TW202028468A - 用於桿狀病毒/Sf9系統中rAAV之大規模生產的表現載體 - Google Patents

用於桿狀病毒/Sf9系統中rAAV之大規模生產的表現載體 Download PDF

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Abstract

本發明描述用於產生腺相關病毒(AAV)粒子，包括重組腺相關病毒(rAAV)粒子之方法及系統。在某些實施例中，該產生方法及系統使用桿狀病毒表現載體(BEV)來產生AAV粒子。在某些實施例中，該產生方法及系統使用草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )昆蟲細胞(諸如Sf9或Sf21)作為病毒生產性細胞。在某些實施例中，該產生方法及系統使用缺乏v-cath 基因之部分或整體或包括該v-cath 基因之突變不活化型式的BEV。

Description

用於桿狀病毒/Sf9系統中rAAV之大規模生產的表現載體
本發明描述用於產生腺相關病毒(AAV)粒子，包括重組腺相關病毒(rAAV)粒子之方法及系統。在某些實施例中，該產生方法及系統使用桿狀病毒表現載體(BEV)來產生AAV粒子。在某些實施例中，該產生方法及系統使用草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )昆蟲細胞(諸如Sf9或Sf21)作為病毒生產性細胞。在某些實施例中，該產生方法及系統使用缺乏v-cath 基因或包含該v-cath 基因之突變不活化型式的BEV。
AAV已成為用於至哺乳動物細胞之基因轉移的最廣泛研究及利用之病毒載體之一。參見例如Tratschin等人,Mol. Cell Biol. , 5(11):3251-3260 (1985)及Grimm等人, Hum. Gene Ther., 10(15):2445-2450 (1999)，其內容以全文引用之方式併入本文中。腺相關病毒(AAV)載體為治療性基因遞送之有前景的候選物且已在臨床試驗中經證實為安全且有效的。出於此目的，設計及產生改良之AAV粒子為活躍的研究領域。
隨著AAV領域之發展的出現，仍需要產生AAV載體(諸如AAV粒子)及對應基因療法產生材料(諸如桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC))的改良系統及方法。
本發明提出用於產生重組腺相關病毒(rAAV)載體之經工程改造核酸構築體。本發明描述用於產生重組腺相關病毒(rAAV)載體之病毒產生系統及病毒生產性細胞(諸如昆蟲細胞)，其包括經工程改造核酸構築體。本發明描述產生本發明之病毒生產性細胞之方法，及使用本發明之經工程改造核酸構築體、病毒產生系統及病毒生產性細胞來產生重組腺相關病毒(rAAV)載體之方法。
本發明描述用於產生腺相關病毒(AAV)載體，諸如重組腺相關病毒(rAAV)載體之核酸構築體。在某些實施例中，核酸構築體為AAV表現構築體。
本發明描述產生本發明之病毒生產性細胞之方法。在某些實施例中，該方法包括以下各者：提供一或多個本發明之表現構築體；提供本發明之有效載荷構築體；將一或多個表現構築體及有效載荷構築體轉染至病毒生產性細胞中。在某些實施例中，病毒生產性細胞為哺乳動物細胞。在某些實施例中，病毒生產性細胞為昆蟲細胞。在某些實施例中，病毒生產性細胞為AAV病毒生產性細胞。在某些實施例中，該方法包括以下各者：提供一或多個本發明之AAV表現構築體；提供本發明之AAV有效載荷構築體；及將一或多個AAV表現構築體及AAV有效載荷構築體轉染至AAV病毒生產性細胞中。在某些實施例中，該方法包括以下各者：提供本發明之病毒產生系統；及將病毒產生系統轉染至病毒生產性細胞中。
本發明提出用於改良AAV粒子產生之方法及策略。此類方法包括使用一或多個重組桿狀病毒表現載體(BEV)在昆蟲細胞株中產生AAV粒子的方法。在某些實施例中，該等BEV缺乏v-cath 基因之部分或整體或包括v-cath 基因之突變不活化型式。在某些實施例中，該等BEV缺乏v-cath 基因之部分或整體。在某些實施例中，該等BEV包括v-cath 基因之突變不活化型式。
本發明提出用於改良AAV粒子產生之方法及策略，其使得AAV產生蛋白，尤其AAV衣殼蛋白(VP1、VP2及VP3)之產率較高且蛋白質降解較少。
在某些實施例中，本發明之該等方法可用於採用病毒生產性細胞之產生系統中，該等病毒生產性細胞包括昆蟲細胞，包括(但不限於)Sf9、Sf21及High FiveTM BTI-TN-5B1-4細胞株。在某些實施例中，本發明之該等方法可用於採用諸如BacMagicTM (Millipore)、FlashBACTM (Oxford Expression Technologies)及BestBac 2.0TM (Expression Systems)之重組BEV系統的產生系統中。
在某些實施例中，本發明提出一種腺相關病毒(AAV)表現構築體，其包括VP編碼區，該VP編碼區包括編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白的核苷酸序列。在某些實施例中，該AAV表現構築體為桿狀病毒表現載體(BEV)。在某些實施例中，該BEV不包括功能性桿狀病毒v-cath 基因。在某些實施例中，該BEV缺乏桿狀病毒v-cath 基因之部分或整體。在某些實施例中，該BEV包含桿狀病毒v-cath 基因之突變不活化型式。
在某些實施例中，一或多種AAV衣殼蛋白之血清型係選自VOY101、VOY201、AAVPHP.B (PHP.B)、AAVPHP.A (PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH1.1-32、AAVTH1.1-35、AAVPHP.B2 (PHP.B2)、AAVPHP.B3 (PHP.B3)、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3 (G2A3)、AAVG2B4 (G2B4)、AAVG2B5 (G2B5)、PHP.S、AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突變體、AAVrh8R R533A突變體、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV Shuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAV Shuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真實類型AAV (ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAV CHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAV CLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAV CLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAV CSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、AAVrh20、AAVrh32/33、AAVrh39、AAVrh46、AAVrh73、AAVrh74、AAVhu.26或其變異體或嵌合體。在某些實施例中，該一或多種AAV衣殼蛋白之血清型為VOY101。
在某些實施例中，本發明提出一種AAV病毒產生系統，其包括本發明之AAV病毒生產性細胞及AAV表現構築體。在某些實施例中，該AAV病毒產生系統包含AAV有效載荷構築體。在某些實施例中，該AAV病毒生產性細胞為昆蟲細胞。在某些實施例中，該AAV病毒生產性細胞為Sf9細胞。在某些實施例中，AAV病毒生產性細胞為Sf21細胞。
在某些實施例中，本發明提出一種在AAV病毒生產性細胞中產生重組腺相關病毒(rAAV)載體的方法。在某些實施例中，該方法包括：提供AAV病毒產生系統，該AAV病毒產生系統包含本發明之AAV表現構築體及AAV有效載荷構築體；將AAV病毒產生系統轉染至AAV病毒生產性細胞中；將AAV病毒生產性細胞暴露於允許AAV病毒生產性細胞將AAV表現構築體及AAV有效載荷構築體加工成rAAV粒子的條件；及自AAV病毒生產性細胞收集rAAV粒子。在某些實施例中，該AAV病毒生產性細胞為昆蟲細胞。在某些實施例中，該AAV病毒生產性細胞為Sf9細胞或Sf21細胞。
在某些實施例中，本發明提出一種在使用桿狀病毒表現載體(BEV)之桿狀病毒表現系統中減少AAV蛋白之蛋白酶降解的方法。在某些實施例中，該方法包括使BEV缺失桿狀病毒v-cath 基因之部分或整體。在某些實施例中，該方法包括以突變方式使來自BEV之桿狀病毒v-cath 基因不活化。
本發明之各種實施例之細節闡述於以下實施方式中。本發明之其他特徵、目標及優勢將自實施方式、圖式及申請專利範圍顯而易見。在實施方式中，除非上下文另有明確規定，否則單數形式亦包括複數形式。除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。在有衝突的情況下，以本說明書為準。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2018年10月15日申請之標題為EXPRESSION VECTORS FOR LARGE-SCALE PRODUCTION OF rAAV IN THE BACULOVIRUS/Sf9 SYSTEM的美國臨時專利申請案第62/745,703之權益，該申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。 序列表之參考
本申請案與電子格式之序列表一起申請。序列表以2019年10月15日創建的名稱為20571514TWSL.txt之檔案之形式提供，其大小為25,073個位元組。電子格式之序列表中之資訊以全文引用之方式併入本文中。 I. 腺相關病毒(AAV)  概述
腺相關病毒(AAV)為由單股DNA病毒基因組表徵之小病毒科之小無包膜二十面體衣殼病毒。小病毒科病毒由兩種亞科組成：感染脊椎動物之小病毒亞科(Parvovirinae)，及感染無脊椎動物之濃核病毒亞科(Densovirinae)。小病毒科包括依賴病毒屬(Dependovirus genus)，其包括AAV，能夠在包括(但不限於)人類、靈長類動物、牛類、犬類、馬類及綿羊類物種之脊椎動物宿主中複製。
小病毒科中之小病毒及其他成員大體描述於Kenneth I. Berns, 「Parvoviridae: The Viruses and Their Replication」, 第69章, Fields Virology (第3版 1996)中，其關於小病毒之內容以全文引用之方式併入。
已證實AAV由於其相對簡單的結構、其在不整合至宿主基因組中及不複製之情況下感染大範圍的細胞(包括休眠細胞及分裂細胞)之能力及其相對良性的免疫原性概況而適用作生物工具。病毒之基因組可經操縱以含有用於組裝功能性重組病毒或病毒粒子之最少組分，該病毒或病毒粒子負載有所需有效載荷或經工程改造以靶向特定組織且表達或遞送所需有效載荷。 AAV病毒基因組
野生型AAV病毒基因組為長度約5,000個核苷酸(nt)的線性單股DNA (ssDNA)分子。反向末端重複序列(ITR)傳統地在5'端及3'端處對病毒基因組封端，為病毒基因組提供複製起點。雖然不希望受理論束縛，但AAV病毒基因組通常包括兩個ITR序列。此等ITR在ssDNA的5'端及3'端處具有由自補區(145 nt於野生型AAV中)定義之特徵性T形髮夾結構，形成能量上穩定的雙股區。雙股髮夾結構包括多種功能，包括(但不限於)藉由充當宿主病毒複製細胞之內源DNA聚合酶複合物的引子來充當DNA複製的起點。
野生型AAV病毒基因組進一步包括用於兩個開放閱讀框架之核苷酸序列，一個用於四種非結構Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52、Rep40，由Rep基因編碼)，且一個用於三種衣殼蛋白或結構蛋白(VP1、VP2、VP3，由衣殼基因或Cap基因編碼)。Rep蛋白對於複製及封裝很重要，而衣殼蛋白經組裝以產生AAV之蛋白殼，或AAV衣殼。Rep78及Rep68可從p5啟動子轉錄，且Rep 52及Rep40可從p19啟動子轉錄。替代性剪接及交替的起始密碼子及啟動子致使自單一開放閱讀框架產生四種不同Rep蛋白及自單一開放閱讀框架產生三種衣殼蛋白。儘管其隨AAV血清型變化，但作為一非限制性實例，對於AAV9/hu.14 (US 7,906,111之SEQ ID NO: 123，該專利關於AAV9/hu.14之內容以全文引用之方式併入本文中)，VP1係指胺基酸1-736，VP2係指胺基酸138-736，且VP3係指胺基酸203-736。換言之，VP1為全長衣殼序列，而VP2及VP3為整體中之較短組分。因此，VP3區中之序列的變化亦為VP1及VP2之變化，然而，VP3相較於親本序列之差異百分比將最大，因為其為三者中之最短序列。儘管關於胺基酸序列在本文進行描述，但可類似地描述編碼此等蛋白質之核酸序列。在一起，三種衣殼蛋白組裝產生AAV衣殼蛋白。雖然不希望受理論束縛，但AAV衣殼蛋白通常包括1:1:10的VP1:VP2:VP3莫耳比。如本文所用，「AAV血清型」主要由AAV衣殼定義。在一些情況下，ITR亦由AAV血清型(例如AAV2/9)特定描述。
為用作生物工具，野生型AAV病毒基因組可經修飾以用包括有效載荷區與至少一個ITR區的核酸序列替換rep/cap序列。通常，在重組AAV病毒基因組中，存在兩個ITR區。rep/cap序列可在產生期間以反式提供，以產生AAV粒子。
除編碼之異源有效載荷以外，AAV載體可包括任何天然存在及/或重組的AAV血清型核苷酸序列或變異體之病毒基因組(整體或部分)。AAV變異體可在核酸層面(基因組或衣殼)及胺基酸層面(衣殼)具有顯著同源序列，以產生在實體及功能上大體等效、藉由類似機制複製且藉由類似機制組裝的構築體。參見Chiorini等人, J. Vir. 71: 6823-33(1997)；Srivastava等人, J. Vir. 45:555-64 (1983)；Chiorini等人, J. Vir. 73:1309-1319 (1999)；Rutledge等人, J. Vir. 72:309-319 (1998)；及Wu等人, J. Vir. 74: 8635-47 (2000)，其各自關於AAV變異體及等效物之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，本發明之AAV粒子、病毒基因組及/或有效載荷，及其使用方法可如WO2017189963中所描述，該專利關於AAV粒子、病毒基因組及/或有效載荷之內容以全文引用之方式併入本文中。
本發明之AAV粒子可在本發明之基因療法調配物中之任一者中調配，該等調配物包括熟習此項技術者顯而易見的此類調配物之任何變化形式。本申請案中提及的「AAV粒子」、「AAV粒子調配物」及「經調配AAV粒子」係指可經調配之AAV粒子及經調配之AAV粒子(均不受限制)。
在某些實施例中，本發明之AAV粒子為複製缺陷性重組AAV (rAAV)病毒粒子，其病毒基因組內缺乏編碼功能性Rep及Cap蛋白之序列。此等缺陷性AAV粒子可能缺乏大部分或全部親本編碼序列，且基本上僅攜有一或兩個用於遞送至細胞、組織、器官或生物體之AAV ITR序列及所關注之核酸(亦即有效載荷)。
在某些實施例中，本發明之AAV粒子之病毒基因組包括至少一個控制元件，其實現在其中編碼之編碼序列的複製、轉錄及轉譯。並非所有的控制元件都需要始終存在，只要編碼序列能夠在適當的宿主細胞中進行複製、轉錄及/或轉譯即可。表現控制元件之非限制性實例包括用於轉錄起始及/或終止之序列、啟動子及/或增強子序列、有效RNA加工信號(諸如剪接及聚腺苷酸化信號)、使細胞質mRNA穩定之序列、增強轉譯功效之序列(例如Kozak共同序列)、增強蛋白質穩定性之序列及/或增強蛋白質加工及/或分泌的序列。
根據本發明，用於治療學及/或診斷學之AAV粒子包括已蒸餾或減少用於轉導所關注之核酸有效載荷或貨物所需之最少組分的病毒。以此方式，AAV粒子經工程改造為用於特異性遞送、同時缺乏發現於野生型病毒中之有害複製及/或整合特徵的媒劑。
本發明之AAV粒子可以重組方式產生，且可基於腺相關病毒(AAV)親本或參考序列。如本文所用，「載體」為轉運、轉導或以其他方式充當諸如本文所描述之核酸的異源分子之載劑的任何分子或部分。
除單股AAV病毒基因組(例如ssAAV)之外，本發明亦提供自補AAV (scAAV)病毒基因組。scAAV載體基因組含有黏接在一起以形成雙股DNA的DNA股。藉由跳過第二股合成，scAAV在細胞中實現快速表現。
在某些實施例中，本發明之AAV病毒基因組為scAAV。在某些實施例中，本發明之AAV病毒基因組為ssAAV。
產生及/或修飾AAV粒子之方法揭示於此項技術中，諸如假型AAV粒子(PCT專利公開案第WO200028004號；第WO200123001號；第WO2004112727號；第WO 2005005610號及第WO 2005072364號，其各自關於產生及/或修飾AAV粒子之內容以全文引用的方式併入本文中)。
AAV粒子可經修飾以增強遞送效率。此類經修飾之AAV粒子可經有效封裝且用於成功地以高頻率及最小毒性感染目標細胞。在某些實施例中，AAV粒子之衣殼根據美國公開案第US 20130195801號中所描述之方法經工程改造，該公開案關於修飾AAV粒子以增強遞送效率之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，AAV粒子包括編碼本發明之多肽或蛋白質的有效載荷區，且可引入至哺乳動物細胞中。反向末端重複序列 (ITR)
本發明之AAV粒子包括具有至少一個ITR區及有效載荷區之病毒基因組。在某些實施例中，病毒基因組具有兩個ITR。此兩個ITR在5'端及3'端側接有效載荷區。ITR充當複製起點，包括用於複製之識別位點。ITR包括可互補且對稱地配置之序列區域。併入本發明之病毒基因組中的ITR可包括天然存在之聚核苷酸序列或以重組方式衍生之聚核苷酸序列。
ITR可衍生自與衣殼相同的血清型，或其衍生物。ITR可具有與衣殼不同之血清型。在某些實施例中，AAV粒子具有超過一個ITR。在一非限制性實例中，AAV粒子具有包括兩個ITR的病毒基因組。在某些實施例中，該等ITR具有彼此相同的血清型。在另一實施例中，該等ITR具有不同血清型。非限制性實例包括零個、一個或兩個具有與衣殼相同之血清型的ITR。在某些實施例中，AAV粒子之病毒基因組的兩個ITR均為AAV2 ITR。
獨立地，各ITR之長度可為約100至約150個核苷酸。ITR之長度可為約100至105個核苷酸，長度為106至110個核苷酸，長度為111至115個核苷酸，長度為116至120個核苷酸，長度為121至125個核苷酸，長度為126至130個核苷酸，長度為131至135個核苷酸，長度為136至140個核苷酸，長度為141至145個核苷酸或長度為146至150個核苷酸。在某些實施例中，ITR之長度為140至142個核苷酸。ITR長度之非限制性實例為102、130、140、141、142、145個核苷酸，及與其具有至少95%一致性之彼等核苷酸之長度。
在某些實施例中，各ITR之長度可為141個核苷酸。在某些實施例中，各ITR之長度可為130個核苷酸。在某些實施例中，各ITR之長度可為119個核苷酸。
在某些實施例中，AAV粒子包括兩個ITR，且一個ITR之長度為141個核苷酸且另一個ITR之長度為130個核苷酸。在某些實施例中，AAV粒子包括兩個ITR，且兩個ITR之長度均為141個核苷酸。啟動子
在某些實施例中，病毒基因組之有效載荷區包括至少一個增強轉殖基因目標特異性及表現之元件(參見例如Powell等人 Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015；其關於有效載荷/轉殖基因增強子元件之內容以全文引用之方式併入本文中)。增強轉殖基因目標特異性及表現之元件的非限制性實例包括啟動子、內源miRNA、轉錄後調控元件(PRE)、聚腺苷酸化(PolyA)信號序列及上游增強子(USE)、CMV增強子及內含子。
熟習此項技術者可認識到，本發明之多肽於目標細胞中之表現可能需要特定啟動子，包括但不限於物種特異性、誘導性、組織特異性或細胞週期特異性的啟動子(參見Parr等人,Nat. Med .3:1145-9 (1997)；其關於多肽表現啟動子之內容以全文引用之方式併入本文中)。
在某些實施例中，當啟動子驅動AAV粒子之病毒基因組之有效載荷區中經編碼之多肽的表現時，認為該啟動子有效。在某些實施例中，當啟動子驅動所靶向之細胞中之表現時，認為該啟動子為有效的啟動子。在某些實施例中，啟動子為對所靶向之細胞具有向性的啟動子。在某些實施例中，啟動子為對病毒生產性細胞具有向性的啟動子。
在某些實施例中，啟動子持續一段時間驅動有效載荷所靶向之細胞或組織中的表現。由啟動子驅動之表現可持續1至31天(或其中之任何值或範圍)、1至23個月(或其中之任何值或範圍)、2至10年(或其中之任何值或範圍)或大於10年之時段。表現可持續1至5小時、1至12小時、1至2天、1至5天、1至2週、1至3週、1至4週、1至2個月、1至4個月、1至6個月、2至6個月、3至6個月、3至9個月、4至8個月、6至12個月、1至2年、1至5年、2至5年、3至6年、3至8年、4至8年或5至10年。作為一非限制性實例，啟動子可為弱啟動子，以在神經(例如CNS)細胞或組織中持續表現有效載荷。
在某些實施例中，啟動子持續至少1至11個月(或其中之任何個別值)、2至65年(或其中之任何個別值)或大於65年驅動本發明之多肽的表現。
啟動子可為天然存在的或非天然存在的。啟動子之非限制性實例包括病毒啟動子、植物啟動子及哺乳動物啟動子。在某些實施例中，啟動子可為人類啟動子。在某些實施例中，啟動子可為截短或突變啟動子。
驅動或促進大部分組織中之表現的啟動子包括(但不限於)人類延長因子1α-次單元(EF1α)、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期增強子及/或啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β葡糖醛酸酶(GUSB)或泛素C (UBC)。組織特異性表現元件可用於將表現限制在某些細胞類型，諸如(但不限於)肌肉特異性啟動子、B細胞啟動子、單核球啟動子、白血球啟動子、巨噬細胞啟動子、胰臟腺泡細胞啟動子、內皮細胞啟動子、肺組織啟動子、星形膠質細胞啟動子，或可用於將表現限制在神經元或神經元亞型、星形膠質細胞或寡樹突神經膠質細胞之神經系統啟動子。
肌肉特異性啟動子之非限制性實例包括哺乳動物肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、哺乳動物肌間線蛋白(desmin，DES)啟動子、哺乳動物肌鈣蛋白I (TNNI2)啟動子及哺乳動物骨骼α-肌動蛋白(ASKA)啟動子(參見例如美國專利公開案US 20110212529，其關於肌肉特異性啟動子之內容以全文引用之方式併入本文中)。
神經元之組織特異性表現元件之非限制性實例包括神經元特異性烯醇酶(NSE)、血小板衍生生長因子(PDGF)、血小板衍生生長因子B鏈(PDGF-β)、突觸蛋白(Syn)、甲基-CpG結合蛋白2 (MeCP2)、Ca2+ /鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II (CaMKII)、代謝型麩胺酸受體2 (mGluR2)、神經纖毛輕鏈(NFL)或重鏈(NFH)、β-血球蛋白袖珍基因nβ2、前腦啡肽原(PPE)、腦啡肽(Enk)及激動性胺基酸轉運體2 (EAAT2)啟動子。星形膠質細胞之組織特異性表現元件之非限制性實例包括膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein；GFAP)及EAAT2啟動子。用於寡樹突神經膠質細胞之組織特異性表現元件的非限制性實例包括髓鞘鹼性蛋白(myelin basic protein；MBP)啟動子。
在某些實施例中，啟動子可小於1 kb。啟動子之長度可為200至800個核苷酸(或其中之任何值或範圍)，或大於800個核苷酸。啟動子之長度可介於200至300、200至400、200至500、200至600、200至700、200至800、300至400、300至500、300至600、300至700、300至800、400至500、400至600、400至700、400至800、500至600、500至700、500至800、600至700、600至800或700至800之間。
在某些實施例中，啟動子可為相同或不同起始或親本啟動子(諸如但不限於CMV及CBA)之兩種或更多種組分之組合。各組分之長度可為200至800個核苷酸(或其中之任何值或範圍)，或大於800個核苷酸。各組分之長度可介於200至300、200至400、200至500、200至600、200至700、200至800、300至400、300至500、300至600、300至700、300至800、400至500、400至600、400至700、400至800、500至600、500至700、500至800、600至700、600至800或700至800之間。在某些實施例中，啟動子為382核苷酸CMV-增強子序列及260核苷酸CBA-啟動子序列之組合。
在某些實施例中，病毒基因組包括普遍存在的啟動子。普遍存在的啟動子之非限制性實例包括CMV、CBA (包括衍生物CAG、CBh等)、EF-1α、PGK、UBC、GUSB (hGBp)及UCOE (HNRPA2B1-CBX3之啟動子)。
