュロウイルスと呼ばれる。
一部の実施形態において、昆虫細胞は、３つの組換えバキュロウイルス、
（ｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、および／またはＲｅｐ４０）をコードする異種配列を含むヘルパー組換えバキュロウイルス、
（ｉｉ）ＡＡＶカプシド（ｃａｐ）タンパク質（例えば、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質）をコードする異種配列を含むヘルパー組換えバキュロウイルス、ならびに
（ｉｉｉ）一方は５’末端で、および他方は３’末端で２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接する導入遺伝子をコードする異種配列を含むベクター組換えバキュロウイルス
と接触させられる。
一部の実施形態において、昆虫細胞は、２つの組換えバキュロウイルス、
（ｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、および／またはＲｅｐ４０）およびＡＡＶカプシド（ｃａｐ）タンパク質（例えば、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質）をコードする異種配列を含むヘルパー組換えバキュロウイルス、ならびに
（ｉｉ）一方は５’末端で、および他方は３’末端で２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接する導入遺伝子をコードする異種配列を含むベクター組換えバキュロウイルス
と接触させられる。
上記で論じたように、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子は、目的のポリペプチド、または目的の遺伝子（「ＧＯＩ」）を典型的にはコードする。導入遺伝子によってコードされるタンパク質としては、治療用タンパク質、例えば、限定はしないが、血液凝固因子（例えば、因子ＸＩＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩａ、もしくはタンパク質Ｃ）、ミニジストロフィン、Ｃ１エステラーゼインヒビター、銅輸送Ｐ型ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰ７Ｂ）、銅－亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、ミオシン結合タンパク質Ｃ３、ａｐｏＥ２、アルギニノコハク酸シンターゼ、酸性アルファグルコシダーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、ＣＩインヒビターセリンプロテアーゼインヒビター、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通調節因子タンパク質）、ゲノム編集のための１つもしくは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはゲノム編集のための修復鋳型として使用されるドナー配列が含まれる。一部の実施形態において、導入遺伝子は、因子ＶＩＩＩをコードする。一部の実施形態において、因子ＶＩＩＩ導入遺伝子には、ＡＡＶ２ ＩＴＲが隣接している。一部の実施形態において、導入遺伝子は配列番号９を含む。
「細胞を適切な条件下で培養する」は、ｒＡＡＶベクターの産生を可能にする細胞培養培地および環境条件において昆虫細胞を増殖させることを指す。適切な条件の例には、限定はしないが、本方法において使用する、細胞を培養する温度、細胞培養培地のタイプ、組換えバキュロウイルスを添加する生存細胞密度標的、細胞培養培地中の溶解した酸素の量、ヘルパー組換えバキュロウイルスの量、および／またはベクター組換えバキュロウイルスの量が含まれる。
一部の実施形態において、昆虫細胞は、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが１５％以下であるｒＡＡＶベクターの産生を可能にするために十分な時間にわたり培養される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピングが６５％以下であり、かつＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下である、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが上記指定の割合であるｒＡＡＶベクターの産生を可能にするために十分な時間にわたり培養される。
一部の実施形態において、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間、もしくは別のＡＡＶ血清型のＶＰ１タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが１５％以下であるｒＡＡＶベクターの産生を可能にする、または、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピングが６５％以下であり、かつＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下であるｒＡＡＶベクターの産生を可能にする、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが上記指定の割合であるｒＡＡＶベクターの産生を可能にするために十分な時間は、２４時間、２日間、３日間、４日間、４．１日間、４．２日間、４．３日間、４．４日間、４．５日間、４．６日間、４．７日間、４．８日間、４．９日間、５日間、５．１日間、５．２日間、５．３日間、５．４日間、５．５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間である。一部の実施形態において、昆虫細胞は、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に少なくとも４．１日間、しかし１０日間以下培養される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に約４日間、４．１日間、４．２日間、４．３日間、４．４日間、４．５日間、４．６日間、４．７日間、４．８日間、４．９日間、５日間、５．１日間、５．２日間、５．３日間、５．４日間、または５．５日間培養される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に約９６時間から約１２８時間培養される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に約１０３時間から約１６３時間培養される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に約１０８±５時間培養される。
ｒＡＡＶベクターの産生を可能にするために十分な時間（「感染後の時間」または「感染後のバッチ期間」とも呼ばれる）は、組換えバキュロウイルスを昆虫細胞と接触させることと、昆虫細胞からのｒＡＡＶベクターの採取（すなわち回収）（すなわち、ｒＡＡＶは、限定はしないが、消化、濾過、遠心分離、クロマトグラフィー、および／またはウイルス不活化ステップなどの当技術分野において周知の方法によって昆虫細胞から回収される）との間の時間を指す。
「インビトロでの効力」は、本明細書において記載される方法によって産生されるｒＡＡＶのインビトロ（すなわち、生存している生物の外部）での活性の測定値を指す。例えば、インビトロでの効力は、ｒＡＡＶベクターの感染性、導入遺伝子の発現、および／または導入遺伝子によってコードされるタンパク質の機能に関して測定され得る。ｒＡＡＶベクターのインビトロでの効力を測定するためのアッセイは当技術分野において周知であり、これとしては、（限定はしないが）比色アッセイ、発色アッセイ、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ、定量ＰＣＲ、および／またはウェスタンブロットが含まれる。
一部の実施形態において、比色アッセイが、ｒＡＡＶベクターのインビトロでの効力を測定するために使用される。血液凝固因子である因子ＶＩＩＩをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターのインビトロでの効力を測定するための比色アッセイの例は、肝臓癌細胞をＡＡＶに曝露し、当該細胞を数日間培養し、その後、発色基質を使用して、採取した培地における因子ＶＩＩＩ活性を定量することを伴う（図４）。
本開示は、産生されたｒＡＡＶベクターのインビトロでの効力を増大させる（すなわち、向上させる、増強させる、および／または最適化する）ための方法を提供する。インビトロでの効力のこの増大、向上、増強、および／または最適化は、本明細書において記載される方法によって産生されていないｒＡＡＶベクターのインビトロでの効力値と比較して測定され得る。例えば、本明細書において記載される方法によって産生されたｒＡＡＶベクターは、６５％以下の、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピング、ならびに、１５％以下の、Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピング、または上記指定の割合の、別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングを有し、かつ、６５％超の、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピング、ならびに、１５％超の、Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピング、または上記指定の割合の、別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングを有するｒＡＡＶベクターと比較したインビトロでの効力の増大、向上、または増強を伴う。
上記で、および本明細書において記載される実施例において論じられるように、データは、クリッピングされたＶＰ１／ＶＰ２タンパク質のレベルと、相対的なインビトロでの効力との間の逆相関を示し、この場合、クリッピングされたＶＰ１およびＶＰ２のレベルが感染後の時間と共に増大するにつれ、インビトロでの効力は低下した。感染後の時間に伴うクリッピングされたＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のこの増大およびインビトロでの効力の付随する低下は、大規模産生（２０００Ｌ）および小規模産生（２Ｌ、１０Ｌ、または２００Ｌ）の両方で見られた。観察された、クリッピングされたＶＰ１およびＶＰ２タンパク質は、２つの形態に対応しており、このうち、第１のクリッピングされた分子種は、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１アミノ酸残基Ｇｌｙ１１５とＡｒｇ１１６との間のタンパク質分解性の切断の後に残っているＣ末端ペプチドに対応しており、一方、第２のクリッピングされた分子種は、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１アミノ酸残基およびＶＰ２アミノ酸残基の間のタンパク質分解性の切断後に残っているＣ末端ペプチドに対応する。
文献（Ｚａｄｏｒｉ Ｚ、Ｓｚｅｌｅｉ Ｊ、Ｌａｃｏｓｔｅ ＭＣ、Ｌｉ Ｙ、Ｇａｒｉｅｐｙ Ｓ、Ｒａｙｍｏｎｄ Ｐ、Ａｌｌａｉｒｅ Ｍ、Ｎａｂｉ ＩＲ、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｐ． Ａ ｖｉｒａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ． Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ．２００１、１（２）：２９１～３０２；Ｇｉｒｏｄ Ａ、Ｗｏｂｕｓ ＣＥ、Ｚａｄｏｒｉ Ｚ、Ｒｉｅｄ Ｍ、Ｌｅｉｋｅ Ｋ、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｐ、Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ ＪＡ、Ｈａｌｌｅｋ Ｍ． Ｔｈｅ ＶＰ１ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ａ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２００２、８３（Ｐｔ５）：９７３～９７８．ｄｏｉ：１０．１０９９／００２２－１３１７－８３－５－９７３）は、ＶＰ１タンパク質がＡＡＶの感染性およびインビトロでの効力に重要であること、ならびにバキュロウイルス発現系が野生型ＡＡＶと比較して低レベルのＶＰ１を天然に産生することを実証している。したがって、一見すると小さな、クリッピングされたＶＰ１タンパク質のレベルの違いは、インビトロでの効力に対する大きな影響を有し得る。
