JP2022505106A - バキュロウイルス／Ｓｆ９システムにおけるｒＡＡＶの大規模産生のための発現ベクター - Google Patents

バキュロウイルス／Ｓｆ９システムにおけるｒＡＡＶの大規模産生のための発現ベクター Download PDF

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Abstract

Figure 2022505106000001
本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の産生における使用のための方法およびシステムを記載する。特定の実施形態において、産生プロセスおよびシステムは、ＡＡＶ粒子の産生においてバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）を使用する。特定の実施形態において、産生プロセスおよびシステムは、ウイルス産生細胞としてＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９またはＳｆ２１）を使用する。特定の実施形態において、産生プロセスおよびシステムは、ｖ－ｃａｔｈ遺伝子の部分もしくは全体を欠くまたはｖ－ｃａｔｈ遺伝子の、突然変異により不活性化されたバージョンを含むＢＥＶを使用する。

Description

本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の産生における使用のための方法およびシステムを記載する。特定の実施形態において、産生プロセスおよびシステムは、ＡＡＶ粒子の産生においてバキュロウイルス発現ベクター（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ、ＢＥＶ）を使用する。特定の実施形態において、産生プロセスおよびシステムは、ウイルス産生細胞としてＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９またはＳｆ２１）を使用する。特定の実施形態において、産生プロセスおよびシステムは、ｖ－ｃａｔｈ遺伝子を欠くまたはｖ－ｃａｔｈ遺伝子の、突然変異により不活性化されたバージョンを含むＢＥＶを使用する。
ＡＡＶは、最も広く研究され利用される、哺乳類細胞への遺伝子移入のためのウイルスベクターの１つとして浮上してきた。例えば、非特許文献１および非特許文献２（その内容は全体として本願明細書に援用される）を参照されたい。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、治療的遺伝子送達のための有望な候補であり、臨床試験において安全かつ有効であると証明されている。この目的のための改善されたＡＡＶ粒子の設計および産生は、活発な研究分野である。
トラッチンら（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，５（１１）：３２５１－３２６０（１９８５） グリムら（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（１５）：２４４５－２４５０（１９９９）
ＡＡＶ分野における開発が進展するなか、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ粒子）および対応する遺伝子療法産生材料、例えば、バキュロウイルス感染昆虫細胞（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ、ＢＩＩＣ）を産生するための改善されたシステムおよび方法の必要が、依然として存在する。
本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの産生における使用のための操作された核酸コンストラクトを提示する。本開示は、操作された核酸コンストラクトを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生するためのウイルス産生システムおよびウイルス産生細胞（例えば、昆虫細胞）を記載する。本開示は、本開示のウイルス産生細胞を産生する方法、ならびに本開示の操作された核酸コンストラクト、ウイルス産生システムおよびウイルス産生細胞を使用して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生する方法を記載する。
本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの産生における使用のための核酸コンストラクトを記載する。特定の実施形態において、核酸コンストラクトは、ＡＡＶ発現コンストラクトである。
本開示は、本開示のウイルス産生細胞を産生する方法を記載する。特定の実施形態において、方法は、以下を含む：本開示の１つ以上の発現コンストラクトを提供する工程；本開示のペイロードコンストラクトを提供する工程；１つ以上の発現コンストラクトおよびペイロードコンストラクトをウイルス産生細胞中にトランスフェクトする工程。特定の実施形態において、ウイルス産生細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、ウイルス産生細胞は、昆虫細胞である。特定の実施形態において、ウイルス産生細胞は、ＡＡＶウイルス産生細胞である。特定の実施形態において、方法は、以下を含む：本開示の１つ以上のＡＡＶ発現コンストラクトを提供する工程；本開示のＡＡＶペイロードコンストラクトを提供する工程；ならびに１つ以上のＡＡＶ発現コンストラクトおよびＡＡＶペイロードコンストラクトをＡＡＶウイルス産生細胞中にトランスフェクトする工程。特定の実施形態において、方法は、以下を含む：本開示のウイルス産生システムを提供する工程；およびウイルス産生システムをウイルス産生細胞中にトランスフェクトする工程。
本開示は、ＡＡＶ粒子産生を改善するための方法および戦略を提示する。かかる方法としては、１つ以上の組換えバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）を使用して昆虫細胞株においてＡＡＶ粒子を産生する方法が挙げられる。特定の実施形態において、ＢＥＶは、ｖ－ｃａｔｈ遺伝子の部分もしくは全体を欠くまたはｖ－ｃａｔｈ遺伝子の、突然変異により不活性化されたバージョンを含む。特定の実施形態において、ＢＥＶは、ｖ－ｃａｔｈ遺伝子の部分または全体を欠く。特定の実施形態において、ＢＥＶは、ｖ－ｃａｔｈ遺伝子の、突然変異により不活性化されたバージョンを含む。
本開示は、ＡＡＶ産生タンパク質、特にＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）におけるより高い収率およびより少ないタンパク質分解をもたらす、ＡＡＶ粒子産生を改善するための方法および戦略を提示する。
特定の実施形態において、本開示の方法は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞株が（限定はされないが）挙げられる昆虫細胞を含むウイルス産生細胞を用いる産生システムにおいて使用することができる。特定の実施形態において、本開示の方法は、組換えＢＥＶシステムを用いる産生システム、例えば、ＢａｃＭａｇｉｃ（商標）（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））、ＦｌａｓｈＢＡＣ（商標）（オックスフォードエクスプレッションテクノロジーズ社（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））およびＢｅｓｔＢａｃ ２．０（商標）（エクスプレッションシステムズ社（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ））において使用することができる。
特定の実施形態において、本開示は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から選択される１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＶＰをコードする領域を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現コンストラクトを提示する。特定の実施形態において、ＡＡＶ発現コンストラクトは、バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）である。特定の実施形態において、ＢＥＶは、機能的バキュロウイルスｖ－ｃａｔｈ遺伝子を含まない。特定の実施形態において、ＢＥＶは、バキュロウイルスｖ－ｃａｔｈ遺伝子の部分または全体を欠く。特定の実施形態において、ＢＥＶは、バキュロウイルスｖ－ｃａｔｈ遺伝子の、突然変異により不活性化されたバージョンを含む。
特定の実施形態において、１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質の血清型は、ＶＯＹ１０１、ＶＯＹ２０１、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ（ＰＨＰ．Ｂ）、ＡＡＶＰＨＰ．Ａ（ＰＨＰ．Ａ）、ＡＡＶＧ２Ｂ－２６、ＡＡＶＧ２Ｂ－１３、ＡＡＶＴＨ１．１－３２、ＡＡＶＴＨ１．１－３５、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２（ＰＨＰ．Ｂ２）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３（ＰＨＰ．Ｂ３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３（Ｇ２Ａ３）、ＡＡＶＧ２Ｂ４（Ｇ２Ｂ４）、ＡＡＶＧ２Ｂ５（Ｇ２Ｂ５）、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ １９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ突然変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ突然変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－２－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶ ＳＭ １０－２、ＡＡＶシャッフル１００－１、ＡＡＶシャッフル１００－３、ＡＡＶシャッフル１００－７、ＡＡＶシャッフル１０－２、ＡＡＶシャッフル１０－６、ＡＡＶシャッフル１０－８、ＡＡＶシャッフル１００－２、ＡＡＶ ＳＭ １０－１、ＡＡＶ ＳＭ １０－８、ＡＡＶ ＳＭ １００－３、ＡＡＶ ＳＭ １００－１０、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、トゥルータイプＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ １０、ジャパニーズＡＡＶ １０血清型、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．１、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．１０、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．２、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．５、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．７、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．８、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｂ７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｂ７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ１、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ２、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ３、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ４、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ－ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ６、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ７、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ８、ＡＡＶ ＣＨｔ－１、ＡＡＶ ＣＨｔ－２、ＡＡＶ ＣＨｔ－３、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．１、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．１０、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．５、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．６、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．７、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．８、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ１、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ２、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ５、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ６、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ８、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ９、ＡＡＶ ＣＫｄ－１、ＡＡＶ ＣＫｄ－１０、ＡＡＶ ＣＫｄ－２、ＡＡＶ ＣＫｄ－３、ＡＡＶ ＣＫｄ－４、ＡＡＶ ＣＫｄ－６、ＡＡＶ ＣＫｄ－７、ＡＡＶ ＣＫｄ－８、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ１、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ２、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ５、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ６、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ７、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ８、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ１、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ２、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ５、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ６、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ９、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ１、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ２、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ３、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ４、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ５、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ６、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ７、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－１、ＡＡＶ ＣＬｖ１－１、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－１０、ＡＡＶ ＣＬｖ１－２、ＡＡＶ ＣＬｖ－１２、ＡＡＶ ＣＬｖ１－３、ＡＡＶ ＣＬｖ－１３、ＡＡＶ ＣＬｖ１－４、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－７、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－８、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－９、ＡＡＶ ＣＬｖ－２、ＡＡＶ ＣＬｖ－３、ＡＡＶ ＣＬｖ－４、ＡＡＶ ＣＬｖ－６、ＡＡＶ ＣＬｖ－８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｅ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ１

、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ１１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ９、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ９、ＡＡＶ ＣＳｐ－１、ＡＡＶ ＣＳｐ－１０、ＡＡＶ ＣＳｐ－１１、ＡＡＶ ＣＳｐ－２、ＡＡＶ ＣＳｐ－３、ＡＡＶ ＣＳｐ－４、ＡＡＶ ＣＳｐ－６、ＡＡＶ ＣＳｐ－７、ＡＡＶ ＣＳｐ－８、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．１０、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．２、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．４、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．５、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．６、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．７、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．８、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．９、ＡＡＶ ＣＳｐ－９、ＡＡＶ．ｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶ．ＶＲ－３５５、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶＦ１／ＨＳＣ１、ＡＡＶＦ１１／ＨＳＣ１１、ＡＡＶＦ１２／ＨＳＣ１２、ＡＡＶＦ１３／ＨＳＣ１３、ＡＡＶＦ１４／ＨＳＣ１４、ＡＡＶＦ１５／ＨＳＣ１５、ＡＡＶＦ１６／ＨＳＣ１６、ＡＡＶＦ１７／ＨＳＣ１７、ＡＡＶＦ２／ＨＳＣ２、ＡＡＶＦ３／ＨＳＣ３、ＡＡＶＦ４／ＨＳＣ４、ＡＡＶＦ５／ＨＳＣ５、ＡＡＶＦ６／ＨＳＣ６、ＡＡＶＦ７／ＨＳＣ７、ＡＡＶＦ８／ＨＳＣ８、ＡＡＶＦ９／ＨＳＣ９、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶｒｈ３２／３３、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４６、ＡＡＶｒｈ７３、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ．２６、またはそれらのバリアントもしくはキメラから選択される。特定の実施形態において、１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質の血清型は、ＶＯＹ１０１である。
特定の実施形態において、本開示は、本開示のＡＡＶウイルス産生細胞およびＡＡＶ発現コンストラクトを含むＡＡＶウイルス産生システムを提示する。特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス産生システムは、ＡＡＶペイロードコンストラクトを含む。特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス産生細胞は、昆虫細胞である。特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス産生細胞は、Ｓｆ９細胞である。特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス産生細胞は、Ｓｆ２１細胞である。
特定の実施形態において、本開示は、ＡＡＶウイルス産生細胞において組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生する方法を提示する。特定の実施形態において、方法は、本開示のＡＡＶ発現コンストラクトおよびＡＡＶペイロードコンストラクトを含むＡＡＶウイルス産生システムを提供する工程；ＡＡＶウイルス産生システムをＡＡＶウイルス産生細胞中にトランスフェクトする工程；ＡＡＶウイルス産生細胞がＡＡＶ発現コンストラクトおよびＡＡＶペイロードコンストラクトをｒＡＡＶ粒子へと加工することを可能にする条件に、ＡＡＶウイルス産生細胞を曝露させる工程；ならびにＡＡＶウイルス産生細胞からｒＡＡＶ粒子を収集する工程、を含む。特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス産生細胞は、昆虫細胞である。特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス産生細胞は、Ｓｆ９細胞またはＳｆ２１細胞である。
特定の実施形態において、本開示は、バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）を使用するバキュロウイルス発現システムにおけるＡＡＶタンパク質のプロテイナーゼ分解を低減させる方法を提示する。特定の実施形態において、方法は、ＢＥＶのバキュロウイルスｖ－ｃａｔｈ遺伝子の部分または全体を欠失させる工程を含む。特定の実施形態において、方法は、ＢＥＶのバキュロウイルスｖ－ｃａｔｈ遺伝子を突然変異により不活性化する工程を含む。
本開示の様々な実施形態の詳細は、以下の説明に示される。本開示の他の特徴、目的および利点は、説明、図面、および特許請求の範囲から明らかであろう。説明では、単数形は、文脈により明白にそうでないと指示されない限り、複数形もまた含む。別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、本明細書の記載が優先されるものとする。
先述および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面に例示される、本開示の特定の実施形態についての以下の説明から明らかであろう。図面は必ずしも原寸に比例でも包括的でもなく、本開示の様々な実施形態の原理を説明することに重点を置いている。
ＢＥＶ／ｓｆ９システムを使用した、ＡＡＶ９バリアントカプシドに起因する精製されたＡＡＶカプシドタンパク質の銀染色ゲルの図。 １８ｋＤａ産物を含む同定された切断産物とアラインメントさせた、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質のアラインメントの図。 ｖ－ｃａｔｈバキュロウイルス遺伝子の保存性の比較の図。タンパク質分解性酵素のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ）２００３（エイ．ジェイ バレット、ローリングス（Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｒａｗｌｉｎｇｓ）およびジェイ．エフ ウェスナー（Ｊ．Ｆ Ｗｏｅｓｎｅｒ）編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第２版，［５５７］ウイルスカテプシン（Ｖｉｒａｌ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ），ジェイ．スラック（Ｊ．Ｓｌａｃｋ）より。 ｖ－ｃａｔｈ遺伝子についての３つのＰＣＲスクリーニングを示す図。 ｖ－ｃａｔｈ遺伝子座が予測通りに出現することを示す３つのＰＣＲスクリーニングのＰＣＲ産物のゲルの図。 細胞バイアビリティに対するｖ－ｃａｔｈ欠失の影響を示す図。 総細胞計数に対するｖ－ｃａｔｈ欠失の影響を示す図。 細胞直径に対するｖ－ｃａｔｈ欠失の影響を示す図。 プロテアーゼ活性に対するｖ－ｃａｔｈ欠失の影響を示す図。 代替的緩衝液におけるプロテアーゼ活性に対するｖ－ｃａｔｈ欠失の影響を示す図。 アルギニン緩衝液における分解産物の出現に対するｖ－ｃａｔｈ欠失の影響を示すゲルの図。 アルギニン緩衝液における分解産物の出現に対するｖ－ｃａｔｈ欠失の影響を示すゲルの図。
Ｉ．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
概説
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、一本鎖ＤＮＡウイルスゲノムによって特徴付けられるパルボウイルス科の小型非エンベロープ二十面体カプシドウイルスである。パルボウイルス科ウイルスは、２つの亜科：脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科および無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科からなる。パルボウイルス科は、限定はされないが、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、およびヒツジ種を含む脊椎動物宿主において複製可能なＡＡＶを含むディペンドウイルス属を含む。
パルボウイルスおよびパルボウイルス科の他のメンバーは、ケネスＩ．ベルン（Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ）、「パルボウイルス科：ウイルスおよびそれらの複製（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第３版、１９９６年）の第６９章（パルボウイルスに関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）に概説されている。
ＡＡＶは、比較的単純な構造、宿主ゲノム中への組込みなしにかつ複製することもなしに広範な細胞（静止状態細胞および分裂細胞が含まれる）に感染する能力、および比較的良性の免疫原性プロファイルに起因して、生物学的ツールとして有用であることが証明されている。ウイルスのゲノムは、所望のペイロードを有するように、または特定の組織をターゲティングし、所望のペイロードを発現もしくは送達するように操作されている機能的組換えウイルスまたはウイルス粒子をアセンブリするための最低限の成分を含有するように操ることができる。
ＡＡＶウイルスゲノム
野生型ＡＡＶウイルスゲノムは、およそ５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長の線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子である。末端逆位配列（ＩＴＲ）は、伝統的には、５’末端および３’末端の両方においてウイルスゲノムにキャップをし、ウイルスゲノムに複製起点を提供する。理論によって束縛されることを望むものではないが、ＡＡＶウイルスゲノムは、典型的には、２つのＩＴＲ配列を含む。これらのＩＴＲは、エネルギー的に安定した二本鎖領域を形成するｓｓＤＮＡの５’末端および３’末端の自己相補的領域（野生型ＡＡＶでは１４５ｎｔ）によって規定される特徴的なＴ形ヘアピン構造を有する。二本鎖ヘアピン構造は、限定はされないが、宿主ウイルス複製細胞の内因性ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして機能することによってＤＮＡ複製の起点として働くことを含む、複数の機能を含む。