Yu等人(Molecular Pain 2011, 7:63；其內容以全文引用之方式併入本文中)使用慢病毒載體評估了eGFP在CAG、EFIα、PGK及UBC啟動子下在大鼠DRG細胞及初級DRG細胞中的表現，且發現UBC所顯示之表現比其他3種啟動子弱且所有啟動子均僅存在10%至12%神經膠質表現。Soderblom等人(E. Neuro 2015；其內容以全文引用之方式併入本文中)評估在注射至運動皮質之後，eGFP藉助於CMV及UBC啟動子在AAV8中的表現及藉助於CMV啟動子在AAV2中的表現。鼻內投與含有UBC或EFIα啟動子的質體顯示持續的呼吸道表現，其大於使用CMV啟動子的表現(參見例如Gill等人, Gene Therapy 2001, 第8卷, 1539-1546；該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中)。Husain等人(Gene Therapy 2009；該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中)評估具有hGUSB啟動子、HSV-1LAT啟動子及NSE啟動子的HβH構築體且發現HβH構築體顯示的表現比小鼠腦中的NSE弱。Passini及Wolfe (J. Virol. 2001, 12382-12392，該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中)評估HβH載體在心室內注射至新生小鼠之後的長期影響且發現存在至少1年的持續表現。Xu等人(Gene Therapy 2001, 8, 1323-1332；該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中)發現，相較於CMV-lacZ、CMV-luc、EF、GFAP、hENK、nAChR、PPE、PPE + wpre、NSE (0.3 kb)、NSE (1.8 kb)及NSE (1.8 kb + wpre)，使用NFL及NFH啟動子時所有腦區域中之表現較低。Xu等人發現，啟動子活性按降序為NSE (1.8 kb)、EF、NSE (0.3 kb)、GFAP、CMV、hENK、PPE、NFL及NFH。NFL為650個核苷酸之啟動子且NFH為920個核苷酸之啟動子，此兩種啟動子在肝中均不存在，但NFH在感覺性本體感受性神經元、腦及脊髓中為豐裕的且NFH存在於心臟中。SCN8A為貫穿DRG、脊髓及腦表現的470個核苷酸之啟動子，且發現在海馬神經元及小腦浦金埃氏細胞(Purkinje cell)、皮質、丘腦及下丘腦中之表現特別高(參見例如Drews等人,Identification of evolutionary conserved, functional noncoding elements in the promoter region of the sodium channel gene SCN8A , Mamm Genome (2007) 18:723-731；及Raymond等人,Expression of Alternatively Spliced Sodium Channel α-subunit genes , Journal of Biological Chemistry (2004) 279(44) 46234-46241；該等文獻中之每一者的內容均以全文引用之方式併入本文中)。
前述Yu、Soderblom、Gill、Husain、Passini、Xu、Drews或Raymond教示之啟動子中之任一者均可用於本發明中。
在某些實施例中，啟動子並非細胞特異性的。
在某些實施例中，啟動子為泛素c (UBC)啟動子。UBC啟動子之大小可為300至350個核苷酸。作為一非限制性實例，UBC啟動子為332個核苷酸。在某些實施例中，啟動子為β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSB)啟動子。GUSB啟動子之大小可為350至400個核苷酸。作為一非限制性實例，GUSB啟動子為378個核苷酸。在某些實施例中，啟動子為神經纖毛輕鏈(NFL)啟動子。NFL啟動子之大小可為600至700個核苷酸。作為一非限制性實例，NFL啟動子為650個核苷酸。在某些實施例中，啟動子為神經纖毛重鏈(NFH)啟動子。NFH啟動子之大小可為900至950個核苷酸。作為一非限制性實例，NFH啟動子為920個核苷酸。在某些實施例中，啟動子為SCN8A啟動子。SCN8A啟動子之大小可為450至500個核苷酸。作為一非限制性實例，SCN8A啟動子為470個核苷酸。
在某些實施例中，啟動子為重組人粒線體型蛋白(frataxin；FXN)啟動子。在某些實施例中，啟動子為磷酸甘油酸激酶1 (PGK)啟動子。在某些實施例中，啟動子為雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子或其變異體。在某些實施例中，啟動子為CB6啟動子。在某些實施例中，啟動子為最小CB啟動子。在某些實施例中，啟動子為細胞巨大病毒(CMV)啟動子。在某些實施例中，啟動子為H1啟動子。在某些實施例中，啟動子為CAG啟動子。在某些實施例中，啟動子為GFAP啟動子。在某些實施例中，啟動子為突觸蛋白(synapsin)啟動子。在某些實施例中，啟動子為經工程改造啟動子。在某些實施例中，啟動子為肝臟或骨胳肌啟動子。肝臟啟動子之非限制性實例包括人類α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)及甲狀腺素結合球蛋白(TBG)。骨胳肌啟動子之非限制性實例包括肌間線蛋白、MCK或合成C5-12。在某些實施例中，啟動子為RNA pol III啟動子。作為一非限制性實例，RNA pol III啟動子為U6。作為一非限制性實例，RNA pol III啟動子為H1。在某些實施例中，啟動子為心肌細胞特異性啟動子。心肌細胞特異性啟動子之非限制性實例包括αMHC、cTnT及CMV-MLC2k。在某些實施例中，病毒基因組包括兩個啟動子。作為一非限制性實例，啟動子為EF1α啟動子及CMV啟動子。
在某些實施例中，病毒基因組包括增強子元件、啟動子及/或5' UTR內含子。增強子元件，在本文中亦稱為「增強子」，可為(但不限於) CMV增強子，啟動子可為(但不限於) CMV、CBA、UBC、GUSB、NSE、突觸蛋白、MeCP2及GFAP啟動子且5'UTR/內含子可為(但不限於) SV40及CBA-MVM。作為一非限制性實例，組合使用之增強子、啟動子及/或內含子可為：(1) CMV增強子、CMV啟動子、SV40 5' UTR內含子；(2) CMV增強子、CBA啟動子、SV 40 5' UTR內含子；(3) CMV增強子、CBA啟動子、CBA-MVM 5' UTR內含子；(4) UBC啟動子；(5) GUSB啟動子；(6) NSE啟動子；(7)突觸蛋白啟動子；(8) MeCP2啟動子及(9) GFAP啟動子。
在某些實施例中，病毒基因組包括經工程改造啟動子。
在另一實施例中，病毒基因組包括來自天然表現之蛋白質的啟動子。非轉譯區 ( UTR )
根據定義，基因之野生型非轉譯區(UTR)發生轉錄，但不轉譯。一般而言，5' UTR起始於轉錄起始位點且結束於起始密碼子，且3' UTR緊隨終止密碼子之後起始且持續直至轉錄終止信號為止。
通常發現於特定目標器官之充分表現之基因中的特徵可經工程改造而進入UTR中以增強穩定性及蛋白質產生。作為一非限制性實例，來自通常表現於肝中之mRNA (例如白蛋白、血清澱粉狀蛋白A、脂蛋白元A/B/E、運鐵蛋白、α胎蛋白、紅血球生成素或因子VIII)的5' UTR可用於本發明之AAV粒子之病毒基因組中，以增強肝細胞株或肝臟中之表現。
雖然不希望受理論束縛，野生型5'非轉譯區(UTR)包括在轉譯起始中起作用的特徵。通常在5' UTR中包括Kozak序列，Kozak序列通常已知參與核糖體藉以起始多個基因之轉譯的過程。Kozak序列具有共同CCR(A/G)CCAUGG，其中R為起始密碼子上游的嘌呤(腺嘌呤或鳥嘌呤)三鹼基(ATG)，繼其之後為另一個「G」。在某些實施例中，病毒基因組中之5' UTR包括Kozak序列。在某些實施例中，病毒基因組中之5' UTR不包括Kozak序列。
雖然不希望受理論束縛，但已知野生型3' UTR中嵌有腺苷及尿苷的片段。此等富AU標誌在周轉率較高之基因中尤其普遍。基於其序列特徵及功能特性，富AU元件(ARE)可分成三類(Chen等人, 1995，其關於富AU元件之內容以全文引用之方式併入本文中)：I類ARE (諸如但不限於c-Myc及MyoD)在富U區內含有AUUUA基序之若干個分散的複本。II類ARE，諸如(但不限於)GM-CSF及TNF-a，具有兩個或更多個重疊的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚體。III類ARES，諸如(但不限於) c-Jun及成肌素，定義不太明確。此等富U區不含AUUUA基序。已知結合於ARE之大部分蛋白質使信使失穩，而已記載ELAV家族成員(最顯著地，HuR)增加mRNA之穩定性。HuR結合於所有三類ARE。將HuR特異性結合位點工程改造至核酸分子之3' UTR中將引起HuR結合，從而引起活體內訊息穩定。
3' UTR富AU元件(ARE)之引入、移除或修飾可用於調節聚核苷酸之穩定性。當對特定聚核苷酸(例如病毒基因組之有效載荷區)進行工程改造時，可引入ARE之一或多個複本以使得聚核苷酸較不穩定，且因此減少轉譯及降低所得蛋白質的產量。同樣，可鑑別出ARE且將其移除或使其突變以增加胞內穩定性，且因此增加所得蛋白質之轉譯及產量。
在某些實施例中，病毒基因組之3' UTR可包括用於模板化添加多聚腺苷酸尾的寡聚(dT)序列。
在某些實施例中，病毒基因組可包括至少一個miRNA種子、結合位點或完整序列。微RNA (或miRNA或miR)為19至25個核苷酸之非編碼RNA，其結合至核酸目標位點且藉由降低核酸分子穩定性或藉由抑制轉譯來下調基因表現。微RNA序列包括「種子」區，亦即成熟微RNA之位置2至8區域中的序列，該序列相對於核酸之miRNA目標序列具有完美的沃森-克里克互補性(Watson-Crick complementarity)。
在某些實施例中，病毒基因組可經工程改造以包括、改變或移除至少一個miRNA結合位點、序列或種子區。
可將來自此項技術中已知之任何基因的任何UTR併入AAV粒子之病毒基因組中。此等UTR或其部分之置放定向可與在其所選自之基因中相同，或其定向或位置可變化。在某些實施例中，AAV粒子之病毒基因組中所用的UTR可經倒轉、縮短、拉長、製成具有此項技術中已知的一或多個其他5' UTR或3' UTR。如本文所用，在與UTR相關時，術語「改變」意謂UTR已以某種方式相對於參考序列變化。舉例而言，3'或5' UTR可如上文所教示根據定向或位置的變化而相對於野生型或原生UTR發生改變，或可藉由包括額外核苷酸、核苷酸缺失、核苷酸調換或轉位而發生改變。
在某些實施例中，AAV粒子之病毒基因組包括至少一個人工UTR，其不為野生型UTR之變異體。
在某些實施例中，AAV粒子之病毒基因組包括已選自轉錄物家族之UTR，該等轉錄物之蛋白質共有共同的功能、結構、特徵或特性。聚腺苷酸化序列
在某些實施例中，本發明之AAV粒子之病毒基因組包括至少一個聚腺苷酸化序列。AAV粒子之病毒基因組可包括位於有效載荷編碼序列之3'端與3' ITR之5'端之間的聚腺苷酸化序列。
在某些實施例中，聚腺苷酸化序列或「polyA序列」之長度可在不存在至約500個核苷酸之範圍內。聚腺苷酸化序列之長度可為但不限於1至500個核苷酸(或其中之任何值或範圍)。
在某些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為127個核苷酸。在某些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為477個核苷酸。在某些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為552個核苷酸。內含子
在某些實施例中，載體基因組包括至少一個增強轉殖基因目標特異性及表現之元件(參見例如Powell等人Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy , 2015；其關於轉殖基因靶向增強子之內容以全文引用之方式併入本文中)，諸如內含子。內含子之非限制性實例包括MVM (67至97 bp)、F.IX截短內含子1 (300 bp)、β-血球蛋白SD/免疫球蛋白重鏈剪接受體(250 bp)、腺病毒剪接供體/免疫球蛋白剪接受體(500 bp)、SV40晚期剪接供體/剪接受體(19S/16S) (180 bp)及雜合腺病毒剪接供體/IgG剪接受體(230 bp)。
在某些實施例中，內含子或內含子部分之長度可為100至500個核苷酸。內含子之長度可為80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500。內含子之長度可介於80至100、80至120、80至140、80至160、80至180、80至200、80至250、80至300、80至350、80至400、80至450、80至500、200至300、200至400、200至500、300至400、300至500或400至500之間。填充序列
在某些實施例中，病毒基因組包括至少一個改良封裝效率及表現之元件，諸如填充序列(stuffer/filler sequence)。填充序列之非限制性實例包括白蛋白及/或α-1抗胰蛋白酶。可操縱任何已知的病毒序列、哺乳動物序列或植物序列，使其適用作填充序列。
在某些實施例中，填充序列之長度可為約100至3500個核苷酸。填充序列之長度可為約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000。miRNA
在某些實施例中，病毒基因組包括至少一個編碼miRNA以減少轉殖基因於特定組織中之表現的序列。miRNA及其所靶向的組織為此項技術中所熟知的。作為一非限制性實例，可在病毒基因組中編碼miR-122 miRNA以減少病毒基因組在肝臟中之表現。 有效載荷
本發明之AAV粒子可包括至少一種包括至少一個有效載荷區之有效載荷構築體，或使用該至少一種有效載荷構築體產生。在某些實施例中，有效載荷區可位於病毒基因組，諸如有效載荷構築體之病毒基因組內。在有效載荷區之5'端及/或3'端處可存在至少一個反向末端重複序列(ITR)。在有效載荷區內，可存在啟動子區、內含子區及編碼區。
在某些實施例中，本發明之有效載荷構築體可為桿粒(bacmid)，亦稱為桿狀病毒質體或重組桿狀病毒基因組。
在某些實施例中，AAV粒子之有效載荷區包括一或多個編碼所關注之多肽或蛋白質的核酸序列。
在某些實施例中，AAV粒子包括具有有效載荷區之病毒基因組，該有效載荷區包含編碼超過一個所關注之多肽的核酸序列。在某些實施例中，編碼一或多種多肽之病毒基因組可經複製及封裝至病毒粒子中。經包含載體基因組之病毒粒子轉導之目標細胞可在單一目標細胞中表現一或多個多肽中之每一者。
在AAV粒子有效載荷區編碼多肽的情況下，該多肽可為肽、多肽或蛋白質。作為一非限制性實例，有效載荷區可編碼至少一種所關注之治療蛋白。編碼本文所描述之多肽的AAV病毒基因組可適用於人類疾病、病毒、感染獸醫學應用之領域及多種活體內及活體外環境中。
在某些實施例中，向個體投與經調配之AAV粒子(其包括病毒基因組)將增加蛋白質於個體中之表現。在某些實施例中，增加蛋白質之表現將減少與由有效載荷編碼之多肽相關之疾病或病痛的影響及/或症狀。
在某些實施例中，AAV粒子包括具有有效載荷區之病毒基因組，該有效載荷區包含編碼所關注之蛋白質(亦即有效載荷蛋白、治療蛋白)之核酸序列。
在某些實施例中，有效載荷區包含編碼蛋白質之核酸序列，該蛋白質包括(但不限於)抗體、芳族L-胺基酸去羧酶(AADC)、ApoE2、重組人粒線體型蛋白、運動神經元存活(SMN)蛋白、葡糖腦苷脂酶、N-磺基葡糖胺磺基水解酶、N-乙醯基-α-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖苷、軟脂醯基-蛋白硫酯酶1、三肽基肽酶1、巴登氏病蛋白(battenin)、CLN5、CLN6 (linclin)、MFSD8、CLN8、天冬醯轉移酶(ASPA)、顆粒蛋白前體(GRN)、MeCP2、β-半乳糖苷酶(GLB1)及/或巨軸索神經病蛋白(gigaxonin) (GAN)。
在某些實施例中，AAV粒子包括具有有效載荷區之病毒基因組，該有效載荷區包含編碼以下國際公開案中之任一者中所描述之任何疾病相關蛋白(及其片段或變異體)的核酸序列：WO2016073693、WO2017023724、WO2018232055、WO2016077687、WO2016077689、WO2018204786、WO2017201258、WO2017201248、WO2018204803、WO2018204797、WO2017189959、WO2017189963、WO2017189964、WO2015191508、WO2016094783、WO20160137949、WO2017075335；其內容各以全文引用之方式併入本文中，程度為其不與本發明衝突。
由本發明之病毒基因組之有效載荷區編碼的胺基酸序列可轉譯為整個多肽、複數個多肽或多肽片段，其獨立地可由一或多個核酸、核酸片段或前述任一者之變異體編碼。如本文所用，「多肽」」意謂最常藉由肽鍵連接在一起的胺基酸殘基(天然或非天然)之聚合物。如本文所用，該術語係指具有任何大小、結構或功能之蛋白質、多肽及肽。在一些情況下，所編碼之多肽小於約50個胺基酸，且該多肽隨後稱為肽。若多肽為肽，則其長度將為至少約2、3、4或至少5個胺基酸殘基。因此，多肽包括基因產物、天然存在之多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段及前述者之其他等效物、變異體及類似物。多肽可為單分子或可為多分子複合物，諸如二聚體、三聚體或四聚體。其亦可包含單鏈或多鏈多肽，且可為締合或連接的。術語多肽亦適用於其中一或多個胺基酸殘基為對應天然存在之胺基酸之人工化學類似物的胺基酸聚合物。
在某些實施例中，提供「多肽變異體」。術語「多肽變異體」係指胺基酸序列與原生或參考序列不同之分子。相較於原生或參考序列，胺基酸序列變異體可在胺基酸序列內某些位置處具有取代、缺失及/或插入。通常，變異體將與原生或參考序列具有至少約50%一致性(同源性)，且在某些實施例中，其將與原生或參考序列具有至少約80%或至少約90%一致性(同源性)。
本發明包含使用經調配之AAV粒子，該等AAV粒子之載體基因組編碼作為治療劑之調節聚核苷酸，例如RNA或DNA分子。因此，本發明提供編碼聚核苷酸之載體基因組，該等聚核苷酸係加工成靶向所關注之基因的小雙股RNA (dsRNA)分子(小干擾RNA、siRNA、miRNA、pre-miRNA)。本發明亦提供將其用於抑制所關注之基因之對偶基因的基因表現及蛋白質產生，以治療疾病、病症及/或病況之方法。
在某些實施例中，AAV粒子包括具有有效載荷區之病毒基因組，該有效載荷區包含編碼或包括一或多個調節聚核苷酸之核酸序列。在某些實施例中，AAV粒子包括具有有效載荷區之病毒基因組，該有效載荷區包含編碼所關注之調節聚核苷酸的核酸序列。在本發明之某些實施例中，例如RNA或DNA分子之調節聚核苷酸係呈現為治療劑。由RNA干擾介導之基因靜默可特異性抑制所靶向基因之表現。
在某些實施例中，有效載荷區包含編碼調節聚核苷酸之核酸序列，該調節聚核苷酸干擾目標基因表現及/或目標蛋白產生。在某些實施例中，待抑制/修飾之基因表現或蛋白質產生可包括(但不限於)超氧化歧化酶1 (SOD1)、染色體9開放閱讀框架72 (C9ORF72)、TAR DNA結合蛋白(TARDBP)、共濟失調蛋白-3 (ataxin-3；ATXN3)、亨廷頓蛋白(huntingtin；HTT)、澱粉狀蛋白前驅蛋白(APP)、脂蛋白元E (ApoE)、微管相關蛋白tau (MAPT)、α-突觸核蛋白(SNCA)、電壓閘控之鈉通道α次單元9 (SCN9A)及/或電壓閘控之鈉通道α次單元10 (SCN10A)。
在某些實施例中，AAV粒子包括具有有效載荷區之病毒基因組，該有效載荷區包含編碼以下國際公開案中之任一者中所描述之任何調節聚核苷酸、RNAi分子、siRNA分子、dsRNA分子及/或RNA雙螺旋體的核酸序列：WO2016073693、WO2017023724、WO2018232055、WO2016077687、WO2016077689、WO2018204786、WO2017201258、WO2017201248、WO2018204803、WO2018204797、WO2017189959、WO2017189963、WO2017189964、WO2015191508、WO2016094783、WO20160137949、WO2017075335；其內容各自以全文引用之方式併入本文中，程度為其不與本發明衝突。
在某些實施例中，編碼此類siRNA分子，或siRNA分子之單股的核酸序列係插入至腺相關病毒載體中且引入至細胞，尤其中樞神經系統中之細胞中。
由於若干獨特的特徵，已研究將AAV粒子用於siRNA遞送。特徵之非限制性實例包括(i)感染分裂細胞及非分裂細胞之能力；(ii)廣泛的宿主感染範圍，包括人類細胞；(iii)野生型AAV不與任何疾病相關且不能在已感染細胞中複製；(iv)缺乏針對載體的細胞介導之免疫反應；及(v)在宿主染色體中之非整合性質，由此降低長期表現之可能性。此外，經AAV粒子感染對改變細胞基因表現模式的影響極小(Stilwell及Samulski等人,Biotechniques , 2003, 34, 148)。
在某些實施例中，本發明之經編碼siRNA雙螺旋體含有混雜在一起形成雙螺旋結構的反義股及有義股，其中反義股與所關注之靶向基因的核酸序列互補，且其中有義股與所關注之靶向基因的核酸序列同源。在其他態樣中，在各股之3'端存在0、1或2個核苷酸突出端。
本發明之經調配AAV粒子的有效載荷可編碼一或多種試劑，其經受RNA干擾(RNAi)誘導之基因表現抑制。本文提供靶向所關注之基因的經編碼siRNA雙螺旋體或經編碼dsRNA (本文中統稱為「siRNA分子」)。例如經編碼siRNA雙螺旋體、經編碼dsRNA或經編碼siRNA或dsRNA前驅體之此類siRNA分子可使細胞，例如星形膠質細胞或微神經膠質細胞、皮質、海馬、內嗅、丘腦、感覺或運動神經元中之基因表現減少或靜默。
RNAi (亦稱為轉錄後基因靜默(PTGS)、壓制或共抑制)為轉錄後基因靜默方法，其中RNA分子以序列特異性方式抑制基因表現，通常藉由使特異性mRNA分子毀壞來進行。RNAi之活性組分為短/小雙股RNA (dsRNA)，稱為小干擾RNA (siRNA)，其通常含有15至30個核苷酸(例如19至25、19至24或19至21個核苷酸)及2個核苷酸之3'突出端，且其匹配目標基因之核酸序列。此等短RNA物種可藉由較大dsRNA的Dicer介導之裂解而在活體內天然產生，且其在哺乳動物細胞中具功能性。
天然表現之小RNA分子，稱為微RNA (miRNA)，藉由調控mRNA之表現引發基因靜默。含有RNA誘導之靜默複合物(RISC)的miRNA靶向與miRNA之稱為種子區的5'區中之核苷酸2至7及其3'區之其他鹼基對呈現完美序列互補的mRNA。miRNA介導的基因表現之下調可由目標mRNA之裂解、目標mRNA之轉譯抑制或mRNA分解引起。miRNA靶向序列通常位於目標mRNA之3' UTR中。單一miRNA可靶向超過100個來自各種基因之轉錄物，且一個mRNA可為不同miRNA所靶向。
靶向特定mRNA之siRNA雙螺旋體或dsRNA可經設計為AAV粒子之有效載荷且引入至細胞中以用於活化RNAi過程。Elbashir等人證明，21-核苷酸siRNA雙螺旋體(稱為小干擾RNA)能夠在哺乳動物細胞中實現有力且特異性的基因表現減弱(gene knockdown)而不誘導免疫反應(Elbashir SM等人,Nature , 2001, 411, 494-498)。自此初始報導以來，藉由siRNA進行之轉錄後基因靜默作為用於哺乳動物細胞中遺傳分析之有效工具迅速出現，且具有產生新穎治療劑之潛力。
siRNA雙螺旋體包含與目標mRNA同源的有義股及與目標mRNA互補的反義股，在目標RNA破壞效率方面提供的優勢比使用單股(ss)-siRNA (例如，反義股RNA或反義寡核苷酸)多得多。在多數情況下，需要較高濃度之ss-siRNA來達成對應雙螺旋體之有效基因靜默效力。
在某些實施例中，siRNA分子可經編碼於亦包含分子支架之調節聚核苷酸中。如本文所用，「分子支架」為形成序列或結構性基礎之構架或起始分子，在該基礎上設計或製成後續分子。
在某些實施例中，包含有效載荷(例如，siRNA、miRNA或本文所描述之其他RNAi劑)之調節聚核苷酸包括分子支架，該分子支架包含前導5'側接序列，其可具有任何長度且可完全或部分衍生自野生型微RNA序列或完全為人工的。3'側接序列之大小及起點與5'側接序列成鏡像。在某些實施例中，5'及3'側接序列中之一者或兩者不存在。
在某些實施例中，分子支架可包含一或多個此項技術中已知之連接子。連接子可使各區域分開或使一個分子支架與另一分子支架分開。作為一非限制性實例，分子支架可為多順反子的。
在某些實施例中，使用以下特性中之至少一者設計調節聚核苷酸：環變異體、種子錯配/凸出/擺動變異體、莖錯配、環變異體及基部莖錯配變異體、種子錯配及基部莖錯配變異體、莖錯配及基部莖錯配變異體、種子擺動及基部莖擺動變異體或莖序列變異體。 基因組大小
在某些實施例中，包括本文所描述之有效載荷的AAV粒子可為單股或雙股載體基因組。載體基因組之大小可為小、中等、大或最大大小。另外，載體基因組可包括啟動子及polyA尾。
在某些實施例中，包括本文所描述之有效載荷的載體基因組可為小單股載體基因組。小單股載體基因組之大小可為2.1至3.5 kb，諸如大小為約2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4及3.5 kb。作為一非限制性實例，小單股載體基因組之大小可為3.2 kb。作為另一非限制性實例，小單股載體基因組之大小可為2.2 kb。另外，載體基因組可包括啟動子及polyA尾。
在某些實施例中，包括本文所描述之有效載荷的載體基因組可為小雙股載體基因組。小雙股載體基因組之大小可為1.3至1.7 kb，諸如大小為約1.3、1.4、1.5、1.6及1.7 kb。作為一非限制性實例，小雙股載體基因組之大小可為1.6 kb。另外，載體基因組可包括啟動子及polyA尾。
在某些實施例中，包括本文所描述之有效載荷，例如聚核苷酸、siRNA或dsRNA的載體基因組可為中等單股載體基因組。中等單股載體基因組之大小可為3.6至4.3 kb，諸如大小為約3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2及4.3 kb。作為一非限制性實例，中等單股載體基因組之大小可為4.0 kb。另外，載體基因組可包括啟動子及polyA尾。