感染性におけるＶＰ１タンパク質の役割は、ＡＡＶゲノムの遺伝子分析において早くに認識された。ＶＰ１のＮ末端領域を欠く突然変異では、正常レベルのＤＮＡ複製およびカプシド形成が得られたが、ウイルス感染性は低かった（Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＰＬら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｍｕｔａｎｔｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９８４、５１（２）：３２９～３９）。ＶＰ１およびＶＰ２のＮ末端領域は、通常はＡＡＶカプシド内に内在化しており、２回対称軸の内表面で電子密度の球体構造を形成している（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｓら、Ａ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｃａｐｓｉｄ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｈｉｄｄｅｎ ＶＰ１ Ｎ ｔｅｒｍｉｎｉ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００５、７９（９）：５２９６～３０３）。熱ショック、またはエンドソームリソソーム系を通る輸送に伴う酸性化に応答して、これらのＮ末端の伸長は、カプシドの５回対称軸にある孔を通って突き出し、カプシドの外側で提示されて、ウイルス感染における必須の機能を果たす。
ＡＡＶ ＶＰ１のＮ末端の固有の領域の最も顕著な特徴は、全てのパルボウイルスに存在する、アミノ酸（ａａ）４５～１０３に延びるホスホリパーゼＡ２ドメイン（ＰＬＡ２）である。このホスホリパーゼ活性は、ウイルスの接着および標的細胞内への内在化に続く、エンドソームエスケープに必須である（Ｚａｄｏｒｉ Ｚら、Ａ ｖｉｒａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ． Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ．２００１、１（２）：２９１～３０２；Ｇｉｒｏｄ Ａら、Ｔｈｅ ＶＰ１ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ａ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２００２、８３（Ｐｔ５）：９７３～９７８）。
ＡＡＶ ＶＰ１のＰＬＡ２ドメイン内に突然変異または欠失を有するカプシドは、標的細胞に接着し内在化する能力を保持しているが、遺伝子発現に欠陥がある（Ｇｉｒｏｄ Ａら、Ｔｈｅ ＶＰ１ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ａ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２００２、８３（Ｐｔ５）：９７３～９７８）。ＡＡＶ６のアミノ酸１１５および／またはアミノ酸１８９でのＶＰ１タンパク質の切断は、ホスホリパーゼＡ２ドメイン（ＰＬＡ２）の喪失、およびそれに続く感染性の喪失をもたらす。
ＰＬＡ２ドメインの重要な機能に加えて、ＶＰ１およびＶＰ２のＮ末端領域内の塩基性アミノ酸の３つのクラスターが核内へのカプシドの輸送に必須であることが示されている（Ｇｒｉｅｇｅｒ ＪＣ、Ｓｎｏｗｄｙ Ｓ、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ． Ｓｅｐａｒａｔｅ ｂａｓｉｃ ｒｅｇｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００６、８０（１１）：５１９９～２１０）。ＶＰ１の塩基性領域（ＢＲ）１（１２０ＱＡＫＫＲＶＬ１２６）（配列番号６）またはＢＲ２（１４０ＰＧＫＫＲＰＶ１４６）（配列番号７）の喪失は、ＡＡＶの感染性をそれぞれ４分の１および１０分の１に低減させる。ＶＰ１およびＶＰ２双方のＮ末端領域に存在するＢＲ３（１６６ＰＡＲＫＲＬＮ１７２）（配列番号８）の喪失は、ベクターの感染性を完全に喪失させる。これらの重要な領域は、ＡＡＶ血清型１～１１で保存されており、そして、ＡＡＶ６のアミノ酸１１５および１１６の間ならびに／またはアミノ酸１８９および１９０の間でのクリッピングの結果生じる切断産物においてＶＰ１およびＶＰ２の双方から失われ、したがって、インビトロでの効力の低減に関与する。
アミノ酸１８９での切断に起因するＶＰ１／ＶＰ２のＮ末端領域の喪失は、感染性および形質導入効率を低減させると予測されるが、ＶＰ３の共通領域内の表面可変領域モチーフによって支配されている細胞型および組織向性は改変しないと予想される。ほとんどのＡＡＶ血清型の初代細胞受容体は、ヘパラン硫酸、シアル酸、またはガラクトースを含むグリカンであり、これは、カプシドの３回対称軸と関連するＶＰ３可変領域に結合する（Ａｌｂｒｉｇｈｔ ＢＨ、Ｓｉｍｏｎ ＫＥ、Ｐｉｌｌａｉ Ｍ、Ｄｅｖｌｉｎ ＧＷ、Ａｓｏｋａｎ Ａ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１９；９３（１１）；Ｚｈａｎｇ Ｒ、Ｃａｏ Ｌ、Ｃｕｉ Ｍ、Ｓｕｎ Ｚ、Ｈｕ Ｍ、Ｚｈａｎｇ Ｒ、Ｓｔｕａｒｔ Ｗ、Ｚｈａｏ Ｘ、Ｙａｎｇ Ｚ、Ｌｉ Ｘ、Ｓｕｎ Ｙ、Ｌｉ Ｓ、Ｄｉｎｇ Ｗ、Ｌｏｕ Ｚ、Ｒａｏ Ｚ． Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｉｔｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＡＡＶＲ． Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１９、４（４）：６７５～６８２）。
ＶＰ１およびＶＰ２のＮ末端領域は、感染の細胞接着相でカプシドの内側に残っており、これらの相互作用に関与しない。同様に、より最近に同定された、ほとんどのＡＡＶ血清型に共通の二次受容体ＡＡＶＲおよびＧＰＲ１０８もまた、３回対称軸に関連するカプシドの外部構造エレメントに結合する（Ａｌｂｒｉｇｈｔ ＢＨ、Ｓｉｍｏｎ ＫＥ、Ｐｉｌｌａｉ Ｍ、Ｄｅｖｌｉｎ ＧＷ、Ａｓｏｋａｎ Ａ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１９、９３（１１）；Ｚｈａｎｇ Ｒ、Ｃａｏ Ｌ、Ｃｕｉ Ｍ、Ｓｕｎ Ｚ、Ｈｕ Ｍ、Ｚｈａｎｇ Ｒ、Ｓｔｕａｒｔ Ｗ、Ｚｈａｏ Ｘ、Ｙａｎｇ Ｚ、Ｌｉ Ｘ、Ｓｕｎ Ｙ、Ｌｉ Ｓ、Ｄｉｎｇ Ｗ、Ｌｏｕ Ｚ、Ｒａｏ Ｚ． Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｉｔｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＡＡＶＲ．Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１９、４（４）：６７５～６８２；Ｈｕａｎｇ ＬＹ、Ｐａｔｅｌ Ａ、Ｎｇ Ｒ、Ｍｉｌｌｅｒ ＥＢ、Ｈａｌｄｅｒ Ｓ、ＭｃＫｅｎｎａ Ｒ、Ａｓｏｋａｎ Ａ、Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ １ ａｎｄ ６ Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１６、９０（１１）：５２１９～５２３０）。
ＶＰ３の共通領域と比較して構造的に障害があるＶＰ１およびＶＰ２のＮ末端領域の存在または不在は、通常、３回軸でのカプシドの構造的特徴に関与しない（Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ、Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ Ｊ． ＡＡＶ ｃａｐｓｉｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１、８０７：４７～９２）。
アミノ酸Ｇｌｙ１８９／Ｇｌｕ１９０でのクリッピングは、バキュロウイルスカテプシン（ｖ－ＣＡＴＨ）プロテアーゼの切断部位として文献において公開されているが（Ｇａｌｉｂｅｒｔ Ｌ、Ｓａｖｙ Ａ、Ｄｉｃｋｘ Ｙ、Ｂｏｎｎｉｎ Ｄ、Ｂｅｒｔｉｎ Ｂ、Ｍｕｓｈｉｍｉｙｉｍａｎａ Ｉ、ｖａｎ Ｏｅｒｓ ＭＭ、Ｍｅｒｔｅｎ ＯＷ． Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｒＡＡＶ８ ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１８、１３（１１）：ｅ０２０７４１４）、位置Ｇｌｙ１１５／Ａｒｇ１１６でのクリッピングは公知ではなかった。加えて、Ｇａｌｉｂｅｒｔら（２０１８）およびその他（ＵＳ２０１９／００５４１５８）が、ｒＡＡＶベクターの感染性の喪失を予防するための潜在的解決法を提案したが、感染後のバッチ期間（すなわち、感染後の時間）がＶＰ１／ＶＰ２のクリッピングおよび効力に対する影響を有するであろうことの認識はなかった。
上記で論じたように、インビトロでの効力は、ｒＡＡＶベクターの感染性、導入遺伝子の発現、および／または導入遺伝子によってコードされるタンパク質の機能に関して測定され得る。したがって、インビトロでの効力は、ｒＡＡＶベクターの感染性、導入遺伝子の発現（例えば定量ＰＣＲによって決定される）、またはタンパク質の機能（例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ、比色アッセイ、もしくは発色アッセイによって決定される）に関して測定され得る。一部の実施形態において、インビトロでの効力は、参照標準を使用して決定される。例えば、本明細書において記載される方法によって産生されたｒＡＡＶベクターの任意に選択されたバッチのインビトロでの効力値が参照標準として指定され得、１００％活性として設定され得る。本明細書において記載される方法によって産生されたｒＡＡＶベクターの他のバッチのインビトロでの効力は、したがって、この参照標準に対するパーセンテージとして計算され得る。一部の実施形態において、本明細書において記載される方法によって産生されていないｒＡＡＶベクターの任意に選択されたバッチのインビトロでの効力値が参照標準として指定され得、１００％活性として設定され得る。本明細書において記載される方法によって産生されたｒＡＡＶベクターの他のバッチのインビトロでの効力は、したがって、この参照標準に対するパーセンテージとして計算され得る。
一部の実施形態において、本明細書において記載される方法によって産生されたｒＡＡＶベクターは、参照標準と比較して１０％～５００％の間のインビトロでの効力を有する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、参照標準と比較して少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、または少なくとも２００％のインビトロでの効力を有する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、参照標準と比較して約５０％から約１５０％のインビトロでの効力を有する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、参照標準と比較して約７０％から約１３０％のインビトロでの効力を有する。一部の実施形態において、インビトロでの効力は、上記の、および図４で示されている、比色アッセイを使用して決定される。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、参照標準と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、または少なくとも２００％のインビボでの効力を有する。
「インビボでの効力」は、本明細書において記載される方法によって産生されるｒＡＡＶのインビボ（すなわち、生存している生物の内部）での活性の測定値を指す。インビボでの効力は、動物モデルにおいて測定され得る。例えば、インビボでの効力は、ｒＡＡＶベクターの感染性、導入遺伝子の発現、および／または導入遺伝子によってコードされるタンパク質の機能に関して測定され得る。ｒＡＡＶベクターのインビトロでの効力を測定するためのアッセイは当技術分野において周知であり、これとしては、（限定はしないが）比色アッセイ、発色アッセイ、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ、定量ＰＣＲ、および／またはウェスタンブロットが含まれる。