野生型ＡＡＶウイルスゲノムは、２つのオープンリーディングフレームについてのヌクレオチド配列を更に含み、１つのオープンリーディングフレームは、４つの非構造Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ遺伝子によってコードされるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０）についてのものであり、１つのオープンリーディングフレームは、３つのカプシドすなわち構造タンパク質（カプシド遺伝子すなわちＣａｐ遺伝子によってコードされるＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）についてのものである。Ｒｅｐタンパク質は、複製およびパッケージングにとって重要であるが、カプシドタンパク質は、アセンブルして、ＡＡＶのタンパク質シェルすなわちＡＡＶカプシドを創出する。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、ｐ５プロモータから転写され得、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０は、ｐ１９プロモータから転写され得る。選択的スプライシングならびに選択的開始コドンおよびプロモータは、単一のオープンリーディングフレームからの４つの異なるＲｅｐタンパク質の生成および単一のオープンリーディングフレームからの３つのカプシドタンパク質の生成をもたらす。ＡＡＶ血清型によって異なるが、非限定的な例として、ＡＡＶ９／ｈｕ．１４（米国特許第７，９０６，１１１号明細書（ＡＡＶ９／ｈｕ．１４に関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）の配列番号１２３）の場合、ＶＰ１は、アミノ酸１～７３６を指し、ＶＰ２は、アミノ酸１３８～７３６を指し、ＶＰ３は、アミノ酸２０～７３６を指す。言い換えると、ＶＰ１は全長カプシド配列であるが、ＶＰ２およびＶＰ３は、全体のより短い成分である。結果として、ＶＰ３領域中の配列における変化は、ＶＰ１およびＶＰ２に対する変化でもあるが、ＶＰ３がこれら３つのうち最も短い配列なので、親配列と比較したパーセント差異は、ＶＰ３で最も高くなるであろう。アミノ酸配列に関連して本明細書に記載しているが、これらのタンパク質をコードする核酸配列も、同様に記載することができる。一緒になって、３つのカプシドタンパク質はアセンブルして、ＡＡＶカプシドタンパク質を創出する。理論によって束縛されることを望むものではないが、ＡＡＶカプシドタンパク質は、典型的には、１：１：１０のモル比のＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３を含む。本明細書で使用されるとき、「ＡＡＶ血清型」は、ＡＡＶカプシドによって主に定義される。一部の場合において、ＩＴＲもまた、ＡＡＶ血清型によって具体的に記載される（例えば、ＡＡＶ２／９）。
生物学的ツールとしての使用のために、野生型ＡＡＶウイルスゲノムは、ｒｅｐ／ｃａｐ配列を、少なくとも１つのＩＴＲ領域と共にペイロード領域を含む核酸配列で置き換えるように改変することができる。典型的には、組換えＡＡＶウイルスゲノム中には、２つのＩＴＲ領域が存在する。ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ＡＡＶ粒子を生成するために、産生の間にトランスで提供され得る。
コード化異種ペイロードに加えて、ＡＡＶベクターは、全体または一部が、任意の天然に存在するおよび／または組換えのＡＡＶ血清型ヌクレオチド配列またはバリアントのウイルスゲノムを含み得る。ＡＡＶバリアントは、概して物理的および機能的同等物であるコンストラクトを産生し、同様の機序によって複製し、同様の機序によってアセンブルするように、核酸レベル（ゲノムまたはカプシド）およびアミノ酸レベル（カプシド）において有意に相同である配列を有し得る。チオリニら（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒ．７１：６８２３－３３（１９９７）；スリバスタバら（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒ．４５：５５５－６４（１９８３）；チオリニら（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒ．７３：１３０９－１３１９（１９９９）；ラトリッジら（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒ．７２：３０９－３１９（１９９８）；およびウーら（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒ．７４：８６３５－４７（２０００）（ＡＡＶバリアントおよび同等物に関して、その各々の内容は全体として本願明細書に援用される）を参照されたい。
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子、ウイルスゲノムおよび／またはペイロード、ならびにその使用の方法は、国際公開第２０１７１８９９６３号パンフレット（ＡＡＶ粒子、ウイルスゲノムおよび／またはペイロードに関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）に記載されている通りであってよい。
本開示のＡＡＶ粒子は、当業者に明らかなかかる製剤の任意のバリエーションを含む本開示の遺伝子療法製剤のいずれかで製剤化することができる。本出願における「ＡＡＶ粒子」、「ＡＡＶ粒子製剤」および「製剤化されたＡＡＶ粒子」への言及は、製剤化され得るＡＡＶ粒子およびいずれの限定もなしに製剤化されるＡＡＶ粒子を指す。
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、ウイルスゲノム内に機能的ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする配列を欠如する、複製欠損型である組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子である。これらの欠損ＡＡＶ粒子は、ほとんどのまたは全ての親コード配列を欠如してもよく、１つまたは２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列、および細胞、組織、臓器または生物への送達のための目的の核酸（即ち、ペイロード）のみを本質的に有してもよい。
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、その中にコードされたコード配列の複製、転写および翻訳を提供する少なくとも１つの制御エレメントを含む。コード配列が適切な宿主細胞において複製、転写および／または翻訳されることができる限り、全ての制御エレメントが常に存在する必要はない。発現制御エレメントの非限定的な例としては、転写開始および／もしくは終結のための配列、プロモータおよび／もしくはエンハンサー配列、効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳有効性を増強する配列（例えば、コザックコンセンサス配列）、タンパク質安定性を増強する配列、ならびに／またはタンパク質プロセシングおよび／もしくは分泌を増強する配列が挙げられる。
本開示によれば、療法および／または診断に使用されるＡＡＶ粒子は、目的の核酸ペイロードまたはカーゴの形質導入に必要な最低限の成分へと純化または縮小されているウイルスを含む。このように、ＡＡＶ粒子は、野生型ウイルスに見られる有害な複製および／または組込み特徴を欠きながらも、特異的送達ビヒクルとして操作される。
本開示のＡＡＶ粒子は、組換え的に産生されてもよく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）親または参照配列に基づいてもよい。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、本明細書に記載される核酸などの異種分子を輸送する、形質導入する、またはその他担体として働く、任意の分子または部分である。
一本鎖ＡＡＶウイルスゲノム（例えば、ｓｓＡＡＶ）に加えて、本開示は、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ウイルスゲノムも提供する。ｓｃＡＡＶベクターゲノムは、共にアニーリングして二本鎖ＤＮＡを形成するＤＮＡ鎖を含有する。第２鎖の合成をスキップすることにより、ｓｃＡＡＶは、細胞において迅速に発現することが可能である。
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶウイルスゲノムは、ｓｃＡＡＶである。特定の実施形態において、本開示のＡＡＶウイルスゲノムは、ｓｓＡＡＶである。
ＡＡＶ粒子を産生および／または改変するための方法は、シュードタイプＡＡＶ粒子（国際公開第２０００２８００４号パンフレット；国際公開第２００１２３００１号パンフレット；国際公開第２００４１１２７２７号パンフレット；国際公開第２００５００５６１０号パンフレットおよび国際公開第２００５０７２３６４号パンフレット（ＡＡＶ粒子を産生および／または改変することに関して、その各々の内容は全体として本願明細書に援用される））など、当該技術分野において開示されている。
ＡＡＶ粒子は、送達の効率を増強するために改変されてもよい。かかる改変されたＡＡＶ粒子は、効率的にパッケージングすることができ、高頻度でおよび最低限の毒性で標的細胞への感染を成功させるために使用することができる。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のカプシドは、米国特許出願公開第２０１３０１９５８０１号明細書（送達の効率を増強するためにＡＡＶ粒子を改変することに関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）に記載される方法に従って操作される。
特定の実施形態において、本開示のポリペプチドまたはタンパク質をコードするペイロード領域を含むＡＡＶ粒子は、哺乳類細胞中に導入されてもよい。
末端逆位配列（ＩＴＲ）
本開示のＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＩＴＲ領域とペイロード領域とを有するウイルスゲノムを含む。特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのＩＴＲを有する。これら２つのＩＴＲは、５’末端および３’末端でペイロード領域に隣接する。ＩＴＲは、複製のための認識部位を含む複製起点として機能する。ＩＴＲは、相補的でかつ対称に配置され得る配列領域を含む。本開示のウイルスゲノムに組み込まれるＩＴＲは、天然に存在するポリヌクレオチド配列または組換え的に誘導されたポリヌクレオチド配列を含み得る。
ＩＴＲは、カプシドと同じ血清型、またはその誘導体に由来してもよい。ＩＴＲは、カプシドとは異なる血清型のものであってもよい。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、１つ超のＩＴＲを有する。非限定的な例において、ＡＡＶ粒子は、２つのＩＴＲを含むウイルスゲノムを有する。特定の実施形態において、ＩＴＲは互いに同じ血清型のものである。別の実施形態において、ＩＴＲは異なる血清型のものである。非限定的な例としては、ＩＴＲのうちのゼロ個、一方、または両方がカプシドと同じ血清型を有することが挙げられる。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムの両方のＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲである。
独立に、各ＩＴＲは約１００～約１５０ヌクレオチド長であってもよい。ＩＴＲは、約１００～１０５ヌクレオチド長、１０６～１１０ヌクレオチド長、１１１～１１５ヌクレオチド長、１１６～１２０ヌクレオチド長、１２１～１２５ヌクレオチド長、１２６～１３０ヌクレオチド長、１３１～１３５ヌクレオチド長、１３６～１４０ヌクレオチド長、１４１～１４５ヌクレオチド長または１４６～１５０ヌクレオチド長であってもよい。特定の実施形態において、ＩＴＲは１４０～１４２ヌクレオチド長である。ＩＴＲ長さの非限定的な例は、１０２、１３０、１４０、１４１、１４２、１４５ヌクレオチド長、およびそれと少なくとも９５％の同一性を有するものである。
特定の実施形態において、各ＩＴＲは、１４１ヌクレオチド長であってもよい。特定の実施形態において、各ＩＴＲは、１３０ヌクレオチド長であってもよい。特定の実施形態において、各ＩＴＲは、１１９ヌクレオチド長であってもよい。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は２つのＩＴＲを含み、一方のＩＴＲは１４１ヌクレオチド長であり、他方のＩＴＲは１３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は２つのＩＴＲを含み、両方のＩＴＲが１４１ヌクレオチド長である。
プロモータ
特定の実施形態において、ウイルスゲノムのペイロード領域は、トランス遺伝子標的特異性および発現を増強する少なくとも１つのエレメントを含む（例えば、パウエルら（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）、遺伝子療法におけるトランス遺伝子標的特異性および発現を増強するウイルス発現カセットエレメント（Ｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ），２０１５（ペイロード／トランス遺伝子エンハンサーエレメントに関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）を参照されたい）。トランス遺伝子標的特異性および発現を増強するエレメントの非限定的な例としては、プロモータ、内因性ｍｉＲＮＡ、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列および上流エンハンサー（ＵＳＥ）、ＣＭＶエンハンサーおよびイントロンが挙げられる。
当業者であれば、標的細胞における本開示のポリペプチドの発現には、限定はされないが、種特異的な、誘導可能な、組織特異的な、または細胞周期特異的なプロモータを含む、特異的なプロモータが必要とされ得ることを認識し得る（パーら（Ｐａｒｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１４５－９（１９９７）（ポリペプチド発現プロモータに関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）を参照されたい）。
特定の実施形態において、プロモータは、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムのペイロード領域中にコードされるポリペプチド（複数可）の発現をドライブする場合、効率的とみなされる。特定の実施形態において、プロモータは、ターゲティングされる細胞における発現をドライブする場合に効率的とみなされるプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ターゲティングされる細胞に対する向性を有するプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ウイルス産生細胞に対する向性を有するプロモータである。
特定の実施形態において、プロモータは、ターゲティングされる細胞または組織において、一定期間にわたるペイロードの発現をドライブする。プロモータによってドライブされる発現は、１～３１日（またはそれらの間の任意の値もしくは範囲）、１～２３ヵ月（またはそれらの間の任意の値もしくは範囲）、２～１０年（またはそれらの間の任意の値もしくは範囲）、または１０年超の期間であってもよい。発現は、１～５時間、１～１２時間、１～２日、１～５日、１～２週間、１～３週間、１～４週間、１～２ヵ月、１～４ヵ月、１～６ヵ月、２～６ヵ月、３～６ヵ月、３～９ヵ月、４～８ヵ月、６～１２ヵ月、１～２年、１～５年、２～５年、３～６年、３～８年、４～８年または５～１０年であってもよい。非限定的な例として、プロモータは、神経（例えば、ＣＮＳ）細胞または組織においてペイロードを持続的に発現させる弱いプロモータであってもよい。
特定の実施形態において、プロモータは、少なくとも１～１１ヵ月（またはそれらの間の任意の個々の値）、２～６５年（またはそれらの間の任意の個々の値）、または６５年超にわたる本開示のポリペプチドの発現をドライブする。
プロモータは、天然に存在しても天然に存在しなくてもよい。プロモータの非限定的な例としては、ウイルスプロモータ、植物プロモータおよび哺乳類プロモータが挙げられる。特定の実施形態において、プロモータは、ヒトプロモータであってもよい。特定の実施形態において、プロモータは、トランケート型であっても突然変異型であってもよい。
ほとんどの組織における発現をドライブまたは促進するプロモータとしては、限定はされないが、ヒト伸長因子１α－サブユニット（ＥＦ１α）、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーおよび／もしくはプロモータ、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）およびその誘導体ＣＡＧ、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）またはユビキチンＣ（ＵＢＣ）が挙げられる。限定はされないが、筋肉特異的プロモータ、Ｂ細胞プロモータ、単球プロモータ、白血球プロモータ、マクロファージプロモータ、膵腺房細胞プロモータ、内皮細胞プロモータ、肺組織プロモータ、アストロサイトプロモータ、あるいはニューロンもしくはニューロンのサブタイプ、アストロサイト、またはオリゴデンドロサイトに発現を制限するために使用することができる神経系プロモータなど、組織特異的発現エレメントを使用して、発現を特定の細胞型に限定することができる。
筋肉特異的プロモータの非限定的な例としては、哺乳類筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ、哺乳類デスミン（ＤＥＳ）プロモータ、哺乳類トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモータおよび哺乳類骨格筋型アルファ－アクチン（ＡＳＫＡ）プロモータ（例えば、米国特許出願公開第２０１１０２１２５２９号明細書（筋肉特異的プロモータに関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）を参照されたい）が挙げられる。
ニューロンに対する組織特異的発現エレメントの非限定的な例としては、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、血小板増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板増殖因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ－β）、シナプシン（Ｓｙｎ）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）、代謝調節型グルタミン酸受容体２（ｍＧｌｕＲ２）、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）または重鎖（ＮＦＨ）、β－グロビンミニ遺伝子ｎβ２、プレプロエンケファリン（ＰＰＥ）、エンケファリン（Ｅｎｋ）および興奮性アミノ酸トランスポーター２（ＥＡＡＴ２）プロモータが挙げられる。アストロサイトに対する組織特異的発現エレメントの非限定的な例としては、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびＥＡＡＴ２プロモータが挙げられる。オリゴデンドロサイトに対する組織特異的発現エレメントの非限定的な例としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモータが挙げられる。
特定の実施形態において、プロモータは１ｋｂ未満であってもよい。プロモータは、２００～８００ヌクレオチド（またはそれらの間の任意の値もしくは範囲）、または８００ヌクレオチド超の長さを有してもよい。プロモータは、２００～３００、２００～４００、２００～５００、２００～６００、２００～７００、２００～８００、３００～４００、３００～５００、３００～６００、３００～７００、３００～８００、４００～５００、４００～６００、４００～７００、４００～８００、５００～６００、５００～７００、５００～８００、６００～７００、６００～８００または７００～８００の長さを有してもよい。
特定の実施形態において、プロモータは、限定はされないが、ＣＭＶおよびＣＢＡなど、同じまたは異なる開始または親プロモータの２つ以上の成分の組合せであってもよい。各成分は、２００～８００ヌクレオチド（またはそれらの間の任意の値もしくは範囲）、または８００ヌクレオチド超の長さを有してもよい。各成分は、２００～３００、２００～４００、２００～５００、２００～６００、２００～７００、２００～８００、３００～４００、３００～５００、３００～６００、３００～７００、３００～８００、４００～５００、４００～６００、４００～７００、４００～８００、５００～６００、５００～７００、５００～８００、６００～７００、６００～８００または７００～８００の長さを有してもよい。特定の実施形態において、プロモータは、３８２ヌクレオチドＣＭＶエンハンサー配列と２６０ヌクレオチドＣＢＡプロモータ配列との組合せである。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムはユビキタスプロモータを含む。ユビキタスプロモータの非限定的な例としては、ＣＭＶ、ＣＢＡ（誘導体ＣＡＧ、ＣＢｈ等を含む）、ＥＦ－１α、ＰＧＫ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ（ｈＧＢｐ）、およびＵＣＯＥ（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１－ＣＢＸ３のプロモータ）が挙げられる。
ユー（Ｙｕ）ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｉｎ、２０１１年、第７巻、ｐ．６３；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、レンチウイルスベクターを使用してラットＤＲＧ細胞および初代ＤＲＧ細胞におけるＣＡＧ、ＥＦＩα、ＰＧＫおよびＵＢＣプロモータ下のｅＧＦＰの発現を評価し、ＵＢＣが他の３つのプロモータよりも弱い発現を示し、全てのプロモータについてわずか１０～１２％のグリア細胞発現しか見られなかったことを見出した。セーデルブロム（Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍ）ら（Ｅ．Ｎｅｕｒｏ、２０１５年；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、運動皮質における注射後のＣＭＶおよびＵＢＣプロモータを含むＡＡＶ８およびＣＭＶプロモータを含むＡＡＶ２におけるｅＧＦＰの発現を評価した。ＵＢＣまたはＥＦＩαプロモータを含むプラスミドの鼻腔内投与は、ＣＭＶプロモータによる発現よりも高い持続的気道発現を示した（例えば、ギル（Ｇｉｌｌ）ら著、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２００１年、第８巻、ｐ．１５３９～１５４６（その内容は本明細書において全体として参照により援用される）を参照のこと）。フセイン（Ｈｕｓａｉｎ）ら（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２００９年；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、ｈＧＵＳＢプロモータ、ＨＳＶ－１ＬＡＴプロモータおよびＮＳＥプロモータを含むＨβＨコンストラクトを評価し、このＨβＨコンストラクトがマウス脳においてＮＳＥよりも弱い発現を示したことを見出した。パッシーニ（Ｐａｓｓｉｎｉ）およびウォルフ（Ｗｏｌｆｅ）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００１年、ｐ．１２３８２～１２３９２、これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、新生仔マウスにおける脳室内注射後のＨβＨベクターの長期効果を評価し、少なくとも１年間にわたり持続的発現があったことを見出した。スー（Ｘｕ）ら（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２００１年、第８巻、ｐ．１３２３～１３３２；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）により、ＮＦＬおよびＮＦＨプロモータを使用したとき、ＣＭＶ－ｌａｃＺ、ＣＭＶ－ｌｕｃ、ＥＦ、ＧＦＡＰ、ｈＥＮＫ、ｎＡＣｈＲ、ＰＰＥ、ＰＰＥ＋ｗｐｒｅ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）およびＮＳＥ（１．８ｋｂ＋ｗｐｒｅ）と比較して全ての脳領域で低発現が見出された。スー（Ｘｕ）らは、プロモータ活性が、降順に、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）、ＥＦ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＧＦＡＰ、ＣＭＶ、ｈＥＮＫ、ＰＰＥ、ＮＦＬおよびＮＦＨであることを見出した。ＮＦＬは６５０ヌクレオチドプロモータであり、ＮＦＨは９２０ヌクレオチドプロモータであり、両方とも肝臓には存在しないが、ＮＦＨは固有受容感覚ニューロン、脳および脊髄に豊富にあり、ＮＦＨは心臓に存在する。ＳＣＮ８Ａは、ＤＲＧ、脊髄および脳全体にわたって発現する４７０ヌクレオチドのプロモータであり、特に海馬ニューロンおよび小脳プルキンエ細胞、皮質、視床および視床下部に高発現が見られる（例えば、ドレウスら（Ｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．）、ナトリウムチャネル遺伝子ＳＣＮ８Ａのプロモータ領域における、進化的に保存された機能性非コードエレメントの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｇｅｎｅ ＳＣＮ８Ａ）、Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ（２００７）１８：７２３－７３１；およびレイモンドら（Ｒａｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．）、選択的スプライシングされたナトリウムチャネルα－サブユニット遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ Ｓｐｌｉｃｅｄ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ α－ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅｓ）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）２７９（４４）４６２３４－４６２４１（その各々の内容は全体として本願明細書に援用される）を参照されたい）。
前述のユー（Ｙｕ）、セーデルブロム（Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍ）、ギル（Ｇｉｌｌ）、フセイン（Ｈｕｓａｉｎ）、パッシーニ（Ｐａｓｓｉｎｉ）、スー（Ｘｕ）、ドレウス（Ｄｒｅｗｓ）またはレイモンド（Ｒａｙｍｏｎｄ）によって教示されるプロモータはいずれも、本開示に使用することができる。
特定の実施形態において、プロモータは、細胞特異的ではない。
特定の実施形態において、プロモータは、ユビキチンｃ（ＵＢＣ）プロモータである。ＵＢＣプロモータは、３００～３５０ヌクレオチドのサイズを有してもよい。非限定的な例として、ＵＢＣプロモータは、３３２ヌクレオチドである。特定の実施形態において、プロモータは、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータである。ＧＵＳＢプロモータは、３５０～４００ヌクレオチドのサイズを有してもよい。非限定的な例として、ＧＵＳＢプロモータは、３７８ヌクレオチドである。特定の実施形態において、プロモータは、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）プロモータである。ＮＦＬプロモータは、６００～７００ヌクレオチドのサイズを有してもよい。非限定的な例として、ＮＦＬプロモータは、６５０ヌクレオチドである。特定の実施形態において、プロモータは、ニューロフィラメント重鎖（ＮＦＨ）プロモータである。ＮＦＨプロモータは、９００～９５０ヌクレオチドのサイズを有してもよい。非限定的な例として、ＮＦＨプロモータは、９２０ヌクレオチドである。特定の実施形態において、プロモータは、ＳＣＮ８Ａプロモータである。ＳＣＮ８Ａプロモータは、４５０～５００ヌクレオチドのサイズを有してもよい。非限定的な例として、ＳＣＮ８Ａプロモータは、４７０ヌクレオチドである。