在某些實施例中，包括本文所描述之有效載荷的載體基因組可為中等雙股載體基因組。中等雙股載體基因組之大小可為1.8至2.1 kb，諸如大小為約1.8、1.9、2.0及2.1 kb。作為一非限制性實例，中等雙股載體基因組之大小可為2.0 kb。另外，載體基因組可包括啟動子及polyA尾。
在某些實施例中，包括本文所描述之有效載荷的載體基因組可為大單股載體基因組。大單股載體基因組之大小可為4.4至6.0 kb，諸如大小為約4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0 kb。作為一非限制性實例，大單股載體基因組之大小可為4.7 kb。作為另一非限制性實例，大單股載體基因組之大小可為4.8 kb。作為又一非限制性實例，大單股載體基因組之大小可為6.0 kb。另外，載體基因組可包括啟動子及polyA尾。
在某些實施例中，包括本文所描述之有效載荷的載體基因組可為大雙股載體基因組。大雙股載體基因組之大小可為2.2至3.0 kb，諸如大小為約2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3.0 kb。作為一非限制性實例，大雙股載體基因組之大小可為2.4 kb。另外，載體基因組可包括啟動子及polyA尾。 AAV血清型
本發明之AAV粒子可包括或衍生自任何天然或重組AAV血清型。根據本發明，AAV粒子可利用或基於選自以下中之任一者的血清型或包括具有該血清型之肽：VOY101、VOY201、AAVPHP.B (PHP.B)、AAVPHP.A (PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH1.1-32、AAVTH1.1-35、AAVPHP.B2 (PHP.B2)、AAVPHP.B3 (PHP.B3)、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3 (G2A3)、AAVG2B4 (G2B4)、AAVG2B5 (G2B5)、PHP.S、AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突變體、AAVrh8R R533A突變體、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛類AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV Shuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAV Shuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真實類型AAV (ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAV CHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAV CLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAV CLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAV CSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、AAVrh20、AAVrh32/33、AAVrh39、AAVrh46、AAVrh73、AAVrh74、AAVhu.26或其變異體或衍生物。
AAV-DJ序列可包括兩種突變：(1) R587Q，其中胺基酸587處之精胺酸(R；Arg)變為麩醯胺酸(Q；Gln)，及(2) R590T，其中胺基酸590處之精胺酸(R；Arg)變為蘇胺酸(T；Thr)。作為另一非限制性實例，可包括三個突變：(1) K406R，其中胺基酸406處之離胺酸(K；Lys)變為精胺酸(R；Arg)；(2) R587Q，其中胺基酸587處之精胺酸(R；Arg)變為麩醯胺酸(Q；Gln)；及(3) R590T，其中胺基酸590處之精胺酸(R；Arg)變為蘇胺酸(T；Thr)。
在某些實施例中，AAV可為藉由在胺基酸390至627 (VP1編號)中具有突變之AAV9衣殼文庫產生的血清型。該血清型及對應核苷酸及胺基酸取代可為(但不限於)AAV9.1 (G1594C；D532H)、AAV6.2 (T1418A及T1436X；V473D及I479K)、AAV9.3 (T1238A；F413Y)、AAV9.4 (T1250C及A1617T；F417S)、AAV9.5 (A1235G、A1314T、A1642G、C1760T；Q412R、T548A、A587V)、AAV9.6 (T1231A；F411I)、AAV9.9 (G1203A、G1785T；W595C)、AAV9.10 (A1500G、T1676C；M559T)、AAV9.11 (A1425T、A1702C、A1769T；T568P、Q590L)、AAV9.13 (A1369C、A1720T；N457H、T574S)、AAV9.14 (T1340A、T1362C、T1560C、G1713A；L447H)、AAV9.16 (A1775T；Q592L)、AAV9.24 (T1507C、T1521G；W503R)、AAV9.26 (A1337G、A1769C；Y446C、Q590P)、AAV9.33 (A1667C；D556A)、AAV9.34 (A1534G、C1794T；N512D)、AAV9.35 (A1289T、T1450A、C1494T、A1515T、C1794A、G1816A；Q430L、Y484N、N98K、V606I)、AAV9.40 (A1694T、E565V)、AAV9.41 (A1348T、T1362C；T450S)、AAV9.44 (A1684C、A1701T、A1737G；N562H、K567N)、AAV9.45 (A1492T、C1804T；N498Y、L602F)、AAV9.46 (G1441C、T1525C、T1549G；G481R、W509R、L517V)、9.47 (G1241A、G1358A、A1669G、C1745T；S414N、G453D、K557E、T582I)、AAV9.48 (C1445T、A1736T；P482L、Q579L)、AAV9.50 (A1638T、C1683T、T1805A；Q546H、L602H)、AAV9.53 (G1301A、A1405C、C1664T、G1811T；R134Q、S469R、A555V、G604V)、AAV9.54 (C1531A、T1609A；L511I、L537M)、AAV9.55 (T1605A；F535L)、AAV9.58 (C1475T、C1579A；T492I、H527N)、AAV.59 (T1336C；Y446H)、AAV9.61 (A1493T；N498I)、AAV9.64 (C1531A、A1617T；L511I)、AAV9.65 (C1335T、T1530C、C1568A；A523D)、AAV9.68 (C1510A；P504T)、AAV9.80 (G1441A；G481R)、AAV9.83 (C1402A、A1500T；P468T、E500D)、AAV9.87 (T1464C、T1468C；S490P)、AAV9.90 (A1196T；Y399F)、AAV9.91 (T1316G、A1583T、C1782G、T1806C；L439R、K528I)、AAV9.93 (A1273G、A1421G、A1638C、C1712T、G1732A、A1744T、A1832T；S425G、Q474R、Q546H、P571L、G578R、T582S、D611V)、AAV9.94 (A1675T；M559L)及AAV9.95 (T1605A；F535L)。
在本文所提及及/或所描述之任何DNA及RNA序列中，單字母符號描述如下：A代表腺嘌呤；C代表胞嘧啶；G代表鳥嘌呤；T代表胸腺嘧啶；U代表尿嘧啶；W代表弱鹼基，諸如腺嘌呤或胸腺嘧啶；S代表強核苷酸，諸如胞嘧啶及鳥嘌呤；M代表胺基核苷酸，諸如腺嘌呤及胞嘧啶；K代表酮基核苷酸，諸如鳥嘌呤及胸腺嘧啶；R代表嘌呤：腺嘌呤及鳥嘌呤；Y代表嘧啶：胞嘧啶及胸腺嘧啶；B代表任何非A鹼基(例如，胞嘧啶、鳥嘌呤及胸腺嘧啶)；D代表任何非C鹼基(例如，腺嘌呤、鳥嘌呤及胸腺嘧啶)；H代表任何非G鹼基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶)；V代表任何非T鹼基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶及鳥嘌呤)；N代表任何核苷酸(其不為間隙)；且Z代表零。
在本文所提及及/或所描述之任何胺基酸序列中，單字母符號描述如下：G (Gly)代表甘胺酸；A (Ala)代表丙胺酸；L (Leu)代表白胺酸；M (Met)代表甲硫胺酸；F (Phe)代表苯丙胺酸；W (Trp)代表色胺酸；K (Lys)代表離胺酸；Q (Gln)代表麩醯胺酸；E (Glu)代表麩胺酸；S (Ser)代表絲胺酸；P (Pro)代表脯胺酸；V (Val)代表纈胺酸；I (Ile)代表異白胺酸；C (Cys)代表半胱胺酸；Y (Tyr)代表酪胺酸；H (His)代表組胺酸；R (Arg)代表精胺酸；N (Asn)代表天冬醯胺；D (Asp)代表天冬胺酸；T (Thr)代表蘇胺酸；B (Asx)代表天冬胺酸或天冬醯胺；J (Xle)代表白胺酸或異白胺酸；O (Pyl)代表吡咯離胺酸；U (Sec)代表硒半胱胺酸；X (Xaa)代表任何胺基酸；且Z (Glx)代表麩醯胺酸或麩胺酸。
在某些實施例中，AAV血清型可為或可包括序列、插入、修飾或突變，如專利公開案WO2015038958、WO2017100671、WO2016134375、WO2017083722、WO2017015102、WO2017058892、WO2017066764、US9624274、US9475845、US20160369298、US20170145405中所描述，該等公開案關於AAV血清型及修飾之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，AAV可為藉由基於Cre重組之AAV靶向演化(CREATE)所產生的血清型，如Deverman等人(Nature Biotechnology 34(2):204-209 (2016))所描述，該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，AAV血清型可如Jackson等人 (Frontiers in Molecular Neuroscience 9:154 (2016))中所描述，該文獻關於AAV血清型及修飾之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，會選擇使用AAV血清型係基於其對於中樞神經系統之細胞的向性。在某些實施例中，中樞神經系統之細胞為神經元。在另一實施例中，中樞神經系統之細胞為星形膠質細胞。
在某些實施例中，會選擇使用AAV血清型係基於其對肌肉細胞的向性。
在某些實施例中，用於轉譯AAV VP1衣殼蛋白之起始密碼子可為CTG、TTG或GTG，如美國專利第US8163543號中所描述，其關於AAV血清型及修飾之內容已以全文引用之方式併入本文中。
本發明係關於由衣殼(Cap)基因編碼之結構衣殼蛋白(包括VP1、VP2及VP3)。此等衣殼蛋白形成諸如AAV之病毒載體的蛋白質結構外殼(亦即衣殼)。由Cap聚核苷酸合成之VP衣殼蛋白通常包括甲硫胺酸作為肽序列中之第一胺基酸(Met1)，其與對應Cap核苷酸序列中之起始密碼子(AUG或ATG)相關聯。然而，第一甲硫胺酸(Met1)殘基或一般任何第一胺基酸(AA1)通常在多肽合成之後或期間，藉由諸如Met-胺基肽酶之蛋白質加工酶裂解。此「Met/AA-削減」過程通常與多肽序列中之第二胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸等)的對應乙醯化相關。Met-削減通常用VP1及VP3衣殼蛋白進行，但亦可用VP2衣殼蛋白進行。
當Met/AA-削減不完全時，可產生包括病毒衣殼之一或多種(一種、兩種或三種) VP衣殼蛋白之混合物，其中一些可包括Met1/AA1胺基酸(Met+/AA+)，且其中一些可由於Met/AA-削減而缺乏Met1/AA1胺基酸(Met-/AA-)。關於衣殼蛋白中之Met/AA-削減的進一步論述，參見Jin等人Direct Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis for Complete Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus Capsid Proteins.Hum Gene Ther Methods . 2017年10月 28(5):255-267；Hwang等人 N-Terminal Acetylation of Cellular Proteins Creates Specific Degradation Signals.Science . 2010年2月19日. 327(5968): 973-977；其關於衣殼蛋白修飾及削減之內容各自以全文引用之方式併入本文中。
根據本發明，提及的衣殼蛋白不限於經削減的(Met-/AA-)或未經削減的(Met+/AA+)，且在上下文中可指代獨立衣殼蛋白、衣殼蛋白混合物包括之病毒衣殼及/或編碼、描述、產生或獲得本發明之衣殼蛋白的聚核苷酸序列(或其片段)。直接提及的「衣殼蛋白」或「衣殼多肽」(諸如VP1、VP2或VP2)亦可包括：VP衣殼蛋白，其包括Met1/AA1胺基酸(Met+/AA+)；以及對應VP衣殼蛋白，其由於Met/AA-削減而缺乏Met1/AA1胺基酸(Met-/AA-)。
另外，根據本發明，提及的分別包括或編碼一或多種包括Met1/AA1胺基酸(Met+/AA+)之衣殼蛋白的特定SEQ ID NO: (無論是蛋白質抑或核酸)應理解為教示不具有Met1/AA1胺基酸之VP衣殼蛋白，當檢查序列時，其顯然為僅缺乏第一所列胺基酸(無論是否為Met1/AA1)之任何序列。
作為一非限制性實例，提及的長度為736個胺基酸且包括由AUG/ATG起始密碼子編碼之「Met1」胺基酸(Met+)的VP1多肽序列亦可理解為教示長度為735個胺基酸且不包括736個胺基酸之Met+序列中的「Met1」胺基酸(Met-)的VP1多肽序列。作為第二非限制性實例，提及的長度為736個胺基酸且包括由任何NNN起始密碼子編碼之「AA1」胺基酸(AA1+)的VP1多肽序列亦可理解為教示長度為735個胺基酸且不包括736個胺基酸之AA1+序列中的「AA1」胺基酸(AA1-)的VP1多肽序列。
提及的由VP衣殼蛋白形成之病毒衣殼(諸如提及的特定AAV衣殼血清型)可併有包括Met1/AA1胺基酸(Met+/AA1+)之VP衣殼蛋白、由於Met/AA1-削減而缺少Met1/AA1胺基酸(Met-/AA1-)之對應VP衣殼蛋白以及其組合(Met+/AA1+及Met-/AA1-)。
作為一非限制性實例，AAV衣殼血清型可包括VP1 (Met+/AA1+)、VP1 (Met-/AA1-)或VP1 (Met+/AA1+)及VP1 (Met-/AA1-)之組合。AAV衣殼血清型亦可包括VP3 (Met+/AA1+)、VP3 (Met-/AA1-)或VP3 (Met+/AA1+)及VP3 (Met-/AA1-)之組合；且亦可包括VP2 (Met+/AA1)及VP2 (Met-/AA1-)之類似視情況存在之組合。 引入至細胞中
本發明之經編碼之siRNA分子(例如siRNA雙螺旋體)可藉由經AAV粒子之載體基因組編碼而引入至細胞中。此等AAV粒子經工程改造及最佳化以便於進入不可被轉染/轉導輕易修改之細胞。此外，一些合成病毒載體能夠將shRNA整合至細胞基因組中，從而引起穩定的siRNA表現並長期減弱目標基因之表現。以此方式，病毒載體經工程改造為用於特異性遞送，同時缺乏發現於野生型病毒中之有害複製及/或整合特徵的媒劑。
在某些實施例中，藉由用AAV粒子轉染、感染或轉導細胞而將經編碼之siRNA分子引入至細胞中，該AAV粒子包含當在細胞中轉錄時能夠產生siRNA分子之核酸序列。在某些實施例中，藉由將AAV粒子注射至細胞或組織中而將siRNA分子引入至細胞中，該AAV粒子包含當在細胞中轉錄時能夠產生siRNA分子之核酸序列。
在某些實施例中，在轉染/轉導之前，本發明之包含編碼siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可轉染至細胞中。
引入本文所描述之包含用於siRNA分子之核酸序列之AAV粒子的其他方法可包括如美國專利公開案第20120264807號中所描述之光化學內化；該公開案關於光化學內化之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，本文所描述之調配物可含有至少一種AAV粒子，其包含編碼本文所描述之siRNA分子的核酸序列。在某些實施例中，siRNA分子可靶向一個目標位點處之所關注之基因。在另一實施例中，調配物包含複數個AAV顆粒，各AAV顆粒包含編碼靶向不同目標位點處之所關注基因之siRNA分子的核酸序列。可靶向2、3、4、5個或超過5個位點處的所關注之基因。
在某些實施例中，可將來自任何相關物種之AAV粒子引入細胞中，相關物種諸如(但不限於)人類、豬、狗、小鼠、大鼠或猴。
在某些實施例中，經調配之AAV粒子可引入至與待治療之疾病相關的細胞或組織中。
在某些實施例中，經調配之AAV粒子可引入至具有高內源目標序列表現量的細胞中。
在另一實施例中，經調配之AAV粒子可引入至具有低內源目標序列表現量的細胞中。
在某些實施例中，細胞可為具有高AAV轉導效率之細胞。
在某些實施例中，本發明之包含編碼siRNA分子之核酸序列的經調配之AAV粒子可用於將siRNA分子遞送至中樞神經系統(例如美國專利第6,180,613號；其關於siRNA分子及AAV粒子之遞送及治療用途之內容以全文引用之方式併入本文中)。
在某些實施例中，本發明之包含編碼siRNA分子之核酸序列的經調配之AAV粒子可進一步包含經修飾之衣殼，其包括來自非病毒來源之肽。在其他態樣中，AAV粒子可含有CNS特異性嵌合衣殼以促進將經編碼之siRNA雙螺旋體遞送至大腦及脊髓中。舉例而言，可構築來自展現CNS向性之AAV變異體之帽核苷酸序列的比對以鑑別可變區(VR)序列及結構。
在某些實施例中，本發明之包含編碼siRNA分子之核酸序列的經調配之AAV粒子可編碼作為多順反子分子的siRNA分子。siRNA分子可在siRNA分子之區域之間另外包含一或多個連接子。
在某些實施例中，經調配之AAV粒子可包含編碼本文所描述之siRNA序列或雙螺旋體中之至少一者的調節聚核苷酸中之至少一者。
在某些實施例中，表現載體自ITR至ITR敍述之5'至3'可包含ITR、啟動子、內含子、調節聚核苷酸、polyA序列及ITR。
在某些實施例中，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於啟動子下游，啟動子諸如(但不限於)CMV、U6、H1、CBA或具有SV40內含子之CBA啟動子。此外，經編碼之siRNA分子在表現載體中亦可位於聚腺苷酸化序列之上游。作為一非限制性實例，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個核苷酸之內。作為另一非限制性實例，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游1至5、1至10、1至15、1至20、1至25、1至30、5至10、5至15、5至20、5至25、5至30、10至15、10至20、10至25、10至30、15至20、15至25、15至30、20至25、20至30或25至30個核苷酸之內。作為一個非限制性實例，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游的前1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%或超過25%之核苷酸內。作為另一非限制性實例，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游前1%至5%、1%至10%、1%至15%、1%至20%、1%至25%、5%至10%、5%至15%、5%至20%、5%至25%、10%至15%、10%至20%、10%至25%、15%至20%、15%至25%或20%至25%之內。
在某些實施例中，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於聚腺苷酸化序列上游。此外，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於啟動子之下游，啟動子諸如(但不限於)CMV、U6、CBA或具有SV40內含子之CBA啟動子。作為一非限制性實例，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個核苷酸之內。作為另一非限制性實例，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游1至5、1至10、1至15、1至20、1至25、1至30、5至10、5至15、5至20、5至25、5至30、10至15、10至20、10至25、10至30、15至20、15至25、15至30、20至25、20至30或25至30個核苷酸之內。作為一個非限制性實例，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游的前1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%或超過25%之核苷酸內。作為另一非限制性實例，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游前1%至5%、1%至10%、1%至15%、1%至20%、1%至25%、5%至10%、5%至15%、5%至20%、5%至25%、10%至15%、10%至20%、10%至25%、15%至20%、15%至25%或20%至25%之內。
在某些實施例中，經編碼之siRNA分子可位於scAAV中。
在某些實施例中，經編碼之siRNA分子可位於ssAAV中。
在某些實施例中，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於翻型ITR(flip ITR)之5'端附近。在另一實施例中，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於翻型ITR之3'端附近。在又一實施例中，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於轉型ITR(flop ITR)之5'端附近。在又一實施例中，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於轉型ITR之3'端附近。在某些實施例中，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於翻型ITR之5'端與轉型ITR之3'端之間。在某些實施例中，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於翻型ITR之3'端與轉型ITR之5'端之間(例如，翻型ITR之5'端與轉型ITR之3'端或轉型ITR之3'端與翻型ITR之5'端之間的中間位置)。作為一非限制性實例，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於ITR(例如，翻型或轉型ITR)之5'或3'端下游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個核苷酸之內。作為一非限制性實例，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於ITR(例如，翻型或轉型ITR)之5'或3'端上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個核苷酸之內。作為另一非限制性實例，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於ITR(例如翻型或轉型ITR)之5'端或3'端下游的1至5、1至10、1至15、1至20、1至25、1至30、5至10、5至15、5至20、5至25、5至30、10至15、10至20、10至25、10至30、15至20、15至25、15至30、20至25、20至30或25至30個核苷酸內。作為另一非限制性實例，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於ITR(例如，翻型或轉型ITR)之5'或3'端上游1至5、1至10、1至15、1至20、1至25、1至30、5至10、5至15、5至20、5至25、5至30、10至15、10至20、10至25、10至30、15至20、15至25、15至30、20至25、20至30或25至30之內。作為一非限制性實例，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於ITR(例如翻型或轉型ITR)之5'端或3'端上游的前1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%或超過25%之核苷酸內。作為另一非限制性實例，經編碼之siRNA分子在表現載體中可位於ITR(例如，翻型或轉型ITR)之5'或3'端下游前1%至5%、1%至10%、1%至15%、1%至20%、1%至25%、5%至10%、5%至15%、5%至20%、5%至25%、10%至15%、10%至20%、10%至25%、15%至20%、15%至25%或20%至25%之內。