典型的には、産生されたｒＡＡＶベクターの量は、カプシドタンパク質またはＡＡＶゲノムの量のいずれかを測定することによって決定される。しかし、ベクターゲノム全体を含有していない空のカプシドの存在を理由に、ウイルスゲノムに基づく定量（すなわちゲノム力価）が好ましい。ｒＡＡＶベクターの臨床的用量は、通常、１ｍＬ当たりのベクターゲノム（ｖｇ）力価に基づき、当技術分野において公知であるいくつかの方法、例えば、限定はしないが、構築物の末端領域の二次構造に影響されないドットブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．、Ｃｈａｎｇ，Ｌ．Ｓ．、およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８９）．Ｈｅｌｐｅｒ－ｆｒｅｅ ｓｔｏｃｋｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ｎｏｒｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｒｅｑｕｉｒｅ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３、３８２２～３８２８）およびサザンブロッティング（ＭｃＣａｒｔｙ，Ｍ．（１９４６）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂｅｅｆ ｐａｎｃｒｅａｓ． Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９、１２３～１３９）；ＵＶ分光測光法（Ｓｏｍｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｈ．、Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ，Ｓ．、Ｉｓａａｃｓ，Ｊ．、Ｖｉｊａｙ，Ｓ．、Ｋｉｅｒａｎ，Ｊ．ら（２００３）．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｅｍｐｔｙ ｃａｐｓｉｄｓ ｂｙ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７、１２～１２８）；ならびに、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎベースの蛍光定量法（Ｐｉｅｄｒａ，Ｊ．、Ｏｎｔｉｖｅｒｏｓ，Ｍ．、Ｍｉｒａｖｅｔ，Ｓ．、Ｐｅｎａｌｖａ，Ｃ．、Ｍｏｎｆａｒ，Ｍ．、およびＣｈｉｌｌｏｎ，Ｍ．（２０１５）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒａｐｉｄ，ｒｏｂｕｓｔ，ａｎｄ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｔｉｔｅｒ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６、３５～４２）、ＥＬＩＳＡ（Ｓｏｎｄｈｉ，Ｄ．、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．、Ｇｉａｎｎａｒｉｓ，Ｅ．Ｌ．、Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｃ．Ｔ．、Ｍｅｎｄｅｚ，Ｂ．Ｓ．、Ｄｅ，Ｂ．ら（２００５）．ＡＡＶ２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＣＬＮ２ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｒｏｄｅｎｔ ａｎｄ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｂｒａｉｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ＴＰＰ－Ｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＬＩＮＣＬ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２、１６１８～１６３２）、および定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）（Ｄ’Ｃｏｓｔａ，Ｓ．、Ｂｌｏｕｉｎ，Ｖ．、Ｂｒｏｕｃｑｕｅ，Ｆ．、Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．、Ｆｃｒａｎｏｉｓ，Ａ．、Ｐｅｒｅｚ，Ｉ．Ｃ．ら（２０１６）．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ：ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅｓ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｒｅｅ ＩＴＲ ｑＰＣＲ． Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．３：１６０１９）が含まれる。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に測定されたゲノム力価は、少なくとも１×１０１０ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍｌである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に測定されたゲノム力価は、少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、または１×１０１１ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍｌである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に測定されたゲノム力価は、少なくとも８×１０１０ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍｌである。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収した後に測定されたゲノム力価は、少なくとも５×１０９ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍｌである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収した後に測定されたゲノム力価は、少なくとも５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、または１×１０１１ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍｌである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収した後に測定されたゲノム力価は、少なくとも４×１０１０ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍｌである。
一部の実施形態において、ゲノム力価は、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって測定される。
本明細書において記載される方法において、昆虫細胞は、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下のｒＡＡＶベクター、または、アミノ酸残基１８９Ｇおよび１９０Ｅの間のクリッピングが６５％以下で、かつＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下のｒＡＡＶベクター、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが上記指定の割合であるｒＡＡＶベクターの産生を可能にする適切な条件下および時間で培養される。上記で論じたように、適切な条件には、限定はしないが、本方法において使用する、細胞を培養する温度、細胞培養培地のタイプ、組換えバキュロウイルスを添加する生存細胞密度標的、培養培地中の溶解した酸素の量、ヘルパー組換えバキュロウイルスの量、および／またはベクター組換えバキュロウイルスの量が含まれる。
特に、昆虫細胞を培養する温度、ベクター組換えバキュロウイルスの量、および溶解した酸素の量が、インビトロでの効力に対して有意な影響を有していることが判定された。一般に、昆虫細胞を培養する温度およびベクター組換えバキュロウイルスの量は、相対的なインビトロでの効力に対して逆相関を示し、この場合、培養温度およびベクター組換えバキュロウイルスの量が増大するにつれ、インビトロでの効力は低下した。溶解した酸素の量は、インビトロでの効力と正の相関を有することが分かり、すなわち、溶解した酸素の量が増大するにつれ、インビトロでの効力は増大した。
一部の実施形態において、昆虫細胞は、３７℃未満の温度で培養される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、３０℃未満の温度で培養される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、２６℃～３０℃の間の温度で培養される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、２７℃～２９℃の間の温度で培養される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、または約３１℃の温度で培養される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、約２７～２８℃の温度で培養される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、約２８℃の温度で培養される。
一部の実施形態において、昆虫細胞と接触させるヘルパー組換えバキュロウイルスの量は、全培養容積に対して約０．００２２～約０．０１７８％の間の容積である。一部の実施形態において、昆虫細胞と接触させるヘルパー組換えバキュロウイルスの量は、全培養容積に対して約０．０１％の容積である。
一部の実施形態において、昆虫細胞と接触させるベクター組換えバキュロウイルスの量は、全培養容積に対して約０．００２２～約０．０１７８％の間の容積である。一部の実施形態において、昆虫細胞と接触させるベクター組換えバキュロウイルスの量は、全培養容積に対して約０．０１％の容積である。
一部の実施形態において、ヘルパー組換えバキュロウイルスおよび／またはベクター組換えバキュロウイルスは、組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞（ＢＩＩＣ）の形態である。一部の実施形態において、ヘルパー組換えバキュロウイルスおよび／またはベクター組換えバキュロウイルスは、精製されている（すなわち、組換えバキュロウイルスは昆虫細胞から単離されている）。
一部の実施形態において、培養培地中の溶解した酸素の量は、空気飽和の約２０％～約１００％である。溶解した酸素は、蛍光センサー、光プローブ、またはポーラログラフプローブによって測定され得、空気飽和に対するパーセンテージとして表される。一部の実施形態において、培養培地中の溶解した酸素の量は、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％である。一部の実施形態において、培養培地中の溶解した酸素の量は、空気飽和の約４０％～５０％の間である。
一部の実施形態において、昆虫細胞と接触させるベクター組換えバキュロウイルスの量は、全培養容積に対して約０．０１％の容積である。昆虫細胞と接触させるヘルパー組換えバキュロウイルスの量は、全培養容積に対して約０．０１％の容積である。培養培地中の溶解した酸素の量は、空気飽和の約４０％～５０％の間である。昆虫細胞は、約２６～２８℃の温度で、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に約１０８±５時間培養される。
昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ－９００ ＩＩＩ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＥｘｐｉＳｆ ＣＤ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、およびグレース培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）などの、任意の適切な細胞培養培地で培養され得る。昆虫細胞は、２Ｌ未満、少なくとも２Ｌ、少なくとも１０Ｌ、少なくとも２５０Ｌ、または少なくとも２０００Ｌの容積で培養され得る。
ｒＡＡＶベクターを産生し得るあらゆる昆虫細胞を、本明細書において記載される方法において使用することができる。一部の実施形態において、昆虫細胞は、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、例えばＳｆ９もしくはＳｆ２１細胞系、ショウジョウバエ細胞系、または蚊細胞系、例えば、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来の細胞系である。好ましい細胞系は、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞系である。
昆虫細胞は、懸濁培養で増殖し得るか、または接着性であり得る。一部の実施形態において、昆虫細胞は、無血清培養培地中で増殖または維持される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、ローラーボトルまたは大型ローラーボトル内で増殖または維持される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、バイオリアクター内で増殖される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、バッグまたはフラスコ内で増殖される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、ＷＡＶＥバイオリアクター内で増殖される。一部の実施形態において、昆虫細胞は、撹拌されているタンクバイオリアクター内で増殖される。