特定の実施形態において、プロモータは、フラタキシン（ＦＸＮ）プロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモータまたはそのバリアントである。特定の実施形態において、プロモータは、ＣＢ６プロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ミニマルＣＢプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、Ｈ１プロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ＣＡＧプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ＧＦＡＰプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、シナプシンプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、操作されたプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、肝臓または骨格筋プロモータである。肝臓プロモータの非限定的な例としては、ヒトα－１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）およびチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）が挙げられる。骨格筋プロモータの非限定的な例としては、デスミン、ＭＣＫまたは合成Ｃ５－１２が挙げられる。特定の実施形態において、プロモータは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモータである。非限定的な例として、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモータは、Ｕ６である。非限定的な例として、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモータは、Ｈ１である。特定の実施形態において、プロモータは、心筋細胞特異的プロモータである。心筋細胞特異的プロモータの非限定的な例としては、αＭＨＣ、ｃＴｎＴおよびＣＭＶ－ＭＬＣ２ｋが挙げられる。特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのプロモータを含む。非限定的な例として、プロモータは、ＥＦ１αプロモータおよびＣＭＶプロモータである。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、エンハンサーエレメント、プロモータおよび／または５’ＵＴＲイントロンを含む。本明細書で「エンハンサー」とも称されるエンハンサーエレメントは、限定はされないが、ＣＭＶエンハンサーであってもよく、プロモータは、限定はされないが、ＣＭＶ、ＣＢＡ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ、ＮＳＥ、シナプシン、ＭｅＣＰ２およびＧＦＡＰプロモータであってもよく、５’ＵＴＲ／イントロンは、限定はされないが、ＳＶ４０およびＣＢＡ－ＭＶＭであってもよい。非限定的な例として、組み合わせて使用されるエンハンサー、プロモータおよび／またはイントロンは、（１）ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモータ、ＳＶ４０ ５’ＵＴＲイントロン；（２）ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモータ、ＳＶ４０ ５’ＵＴＲイントロン；（３）ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモータ、ＣＢＡ－ＭＶＭ ５’ＵＴＲイントロン；（４）ＵＢＣプロモータ；（５）ＧＵＳＢプロモータ；（６）ＮＳＥプロモータ；（７）シナプシンプロモータ；（８）ＭｅＣＰ２プロモータおよび（９）ＧＦＡＰプロモータ、であってもよい。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、操作されたプロモータを含む。
別の実施形態において、ウイルスゲノムは、天然に発現されるタンパク質のプロモータを含む。
非翻訳領域（ＵＴＲ）
定義上、遺伝子の野生型非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが翻訳されない。一般的には、５’ＵＴＲは、転写開始部位から始まり、開始コドンで終了し、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後から始まり、転写の終結シグナルまで継続する。
特定の標的臓器の、豊富に発現される遺伝子に典型的に見出される特徴を、ＵＴＲ内に操作して、安定性およびタンパク質産生を増強することができる。非限定的な例として、肝臓において通常発現されるｍＲＮＡ（例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子）に由来する５’ＵＴＲを、本開示のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに使用して、肝細胞株または肝臓での発現を増強することができる。
理論によって束縛されることを望むものではないが、野生型５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳開始に役割を果たす特徴を含む。コザック配列は、リボソームが多数の遺伝子の翻訳を開始させる過程に関与することが広く知られており、通常は５’ＵＴＲに含まれている。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、式中Ｒは、開始コドン（ＡＴＧ）の３塩基上流にあるプリン（アデニンまたはグアニン）であり、別の「Ｇ」がその後に続く。特定の実施形態において、ウイルスゲノム中の５’ＵＴＲは、コザック配列を含む。特定の実施形態において、ウイルスゲノム中の５’ＵＴＲは、コザック配列を含まない。
理論によって束縛されることを望むものではないが、野生型３’ＵＴＲは、アデノシンおよびウリジンのストレッチがそこに埋め込まれていることが知られている。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高いターンオーバー率を有する遺伝子において特に広く見受けられる。それらの配列特徴および機能的特性に基づき、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、３つのクラスに分離することができる（チェンら（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ），１９９５（ＡＵリッチエレメントに関して、その内容は全体として本願明細書に援用される））：限定はされないが、ｃ－ＭｙｃおよびＭｙｏＤなどのクラスＩ ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフの幾つかの分散コピーを含有する。限定はされないが、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦ－ａなどのクラスＩＩ ＡＲＥは、２つ以上のオーバーラップＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）ノナマーを有する。限定はされないが、ｃ－ＪｕｎおよびミオゲニンなどのクラスＩＩＩ ＡＲＥＳは、それほど十分に規定されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを不安定化することが知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバーである最も顕著にはＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増加させることが実証されている。ＨｕＲは、３つ全てのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲ内に、操作により加えることは、インビボにて、ＨｕＲ結合を、したがってメッセージの安定化をもたらすことになる。
３’ＵＴＲ ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去または改変を使用して、ポリヌクレオチドの安定性を調節することができる。特異的なポリヌクレオチド（例えばウイルスゲノムのペイロード領域）を操作する場合、ＡＲＥの１つ以上のコピーを導入して、ポリヌクレオチドをより不安定にし、それにより、翻訳を減らし、結果として生じるタンパク質の産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを、同定および除去または突然変異させて、細胞内安定性を増加させ、したがって結果として生じるタンパク質の翻訳および産生を増加させることができる。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムの３’ＵＴＲは、ポリＡテールを鋳型付加するためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡシード、結合部位または完全な配列を含み得る。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）は、核酸標的の部位に結合し、核酸分子安定性を低減することまたは翻訳を阻害することのいずれかによって遺伝子発現を下方調節する１９～２５ヌクレオチド非コードＲＮＡである。ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡの２～８位の領域の配列を含む。この配列は、核酸のｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソンクリック型相補性を有する。
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位、配列またはシード領域を含む、変更するまたは除去するように操作されていてもよい。
当該技術分野で公知の任意の遺伝子に由来する任意のＵＴＲを、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに組み込むことができる。これらのＵＴＲまたはそれらの部分は、それらが選択されたかまたはそれらの配向性もしくは位置が変更され得る遺伝子と同じ配向性に配置され得る。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに使用されるＵＴＲは、逆位化、短縮化、延長化、当該技術分野で公知の１つ以上の他の５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲで作製され得る。本明細書で使用されるとき、用語「変更される」は、ＵＴＲに関する場合、ＵＴＲが、参照配列に対して何らかの点で変化していることを意味する。例えば、３’または５’ＵＴＲは、上記で教示されるような配向性または位置の変化によって野生型または天然ＵＴＲに対して変更されていてもよく、または追加ヌクレオチドの介在、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転位によって変更されていてもよい。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、野生型ＵＴＲのバリアントでない少なくとも１つの人工ＵＴＲを含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、そのタンパク質が、共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する転写物のファミリーから選択されているＵＴＲを含む。
ポリアデニル化配列
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは少なくとも１つのポリアデニル化配列を含む。ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、ペイロードコード配列の３’末端と３’ＩＴＲの５’末端との間にポリアデニル化配列を含み得る。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列または「ポリＡ配列」は、存在しない～約５００ヌクレオチド長の範囲であってもよい。ポリアデニル化配列は、限定はされないが、１～５００ヌクレオチド長（またはそれらの間の任意の値もしくは範囲）であってもよい。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は、１２７ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は、４７７ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は、５５２ヌクレオチド長である。
イントロン
特定の実施形態において、ベクターゲノムは、イントロンなど、トランス遺伝子標的特異性および発現を増強する少なくとも１つのエレメントを含む（例えば、パウエルら（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）、遺伝子療法におけるトランス遺伝子標的特異性および発現を増強するウイルス発現カセットエレメント（Ｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ），２０１５（エンハンサーをターゲティングするトランス遺伝子に関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）を参照されたい）。イントロンの非限定的な例としては、ＭＶＭ（６７～９７ｂｐ）、Ｆ．ＩＸトランケート型イントロン１（３００ｂｐ）、β－グロビンＳＤ／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプター（２５０ｂｐ）、アデノウイルススプライスドナー／イムノグロビン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）スプライスアクセプター（５００ｂｐ）、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）（１８０ｂｐ）およびハイブリッドアデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプター（２３０ｂｐ）が挙げられる。
特定の実施形態において、イントロンまたはイントロン部分は、１００～５００ヌクレオチド長であってもよい。イントロンは、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００の長さを有してもよい。イントロンは、８０～１００、８０～１２０、８０～１４０、８０～１６０、８０～１８０、８０～２００、８０～２５０、８０～３００、８０～３５０、８０～４００、８０～４５０、８０～５００、２００～３００、２００～４００、２００～５００、３００～４００、３００～５００、または４００～５００の長さを有してもよい。
スタッファー配列
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、パッケージング効率および発現を改善する少なくとも１つのエレメント、例えば、スタッファーまたはフィラー配列を含む。スタッファー配列の非限定的な例としては、アルブミンおよび／またはアルファ－１抗トリプシンが挙げられる。任意の公知のウイルス、哺乳類または植物配列は、スタッファー配列として使用するために操られ得る。
特定の実施形態において、スタッファーまたはフィラー配列は、約１００～３５００ヌクレオチド長であってもよい。スタッファー配列は、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００または３０００の長さを有してもよい。
ｍｉＲＮＡ
特定の実施形態において、ウイルスゲノムは、特定の組織におけるトランス遺伝子の発現を低減させるｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの配列を含む。ｍｉＲＮＡおよびそのターゲティングされる組織は、当該技術分野で周知である。非限定的な例として、ｍｉＲ－１２２ ｍｉＲＮＡは、肝臓におけるウイルスゲノムの発現を低減させるために、ウイルスゲノムにコードされ得る。
ペイロード
本開示のＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのペイロード領域を含む少なくとも１つのペイロードコンストラクトを含み得る、またはそれを使用して産生され得る。特定の実施形態において、ペイロード領域は、ウイルスゲノム、例えば、ペイロードコンストラクトのウイルスゲノム内に位置してもよい。ペイロード領域の５’末端および／または３’末端に、少なくとも１つの末端逆位配列（ＩＴＲ）が存在してもよい。ペイロード領域内に、プロモータ領域、イントロン領域およびコード領域が存在してもよい。
特定の実施形態において、本開示のペイロードコンストラクトは、バキュロウイルスプラスミドまたは組換えバキュロウイルスゲノムとしても公知のバクミドであってもよい。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子のペイロード領域は、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする１つ以上の核酸配列を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、１つ超の目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む。特定の実施形態において、１つ以上のポリペプチドをコードするウイルスゲノムは、複製され得、ウイルス粒子中にパッケージングされ得る。ベクターゲノムを含むウイルス粒子で形質導入された標的細胞は、単一標的細胞において１つ以上のポリペプチドの各々を発現することができる。
ＡＡＶ粒子ペイロード領域がポリペプチドをコードする場合、このポリペプチドは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であってもよい。非限定的な例として、ペイロード領域は、少なくとも１つの目的の治療的タンパク質をコードし得る。本明細書に記載されるポリペプチドをコードするＡＡＶウイルスゲノムは、ヒト疾患、ウイルス、感染獣医学的応用の分野、ならびに様々なインビボおよびインビトロ設定において有用であり得る。
特定の実施形態において、対象への製剤化されたＡＡＶ粒子（ウイルスゲノムを含む）の投与は、対象におけるタンパク質の発現を増加させるであろう。特定の実施形態において、タンパク質の発現の増加は、ペイロードによってコードされるポリペプチドに関連する疾患または病気の影響および／または症状を低減させるであろう。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、目的のタンパク質（即ち、ペイロードタンパク質、治療的タンパク質）をコードする核酸配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む。
特定の実施形態において、ペイロード領域は、限定はされないが、抗体、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、ＡｐｏＥ２、フラタキシン、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質、グルコセレブロシダーゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ、イズロン酸２－スルファターゼ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１、トリペプチジルペプチダーゼ１、バッテニン（ｂａｔｔｅｎｉｎ）、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６（リンクリン（ｌｉｎｃｌｉｎ））、ＭＦＳＤ８、ＣＬＮ８、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、プログラニュリン（ＧＲＮ）、ＭｅＣＰ２、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）および／またはギガキソニン（ｇｉｇａｘｏｎｉｎ）（ＧＡＮ）が挙げられるタンパク質をコードする核酸配列を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、以下の国際公開のいずれか１つに記載される疾患関連タンパク質（およびそれらの断片またはバリアント）のいずれかをコードする核酸配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む：国際公開第２０１６０７３６９３号パンフレット、国際公開第２０１７０２３７２４号パンフレット、国際公開第２０１８２３２０５５号パンフレット、国際公開第２０１６０７７６８７号パンフレット、国際公開第２０１６０７７６８９号パンフレット、国際公開第２０１８２０４７８６号パンフレット、国際公開第２０１７２０１２５８号パンフレット、国際公開第２０１７２０１２４８号パンフレット、国際公開第２０１８２０４８０３号パンフレット、国際公開第２０１８２０４７９７号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９５９号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９６３号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９６４号パンフレット、国際公開第２０１５１９１５０８号パンフレット、国際公開第２０１６０９４７８３号パンフレット、国際公開第２０１６０１３７９４９号パンフレット、国際公開第２０１７０７５３３５号パンフレット（本開示と矛盾しない限り、その内容は各々全体として本願明細書に援用される）。
本開示のウイルスゲノムのペイロード領域によってコードされるアミノ酸配列は、１つ以上の核酸、核酸の断片または上述のいずれかのバリアントによって独立してコードされ得るポリペプチド全体、複数のポリペプチドまたはポリペプチドの断片として翻訳され得る。本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合でペプチド結合によって一緒に連結されているアミノ酸残基（天然または非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用されるとき、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを指す。一部の場合において、コードされたポリペプチドは、約５０アミノ酸より小さく、その場合は、ポリペプチドはペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長であろう。したがって、ポリペプチドとしては、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、上述のものの相同体、オルソログ、パラログ、断片および他の同等物、バリアント、および類似体が挙げられる。ポリペプチドは、単一分子であってもよく、または二量体、三量体もしくは四量体などの多分子複合体であってもよい。また、それらは、単一鎖または複数鎖のポリペプチドを含んでいてもよく、会合していても、または連結されていてもよい。用語「ポリペプチド」は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも該当し得る。
特定の実施形態において、「ポリペプチドバリアント」が提供される。用語「ポリペプチドバリアント」は、それらのアミノ酸配列が天然または参照配列とは異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失および／または挿入を有し得る。大抵の場合、バリアントは、天然または参照配列に対して少なくとも約５０％同一性（相同性）を有することになり、特定の実施形態において、天然または参照配列に対して少なくとも約８０％または少なくとも約９０％同一（相同）になるだろう。
本開示は、そのベクターゲノムが、療法剤として調節性ポリヌクレオチド、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子をコードする、製剤化されたＡＡＶ粒子の使用を含む。したがって、本開示は、目的の遺伝子をターゲティングする小型二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子（低分子干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）へとプロセシングされるポリヌクレオチドをコードするベクターゲノムを提供する。本開示は、疾患、障害および／または状態を治療するために、目的の遺伝子の対立遺伝子の遺伝子発現およびタンパク質産生を阻害するためにそれらを使用する方法もまた提供する。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、１つ以上の調節性ポリヌクレオチドをコードするまたは含む核酸配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、目的の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む。本開示の特定の実施形態において、調節性ポリヌクレオチド、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、療法剤として提示される。ＲＮＡ干渉媒介性遺伝子サイレンシングは、ターゲティングされた遺伝子発現を特異的に阻害することができる。
特定の実施形態において、ペイロード領域は、標的遺伝子発現および／または標的タンパク質産生を妨げる調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含む。特定の実施形態において、阻害／改変される遺伝子発現またはタンパク質産生としては、限定はされないが、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、９番染色体オープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ＯＲＦ７２）、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＡＲＤＢＰ）、アタキシン－３（ＡＴＸＮ３）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）、アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）、電位開口型ナトリウムチャネルアルファサブユニット９（ＳＣＮ９Ａ）、および／または電位開口型ナトリウムチャネルアルファサブユニット１０（ＳＣＮ１０Ａ）が挙げられ得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、以下の国際公開のいずれか１つに記載される調節性ポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｄｓＲＮＡ分子および／またはＲＮＡ二重鎖のいずれかをコードする核酸配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む：国際公開第２０１６０７３６９３号パンフレット、国際公開第２０１７０２３７２４号パンフレット、国際公開第２０１８２３２０５５号パンフレット、国際公開第２０１６０７７６８７号パンフレット、国際公開第２０１６０７７６８９号パンフレット、国際公開第２０１８２０４７８６号パンフレット、国際公開第２０１７２０１２５８号パンフレット、国際公開第２０１７２０１２４８号パンフレット、国際公開第２０１８２０４８０３号パンフレット、国際公開第２０１８２０４７９７号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９５９号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９６３号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９６４号パンフレット、国際公開第２０１５１９１５０８号パンフレット、国際公開第２０１６０９４７８３号パンフレット、国際公開第２０１６０１３７９４９号パンフレット、国際公開第２０１７０７５３３５号パンフレット（本開示と矛盾しない限り、その内容は各々全体として本願明細書に援用される）。
特定の実施形態において、かかるｓｉＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子の一本鎖をコードする核酸配列は、アデノ随伴ウイルスベクター中に挿入され、細胞、具体的には、中枢神経系の細胞中に導入される。
ＡＡＶ粒子は、幾つかの固有の特徴に起因して、ｓｉＲＮＡ送達について調査されてきた。特徴の非限定的な例としては、（ｉ）分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する能力；（ｉｉ）ヒト細胞を含む、感染性のための広い宿主範囲；（ｉｉｉ）野生型ＡＡＶは、いずれの疾患にも関連付けられておらず、感染細胞において複製しないことが示されている；（ｉｖ）ベクターに対する細胞媒介性免疫応答が欠如している、ならびに（ｖ）長期の発現の潜在性を低減させる、宿主染色体中に組み込まれない性質、が挙げられる。更に、ＡＡＶ粒子による感染は、細胞遺伝子発現のパターンを変化させることに対して最小限の影響を有する（スティルウェルおよびサムルスキーら（Ｓｔｉｌｗｅｌｌ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００３，３４，１４８）。
特定の実施形態において、本開示のコード化ｓｉＲＮＡ二重鎖は、一緒にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含有し、アンチセンス鎖は、目的のターゲティングされる遺伝子の核酸配列と相補的であり、センス鎖は、目的のターゲティングされる遺伝子の核酸配列と相同である。他の態様において、各鎖の３’末端に、０、１または２ヌクレオチドのオーバーハングが存在する。
本開示の製剤化されたＡＡＶ粒子のペイロードは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導性の遺伝子発現阻害の対象になる１つ以上の薬剤をコードしてもよい。目的の遺伝子をターゲティングするコード化ｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡ（本明細書で集合的に「ｓｉＲＮＡ分子」と称する）が、本明細書に提供される。かかるｓｉＲＮＡ分子、例えば、コード化ｓｉＲＮＡ二重鎖、コード化ｄｓＲＮＡまたはコード化ｓｉＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡ前駆体は、細胞、例えば、アストロサイトまたはミクログリア、皮質、海馬、嗅内、視床、感覚または運動ニューロンにおける遺伝子発現を低減またはサイレンシングすることができる。