在某些實施例中，本發明之包含用於siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可經調配用於CNS遞送。可使用穿過腦血障壁之試劑。舉例而言，可將siRNA分子靶向腦血障壁內皮之一些細胞穿透肽可用於調配靶向所關注之基因之siRNA雙螺旋體。
在某些實施例中，本發明之包含編碼siRNA分子之核酸序列的經調配之AAV粒子可直接投與至CNS。作為一非限制性實例，載體包含編碼靶向所關注之基因之siRNA分子的核酸序列。
在特定實施例中，本發明之包含編碼siRNA分子之核酸序列的經調配之AAV粒子之組合物可以便於載體或siRNA分子進入中樞神經系統及穿透至運動神經元中之方式投與。
在某些實施例中，經調配之AAV粒子可以對於siRNA雙螺旋體或dsRNA靶向脊髓及/或腦幹中之運動神經元及星形膠質細胞而言的治療有效量向個體投與(例如，經由鞘內投與向個體之CNS投與)。作為一非限制性實例，siRNA雙螺旋體或dsRNA可降低蛋白質或mRNA之表現。 II. AAV產生  通用病毒產生製程
用於產生rAAV粒子之病毒生產性細胞通常包括哺乳動物細胞類型。然而，對於大規模產生rAAV粒子，哺乳動物細胞呈現若干併發情況，包括每個複製細胞之病毒粒子的一般低產率以及由病毒生產性細胞中之其他哺乳動物生物材料所致之非所需污染的高風險。因此，昆蟲細胞已變為大規模產生rAAV粒子之替代媒劑。
使用昆蟲細胞之AAV產生系統亦呈現一系列併發情況。舉例而言，高產率地產生rAAV粒子通常需要Rep78相較於Rep52之較低表現。控制Rep78及Rep52於昆蟲細胞中之相對表現因此需要Rep操縱子內之小心設計的控制機制。此等控制機制可包括經個別工程改造之昆蟲細胞啟動子，諸如用於Rep78之ΔIE1啟動子及用於Rep52之PolH啟動子，或Rep編碼核苷酸序列至經獨立工程改造之序列或構築體上之分區。然而，實施此等控制機制通常導致降低之rAAV粒子產率或結構上不穩定之病毒粒子。
在另一實例中，產生rAAV粒子需要組裝形成AAV衣殼之VP1、VP2及VP3蛋白。高產率地產生rAAV粒子需要調節VP1、VP2及VP3之比率，其一般應分別為約1:1:10，但相對於10個VP3複本，VP1可在1至2之間變化且或VP2可在1至2之間變化。此比率對於衣殼之品質十分重要，因為過多VP1使衣殼不穩定，且過少VP1將降低病毒之感染性。
野生型AAV使用缺陷剪接方法來控制VP1表現；具有特殊周圍序列(「Kozak」序列)之弱起始密碼子(ACG)用於控制VP2；且標準起始密碼子(ATG)用於VP3表現。然而，在一些桿狀病毒系統中，哺乳動物剪接序列並非始終經識別且無法恰當地控制VP1、VP2及VP3之產生。因此，來自VP2之相鄰核苷酸及ACG起始序列可用於驅動衣殼蛋白產生。令人遺憾的是，對於大部分AAV血清型，此方法產生相較於VP2，VP1之比率較低(相對於10個VP3複本＜1)的衣殼。為了更有效地控制VP蛋白之產生，已使用非典型或起始密碼子，如TTG、GTG或CTG。然而，相對於野生型ATG或ACG起始密碼子，熟習此項技術者將此等起始密碼子視為次佳的(參見WO2007046703及WO2007148971，其關於AAV衣殼蛋白之產生之內容以全文引用之方式併入本文中)。
在另一實例中，使用桿狀病毒/Sf9系統產生rAAV粒子一般需要廣泛使用之基於桿粒的桿狀病毒表現載體系統(BEV)，其未針對大規模AAV產生進行最佳化。病毒蛋白於基於桿粒之BEV中之異常蛋白水解降解為出人意料的問題，妨礙了使用桿狀病毒/Sf9系統可靠地大規模產生AAV衣殼蛋白。
仍需要允許在哺乳動物及昆蟲細胞中有效且高效地大規模(商業)產生rAAV粒子的方法及系統。
本發明之一或多個實施例之細節闡述於以下隨附說明書中。本發明之其他特徵、目標及優勢將自實施方式、圖式及申請專利範圍顯而易見。在實施方式中，除非上下文另有明確規定，否則單數形式亦包括複數形式。除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。在與以引用的方式併入之揭示內容有衝突的情況下，將以本說明書為準。
在某些實施例中，本發明之構築體、聚核苷酸、多肽、載體、血清型、衣殼調配物或粒子可為以下國際公開案中之一者中所描述之任何序列、元件、構築體、系統、目標或製程，可包括該序列、元件、構築體、系統、目標或製程，可由該序列、元件、構築體、系統、目標或製程修改，可由該序列、元件、構築體、系統、目標或製程使用，可用於該序列、元件、構築體、系統、目標或製程，可與該序列、元件、構築體、系統、目標或製程一起使用或可由該序列、元件、構築體、系統、目標或製程產生：WO2016073693、WO2017023724、WO2018232055、WO2016077687、WO2016077689、WO2018204786、WO2017201258、WO2017201248、WO2018204803、WO2018204797、WO2017189959、WO2017189963、WO2017189964、WO2015191508、WO2016094783、WO20160137949、WO2017075335；其內容各自以全文引用之方式併入本文中，程度為其不與本發明衝突。
本發明之AAV產生包括用於產生AAV粒子及病毒載體之製程及方法，該等AAV粒子及病毒載體可與目標細胞接觸以遞送有效載荷，例如重組病毒構築體，其包括編碼有效載荷分子之核苷酸。在某些實施例中，病毒載體為腺相關病毒(AAV)載體，諸如重組腺相關病毒(rAAV)載體。在某些實施例中，AAV粒子為腺相關病毒(AAV)粒子，諸如重組腺相關病毒(rAAV)粒子。
本發明提供產生AAV粒子或病毒載體之方法，其藉由(a)使病毒生產性細胞與一或多種編碼至少一種嵌合衣殼蛋白之病毒表現構築體及一或多種有效載荷構築體載體接觸，其中該有效載荷構築體載體包括編碼選自由以下組成之群的有效載荷分子之有效載荷構築體：轉殖基因、聚核苷酸編碼蛋白及調節核酸；(b)在使得產生至少一種AAV粒子或病毒載體之條件下培養該病毒生產性細胞，及(c)分離該至少一種AAV粒子或病毒載體。
在此等方法中，病毒表現構築體可編碼至少一種結構蛋白及/或至少一種非結構蛋白。結構蛋白可包括原生或野生型衣殼蛋白VP1、VP2及/或VP3或嵌合蛋白中之任一者。非結構蛋白可包括原生或野生型Rep78、Rep68、Rep52及/或Rep40蛋白或嵌合蛋白中之任一者。
在某些實施例中，接觸經由瞬時轉染、病毒轉導及/或電穿孔發生。
在某些實施例中，病毒生產性細胞係選自由哺乳動物細胞及昆蟲細胞組成之群。在某些實施例中，昆蟲細胞包括草地黏蟲昆蟲細胞。在某些實施例中，昆蟲細胞包括Sf9昆蟲細胞。在某些實施例中，昆蟲細胞包括Sf21昆蟲細胞。
本發明之有效載荷構築體載體可包括至少一個反向末端重複序列(ITR)且可包括哺乳動物DNA。
亦提供根據本文中所描述之方法產生之AAV粒子及病毒載體。
本發明之AAV粒子可調配為具有一或多種可接受之賦形劑的醫藥組合物。
在某些實施例中，AAV粒子或病毒載體可由本文所描述之方法產生。
在某些實施例中，AAV粒子可由使病毒生產性細胞(例如昆蟲細胞或哺乳動物細胞)與至少一種編碼至少一種衣殼蛋白之病毒表現構築體及至少一種有效載荷構築體載體接觸產生。病毒生產性細胞可藉由瞬時轉染、病毒轉導及/或電穿孔接觸。有效載荷構築體載體可包括編碼有效載荷分子之有效載荷構築體，有效載荷分子諸如(但不限於)轉殖基因、聚核苷酸編碼蛋白及調節核酸。病毒生產性細胞可在使得產生、分離(例如使用溫度誘導之溶解、機械溶解及/或化學溶解)及/或純化(例如使用過濾、層析及/或免疫親和力純化)至少一種AAV粒子或病毒載體之條件下培養。作為一非限制性實例，有效載荷構築體載體可包括哺乳動物DNA。
在某些實施例中，使用本文所描述之方法在昆蟲細胞(例如草地黏蟲(Sf9)細胞)中產生AAV粒子。作為一非限制性實例，使用可包括桿狀病毒轉導之病毒轉導來接觸昆蟲細胞。
在另一實施例中，使用本文所描述之方法在哺乳動物細胞中產生AAV粒子。作為一非限制性實例，使用瞬時轉染來接觸哺乳動物細胞。
在某些實施例中，病毒表現構築體可編碼至少一種結構蛋白及至少一種非結構蛋白。作為一非限制性實例，結構蛋白包括VP1、VP2及/或VP3。作為另一非限制性實例，非結構蛋白包括Rep78、Rep68、Rep52及/或Rep40。
在某些實施例中，本文所描述之AAV粒子產生方法在病毒生產性細胞中產生大於101 、大於102 、大於103 、大於104 或大於105 個AAV粒子。
在某些實施例中，本發明之製程包括使用病毒產生系統在病毒生產性細胞中產生病毒粒子，該病毒產生系統包括至少一種病毒表現構築體及至少一種有效載荷構築體。至少一種病毒表現構築體及至少一種有效載荷構築體可共轉染(例如雙重轉染、三重轉染)至病毒生產性細胞中。使用熟習此項技術者已知且常規進行之標準分子生物學技術來完成轉染。病毒生產性細胞提供蛋白質表現所需之細胞機構及產生AAV粒子所需之其他生物材料，包括複製有效載荷構築體之Rep蛋白及組裝形成圍封複製之有效載荷構築體之衣殼的Cap蛋白。自病毒生產性細胞提取所得AAV粒子且加工成用於投與之醫藥製劑。
一旦投與，AAV粒子接觸目標細胞且在內體中進入細胞。AAV粒子自內體釋放且隨後接觸目標細胞之細胞核以遞送有效載荷構築體。例如重組病毒構築體之有效載荷構築體經遞送至目標細胞之細胞核，由有效載荷構築體編碼之有效載荷分子可表現於該目標細胞中。
在某些實施例中，用於產生病毒粒子之製程利用病毒生產性細胞之種菌培養物，其包括一或多種桿狀病毒(例如已經病毒表現構築體及有效載荷構築體載體轉染之桿狀病毒表現載體(BEV)或桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC))。在某些實施例中，收穫種菌培養物，將其分成等分試樣且冷凍，且可在稍後時間點使用以起始原生產生細胞群體之感染。
可利用生物反應器大規模產生AAV粒子。使用生物反應器允許精確量測及/或控制支援病毒生產性細胞之生長及活性的變數，諸如質量、溫度、混合條件(葉輪RPM或波振盪)、CO2 濃度、O2 濃度、氣體噴射速率及體積、氣體覆蓋速率及體積、pH、活細胞密度(VCD)、細胞活力、細胞直徑及/或光密度(OD)。在某些實施例中，生物反應器用於批量生產，其中整個培養物在以實驗方式測定之時間點收穫且AAV粒子經純化。在另一實施例中，生物反應器用於連續生產，其中一部分培養物在以實驗方式測定之時間點收穫用於AAV粒子純化，且生物反應器中之剩餘培養物用額外生長培養基組分再新。
AAV病毒粒子可在包括細胞溶解、澄清、滅菌及純化之過程中自病毒生產性細胞提取。細胞溶解包括破壞病毒生產性細胞之結構，從而釋放AAV粒子之任何過程。在某些實施例中，細胞溶解可包括熱衝擊、化學或機械溶解方法。澄清可包括總體純化溶解細胞、培養基組分及AAV粒子之混合物。在某些實施例中，澄清包括離心及/或過濾，包括(但不限於)深度末端、切向流及/或中空纖維過濾。
病毒產生之最終結果為包括兩種組分之AAV粒子之純化集合：(1)有效載荷構築體(例如重組病毒基因組構築體)及(2)病毒衣殼。
在某些實施例中，本發明之病毒產生系統或製程包括使用病毒生產性細胞(VPC)及質體構築體產生桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)的步驟。來自細胞庫(CB)之病毒生產性細胞(VPC)經解凍及擴增，得到目標工作體積及VPC濃度。將所得VPC集合體分成Rep/Cap VPC集合體及有效載荷VPC集合體。將一或多個Rep/Cap質體構築體(病毒表現構築體)加工成Rep/Cap桿粒聚核苷酸且轉染至Rep/Cap VPC集合體中。將一或多種有效載荷質體構築體(有效載荷構築體)加工成有效載荷桿粒聚核苷酸且轉染至有效載荷VPC集合體中。培育兩個VPC集合體，以產生P1 Rep/Cap桿狀病毒表現載體(BEV)及P1有效載荷BEV。將兩個BEV集合體擴增成空斑集合，其中選擇單一空斑用於純系空斑(CP)純化(亦稱作單一空斑擴增)。製程可包括單一CP純化步驟或可包括連續或由其他加工步驟分開之多個CP純化步驟。一或多個CP純化步驟提供CP Rep/Cap BEV集合體及CP有效載荷BEV集合體。此兩個BEV集合體隨後可經儲存及用於未來的產生步驟，或其隨後可轉染至VPC中，以產生Rep/Cap BIIC集合體及有效載荷BIIC集合體。
在某些實施例中，本發明之病毒產生系統或製程包括使用病毒生產性細胞(VPC)及桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)產生AAV粒子的步驟。來自細胞庫(CB)之病毒生產性細胞(VPC)經解凍及擴增，得到目標工作體積及VPC濃度。將工作體積之病毒生產性細胞接種至生產用生物反應器中，且可進一步擴增為具有用於BIIC感染之目標VPC濃度的200至2000 L工作體積。生產用生物反應器中之工作體積的VPC隨後以目標VPC:BIIC比及目標BIIC:BIIC比經Rep/Cap BIIC及有效載荷BIIC共感染。VCD感染亦可利用BEV。將共感染之VPC在生產用生物反應器中培育及擴增，以產生AAV粒子及VPC之批量收穫物。 病毒表現構築體
本發明之病毒產生系統包括一或多種病毒表現構築體，其可轉染/轉導至病毒生產性細胞中。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體或有效載荷構築體可為桿粒，亦稱為桿狀病毒質體或重組桿狀病毒基因組。在某些實施例中，病毒表現包括蛋白質編碼核苷酸序列及至少一個用於在病毒生產性細胞中表現之表現控制序列。在某些實施例中，病毒表現包括蛋白質編碼核苷酸序列，其可操作地連接於至少一個用於在病毒生產性細胞中表現之表現控制序列。在某些實施例中，病毒表現構築體含有在一或多個啟動子控制下之小病毒基因。小病毒基因可包括編碼非結構AAV複製蛋白之核苷酸序列，諸如編碼Rep52、Rep40、Rep68或Rep78蛋白之Rep基因。小病毒基因可包括編碼結構AAV蛋白之核苷酸序列，諸如編碼VP1、VP2及VP3蛋白之Cap基因。
在某些實施例中，病毒表現構築體可包括Rep52編碼區；Rep52編碼區為包括編碼Rep52蛋白之Rep52核苷酸序列的核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包括Rep78編碼區；Rep78編碼區為包括編碼Rep78蛋白之Rep78核苷酸序列的核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包括Rep40編碼區；Rep40編碼區為包括編碼Rep40蛋白之Rep40核苷酸序列的核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包括Rep68編碼區；Rep68編碼區為包括編碼Rep68蛋白之Rep68核苷酸序列的核苷酸序列。
在某些實施例中，病毒表現構築體可包括VP編碼區；VP編碼區為包括編碼VP1、VP2、VP3或其組合之VP核苷酸序列的核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包括VP1編碼區；VP1編碼區為包括編碼VP1蛋白之VP1核苷酸序列的核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包括VP2編碼區；VP2編碼區為包括編碼VP2蛋白之VP2核苷酸序列的核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包括VP3編碼區；VP3編碼區為包括編碼VP3蛋白之VP3核苷酸序列的核苷酸序列。
病毒表現構築體之結構VP蛋白VP1、VP2及VP3以及非結構蛋白Rep52及Rep78可在單一開放閱讀框架中經編碼，該單一開放閱讀框架藉由利用替代剪接受體及非典型轉譯起始密碼子來調控。Rep78及Rep52均可自單一轉錄物轉譯：Rep78轉譯起始於第一起始密碼子(AUG或非AUG)，且Rep52轉譯起始自Rep78序列內之Rep52起始密碼子(例如AUG)。Rep78及Rep52亦可自具有獨立起始密碼子之單獨轉錄物轉譯。Rep78序列內之Rep52起始密碼子可經突變、修飾或移除，使得經修飾之Rep78序列之加工將不產生Rep52蛋白。
VP1、VP2及VP3可自單一轉錄物轉錄及轉譯，其中框內及/或框外起始密碼子均經工程改造以控制由核苷酸轉錄物產生之VP1:VP2:VP3比。在某些實施例中，VP1可產生自僅編碼VP1之序列。如本文所用，術語「僅用於VP1」或「僅VP1」係指核苷酸序列或轉錄物編碼VP1衣殼蛋白且：(i)在VP1序列內缺乏自相同序列完全轉錄或轉譯VP2及VP3所需之起始密碼子(亦即缺失的或突變的)；(ii)在VP1序列內包括防止自相同序列轉錄或轉譯VP2及VP3的額外密碼子；或(iii)包括用於VP1之起始密碼子(例如ATG)，使得VP1為由核苷酸轉錄物產生之主要VP蛋白。
在某些實施例中，VP2可產生自僅編碼VP2之序列。如本文所用，術語「僅用於VP2」或「僅VP2」係指核苷酸序列或轉錄物編碼VP2衣殼蛋白且：(i)核苷酸轉錄物為僅編碼VP2及VP3衣殼蛋白之全VP衣殼序列之截短變異體；且(ii)其包括用於VP2之起始密碼子(例如ATG)，使得VP2為由核苷酸轉錄物產生之主要VP蛋白。
在某些實施例中，VP1及VP2可產生自僅編碼VP1及VP2之序列。如本文所用，術語「僅用於VP1及VP2」或「僅VP1及VP2」係指核苷酸序列或轉錄物編碼VP1及VP2衣殼蛋白且：(i)在VP序列內缺乏自相同序列完全轉錄或轉譯VP3所需之起始密碼子(亦即缺失的或突變的)；(ii)在VP序列內包括防止自相同序列轉錄或轉譯VP3的額外密碼子；(iii)包括用於VP1 (例如ATG)及VP2 (例如ATG)之起始密碼子，使得VP1及VP2為由核苷酸轉錄物產生之主要VP蛋白；或(iv)包括由諸如IRES區之連接子連接的僅VP1核苷酸轉錄物及僅VP2核苷酸轉錄物。
本發明之病毒產生系統不受用於將小病毒功能引入至病毒複製細胞中之病毒表現載體限制。病毒表現構築體於病毒複製細胞中之存在不必為永久的。病毒表現構築體可藉由任何已知方式引入，例如藉由細胞化學處理、電穿孔或感染。
本發明之病毒表現構築體可包括任何生物或化學化合物或調配物，其促進用核酸轉化、轉染或轉導細胞。例示性生物病毒表現構築體包括質體、線性核酸分子及重組病毒，包括桿狀病毒。例示性化學載體包括脂質複合物。病毒表現構築體用於將核酸序列併入至根據本發明之病毒複製細胞中。(O'Reilly, David R., Lois K. Miller及Verne A. Luckow. Baculovirus expression vectors: a laboratory manual. Oxford University Press, 1994.)；Maniatis等人編Molecular Cloning. CSH Laboratory, NY, N.Y. (1982)；及Philiport及Scluber編Liposoes as tools in Basic Research and Industry. CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)，其各自關於病毒表現構築體及其用途之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，病毒表現構築體為AAV表現構築體，其包括一或多個編碼非結構AAV複製蛋白、結構AAV衣殼蛋白或其組合之核苷酸序列。
在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可為質體載體。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可為桿狀病毒構築體。
本發明不受用於產生AAV粒子或病毒載體之病毒表現構築體的數目限制。在某些實施例中，一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個病毒表現構築體可用於在根據本發明之病毒生產性細胞中產生AAV粒子。在一個非限制性實例中，五個表現構築體可分別地編碼AAV VP1、AAV VP2、AAV VP3、Rep52、Rep78，且具有包含有效載荷聚核苷酸及至少一個AAV ITR之伴隨的有效載荷構築體。在另一實施例中，表現構築體可用於表現例如Rep52及Rep40，或Rep78及Rep 68。表現構築體可包括VP1、VP2、VP3、Rep52/Rep40及Rep78/Rep68編碼序列之任何組合。
在本發明之某些實施例中，病毒表現構築體可用於在昆蟲細胞中產生AAV粒子。在某些實施例中，可對衣殼及/或rep基因之野生型AAV序列進行修飾，例如以改良病毒粒子之屬性，諸如增加感染性或特異性，或提高產率。
在某些實施例中，病毒表現構築體可在蛋白質編碼核苷酸序列之間包括一或多個表現控制序列。在某些實施例中，表現控制區可包括IRES序列區，其包括編碼內部核糖體進入位點(IRES)之IRES核苷酸序列。內部核糖體進入位點(IRES)可選自由以下組成之群：來自口蹄疫病毒之FMDV-IRES、來自腦心肌炎病毒之EMCV-IRES以及其組合。
在某些實施例中，表現控制區可包括2A序列區，其包含編碼病毒2A肽之2A核苷酸序列。序列允許在單一開放閱讀框架(ORF)內共轉譯多個多肽。隨著ORF經轉譯，甘胺酸及脯胺酸殘基與2A序列防止形成正常肽鍵，其導致多肽鏈內之核糖體「跳過」及「自裂解」。病毒2A肽可選自由以下組成之群：來自口蹄疫病毒之F2A、來自明脈扁刺蛾(Thosea asigna) 病毒之T2A、來自馬A型鼻炎病毒之E2A、來自豬捷申病毒(teschovirus )-1之P2A、來自質型多角體病毒之BmCPV2A、來自家蠶軟化病(B. mori flacherie)病毒之BmIFV 2A以及其組合。
在某些實施例中，病毒表現構築體可含有包括起始密碼子區之核苷酸序列，諸如編碼包括一或多個起始密碼子區之AAV衣殼蛋白的序列。在某些實施例中，起始密碼子區可在表現控制序列內。起始密碼子可為ATG或非ATG密碼子(亦即，次佳起始密碼子，其中AAV VP1衣殼蛋白之起始密碼子為非ATG)。
在某些實施例中，用於AAV產生之病毒表現構築體可含有編碼AAV衣殼蛋白之核苷酸序列，其中AAV VP1衣殼蛋白之起始密碼子為非ATG，亦即次佳起始密碼子，其允許在產生系統中表現經修改比率之病毒衣殼蛋白，以提供改良之宿主細胞感染性。在一非限制性實例中，病毒構築體載體可含有核酸構築體，其包含編碼AAV VP1、VP2及VP3衣殼蛋白之核苷酸序列，其中用於轉譯AAV VP1衣殼蛋白之起始密碼子為CTG、TTG或GTG，如美國專利第US8,163,543號中所描述，該專利關於AAV衣殼蛋白及其產生之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可為質體載體或桿狀病毒構築體，其編碼小病毒Rep蛋白以表現於昆蟲細胞中。在某些實施例中，單一編碼序列用於Rep78及Rep52蛋白，其中用於轉譯Rep78蛋白之起始密碼子為選自由ACG、TTG、CTG及GTG組成之群的次佳起始密碼子，其在表現於昆蟲細胞中之後實現部分外顯子跳過，如內容以全文引用之方式併入本文中之美國專利第8,512,981號中所描述，例如以促使Rep78之表現相較於Rep52較不充分，此可歸因於其促進高載體產率。
在某些實施例中，病毒表現構築體可為用於在昆蟲細胞中表現之質體載體或桿狀病毒構築體，其含有具有差異性密碼子偏倚之重複密碼子，例如以獲得改良之Rep蛋白(例如Rep78及Rep52)比，從而改良在昆蟲細胞中大規模(商業)產生病毒表現構築體及/或有效載荷構築體載體，如美國專利第8,697,417號中所教示，該專利關於AAV複製蛋白及其產生之內容以全文引用之方式併入本文中。
在另一實施例中，改良之Rep蛋白比可使用美國專利第8,642,314號中所描述之方法及構築體達成，該專利關於AAV複製蛋白及其產生之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，病毒表現構築體可編碼突變型小病毒Rep多肽，該多肽與其對應野生型Rep多肽相比具有一或多種改良之特性，諸如製備較高病毒效價以供大規模生產。或者，其可能能夠允許產生品質更佳之病毒粒子或維持更穩定的病毒產生。在一非限制性實例中，病毒表現構築體可編碼具有突變之核定位序列或鋅指域之突變型Rep多肽，如專利申請案US 20130023034中所描述，該申請案關於AAV複製蛋白及其產生之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，病毒表現構築體可編碼具有併入之Gly-Ala重複區之小病毒衣殼的組分，該重複區可充當免疫侵入序列，如美國專利申請案20110171262中所描述，該申請案關於小病毒衣殼蛋白之內容以全文引用之方式併入本文中。
在本發明之某些實施例中，病毒表現構築體可用於在昆蟲細胞中產生AAV粒子。在某些實施例中，可對衣殼及/或rep基因之野生型AAV序列進行修飾，例如以改良病毒粒子之屬性，諸如增加感染性或特異性，或提高產率。
在某些實施例中，VP編碼區編碼特定AAV血清型之一或多種AAV衣殼蛋白。VP編碼區之AAV血清型可相同或不同。在某些實施例中，VP編碼區可經密碼子最佳化。在某些實施例中，VP編碼區或核苷酸序列可針對哺乳動物細胞經密碼子最佳化。在某些實施例中，VP編碼區或核苷酸序列可針對昆蟲細胞經密碼子最佳化。在某些實施例中，VP編碼區或核苷酸序列可針對草地黏蟲細胞經密碼子最佳化。在某些實施例中，VP編碼區或核苷酸序列可針對Sf9或Sf21細胞株經密碼子最佳化。
在某些實施例中，編碼一或多種VP衣殼蛋白之核苷酸序列可經密碼子最佳化以與參考核苷酸序列具有小於100%之核苷酸同源性。在某些實施例中，經密碼子最佳化之VP核苷酸序列與參考VP核苷酸序列之間的核苷酸同源性為小於100%、小於99%、小於98%、小於97%、小於96%、小於95%、小於94%、小於93%、小於92%、小於91%、小於90%、小於89%、小於88%、小於87%、小於86%、小於85%、小於84%、小於83%、小於82%、小於81%、小於80%、小於78%、小於76%、小於74%、小於72%、小於70%、小於68%、小於66%、小於64%、小於62%、小於60%、小於55%、小於50%及小於40%。
在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體或有效載荷構築體可為桿粒，亦稱為桿狀病毒質體或重組桿狀病毒基因組。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體或有效載荷構築體(例如桿粒)可包括聚核苷酸，其藉由熟習此項技術者已知及進行之標準分子生物學技術由同源重組(轉座子供體/受體系統)併入至桿粒中。