上記で論じたように、任意の野生型またはバリアント血清型のｒＡＡＶベクターを、本明細書において記載される方法によって産生することができる。本明細書において記載される方法によって産生されるｒＡＡＶベクターの例には、限定はしないが、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ３Ａ、ｒＡＡＶ３Ｂ、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ１０、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ７４、ｒＡＡＶ１２、ｒＡＡＶ２ｉ８、ｒＡＡＶ１．１、ｒＡＡＶ２．５、ｒＡＡＶ６．１、ｒＡＡＶ６．３．１、ｒＡＡＶ９．４５、ｒＡＡＶｈｕ．２６、ｒＡＡＶ１．１、ｒＡＡＶ２．５、ｒＡＡＶ６．１、ｒＡＡＶ６．３．１、ｒＡＡＶ２ｉ８、ｒＡＡＶ２９Ｇ、ｒＡＶＶ－ＬＫ０３、ｒＡＡＶ２－ＴＴ、ｒＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、およびｒＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎが含まれる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ３Ａ、ｒＡＡＶ３Ｂ、ｒＡＡＶ６、および／またはｒＡＡＶ８である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターはｒＡＡＶ６である。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＰＦ－０７０５５４８０（本明細書において「ＳＢ－５２５」とも呼ばれる）を含む。ＰＦ－０７０５５４８０／ＳＢ－５２５ベクターは、ＡＡＶ６カプシド、および、ＦＶＩＩＩをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号９）に作動可能に連結しているＴＴＲｍプロモーターに連結している野生型または突然変異Ｓｅｒｐｉｎ１エンハンサーに隣接するＡＡＶ２のＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶ２／６ベクターである。典型的なベクター配列は、例えば、ＷＯ２０１７／０７４５２６において記載されている。
典型的なＡＡＶ２ ５’ＩＴＲは、
ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号１０）
である。
典型的なＡＡＶ２ ３’ＩＴＲは、
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ（配列番号１１）
である。
配列番号１２は、シグナルペプチドを伴うヒトＦＶＩＩＩアミノ酸配列を示す。
ＭＱＩＥＬＳＴＣＦＦＬＣＬＬＲＦＣＦＳＡＴＲＲＹＹＬＧＡＶＥＬＳＷＤＹＭＱＳＤＬＧＥＬＰＶＤＡＲＦＰＰＲＶＰＫＳＦＰＦＮＴＳＶＶＹＫＫＴＬＦＶＥＦＴＤＨＬＦＮＩＡＫＰＲＰＰＷＭＧＬＬＧＰＴＩＱＡＥＶＹＤＴＶＶＩＴＬＫＮＭＡＳＨＰＶＳＬＨＡＶＧＶＳＹＷＫＡＳＥＧＡＥＹＤＤＱＴＳＱＲＥＫＥＤＤＫＶＦＰＧＧＳＨＴＹＶＷＱＶＬＫＥＮＧＰＭＡＳＤＰＬＣＬＴＹＳＹＬＳＨＶＤＬＶＫＤＬＮＳＧＬＩＧＡＬＬＶＣＲＥＧＳＬＡＫＥＫＴＱＴＬＨＫＦＩＬＬＦＡＶＦＤＥＧＫＳＷＨＳＥＴＫＮＳＬＭＱＤＲＤＡＡＳＡＲＡＷＰＫＭＨＴＶＮＧＹＶＮＲＳＬＰＧＬＩＧＣＨＲＫＳＶＹＷＨＶＩＧＭＧＴＴＰＥＶＨＳＩＦＬＥＧＨＴＦＬＶＲＮＨＲＱＡＳＬＥＩＳＰＩＴＦＬＴＡＱＴＬＬＭＤＬＧＱＦＬＬＦＣＨＩＳＳＨＱＨＤＧＭＥＡＹＶＫＶＤＳＣＰＥＥＰＱＬＲＭＫＮＮＥＥＡＥＤＹＤＤＤＬＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳＰＳＦＩＱＩＲＳＶＡＫＫＨＰＫＴＷＶＨＹＩＡＡＥＥＥＤＷＤＹＡＰＬＶＬＡＰＤＤＲＳＹＫＳＱＹＬＮＮＧＰＱＲＩＧＲＫＹＫＫＶＲＦＭＡＹＴＤＥＴＦＫＴＲＥＡＩＱＨＥＳＧＩＬＧＰＬＬＹＧＥＶＧＤＴＬＬＩＩＦＫＮＱＡＳＲＰＹＮＩＹＰＨＧＩＴＤＶＲＰＬＹＳＲＲＬＰＫＧＶＫＨＬＫＤＦＰＩＬＰＧＥＩＦＫＹＫＷＴＶＴＶＥＤＧＰＴＫＳＤＰＲＣＬＴＲＹＹＳＳＦＶＮＭＥＲＤＬＡＳＧＬＩＧＰＬＬＩＣＹＫＥＳＶＤＱＲＧＮＱＩＭＳＤＫＲＮＶＩＬＦＳＶＦＤＥＮＲＳＷＹＬＴＥＮＩＱＲＦＬＰＮＰＡＧＶＱＬＥＤＰＥＦＱＡＳＮＩＭＨＳＩＮＧＹＶＦＤＳＬＱＬＳＶＣＬＨＥＶＡＹＷＹＩＬＳＩＧＡＱＴＤＦＬＳＶＦＦＳＧＹＴＦＫＨＫＭＶＹＥＤＴＬＴＬＦＰＦＳＧＥＴＶＦＭＳＭＥＮＰＧＬＷＩＬＧＣＨＮＳＤＦＲＮＲＧＭＴＡＬＬＫＶＳＳＣＤＫＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲＥＩＴＲＴＴＬＱＳＤＱＥＥＩＤＹＤＤＴＩＳＶＥＭＫＫＥＤＦＤＩＹＤＥＤＥＮＱＳＰＲＳＦＱＫＫＴＲＨＹＦＩＡＡＶＥＲＬＷＤＹＧＭＳＳＳＰＨＶＬＲＮＲＡＱＳＧＳＶＰＱＦＫＫＶＶＦＱＥＦＴＤＧＳＦＴＱＰＬＹＲＧＥＬＮＥＨＬＧＬＬＧＰＹＩＲＡＥＶＥＤＮＩＭＶＴＦＲＮＱＡＳＲＰＹＳＦＹＳＳＬＩＳＹＥＥＤＱＲＱＧＡＥＰＲＫＮＦＶＫＰＮＥＴＫＴＹＦＷＫＶＱＨＨＭＡＰＴＫＤＥＦＤＣＫＡＷＡＹＦＳＤＶＤＬＥＫＤＶＨＳＧＬＩＧＰＬＬＶＣＨＴＮＴＬＮＰＡＨＧＲＱＶＴＶＱＥＦＡＬＦＦＴＩＦＤＥＴＫＳＷＹＦＴＥＮＭＥＲＮＣＲＡＰＣＮＩＱＭＥＤＰＴＦＫＥＮＹＲＦＨＡＩＮＧＹＩＭＤＴＬＰＧＬＶＭＡＱＤＱＲＩＲＷＹＬＬＳＭＧＳＮＥＮＩＨＳＩＨＦＳＧＨＶＦＴＶＲＫＫＥＥＹＫＭＡＬＹＮＬＹＰＧＶＦＥＴＶＥＭＬＰＳＫＡＧＩＷＲＶＥＣＬＩＧＥＨＬＨＡＧＭＳＴＬＦＬＶＹＳＮＫＣＱＴＰＬＧＭＡＳＧＨＩＲＤＦＱＩＴＡＳＧＱＹＧＱＷＡＰＫＬＡＲＬＨＹＳＧＳＩＮＡＷＳＴＫＥＰＦＳＷＩＫＶＤＬＬＡＰＭＩＩＨＧＩＫＴＱＧＡＲＱＫＦＳＳＬＹＩＳＱＦＩＩＭＹＳＬＤＧＫＫＷＱＴＹＲＧＮＳＴＧＴＬＭＶＦＦＧＮＶＤＳＳＧＩＫＨＮＩＦＮＰＰＩＩＡＲＹＩＲＬＨＰＴＨＹＳＩＲＳＴＬＲＭＥＬＭＧＣＤＬＮＳＣＳＭＰＬＧＭＥＳＫＡＩＳＤＡＱＩＴＡＳＳＹＦＴＮＭＦＡＴＷＳＰＳＫＡＲＬＨＬＱＧＲＳＮＡＷＲＰＱＶＮＮＰＫＥＷＬＱＶＤＦＱＫＴＭＫＶＴＧＶＴＴＱＧＶＫＳＬＬＴＳＭＹＶＫＥＦＬＩＳＳＳＱＤＧＨＱＷＴＬＦＦＱＮＧＫＶＫＶＦＱＧＮＱＤＳＦＴＰＶＶＮＳＬＤＰＰＬＬＴＲＹＬＲＩＨＰＱＳＷＶＨＱＩＡＬＲＭＥＶＬＧＣＥＡＱＤＬＹ
配列番号１２のシグナルペプチド部分は、ＭＱＩＥＬＳＴＣＦＦＬＣＬＬＲＦＣＦＳ（配列番号１３）であり、これは、タンパク質が分泌されると切除される。
一部の実施形態において、典型的なＳＥＲＰＩＮ１エンハンサーは、
ＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＡＴＴＡＡＣＣＡＡＧＡＴＣＡＣＣＣＣＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＧＡＣＴＡＡＧＴＴＣＡＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣ（配列番号１４）
である。
典型的なＴＴＲｍプロモーターは、
ＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＴＴＣＣＧＡＴＡＣＴＣＴＡＡＴＣＴＣＣＣＴＡＧＧＣＡＡＧＧＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＴＧＴＡＧＧＴＴＡＣＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＡＣＴＡＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧＡＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＧＧＴＡＴＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧ（配列番号１５）である。
ＦＶＩＩＩの典型的なコード配列は、
ＡＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＣＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧＴＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＧＴＴＣＡＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＴＡＴＧＡＣＡＣＴＧＴＧＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧＣＴＧＴＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＴＡＴＧＴＧＴＧＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＴＧＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＴＧＡＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＧＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＴＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＧＡＡＡＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＡＴＧＣＡＣＡＣＴＧＴＧＡＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＧＡＡＣＡＧＧＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＣＣＡＣＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＡＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＴＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＣＴＧＡＧＡＴＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＡＧＧＴＣＴＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＡＣＴＡＣＡＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＧＡＣＴＡＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＧＧＡＧＣＴＡＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＡＴＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＴＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＴＴＣＡＴＧＧＣＣＴＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＴＧＡＧＴＣＴＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＴＡＴＧＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＣＣＣＣＡＴＧＧＣＡＴＣＡＣＴＧＡＴＧＴＧＡＧＧＣＣＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＡＧＧＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＴＣＴＧＡＣＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＴＣＴＧＴＧＧＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＧＡＡＴＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＴＣＴＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＧＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧＧＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＴＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＣＡＣＡＡＧＡＴＧＧＴＧＴＡＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＴＧＧＡＴＴＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＣＴＣＴＧＡＣＴＴＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＣＴＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＧＧＧＧＡＣＴＡＣＴＡＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＧＡＣＡＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＡＴＣＣＡＣＣＣＧＴＣＣＴＴＡＡＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＧＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＴＧＡＣＴＡＴＧＡＴＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＴＴＴＧＡＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＡＣＴＴＣＡＴＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＧＣＣＣＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＣＡＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＡＣＡＧＡＧＧＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＴＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＧＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＡＣＴＴＣＴＣＴＧＡＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧＣＡＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣＡＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧＴＧＡＣＴＧＴＧＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＴＧＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＣＴＧＡＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＡＧＧＴＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＣＴＧＴＡＣＣＣＴＧＧＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＧＧＡＧＣＡＣＣＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＣＡＴＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＴＣＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＡＧＴＡＴＧＧＣＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＴＧＡＴＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＧＡＡＧＴＧＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣＡＡＴＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＡＴＣＡＴＴＧＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴＧＣＣＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＣＡＧＡＴＣＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＡＴＧＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＣＡＴＧＴＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＡＣＣＡＧＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＧＧＡＴＴＣＡＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＡＴＴＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＴＡＣＴＧＡ（配列番号１６）である。
逆位末端反復配列が隣接する発現カセットの典型的な配列は、
ＧＣＧＧＣＣＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＴＴＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡ －５０
ＡＴＡＴＴＡＡＣＣＡＡＧＡＴＣＡＣＣＣＣＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＧＡＣＴＡＡＧＴ－１００
ＴＣＡＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＴＴＣＣＧ－１５０
ＡＴＡＣＴＣＴＡＡＴＣＴＣＣＣＴＡＧＧＣＡＡＧＧＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＴＧＴＡＧＧＴＴＡＣＴＴＡＴＴＣ－２００
ＴＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＡＣＴＡＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧＡＧＴＣＡＧＣ－２５０
ＴＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＧＧＴＡＴＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴ－３００
ＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＡＧＧ－３５０
ＧＴＴＴＡＡＧＴＴＡＴＣＧＴＴＡＧＴＴＣＧＴＧＣＡＣＣＡＴＴＡＡＴＧＴＴＴＡＡＴＴＡＣＣＴＧＧＡＧＣ－４００
ＡＣＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＡＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＧＣ－４５０
ＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣ－５００
ＡＧＧＡＧＡＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＴＣ－５５０
ＴＧＡＣＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧＴＧＣＣＣＡ－６００
ＡＧＡＧＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＴＴＴＧＴＧ－６５０
ＧＡＧＴＴＣＡＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴ－７００
ＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＴＡＴＧＡＣＡＣＴＧＴＧＧＴＧＡ－７５０
ＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧＣＴＧＴＧＧＧＧ－８００
ＧＴＧＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＡＣＣＡＧ－８５０
ＣＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＴ－９００
ＡＴＧＴＧＴＧＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＴＧＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＴＧＡＣＣＣＣＣＴＧ－９５０
ＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡ－１０００
ＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡ－１０５０
ＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＧＣＴＧＴＧＴＴＴ－１１００
ＧＡＴＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＧＡＡＡＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＧＡ－１１５０
ＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＡＴＧＣＡＣＡＣＴＧＴＧＡＡＴＧ－１２００
ＧＣＴＡＴＧＴＧＡＡＣＡＧＧＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＣＣＡＣＡＧＧＡＡＧＴＣＴ－１２５０
ＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＡＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＡＴ－１３００
ＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣ－１３５０
ＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣ－１４００
ＣＴＧＧＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧＡＴＧＧ－１４５０
ＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＴＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＧＡ－１５００
ＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣ－１５５０
ＴＣＴＧＡＧＡＴＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＴＣＡＴ－１６００
ＣＣＡＧＡＴＣＡＧＧＴＣＴＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＡＣＴＡＣＡ－１６５０
ＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＧＡＣＴＡＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＣＴ－１７００
ＧＡＴＧＡＣＡＧＧＡＧＣＴＡＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＡＴ－１７５０
ＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＴＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＴＴＣＡＴＧＧＣＣＴＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＣＣＴ－１８００
ＴＣＡＡＧＡＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＴＧＡＧＴＣＴＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＣＣＣＣＴＧ－１８５０
ＣＴＧＴＡＴＧＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＣ－１９００
ＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＣＣＣＣＡＴＧＧＣＡＴＣＡＣＴＧＡＴＧＴＧＡＧＧＣＣＣＣ－１９５０
ＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＡＧＧＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＣＣ－２０００
ＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡ－２０５０
ＴＧＧＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＴＣＴＧＡＣＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＴ－２１００
ＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧ－２１５０
ＡＴＣＴＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＴＣＴＧＴＧＧＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＡ－２２００
ＣＡＡＧＡＧＧＡＡＴＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＴＣＴＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴ－２２５０
ＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＧＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＧ－２３００
ＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＧＧ－２３５０
ＣＴＡＴＧＴＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴ－２４００
ＡＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧＧＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＴＣ－２４５０
ＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＣＡＣＡＡＧＡＴＧＧＴＧＴＡＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＣ－２５００
ＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧ－２５５０
ＧＣＣＴＧＴＧＧＡＴＴＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＣＴＣＴＧＡＣＴＴＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＧＧＣＡＴＧ－２６００
ＡＣＴＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＧＧＧＧＡＣＴＡＣＴＡ－２６５０
ＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＧＡＣＡＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＧ－２７００
ＣＣＡＴＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＡＴＣＣＡＣＣＣＧＴＣＣＴＴＡＡＧＣＧＣＣＡＴ－２７５０
ＣＡＧＣＧＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＴＧＡ－２８００
ＣＴＡＴＧＡＴＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＴＴＴＧＡＣＡＴＣＴ－２８５０
ＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＡＧＧ－２９００
ＣＡＣＴＡＣＴＴＣＡＴＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＡＧＣＡＧ－２９５０
ＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＧＣＣＣＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴ－３０００
ＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＣＡＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＡＧＣＣＣ－３０５０
ＣＴＧＴＡＣＡＧＡＧＧＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＴ－３１００
ＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡ－３１５０
ＧＣＡＧＧＣＣＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＧ－３２００
ＡＧＧＣＡＧＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡ－３２５０
ＧＡＣＣＴＡＣＴＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＧＴ－３３００
ＴＴＧＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＡＣＴＴＣＴＣＴＧＡＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＴ－３３５０
ＧＴＧＣＡＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣＡＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＣＴ－３４００
ＧＡＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧＴＧＡＣＴＧＴＧＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣＣＣＴＧＴＴＣＴ－３４５０
ＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＴＧＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＡＣＴＧＡＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧ－３５００
ＡＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡ－３５５０
ＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＡＧＧＴＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣ－３６００
ＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣ－３６５０
ＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＴＧＴＴ－３７００
ＣＡＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＣＴＧＴＡＣＣ－３７５０
ＣＴＧＧＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＧ－３８００
ＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＧＧＡＧＣＡＣＣＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＣＡＴＧＡＧＣＡＣＣＣＴ－３８５０
ＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＣＣＴＣＴＧ－３９００
ＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＴＣＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＡＧＴＡＴＧＧＣＣＡＧＴＧＧ－３９５０
ＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＡＧ－４０００
ＣＡＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＴＧＡ－４０５０
ＴＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧ－４１００
ＴＡＣＡＴＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＧＡＡＧＴＧＧＣＡ－４１５０
ＧＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣＡＡＴＧ－４２００
ＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＡＴＣＡＴＴＧＣＣ－４２５０
ＡＧＡＴＡＣＡＴＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧ－４３００
ＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴＧＣＣＣＣＴＧＧＧＣＡ－４３５０
ＴＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＣＡＧＡＴＣＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＴＣ－４４００
ＡＣＣＡＡＣＡＴＧＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡ－４４５０
ＧＧＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＴＧＧＣ－４５００
ＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧ－４５５０
ＧＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＣＡＴＧＴＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧ－４６００
ＣＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＡＣＣＡＧＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧ－４６５０
ＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＣ－４７００
ＣＴＧＧＡＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＧＧＡＴＴＣＡＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧ－４７５０
ＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＡＴＴＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧ－４８００
ＡＣＣＴＧＴＡＣＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴ－４８５０
ＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＣＣＴＧＴＡＡＣＧＡＴＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣ
（配列番号９）である。
配列番号９は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０７４５２６において記載されているように、（５’から３’まで）インシュレーター（スペーサー）配列Ｉｎｓ１（配列番号９のヌクレオチド１４～３２）、Ｓｅｒｐｉｎ１エンハンサーＣＲＭＳＢＳ２（配列番号９のヌクレオチド３３～１０４）、トランスサイレチン最小プロモーターＴＴＲｍ（配列番号９のヌクレオチド１１７～３３９）、ＳＢＲイントロン３（配列番号９のヌクレオチド３４０～４３２）、ＦＶＩＩＩコード配列ｈＦ８ ＢＤＤ（配列番号９の４３８～４８１１）、ＳＰＡ５１合成ポリＡ配列（配列番号９のヌクレオチド４８１８～４８６８）、およびインシュレーター配列Ｉｎｓ３（配列番号９のヌクレオチド４８６９～４８８５）を含む。
一部の実施形態において、血液凝固因子ＶＩＩＩを含む組換えアデノ随伴ウイルス６（ｒＡＡＶ６）ベクターを産生するための方法が提供される。本方法は、（ｉ）Ｓｆ９細胞を、ＡＡＶ６のＲｅｐタンパク質および／またはＡＡＶ６のＣａｐタンパク質をコードする異種配列を各々が含む１つまたは２つのヘルパー組換えバキュロウイルス、ならびに血液凝固因子ＶＩＩＩをコードする異種配列を２つのＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間に含むベクター組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびにｉｉ）Ｓｆ９細胞を適切な条件下で１０８±５時間培養して、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下のｒＡＡＶ６ベクターを産生するステップを含む。
一部の実施形態において、血液凝固因子ＶＩＩＩを含む組換えアデノ随伴ウイルス６（ｒＡＡＶ６）ベクターを産生するための方法が提供される。本方法は、（ｉ）Ｓｆ９細胞を、ＡＡＶ６のＲｅｐタンパク質および／またはＡＡＶ６のＣａｐタンパク質をコードする異種配列を各々が含む１つまたは２つのヘルパー組換えバキュロウイルス、ならびに血液凝固因子ＶＩＩＩをコードする異種配列を２つのＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間に含むベクター組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに（ｉｉ）Ｓｆ９細胞を適切な条件下で１０８±５時間培養して、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピングが６５％以下であり、かつＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下であるｒＡＡＶ６ベクターを産生するステップを含む。
一部の実施形態において、血液凝固因子ＶＩＩＩを含む組換えアデノ随伴ウイルス６（ｒＡＡＶ６）ベクターを産生するための方法が提供される。本方法は、（ｉ）Ｓｆ９細胞を、ＡＡＶ６のＲｅｐタンパク質および／またはＡＡＶ６のＣａｐタンパク質をコードする異種配列を各々が含む１つまたは２つのヘルパー組換えバキュロウイルス、ならびに血液凝固因子ＶＩＩＩをコードする異種配列を２つのＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間に含むベクター組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに（ｉｉ）Ｓｆ９細胞を適切な条件下で１０８±５時間培養して、参照標準と比較して５０～１５０％の間のインビトロでの効力を有し、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下のｒＡＡＶ６ベクターを産生するステップを含む。
一部の実施形態において、血液凝固因子ＶＩＩＩを含む組換えアデノ随伴ウイルス６（ｒＡＡＶ６）ベクターを産生するための方法が提供される。本方法は、（ｉ）Ｓｆ９細胞を、ＡＡＶ６のＲｅｐタンパク質および／またはＡＡＶ６のＣａｐタンパク質をコードする異種配列を各々が含む１つまたは２つのヘルパー組換えバキュロウイルス、ならびに血液凝固因子ＶＩＩＩをコードする異種配列を２つのＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間に含むベクター組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに（ｉｉ）Ｓｆ９細胞を適切な条件下で１０８±５時間培養して、参照標準と比較して５０～１５０％の間のインビトロでの効力を有し、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピングが６５％以下であり、かつＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下であるｒＡＡＶ６ベクターを産生するステップを含む。