ＲＮＡｉ（転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クウェリングまたは共抑制としても公知）は、ＲＮＡ分子が、特定のｍＲＮＡ分子の破壊を典型的には引き起こすことによって、配列特異的方式で遺伝子発現を阻害する、転写後遺伝子サイレンシングプロセスである。ＲＮＡｉの有効成分は、１５～３０ヌクレオチド（例えば、１９～２５、１９～２４または１９～２１ヌクレオチド）および２ヌクレオチドの３’オーバーハングを典型的には含有し、標的遺伝子の核酸配列とマッチする、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短鎖／低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。これらの短鎖ＲＮＡ種は、より大きいｄｓＲＮＡのダイサー媒介性切断によってインビボで天然に産生され得、哺乳類細胞において機能的である。
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）としても公知の天然に発現される低分子ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡの発現を調節することによって、遺伝子サイレンシングを誘発する。ｍｉＲＮＡ含有ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）は、ｍｉＲＮＡのシード領域と呼ばれる５’領域中のヌクレオチド２～７と完全な配列相補性を示し、他はその３’領域と塩基対合するｍＲＮＡをターゲティングする。遺伝子発現のｍｉＲＮＡ媒介性下方調節は、標的ｍＲＮＡの切断、標的ｍＲＮＡの翻訳阻害、またはｍＲＮＡ崩壊によって引き起こされ得る。ｍｉＲＮＡターゲティング配列は通常、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中に位置する。単一のｍｉＲＮＡが、様々な遺伝子からの１００超の転写物をターゲティングしてもよく、１つのｍＲＮＡが異なるｍｉＲＮＡによってターゲティングされてもよい。
特定のｍＲＮＡをターゲティングするｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡは、ＡＡＶ粒子のペイロードとして設計され得、ＲＮＡｉプロセスを活性化するために細胞中に導入され得る。エルバシールら（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．）は、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖（低分子干渉ＲＮＡと呼ばれる）が、哺乳類細胞において免疫応答を誘導することなしに強力かつ特異的な遺伝子ノックダウンをもたらすことができたことを実証した（エルバシール エスエムら（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１，４９４－４９８）。この初期の報告以降、ｓｉＲＮＡによる転写後遺伝子サイレンシングは、哺乳類細胞における遺伝子分析のための強力なツールとして急速に浮上し、新規療法剤を産生する潜在性を有する。
標的ｍＲＮＡに相同なセンス鎖および標的ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス鎖から構成されるｓｉＲＮＡ二重鎖は、一本鎖（ｓｓ）－ｓｉＲＮＡ（例えば、アンチセンス鎖ＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド）の使用と比較して、標的ＲＮＡ破壊の効率に関して、更に多くの利点を提供する。多数のケースにおいて、対応する二重鎖の有効な遺伝子サイレンシング効力を達成するには、より高い濃度のｓｓ－ｓｉＲＮＡが必要とされる。
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、分子足場もまた含む調節性ポリヌクレオチド中にコードされ得る。本明細書で使用されるとき、「分子足場」は、その後の分子をそれに対して設計または作製する配列または構造的基礎を形成するフレームワークまたは開始分子である。
特定の実施形態において、ペイロード（例えば、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ剤）を含む調節性ポリヌクレオチドは、任意の長さのものであってよく、全体または一部が野生型ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列由来であっても完全に人工的であってもよいリーディング５’隣接配列を含む分子足場を含む。３’隣接配列は、サイズおよび起源が５’隣接配列と酷似していてもよい。特定の実施形態において、５’隣接配列および３’隣接配列の一方または両方は、存在しない。
特定の実施形態において、分子足場は、当該技術分野において公知の１つ以上のリンカーを含んでもよい。リンカーは、領域または１つの分子足場を別のものから分離してもよい。非限定的な例として、分子足場は、ポリシストロニックであってもよい。
特定の実施形態において、調節性ポリヌクレオチドは、以下の特性のうち少なくとも１つを使用して設計される：ループバリアント、シードミスマッチ／バルジ／ゆらぎバリアント、ステムミスマッチ、ループバリアントおよびベーサルステム（ｂａｓａｌ ｓｔｅｍ）ミスマッチバリアント、シードミスマッチおよびベーサルステムミスマッチバリアント、ステムミスマッチおよびベーサルステムミスマッチバリアント、シードゆらぎおよびベーサルステムゆらぎバリアント、またはステム配列バリアント。
ゲノムサイズ
特定の実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むＡＡＶ粒子は、一本鎖または二本鎖ベクターゲノムであってもよい。ベクターゲノムのサイズは、小型、中型、大型または最大サイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムは、プロモータおよびポリＡテールを含んでもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むベクターゲノムは、小型一本鎖ベクターゲノムであってもよい。小型一本鎖ベクターゲノムは、約２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４および３．５ｋｂサイズなど、２．１～３．５ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、小型一本鎖ベクターゲノムは、３．２ｋｂサイズであってもよい。別の非限定的な例として、小型一本鎖ベクターゲノムは、２．２ｋｂサイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムは、プロモータおよびポリＡテールを含んでもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むベクターゲノムは、小型二本鎖ベクターゲノムであってもよい。小型二本鎖ベクターゲノムは、約１．３、１．４、１．５、１．６および１．７ｋｂサイズなど、１．３～１．７ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、小型二本鎖ベクターゲノムは、１．６ｋｂサイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムは、プロモータおよびポリＡテールを含んでもよい。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡなど、本明細書に記載されるペイロードを含むベクターゲノムは、中型一本鎖ベクターゲノムであってもよい。中型一本鎖ベクターゲノムは、約３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２および４．３ｋｂサイズなど、３．６～４．３ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、中型一本鎖ベクターゲノムは、４．０ｋｂサイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムは、プロモータおよびポリＡテールを含んでもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むベクターゲノムは、中型二本鎖ベクターゲノムであってもよい。中型二本鎖ベクターゲノムは、約１．８、１．９、２．０および２．１ｋｂサイズなど、１．８～２．１ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、中型二本鎖ベクターゲノムは、２．０ｋｂサイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムは、プロモータおよびポリＡテールを含んでもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むベクターゲノムは、大型一本鎖ベクターゲノムであってもよい。大型一本鎖ベクターゲノムは、約４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９および６．０ｋｂサイズなど、４．４～６．０ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、大型一本鎖ベクターゲノムは、４．７ｋｂサイズであってもよい。別の非限定的な例として、大型一本鎖ベクターゲノムは、４．８ｋｂサイズであってもよい。更に別の非限定的な例として、大型一本鎖ベクターゲノムは、６．０ｋｂサイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムは、プロモータおよびポリＡテールを含んでもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むベクターゲノムは、大型二本鎖ベクターゲノムであってもよい。大型二本鎖ベクターゲノムは、約２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９および３．０ｋｂサイズなど、２．２～３．０ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、大型二本鎖ベクターゲノムは、２．４ｋｂサイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムは、プロモータおよびポリＡテールを含んでもよい。
ＡＡＶ血清型
本開示のＡＡＶ粒子は、任意の天然または組換えＡＡＶ血清型を含んでもよいまたはそれに由来してもよい。本開示によれば、ＡＡＶ粒子は、以下のいずれかから選択される血清型を利用してもよいもしくはそれに基づいてもよく、または以下のいずれかから選択されるペプチドを含んでもよい：
ＶＯＹ１０１、ＶＯＹ２０１、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ（ＰＨＰ．Ｂ）、ＡＡＶＰＨＰ．Ａ（ＰＨＰ．Ａ）、ＡＡＶＧ２Ｂ－２６、ＡＡＶＧ２Ｂ－１３、ＡＡＶＴＨ１．１－３２、ＡＡＶＴＨ１．１－３５、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２（ＰＨＰ．Ｂ２）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３（ＰＨＰ．Ｂ３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３（Ｇ２Ａ３）、ＡＡＶＧ２Ｂ４（Ｇ２Ｂ４）、ＡＡＶＧ２Ｂ５（Ｇ２Ｂ５）、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ １９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ突然変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ突然変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－２－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶ ＳＭ １０－２、ＡＡＶシャッフル１００－１、ＡＡＶシャッフル１００－３、ＡＡＶシャッフル１００－７、ＡＡＶシャッフル１０－２、ＡＡＶシャッフル１０－６、ＡＡＶシャッフル１０－８、ＡＡＶシャッフル１００－２、ＡＡＶ ＳＭ １０－１、ＡＡＶ ＳＭ １０－８、ＡＡＶ ＳＭ １００－３、ＡＡＶ ＳＭ １００－１０、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、トゥルータイプＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ １０、ジャパニーズＡＡＶ １０血清型、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．１、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．１０、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．２、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．５、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．７、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．８、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｂ７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｂ７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ１、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ２、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ３、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ４、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ－ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ６、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ７、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ８、ＡＡＶ ＣＨｔ－１、ＡＡＶ ＣＨｔ－２、ＡＡＶ ＣＨｔ－３、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．１、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．１０、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．５、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．６、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．７、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．８、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ１、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ２、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ５、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ６、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ８、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ９、ＡＡＶ ＣＫｄ－１、ＡＡＶ ＣＫｄ－１０、ＡＡＶ ＣＫｄ－２、ＡＡＶ ＣＫｄ－３、ＡＡＶ ＣＫｄ－４、ＡＡＶ ＣＫｄ－６、ＡＡＶ ＣＫｄ－７、ＡＡＶ ＣＫｄ－８、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ１、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ２、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ５、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ６、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ７、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ８、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ１、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ２、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ５、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ６、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ９、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ１、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ２、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ３、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ４、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ５、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ６、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ７、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－１、ＡＡＶ ＣＬｖ１－１、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－１０、ＡＡＶ ＣＬｖ１－２、ＡＡＶ ＣＬｖ－１２、ＡＡＶ ＣＬｖ１－３、ＡＡＶ ＣＬｖ－１３、ＡＡＶ ＣＬｖ１－４、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－７、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－８、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－９、ＡＡＶ ＣＬｖ－２、ＡＡＶ ＣＬｖ－３、ＡＡＶ ＣＬｖ－４、ＡＡＶ ＣＬｖ－６、ＡＡＶ ＣＬｖ－８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｅ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ１１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ５、Ａ

ＡＶ ＣＬｖ－Ｍ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ９、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ９、ＡＡＶ ＣＳｐ－１、ＡＡＶ ＣＳｐ－１０、ＡＡＶ ＣＳｐ－１１、ＡＡＶ ＣＳｐ－２、ＡＡＶ ＣＳｐ－３、ＡＡＶ ＣＳｐ－４、ＡＡＶ ＣＳｐ－６、ＡＡＶ ＣＳｐ－７、ＡＡＶ ＣＳｐ－８、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．１０、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．２、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．４、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．５、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．６、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．７、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．８、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．９、ＡＡＶ ＣＳｐ－９、ＡＡＶ．ｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶ．ＶＲ－３５５、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶＦ１／ＨＳＣ１、ＡＡＶＦ１１／ＨＳＣ１１、ＡＡＶＦ１２／ＨＳＣ１２、ＡＡＶＦ１３／ＨＳＣ１３、ＡＡＶＦ１４／ＨＳＣ１４、ＡＡＶＦ１５／ＨＳＣ１５、ＡＡＶＦ１６／ＨＳＣ１６、ＡＡＶＦ１７／ＨＳＣ１７、ＡＡＶＦ２／ＨＳＣ２、ＡＡＶＦ３／ＨＳＣ３、ＡＡＶＦ４／ＨＳＣ４、ＡＡＶＦ５／ＨＳＣ５、ＡＡＶＦ６／ＨＳＣ６、ＡＡＶＦ７／ＨＳＣ７、ＡＡＶＦ８／ＨＳＣ８、ＡＡＶＦ９／ＨＳＣ９、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶｒｈ３２／３３、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４６、ＡＡＶｒｈ７３、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ．２６、またはそれらのバリアントもしくは誘導体。
ＡＡＶ－ＤＪ配列は、２つの突然変異：（１）Ｒ５８７Ｑ［アミノ酸５８７のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がグルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）に変更される］および（２）Ｒ５９０Ｔ［アミノ酸５９０のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がスレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）に変更される］を含み得る。別の非限定的な例として、ＡＡＶ－ＤＪ配列は、３つの突然変異：（１）Ｋ４０６Ｒ［アミノ酸４０６のリシン（Ｋ；Ｌｙｓ）がアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）に変更される］、（２）Ｒ５８７Ｑ［アミノ酸５８７のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がグルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）に変更される］、および（３）Ｒ５９０Ｔ［アミノ酸５９０のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がスレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）に変更される］を含み得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶは、アミノ酸３９０～６２７（ＶＰ１の付番）に突然変異を有するＡＡＶ９カプシドライブラリによって生成された血清型であってもよい。血清型ならびに対応するヌクレオチドおよびアミノ酸の置換は、限定はされないが、ＡＡＶ９．１（Ｇ１５９４Ｃ；Ｄ５３２Ｈ）、ＡＡＶ６．２（Ｔ１４１８ＡおよびＴ１４３６Ｘ；Ｖ４７３ＤおよびＩ４７９Ｋ）、ＡＡＶ９．３（Ｔ１２３８Ａ；Ｆ４１３Ｙ）、ＡＡＶ９．４（Ｔ１２５０ＣおよびＡ１６１７Ｔ；Ｆ４１７Ｓ）、ＡＡＶ９．５（Ａ１２３５Ｇ、Ａ１３１４Ｔ、Ａ１６４２Ｇ、Ｃ１７６０Ｔ；Ｑ４１２Ｒ、Ｔ５４８Ａ、Ａ５８７Ｖ）、ＡＡＶ９．６（Ｔ１２３１Ａ；Ｆ４１１Ｉ）、ＡＡＶ９．９（Ｇ１２０３Ａ、Ｇ１７８５Ｔ；Ｗ５９５Ｃ）、ＡＡＶ９．１０（Ａ１５００Ｇ、Ｔ１６７６Ｃ；Ｍ５５９Ｔ）、ＡＡＶ９．１１（Ａ１４２５Ｔ、Ａ１７０２Ｃ、Ａ１７６９Ｔ；Ｔ５６８Ｐ、Ｑ５９０Ｌ）、ＡＡＶ９．１３（Ａ１３６９Ｃ、Ａ１７２０Ｔ；Ｎ４５７Ｈ、Ｔ５７４Ｓ）、ＡＡＶ９．１４（Ｔ１３４０Ａ、Ｔ１３６２Ｃ、Ｔ１５６０Ｃ、Ｇ１７１３Ａ；Ｌ４４７Ｈ）、ＡＡＶ９．１６（Ａ１７７５Ｔ；Ｑ５９２Ｌ）、ＡＡＶ９．２４（Ｔ１５０７Ｃ、Ｔ１５２１Ｇ；Ｗ５０３Ｒ）、ＡＡＶ９．２６（Ａ１３３７Ｇ、Ａ１７６９Ｃ；Ｙ４４６Ｃ、Ｑ５９０Ｐ）、ＡＡＶ９．３３（Ａ１６６７Ｃ；Ｄ５５６Ａ）、ＡＡＶ９．３４（Ａ１５３４Ｇ、Ｃ１７９４Ｔ；Ｎ５１２Ｄ）、ＡＡＶ９．３５（Ａ１２８９Ｔ、Ｔ１４５０Ａ、Ｃ１４９４Ｔ、Ａ１５１５Ｔ、Ｃ１７９４Ａ、Ｇ１８１６Ａ；Ｑ４３０Ｌ、Ｙ４８４Ｎ、Ｎ９８Ｋ、Ｖ６０６Ｉ）、ＡＡＶ９．４０（Ａ１６９４Ｔ、Ｅ５６５Ｖ）、ＡＡＶ９．４１（Ａ１３４８Ｔ、Ｔ１３６２Ｃ；Ｔ４５０Ｓ）、ＡＡＶ９．４４（Ａ１６８４Ｃ、Ａ１７０１Ｔ、Ａ１７３７Ｇ；Ｎ５６２Ｈ、Ｋ５６７Ｎ）、ＡＡＶ９．４５（Ａ１４９２Ｔ、Ｃ１８０４Ｔ；Ｎ４９８Ｙ、Ｌ６０２Ｆ）、ＡＡＶ９．４６（Ｇ１４４１Ｃ、Ｔ１５２５Ｃ、Ｔ１５４９Ｇ；Ｇ４８１Ｒ、Ｗ５０９Ｒ、Ｌ５１７Ｖ）、９．４７（Ｇ１２４１Ａ、Ｇ１３５８Ａ、Ａ１６６９Ｇ、Ｃ１７４５Ｔ；Ｓ４１４Ｎ、Ｇ４５３Ｄ、Ｋ５５７Ｅ、Ｔ５８２Ｉ）、ＡＡＶ９．４８（Ｃ１４４５Ｔ、Ａ１７３６Ｔ；Ｐ４８２Ｌ、Ｑ５７９Ｌ）、ＡＡＶ９．５０（Ａ１６３８Ｔ、Ｃ１６８３Ｔ、Ｔ１８０５Ａ；Ｑ５４６Ｈ、Ｌ６０２Ｈ）、ＡＡＶ９．５３（Ｇ１３０１Ａ、Ａ１４０５Ｃ、Ｃ１６６４Ｔ、Ｇ１８１１Ｔ；Ｒ１３４Ｑ、Ｓ４６９Ｒ、Ａ５５５Ｖ、Ｇ６０４Ｖ）、ＡＡＶ９．５４（Ｃ１５３１Ａ、Ｔ１６０９Ａ；Ｌ５１１Ｉ、Ｌ５３７Ｍ）、ＡＡＶ９．５５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）、ＡＡＶ９．５８（Ｃ１４７５Ｔ、Ｃ１５７９Ａ；Ｔ４９２Ｉ、Ｈ５２７Ｎ）、ＡＡＶ．５９（Ｔ１３３６Ｃ；Ｙ４４６Ｈ）、ＡＡＶ９．６１（Ａ１４９３Ｔ；Ｎ４９８Ｉ）、ＡＡＶ９．６４（Ｃ１５３１Ａ、Ａ１６１７Ｔ；Ｌ５１１Ｉ）、ＡＡＶ９．６５（Ｃ１３３５Ｔ、Ｔ１５３０Ｃ、Ｃ１５６８Ａ；Ａ５２３Ｄ）、ＡＡＶ９．６８（Ｃ１５１０Ａ；Ｐ５０４Ｔ）、ＡＡＶ９．８０（Ｇ１４４１Ａ、；Ｇ４８１Ｒ）、ＡＡＶ９．８３（Ｃ１４０２Ａ、Ａ１５００Ｔ；Ｐ４６８Ｔ、Ｅ５００Ｄ）、ＡＡＶ９．８７（Ｔ１４６４Ｃ、Ｔ１４６８Ｃ；Ｓ４９０Ｐ）、ＡＡＶ９．９０（Ａ１１９６Ｔ；Ｙ３９９Ｆ）、ＡＡＶ９．９１（Ｔ１３１６Ｇ、Ａ１５８３Ｔ、Ｃ１７８２Ｇ、Ｔ１８０６Ｃ；Ｌ４３９Ｒ、Ｋ５２８Ｉ）、ＡＡＶ９．９３（Ａ１２７３Ｇ、Ａ１４２１Ｇ、Ａ１６３８Ｃ、Ｃ１７１２Ｔ、Ｇ１７３２Ａ、Ａ１７４４Ｔ、Ａ１８３２Ｔ；Ｓ４２５Ｇ、Ｑ４７４Ｒ、Ｑ５４６Ｈ、Ｐ５７１Ｌ、Ｇ５７８Ｒ、Ｔ５８２Ｓ、Ｄ６１１Ｖ）、ＡＡＶ９．９４（Ａ１６７５Ｔ；Ｍ５５９Ｌ）およびＡＡＶ９．９５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）であってもよい。
本明細書において引用および／または記載したＤＮＡおよびＲＮＡ配列のいずれかにおいて、一文字記号は以下の説明を有する：Ａはアデニンであり；Ｃはシトシンであり；Ｇはグアニンであり；Ｔはチミンであり；Ｕはウラシルであり；Ｗはアデニンまたはチミンなどの弱塩基であり；Ｓはシトシンおよびグアニンなどの強ヌクレオチドであり；Ｍはアデニンおよびシトシンなどのアミノヌクレオチドであり；Ｋはグアニンおよびチミンなどのケトヌクレオチドであり；Ｒはプリンのアデニンおよびグアニンであり；Ｙはピリミジンのシトシンおよびチミンであり；ＢはＡではない任意の塩基（例えば、シトシン、グアニン、およびチミン）であり；ＤはＣではない任意の塩基（例えば、アデニン、グアニン、およびチミン）であり；ＨはＧではない任意の塩基（例えば、アデニン、シトシン、およびチミン）であり；ＶはＴではない任意の塩基（例えば、アデニン、シトシン、およびグアニン）であり；Ｎは任意のヌクレオチドであり（ギャップではない）；Ｚはゼロである。
本明細書において引用および／または記載したアミノ酸配列のいずれかにおいて、一文字記号は以下の説明を有する：Ｇ（Ｇｌｙ）はグリシンであり；Ａ（Ａｌａ）はアラニンであり；Ｌ（Ｌｅｕ）はロイシンであり；Ｍ（Ｍｅｔ）はメチオニンであり；Ｆ（Ｐｈｅ）はフェニルアラニンであり；Ｗ（Ｔｒｐ）はトリプトファンであり；Ｋ（Ｌｙｓ）はリシンであり；Ｑ（Ｇｌｎ）はグルタミンであり；Ｅ（Ｇｌｕ）はグルタミン酸であり；Ｓ（Ｓｅｒ）はセリンであり；Ｐ（Ｐｒｏ）はプロリンであり；Ｖ（Ｖａｌ）はバリンであり；Ｉ（Ｉｌｅ）はイソロイシンであり；Ｃ（Ｃｙｓ）はシステインであり；Ｙ（Ｔｙｒ）はチロシンであり；Ｈ（Ｈｉｓ）はヒスチジンであり；Ｒ（Ａｒｇ）はアルギニンであり；Ｎ（Ａｓｎ）はアスパラギンであり；Ｄ（Ａｓｐ）はアスパラギン酸であり；Ｔ（Ｔｈｒ）はスレオニンであり；Ｂ（Ａｓｘ）はアスパラギン酸またはアスパラギンであり；Ｊ（Ｘｌｅ）はロイシンまたはイソロイシンであり；Ｏ（Ｐｙｌ）はピロリジンであり；Ｕ（Ｓｅｃ）はセレノシステインであり；Ｘ（Ｘａａ）は任意のアミノ酸であり；Ｚ（Ｇｌｘ）はグルタミンまたはグルタミン酸である。