在某些實施例中，併入至桿粒中之聚核苷酸(亦即聚核苷酸插入物)可包括可操作地連接於蛋白質編碼核苷酸序列之表現控制序列。在某些實施例中，併入至桿粒中之聚核苷酸可包括表現控制序列，其包括啟動子，諸如p10或polH，且其可操作地連接於編碼結構AAV衣殼蛋白(例如VP1、VP2 VP3或其組合)之核苷酸序列。在某些實施例中，併入至桿粒中之聚核苷酸可包括表現控制序列，其包括啟動子，諸如p10或polH，且其可操作地連接於編碼非結構AAV衣殼蛋白(例如Rep78、Rep52或其組合)之核苷酸序列。
在某些實施例中，聚核苷酸插入物可在桿狀病毒基因的位置處併入至桿粒中。在某些實施例中，聚核苷酸插入物可在非必需桿狀病毒基因的位置處併入至桿粒中。在某些實施例中，聚核苷酸插入物可藉由用聚核苷酸插入物置換桿狀病毒基因或桿狀病毒基因之一部分而併入至桿粒中。在某些實施例中，聚核苷酸插入物可藉由用融合聚核苷酸置換桿狀病毒基因或桿狀病毒基因之一部分而併入至桿粒中，該融合聚核苷酸包括聚核苷酸插入物及置換之桿狀病毒基因(或其部分)。
在某些實施例中，聚核苷酸插入物可藉由用聚核苷酸插入物分裂桿狀病毒基因而併入至桿粒中(亦即聚核苷酸插入物係併入至基因中部，將基因之5'部分與桿粒基因之3'部分分離)。在某些實施例中，聚核苷酸插入物可藉由用融合聚核苷酸分裂桿狀病毒基因而併入至桿粒中，該融合聚核苷酸包括聚核苷酸插入物及分裂之桿狀病毒基因之部分。在某些實施例中，融合聚核苷酸之3'端包括分裂之基因的5'部分，使得融合聚核苷酸中之基因的5'部分及保留於桿粒中之基因的3'部分形成完整桿狀病毒基因或其功能部分。在某些實施例中，融合聚核苷酸之5'端包括分裂之基因的3'部分，使得融合聚核苷酸中之基因的3'部分及保留於桿粒中之基因的5'部分形成完整桿狀病毒基因或其功能部分。非限制性實例呈現於實例13及14中，其中融合聚核苷酸經工程改造及產生以包括來自gta基因ORF之組分(完全/部分Ac-lef12啟動子，完全/部分Ac-gta基因)。
在某些實施例中，聚核苷酸可在與桿狀病毒基因相關之限制性核酸內切酶(REN)裂解位點(亦即REN進入點)的位置處併入至桿粒中。在某些實施例中，桿粒中之REN進入點為FseI (與gta桿狀病毒基因對應)(ggccggcc)。在某些實施例中，桿粒中之REN進入點為SdaI (與DNA聚合酶桿狀病毒基因對應)(cctgcagg)。在某些實施例中，桿粒中之REN進入點為MauBI (與lef-4桿狀病毒基因對應)(cgcgcgcg)。在某些實施例中，桿粒中之REN進入點為SbfI (與gp64/gp67桿狀病毒基因對應)(cctgcagg)。在某些實施例中，桿粒中之REN進入點為I-CeuI (與v-cath桿狀病毒基因對應)(SEQ ID NO: 1)。在某些實施例中，桿粒中之REN進入點為AvrII (與egt桿狀病毒基因對應)(cctagg)。在某些實施例中，桿粒中之REN進入點為NheI (gctagc)。在某些實施例中，桿粒中之REN進入點為SpeI (actagt)。在某些實施例中，桿粒中之REN進入點為BstZ17I (gtatac)。在某些實施例中，桿粒中之REN進入點為NcoI (ccatgg)。在某些實施例中，桿粒中之REN進入點為MluI (acgcgt)。
在桿粒為雙股構築體之某些實施例中，REN裂解位點可在一個股中包括裂解序列，且在另一股中包括裂解序列之反向互補序列(其亦充當裂解序列)。聚核苷酸插入物(或其股)可因此包括REN裂解序列或反向互補REN裂解序列(其一般為功能上可互換的)。作為一非限制性實例，聚核苷酸插入物之股可包括FseI裂解序列(ggccggcc)或其反向互補REN裂解序列(ccggccgg)。
聚核苷酸可藉由以下各者併入至此等REN進入點中：(i)提供已經工程改造以包括目標REN裂解序列之聚核苷酸插入物(例如經工程改造以在聚核苷酸之兩端包括FseI REN序列之聚核苷酸插入物)；(ii)提供桿粒，其包括用於聚核苷酸插入物之目標REN進入點(例如AcMNPV桿粒bMON14272之變異體，其包括用適當REN酶消化經REN工程改造之聚核苷酸的FseI裂解位點(ii)(例如使用FseI酶消化在兩端包括FseI區之REN工程改造聚核苷酸，以產生聚核苷酸-FseI插入物)；(iii)用相同REN酶消化桿粒以在REN進入點產生單切桿粒(例如使用FseI酶在FseI位置處產生單切桿粒)；及(iv)使用適當接合酶，諸如T4接合酶將聚核苷酸插入物接合至單切桿粒中。結果為經工程改造之桿粒DNA，其在目標REN進入點包括經工程改造之聚核苷酸插入物。
可重複插入過程一或多次，以在不同REN進入點將其他經工程改造之聚核苷酸插入物併入至相同桿粒中(例如在egt中之AvrII REN進入點插入第一經工程改造聚核苷酸插入物，接著在cath基因中之I-CeuI REN進入點插入第二經工程改造聚核苷酸插入物，且接著在gta基因中之FseI REN進入點插入第三經工程改造聚核苷酸插入物)。
在某些實施例中，限制性核酸內切酶(REN)裂解可用於自桿粒移除一或多個野生型基因。在某些實施例中，限制性核酸內切酶(REN)裂解可用於移除先前已插入至桿粒中之一或多個經工程改造聚核苷酸插入物。在某些實施例中，限制性核酸內切酶(REN)裂解可用於用包括相同REN裂解序列之不同經工程改造聚核苷酸插入物替換一或多個經工程改造聚核苷酸插入物(例如FseI REN進入點處之經工程改造聚核苷酸插入物可經包括FseI REN裂解序列之不同經工程改造聚核苷酸插入物替換)。
在某些實施例中，可使用以下各者中教示之病毒表現構築體：美國專利第US 8,512,981號、第US 8,163,543號、第US 8,697,417號、第US 8,642,314號、美國專利公開案第US20130296532號、第US20110119777號、第US20110136227號、第US20110171262號、第US20130023034號、國際專利申請案第PCT/NL2008/050613號、第PCT/NL2009/050076號、第PCT/NL2009/050352號、第PCT/NL2011/050170號、第PCT/NL2012/050619號及美國專利申請案第14/149,953號，其各自之內容以全文引用之方式併入本文中，程度為其不與本發明衝突。
在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可來源於以下中所教示之病毒表現構築體：美國專利第US 6,468,524號、第US 6,984,517號、第US 7,479,554號、第US 6,855,314號、第US 7,271,002號、第US 6,723,551、美國專利公開案第20140107186號、美國專利申請案第US 09/717,789號、第US 11/936,394號、第US 14/004,379號、歐洲專利申請案EP1082413、EP2500434、EP 2683829、EP1572893以及國際專利申請案PCT/US99/11958、PCT/US01/09123、PCT/EP2012/054303及PCT/US2002/035829，其各自之內容以全文引用之方式併入本文中，程度為其不與本發明衝突。
在某些實施例中，病毒表現構築體可包括來自猿猴物種之序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可含有來自以下之包括(但不限於)衣殼及rep序列的序列：國際專利申請案PCT/US1997/015694、PCT/US2000/033256、PCT/US2002/019735、PCT/US2002/033645、PCT/US2008/013067、PCT/US2008/013066、PCT/US2008/013065、PCT/US2009/062548、PCT/US2009/001344、PCT/US2010/036332、PCT/US2011/061632、PCT/US2013/041565、美國申請案第US13/475535號、第US13/896722號、第US10/739096號、第US14/073979號、美國專利公開案第US20010049144號、第US20120093853號、第US20090215871號、第US20040136963號、第US20080219954號、第US20040171807號、第US20120093778號、第US20080090281號、第US20050069866號、第US20100260799號、第US20100247490號、第US20140044680號、第US20100254947號、第US20110223135號、第US20130309205號、第US20120189582號、第US20130004461號、第US20130315871號、美國專利第US6083716號、第US7838277號、第US7344872號、第US8603459號、第US8105574號、第US7247472號、第US8231880號、第US8524219號、第US8470310號、歐洲專利申請案第EP2301582號、第EP2286841號、第EP1944043號、第EP1453543號、第EP1409748號、第EP2463362號、第EP2220217號、第EP2220241號、第EP2220242號、第EP2350269號、第EP2250255號、第EP2435559號、第EP2643465號、第EP1409748號、第EP2325298號、第EP1240345號，其各自之內容以全文引用之方式併入本文中，程度為其不與本發明衝突。
在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可包括來自以下中所描述之一或多種病毒構築體之一或多個核苷酸序列：國際申請案第PCT/US2002/025096號、第PCT/US2002/033629號、第PCT/US2003/012405號、美國申請案第US10/291583號、第US10/420284號、第US 7,319,002號、美國專利公開案第US20040191762號、第US20130045186號、第US20110263027號、第US20110151434號、第US20030138772號、第US20030207259號、歐洲申請案第EP2338900號、第EP1456419號、第EP1310571號、第EP1359217號、第EP1427835號、第EP2338900號、第EP1456419號、第EP1310571號、第EP1359217號以及美國專利第US 7,235,393號及第US 8,524,446號，程度為其不與本發明衝突。
在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可包括以下中所描述之序列或組合物：國際專利申請案第PCT/US1999/025694號、第PCT/US1999/010096號、第PCT/US2001/013000號、第PCT/US2002/25976號、第PCT/US2002/033631號、第PCT/US2002/033630號、第PCT/US2009/041606號、第PCT/US2012/025550號、美國專利第US8637255號、第US8637255號、第US7186552號、第US7105345號、第US6759237號、第US7056502號、第US7198951號、第US8318480號、第US7790449號、第US7282199號、美國專利公開案第US20130059289號、第US20040057933號、第US20040057932號、第US20100278791號、第US20080050345號、第US20080050343號、第US20080008684號、第US20060204479號、第US20040057931號、第US20040052764號、第US20030013189號、第US20090227030號、第US20080075740號、第US20080075737號、第US20030228282號、第US20130323226號、第US20050014262號、美國專利申請案第US14/136331號、第US09/076369號、第US10/738609號、歐洲申請案第EP2573170號、第EP1127150號、第EP2341068號、第EP1845163號、第EP1127150號、第EP1078096號、第EP1285078號、第EP1463805號、第EP2010178940號、第US20140004143號、第EP2359869號、第EP1453547號、第EP2341068號及第EP2675902號，其各自之內容以全文引用之方式併入本文中，程度為其不與本發明衝突。
在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可包括來自以下中所描述之核苷酸序列中之一或多者的一或多個核苷酸序列：美國專利第US7186552號、第US7105345號、第US6759237號、第US7056502號、第US7198951號、第US8318480號、第US7790449號、第US7282199號、美國專利公開案第US20130059289號、第US20040057933號、第US20040057932號、第US20100278791號、第US20080050345號、第US20080050343號、第US20080008684號、第US20060204479號、第US20040057931號、第US20140004143號、第US20090227030號、第US20080075740號、第US20080075737號、第US20030228282號、第US20040052764號、第US20030013189號、第US20050014262號、第US20130323226號、美國專利申請案第US14/136331號、第US10/738609號、歐洲專利申請案第EP1127150號、第EP2341068號、第EP1845163號、第EP1127150號、第EP1078096號、第EP1285078號、第EP2573170號、第EP1463805號、第EP2675902號、第EP2359869號、第EP1453547號、第EP2341068號，其各自之內容以全文引用之方式併入本文中，程度為其不與本發明衝突。
在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可包括如以下中所描述的經修飾之AAV之構築：國際專利申請案第PCT/US1995/014018號、第PCT/US2000/026449號、第PCT/US2004/028817號、第PCT/US2006/013375號、第PCT/US2007/010056號、第PCT/US2010/032158號、第PCT/US2010/050135號、第PCT/US2011/033596號、美國專利申請案第12/473917號、第US08/331384號、第US09/670277號、美國專利第US5871982號、第US5856152號、第US6251677號、第US6387368號、第US6399385號、第US7906111號、歐洲專利申請案第EP2000103600號、歐洲專利公開案第EP797678號、第EP1046711號、第EP1668143號、第EP2359866號、第EP2359865號、第EP2357010號、第EP1046711號、第EP1218035號、第EP2345731號、第EP2298926號、第EP2292780號、第EP2292779號、第EP1668143號、第US20090197338號、第EP2383346號、第EP2359867號、第EP2359866號、第EP2359865號、第EP2357010號、第EP1866422號、第US20090317417號、第EP2016174號、美國專利公開案第US20110236353號、第US20070036760號、第US20100186103號、第US20120137379號及第US20130281516號，其各自之內容以全文引用之方式併入本文中，程度為其不與本發明衝突。
在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可包括以下中所描述之一或多個構築體：國際申請案第PCT/US1999/004367號、第PCT/US2004/010965號、第PCT/US2005/014556號、第PCT/US2006/009699號、第PCT/US2010/032943號、第PCT/US2011/033628號、第PCT/US2011/033616號、第PCT/US2012/034355號、美國專利第US8394386號、第EP1742668號、美國專利公開案第US20080241189號、第US20120046349號、第US20130195801號、第US20140031418號、第EP2425000號、第US20130101558號、第EP1742668號、第EP2561075號、第EP2561073號、第EP2699688號，其各自之內容以全文引用之方式併入本文中，程度為其不與本發明衝突。 表現控制表現控制區
本發明之病毒表現構築體可包括由表現控制序列編碼之一或多個表現控制區。在某些實施例中，表現控制序列係用於表現於病毒生產性細胞，諸如昆蟲細胞中。在某些實施例中，表現控制序列可操作地連接於蛋白質編碼核苷酸序列。在某些實施例中，表現控制序列可操作地連接於VP編碼核苷酸序列或Rep編碼核苷酸序列。
本文中，術語「編碼核苷酸序列」、「蛋白質編碼基因」或「蛋白質編碼核苷酸序列」係指編碼或轉譯成蛋白質產物，諸如VP蛋白或Rep蛋白之核苷酸序列。「可操作地連接」意謂表現控制序列相對於編碼序列定位，使其可促進經編碼之基因產物的表現。
「表現控制序列」係指調控其可操作地連接之核苷酸序列之表現的核酸序列。當表現控制序列控制及調控核苷酸序列之轉錄及/或轉譯時，表現控制序列「可操作地連接」於核苷酸序列。因此，表現控制序列可包括啟動子、增強子、非轉譯區(UTR)、內部核糖體進入位點(IRES)、轉錄終止子、在蛋白質編碼基因前面的起始密碼子、用於內含子的剪接信號及終止密碼子。在最低限度下，術語「表現控制序列」意欲包括其存在經設計以影響表現之序列，且亦可包括其他有利組分。舉例而言，前導序列及融合搭配物序列為表現控制序列。該術語亦可包括設計核酸序列，使得自序列移除框內及框外之非所需、潛在起始密碼子。其亦可包括設計核酸序列，使得移除非所需潛在剪接位點。其包括序列或聚腺苷酸化序列(pA)，該等序列導引polyA尾添加，polyA尾亦即mRNA之3'端處的一串腺嘌呤殘基，序列稱為polyA序列。其亦可經設計以增強mRNA穩定性。在昆蟲細胞中已知影響轉錄及轉譯穩定性之表現控制序列，例如啟動子，以及影響轉譯之序列，例如Kozak序列。表現控制序列可具有如下性質：調節其可操作地連接之核苷酸序列，以達成更低表現量或更高表現量。
在某些實施例中，表現控制序列可包括一或多個啟動子。啟動子可包括(但不限於)桿狀病毒主要晚期啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、核基因啟動子、來自包括病毒及非病毒元件之一或多個物種的嵌合啟動子及/或合成啟動子。在某些實施例中，啟動子可為Ctx、Op-EI、EI、ΔEI、EI-1、pH、PIO、polH (多面體)、ΔpolH、Dmhsp70、Hr1、Hsp70、4xHsp27 EcRE+最小Hsp70、IE、IE-1、ΔIE-1、ΔIE、p10、Δp10 (p10之經修飾之變異體或衍生物)、p5、p19、p35、p40、p6.9及其變異體或衍生物。在某些實施例中，啟動子為Ctx啟動子。在某些實施例中，啟動子為p10啟動子。在某些實施例中，啟動子為polH啟動子。在某些實施例中，啟動子可選自組織特異性啟動子、細胞類型特異性啟動子、細胞週期特異性啟動子及其變異體或衍生物。在某些實施例中，啟動子可為CMV啟動子、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)啟動子、甲狀腺激素結合球蛋白啟動子、甲狀腺素結合球蛋白(LPS)啟動子、HCR-ApoCII雜合啟動子、HCR-hAAT雜合啟動子、白蛋白啟動子、脂蛋白元E啟動子、α1-AT+EaIb啟動子、腫瘤選擇性E2F啟動子、單核血液IL-2啟動子及其變異體或衍生物。在某些實施例中，啟動子為低表現啟動子序列。在某些實施例中，啟動子為表現增強之啟動子序列。在某些實施例中，啟動子可包括如美國專利申請案20110136227中所描述之Rep或Cap啟動子，該申請案關於表現啟動子之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，病毒表現構築體可在所有核苷酸序列中包括相同啟動子。在某些實施例中，病毒表現構築體可在兩個或更多個核苷酸序列中包括相同啟動子。在某些實施例中，病毒表現構築體可在兩個或更多個核苷酸序列中包括不同啟動子。在某些實施例中，病毒表現構築體可在所有核苷酸序列中包括不同啟動子。
在某些實施例中，病毒表現構築體編碼元件以改良於某些細胞類型中之表現。在另一實施例中，表現構築體可包括polh及/或ΔIE-1昆蟲轉錄啟動子、CMV哺乳動物轉錄啟動子及/或p10昆蟲特異性啟動子，以在哺乳動物或昆蟲細胞中表現所需基因。
超過一個表現控制序列能夠可操作地連接於給定核苷酸序列。舉例而言，啟動子序列、轉譯起始序列及終止密碼子能夠可操作地連接於核苷酸序列。
在某些實施例中，病毒表現構築體可含有包括起始密碼子區之核苷酸序列，諸如編碼包括一或多個起始密碼子區之AAV衣殼蛋白的序列。在某些實施例中，起始密碼子區可在表現控制序列內。
真核mRNA之轉譯起始位點部分地由稱作Kozak序列之核苷酸序列控制，如Kozak, MCell. 1986 年 1 月 31 日 ;44(2):283-92 及Kozak, M. J Cell Biol. 1989年2月;108(2):229-41中所描述，該等文獻各自關於Kozak序列及其用途之內容以全文引用之方式併入本文中。Kozak形式之天然存在之及合成之轉譯起始位點均可用於藉由分子遺傳技術產生多肽，Kozak, M.Mamm Genome. 1996 年 8 月 ;7(8):563-74 ，其關於Kozak序列及其用途之內容以全文引用之方式併入本文中。剪接位點為mRNA上之序列，其促進在轉錄(形成)mRNA之後移除部分mRNA序列。通常，剪接在mRNA轉運至細胞之細胞質中之前發生於細胞核中。
本發明之方法不受使用特定表現控制序列限制。然而，當達成VP產物之某一化學計量(分別對於VP1、VP2及VP3，接近1:1:10)時，以及當Rep52或Rep40 (亦稱作p19 Rep)之量顯著高於Rep78或Rep68 (亦稱作p5 Rep)時，可獲得產生細胞(諸如昆蟲細胞)中改良之AAV產率。在某些實施例中，p5/p19比低於0.6、低於0.4或低於0.3，但始終為至少0.03。此等比可在蛋白質層面上量測或可與特定mRNA之相對含量有關。
在某些實施例中，AAV粒子產生於病毒生產性細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白均以接近、約或為1:1:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子產生於病毒生產性細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白均以接近、約或為2:2:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子產生於病毒生產性細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白均以接近、約或為2:0:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子產生於病毒生產性細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白均以接近、約或為1至2:0至2:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子產生於病毒生產性細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白均以接近、約或為1至2:1至2:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子產生於病毒生產性細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白均以接近、約或為2至3:0至3:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子產生於病毒生產性細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白均以接近、約或為2至3:2至3:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子產生於病毒生產性細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白均以接近、約或為3:3:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子產生於病毒生產性細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白均以接近、約或為3至5:0至5:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子產生於病毒生產性細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白均以接近、約或為3至5:3至5:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，表現控制區經工程改造以產生選自由以下組成之群的VP1:VP2:VP3比：約或恰好1:0:10；約或恰好1:1:10；約或恰好2:1:10；約或恰好2:1:10；約或恰好2:2:10；約或恰好3:0:10；約或恰好3:1:10；約或恰好3:2:10；約或恰好3:3:10；約或恰好4:0:10；約或恰好4:1:10；約或恰好4:2:10；約或恰好4:3:10；約或恰好4:4:10；約或恰好5:5:10；約或恰好1至2:0至2:10；約或恰好1至2:1至2:10；約或恰好1至3:0至3:10；約或恰好1至3:1至3:10；約或恰好1至4:0至4:10；約或恰好1至4:1至4:10；約或恰好1至5:1至5:10；約或恰好2至3:0至3:10；約或恰好2至3:2至3:10；約或恰好2至4:2至4:10；約或恰好2至5:2至5:10；約或恰好3至4:3至4:10；約或恰好3至5:3至5:10；及約或恰好4至5:4至5:10。