一部の実施形態において、昆虫細胞と接触させるベクター組換えバキュロウイルスの量は、全培養容積に対して約０．０１％の容積である。昆虫細胞と接触させるヘルパー組換えバキュロウイルスの量は、全培養容積に対して約０．０１％の容積である。培養培地中の溶解した酸素の量は、空気飽和の約４０％～５０％の間である。昆虫細胞は、約２６～２８℃の温度で、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に約１０８±５時間培養される。
また、本明細書において、精製された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む組成物が開示されている。一部の実施形態において、組成物は、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが１５％以下のｒＡＡＶベクターを含む。一部の実施形態において、組成物は、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下であり、かつアミノ酸残基１８９Ｇおよび１９０Ｅの間のクリッピングが６５％以下である、または、別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが上記指定の割合であるｒＡＡＶベクターを含む。ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質でのクリッピングは、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、質量分析（多特性質量分析を含む）、および／またはウェスタンブロットアッセイによって測定することができる。
本明細書において開示されているように、ｒＡＡＶベクターは、限定はしないが、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ３ａ、ｒＡＡＶ３ｂ、ｒＡＡＶ６、またはｒＡＡＶ８を含む、任意の野生型またはバリアント血清型のものであり得る。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、限定はしないが、野生型または機能的バリアントの血液凝固因子、ミニジストロフィン、Ｃ１エステラーゼインヒビター、銅輸送Ｐ型ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰ７Ｂ）、銅－亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、またはミオシン結合タンパク質Ｃ３などの治療用ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む。一部の実施形態において、野生型または機能的バリアントの血液凝固因子は、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、または因子ＩＸである。一部の実施形態において、野生型または機能的バリアントの血液凝固因子は、因子ＶＩＩＩである。
一部の実施形態において、本明細書において記載される組成物は、参照標準と比較して少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、または少なくとも２００％のインビトロでの効力を有するｒＡＡＶベクターを含む。本明細書において記載されるように、インビトロでの効力は、比色アッセイ、発色アッセイ、またはＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して測定することができる。
一部の実施形態において、本明細書において記載される組成物は、参照標準と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、または少なくとも２００％のインビボでの効力を有するｒＡＡＶベクターを含む。インビボでの効力は、動物モデルにおいて測定することができる。
一部の態様において、精製された組換えアデノ随伴ウイルス６（ｒＡＡＶ６）ベクターを含む組成物が提供される。ｒＡＡＶベクターは、参照標準と比較して約１０％～５００％のインビトロでの効力を有し、ＶＰ１タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下の、野生型または機能的バリアントの血液凝固因子ＶＩＩＩをコードする導入遺伝子を含む。
一部の態様において、精製された組換えアデノ随伴ウイルス６（ｒＡＡＶ６）ベクターを含む組成物が提供される。ｒＡＡＶベクターは、参照標準と比較して約１０％～５００％のインビトロでの効力を有し、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下であり、かつアミノ酸残基１８９Ｇおよび１９０Ｅの間のクリッピングが６５％以下である、野生型または機能的バリアントの血液凝固因子ＶＩＩＩをコードする導入遺伝子を含む。
一部の実施形態において、本明細書において記載される組成物は、医薬組成物である。医薬組成物は、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下の精製された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、またはＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下であり、かつアミノ酸残基１８９Ｇおよび１９０Ｅの間のクリッピングが６５％以下であるｒＡＡＶベクター、または、別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが上記指定の割合であるｒＡＡＶベクター、ならびに薬学的に許容できる担体を含み得る。
一部の実施形態において、医薬組成物は、因子ＶＩＩＩをコードする核酸配列（例えば配列番号９）を含む治療有効量のｒＡＡＶ６ベクター、および薬学的に許容できる担体を含む。ｒＡＡＶ６ベクターは、１５％以下の、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングを有するか、または、ｒＡＡＶ６ベクターは、野生型ＡＡＶ６のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下であり、かつアミノ酸残基１８９Ｇおよび１９０Ｅの間のクリッピングが６５％以下であるか、または、別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが上記指定の割合である。
一部の実施形態において、本明細書において記載される医薬組成物は、薬学的に許容できる担体、アジュバント、希釈剤、賦形剤、および／または他の医薬剤をさらに含む。薬学的に許容できる担体、アジュバント、希釈剤、賦形剤、または他の医薬剤は、生物学的にまたは他の面で望ましくないものではなく、例えば、材料は、当該材料の有利な生物学的影響を上回る望ましくない生物学的影響を生じさせることなく、対象に投与され得る。
あらゆる適切な薬学的に許容できる担体または賦形剤を、本発明に従った医薬組成物の調製において使用することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９７年４月を参照されたい）。
医薬組成物は、典型的には無菌であり、発熱性物質を有さず、かつ製造および保存の条件下で安定である。医薬組成物は、溶液（例えば、水、生理食塩水、デキストロース溶液、緩衝溶液、もしくは他の薬学的に無菌の流体）、マイクロエマルジョン、リポソーム、または、高い生成物（例えば、ウイルスベクター粒子、微粒子、もしくはナノ粒子）濃度を入れるために適した他の秩序ある構造として製剤され得る。一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物は、水または緩衝生理食塩水中に製剤される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、およびそれに類するもの）、ならびにこれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒質であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用によって、分散のケースでは所要の粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。一部の実施形態において、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含めることが好ましい場合がある。注射可能な組成物の吸着の延長は、組成物中に、吸収を遅延させる作用剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶベクターは、例えば、徐放ポリマーを含む組成物中、または、インプラントおよびマイクロカプセル化された送達系を含む、生成物を迅速な放出から保護する他の担体を含む組成物中の制御放出製剤において投与され得る。
一部の実施形態において、本開示の医薬組成物は、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、関節内投与、実質内（ＩＰ）投与、髄腔内（ＩＴ）投与、脳室内（ＩＣＶ）投与、および／または大槽内（ＩＣＭ）投与に適した組成物を含む非経口医薬組成物である。一部の実施形態において、因子ＶＩＩＩをコードする修飾核酸を含むｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物が、ＩＶ注射による投与のために製剤される。
均等物
前述の明細書は、当業者が本開示を実施することができるようになるために十分であると考えられる。先の記載および実施例は、本開示のある特定の典型的な実施形態を詳述している。しかし、先の記載が文章中ではいかに詳細に記載されているように見えても、本開示は多くの様式で実施され得、本開示は添付の特許請求の範囲およびそのあらゆる均等物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
特許、特許出願、書類、テキスト、およびそれに類するものを含む、本明細書において引用される全ての参考文献、ならびにこれらにおいて引用される参考文献は、まだそうされていない限り、ここで参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明を、以下の実施例を参照することによってさらに詳述する。これらの実施例は、説明のみを目的として提供され、別段の特定がない限り、限定的であることを意図したものではない。したがって、本発明は以下の実施例に決して限定されるべきではなく、むしろ、本明細書において提供される教示の結果として自明となる任意のおよび全ての変型を包含すると解釈されるべきである。
（実施例１）
インビトロでの効力と感染後のバッチ期間との間の関係
ＰＦ－０７０５５４８０と呼ばれるｒＡＡＶベクター（本明細書において「ＳＢ－５２５」とも呼ばれる）を、Ｓｆ９細胞においてバキュロウイルス発現系を使用して作製した。細胞バンクの細胞を２０００Ｌの産生バイオリアクターへと増殖させ、次いで、逆方向末端反復が隣接する、ｒｅｐ、ｃａｐ（ヘルパーマスターバキュロウイルスに感染した昆虫細胞またはＭＢＩＩＣ）、および因子ＶＩＩＩ遺伝子（ベクターマスターバキュロウイルスに感染した昆虫細胞またはＭＢＩＩＣ）を有する組換えバキュロウイルスに同時感染させた。細胞培養物プロセスを、産生バイオリアクター内で数日間、採取するまで継続し、その後、消化、濾過、および精製を行って、原薬を作製した。
原薬サンプルを次いで、ウイルス感染性、遺伝子発現、およびタンパク質機能を含むインビトロ効力アッセイによって試験した（図４）。簡潔に述べると、肝臓癌細胞をＡＡＶに曝露して数日間培養し、その後、発色基質を使用して、採取した培地における因子ＶＩＩＩの活性を定量した。
図１の結果は、インビトロでの効力が、観察した１０３時間から１６３時間の範囲内で、感染後（すなわち、組換えバキュロウイルスとの接触後）、バッチ期間を経るにつれて低下することを示唆している。
この結果は、実施例３において記載されている図６で詳述されているように、２Ｌのバイオリアクター内で行った小規模実験において裏付けられた。
（実施例２）
インビトロでの効力の低下の考えられる根本的原因としてのＶＰ１およびＶＰ２のクリッピングの同定
観察されたインビトロでの効力の変動の結果、プロセスおよび分析的観点の両方からインビトロでの効力値の変化の潜在的原動力を理解するために、さらなる研究を行った。質量分析（ＭＳ）研究は、インビトロでの効力と相関していると思われる特性を同定した。クリッピングされた形態のＶＰ１／ＶＰ２タンパク質という特性を、複数の特性を同時に評価するＬＣ／ＭＳ－ペプチドマッピング法（多特性方法またはＭＡＭと呼ばれる）を使用して定量した。このクリッピングされた分子種は、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のアミノ酸残基１８９Ｇおよび１９０Ｅの間のタンパク質分解性の切断の後に残っているＣ末端ペプチドとして同定されている。ＶＰ１またはＶＰ２のＮ末端ペプチドは検出不可能であり、製造プロセスの間に明らかになると推定される。図２および表１で示すように、データは、クリッピングされたＶＰ１／ＶＰ２タンパク質のレベルと相対的効力との間の逆相関を示している。
Figure 2023002483000001
データは、クリッピングされたＶＰ１／ＶＰ２タンパク質のレベルと、相対的なインビトロでの効力との間の逆相関を示しており、この場合、クリッピングされたＶＰ１／ＶＰ２のレベルが増大するにつれて、インビトロでの効力は低下する。
（実施例３）
インビトロでの効力に対する、細胞培養物の温度、溶解した酸素、組換えバキュロウイルスの量、および感染後のバッチ期間の影響