特定の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、国際公開第２０１５０３８９５８号パンフレット、国際公開第２０１７１００６７１号パンフレット、国際公開第２０１６１３４３７５号パンフレット、国際公開第２０１７０８３７２２号パンフレット、国際公開第２０１７０１５１０２号パンフレット、国際公開第２０１７０５８８９２号パンフレット、国際公開第２０１７０６６７６４号パンフレット、米国特許第９６２４２７４号明細書、米国特許第９４７５８４５号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３６９２９８号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１４５４０５号明細書（ＡＡＶ血清型および改変に関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）に記載される通りの配列、インサート、改変もしくは突然変異であってもよい、またはそれを含んでもよい。
特定の実施形態において、ＡＡＶは、デバーマンら（Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．），（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４（２）：２０４－２０９（２０１６））（その内容は全体として本願明細書に援用される）によって記載される通りのＣｒｅ組換えに基づくＡＡＶ標的進化（Ｃｒｅ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ＡＡＶ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、ＣＲＥＡＴＥ）によって作製した血清型であり得る。特定の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ジャクソンら（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ）（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ９：１５４（２０１６））（ＡＡＶ血清型および改変に関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）に記載される通りであり得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、中枢神経系の細胞に対するその向性に起因して、使用のために選択される。特定の実施形態において、中枢神経系の細胞は、ニューロンである。別の実施形態において、中枢神経系の細胞は、アストロサイトである。
特定の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、筋肉（複数可）の細胞に対するその向性に起因して、使用のために選択される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンは、米国特許第８１６３５４３号明細書（ＡＡＶ血清型および改変に関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）に記載される通りのＣＴＧ、ＴＴＧまたはＧＴＧであり得る。
本開示は、カプシド（Ｃａｐ）遺伝子によってコードされるカプシド構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む）に言及する。これらのカプシドタンパク質はＡＡＶなどのウイルスベクターのタンパク質外部の構造的殻（すなわちカプシド）を形成する。Ｃａｐポリヌクレオチドから合成されたＶＰカプシドタンパク質には、一般に、ペプチド配列中の最初のアミノ酸としてメチオニンが含まれ（Ｍｅｔ１）、これは対応するＣａｐヌクレオチド配列中の開始コドン（ＡＵＧまたはＡＴＧ）に関連している。しかし、最初のメチオニン（Ｍｅｔ１）残基または一般にどの最初のアミノ酸（ＡＡ１）でも、ポリペプチド合成後またはその間に、Ｍｅｔ－アミノペプチダーゼなどのタンパク質プロセシング酵素によって切断されることが一般的である。この「Ｍｅｔ／ＡＡクリッピング」プロセスは、しばしば、ポリペプチド配列中の２番目のアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、セリン、スレオニンなど）の対応するアセチル化に関連している。Ｍｅｔクリッピングは一般的にＶＰ１およびＶＰ３のカプシドタンパク質で起こるが、ＶＰ２カプシドタンパク質でも起こる場合がある。
Ｍｅｔ／ＡＡクリッピングが不完全な場合、ウイルスカプシドを含む１つ以上（１つ、２つ、または３つ）のＶＰカプシドタンパク質の混合物が生成される場合があり、その一部はＭｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を含む場合があり（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）、一部はＭｅｔ／ＡＡクリッピングの結果としてＭｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠く場合がある（Ｍｅｔ－／ＡＡ－）。カプシドタンパク質におけるＭｅｔ／ＡＡクリッピングに関する更なる議論には、ジンら（Ｊｉｎ，ｅｔ ａｌ．）、組換えアデノ随伴ウイルスカプシドタンパク質の完全な特徴付けのための、直接液体クロマトグラフィー／質量分析による分析（Ｄｉｒｅｃｔ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７年１０月．２８（５）：２５５－２６７；ホワンら（Ｈｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．）、細胞タンパク質のＮ末端アセチル化は特異的分解シグナルを生じる（Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｒｅａｔｅｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｌｓ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０年２月１９日．３２７（５９６８）：９７３－９７７（カプシドタンパク質改変およびクリッピングに関して、その内容は各々全体として本願明細書に援用される）を参照されたい。
本開示によれば、カプシドタンパク質への言及は、クリップされたもの（Ｍｅｔ－／ＡＡ－）またはクリップされていないもの（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）のどちらかに限定されず、文脈内において、独立したカプシドタンパク質、カプシドタンパク質の混合物から構成されるウイルスカプシド、および／または本開示のカプシドタンパク質をコードする、記載する、生じる、もしくはもたらすポリヌクレオチド配列（もしくはその断片）を指してもよい。「カプシドタンパク質」または「カプシドポリペプチド」（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ２）への直接の言及は、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を含むＶＰカプシドタンパク質（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）、ならびにＭｅｔ／ＡＡクリッピングの結果としてＭｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠く対応するＶＰカプシドタンパク質（Ｍｅｔ－／ＡＡ－）も含み得る。
本開示に更によれば、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を含む（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）１つ以上のカプシドタンパク質をそれぞれ含むまたはコードする、特定の配列番号（タンパク質または核酸にかかわらない）への言及は、配列を再検討すれば、最初に列挙されたアミノ酸（Ｍｅｔ１／ＡＡ１であるかどうかにかかわらない）を単に欠く任意の配列は容易に明らかになるため、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠くＶＰカプシドタンパク質を教示するものと理解されたい。
非限定的な例として、７３６個のアミノ酸の長さであり、ＡＵＧ／ＡＴＧ開始コドンにコードされる「Ｍｅｔ１」アミノ酸を含む（Ｍｅｔ＋）、ＶＰ１ポリペプチド配列への言及も、７３５個のアミノ酸の長さであり、７３６個のアミノ酸のＭｅｔ＋配列の「Ｍｅｔ１」アミノ酸が含まれない（Ｍｅｔ－）、ＶＰ１ポリペプチド配列を教示するものと理解され得る。第２の非限定的な例として、７３６個のアミノ酸の長さであり、任意のＮＮＮ開始コドンにコードされる「ＡＡ１」アミノ酸を含む（ＡＡ１＋）、ＶＰ１ポリペプチド配列への言及も、７３５個のアミノ酸の長さであり、７３６個のアミノ酸のＡＡ１＋配列の「ＡＡ１」アミノ酸が含まれない（ＡＡ１－）、ＶＰ１ポリペプチド配列を教示するものと理解され得る。
ＶＰカプシドタンパク質から形成されたウイルスカプシドへの言及（特定のＡＡＶカプシド血清型への言及など）は、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を含むＶＰカプシドタンパク質（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）、Ｍｅｔ／ＡＡ１クリッピングの結果としてＭｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠く対応するＶＰカプシドタンパク質（Ｍｅｔ－／ＡＡ１－）、およびその組合せ（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋およびＭｅｔ－／ＡＡ１－）を組み入れることができる。
非限定的な例として、ＡＡＶカプシド血清型としては、ＶＰ１（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）、ＶＰ１（Ｍｅｔ－／ＡＡ１－）、またはＶＰ１（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）とＶＰ１（Ｍｅｔ－／ＡＡ１－）との組合せを挙げることができる。ＡＡＶカプシド血清型として、ＶＰ３（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）、ＶＰ３（Ｍｅｔ－／ＡＡ１－）、またはＶＰ３（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）とＶＰ３（Ｍｅｔ－／ＡＡ１－）との組合せを挙げることもでき、また、ＶＰ２（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１）とＶＰ２（Ｍｅｔ－／ＡＡ１－）との同様の任意選択の組合せも挙げることができる。
細胞中への導入
本開示のコード化ｓｉＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖）は、ＡＡＶ粒子のベクターゲノムによってコードされることによって、細胞中に導入され得る。これらのＡＡＶ粒子は、トランスフェクション／形質導入を容易には受け入れない細胞中への進入を容易にするために、操作および最適化される。また、一部の合成ウイルスベクターは、ｓｈＲＮＡを細胞ゲノム中に組込む能力を有して、安定なｓｉＲＮＡ発現および標的遺伝子の長期ノックダウンをもたらす。このように、ウイルスベクターは、野生型ウイルスに見られる有害な複製および／または組込み特徴を欠きながらも、特異的送達ビヒクルとして操作される。
特定の実施形態において、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、細胞において転写されるとｓｉＲＮＡ分子を産生することができる核酸配列を含むＡＡＶ粒子で、細胞をトランスフェクト、感染または形質導入することによって、細胞中に導入される。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、細胞において転写されるとｓｉＲＮＡ分子を産生することができる核酸配列を含むＡＡＶ粒子を、細胞または組織中に注射することによって、細胞中に導入される。
特定の実施形態において、トランスフェクション／形質導入の前に、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶ粒子は、細胞中にトランスフェクトされ得る。
本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ分子の核酸配列を含むＡＡＶ粒子を導入するための他の方法としては、米国特許出願公開第２０１２０２６４８０７号明細書（光化学的内部移行に関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）に記載される通りの光化学的内部移行が挙げられ得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載される製剤は、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む少なくとも１つのＡＡＶ粒子を含有してもよい。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、１つの標的部位において目的の遺伝子をターゲティングしてもよい。別の実施形態において、製剤は、複数のＡＡＶ粒子を含み、各ＡＡＶ粒子は、異なる標的部位において目的の遺伝子をターゲティングするｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。目的の遺伝子は、２、３、４、５または５超の部位においてターゲティングされ得る。
特定の実施形態において、限定はされないが、ヒト、ブタ、イヌ、マウス、ラットまたはサルなど、任意の関連性がある種由来のＡＡＶ粒子が、細胞中に導入され得る。
特定の実施形態において、製剤化されたＡＡＶ粒子は、治療される疾患と関連性がある細胞または組織中に導入され得る。
特定の実施形態において、製剤化されたＡＡＶ粒子は、標的配列の高レベルの内因性発現を有する細胞中に導入され得る。
別の実施形態において、製剤化されたＡＡＶ粒子は、標的配列の低レベルの内因性発現を有する細胞中に導入され得る。
特定の実施形態において、細胞は、高い効率のＡＡＶ形質導入を有する細胞であってもよい。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む製剤化されたＡＡＶ粒子は、ｓｉＲＮＡ分子を中枢神経系に送達するために使用することができる（例えば、米国特許第６，１８０，６１３号明細書（ｓｉＲＮＡ分子およびＡＡＶ粒子の送達および治療的使用に関して、その内容は全体として本願明細書に援用される））。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む製剤化されたＡＡＶ粒子は、非ウイルス起源のペプチドを含む改変されたカプシドをさらに含んでもよい。他の態様において、ＡＡＶ粒子は、脳および脊髄中へのコード化ｓｉＲＮＡ二重鎖の送達を容易にするために、ＣＮＳ特異的キメラカプシドを含有してもよい。例えば、ＣＮＳ向性を呈するＡＡＶバリアント由来のｃａｐヌクレオチド配列のアラインメントは、可変領域（ＶＲ）の配列および構造を同定するために構築され得る。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む製剤化されたＡＡＶ粒子は、ポリシストロニック分子であるｓｉＲＮＡ分子をコードしてもよい。ｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子の領域間に１つ以上のリンカーを更に含んでもよい。
特定の実施形態において、製剤化されたＡＡＶ粒子は、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ配列または二重鎖の少なくとも１つをコードする、少なくとも１つの調節性ポリヌクレオチドを含んでもよい。
特定の実施形態において、発現ベクターは、５’から３’へと記載されるＩＴＲからＩＴＲまでに、ＩＴＲ、プロモータ、イントロン、調節性ポリヌクレオチド、ポリＡ配列およびＩＴＲを含んでもよい。
特定の実施形態において、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＳＶ４０イントロンを有するプロモータ、例えば、限定はされないが、ＣＭＶ、Ｕ６、Ｈ１、ＣＢＡまたはＣＢＡプロモータの下流に位置してもよい。更に、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置してもよい。非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３０ヌクレオチド超以内に位置してもよい。別の非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０または２５～３０ヌクレオチド以内に位置してもよい。非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流のヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％または２５％超以内に位置してもよい。別の非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流の最初の１～５％、１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、５～１０％、５～１５％、５～２０％、５～２５％、１０～１５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２０％、１５～２５％または２０～２５％以内に位置してもよい。
特定の実施形態において、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置してもよい。更に、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＳＶ４０イントロンを有するプロモータ、例えば、限定はされないが、ＣＭＶ、Ｕ６、ＣＢＡまたはＣＢＡプロモータの下流に位置してもよい。非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３０ヌクレオチド超以内に位置してもよい。別の非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０または２５～３０ヌクレオチド以内に位置してもよい。非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流のヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％または２５％超以内に位置してもよい。別の非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流の最初の１～５％、１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、５～１０％、５～１５％、５～２０％、５～２５％、１０～１５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２０％、１５～２５％または２０～２５％以内に位置してもよい。
特定の実施形態において、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、ｓｃＡＡＶ中に位置してもよい。
特定の実施形態において、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、ｓｓＡＡＶ中に位置してもよい。
特定の実施形態において、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフリップＩＴＲの５’末端の近傍に位置してもよい。別の実施形態において、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフリップＩＴＲの３’末端の近傍に位置してもよい。更に別の実施形態において、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフロップＩＴＲの５’末端の近傍に位置してもよい。更に別の実施形態において、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフロップＩＴＲの３’末端の近傍に位置してもよい。特定の実施形態において、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフリップＩＴＲの５’末端とフロップＩＴＲの３’末端との間に位置してもよい。特定の実施形態において、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフリップＩＴＲの３’末端とフリップＩＴＲの５’末端との間（例えば、フリップＩＴＲの５’末端とフロップＩＴＲの３’末端との間、またはフロップＩＴＲの３’末端とフリップＩＴＲの５’末端との間の中間）に位置してもよい。非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から下流１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３０ヌクレオチド超以内に位置してもよい。非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から上流１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３０ヌクレオチド超以内に位置してもよい。別の非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から下流１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０または２５～３０ヌクレオチド以内に位置してもよい。別の非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から上流１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０または２５～３０以内に位置してもよい。非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から上流のヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％または２５％超以内に位置してもよい。別の非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から下流の最初の１～５％、１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、５～１０％、５～１５％、５～２０％、５～２５％、１０～１５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２０％、１５～２５％または２０～２５％以内に位置してもよい。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列を含むＡＡＶ粒子は、ＣＮＳ送達のために製剤化され得る。脳血液関門を超える薬剤が使用され得る。例えば、ｓｉＲＮＡ分子を脳血液関門内皮へとターゲティングすることができる一部の細胞透過性ペプチドが、目的の遺伝子をターゲティングするｓｉＲＮＡ二重鎖を製剤するために使用されてもよい。
特定の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む製剤化されたＡＡＶ粒子は、ＣＮＳに直接投与されてもよい。非限定的な例として、ベクターは、目的の遺伝子をターゲティングするｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。
具体的な実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む製剤化されたＡＡＶ粒子の組成物は、ベクターまたはｓｉＲＮＡ分子が中枢神経系に進入し、運動ニューロン中に透過するのを容易にする方法で投与され得る。
特定の実施形態において、製剤化されたＡＡＶ粒子は、脊髄および／または脳幹中の運動ニューロンおよびアストロサイトをターゲティングするために、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡに関して治療有効量で対象に（例えば、髄腔内投与を介して対象のＣＮＳに）投与され得る。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡは、タンパク質またはｍＲＮＡの発現を低減させ得る。
ＩＩ．ＡＡＶ産生
一般的なウイルス産生プロセス
ｒＡＡＶ粒子の産生のためのウイルス産生細胞としては、哺乳類細胞型が一般に挙げられる。しかしながら、哺乳類細胞は、複製細胞当たりの全般的な低収率のウイルス粒子、ならびにウイルス産生細胞中の他の哺乳類バイオマテリアルからの高リスクの望ましくない混入が挙げられる、ｒＡＡＶ粒子の大規模産生に関する幾つかの厄介な問題を提示する。結果として、昆虫細胞が、ｒＡＡＶ粒子の大規模産生のための代替的ビヒクルとなっている。
昆虫細胞を使用するＡＡＶ産生システムもまた、様々な厄介な問題を提示する。例えば、ｒＡＡＶ粒子の高収率産生は、Ｒｅｐ５２と比較したＲｅｐ７８のより低い発現を必要とする場合が多い。したがって、昆虫細胞においてＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２の相対的発現を制御することは、Ｒｅｐオペロン内の注意深く設計された制御機序を必要とする。これらの制御機序としては、個別に操作された昆虫細胞プロモータ、例えば、Ｒｅｐ７８のためのΔＩＥ１プロモータおよびＲｅｐ５２のためのＰｏｌＨプロモータ、または独立して操作された配列もしくはコンストラクトへの、Ｒｅｐをコードするヌクレオチド配列の分割が挙げられ得る。しかしながら、これらの制御機序の実行は、低減されたｒＡＡＶ粒子収率または構造的に不安定なビリオンをもたらす場合が多い。
別の例において、ｒＡＡＶ粒子の産生は、アセンブルしてＡＡＶカプシドを形成するＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質を必要とする。ｒＡＡＶ粒子の高収率産生は、調整された比率のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を必要とし、これは一般に、それぞれおおよそ１：１：１０にすべきであるが、１０コピーのＶＰ３に対して、ＶＰ１は１～２および／またはＶＰ２は１～２で変動し得る。この比率は、カプシドの質にとって重要であり、多すぎるＶＰ１はカプシドを不安定化し、少なすぎるＶＰ１はウイルスの感染性を減少させるであろう。
野生型ＡＡＶは、ＶＰ１発現を制御するために欠損スプライシング法を使用し；ＶＰ２を制御するために特別な周囲（「コザック」配列）を有する弱い開始コドン（ＡＣＧ）を使用し；ＶＰ３発現のために標準的開始コドン（ＡＴＧ）を使用する。しかしながら、一部のバキュロウイルスシステムでは、哺乳類スプライシング配列は常に認識されるわけではなく、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の産生を適切に制御することができない。結果として、ＶＰ２由来の隣のヌクレオチドおよびＡＣＧ開始配列が、カプシドタンパク質産生をドライブするために使用され得る。残念ながら、ＡＡＶ血清型のほとんどについて、この方法は、ＶＰ２と比較してより低い比率のＶＰ１（１０コピーのＶＰ３と比較して＜１）を有するカプシドを創出する。ＶＰタンパク質の産生をより効果的に制御するために、ＴＴＧ、ＧＴＧまたはＣＴＧなど、非カノニカルまたは開始コドンが使用されてきた。しかしながら、これらの開始コドンは、野生型ＡＴＧまたはＡＣＧ開始コドンと比較して、当業者によって最適以下とみなされている（国際公開第２００７０４６７０３号パンフレットおよび国際公開第２００７１４８９７１号パンフレット（ＡＡＶカプシドタンパク質の産生に関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）を参照されたい）。
別の例において、バキュロウイルス／Ｓｆ９システムを使用するｒＡＡＶ粒子の産生は、一般に、大規模ＡＡＶ産生のために最適化されていない、広く使用されるバクミドに基づくバキュロウイルス発現ベクターシステム（ＢＥＶ）を必要とする。バクミドに基づくＢＥＶにおけるウイルスタンパク質の異常なタンパク質分解性分解は、予期せぬ問題であり、バキュロウイルス／Ｓｆ９システムを使用するＡＡＶカプシドタンパク質の信頼性のある大規模産生を除外する。
哺乳類および昆虫細胞におけるｒＡＡＶ粒子の有効かつ効率的な大規模（商業的）産生を可能にする方法およびシステムの必要が継続している。
本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の付随する説明において記載される。本開示の他の特徴、目的および利点は、説明、図面および特許請求の範囲から明らかであろう。説明では、単数形は、文脈により明白にそうでないと指示されない限り、複数形もまた含む。別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。援用されている開示と矛盾する場合には、本明細書の明確な記載が優先されるものとする。
特定の実施形態において、本開示のコンストラクト、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、血清型、カプシド製剤または粒子は、以下の国際公開の１つに記載される任意の配列、エレメント、コンストラクト、システム、標的またはプロセスであり得、それを含み得、それによって改変され得、それによって使用され得、それのために使用され得、それと共に使用され得、またはそれによって産生され得る：国際公開第２０１６０７３６９３号パンフレット、国際公開第２０１７０２３７２４号パンフレット、国際公開第２０１８２３２０５５号パンフレット、国際公開第２０１６０７７６８７号パンフレット、国際公開第２０１６０７７６８９号パンフレット、国際公開第２０１８２０４７８６号パンフレット、国際公開第２０１７２０１２５８号パンフレット、国際公開第２０１７２０１２４８号パンフレット、国際公開第２０１８２０４８０３号パンフレット、国際公開第２０１８２０４７９７号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９５９号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９６３号パンフレット、国際公開第２０１７１８９９６４号パンフレット、国際公開第２０１５１９１５０８号パンフレット、国際公開第２０１６０９４７８３号パンフレット、国際公開第２０１６０１３７９４９号パンフレット、国際公開第２０１７０７５３３５号パンフレット（本開示と矛盾しない限り、その内容は各々全体として本願明細書に援用される）。