在本發明之某些實施例中，Rep52或Rep78係轉錄自桿狀病毒源性多面體啟動子(polh)。Rep52或Rep78亦可轉錄自較弱啟動子，例如IE-1啟動子之缺失突變體ΔIE-1啟動子的轉錄活性為IE-1啟動子的約20%。可使用實質上與ΔIE-1啟動子同源之啟動子。相對於啟動子，將至少50%、60%、70%、80%、90%或更大的同源性視為實質上同源之啟動子。 病毒生產性細胞及載體哺乳動物細胞
本文揭示之本發明的病毒產生描述產生AAV粒子或病毒載體之製程及方法，該AAV粒子或病毒載體接觸目標細胞以遞送有效載荷構築體，例如重組AAV粒子或病毒構築體，其包括編碼有效載荷分子之核苷酸。病毒生產性細胞可選自任何生物體，包括原核(例如細菌)細胞，及真核細胞，包括昆蟲細胞、酵母細胞及哺乳動物細胞。
在某些實施例中，本發明之AAV粒子可在包括哺乳動物細胞之病毒生產性細胞中產生。病毒生產性細胞可包含哺乳動物細胞，諸如衍生自哺乳動物之A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、HEK293、HEK293T (293T)、Saos、C2C12、L細胞、HT1080、HepG2及原代纖維母細胞、肝細胞及肌母細胞。病毒生產性細胞可包括衍生自哺乳動物物種，包括(但不限於)人類、猴、小鼠、大鼠、兔及倉鼠之細胞，或細胞類型，包括(但不限於)纖維母細胞、肝細胞、腫瘤細胞、細胞株轉化細胞等。
通常用於產生重組AAV粒子之AAV病毒生產性細胞包括但不限於如以下中所描述之HEK293細胞、COS細胞、C127、3T3、CHO、HeLa細胞、KB細胞、BHK及其他哺乳動物細胞株：美國專利第6,156,303號、第5,387,484號、第5,741,683號、第5,691,176號、第6,428,988號及第5,688,676號；美國專利申請案2002/0081721及國際專利公開案第WO 00/47757號、第WO 00/24916號及第WO 96/17947號，其各自之內容以全文引用的方式併入本文中，程度為其不與本發明衝突。在某些實施例中，AAV病毒生產性細胞為反式互補封裝細胞株，其提供複製缺陷型輔助病毒缺失之功能，例如HEK293細胞或其他Ea反式互補細胞。
在某些實施例中，封裝細胞株293-10-3 (ATCC寄存編號PTA-2361)可用於產生AAV粒子，如美國專利第US6,281,010號中所描述，其關於293-10-3封裝細胞株及其用途之內容以全文引用之方式併入本文中。
在本發明之某些實施例中，用於反式互補E1缺失之腺病毒載體的細胞株，諸如HeLA細胞株可用於AAV粒子產生，該等腺病毒載體在磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子控制下編碼腺病毒E1a及腺病毒E1b，如美國專利第6365394號中所描述，其關於HeLA細胞株及其用途之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，AAV粒子使用三重轉染方法在哺乳動物細胞中產生，其中有效載荷構築體、小病毒Rep及小病毒Cap以及輔助構築體包含於三種不同構築體內。AAV粒子產生之三種組分之三重轉染方法可用於產生小批量病毒以用於包括轉導效率、目標組織(向性)評估及穩定性之分析。
待調配之AAV粒子可由三重轉染或桿狀病毒介導之病毒產生或此項技術中已知的任何其他方法產生。可採用此項技術中已知的任何適合之容許或封裝細胞來產生載體。在某些實施例中，使用提供自複製缺陷型輔助病毒缺失之功能的反式互補封裝細胞株，例如293細胞或其他E1a反式互補細胞。
基因卡匣可含有小病毒(例如AAV) cap及rep基因中之一些或全部。在某些實施例中，藉由將編碼衣殼及/或Rep蛋白之封裝載體引入至細胞中來以反式形式提供cap及rep功能中之一些或全部。在某些實施例中，基因卡匣不編碼衣殼或Rep蛋白。或者，使用經穩定轉化以表現cap及/或rep基因之封裝細胞株。
在某些實施例中，重組AAV病毒粒子係根據如US2016/0032254中所描述之程序自培養上清液產生及純化，該專利關於產生及加工重組AAV病毒粒子之內容以全文引用的方式併入本文中。產生亦可涉及此項技術中已知之方法，包括使用293T細胞之方法、三重轉染或任何適合之產生方法。
在某些實施例中，哺乳動物病毒生產性細胞(例如293T細胞)可呈黏著/黏附狀態(例如與磷酸鈣)或懸浮狀態(例如與聚乙二亞胺(PEI))。哺乳動物病毒生產性細胞經產生AAV所需之質體(亦即，AAV rep/cap構築體、腺病毒輔助構築體及/或ITR側接有效載荷構築體)轉染。在某些實施例中，轉染過程可包括視情況存在之培養基更換(例如對於呈黏著形式之細胞更換培養基、對於呈懸浮形式之細胞不更換培養基、對於呈懸浮形式之細胞在必要時更換培養基)。在某些實施例中，轉染過程可包括轉染培養基，諸如DMEM或F17。在某些實施例中，轉染培養基可包括血清或可為無血清的(例如與磷酸鈣及血清呈黏著狀態之細胞、與PEI呈懸浮狀態且無血清之細胞)。
細胞可隨後藉由刮擦(黏附形式)及/或粒化(懸浮形式及刮擦之黏附形式)收集且轉移至容器中。可視需要重複收集步驟以完全收集產生之細胞。接下來，可藉由連續凍融循環(-80℃至37℃)、化學溶解(諸如添加清潔劑曲拉通(triton))、機械溶解或藉由使細胞培養物在達到約0%活力之後降解來達成細胞溶解。藉由離心及/或深度過濾移除細胞碎屑。藉由DNA qPCR藉由抗DNA酶基因組滴定針對AAV粒子對樣本進行定量。
根據基因組複本數(每毫升基因組粒子數)量測AAV粒子效價。如先前報導，基因組粒子濃度係基於載體DNA之DNA qPCR (Clark等人 (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039；Veldwijk等人 (2002) Mol. Ther., 6:272-278，其關於粒子濃度量測之內容各自以全文引用的方式併入)。昆蟲細胞
本發明之病毒產生包括用於產生AAV粒子或病毒載體之製程及方法，該等AAV粒子或病毒載體接觸目標細胞以遞送有效載荷構築體，例如重組病毒構築體，其包括編碼有效載荷分子之核苷酸。在某些實施例中，本發明之AAV粒子或病毒載體可在包括昆蟲細胞之病毒生產性細胞中產生。
培養物中之昆蟲細胞之生長條件及在培養物中之昆蟲細胞中產生異源產物為此項技術中熟知的，參見美國專利第6,204,059號，其關於在病毒產生中生長及使用昆蟲細胞之內容以全文引用之方式併入本文中。
可根據本發明使用允許小病毒之複製且可維持於培養物中之任何昆蟲細胞。通常用於產生重組AAV粒子之AAV病毒生產性細胞包括但不限於草地黏蟲，包括(但不限於)Sf9或Sf21細胞株；果蠅細胞株；或蚊子細胞株，諸如白紋伊蚊(Aedes albopictus )源性細胞株。昆蟲細胞用於表現異源蛋白質的用途已有據可查，將核酸(諸如載體，例如昆蟲細胞相容載體)引入至此類細胞中之方法及將此類細胞維持於培養物中之方法亦有據可查。參見例如Methods in Molecular Biology, Richard編, Humana Press, NJ (1995)；O'Reilly等人, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994)；Samulski等人, J. Vir.63:3822-8 (1989)；Kajigaya等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991)；Ruffing等人, J. Vir. 66:6922-30 (1992)；Kimbauer等人,Vir.219:37-44 (1996)；Zhao等人, Vir.272:382-93 (2000)；及Samulski等人, 美國專利第6,204,059號，其各自關於在病毒產生中使用昆蟲細胞之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中，使用WO2015/191508中所描述之方法製得AAV粒子，該專利案之內容以全文引用之方式併入本文中，其引用程度不與本發明衝突。
在某些實施例中，可使用昆蟲宿主細胞系統與桿狀病毒系統之組合(例如如Luckow等人, Bio/Technology 6: 47 (1988)所描述)。在某些實施例中，製備嵌合肽之表現系統為粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)，Tn 5B1-4昆蟲細胞/桿狀病毒系統，其可用於高度表現蛋白質，如美國專利第6660521號中所描述，其中關於病毒粒子產生之內容以全文引用之方式併入本文中。
昆蟲細胞之擴增、培養、轉染、感染及儲存可在此項技術中已知之任何細胞培養基、細胞轉染培養基或儲存培養基中進行，該等培養基包括Hyclone SFX Insect細胞培養基、Expression System ESF AF昆蟲細胞培養基、ThermoFisher Sf900II培養基、ThermoFisher Sf900III培養基或ThermoFisher Grace's昆蟲培養基。本發明之昆蟲細胞混合物亦可包括本發明中所描述之調配物添加劑或元素中之任一者，包括(但不限於)鹽、酸、鹼、緩衝劑、界面活性劑(諸如Poloxamer 188/Pluronic F-68)及其他已知培養基元素。調配物添加劑可逐漸添加或「掺加」(在短時間內加入大量體積)。桿狀病毒產生系統
在某些實施例中，本發明之方法可包括使用病毒表現構築體及有效載荷構築體載體在桿狀病毒系統中產生AAV粒子或病毒載體。在某些實施例中，桿狀病毒系統包括桿狀病毒表現載體(BEV)及/或桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體或有效載荷構築體可為桿粒，亦稱為桿狀病毒質體或重組桿狀病毒基因組。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體或有效載荷構築體可為聚核苷酸，其藉由熟習此項技術者已知及進行之標準分子生物學技術，由同源重組(轉座子供體/受體系統)併入至桿粒中。轉染獨立病毒複製細胞群體，產生兩組或更多組(例如兩組、三組)桿狀病毒(BEV)，其中一或多組可包括病毒表現構築體(表現BEV)，且其中一或多組可包括有效載荷構築體(有效載荷BEV)。桿狀病毒可用於感染病毒生產性細胞，以產生AAV粒子或病毒載體。
在某些實施例中，製程包括轉染單一病毒複製細胞群體以產生單一桿狀病毒(BEV)組，其包括病毒表現構築體及有效載荷構築體二者。此等桿狀病毒可用於感染病毒生產性細胞，以產生AAV粒子或病毒載體。
在某些實施例中，使用桿粒轉染劑，諸如Promega FuGENE HD、WFI水或ThermoFisher Cellfectin II試劑來產生BEV。在某些實施例中，在諸如昆蟲細胞之病毒生產性細胞中產生及擴增BEV。
在某些實施例中，方法利用包括一或多種BEV，包括桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)的病毒生產性細胞之種菌培養物。種菌BIIC已經包括病毒表現構築體之表現BEV以及包括有效載荷構築體之有效載荷BEV轉染/轉導/感染。在某些實施例中，收穫種菌培養物，將其分成等分試樣且冷凍，且可在稍後使用以起始原生產生細胞群體之轉染/轉導/感染。在某些實施例中，將一組種菌BIIC儲存於-80℃下或LN2 蒸氣中。
桿狀病毒由若干必需蛋白質製成，該等必需蛋白質對於桿狀病毒之功能及複製為必需的，諸如複製蛋白、包膜蛋白及衣殼蛋白。桿狀病毒基因組因此包括編碼必需蛋白質之若干必需基因核苷酸序列。作為一非限制性實例，基因組可包括必需基因區，其包括編碼用於桿狀病毒構築體之必需蛋白質的必需基因核苷酸序列。必需蛋白質可包括：GP64桿狀病毒包膜蛋白、VP39桿狀病毒衣殼蛋白或用於桿狀病毒構築體之其他類似的必需蛋白質。
用於在包括但不限於草地黏蟲(Sf9)細胞之昆蟲細胞中產生AAV粒子之桿狀病毒表現載體(BEV)提供高效價之病毒載體產物。編碼病毒表現構築體及有效載荷構築體之重組桿狀病毒起始病毒載體複製細胞之產毒性感染(productive infection)。自原發性感染釋放之感染性桿狀病毒粒子繼發性感染培養物中之其他細胞，在作為初始感染倍率之函數的感染循環數中指數性感染整個細胞培養物群體，參見Urabe, M.等人 J Virol. 2006年2月;80(4):1874-85，其關於產生及使用BEV及病毒粒子之內容以全文引用之方式併入本文中。
在昆蟲細胞系統中產生具有桿狀病毒之AAV粒子可解決已知桿狀病毒遺傳及物理不穩定性。
在某些實施例中，藉由利用無效價感染細胞保藏及按比例擴大系統，本發明之產生系統在多個繼代內解決桿狀病毒不穩定性。病毒生產性細胞之小規模種菌培養物經編碼AAV粒子之結構及/或非結構組分的病毒表現構築體轉染。將桿狀病毒感染之病毒生產性細胞收穫為可在液氮中低溫保藏之等分試樣；等分試樣保留感染大規模病毒生產性細胞培養物之活力及感染性，Wasilko DJ等人 Protein Expr Purif. 2009年6月;65(2):122-32，其關於產生及使用BEV及病毒粒子之內容以全文引用之方式併入本文中
遺傳穩定之桿狀病毒可用於產生用以在無脊椎細胞中產生AAV粒子之組分中的一或多者之來源。在某些實施例中，缺陷性桿狀病毒表現載體可游離地維持在昆蟲細胞中。在此類實施例中，對應桿粒用複製控制元件，包括(但不限於)啟動子、強化子及/或細胞週期經調控之複製元件來工程改造。
在某些實施例中，桿狀病毒可用標記物經工程改造以用於重組至殼質酶/組織蛋白酶基因座中。chia/v-cath基因座對於在組織培養物中繁殖桿狀病毒為非必需的，且V-cath (EC 3.4.22.50)係對含有受質之Arg-Arg二肽活性最強之半胱胺酸內切蛋白酶。Arg-Arg二肽存在於濃核病毒及小病毒衣殼結構蛋白中但偶爾出現於依賴病毒VP1中。
在某些實施例中，容許桿狀病毒感染的穩定病毒生產性細胞用AAV複製及載體產生所需之元件中之任一者的至少一個穩定整合複本經工程改造，該至少一個複本包括(但不限於)完整AAV基因組、Rep及Cap基因、Rep基因、Cap基因、呈單獨轉錄卡匣形式之各Rep蛋白、呈單獨轉錄卡匣形式之各VP蛋白、AAP (組裝活化蛋白)或至少一種具有原生或非原生啟動子之桿狀病毒輔助基因。
在某些實施例中，桿狀病毒表現載體(BEV)係基於AcMNPV桿狀病毒或BmNPV桿狀病毒BmNPV。在某些實施例中，本發明之桿粒係基於AcMNPV桿粒，諸如bmon14272、vAce25ko或vAclef11KO (亦即其經工程改造變異體)。
一般而言，BEV未經最佳化以用於AAV產生。病毒蛋白於基於桿粒之BEV中之異常蛋白水解降解通常導致出人意料的問題，妨礙了使用桿狀病毒/Sf9系統可靠地大規模產生AAV衣殼蛋白。
本發明鑑別蛋白質降解之來源及路徑。本發明提出可包括經修飾BEV (mBEV)之對應系統，該等經修飾BEV消除rAAV衣殼及衣殼變異體在於桿狀病毒/Sf9系統中產生期間之降解。此新系統不僅能夠緩解蛋白水解降解，而且使得功能性AAV衣殼蛋白之產率增加，從而提供支援大規模AAV製造以便支援臨床試驗的更寬收穫窗。
在某些實施例中，本發明提出經修飾桿狀病毒表現載體(mBEV)及其用於在桿狀病毒/Sf9系統中大規模製造重組腺相關病毒(rAAV)之方法。
在某些實施例中，桿狀病毒表現載體(BEV)為其中桿狀病毒v-cath 基因已部分或完全缺失(「v-cath缺失之BEV」)或突變的BEV。在某些實施例中，BEV缺乏v-cath 基因或包括v-cath 基因之突變不活化型式。在某些實施例中，BEV缺乏v-cath 基因。在某些實施例中，該等BEV包括v-cath 基因之突變不活化型式。
其中桿狀病毒v-cath基因已部分缺失、完全缺失或突變不活化的BEV構築體之非限制性實例包括包含選自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4之核苷酸序列的BEV。在某些實施例中，本發明之BEV構築體包括SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4。在某些實施例中，本發明之BEV構築體包括SEQ ID NO: 2。在某些實施例中，本發明之BEV構築體包括SEQ ID NO: 3。在某些實施例中，本發明之BEV構築體包括SEQ ID NO: 4。
本發明之病毒產生桿粒可包括某些桿狀病毒基因或基因座之缺失。其他
在某些實施例中，表現宿主包括(但不限於)埃希氏桿菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)內之細菌物種。
在某些實施例中，包括穩定整合於細胞之染色體內之AAV rep及cap基因的宿主細胞可用於AAV粒子產生。在一非限制性實例中，在其染色體中具有穩定整合之AAV rep基因及AAV cap基因之至少兩個複本的宿主細胞可用於根據美國專利第7238526號中所描述之方法及構築體產生AAV粒子，該專利關於產生病毒粒子之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，AAV粒子可在經分子穩定轉化之宿主細胞中產生，該分子包含准許在宿主細胞中調控地表現稀有限制酶之核酸序列，如US20030092161及EP1183380中所描述，其關於產生病毒粒子之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，AAV粒子之產生方法及產生AAV粒子之細胞株可包括(但不限於)以下中教示之彼等方法及細胞株：PCT/US1996/010245、PCT/US1997/015716、PCT/US1997/015691、PCT/US1998/019479、PCT/US1998/019463、PCT/US2000/000415、PCT/US2000/040872、PCT/US2004/016614、PCT/US2007/010055、PCT/US1999/005870、PCT/US2000/004755、美國專利申請案第US08/549489號、第US08/462014號、第US09/659203號、第US10/246447號、第US10/465302號、美國專利第US6281010號、第US6270996號、第US6261551號、第US5756283號(讓與NIH)、第US6428988號、第US6274354號、第US6943019號、第US6482634號(讓與NIH：US7238526、US6475769)、第US6365394號(讓與NIH)、第US7491508號、第US7291498號、第US7022519號、第US6485966號、第US6953690號、第US6258595號、EP2018421、EP1064393、EP1163354、EP835321、EP931158、EP950111、EP1015619、EP1183380、EP2018421、EP1226264、EP1636370、EP1163354、EP1064393、US20030032613、US20020102714、US20030073232、US20030040101 (讓與NIH)、US20060003451、US20020090717、US20030092161、US20070231303、US20060211115、US20090275107、US2007004042、US20030119191、US20020019050，其各者之內容以全文引用之方式併入本文中，程度為其不與本發明衝突。 III. 定義
在本發明中的不同位置，以組或範圍來揭示本發明化合物之取代物或特性。特別預期本發明包括此類組及範圍之每一個別成員或其子組合。
除非另有說明，否則以下術語及片語具有下文描述之含義。定義本質上不意欲為限制性的且用以提供本發明之某些態樣之更清晰理解。
約 ：如本文所用，術語「約」意謂所引述之值的+/- 10%。
腺相關病毒 ：如本文所用之術語「腺相關病毒」或「AAV」係指依賴病毒屬之成員，包含來源於其之任何粒子、序列、基因、蛋白質或組分。
AAV 粒子 ：如本文所用，「AAV粒子」為包括衣殼及具有至少一個有效載荷區及至少一個ITR區之病毒基因組的病毒。本發明之AAV粒子可以重組方式產生，且可基於腺相關病毒(AAV)親本或參考序列。AAV粒子可衍生自本文所描述或此項技術中已知之任何血清型，包括血清型之組合(亦即，「假型」AAV)或各種基因組(例如單股的或自補的)。另外，AAV粒子可為複製缺陷型及/或所靶向的。
活性 ：如本文所用，術語「活性」係指其中事件發生或進行之情況。本發明之組合物可具有活性，且此活性可涉及一或多個生物學事件。
投與 ：如本文所用，術語「投與」係指向個體提供醫藥劑或組合物。
以組合形式投與 ：如本文所用，術語「以組合形式投與」或「組合投與」意謂同時或在一定時間間隔內向個體投與兩種或更多種藥劑，使得每種藥劑對患者之作用發生重疊。在某些實施例中，其係在彼此之約60、30、15、10、5或1分鐘內投與。在某些實施例中，藥劑之投與係以在一起足夠緊密的程度間隔開以達成組合(例如協同)作用。
改善 ：如本文所用，術語「改善(amelioration或ameliorating)」係指病況或疾病之至少一種指標的嚴重程度減輕。舉例而言，在神經退化病症之情形下，改善包括神經元損失之減小。
動物 ：如本文所用，術語「動物」係指動物界的任何成員。在某些實施例中，「動物」係指任何發育階段之人類。在某些實施例中，「動物」係指任何發育階段之非人類動物。在某些實施例中，非人類動物為哺乳動物(例如，嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長類動物或豬)。在某些實施例中，動物包括(但不限於)哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚類及蠕蟲。在某些實施例中，動物為轉殖基因動物、經基因工程改造之動物或純系。
反義股 ：如本文所用，術語siRNA分子之「反義股」或「第一股」或「引導股」係指與所靶向以靜默之基因之mRNA的約10至50個核苷酸，例如約15至30、16至25、18至23或19至22個核苷酸之區段實質上互補的股。反義股或第一股具有與所需目標mRNA序列充分互補以導引目標特異性靜默的序列，例如互補性足以讓RNAi機制或過程觸發對所需目標mRNA之破壞。
大致 ：如本文所用，在應用於一或多個所關注之值時，術語「大致」或「約」係指與所陳述之參考值類似的值。在某些實施例中，除非另有說明或另外自上下文顯而易見(除了此類數目將超過可能值之100%的情況)，否則術語「大致」係指在陳述之參考值的任一方向(大於或小於)落入25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小百分比內的一系列值。
與 … 締合 ：如本文所用，當關於兩個或更多個部分使用時，術語「與…締合」、「結合」、「連接」、「附接」及「繫栓」意謂該等部分直接或經由一或多個充當連接劑之額外部分而在物理上彼此締合或連接，以形成足夠穩定之結構以使得該等部分在使用該結構之條件(例如生理學條件)下保持在物理上締合。「締合」不必嚴格經由直接共價化學鍵結進行。其亦可表示離子鍵結或氫鍵結或基於雜合之連接性足夠穩定以使得「締合的」實體保持在物理上締合。
桿狀病毒表現載體 (BEV) ：如本文所用，BEV為桿狀病毒表現載體，亦即桿狀病毒來源之聚核苷酸載體。使用BEV之系統係稱為桿狀病毒表現載體系統(BEVS)。
mBEV 或經修飾之 BEV ：如本文所用，經修飾之BEV為桿狀病毒來源之表現載體，其已藉由以下一或多者之添加及/或缺失及/或複製及/或倒置而相對於起始BEV (無論野生型抑或人工的)改變：基因；基因片段；裂解位點；限制位點；序列區域；編碼有效載荷或所關注之基因的序列；或前述之組合。
雙功能性 ：如本文所用，術語「雙功能性」係指任何能夠具有或保持至少兩種功能的物質、分子或部分。該等功能可影響相同結果或不同結果。產生該功能之結構可相同或不同。
BIIC ：如本文所用，BIIC為桿狀病毒感染之昆蟲細胞。
生物相容性 ：如本文所用，術語「生物相容性」意謂與活的細胞、組織、器官或系統相容，幾乎不引起損傷、毒性或被免疫系統排斥的風險。
生物可降解 ：如本文所用，術語「生物可降解」意謂能夠藉由活物之作用分解成無害產物。
具生物活性 ：如本文所用，片語「具生物活性」係指任何在生物系統及/或生物體中具有活性之物質的特徵。舉例而言，當向生物體投與時對該生物體具有生物學作用之物質視為具有生物學活性。在特定實施例中，若經編碼之有效載荷的即使一部分具有生物活性或模擬被視為生物學相關的活性，則可認為本發明之AAV粒子具有生物活性。
衣殼 ：如本文所用，術語「衣殼」係指病毒粒子之蛋白質外殼。
經密碼子最佳化 ：如本文所用，術語「經密碼子最佳化」或「密碼子最佳化」係指經修飾之核酸序列編碼與親本/參考序列相同的胺基酸序列，但已改變以使得經修飾之核酸序列的密碼子針對在特定系統(諸如特定物種或物種群)中之表現最佳化或改良。作為一非限制性實例，包括AAV衣殼蛋白之核酸序列可針對在昆蟲細胞中或在一特定昆蟲細胞(諸如草地黏蟲細胞)中之表現經密碼子最佳化。密碼子最佳化可使用熟習此項技術者已知之方法及資料庫完成。
互補及實質上互補 ：如本文所用，術語「互補」係指聚核苷酸能夠彼此形成鹼基對。鹼基對通常由反平行聚核苷酸股中之核苷酸單元之間的氫鍵形成。互補聚核苷酸股可以沃森-克里克方式(例如A至T、A至U、C至G)，或以允許形成雙螺旋之任何其他方式形成鹼基對。如熟習此項技術者所知，當與DNA相對使用RNA時，尿嘧啶而非胸腺嘧啶為視為與腺苷互補之鹼基。然而，除非另有說明，否則當在本發明之上下文中表示為U時，暗示能夠取代T。完美互補性或100%互補性係指一個聚核苷酸股之各核苷酸單元可與第二聚核苷酸股之核苷酸單元形成氫鍵之情況。次完美互補係指兩個股之一些但並非所有核苷單元可彼此形成氫鍵的情況。舉例而言，對於兩個20聚體，若各股上僅兩個鹼基對可彼此形成氫鍵，則該等聚核苷酸股展現10%互補性。在同一實例中，若各股上之18個鹼基對可彼此形成氫鍵，則聚核苷酸股展現90%互補性。如本文所用，術語「實質上互補」意謂siRNA之序列(例如在反義股中)足以結合所需目標mRNA及觸發該目標mRNA之RNA靜默。