統計的に計画された実験を構築し、２Ｌのバイオリアクター内で実行して、ｒＡＡＶベクターＰＦ－０７０５５４８０（本明細書において「ＳＢ－５２５」とも呼ばれる）の産生における影響の強いプロセスパラメータを同定した。特に、インビトロでの効力を含むｒＡＡＶベクターの特性に対する、産生バイオリアクター内での細胞培養温度、溶解した酸素のレベル、組換えバキュロウイルスの量、および感染後のバッチ期間を含むプロセスパラメータの影響を、この実験において研究した。
簡潔に述べると、Ｓｆ９細胞を連続継代し、増殖させて、２Ｌの産生バイオリアクターに接種した。標的細胞密度に達した後、マスターバキュロウイルスに感染した昆虫細胞（ＭＢＩＩＣ）の形態で保存されていた組換えバキュロウイルスを加えて、ＡＡＶの産生を開始させた。培養を所定の期間にわたり継続し、その後、これを採取し、澄明化し、そして部分的に精製する。部分的に精製されたＡＡＶ産物で、インビトロでの効力のデータを回収する。
実験データに基づいて、これらのパラメータとインビトロでの効力との間の予測的関係がこの実施例においてまとめられる。
実験計画およびデータ解析
中心複合計画は、因子相互作用および二次項の推定を可能にする応答曲面モデリングのための、一般的に使用される計画の１つである。分解能Ｖを伴う最小一部実施要因計画をこの研究に利用する。いくつかのブロックの間で分けられた全部で６０回のランで、６つの因子を研究した。
ソフトウェア（Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ）によって提案されたモデル、不適合度、調整済みＲ２、ならびに数値モデルおよび視覚モデルの両方の他のモデル診断を考慮して、モデルの構築およびモデルの縮小を行った。モデルフィッティングはまた、残差プロット、すなわち実測プロット対予測プロットの検査、およびデータ変換の考慮も含んでいた。ｐ値の有意レベルのカットオフは０．０５に選択された。
２Ｌのバイオリアクターから部分的に精製された材料から測定されたインビトロでの効力値と、２０００Ｌのバイオリアクターから産生された原薬のインビトロでの効力値とで、一貫したオフセットが見られ、したがって、線形回帰モデルを構築して、以下の提示されるモデルにおけるデータを変換し、これによって、原薬における予測値を反映させた。
実験計画およびデータ解析を、バージョン１１．０．６．０のＤｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔソフトウェアで行う。
インビトロでの効力の結果
図６に示すように、バッチ期間に応じて効力が低下するため、研究は、感染後のバッチ期間と効力との間の負の関係を裏付けている。負の関係はまた、培養容積に対するベクターＭＢＩＩＣの添加容積の比率およびインビトロでの効力でも見られる。正の関係は、培養容積に対するヘルパーＭＢＩＩＣの添加容積の比率およびインビトロでの効力で見られる。温度の二次効果が見られるが、効力のための最適な温度は２７～２８℃の間であり、温度が最適温度から離れると効力は低下する。正の関係は、溶解した酸素およびインビトロでの効力で見られる。
均等物
前述の明細書は、当業者が本開示を実施することができるようになるために十分であると考えられる。先の記載および実施例は、本開示のある特定の典型的な実施形態を詳述している。しかし、先の記載が文章中ではいかに詳細に記載されているように見えても、本開示は多くの様式で実施され得、本開示は添付の特許請求の範囲およびそのあらゆる均等物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
特許、特許出願、書類、テキスト、およびそれに類するものを含む、本明細書において引用される全ての参考文献、ならびにこれらにおいて引用される参考文献は、まだそうされていない限り、ここで参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (20)

  1. 組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのインビトロでの効力を増大させるための方法であって、
    昆虫細胞を、各々が異種配列を含む１つまたは複数の組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに、
    ｒＡＡＶベクターのインビトロでの効力が、参照標準と比較して１０％～５００％の間となり、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピングが６５％以下となり、かつＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下となる、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが上記指定の割合となるように、昆虫細胞を適切な条件下で培養する時間を最適化するステップ
    を含む方法。
  2. ｒＡＡＶベクターが、約３０％～約６０％の間の、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピング、ならびに、５％以下の、Ｇｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピング、または上記指定の割合の、別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間クリッピングを有する、請求項１に記載の方法。
  3. ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質でのクリッピングが、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、質量分析（多特性質量分析を含む）、および／またはウェスタンブロットアッセイによって測定される、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
  4. ｒＡＡＶベクターのインビトロでの効力が、参照標準と比較して５０％から１５０％の間である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. インビトロでの効力が、比色アッセイ、発色アッセイ、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ、定量ＰＣＲ、および／またはウェスタンブロットを使用して測定される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 昆虫細胞が、ｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に約９６時間から約１２８時間、またはｒＡＡＶベクターを昆虫細胞から回収する前に約１０８±５時間培養される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 昆虫細胞が、
    （ｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質および／またはＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードする異種配列を各々が含む、１つまたは２つのヘルパー組換えバキュロウイルス、ならびに
    （ｉｉ）導入遺伝子をコードする異種配列を２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間に含む、ベクター組換えバキュロウイルス
    と接触させられる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 野生型ＡＡＶ６のＶＰ１タンパク質のアミノ酸残基１８９Ｇおよび１９０Ｅの間のクリッピングが６５％以下であり、かつアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下である、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが上記指定の割合であるｒＡＡＶベクターを産生する昆虫細胞を培養するための適切な条件が、
    （ｉ）昆虫細胞を培養する温度、
    （ｉｉ）昆虫細胞と接触させるヘルパー組換えバキュロウイルスの量、
    （ｉｉｉ）昆虫細胞と接触させるベクター組換えバキュロウイルスベクターの量、および／または
    （ｉｖ）細胞培養培地中の溶解した酸素の量
    を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 昆虫細胞が、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、または約３１℃の温度で培養される、請求項８に記載の方法。
  10. 昆虫細胞と接触させるヘルパー組換えバキュロウイルスの量が、全培養容積に対して約０．００２２％～約０．０１７８％の間の容積である、請求項８から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 昆虫細胞と接触させるベクター組換えバキュロウイルスの量が、全培養容積に対して約０．００２２％～約０．０１７８％の間の容積である、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 培養培地中の溶解した酸素の量が、空気飽和の約２０％～約１００％である、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 昆虫細胞が、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、またはＨｉ５細胞である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 導入遺伝子が、野生型または機能的バリアントの血液凝固因子、ミニジストロフィン、Ｃ１エステラーゼインヒビター、銅輸送Ｐ型ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰ７Ｂ）、銅－亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、またはミオシン結合タンパク質Ｃ３をコードする、請求項７から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 野生型または機能的バリアント血液凝固因子が、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、または因子ＩＸである、請求項１４に記載の方法。
  16. ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ３ａ、ｒＡＡＶ３ｂ、ｒＡＡＶ６、またはｒＡＡＶ８である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 血液凝固因子ＶＩＩＩを含む組換えアデノ随伴ウイルス６（ｒＡＡＶ６）ベクターを産生するための方法であって、
    （ｉ）Ｓｆ９細胞を、ＡＡＶ６のＲｅｐタンパク質および／またはＡＡＶ６のＣａｐタンパク質をコードする異種配列を各々が含む１つまたは２つのヘルパー組換えバキュロウイルス、ならびに血液凝固因子ＶＩＩＩをコードする異種配列を２つのＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間に含むベクター組換えバキュロウイルスと接触させるステップ、ならびに
    （ｉｉ）Ｓｆ９細胞を適切な条件下で１０８±５時間培養して、参照標準と比較して５０～１５０％の間のインビトロでの効力を有し、野生型ＡＡＶ６のＧｌｙ１８９およびＧｌｕ１９０に対応するＶＰ１およびＶＰ２アミノ酸残基の間のクリッピングが６５％以下であり、かつＧｌｙ１１５およびＡｒｇ１１６に対応するＶＰ１アミノ酸残基の間のクリッピングが１５％以下であるｒＡＡＶ６ベクターを産生するステップ
    を含む方法。
  18. （ｉ）昆虫細胞が、約２８℃の温度で培養され、
    （ｉｉ）昆虫細胞と接触させるベクター組換えバキュロウイルスの量が、全培養容積に対して約０．００２２％～約０．０１７８％の間の容積であり、
    （ｉｉｉ）昆虫細胞と接触させるヘルパー組換えバキュロウイルスの量が、全培養容積に対して約０．００２２％～約０．０１７８％の間の容積であり、かつ
    （ｉｖ）培養培地中の溶解した酸素の量が、空気飽和の約２０％～約１００％である、
    請求項１７に記載の方法。
  19. 野生型ＡＡＶ６のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下であり、かつアミノ酸残基１８９Ｇおよび１９０Ｅの間のクリッピングが６５％以下である、または別のＡＡＶ血清型のＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における対応するアミノ酸の間のクリッピングが前記指定の割合である、精製された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む組成物。
  20. 参照標準と比較して約５０％～１５０％のインビトロでの効力を有し、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のアミノ酸残基１１５Ｇおよび１１６Ｒの間のクリッピングが１５％以下であり、かつアミノ酸残基１８９Ｇおよび１９０Ｅの間のクリッピングが６５％以下である、野生型または機能的バリアントの血液凝固因子ＶＩＩＩをコードする導入遺伝子を含む精製された組換えアデノ随伴ウイルス６（ｒＡＡＶ６）ベクターを含む組成物。
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