本開示のＡＡＶ産生は、ペイロードを送達するために標的細胞と接触することができるＡＡＶ粒子およびウイルスベクター、例えば、ペイロード分子をコードするヌクレオチドを含む組換えウイルスコンストラクトを産生するためのプロセスおよび方法を含む。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。
本開示は、（ａ）ウイルス産生細胞を、少なくとも１つのキメラカプシドタンパク質をコードする１つ以上のウイルス発現コンストラクト、および１つ以上のペイロードコンストラクトベクターと接触させる工程であって、前記ペイロードコンストラクトベクターは、トランス遺伝子、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および調節性核酸からなる群から選択されるペイロード分子をコードするペイロードコンストラクトを含む、工程；（ｂ）少なくとも１つのＡＡＶ粒子またはウイルスベクターが産生されるような条件下で前記ウイルス産生細胞を培養する工程、ならびに（ｃ）前記少なくとも１つのＡＡＶ粒子またはウイルスベクターを単離する工程によって、ＡＡＶ粒子またはウイルスベクターを産生する方法を提供する。
これらの方法において、ウイルス発現コンストラクトは、少なくとも１つの構造タンパク質および／または少なくとも１つの非構造タンパク質をコードし得る。構造タンパク質は、天然もしくは野生型カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３またはキメラタンパク質のいずれかを含んでもよい。非構造タンパク質は、天然もしくは野生型Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、および／もしくはＲｅｐ４０タンパク質またはキメラタンパク質のいずれかを含んでもよい。
特定の実施形態において、接触は、一過性トランスフェクション、ウイルス形質導入、および／またはエレクトロポレーションを介して生じる。
特定の実施形態において、ウイルス産生細胞は、哺乳類細胞および昆虫細胞からなる群から選択される。特定の実施形態において、昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞を含む。特定の実施形態において、昆虫細胞は、Ｓｆ９昆虫細胞を含む。特定の実施形態において、昆虫細胞は、Ｓｆ２１昆虫細胞を含む。
本開示のペイロードコンストラクトベクターは、少なくとも１つの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含んでもよく、哺乳類ＤＮＡを含んでもよい。
本明細書に記載される方法に従って作製されたＡＡＶ粒子およびウイルスベクターも提供される。
本開示のＡＡＶ粒子は、１つ以上の許容可能な賦形剤を有する医薬組成物として製剤化されてもよい。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子またはウイルスベクターは、本明細書に記載される方法によって作製されてもよい。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（例えば、昆虫細胞または哺乳類細胞）を、少なくとも１つのカプシドタンパク質および少なくとも１つのペイロードコンストラクトベクターをコードする少なくとも１つのウイルス発現コンストラクトと接触させることによって作製され得る。ウイルス産生細胞は、一過性トランスフェクション、ウイルス形質導入、および／またはエレクトロポレーションによって接触させてもよい。ペイロードコンストラクトベクターは、ペイロード分子、例えば、限定はされないが、トランス遺伝子、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および調節性核酸をコードするペイロードコンストラクトを含んでもよい。ウイルス産生細胞は、少なくとも１つのＡＡＶ粒子またはウイルスベクターが作製、単離（例えば、温度誘導溶解、機械的溶解、および／もしくは化学的溶解を使用）、ならびに／または精製（例えば、濾過、クロマトグラフィー、および／もしくは免疫親和性精製を使用）されるような条件下で培養され得る。非限定的な例として、ペイロードコンストラクトベクターは、哺乳類ＤＮＡを含んでもよい。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、本明細書に記載される方法を使用して、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）細胞）において作製される。非限定的な例として、昆虫細胞を、バキュロウイルス形質導入を含み得るウイルス形質導入を使用して接触させる。
別の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、本明細書に記載される方法を使用して哺乳類細胞において産生される。非限定的な例として、哺乳類細胞は、一過性トランスフェクションを使用して接触される。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、少なくとも１つの構造タンパク質および少なくとも１つの非構造タンパク質をコードし得る。非限定的な例として、構造タンパク質としては、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３が挙げられる。別の非限定的な例として、非構造タンパク質としては、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０が挙げられる。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子作製方法は、ウイルス産生細胞において、１０１個を超える、１０２個を超える、１０３個を超える、１０４個を超える、または１０５個を超えるＡＡＶ粒子を作製する。
特定の実施形態において、本開示のプロセスは、少なくとも１つのウイルス発現コンストラクトおよび少なくとも１つのペイロードコンストラクトを含むウイルス産生システムを使用した、ウイルス産生細胞におけるウイルス粒子の作製を含む。少なくとも１つのウイルス発現コンストラクトおよび少なくとも１つのペイロードコンストラクトは、ウイルス産生細胞にコトランスフェクト（例えば、二重トランスフェクション、三重トランスフェクション）させてもよい。トランスフェクションは、当業者によってルーチン的に行われる公知の標準的分子生物学的技法を用いて完了される。ウイルス産生細胞は、ペイロードコンストラクトを複製するＲｅｐタンパク質、および複製されたペイロードコンストラクトを封入するカプシドを形成するようにアセンブルするＣａｐタンパク質を含む、ＡＡＶ粒子を作製するために必要なタンパク質および他のバイオマテリアルの発現に必要な細胞機構を提供する。得られたＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞から抽出され、投与のための医薬調製物へ処理される。
ＡＡＶ粒子は、投与されると、標的細胞に接触して、細胞、エンドソーム内に入る。エンドソームから放出されるＡＡＶ粒子は、次いで、標的細胞の核に接触して、ペイロードコンストラクトを送達する。ペイロードコンストラクト、例えば組換えウイルスコンストラクトは、ペイロードコンストラクトによってコードされるペイロード分子が発現され得る標的細胞の核に送達される。
特定の実施形態において、ウイルス粒子の作製のためのプロセスは、１つ以上のバキュロウイルス（例えば、バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）またはウイルス発現コンストラクトおよびペイロードコンストラクトベクターでトランスフェクトされたバキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ））を含む、ウイルス産生細胞のシード培養物を利用する。特定の実施形態において、シード培養物は、回収され、アリコートに分割され、凍結される。更に、シード培養物は、後の時点で、産生細胞のナイーブ集団の感染を開始するために使用されてもよい。
ＡＡＶ粒子の大規模な作製は、バイオリアクターを利用してもよい。バイオリアクターの使用は、質量、温度、混合条件（インペラー回転数または波動オシレーション）、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度、ガススパージ速度および体積、ガスオーバーレイ速度および体積、ｐＨ、生存細胞密度（ＶＣＤ）、細胞バイアビリティ、細胞直径、および／または光学濃度（ＯＤ）などの、ウイルス産生細胞の増殖および活性を支援する変数の正確な測定および／または制御を可能にする。特定の実施形態において、バイオリアクターは、培養物全体が実験的に決定された時点で回収され、ＡＡＶ粒子が精製される、バッチ産生のために使用される。別の実施形態において、バイオリアクターは、ＡＡＶ粒子の精製のために実験的に決定された時点で培養物の一部が回収され、バイオリアクター中の残りの培養物が追加の成長培地成分でリフレッシュされる、連続生産のために使用される。
ＡＡＶウイルス粒子は、細胞溶解、清澄化、滅菌、および精製を含むプロセスにおいて、ウイルス産生細胞から抽出されてもよい。細胞溶解は、ウイルス産生細胞の構造を破壊し、それによってＡＡＶ粒子を放出する、任意のプロセスを含む。特定の実施形態において、細胞溶解は、熱ショック、化学的または機械的溶解方法を含み得る。清澄化は、溶解細胞、培地成分、およびＡＡＶ粒子の混合物の総精製（ｇｒｏｓｓ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含み得る。特定の実施形態において、清澄化は、限定はされないが、デプスエンド、タンジェンシャルフロー、および／または中空繊維濾過を含む、遠心分離および／または濾過を含む。
ウイルス産生の最終結果物は、以下の２つの成分：（１）ペイロードコンストラクト（例えば、組換えウイルスゲノムコンストラクト）、および（２）ウイルスカプシドを含むＡＡＶ粒子の精製収集物である。
特定の実施形態において、本開示のウイルス産生システムまたはプロセスは、ウイルス産生細胞（ＶＰＣ）およびプラスミドコンストラクトを使用して、バキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を作製するための工程を含む。細胞バンク（ＣＢ）からのウイルス産生細胞（ＶＰＣ）を融解し、拡大させて、標的作業体積およびＶＰＣ濃度を提供する。得られたＶＰＣプールを、Ｒｅｐ／Ｃａｐ ＶＰＣプールとペイロードＶＰＣプールに分割する。１つ以上のＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドコンストラクト（ウイルス発現コンストラクト）をＲｅｐ／Ｃａｐバクミドポリヌクレオチドへ処理し、Ｒｅｐ／ＣａｐＶＰＣプールにトランスフェクトする。１つ以上のペイロードプラスミドコンストラクト（ペイロードコンストラクト）をペイロードバクミドポリヌクレオチドへ処理し、ペイロードＶＰＣプールにトランスフェクトする。２つのＶＰＣプールをインキュベートして、Ｐ１Ｒｅｐ／Ｃａｐバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）およびＰ１ペイロードＢＥＶを作製する。２つのＢＥＶプールは、クローナルプラーク（ＣＰ）精製のために選択された単一のプラークを用いて、プラークのコレクションに拡大される（単一プラーク拡大とも呼ばれる）。プロセスは、単一のＣＰ精製工程を含んでもよく、または一連のもしくは他のプロセシング工程によって分離された複数のＣＰ精製工程を含んでもよい。１つ以上のＣＰ精製工程により、ＣＰ Ｒｅｐ／Ｃａｐ ＢＥＶプールおよびＣＰペイロードＢＥＶプールが提供される。次いで、これら２つのＢＥＶプールを保管し、将来の作製工程のために使用してもよく、またはそれらをＶＰＣにトランスフェクトして、Ｒｅｐ／Ｃａｐ ＢＩＩＣプールおよびペイロードＢＩＩＣプールを作製してもよい。
特定の実施形態において、本開示のウイルス産生システムまたはプロセスは、ウイルス産生細胞（ＶＰＣ）およびバキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を使用してＡＡＶ粒子を作製するための工程を含む。細胞バンク（ＣＢ）からのウイルス産生細胞（ＶＰＣ）を融解し、拡大させて、標的作業体積およびＶＰＣ濃度を提供する。ウイルス産生細胞の作業体積を、産生バイオリアクターに播種し、ＢＩＩＣ感染のための標的ＶＰＣ濃度を有する２００～２０００Ｌの作業体積に更に拡大してもよい。次に、産生バイオリアクター中のＶＰＣの作業体積を、標的ＶＰＣ：ＢＩＩＣ比および標的ＢＩＩＣ：ＢＩＩＣ比で、Ｒｅｐ／Ｃａｐ ＢＩＩＣおよびペイロードＢＩＩＣに共感染させる。ＶＣＤ感染は、ＢＥＶを利用してもよい。共感染させたＶＰＣを、産生バイオリアクター内でインキュベートし、拡大させて、ＡＡＶ粒子およびＶＰＣのバルク回収物を作製する。
ウイルス発現コンストラクト
本開示のウイルス産生システムは、ウイルス産生細胞にトランスフェクト／形質導入され得る１つ以上のウイルス発現コンストラクトを含む。特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトまたはペイロードコンストラクトは、バキュロウイルスプラスミドまたは組換えバキュロウイルスゲノムとしても知られるバクミドであり得る。特定の実施形態において、ウイルス発現は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびウイルス産生細胞において発現するための少なくとも１つの発現制御配列を含む。特定の実施形態において、ウイルス発現は、ウイルス産生細胞において発現するための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、１つ以上のプロモータの制御下にパルボウイルス遺伝子を含む。パルボウイルス遺伝子は、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ６８、またはＲｅｐ７８タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子などの非構造ＡＡＶ複製タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。パルボウイルス遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質をコードするＣａｐ遺伝子などの構造ＡＡＶタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、Ｒｅｐ５２をコードする領域を含んでもよく；Ｒｅｐ５２をコードする領域は、Ｒｅｐ５２タンパク質をコードするＲｅｐ５２ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、Ｒｅｐ７８をコードする領域を含んでもよく；Ｒｅｐ７８をコードする領域は、Ｒｅｐ７８タンパク質をコードするＲｅｐ７８ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、Ｒｅｐ４０をコードする領域を含んでもよく；Ｒｅｐ４０をコードする領域は、Ｒｅｐ４０タンパク質をコードするＲｅｐ４０ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、Ｒｅｐ６８をコードする領域を含んでもよく；Ｒｅｐ６８をコードする領域は、Ｒｅｐ６８タンパク質をコードするＲｅｐ６８ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、ＶＰをコードする領域を含んでもよく；ＶＰをコードする領域は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、またはそれらの組合せをコードするＶＰヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、ＶＰ１をコードする領域を含んでもよく；ＶＰ１をコードする領域は、ＶＰ１タンパク質をコードするＶＰ１ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、ＶＰ２をコードする領域を含んでもよく；ＶＰ２をコードする領域は、ＶＰ２タンパク質をコードするＶＰ２ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、ＶＰ３をコードする領域を含んでもよく；ＶＰ３をコードする領域は、ＶＰ３タンパク質をコードするＶＰ３ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。
ウイルス発現コンストラクトのＶＰ構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、ならびに非構造タンパク質Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ７８は、選択的スプライスアクセプターおよび非カノニカル翻訳開始コドンの両方の利用によって調節される単一のオープンリーディングフレームでコードされ得る。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２は共に、単一の転写物から翻訳され得る：Ｒｅｐ７８翻訳は、最初の開始コドン（ＡＵＧまたは非ＡＵＧ）で開始し、Ｒｅｐ５２翻訳は、Ｒｅｐ７８配列内のＲｅｐ５２開始コドン（例えば、ＡＵＧ）から開始する。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２は、独立した開始コドンを有する別々の転写物からも翻訳され得る。Ｒｅｐ７８配列内のＲｅｐ５２開始コドンは、改変されたＲｅｐ７８配列のプロセシングがＲｅｐ５２タンパク質を生じさせないように、突然変異、改変または除去され得る。
ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、インフレームおよび／またはアウトオブフレーム開始コドンの両方がヌクレオチド転写物によって産生されるＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比率を制御するように操作されている単一の転写物から転写および翻訳され得る。特定の実施形態において、ＶＰ１は、ＶＰ１のみをコードする配列から産生され得る。本明細書で使用されるとき、用語「ＶＰ１だけ」または「ＶＰ１のみ」は、ＶＰ１カプシドタンパク質をコードし、かつ：（ｉ）同じ配列からのＶＰ２およびＶＰ３の完全な転写または翻訳のために必要なＶＰ１配列内の開始コドンを欠く（即ち、欠失または突然変異されている）；（ｉｉ）同じ配列からのＶＰ２およびＶＰ３の転写または翻訳を防止する追加のコドンをＶＰ１配列内に含む；または（ｉｉｉ）ＶＰ１がヌクレオチド転写物によって産生される主なＶＰタンパク質になるように、ＶＰ１のための開始コドン（例えば、ＡＴＧ）を含む、ヌクレオチド配列または転写物を指す。
特定の実施形態において、ＶＰ２は、ＶＰ２のみをコードする配列から産生され得る。本明細書で使用されるとき、用語「ＶＰ２だけ」または「ＶＰ２のみ」は、ＶＰ２カプシドタンパク質をコードし、かつ：（ｉ）ヌクレオチド転写物が、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質のみをコードする完全なＶＰカプシド配列のトランケート型バリアントである；ならびに（ｉｉ）ＶＰ２がヌクレオチド転写物によって産生される主なＶＰタンパク質になるように、ＶＰ２のための開始コドン（例えば、ＡＴＧ）を含む、ヌクレオチド配列または転写物を指す。
特定の実施形態において、ＶＰ１およびＶＰ２は、ＶＰ１およびＶＰ２のみをコードする配列から産生され得る。本明細書で使用されるとき、用語「ＶＰ１およびＶＰ２だけ」または「ＶＰ１およびＶＰ２のみ」は、ＶＰ１およびＶＰ２カプシドタンパク質をコードし、かつ：（ｉ）同じ配列からのＶＰ３の完全な転写または翻訳のために必要なＶＰ配列内の開始コドンを欠く（即ち、欠失または突然変異されている）；（ｉｉ）同じ配列からのＶＰ３の転写または翻訳を防止する追加のコドンをＶＰ配列内に含む；（ｉｉｉ）ＶＰ１およびＶＰ２がヌクレオチド転写物によって産生される主なＶＰタンパク質になるように、ＶＰ１のための開始コドン（例えば、ＡＴＧ）およびＶＰ２のための開始コドン（例えば、ＡＴＧ）を含む；または（ｉｖ）ＩＲＥＳ領域などのリンカーによって接続されたＶＰ１のみヌクレオチド転写物およびＶＰ２のみヌクレオチド転写物を含む、ヌクレオチド配列または転写物を指す。
本開示のウイルス産生システムは、パルボウイルス機能をウイルス複製細胞中に導入するために使用されるウイルス発現ベクターによって限定されない。ウイルス複製細胞中のウイルス発現コンストラクトの存在は、永続的である必要はない。ウイルス発現コンストラクトは、例えば、細胞の化学的処理、エレクトロポレーション、または感染によって、任意の公知の手段によって導入され得る。
本開示のウイルス発現コンストラクトは、核酸を有する細胞の形質転換、トランスフェクション、または形質導入を容易にする任意の化合物もしくは製剤、または生物学的もしくは化学的物質を含んでもよい。例示的な生物学的ウイルス発現コンストラクトとしては、プラスミド、線状核酸分子、および組換えウイルス、例えばバキュロウイルスが挙げられる。例示的な化学的ベクターとしては、脂質複合体が挙げられる。ウイルス発現コンストラクトは、核酸配列を、本開示に従ってウイルス複製細胞に組み込むために使用される。（オライリー（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）、デイビッド Ｒ．（Ｄａｖｉｄ Ｒ．）、ロイス Ｋ．ミラー（Ｌｏｉｓ Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ）およびベルネ Ａ ラコウ（Ｖｅｒｎｅ Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ）、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９９４年）；マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＣＳＨラボラトリー（ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州ニューヨーク所在（１９８２年）；ならびにフィリポート（Ｐｈｉｌｉｐｏｒｔ）およびスクルバー（Ｓｃｌｕｂｅｒ）編、Ｌｉｐｏｓｏｅｓ ａｓ ｔｏｏｌｓ ｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、ミシガン州アナーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）所在（１９９５年）、これらの各々の内容は、ウイルス発現コンストラクトおよびその使用に関係して、本明細書において全体として参照により援用される。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、非構造ＡＡＶ複製タンパク質、構造ＡＡＶカプシドタンパク質、またはその組合せをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むＡＡＶ発現コンストラクトである。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、プラスミドベクターであり得る。特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、バキュロウイルスコンストラクトであり得る。
本開示は、ＡＡＶ粒子またはウイルスベクターを作製するために用いられるウイルス発現コンストラクトの数によって限定されない。特定の実施形態において、本開示に従って、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または６つより多くのウイルス発現コンストラクトが、ウイルス産生細胞においてＡＡＶ粒子を作製するために用いられてもよい。１つの非限定的な例において、５つの発現コンストラクトが、ＡＡＶ ＶＰ１、ＡＡＶ ＶＰ２、ＡＡＶ ＶＰ３、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ７８を個別にコードしてもよく、付随するペイロードコンストラクトが、ペイロードポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含む。別の実施形態において、発現コンストラクトは、例えば、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０、またはＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８を発現させるために使用され得る。発現コンストラクトは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、Ｒｅｐ５２／Ｒｅｐ４０、およびＲｅｐ７８／Ｒｅｐ６８コード配列の任意の組合せを含み得る。
本開示の特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、昆虫細胞においてＡＡＶ粒子を作製するために使用されてもよい。特定の実施形態において、例えば、感染性もしくは特異性の増加などのウイルス粒子の属性を改善するために、または産生収率を向上させるために、カプシドおよび／またはｒｅｐ遺伝子の野生型ＡＡＶ配列に改変を行ってもよい。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列間に、１つ以上の発現制御配列を含むことができる。特定の実施形態において、発現制御領域は、内部リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードするＩＲＥＳヌクレオチド配列を含むＩＲＥＳ配列領域を含むことができる。内部リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、口蹄疫ウイルス由来のＦＭＤＶ－ＩＲＥＳ、脳心筋炎ウイルス由来のＥＭＣＶ－ＩＲＥＳ、およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。
特定の実施形態において、発現制御領域は、ウイルス２Ａペプチドをコードする２Ａヌクレオチド配列を含む２Ａ配列領域を含むことができる。この配列は、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内の複数のポリペプチドの同時翻訳を可能にする。ＯＲＦが翻訳されると、グリシンおよびプロリン残基が２Ａ配列と共に、正常なペプチド結合の形成を防止し、それにより、ポリペプチド鎖内のリボゾーム「スキッピング」および「自己切断」がもたらされる。ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス由来のＦ２Ａ、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス由来のＴ２Ａ、ウマ鼻炎Ａウイルス由来のＥ２Ａ、ブタテッショウウイルス－１由来のＰ２Ａ、細胞質多角体病ウイルス由来のＢｍＣＰＶ２Ａ、Ｂ．ｍｏｒｉ軟化病ウイルス由来のＢｍＩＦＶ２Ａ、およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、開始コドン領域を含むヌクレオチド配列、例えば、１つ以上の開始コドン領域を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列を含んでもよい。特定の実施形態において、開始コドン領域は、発現制御配列内にあってもよい。開始コドンは、ＡＴＧまたは非ＡＴＧコドン（すなわち、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の開始コドンが非ＡＴＧである、最適以下の開始コドン）であってもよい。
特定の実施形態において、ＡＡＶ産生に使用されるウイルス発現コンストラクトは、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の開始コドンが非ＡＴＧ、すなわち最適以下の開始コドンである、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく、産生システムにおけるウイルスカプシドタンパク質の改変比率の発現を可能にして、宿主細胞の改善された感染性を提供し得る。非限定的な例において、ウイルスコンストラクトベクターは、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトであって、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンが、米国特許第８，１６３，５４３号明細書（その内容は、ＡＡＶカプシドタンパク質およびその産生に関係して、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されているように、ＣＴＧ、ＴＴＧまたはＧＴＧである、核酸コンストラクトを含んでもよい。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、昆虫細胞内での発現のためのパルボウイルスｒｅｐタンパク質をコードするプラスミドベクターまたはバキュロウイルスコンストラクトであってもよい。特定の実施形態において、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質には、例えば、その中で高いベクター収率を促進するＲｅｐ５２と比較してＲｅｐ７８のより少ない発現を促進するために、単一のコード配列が使用され、ここで、Ｒｅｐ７８タンパク質の翻訳開始コドンは、米国特許第８，５１２，９８１号明細書（その内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載されているように、昆虫細胞内での発現時に部分的なエクソンスキップをもたらす、ＡＣＧ、ＴＴＧ、ＣＴＧおよびＧＴＧからなる群から選択される最適以下の開始コドンである。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、米国特許第８，６９７，４１７号明細書（ＡＡＶ複製タンパク質およびその産生に関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）で教示される通り、例えば、改善された比率のＲｅｐタンパク質、例えば、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２を達成して、昆虫細胞におけるウイルス発現コンストラクトおよび／またはペイロードコンストラクトベクターの大規模（商業的）産生を改善するための、昆虫細胞における発現のための、差次的コドンバイアスを有する反復コドンを含有するプラスミドベクターまたはバキュロウイルスコンストラクトであり得る。