化合物 ：本發明之化合物包括原子之存在於中間化合物或最終化合物中的所有同位素。「同位素」係指具有相同原子數但因為原子核中之中子數不同而具有不同質量數的原子。舉例而言，氫之同位素包括氚及氘。
本發明之化合物及鹽可藉由常規方法與溶劑或水分子組合製備以形成溶劑合物及水合物。
條件性活性 ：如本文所用，術語「條件性活性」係指野生型多肽之突變體或變異體，其中該突變體或變異體之活性在生理條件下比親本多肽大或小。此外，條件性活性多肽在異常條件下相較於親本多肽具有增加或減小的活性。條件性活性多肽在普通生理條件或異常條件下可以可逆地或不可逆地不活化。
保守 ：如本文所用，術語「保守」係指聚核苷酸序列或多肽序列之核苷酸或胺基酸殘基分別在所比較之兩個或更多個序列之相同位置中未發生改變。與在序列中其他地方出現之核苷酸或胺基酸相比，相對保守之核苷酸或胺基酸為在更相關之序列當中保留的核苷酸或胺基酸。
在某些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此100%一致，則將其稱為「完全保守的」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則將其稱為「高度保守的」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此約70%一致、約80%一致、約90%一致、約95%、約98%或約99%一致，則將其稱為「高度保守的」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此至少30%一致、至少40%一致、至少50%一致、至少60%一致、至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則將其稱為「保守的」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此約30%一致、約40%一致、約50%一致、約60%一致、約70%一致、約80%一致、約90%一致、約95%一致、約98%一致或約99%一致，則將其稱為「保守的」。序列之保守可適用於聚核苷酸或多肽之整個長度或可適用於其一部分、區域或特徵。
控制元件 ：如本文所用，「控制元件」、「調控控制元件」或「調控序列」係指提供接受者細胞中之編碼序列之複製、轉錄及轉譯的啟動子區、聚腺苷酸化信號、轉錄終止序列、上游調控域、複製起點、內部核糖體進入位點(「IRES」)、增強子及其類似物。此等控制元件並非全部都需要始終存在，只要所選編碼序列能夠在適當的宿主細胞中進行複製、轉錄及/或轉譯即可。
控制釋放 ：如本文所用，術語「控制釋放」係指符合特定釋放模式以實現治療結果的醫藥組合物或化合物釋放曲線。
細胞生長抑制 ：如本文所用，「細胞生長抑制」係指抑制、減少、抑止細胞(例如，哺乳動物細胞(例如，人類細胞))、細菌、病毒、真菌、原蟲、寄生蟲、朊病毒或其組合之生長、分裂或倍增。
細胞毒性 ：如本文所用，「細胞毒性」係指將細胞(例如，哺乳動物細胞(例如，人類細胞))、細菌、病毒、真菌、原蟲、寄生蟲、朊病毒或其組合殺死或對其造成有害、有毒或致命影響。
遞送 ：如本文所用，「遞送」係指遞送AAV粒子、化合物、物質、實體、部分、貨物或有效載荷的動作或方式。
遞送劑 ：如本文所用，「遞送劑」係指任何至少部分地有助於將AAV粒子活體內遞送至所靶向細胞的物質。
去穩定化 ：如本文所用，術語「去穩定」、「去穩定化」或「去穩定化區域」意謂使某個區域或分子之穩定性比相同區域或分子之起始、野生型或原生形式低。
可偵測標記 ：如本文所用，「可偵測標記」係指一或多種與另一實體附接、併入另一實體中或與另一實體締合的標記物、信號或部分，該另一實體容易藉由此項技術中已知之方法偵測，該等方法包括放射線照相術、螢光、化學發光、酶活性、吸光度及其類似方法。可偵測標記包括放射性同位素、螢光團、發色團、酶、染料、金屬離子、配體(諸如生物素、抗生物素蛋白、鏈黴親和素及半抗原)、量子點及其類似物。可偵測標記可位於本文所揭示之肽或蛋白質中之任何位置。其可在胺基酸、肽或蛋白質內，或位於N端或C端。
消化 ：如本文所用，術語「消化」意謂分裂成較小的碎片或組分。在提及多肽或蛋白質時，消化引起肽的產生。
遠端 ：如本文所用，術語「遠端」意謂位於遠離中心或遠離所關注之點或區域處。
給藥方案 ：如本文所用，「給藥方案」為投與時程或由醫師確定之治療、預防或緩解性照護方案。
囊封 ：如本文所用，術語「囊封」意謂圍封、包圍或包覆。
經工程改造 ：如本文所用，當本發明之實施例經設計以具有與起始點、野生型或原生分子不同的特徵或特性(無論結構上抑或化學上)時，該等實施例「經工程改造」。
有效量 ：如本文所用，術語藥劑之「有效量」為足以實現有益的或所需的結果，例如臨床結果的量，且因此「有效量」視其應用情形而定。舉例而言，在投與治療癌症之藥劑的情況下，藥劑之有效量為例如相較於在未投與藥劑之情況下所獲得的反應，足以對癌症達成如本文中所定義之治療的量。
表現 ：如本文所用，核酸序列之「表現」係指以下事件中之一或多者：(1)自DNA序列產生RNA模板(例如，藉由轉錄)；(2)加工RNA轉錄物(例如，藉由剪接、編輯、5'帽形成及/或3'端加工)；(3)將RNA轉譯成多肽或蛋白質；及(4)多肽或蛋白質之轉譯後修飾。
特徵 (feature)：如本文所用，「特徵」係指特徵(characteristic)、特性或獨特要素。
調配物 ：如本文所用，「調配物」包括至少一種AAV粒子及遞送劑或賦形劑。
片段 ：如本文所用之「片段」係指一部分。舉例而言，蛋白質之片段可包括藉由使自經培養細胞分離之全長蛋白質消化而獲得的多肽。
功能性 ：如本文所用，「功能性」生物分子為展現出某種特性及/或活性的生物分子形式，其以該特性及/或活性為特徵。
基因表現 ：術語「基因表現」係指核酸序列進行成功轉錄且在大部分情況下進行成功轉譯以產生蛋白質或肽的過程。為了清楚起見，在提及量測「基因表現」時，此應該理解為意謂量測可針對核酸轉錄產物，例如對RNA或mRNA，或針對胺基酸轉譯產物，例如對多肽或肽。量測RNA、mRNA、多肽及肽之量或水準的方法為此項技術中熟知的。
同源性 ：如本文所用，術語「同源性」係指聚合分子之間，例如聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。在某些實施例中，若聚合分子之序列為至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致或類似，則將聚合分子視為彼此「同源」。術語「同源」必然係指在至少兩個序列(聚核苷酸或多肽序列)之間的比較。根據本發明，若對於至少約20個胺基酸之至少一個延伸部，兩個聚核苷酸序列編碼之多肽為至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至99%，則將兩個聚核苷酸序列視為同源。在某些實施例中，同源聚核酸苷序列之特徵在於編碼具有至少4至5個特別指定之胺基酸的延伸部的能力。對於長度小於60個核苷酸之聚核苷酸序列，同源性由編碼具有至少4至5個特別指定之胺基酸的延伸部的能力來確定。根據本發明，若對於至少約20個胺基酸之至少一個延伸部，兩個蛋白質為至少約50%、60%、70%、80%或90%一致，則將該等蛋白質序列視為同源。
異源區 ：如本文所用，術語「異源區」係指不認為是同源區的區域。
同源區 ：如本文所用,術語「同源區」係指在位置、結構、進化起源、特徵、形式或功能方面類似的區域。
一致性 ：如本文所用，術語「一致性」係指聚合分子之間，例如聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。舉例而言，兩個聚核苷酸序列之一致性百分比的計算可藉由出於最佳比較目的而比對兩個序列來進行(例如，可將間隙引入第一及第二核酸序列中之一者或兩者中以便最佳比對且出於比較目的可忽略不一致序列)。在某些實施例中，出於比較目的比對之序列的長度為參考序列之長度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。隨後比較在對應核苷酸位置處之核苷酸。當第一序列中之位置經與第二序列中之對應位置相同的核苷酸佔據時，則該分子在彼位置上一致。在考慮到為了兩個序列之最佳比對需要引入的間隙之數目及各間隙之長度的情況下，兩個序列之間的一致性百分比與由該等序列共用之一致位置之數目有關。可使用數學演算法實現序列比較及兩個序列之間的一致性百分比之測定。舉例而言，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用諸如以下中所描述之方法來測定：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.編, Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.編, Academic Press, New York, 1993；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M.及Griffin, H. G.編, Humana Press, New Jersey, 1994；及Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編, M Stockton Press, New York, 1991；其各自以引用之方式併入本文中，程度為其不與本發明衝突。舉例而言，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用Meyers及Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17)之演算法來測定，該演算法已併入使用PAM120權重殘基表、間隙長度罰分12及間隙罰分4之ALIGN程式(2.0版)中。或者，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用GCG套裝軟體中之GAP程式，使用NWSgapdna.CMP矩陣來測定。通常用於測定序列之間的一致性百分比之方法包括(但不限於)Carillo, H.及Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988)中揭示之方法；該文獻以引用之方式併入本文中，程度為其不與本發明衝突。用於測定一致性之技術編碼於公開可獲得之電腦程式中。用以確定兩個序列之間的同源性的例示性電腦軟體包括(但不限於)GCG套裝程式(Devereux, J.等人, Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA (Altschul, S. F.等人,J. Molec. Biol ., 215, 403 (1990))。
抑制基因表現 ：如本文所用，片語「抑制基因表現」意謂使得基因表現產物之量減少。表現產物可為自基因轉錄之RNA (例如mRNA)或自mRNA (自基因轉錄)轉譯之多肽。通常，mRNA含量之減少引起自其轉譯之多肽的含量減少。表現量可使用用於量測mRNA或蛋白質之標準技術來測定。
活體外 ：如本文所用，術語「活體外」係指發生在人工環境中(例如試管或反應容器中、細胞培養物中、皮氏培養皿中等)而非發生在生物體(例如動物、植物或微生物)內的事件。
活體內 ：如本文所用，術語「活體內」係指發生在生物體(例如動物、植物、或微生物、或其細胞或組織)內之事件。
經分離 ：如本文所用，術語「經分離」係指物質或實體已與至少一些與其締合(無論是在自然界中抑或在實驗環境中)的組分分離。經分離之物質關於其曾締合之物質的純度可不同。經分離之物質及/或實體可與其最初締合之其他組分的至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或更大百分比分離。在某些實施例中，經分離之藥劑之純度超過約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或超過約99%。如本文所用，若物質實質上不含其他組分，則該物質為「純的」。
實質上經分離 ：「實質上經分離」意謂物質自形成或偵測該物質之環境實質上分離。部分分離可包括例如富含本發明之物質或AAV粒子的組合物。實質上分離可包括含有至少約50重量%、至少約60重量%、至少約70重量%、至少約80重量%、至少約90重量%、至少約95重量%、至少約97重量%或至少約99重量%之本發明化合物或其鹽的組合物。用於分離化合物及其鹽之方法為此項技術中之常規方法。
連接子 ：如本文所用，「連接子」係指連接兩個分子之分子或分子群。連接子可為連接編碼兩種不同多肽的兩個核酸序列的核酸序列。連接子可經轉譯或可不轉譯。連接子可為可裂解連接子。
微小 RNA (miRNA) 結合位點 ：如本文所用，微小RNA (miRNA)結合位點表示核酸轉錄物中至少由miRNA之「種子」區結合的核苷酸位置或區域。
經修飾 ：如本文所用，術語「經修飾」係指改變本發明之分子之狀態或結構。可以多種方式修飾分子，包括在化學上、結構上及功能上修飾分子。如本文所用，當本發明之實施例具有或擁有與起始點、野生型或原生分子不同的特徵或特性(無論結構上抑或化學上)時，該等實施例「經修飾」。
突變 ：如本文所用，術語「突變」係指基因結構之任何變化，該變化產生可傳遞至後代之變異(亦稱為「突變」)形式。基因突變可由DNA中之單鹼基之交替、或基因或染色體之較大部分之缺失、插入或重排引起。
天然存在 ：如本文所用，「天然存在」或「野生型」意謂存在於自然界中而沒有人工輔助或人的手的參與。
非人類脊椎動物 ：如本文所用，「非人類脊椎動物」包括除了智人(Homo sapiens )之外的所有脊椎動物，包括野生及家養物種。非人類脊椎動物之實例包括(但不限於)哺乳動物，諸如羊駝、爪哇牛(banteng)、野牛、駱駝、貓、家牛、鹿、狗、驢、大額牛(gayal)、山羊、天竺鼠、馬、駱馬、騾、豬、兔、馴鹿、綿羊、水牛及犛牛(yak)。
脫靶 ：如本文所用，「脫靶」係指對任何一或多個目標、基因或細胞轉錄物之任何非預期作用。
開放閱讀框架 ：如本文所用，「開放閱讀框架」或「ORF」係指除了閱讀框架之末端以外，在給定閱讀框架內不含終止密碼子之序列。
可操作地連接 ：如本文所用，片語「可操作地連接」係指在兩個或更多個分子、構築體、轉錄物、實體、部分或其類似物之間的功能性連接。
患者 ：如本文所用，「患者」係指可能尋求或需要治療、要求治療、正在接受治療、即將接受治療的個體，或受到經過訓練的專業人員針對特定疾病或病況之照護的個體。
有效載荷 ：如本文所用，「有效載荷」或「有效載荷區」係指一或多個由病毒基因組編碼或在病毒基因組內編碼之聚核苷酸或聚核苷酸區或此類聚核苷酸或聚核苷酸區之表現產物，例如轉殖基因、編碼多肽或多元多肽之聚核苷酸或調節核酸或調控核酸。
有效載荷構築體 ：如本文所用，「有效載荷構築體」為包括聚核苷酸區之一或多個載體構築體，該聚核苷酸區編碼或包含在一側或兩側上側接有反向末端重複(ITR)序列的有效載荷。有效載荷構築體呈遞在病毒生產性細胞中複製之模板，以產生治療性病毒基因組。
有效載荷構築體載體 ：如本文所用，「有效載荷構築體載體」為編碼或包含有效載荷構築體及用於在細菌細胞中複製及表現有效載荷構築體之調節區的載體。
有效載荷構築體表現載體 ：如本文所用，「有效載荷構築體表現載體」為如下載體，其編碼或包含有效載荷構築體且進一步包含一或多個編碼或包含用於在病毒複製細胞中進行病毒表現之組分的聚核苷酸區。
肽 ：如本文所用，「肽」之長度小於或等於50個胺基酸，例如長度為約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸。
醫藥學上可接受 ：片語「醫藥學上可接受」在本文中用於指代在合理醫學判斷範疇內，適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理益處/風險比相匹配的彼等化合物、材料、組合物及/或劑型。
醫藥學上可接受之賦形劑 ：如本文所用之片語「醫藥學上可接受之賦形劑」係指除本文所描述之化合物以外的任何成分(例如，能夠懸浮或溶解活性化合物之媒劑)且其特性為在患者中實質上無毒且非炎性。賦形劑可包括例如：抗黏劑、抗氧化劑、黏合劑、包衣、壓縮助劑、崩解劑、染料(顏料)、潤膚劑、乳化劑、填充劑(稀釋劑)、成膜劑或包衣、調味劑、芳香劑、助流劑(流動增強劑)、潤滑劑、防腐劑、印刷油墨、吸附劑、懸浮劑或分散劑、甜味劑及水合用水。例示性賦形劑包括(但不限於)：丁基化羥基甲苯(BHT)、碳酸鈣、磷酸鈣(磷酸氫二鈣)、硬脂酸鈣、交聯羧甲纖維素、交聯聚乙烯吡咯啶酮、檸檬酸、交聯普維酮、半胱胺酸、乙基纖維素、明膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、麥芽糖醇、甘露糖醇、甲硫胺酸、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯、微晶纖維素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮、普維酮、預膠凝化澱粉、對羥基苯甲酸丙酯、棕櫚酸視黃酯、蟲膠、二氧化矽、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、羥基乙酸澱粉鈉、山梨糖醇、澱粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化鈦、維生素A、維生素E、維生素C及木糖醇。
醫藥學上可接受之鹽 ：本發明亦包括本文所描述之化合物的醫藥學上可接受之鹽。如本文所用，「醫藥學上可接受之鹽」係指所揭示之化合物之衍生物，其中母體化合物藉由將現有酸或鹼部分轉化為其鹽形式(例如藉由使游離鹼基團與適合有機酸反應)來修飾。醫藥學上可接受之鹽的實例包括(但不限於)鹼性殘基(諸如胺)之無機酸鹽或有機酸鹽；酸性殘基(諸如羧酸)之鹼金屬鹽或有機鹽；及其類似物。代表性酸加成鹽包括乙酸鹽、乙酸、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯磺酸、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙烷磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及其類似物。代表性鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂及其類似物，以及無毒性銨、四級銨及胺陽離子，包括(但不限於)銨、四甲銨、四乙銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺及其類似物。本發明之醫藥學上可接受之鹽包括例如由無毒無機酸或有機酸形成之母體化合物的習知無毒鹽。本發明之醫藥學上可接受之鹽可藉由習知化學方法由含有鹼性或酸性部分之母體化合物合成。一般而言，可藉由使此等化合物之游離酸或鹼形式與化學計算量之適當鹼或酸於水中或有機溶劑中，或兩者之混合物中反應來製備此類鹽；一般而言，可使用非水性介質，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。適合之鹽之清單可見於Remington's Pharmaceutical Sciences , 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, 第1418頁，Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use , P.H. Stahl及C.G. Wermuth (編), Wiley-VCH, 2008，及Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science , 66, 1-19 (1977)中，其各自以全文引用的方式併入本文中，程度為其不與本發明衝突。
醫藥學上可接受之溶劑合物 ：如本文所用，術語「醫藥學上可接受之溶劑合物」意謂本發明化合物，其中適合之溶劑的分子併入晶格中。適合溶劑在所投與之劑量下為生理學上可耐受的。舉例而言，溶劑合物可藉由結晶、再結晶或沈澱自包括有機溶劑、水或其混合物之溶液製備。適合溶劑之實例為乙醇、水(例如單水合物、二水合物及三水合物)、N -甲基吡咯啶酮(NMP)、二甲亞碸(DMSO)、N,N' -二甲基甲醯胺(DMF)、N,N' -二甲基乙醯胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啶酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2-(1H)嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯啶酮、苯甲酸苯甲酯及其類似者。當水為溶劑時，溶劑合物稱作「水合物」。
藥物動力學 ：如本文所用，「藥物動力學」係指分子或化合物在涉及確定向活生物體投與之物質的結局時的任何一或多種特性。藥物動力學分成若干領域，包括吸收、分佈、代謝及排泄之程度及速率。此通常稱作ADME，其中：(A)吸收為物質進入血液循環之過程；(D)分佈為物質在整個體液及身體組織中之分散或擴散；(M)代謝(或生物轉化)為母體化合物變成子體代謝物之不可逆轉化；及(E)排泄(或消除)係指自身體消除物質。在罕見情況下，一些藥物在身體組織中不可逆地積聚。
物理化學 ：如本文所用，「物理化學」意謂具有或涉及物理及/或化學性質。
預防 (preventing) ：如本文所用，術語「預防(preventing或prevention)」係指部分或完全地延遲感染、疾病、病症及/或病況之發作；部分或完全地延遲特定感染、疾病、病症及/或病況之一或多種症狀、特徵或臨床表現的發作；部分或完全地延遲特定感染、疾病、病症及/或病況之一或多種症狀、特徵或表現的發作；部分或完全地延遲感染、特定疾病、病症及/或病況之進展；及/或降低患上與感染、疾病、病症及/或病況相關之病變的風險。
增生 ：如本文所用，術語「增生」意謂生長、擴增或增加或引起快速生長、擴增或增加。「增生性」意謂具有增生能力。「抗增生性」意謂具有與增生特性相對或相反之特性。
預防 (prophylactic) ：如本文所用，「預防」係指用於預防疾病擴散之治療或作用時程。
預防 (prophylaxis) ：如本文所用，「預防」係指為維持健康並預防疾病擴散而採用之措施。
所關注之蛋白質 ：如本文所用，術語「所關注之蛋白質」或「所需蛋白質」包括本文所提供之蛋白質及其片段、突變體、變異體及改變形式。
近端 ：如本文所用，術語「近端」意謂位於較靠近中心或所關注之點或區域處。
經純化 ：如本文所用，「純化(purify)」、「經純化(purified)」、「純化(purification)」意謂自非所需組分、材料污物、混雜物或缺陷品變得實質上純的或乾淨的。「經純化」係指純的狀態。「純化」係指變純的過程。
區域 (region) ：如本文所用，術語「區域」係指區(zone)或一般區域(area)。在某些實施例中，當提及蛋白質或蛋白質模組時，區域可包括沿蛋白質或蛋白質模組之線性胺基酸序列，或可包括三維區域、抗原決定基及/或抗原決定基叢集。在某些實施例中，區域包括末端區域。如本文所用，術語「末端區域」係指位於給定藥劑之端部或末端處的區域。當提及蛋白質時，末端區域可包括N端及/或C端。N端係指包含具有游離胺基之胺基酸的蛋白質末端。C端係指包含具有游離羧基之胺基酸的蛋白質末端。N端及/或C端區域可因此包括N端及/或C端以及周圍胺基酸。在某些實施例中，N端及/或C端區域包括約3個胺基酸至約30個胺基酸、約5個胺基酸至約40個胺基酸、約10個胺基酸至約50個胺基酸、約20個胺基酸至約100個胺基酸及/或至少100個胺基酸。在某些實施例中，N端區域可包括任何長度之胺基酸，其包括N端但不包括C端。在某些實施例中，C端區域可包括任何長度之胺基酸，其包括C端但不包括N端。
在某些實施例中，當提及聚核苷酸時，區域可包括沿聚核苷酸之線性核酸序列，或可包括三維區域、二級結構或三級結構。在某些實施例中，區域包括末端區域。如本文所用，術語「末端區域」係指位於給定藥劑之端部或末端處的區域。當提及聚核苷酸時，末端區域可包括5'端及3'端。5'端係指包含具有游離磷酸酯基團之核酸的聚核苷酸末端。3'端係指包含具有游離羥基之核酸的聚核苷酸末端。5'及3'區域可因此包括5'端及3'端以及周圍核酸。在某些實施例中，5'端及3'端區域包括約9個核酸至約90個核酸、約15個核酸至約120個核酸、約30個核酸至約150個核酸、約60個核酸至約300個核酸及/或至少300個核酸。在某些實施例中，5'區域可包括任何長度之核酸，其包括5'端但不包括3'端。在某些實施例中，3'區域可包括任何長度之核酸，其包括3'端但不包括5'端。
RNA 或 RNA 分子 ：如本文所用，術語「RNA」或「RNA分子」或「核糖核酸分子」係指核糖核苷酸之聚合物；術語「DNA」或「DNA分子」或「去氧核糖核酸分子」係指去氧核糖核苷酸之聚合物。DNA及RNA可分別例如藉由DNA複製及DNA轉錄天然合成；或化學合成。DNA及RNA可為單股(亦即分別為ssRNA或ssDNA)或多股(例如雙股，亦即分別為dsRNA及dsDNA)。如本文所用之術語「mRNA」或「信使RNA」係指編碼一或多個多肽鏈之胺基酸序列的單股RNA。
RNA 干擾或 RNAi ：如本文所用，術語「RNA干擾」或「RNAi」係指由RNA分子介導的引起對應蛋白質編碼基因之表現受到抑制或干擾或「靜默」的序列特異性調控機制。已在許多類型之生物體中觀測到RNAi，該等生物體包括植物、動物及真菌。RNAi出現在天然移除外源RNA (例如病毒RNA)之細胞中。天然RNAi經由自游離dsRNA裂解之片段前進，其將降解機制引導至其他類似RNA序列。RNAi受RNA誘導靜默複合物(RNA-induced silencing complex；RISC)控制且由細胞質中之短/小dsRNA分子起始，其中其與催化RISC組分阿爾戈(argonaute)相互作用。可將dsRNA分子外源地引入至細胞中。外源性dsRNA藉由活化核糖核酸酶蛋白Dicer起始RNAi，該Dicer結合且裂解dsRNA以產生具有21至25個鹼基對之雙股片段，其中各端上具有若干未配對突出鹼基。此等短雙股片段稱為小干擾RNA (siRNA)。