別の実施形態において、改善された比率のｒｅｐタンパク質は、米国特許第８，６４２，３１４号明細書（ＡＡＶ複製タンパク質およびその産生に関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）に記載される方法およびコンストラクトを使用して達成され得る。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、大規模産生のためのより高いウイルス力価の調製物など、その対応する野生型Ｒｅｐポリペプチドと比較して１つ以上の改善された特性を有する突然変異体パルボウイルスＲｅｐポリペプチドをコードしていてもよい。代替として、これらは、より高品質のウイルス粒子の産生を可能にすること、またはウイルスのより安定な産生を持続させることが可能であってもよい。非限定的な例において、ウイルス発現コンストラクトは、米国特許出願公開第２０１３００２３０３４号明細書（ＡＡＶ複製タンパク質およびその産生に関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）に記載される通りの、突然変異した核局在化配列またはジンクフィンガードメインを有する突然変異体Ｒｅｐポリペプチドをコードしていてもよい。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、米国特許出願公開第２０１１０１７１２６２号明細書（パルボウイルスカプシドタンパク質に関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）に記載される通りの、免疫浸潤配列として機能し得る取り込まれたＧｌｙ－Ａｌａ反復領域を有するパルボウイルスカプシドの成分をコードしていてもよい。
本開示の特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、昆虫細胞におけるＡＡＶ粒子の産生のために使用され得る。特定の実施形態において、例えば、感染性もしくは特異性の増加などのウイルス粒子の属性を改善するために、または産生収率を向上させるために、カプシドおよび／またはｒｅｐ遺伝子の野生型ＡＡＶ配列に改変を行ってもよい。
特定の実施形態において、ＶＰコード領域は、特異的ＡＡＶ血清型の１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質をコードする。ＶＰコード領域のＡＡＶ血清型は、同じであっても異なってもよい。特定の実施形態において、ＶＰコード領域は、コドン最適化されてもよい。特定の実施形態において、ＶＰコード領域またはヌクレオチド配列は、哺乳類細胞に対してコドン最適化されてもよい。特定の実施形態において、ＶＰコード領域またはヌクレオチド配列は、昆虫細胞に対してコドン最適化されてもよい。特定の実施形態において、ＶＰコード領域またはヌクレオチド配列は、スポドプテラ・フルギペルダ細胞に対してコドン最適化されてもよい。特定の実施形態において、ＶＰコード領域またはヌクレオチド配列は、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞株に対してコドン最適化されてもよい。
特定の実施形態において、１つ以上のＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列と１００％未満のヌクレオチド相同性を有するようにコドン最適化されてもよい。特定の実施形態において、コドン最適化ＶＰヌクレオチド配列と参照ＶＰヌクレオチド配列との間のヌクレオチド相同性は、１００％未満、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満、８９％未満、８８％未満、８７％未満、８６％未満、８５％未満、８４％未満、８３％未満、８２％未満、８１％未満、８０％未満、７８％未満、７６％未満、７４％未満、７２％未満、７０％未満、６８％未満、６６％未満、６４％未満、６２％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、および４０％未満である。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトまたはペイロードコンストラクトは、バキュロウイルスプラスミドまたは組換えバキュロウイルスゲノムとしても知られるバクミドであり得る。特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトまたはペイロードコンストラクト（例えば、バクミド）は、当業者によって行われる公知の標準的分子生物学的技法によって、バクミドへの相同組換え（トランスポゾンドナー／アクセプターシステム）によって組み込まれるポリヌクレオチドを含んでもよい。
特定の実施形態において、バクミドに組み込まれたポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチドインサート）は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含み得る。特定の実施形態において、バクミドに組み込まれたポリヌクレオチドは、ｐ１０またはｐｏｌＨなどのプロモータを含み、構造ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、またはそれらの組合せ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含み得る。特定の実施形態において、バクミドに組み込まれたポリヌクレオチドは、ｐ１０またはｐｏｌＨなどのプロモータを含み、非構造ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ５２、またはそれらの組合せ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含み得る。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドインサートは、バキュロウイルス遺伝子の位置においてバクミド中に取り込まれてもよい。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドインサートは、非必須バキュロウイルス遺伝子の位置においてバクミド中に取り込まれてもよい。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドインサートは、バキュロウイルス遺伝子またはバキュロウイルス遺伝子の部分をポリヌクレオチドインサートで置き換えることによって、バクミド中に取り込まれてもよい。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドインサートは、バキュロウイルス遺伝子またはバキュロウイルス遺伝子の部分を、ポリヌクレオチドインサートと置き換えられるバキュロウイルス遺伝子（またはその部分）とを含む融合ポリヌクレオチドで置き換えることによって、バクミド中に取り込まれ得る。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドインサートは、バキュロウイルス遺伝子をポリヌクレオチドインサートで分割することによって、バクミド中に取り込まれ得る（即ち、ポリヌクレオチドインサートは、遺伝子の中央部に取り込まれ、遺伝子の５’部分をバクミド遺伝子の３’部分から分離する）。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドインサートは、バキュロウイルス遺伝子を、ポリヌクレオチドインサートと分割されたバキュロウイルス遺伝子の部分とを含む融合ポリヌクレオチドで分割することによって、バクミド中に取り込まれ得る。特定の実施形態において、融合ポリヌクレオチドの３’末端は、融合ポリヌクレオチド中の遺伝子の５’部分とバクミド中に残留する遺伝子の３’部分とが、バキュロウイルス遺伝子の完全なまたは機能的部分を形成するように、分割された遺伝子の５’部分を含む。特定の実施形態において、融合ポリヌクレオチドの５’末端は、融合ポリヌクレオチド中の遺伝子の３’部分とバクミド中に残留する遺伝子の５’部分とが、バキュロウイルス遺伝子の完全なまたは機能的部分を形成するように、分割された遺伝子の３’部分を含む。非限定的な例は、実施例１３および１４に提示され、ここで、融合ポリヌクレオチドは、ｇｔａ遺伝子ＯＲＦ由来の成分（完全／部分的Ａｃ－ｌｅｆ１２プロモータ、完全／部分的Ａｃ－ｇｔａ遺伝子）を含むように操作および産生される。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、バキュロウイルス遺伝子に関連する制限エンドヌクレアーゼ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＥＮ）切断部位（即ち、ＲＥＮアクセスポイント）の位置において、バクミド中に取り込まれ得る。特定の実施形態において、バクミド中のＲＥＮアクセスポイントは、ＦｓｅＩ（ｇｔａバキュロウイルス遺伝子と対応する）（ｇｇｃｃｇｇｃｃ）である。特定の実施形態において、バクミド中のＲＥＮアクセスポイントは、ＳｄａＩ（ＤＮＡポリメラーゼバキュロウイルス遺伝子と対応する）（ｃｃｔｇｃａｇｇ）である。特定の実施形態において、バクミド中のＲＥＮアクセスポイントは、ＭａｕＢＩ（ｌｅｆ－４バキュロウイルス遺伝子と対応する）（ｃｇｃｇｃｇｃｇ）である。特定の実施形態において、バクミド中のＲＥＮアクセスポイントは、ＳｂｆＩ（ｇｐ６４／ｇｐ６７バキュロウイルス遺伝子と対応する）（ｃｃｔｇｃａｇｇ）である。特定の実施形態において、バクミド中のＲＥＮアクセスポイントは、Ｉ－ＣｅｕＩ（ｖ－ｃａｔｈバキュロウイルス遺伝子と対応する）（配列番号１）である。特定の実施形態において、バクミド中のＲＥＮアクセスポイントは、ＡｖｒＩＩ（ｅｇｔバキュロウイルス遺伝子と対応する）（ｃｃｔａｇｇ）である。特定の実施形態において、バクミド中のＲＥＮアクセスポイントは、ＮｈｅＩ（ｇｃｔａｇｃ）である。特定の実施形態において、バクミド中のＲＥＮアクセスポイントは、ＳｐｅＩ（ａｃｔａｇｔ）である。特定の実施形態において、バクミド中のＲＥＮアクセスポイントは、ＢｓｔＺ１７Ｉ（ｇｔａｔａｃ）である。特定の実施形態において、バクミド中のＲＥＮアクセスポイントは、ＮｃｏＩ（ｃｃａｔｇｇ）である。特定の実施形態において、バクミド中のＲＥＮアクセスポイントは、ＭｌｕＩ（ａｃｇｃｇｔ）である。
バクミドが二本鎖コンストラクトである特定の実施形態において、ＲＥＮ切断部位は、一方の鎖に切断配列を含み得、他方の鎖に切断配列の逆相補体（これも切断配列として機能する）を含み得る。したがって、ポリヌクレオチドインサート（またはその鎖）は、ＲＥＮ切断配列または逆相補体ＲＥＮ切断配列（これらは一般に機能的に互換性がある）を含み得る。非限定的な例として、ポリヌクレオチドインサートの鎖は、ＦｓｅＩ切断配列（ｇｇｃｃｇｇｃｃ）またはその逆相補体ＲＥＮ切断配列（ｃｃｇｇｃｃｇｇ）を含み得る。
ポリヌクレオチドは、（ｉ）標的ＲＥＮ切断配列を含むように操作されたポリヌクレオチドインサート（例えば、ポリヌクレオチドの両方の末端においてＦｓｅＩ ＲＥＮ配列を含むように操作されたポリヌクレオチドインサート）を提供する工程；（ｉｉ）ポリヌクレオチド挿入のための標的ＲＥＮアクセスポイントを含むバクミド（例えば、ＦｓｅＩ切断部位を含むＡｃＭＮＰＶバクミドのバリアントｂＭＯＮ１４２７２）を提供する工程；（ｉｉ）適切なＲＥＮ酵素を用いてＲＥＮ操作されたポリヌクレオチドを消化する（例えば、両方の末端においてＦｓｅＩ領域を含むＲＥＮ操作性ポリヌクレオチドを消化するためにＦｓｅＩ酵素を使用して、ポリヌクレオチド－ＦｓｅＩインサートを産生する）工程；（ｉｉｉ）バクミドを同じＲＥＮ酵素で消化して、ＲＥＮアクセスポイントにおいてシングルカットされたバクミドを産生する（例えば、ＦｓｅＩ酵素を使用して、ＦｓｅＩ位置においてシングルカットされたバクミドを産生する）工程；ならびに（ｉｖ）Ｔ４リガーゼ酵素などの適切なライゲーション酵素を使用して、ポリヌクレオチドインサートをシングルカットされたバクミド中にライゲーションさせる工程によって、これらのＲＥＮアクセスポイント中に取り込まれ得る。結果は、標的ＲＥＮアクセスポイントにおいて操作されたポリヌクレオチドインサートを含む操作されたバクミドＤＮＡである。
挿入プロセスは、異なるＲＥＮアクセスポイントにおいて同じバクミド中に他の操作されたポリヌクレオチドインサートを取り込むために１回以上反復され得る（例えば、ｅｇｔ中のＡｖｒＩＩ ＲＥＮアクセスポイントにおける第１の操作されたポリヌクレオチドインサートの挿入、その後、ｃａｔｈ遺伝子中のＩ－ＣｅｕＩ ＲＥＮアクセスポイントにおける第２の操作されたポリヌクレオチドインサートの挿入、その後、ｇｔａ遺伝子中のＦｓｅＩ ＲＥＮアクセスポイントにおける第３の操作されたポリヌクレオチドインサートの挿入）。
特定の実施形態において、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥＮ）切断は、バクミドから１つ以上の野生型遺伝子を除去するために使用され得る。特定の実施形態において、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥＮ）切断は、バクミド中に以前に挿入された１つ以上の操作されたポリヌクレオチドインサートを除去するために使用され得る。特定の実施形態において、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥＮ）切断は、１つ以上の操作されたポリヌクレオチドインサートを、同じＲＥＮ切断配列を含む異なる操作されたポリヌクレオチドインサートで置き換えるために使用され得る（例えば、ＦｓｅＩ ＲＥＮアクセスポイントにおける操作されたポリヌクレオチドインサートが、ＦｓｅＩ ＲＥＮ切断配列を含む異なる操作されたポリヌクレオチドインサートで置き換えられ得る）。
特定の実施形態において、米国特許第８，５１２，９８１号明細書、米国特許第８，１６３，５４３号明細書、米国特許第８，６９７，４１７号明細書、米国特許第８，６４２，３１４号明細書、米国特許出願公開第２０１３０２９６５３２号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１１９７７７号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１３６２２７号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１７１２６２号明細書、米国特許出願公開第２０１３００２３０３４号明細書、国際特許出願第ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０６１３号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＮＬ２００９／０５００７６号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＮＬ２００９／０５０３５２号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＮＬ２０１１／０５０１７０号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＮＬ２０１２／０５０６１９号および米国特許出願第１４／１４９，９５３号明細書（本開示と矛盾しない限り、その各々の内容は全体として本願明細書に援用される）に教示されるウイルス発現コンストラクトが使用され得る。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、米国特許第６，４６８，５２４号明細書、米国特許第６，９８４，５１７号明細書、米国特許第７，４７９，５５４号明細書、米国特許第６，８５５，３１４号明細書、米国特許第７，２７１，００２号明細書、米国特許第６，７２３，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１４０１０７１８６号明細書、米国特許出願第０９／７１７，７８９号明細書、米国特許出願第１１／９３６，３９４号明細書、米国特許出願第１４／００４，３７９号明細書、欧州特許出願第１０８２４１３号明細書、欧州特許出願第２５００４３４号明細書、欧州特許出願第２６８３８２９号明細書、欧州特許出願第１５７２８９３号明細書ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／１１９５８号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９１２３号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５４３０３号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３５８２９号（本開示と矛盾しない限り、その各々の内容は全体として本願明細書に援用される）に教示されるウイルス発現コンストラクトに由来してもよい。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、サル種由来の配列を含んでもよい。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、限定はされないが、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１５６９４号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０００／０３３２５６号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０１９７３５号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３３６４５号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１３０６７号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１３０６６号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１３０６５号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６２５４８号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００１３４４号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３６３３２号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６１６３２号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０４１５６５号、米国特許出願第１３／４７５５３５号明細書、米国特許出願第１３／８９６７２２号明細書、米国特許出願第１０／７３９０９６号明細書、米国特許出願第１４／０７３９７９号明細書、米国特許出願公開第２００１００４９１４４号明細書、米国特許出願公開第２０１２００９３８５３号明細書、米国特許出願公開第２００９０２１５８７１号明細書、米国特許出願公開第２００４０１３６９６３号明細書、米国特許出願公開第２００８０２１９９５４号明細書、米国特許出願公開第２００４０１７１８０７号明細書、米国特許出願公開第２０１２００９３７７８号明細書、米国特許出願公開第２００８００９０２８１号明細書、米国特許出願公開第２００５００６９８６６号明細書、米国特許出願公開第２０１００２６０７９９号明細書、米国特許出願公開第２０１００２４７４９０号明細書、米国特許出願公開第２０１４００４４６８０号明細書、米国特許出願公開第２０１００２５４９４７号明細書、米国特許出願公開第２０１１０２２３１３５号明細書、米国特許出願公開第２０１３０３０９２０５号明細書、米国特許出願公開第２０１２０１８９５８２号明細書、米国特許出願公開第２０１３０００４４６１号明細書、米国特許出願公開第２０１３０３１５８７１号明細書、米国特許第６０８３７１６号明細書、米国特許第７８３８２７７号明細書、米国特許第７３４４８７２号明細書、米国特許第８６０３４５９号明細書、米国特許第８１０５５７４号明細書、米国特許第７２４７４７２号明細書、米国特許第８２３１８８０号明細書、米国特許第８５２４２１９号明細書、米国特許第８４７０３１０号明細書、欧州特許出願第２３０１５８２号明細書、欧州特許出願第２２８６８４１号明細書、欧州特許出願第１９４４０４３号明細書、欧州特許出願第１４５３５４３号明細書、欧州特許出願第１４０９７４８号明細書、欧州特許出願第２４６３３６２号明細書、欧州特許出願第２２２０２１７号明細書、欧州特許出願第２２２０２４１号明細書、欧州特許出願第２２２０２４２号明細書、欧州特許出願第２３５０２６９号明細書、欧州特許出願第２２５０２５５号明細書、欧州特許出願第２４３５５５９号明細書、欧州特許出願第２６４３４６５号明細書、欧州特許出願第１４０９７４８号明細書、欧州特許出願第２３２５２９８号明細書、欧州特許出願第１２４０３４５号明細書（本開示と矛盾しない限り、その各々の内容は全体として本願明細書に援用される）からのカプシドおよびｒｅｐ配列が挙げられる配列を含有してもよい。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、本開示と矛盾しない限り、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０２５０９６号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３３６２９号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１２４０５号、米国特許出願第１０／２９１５８３号明細書、米国特許出願第１０／４２０２８４号明細書、米国特許第７，３１９，００２号明細書、米国特許出願公開第２００４０１９１７６２号明細書、米国特許出願公開第２０１３００４５１８６号明細書、米国特許出願公開第２０１１０２６３０２７号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１５１４３４号明細書、米国特許出願公開第２００３０１３８７７２号明細書、米国特許出願公開第２００３０２０７２５９号明細書、欧州特許出願第２３３８９００号明細書、欧州特許出願第１４５６４１９号明細書、欧州特許出願第１３１０５７１号明細書、欧州特許出願第１３５９２１７号明細書、欧州特許出願第１４２７８３５号明細書、欧州特許出願第２３３８９００号明細書、欧州特許出願第１４５６４１９号明細書、欧州特許出願第１３１０５７１号明細書、欧州特許出願第１３５９２１７号明細書ならびに米国特許第７，２３５，３９３号明細書および米国特許第８，５２４，４４６号明細書に記載される１つ以上のウイルスコンストラクト由来の１つ以上のヌクレオチド配列を含んでもよい。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／０２５６９４号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／０１００９６号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００１／０１３０００号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００２／２５９７６号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３３６３１号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３３６３０号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４１６０６号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２５５５０号、米国特許第８６３７２５５号明細書、米国特許第８６３７２５５号明細書、米国特許第７１８６５５２号明細書、米国特許第７１０５３４５号明細書、米国特許第６７５９２３７号明細書、米国特許第７０５６５０２号明細書、米国特許第７１９８９５１号明細書、米国特許第８３１８４８０号明細書、米国特許第７７９０４４９号明細書、米国特許第７２８２１９９号明細書、米国特許出願公開第２０１３００５９２８９号明細書、米国特許出願公開第２００４００５７９３３号明細書、米国特許出願公開第２００４００５７９３２号明細書、米国特許出願公開第２０１００２７８７９１号明細書、米国特許出願公開第２００８００５０３４５号明細書、米国特許出願公開第２００８００５０３４３号明細書、米国特許出願公開第２００８０００８６８４号明細書、米国特許出願公開第２００６０２０４４７９号明細書、米国特許出願公開第２００４００５７９３１号明細書、米国特許出願公開第２００４００５２７６４号明細書、米国特許出願公開第２００３００１３１８９号明細書、米国特許出願公開第２００９０２２７０３０号明細書、米国特許出願公開第２００８００７５７４０号明細書、米国特許出願公開第２００８００７５７３７号明細書、米国特許出願公開第２００３０２２８２８２号明細書、米国特許出願公開第２０１３０３２３２２６号明細書、米国特許出願公開第２００５００１４２６２号明細書、米国特許出願第１４／１３６３３１号明細書、米国特許出願第０９／０７６３６９号明細書、米国特許出願第１０／７３８６０９号明細書、欧州特許出願第２５７３１７０号明細書、欧州特許出願第１１２７１５０号明細書、欧州特許出願第２３４１０６８号明細書、欧州特許出願第１８４５１６３号明細書、欧州特許出願第１１２７１５０号明細書、欧州特許出願第１０７８０９６号明細書、欧州特許出願第１２８５０７８号明細書、欧州特許出願第１４６３８０５号明細書、欧州特許出願第２０１０１７８９４０号明細書、米国特許出願公開第２０１４０００４１４３号明細書、欧州特許出願第２３５９８６９号明細書、欧州特許出願第１４５３５４７号明細書、欧州特許出願第２３４１０６８号明細書および欧州特許出願第２６７５９０２号明細書（本開示と矛盾しない限り、その各々の内容は全体として本願明細書に援用される）に記載される配列または組成物を含んでもよい。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、米国特許第７１８６５５２号明細書、米国特許第７１０５３４５号明細書、米国特許第６７５９２３７号明細書、米国特許第７０５６５０２号明細書、米国特許第７１９８９５１号明細書、米国特許第８３１８４８０号明細書、米国特許第７７９０４４９号明細書、米国特許第７２８２１９９号明細書、米国特許出願公開第２０１３００５９２８９号明細書、米国特許出願公開第２００４００５７９３３号明細書、米国特許出願公開第２００４００５７９３２号明細書、米国特許出願公開第２０１００２７８７９１号明細書、米国特許出願公開第２００８００５０３４５号明細書、米国特許出願公開第２００８００５０３４３号明細書、米国特許出願公開第２００８０００８６８４号明細書、米国特許出願公開第２００６０２０４４７９号明細書、米国特許出願公開第２００４００５７９３１号明細書、米国特許出願公開第２０１４０００４１４３号明細書、米国特許出願公開第２００９０２２７０３０号明細書、米国特許出願公開第２００８００７５７４０号明細書、米国特許出願公開第２００８００７５７３７号明細書、米国特許出願公開第２００３０２２８２８２号明細書、米国特許出願公開第２００４００５２７６４号明細書、米国特許出願公開第２００３００１３１８９号明細書、米国特許出願公開第２００５００１４２６２号明細書、米国特許出願公開第２０１３０３２３２２６号明細書、米国特許出願第１４／１３６３３１号明細書、米国特許出願第１０／７３８６０９号明細書、欧州特許出願第１１２７１５０号明細書、欧州特許出願第２３４１０６８号明細書、欧州特許出願第１８４５１６３号明細書、欧州特許出願第１１２７１５０号明細書、欧州特許出願第１０７８０９６号明細書、欧州特許出願第１２８５０７８号明細書、欧州特許出願第２５７３１７０号明細書、欧州特許出願第１４６３８０５号明細書、欧州特許出願第２６７５９０２号明細書、欧州特許出願第２３５９８６９号明細書、欧州特許出願第１４５３５４７号明細書、欧州特許出願第２３４１０６８号明細書（本開示と矛盾しない限り、その各々の内容は全体として本願明細書に援用される）に記載されるもののうち１つ以上由来の１つ以上のヌクレオチド配列を含んでもよい。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９５／０１４０１８号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０００／０２６４４９号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２８８１７号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３３７５号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１００５６号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３２１５８号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５０１３５号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３５９６号、米国特許出願第１２／４７３９１７号明細書、米国特許出願第０８／３３１３８４号明細書、米国特許出願第０９／６７０２７７号明細書、米国特許第５８７１９８２号明細書、米国特許第５８５６１５２号明細書、米国特許第６２５１６７７号明細書、米国特許第６３８７３６８号明細書、米国特許第６３９９３８５号明細書、米国特許第７９０６１１１号明細書、欧州特許出願第２０００１０３６００号明細書、欧州特許出願公開第７９７６７８号明細書、欧州特許出願公開第１０４６７１１号明細書、欧州特許出願公開第１６６８１４３号明細書、欧州特許出願公開第２３５９８６６号明細書、欧州特許出願公開第２３５９８６５号明細書、欧州特許出願公開第２３５７０１０号明細書、欧州特許出願公開第１０４６７１１号明細書、欧州特許出願公開第１２１８０３５号明細書、欧州特許出願公開第２３４５７３１号明細書、欧州特許出願公開第２２９８９２６号明細書、欧州特許出願公開第２２９２７８０号明細書、欧州特許出願公開第２２９２７７９号明細書、欧州特許出願公開第１６６８１４３号明細書、米国特許出願公開第２００９０１９７３３８号明細書、欧州特許出願公開第２３８３３４６号明細書、欧州特許出願公開第２３５９８６７号明細書、欧州特許出願公開第２３５９８６６号明細書、欧州特許出願公開第２３５９８６５号明細書、欧州特許出願公開第２３５７０１０号明細書、欧州特許出願公開第１８６６４２２号明細書、米国特許出願公開第２００９０３１７４１７号明細書、欧州特許出願公開第２０１６１７４号明細書、米国特許出願公開第２０１１０２３６３５３号明細書、米国特許出願公開第２００７００３６７６０号明細書、米国特許出願公開第２０１００１８６１０３号明細書、米国特許出願公開第２０１２０１３７３７９号明細書および米国特許出願公開第２０１３０２８１５１６号明細書（本開示と矛盾しない限り、その各々の内容は全体として本願明細書に援用される）に記載される通りの、改変されたＡＡＶのコンストラクトを含んでもよい。