樣本 ：如本文所用，術語「樣本」或「生物樣本」係指其組織、細胞或組成部分之子組(例如，體液，包括但不限於血液、黏液、淋巴液、滑液、腦脊髓液、唾液、羊水、羊膜臍帶血、尿液、陰道液及精液)。樣本進一步可包括由完整生物體或其組織、細胞或組成部分之子組或其級分或部分製備的均質物、溶胞物或提取物，其組織、細胞或組成部分包括但不限於例如血漿、血清、脊髓液、淋巴液，皮膚、呼吸道、腸道及生殖泌尿道之外部切片，淚液、唾液、乳汁、血球、腫瘤、器官。樣本進一步指培養基，諸如營養培養液或凝膠，其可含有細胞組分，諸如蛋白質或核酸分子。
自補病毒粒子 ：如本文所用，「自補病毒粒子」為包括至少兩種組分，即蛋白質衣殼及圍封於衣殼內之編碼自補基因組之聚核苷酸序列的粒子。
有義股 ：如本文所用，術語siRNA分子之「有義股」或「第二股」或「隨從股」係指與反義股或第一股互補之股。siRNA分子之反義股與有義股雜合以形成雙螺旋結構。如本文所用，「siRNA雙螺旋體」包括與所靶向以便靜默之基因之mRNA的約10至50個核苷酸之部分具有足夠互補性的siRNA股及具有足夠互補性以與另一siRNA股形成雙螺旋體的siRNA股。
短干擾 RNA 或 siRNA ：如本文所用，術語「短干擾RNA」、「小干擾RNA」或「siRNA」係指包含在約5至60個之間的能夠導引或介導RNAi之核苷酸(或核苷酸類似物)的RNA分子(或RNA類似物)。在某些實施例中，siRNA分子包括約15至30個核苷酸或核苷酸類似物，諸如約16至25個核苷酸(或核苷酸類似物)、約18至23個核苷酸(或核苷酸類似物)、約19至22個核苷酸(或核苷酸類似物) (例如19、20、21或22個核苷酸或核苷酸類似物)、約19至25個核苷酸(或核苷酸類似物)，及約19至24個核苷酸(或核苷酸類似物)。術語「短」siRNA係指包含5至23個核苷酸，諸如21個核苷酸(或核苷酸類似物)，例如19、20、21或22個核苷酸之siRNA。術語「長」siRNA係指包含24至60個核苷酸，諸如約24至25個核苷酸，例如23、24、25或26個核苷酸之siRNA。短siRNA在一些情況下可包括少於19個核苷酸，例如16、17或18個核苷酸、或少至5個核苷酸，其限制條件為較短的siRNA保留介導RNAi之能力。同樣地，長siRNA在一些情況下可包括超過26個核苷酸，例如27、28、29、30、35、40、45、50、55或甚至60個核苷酸，其限制條件為較長siRNA保留介導RNAi或轉譯阻遏而不需進一步處理，例如酶處理為短siRNA之能力。siRNA可為單股RNA分子(ss-siRNA)或包含有義股及反義股之雙股RNA分子(ds-siRNA)，有義股與反義股雜合形成稱為siRNA雙螺旋體之雙螺旋結構。
信號序列 ：如本文所用，片語「信號序列」係指可導引蛋白質之轉運或定位的序列。
單一單位劑量 ：如本文所用，「單一單位劑量」為以一個劑量/一次性/在單一途徑/單一接觸點中投與的任何治療劑之劑量，亦即，單一投與事件。在某些實施例中，單一單位劑量以離散劑型(例如錠劑、膠囊、貼片、裝藥注射器、小瓶等)提供。
相似性 ：如本文所用，術語「類似性」係指聚合性分子之間，例如聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。聚合物分子彼此之類似性百分比的計算可以與一致性百分比之計算相同的方式進行，不同之處在於計算類似性百分比時要考慮如此項技術中所理解之保守性取代。
分次劑量 ：如本文所用，「分次劑量」為將單一單位劑量或每日總劑量分成兩個或更多個劑量。
穩定 ：如本文所用，「穩定」係指化合物足夠穩固以經受住自反應混合物中分離得到適用純度，且在某些實施例中能夠調配成有效治療劑。
穩定化 ：如本文所用，術語「使……穩定」、「穩定化」、「穩定化區域」意謂使之穩定或變得穩定。
個體 ：如本文所用，術語「個體」或「患者」係指可例如出於實驗、診斷、預防及/或治療目的向其投與根據本發明之組合物的任何生物體。典型個體包括動物(例如哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類動物及人類)及/或植物。
實質上 ：如本文所用，術語「實質上」係指展現所關注特徵或特性之總的或接近總的程度或等級之定性狀況。生物技術中之普通技術者應理解，生物及化學現象很少(若曾有)進行完全及/或繼續進行至完全或達成或避免絕對結果。因而，本文使用術語「實質上」以獲得許多生物及化學現象中所固有的完整性之潛在缺乏。
實質上相等 ：如本文所用，在其與各劑量之間的時間差異相關時，該術語意謂加/減2%。
實質上同時 ：如本文所用且在其與複數個劑量相關時，該術語意謂在2秒之內。
患有 ：「患有」疾病、病症及/或病況之個體已診斷患有該疾病、病症及/或病況或呈現其一或多種症狀。
易患 ：「易患」疾病、病症及/或病況之個體尚未診斷患有該疾病、病症及/或病況及/或可能未展現其症狀，但具有患上疾病或其症狀之傾向。在某些實施例中，易患疾病、病症及/或病況(例如癌症)之個體的特徵可為以下中之一或多者：(1)與疾病、病症及/或病況顯現相關之基因突變；(2)與疾病、病症及/或病況顯現相關之基因多形性；(3)與疾病、病症及/或病況相關之蛋白質及/或核酸的表現及/或活性增加及/或減少；(4)與疾病、病症及/或病況顯現相關之習慣及/或生活方式；(5)疾病、病症及/或病況之家族病史；及(6)暴露於與疾病、病症及/或病況顯現相關之微生物及/或經該微生物感染。在某些實施例中，易患疾病、病症及/或病況之個體將顯現該疾病、病症及/或病況。在某些實施例中，易患疾病、病症及/或病況之個體將不顯現該疾病、病症及/或病況。
持續釋放 ：如本文所用，術語「持續釋放」係指醫藥組合物或化合物在特定時間段內的釋放曲線符合一定釋放速率。
合成 ：術語「合成」意謂藉由人的手產生、製備及/或製造。本發明之聚核苷酸或多肽或其他分子的合成可為化學合成或酶合成。
靶向 ：如本文所用，「靶向」意謂設計並選擇將與目標核酸雜合且誘導所需作用之核酸序列的過程。
所靶向細胞 ：如本文所用，「所靶向細胞」係指任何一或多個所關注細胞。細胞可見於活體外、活體內、原位或生物體之組織或器官中。生物體可為動物，諸如哺乳動物、人類或人類患者。
末端區域 ：如本文所用，術語「末端區域」係指連接之核苷或胺基酸(分別為聚核苷酸或多肽)的區域之5'或3'端上的區域。
末端最佳化 ：當提及核酸時，術語「末端最佳化」意謂核酸之末端區域相比於原生或野生型末端區域以一些方式改良，例如經密碼子最佳化。
治療劑 ：術語「治療劑」係指當向個體投與時，具有治療、診斷及/或預防作用及/或引起所需生物學及/或藥理學作用的任何藥劑。
治療有效量 ：如本文所用，術語「治療有效量」意謂當向該或易患感染、疾病、病症及/或病況之個體投與時，足以治療該感染、疾病、病症及/或病況，改善其症狀、對其進行診斷、預防及/或延緩其發作的待遞送之藥劑(例如核酸、藥物、治療劑、診斷劑、預防劑等)的量。在某些實施例中，治療有效量將以單一劑量提供。在某些實施例中，治療有效量以包含複數個劑量之給藥方案投與。熟習此項技術者應瞭解，在某些實施例中，若單位劑型包括當作為此類給藥方案之部分投與時有效的量，則可將其視為包括治療有效量之特定藥劑或實體。
治療有效結果 ：如本文所用，術語「治療有效結果」意謂在患有或易患感染、疾病、病症及/或病況之個體中足以治療該感染、疾病、病症及/或病況、改善其症狀、對其進行診斷、預防及/或延遲其發作的結果。
每日總劑量 ：如本文所用，「每日總劑量」為在24小時時間內給予或以處方開具之量。其可以單一單位劑量形式進行投與。
轉染 ：如本文所用，術語「轉染」係指將外源性核酸引入至細胞中之方法。轉染方法包括(但不限於)化學方法、物理治療及陽離子型脂質或混合物。
治療 ：如本文所用，術語「治療」係指部分或完全地減輕、改善、改良、緩解特定感染、疾病、病症及/或病況、延遲其發作、抑制其進展、減小其嚴重程度及/或降低其一或多種症狀或特徵的發生率。舉例而言，「治療」癌症可指抑制腫瘤之存活、生長及/或擴散。出於降低顯現與某種疾病、病症及/或病況相關之病變的風險的目的，可向未展現該疾病、病症及/或病況之病徵的個體及/或向僅展現該疾病、病症及/或病況之早期病徵的個體投與治療。
未經修飾 ：如本文所用，「未經修飾」係指任何以任何方式改變之前的物質、化合物或分子。未經修飾可指代，但並不始終指代生物分子之野生型或原生形式。分子可進行一系列修飾，由此，各經修飾分子可充當後一修飾之「未經修飾」的起始分子。
載體 ：如本文所用，「載體」為轉運、轉導或以其他方式充當異源分子載劑的任何分子或部分。本發明之載體可以重組方式產生且可基於及/或可包括腺相關病毒(AAV)親本或參考序列。此類親本或參考AAV序列可充當用於對載體進行工程改造之原始、第二、第三或後續序列。在非限制性實例中，此類親本或參考AAV序列可包括以下序列中之任一或多者：編碼多肽或多元多肽之聚核苷酸序列，該序列可為野生型或自野生型修飾，且該序列可編碼蛋白質、蛋白質域或蛋白質之一或多個次單元的全長或部分序列；包含調節或調控核酸之聚核苷酸，該序列可為野生型或自野生型修飾；及可自或可不自野生型序列修飾之轉殖基因。此等AAV序列可充當一或多個密碼子(在核酸層面)或胺基酸(在多肽層面)之「供體」序列或一或多個密碼子(在核酸層面)或胺基酸(在多肽層面)之「受體」序列。
病毒基因組 ：如本文所用，「病毒基因組」或「載體基因組」係指囊封於AAV粒子中之核酸序列。 IV. 等效物及範疇
最多使用常規實驗，熟習此項技術者將識別或能夠確定根據本文所描述之本發明之特定實施例的許多等效物。本發明之範疇不意欲受限於以上描述，而是如隨附申請專利範圍中所闡述。
在申請專利範圍中，除非相反地指示或另外從上下文顯而易見，否則諸如「一(a/an)」及「該」之冠詞可意謂一或大於一。除非相反地指示或另外自上下文顯而易見，否則若一個、超過一個或所有群組成員存在於、用於給定產物或製程中或以其他方式與給定產物或製程有關，則在群組的一或多個成員之間包括「或」之申請專利範圍或描述被視為滿足。本發明包括群組中恰好一個成員存在於、用於給定產物或製程中或以其他方式與給定產物或製程相關之實施例。本發明包括超過一個或所有的群組成員存在於、用於給定產物或製程中或以其他方式與給定產物或製程有關的實施例。
亦應注意，術語「包含」意欲為開放的且准許但不要求包括額外要素或步驟。當本文使用術語「包含」時，亦因此涵蓋及揭示術語「由…組成」。
當給出範圍時，包括端點。此外，應理解，除非另有指示或以其他方式自上下文及一般熟習此項技術者之理解顯而易見，否則表示為範圍之值可在本發明之不同實施例中採用所陳述範圍內之任何特定值或子範圍，除非上下文另外明確規定，否則達到該範圍下限之單位的十分之一。
另外，應理解，屬於先前技術內之本發明之任何特定實施例可自任何一或多個請求項中明確排除。因為此類實施例被認為是一般熟習此項技術者所已知，故其可經排除，即使未在本文中明確地闡述該排除。出於任何原因，無論是否與先前技術之存在有關，本發明之組合物之任何特定實施例(例如任何抗生素、治療或活性成分；任何產生方法；任何使用方法；等)可自任何一或多個請求項中排除。
應理解，已使用之文字係描述性而非限制性文字，且可在不背離本發明在其較廣泛態樣中之真實範疇及精神的情況下，在隨附申請專利範圍之範圍內作出改變。
儘管已經相對於所描述之若干實施例以一定的長度及一些特殊性描述了本發明，但並非意指本發明應受限於任何此類細節或實施例或任何特定實施例，而是應參考隨附申請專利範圍進行解釋，以便考慮到先前技術提供對此類申請專利範圍之儘可能最廣泛的解釋，並因此有效地涵蓋本發明之預期範疇。
本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻均以全文引用之方式併入本文中。在有衝突之情況下，將以本說明書(包括定義)為準。另外，章節標題、材料、方法及實例僅為說明性的而不意欲為限制性的。 實例  實例1.異常衣殼蛋白裂解產物之鑑別
具有7個胺基酸之肽插入物的重組合成AAV9變異衣殼(SEQ ID NO: 5)係使用商業桿狀病毒表現載體(BEV)系統表現於Sf9昆蟲細胞中。
在處理及CsCl梯度純化之後，於SDS-PAGE凝膠上分餾AAV衣殼蛋白且針對蛋白進行銀染色。除VP1、VP2及VP3以外，出人意料之18 kDa、43 kDa及52 kDa蛋白質出現於如圖1中所示之AAV藥物物質中。
此等額外蛋白質之豐度隨純化批次及隨儲存時間推移而變化。來源於BEV/Sf9表現之AAV藥物物質之穩定性因此受損。
當同一AAV衣殼構築體由哺乳動物細胞(HEK293)中之質體轉染表現時，未發現任何出人意料之蛋白質。然而，若基因療法應用需要極大量AAV載體，則哺乳動物細胞轉染不為AAV產生之理想選項。
最小18 kDa蛋白質之N端定序揭露其為如圖2中所示之VP1、VP2及VP3所共用之C端肽片段。
52 kDa及43 kDa肽片段於銀染色SDS-PAGE凝膠中之觀測結果與有18 kDa自其共同C端裂解之VP2及VP3蛋白相關。
自VP1之類似裂解預測的67 kDa肽片段不可觀測，因為其將與70 kDa未裂解VP2蛋白共遷移。吾人不能以至裂解產物之100%轉化率來產生AAV樣本，因此吾人不能確認VP1經裂解。此等資料導向表明蛋白酶自VP1、VP2及VP3之C端裂解18 kDa肽。
當使用針對VP1、VP2及VP3之共同C端區之抗體藉由抗體親和管柱純化時，西方墨點免疫偵測揭露僅形成18 kDa C端裂解產物。當存在絲胺酸/半胱胺酸蛋白酶抑制劑混合物時，不再偵測到18 kDa肽。此等資料表明絲胺酸及/或半胱胺酸蛋白酶參與18 kDa C端裂解產物之出現。 實例2. 蛋白酶鑑別
大部分商業BEV係基於桿狀病毒AcMNPV或與桿狀病毒BmNPV緊密相關。桿狀病毒v-cath 基因編碼組織蛋白酶樣蛋白酶(病毒組織蛋白酶)。v-cath 基因與桿狀病毒殼質酶基因ChiA 連接。除幾個例外，幾乎所有約80個經定序桿狀病毒基因組具有v-cath 及ChiA 基因。v-cath基因之比對參見圖3。
考慮到保守，可得出結論，v-cath 及 ChiA 為必需桿狀病毒基因且應完整保留於用於產生重組蛋白之桿狀病毒表現載體(BEV)中。
在發現v-cath 基因之後不久證實，V-CATH蛋白酶在鱗翅目宿主中之組織液化及桿狀病毒感染黑變病變中起到一定作用(Slack等人,1995 J.Gen Virol.1091-8)。
在細胞培養物中之桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)中，V-CATH之存在與感染結束時細胞溶解及多角包含體(polyhedral occlusion body)之釋放相關。
然而，雖然V-CATH在於感染結束時增強桿狀病毒包含體自宿主之分散中起到作用，但不認為V-CATH為重組蛋白藉由BEV表現於昆蟲細胞培養物中所需。
進行篩選以鑑別所利用BEV系統中之v-cath 基因。雖然用於於Sf9細胞中表現AAV衣殼蛋白之BEV系統常用於重組蛋白表現，但BEV之完整序列不可用於確定v-cath 是否仍存在於BEV系統中。
進行PCR篩選以確定v-cath 基因是否發現於野生型AcMNPV桿狀病毒中。三種不同PCR篩選確認BEV系統中之v-cath 基因座與將自wt AcMNPV預測之基因座相比無變化。參見圖4。 實例3. BEV系統中v-cath缺失之產生及作用
研究缺失v-cath 基因之BEV構築體，包括v-cath 基因缺失對產生重組合成AAV衣殼構築體之可能影響。亦研究對應蛋白質裂解、穩定性、細胞活力、細胞直徑、細胞外觀及產生效率。
具有1.4×106 個細胞/毫升的120 ml之Sf9細胞之振盪燒瓶經具有AAV BEV1 (標準BEV表現載體)或AAV BEV 2 (包括SEQ ID NO: 2之構築體的v-cath缺失BEV表現載體)之120 μl桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)感染。亦包括具有未感染之Sf9細胞之對照燒瓶。在27℃下以130 rpm培育振盪燒瓶。酶24小時收集細胞樣本，持續6天。 細胞活力
藉由混合細胞與0.2% w/v錐蟲藍染料及於Nexcelom Cellometer Auto T4上計數來測定細胞活力。標準BEV1感染及v-cath 缺失之BEV2感染在感染時程內產生完全類似之Sf9細胞活力特徵曲線(圖5)及細胞計數特徵曲線(圖6)。 細胞直徑
使用Nexcelom Cellometer Auto T4測定細胞直徑。標準BEV1感染及v-cath 缺失之BEV2感染直至感染後96小時產生完全類似之Sf9細胞直徑(圖7)。在感染後之極後期時間，直徑不同。 細胞外觀
未感染之Sf9細胞、AAV-BEV1及AAV-BEV2感染之Sf9細胞在用錐蟲藍染色之後的顯微鏡影像揭露BEV1與BEV2細胞之間的類似形態。 蛋白酶活性
對病毒感染之Sf9細胞溶解物進行偶氮酪蛋白(azocasein)蛋白酶活性分析，其自Slac等人2004, J Gen Virol. 211-9進行以偵測V-CATH之分析調適而來。將所收集Sf9細胞於PBS (pH7.4)中稀釋至5×108 個細胞/毫升，隨後於50 μl體積之PBS中進行一系列稀釋。將稀釋液與50 μl蛋白酶分析緩衝液C (6.7 mM檸檬酸；10 mM檸檬酸Na；0.25%Triton X-100；46 mM NaCl；3.3 mM磷酸鹽；0.9 mM KCl；3.3 mM EDTA)組合。隨後將此混合物與50 μl 0.17% w/v偶氮酪蛋白組合。緩衝液C混合物之最終pH經量測為pH 5.87。
在37℃下，在不振盪之情況下將樣本於96孔U形底培養盤中培育14小時。將50 μl體積之20% v/v三氯乙酸添加至各孔，且在混合後，在2100x g下將96孔培養盤離心5分鐘。將體積150 μl之上清液轉移至平底96孔培養盤，且在光譜光度計上量測OD405。
未感染之Sf9細胞及v-cath 缺失之BEV2感染細胞針對偶氮酪蛋白受質具有類似水準之蛋白酶活性。相比之下，隨著感染進展，經標準BEV1感染之Sf9細胞針對偶氮酪蛋白受質顯示提高水準之蛋白酶活性。參見圖8。
亦使用緩衝液A代替先前描述之緩衝液C進行偶氮酪蛋白蛋白酶分析。緩衝液A(200 mM精胺酸；0.25%Triton X-100；46 mM NaCl；3.3 mM磷酸鹽；0.9 mM KCl)。隨後將此混合物與50 μl 0.17% w/v偶氮酪蛋白組合。緩衝液A之pH經量測為pH 6.89。
發現緩衝液A增加與標準BEV1 Sf9細胞溶解物相關之蛋白酶活性。v-cath 缺失BEV2 Sf9細胞溶解物即使在緩衝液A存在下仍保留低水準之蛋白酶活性。參見圖9。
由於先前研究顯示V-CATH偏好酸性條件，故發現V-CATH相關之蛋白酶活性在中性pH下增加係讓人意外的。
雖然不希望受理論束縛，但胺基之存在很可能充當底物之溶劑。本發明者先前已展示偶氮酪蛋白受質之v-cath 活性在緩衝液中之脲存在下顯著增強(Slack等人,1995)。因此，精胺酸緩衝液很可能以類似方式作用，亦即，其改變底物蛋白質或衣殼之構形且將殘基暴露於蛋白酶。
因此，吾人已確定精胺酸增強AAV純化產率。 降解產物之西方墨點消除
將藉由標準BEV1感染及v-cath 缺失之BEV2感染表現之AAV在緩衝液A裂解緩衝液中進行處理，隨後使用抗VP1、VP2、VP3抗體(American Research Products, 產品#: 03-61058)藉由西方免疫墨點偵測AAV衣殼。v-cath 之缺失消除了降解產物。參見圖10A及圖10B。 結論
本發明提出可用於解決Sf9/桿狀病毒系統中產生之AAV衣殼之經桿狀病毒編碼之蛋白酶降解的構築體、系統及方法。添加蛋白酶抑制劑得到不良溶液，因為其通常昂貴且殘餘物在下游治療產物中可能具有毒性作用。
此處之證據顯示V-CATH為自桿狀病毒表現AAV藥物物質中之VP1、VP2及VP3裂解18 kDa C端片段的蛋白酶。
BEV系統中存在V-CATH的額外潛在問題在於可能損害AAV藥物物質之長期穩定性，因為蛋白酶亦可結合於其他蛋白質且V-CATH可能與一些AAV共純化。
前述及其他目標、特徵及優勢將自如隨附圖式中所說明之本發明特定實施例的以下描述顯而易見。圖式不一定按比例或全面，而是著重說明本發明之各種實施例的原理。
圖1為使用BEV/sf9系統由AAV9變體衣殼產生之純化AAV衣殼蛋白的銀染色凝膠。
圖2為VP1、VP2及VP3衣殼蛋白與所鑑別裂解產物(包括18kDa產物)比對的比對結果。
圖3為v-cath 桿狀病毒基因之保守之比較。根據Handbook of Proteolytic Enzymes 2003 (A.J. Barrett、Rawlings及J.F Woesner編) Academic Press, 第2版, [557] Viral cathepsin, J. Slack。
圖4A說明v-cath 基因之三個PCR篩檢。
圖4B為顯示v-cath 基因座如所預測呈現的三個PCR篩檢之PCR產物之凝膠。
圖5為顯示v-cath 缺失對細胞活力之影響的圖表。
圖6為顯示v-cath 缺失對總細胞計數之影響的圖表。
圖7為顯示v-cath 缺失對細胞直徑之影響的圖表。
圖8為顯示v-cath 缺失對蛋白酶活性之影響的圖表。
圖9為顯示v-cath 缺失對替代緩衝液中之蛋白酶活性之影響的圖表。
圖10A為顯示v-cath 缺失對精胺酸緩衝液中降解產物之外觀之影響的凝膠。
圖10B為顯示v-cath 缺失對精胺酸緩衝液中降解產物之外觀之影響的凝膠。
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Claims (17)

  1. 一種腺相關病毒(AAV)表現構築體，其包含VP編碼區，該VP編碼區包含編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白的核苷酸序列。
  2. 如請求項1之AAV表現構築體，其中該AAV表現構築體為桿狀病毒表現載體(BEV)。
  3. 如請求項2之AAV表現構築體，其中該BEV不包括功能性桿狀病毒v-cath 基因。
  4. 如請求項3之AAV表現構築體，其中該BEV缺乏該桿狀病毒v-cath 基因之部分或整體。
  5. 如請求項3之AAV表現構築體，其中該BEV包含該桿狀病毒v-cath 基因之突變不活化型式。
  6. 如請求項3之AAV表現構築體，其中該一或多種AAV衣殼蛋白之血清型係選自VOY101、VOY201、AAVPHP.B (PHP.B)、AAVPHP.A (PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH1.1-32、AAVTH1.1-35、AAVPHP.B2 (PHP.B2)、AAVPHP.B3 (PHP.B3)、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3 (G2A3)、AAVG2B4 (G2B4)、AAVG2B5 (G2B5)、PHP.S、AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突變體、AAVrh8R R533A突變體、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV Shuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAV Shuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真實類型AAV (ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAV CHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAV CLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAV CLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAV CSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、AAVrh20、AAVrh32/33、AAVrh39、AAVrh46、AAVrh73、AAVrh74、AAVhu.26或其變異體或嵌合體。
  7. 如請求項3之AAV表現構築體，其中該一或多種AAV衣殼蛋白之該血清型為VOY101。
  8. 一種AAV病毒產生系統，其包含AAV病毒生產性細胞及如請求項3之該AAV表現構築體。
  9. 如請求項8之AAV病毒產生系統，其中該AAV病毒產生系統包含AAV有效載荷構築體。
  10. 如請求項9之AAV病毒產生系統，其中該AAV病毒生產性細胞為昆蟲細胞。
  11. 如請求項9之AAV病毒產生系統，其中該AAV病毒生產性細胞為Sf9細胞。
  12. 如請求項9之AAV病毒產生系統，其中該AAV病毒生產性細胞為Sf21細胞。
  13. 一種在AAV病毒生產性細胞中產生重組腺相關病毒(rAAV)載體的方法，該方法包含：提供AAV病毒產生系統，該AAV病毒產生系統包含AAV表現構築體及AAV有效載荷構築體，其中該AAV表現構築體包含如請求項3之該AAV表現構築體；將該AAV病毒產生系統轉染至AAV病毒生產性細胞中；將該AAV病毒生產性細胞暴露於允許該AAV病毒生產性細胞將該AAV表現構築體及該AAV有效載荷構築體加工成rAAV粒子的條件；及自該AAV病毒生產性細胞收集該等rAAV粒子。
  14. 如請求項13之方法，其中該AAV病毒生產性細胞為昆蟲細胞。
  15. 如請求項13之方法，其中該AAV病毒生產性細胞為Sf9細胞或Sf21細胞。
  16. 一種在使用桿狀病毒表現載體(BEV)之桿狀病毒表現系統中減少AAV蛋白之蛋白酶降解的方法，該方法包含使該BEV缺失該桿狀病毒v-cath 基因之部分或整體。
  17. 一種在使用桿狀病毒表現載體(BEV)之桿狀病毒表現系統中減少AAV蛋白之蛋白酶降解的方法，該方法包含以突變方式使來自該BEV之該桿狀病毒v-cath 基因不活化。
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