特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３６７号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０９６５号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４５５６号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００９６９９号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３２９４３号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３６２８号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３６１６号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３４３５５号、米国特許第８３９４３８６号明細書、欧州特許出願公開第１７４２６６８号明細書、米国特許出願公開第２００８０２４１１８９号明細書、米国特許出願公開第２０１２００４６３４９号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１９５８０１号明細書、米国特許出願公開第２０１４００３１４１８号明細書、欧州特許出願公開第２４２５０００号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１０１５５８号明細書、欧州特許出願公開第１７４２６６８号明細書、欧州特許出願公開第２５６１０７５号明細書、欧州特許出願公開第２５６１０７３号明細書、欧州特許出願公開第２６９９６８８号明細書（本開示と矛盾しない限り、その各々の内容は全体として本願明細書に援用される）に記載される１つ以上のコンストラクトを含んでもよい。
発現制御
発現制御領域
本開示のウイルス発現コンストラクトは、発現制御配列によってコードされる１つ以上の発現制御領域を含み得る。特定の実施形態において、発現制御配列は、昆虫細胞などのウイルス産生細胞における発現のためのものである。特定の実施形態において、発現制御配列は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。特定の実施形態において、発現制御配列は、ＶＰをコードするヌクレオチド配列またはＲｅｐをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。
本明細書で、用語「コードするヌクレオチド配列」、「タンパク質をコードする遺伝子」または「タンパク質をコードするヌクレオチド配列」は、ＶＰタンパク質またはＲｅｐタンパク質などのタンパク質産物をコードするまたはそれへと翻訳されるヌクレオチド配列を指す。「作動可能に連結された」は、発現制御配列がコード化遺伝子産物の発現を促進することができるように、発現制御配列がコード配列に対して位置していることを意味する。
「発現制御配列」は、作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現を調節する核酸配列を指す。発現制御配列は、発現制御配列がヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を制御および調節する場合、ヌクレオチド配列に「作動可能に連結され」ている。したがって、発現制御配列としては、プロモータ、エンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、内部リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前にある開始コドン、イントロンのためのスプライシングシグナル、および終止コドンが挙げられ得る。用語「発現制御配列」は、その存在が発現に影響を及ぼすように設計された配列を最低でも含む意図であり、追加の有利な成分もまた含むことができる。例えば、リーダー配列および融合パートナー配列は、発現制御配列である。この用語は、フレームの内側および外側の望ましくない潜在的開始コドンが配列から除去されるような、核酸配列の設計もまた含み得る。これは、望ましくない潜在的スプライス部位が除去されるような、核酸配列の設計もまた含み得る。これは、ポリＡテール、即ち、ｍＲＮＡの３’末端にあるアデニン残基のストリング、ポリＡ配列と呼ばれる配列の付加を指示する配列、即ちポリアデニル化配列（ｐＡ）を含む。これは、ｍＲＮＡ安定性を増強するように設計することもできる。転写および翻訳安定性に影響を与える発現制御配列、例えば、プロモータ、ならびに翻訳をもたらす配列、例えば、コザック配列は、昆虫細胞において公知である。発現制御配列は、より低い発現レベルまたはより高い発現レベルが達成されるように、発現制御配列が作動可能に連結されているヌクレオチド配列を調節するなどの性質のものであってもよい。
特定の実施形態において、発現制御配列としては、１つ以上のプロモータが挙げられ得る。プロモータとしては、限定はされないが、バキュロウイルス主要後期プロモータ、昆虫ウイルスプロモータ、非昆虫ウイルスプロモータ、脊椎動物ウイルスプロモータ、核遺伝子プロモータ、ウイルスおよび非ウイルスエレメントを含む１つ以上の種からのキメラプロモータ、ならびに／または合成プロモータが挙げられ得る。特定の実施形態において、プロモータは、Ｃｔｘ、Ｏｐ－ＥＩ、ＥＩ、ΔＥＩ、ＥＩ－１、ｐＨ、ＰＩＯ、ｐｏｌＨ（多面体）、ΔｐｏｌＨ、Ｄｍｈｓｐ７０、Ｈｒ１、Ｈｓｐ７０、４ｘＨｓｐ２７ ＥｃＲＥ＋ミニマルＨｓｐ７０、ＩＥ、ＩＥ－１、ΔＩＥ－１、ΔＩＥ、ｐ１０、Δｐ１０（ｐ１０の改変されたバリエーションまたは誘導体）、ｐ５、ｐ１９、ｐ３５、ｐ４０、ｐ６．９、およびそれらのバリエーションまたは誘導体であってもよい。特定の実施形態において、プロモータは、Ｃｔｘプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ｐ１０プロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、ｐｏｌＨプロモータである。特定の実施形態において、プロモータは、組織特異的プロモータ、細胞型特異的プロモータ、細胞周期特異的プロモータ、およびそれらのバリエーションまたは誘導体から選択され得る。特定の実施形態において、プロモータは、ＣＭＶプロモータ、アルファ１－抗トリプシン（α１－ＡＴ）プロモータ、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモータ、チロキシン結合グロブリン（ｇｌｏｂｌｉｎ）（ＬＰＳ）プロモータ、ＨＣＲ－ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモータ、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモータ、アルブミンプロモータ、アポリポタンパク質Ｅプロモータ、α１－ＡＴ＋ＥａＩｂプロモータ、腫瘍選択的Ｅ２Ｆプロモータ、単核血液ＩＬ－２プロモータ、およびそれらのバリエーションまたは誘導体であってもよい。特定の実施形態において、プロモータは、低発現プロモータ配列である。特定の実施形態において、プロモータは、増強発現プロモータ配列である。特定の実施形態において、プロモータとしては、米国特許出願公開第２０１１０１３６２２７号明細書（発現プロモータに関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）に記載される通りのＲｅｐまたはＣａｐプロモータが挙げられ得る。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、全てのヌクレオチド配列において同じプロモータを含み得る。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、２つ以上のヌクレオチド配列において同じプロモータを含み得る。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、２つ以上のヌクレオチド配列において異なるプロモータを含み得る。特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、全てのヌクレオチド配列において異なるプロモータを含み得る。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、特定の細胞型における発現を改善するエレメントをコードする。更なる実施形態において、発現コンストラクトは、哺乳類または昆虫細胞における所望の遺伝子の発現のための、ｐｏｌｈおよび／もしくはΔＩＥ－１昆虫転写プロモータ、ＣＭＶ哺乳類転写プロモータならびに／またはｐ１０昆虫特異的プロモータを含み得る。
１つ超の発現制御配列が、所与のヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。例えば、プロモータ配列、翻訳開始配列および終止コドンが、ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。
特定の実施形態において、ウイルス発現コンストラクトは、１つ以上の開始コドン領域を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列など、開始コドン領域を含むヌクレオチド配列を含有してもよい。特定の実施形態において、開始コドン領域は、発現制御配列内にあってもよい。
真核生物ｍＲＮＡの翻訳開始部位は、コザック、エム（Ｋｏｚａｋ，Ｍ），Ｃｅｌｌ．１９８６ Ｊａｎ ３１；４４（２）：２８３－９２およびコザック、エム（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．），Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８９年２月；１０８（２）：２２９－４１（コザック配列およびその使用に関して、その各々の内容は全体として本願明細書に援用される）に記載される通りの、コザック配列と称されるヌクレオチド配列によって一部制御される。コザック形態の天然に存在する翻訳開始部位および合成翻訳開始部位の両方が、分子遺伝学的技法、コザック、エム（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．），Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ．１９９６年８月；７（８）：５６３－７４（コザック配列およびその使用に関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）によるポリペプチドの産生において使用され得る。スプライス部位は、ｍＲＮＡの転写（形成）後のｍＲＮＡ配列の一部の除去を容易にする、ｍＲＮＡ上の配列である。典型的には、スプライシングは、細胞の細胞質中へのｍＲＮＡ輸送の前に、核において生じる。
本開示の方法は、特定の発現制御配列の使用によって限定されない。しかしながら、ＶＰ産物の特定の化学量論量が達成されるとき（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３についてそれぞれ１：１：１０近く）、およびＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０（ｐ１９Ｒｅｐとも呼ばれる）のレベルがＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８（ｐ５Ｒｅｐとも呼ばれる）よりも著しく高いとき、産生細胞（昆虫細胞など）におけるＡＡＶの収率が改善され得る。特定の実施形態において、ｐ５／ｐ１９比は、０．６未満、０．４未満、または０．３未満であるが、常に少なくとも０．０３である。これらの比は、タンパク質レベルで測定され得るか、または特定のｍＲＮＡの相対レベルから含意され得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（例えば、哺乳類または昆虫細胞）において産生され、３つ全てのＶＰタンパク質は、１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近い、約１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の、または１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）である化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（例えば、哺乳類または昆虫細胞）において産生され、３つ全てのＶＰタンパク質は、２：２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近い、約２：２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の、または２：２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）である化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（例えば、哺乳類または昆虫細胞）において産生され、３つ全てのＶＰタンパク質は、２：０：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近い、約２：０：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の、または２：０：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）である化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（例えば、哺乳類または昆虫細胞）において産生され、３つ全てのＶＰタンパク質は、１～２：０～２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近い、約１～２：０～２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の、または１～２：０～２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）である化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（例えば、哺乳類または昆虫細胞）において産生され、３つ全てのＶＰタンパク質は、１～２：１～２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近い、約１～２：１～２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の、または１～２：１～２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）である化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（例えば、哺乳類または昆虫細胞）において産生され、３つ全てのＶＰタンパク質は、２～３：０～３：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近い、約２～３：０～３：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の、または２～３：０～３：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）である化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（例えば、哺乳類または昆虫細胞）において産生され、３つ全てのＶＰタンパク質は、２～３：２～３：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近い、約２～３：２～３：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の、または２～３：２～３：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）である化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（例えば、哺乳類または昆虫細胞）において産生され、３つ全てのＶＰタンパク質は、３：３：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近い、約３：３：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の、または３：３：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）である化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（例えば、哺乳類または昆虫細胞）において産生され、３つ全てのＶＰタンパク質は、３～５：０～５：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近い、約３～５：０～５：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の、または３～５：０～５：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）である化学量論で発現される。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（例えば、哺乳類または昆虫細胞）において産生され、３つ全てのＶＰタンパク質は、３～５：３～５：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近い、約３～５：３～５：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の、または３～５：３～５：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）である化学量論で発現される。
特定の実施形態において、発現制御領域は、約または正確に１：０：１０、約または正確に１：１：１０、約または正確に２：１：１０、約または正確に２：１：１０、約または正確に２：２：１０、約または正確に３：０：１０、約または正確に３：１：１０、約または正確に３：２：１０、約または正確に３：３：１０、約または正確に４：０：１０、約または正確に４：１：１０、約または正確に４：２：１０、約または正確に４：３：１０、約または正確に４：４：１０、約または正確に５：５：１０、約または正確に１～２：０～２：１０、約または正確に１～２：１～２：１０、約または正確に１～３：０～３：１０、約または正確に１～３：１～３：１０、約または正確に１～４：０～４：１０、約または正確に１～４：１～４：１０、約または正確に１～５：１～５：１０、約または正確に２～３：０～３：１０、約または正確に２～３：２～３：１０、約または正確に２～４：２～４：１０、約または正確に２～５：２～５：１０、約または正確に３～４：３～４：１０、約または正確に３～５：３～５：１０、および約または正確に４～５：４～５：１０からなる群から選択されるＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比を生じるように操作される。
本開示の特定の実施形態において、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ７８は、バキュロウイルス由来多面体プロモータ（ｐｏｌｈ）から転写される。Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ７８は、弱いプロモータ、例えば、ＩＥ－１プロモータの欠失変異体であり、ＩＥ－１プロモータの転写活性の約２０％を有するΔＩＥ－１プロモータからも転写され得る。ΔＩＥ－１プロモータに対して実質的に相同なプロモータを用いてもよい。プロモータに関して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％超の相同性は、実質的に相同なプロモータとみなされる。
ウイルス産生細胞とベクター
哺乳類細胞
本明細書に開示される本開示のウイルス産生は、ペイロードコンストラクト、例えばペイロード分子をコードするヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ粒子またはウイルスコンストラクトを送達するために標的細胞に接触するＡＡＶ粒子またはウイルスベクターを作製するためのプロセスおよび方法を説明する。ウイルス産生細胞は、原核（例えば、細菌）細胞、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳類細胞を含む真核細胞を含む、任意の生物学的生物から選択され得る。
特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、哺乳類細胞を含むウイルス産生細胞において作製され得る。ウイルス産生細胞は、Ａ５４９、ＷＥＨ１、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２などの哺乳類細胞、ならびに哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞、および筋芽細胞を含み得る。ウイルス産生細胞は、哺乳類種、例えば、限定はされないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、およびハムスター、または、細胞型、例えば、限定はされないが、線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞、細胞株形質転換細胞など、に由来する細胞を含み得る。
組換えＡＡＶ粒子を作製するために一般的に使用されるＡＡＶウイルス産生細胞は、限定はされないが、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞、ＢＨＫ、および米国特許第６，１５６，３０３号明細書、同第５，３８７，４８４号明細書、同第５，７４１，６８３号明細書、同第５，６９１，１７６号明細書、同第６，４２８，９８８号明細書、および同第５，６８８，６７６号明細書；米国特許出願公開第２００２／００８１７２１号明細書；ならびに国際公開第００／４７７５７号パンフレット、同第００／２４９１６号パンフレット、および同第９６／１７９４７号パンフレットに記載されている他の哺乳類細胞株を含み、これらの文献の各々の内容は、それらが本開示と矛盾しない限り、本明細書において全体として参照により援用される。特定の実施形態において、ＡＡＶウイルス産生細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失された機能を提供するトランス相補（ｔｒａｎｓ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）パッケージング細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞または他のＥａトランス相補細胞である。
特定の実施形態において、パッケージング細胞株２９３－１０－３（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－２３６１）は、米国特許第６，２８１，０１０号明細書（その内容は、２９３－１０－３パッケージング細胞株およびその使用に関係して、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されているように、ＡＡＶ粒子を作製するために使用され得る。
特定の実施形態において、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモータの制御下で、アデノウイルスＥ１ａおよびアデノウイルスＥ１ｂをコードするＥ１欠失アデノウイルスベクターをトランス相補するための、本開示の細胞株、例えばＨｅＬＡ細胞株が、米国特許第６３６５３９４号明細書（その内容は、ＨｅＬＡ細胞株およびその使用に関係して、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されるように、ＡＡＶ粒子作製のために使用され得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ペイロードコンストラクト、パルボウイルスＲｅｐおよびパルボウイルスＣａｐならびにヘルパーコンストラクトが３つの異なるコンストラクト内に含まれる三重トランスフェクション法を使用して、哺乳類細胞において産生される。ＡＡＶ粒子作製の３つの成分の三重トランスフェクション方法は、形質導入効率、標的組織（向性）評価、および安定性を含むアッセイのための小ロットのウイルスを産生するために利用されてもよい。
製剤化されるＡＡＶ粒子は、三重トランスフェクションもしくはバキュロウイルス媒介性ウイルス産生、または当該技術分野において公知の任意の他の方法によって作製され得る。当該技術分野で公知の任意の適切な許容される細胞またはパッケージング細胞を、ベクターを作製するために利用してもよい。特定の実施形態において、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失された機能を提供するトランス相補パッケージング細胞株、例えば、２９３細胞、または他のＥ１ａトランス相補細胞が使用される。
遺伝子カセットは、パルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子の一部または全てを含んでもよい。特定の実施形態において、ｃａｐおよびｒｅｐ機能の一部または全ては、カプシドおよび／またはＲｅｐタンパク質をコードするパッケージングベクター（複数可）を細胞に導入することによって、トランスで提供される。特定の実施形態において、遺伝子カセットは、カプシドまたはＲｅｐタンパク質をコードしない。あるいは、安定に形質転換されてｃａｐおよび／またはｒｅｐ遺伝子を発現するパッケージング細胞株が使用される。
特定の実施形態において、組換えＡＡＶウイルス粒子は、米国特許出願公開第２０１６／００３２２５４号明細書（その内容は、組換えＡＡＶウイルス粒子の作製およびプロセシングに関係して、全体として参照により援用される）に記載される手順に従って、培養上清から作製および精製される。作製はまた、２９３Ｔ細胞、三重トランスフェクション、または任意の好適な産生方法を使用する方法などの、当該技術分野で公知の方法を含んでもよい。
特定の実施形態において、哺乳類ウイルス産生細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）は、接着／接着性状態（例えば、リン酸カルシウムを用いて）であってもよく、または懸濁状態（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて）であってもよい。哺乳類ウイルス産生細胞を、ＡＡＶの産生に必要なプラスミド（すなわち、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐコンストラクト、アデノウイルスヘルパーコンストラクト、および／またはＩＴＲ隣接ペイロードコンストラクト）でトランスフェクトする。特定の実施形態において、トランスフェクションプロセスは、任意選択の培地変更（例えば、接着形態の細胞について培地変更、懸濁形態の細胞について培地変更なし、所望される場合、懸濁形態の細胞について培地変更）を含み得る。特定の実施形態において、トランスフェクションプロセスは、ＤＭＥＭまたはＦ１７などのトランスフェクション培地を含んでもよい。特定の実施形態において、トランスフェクション培地は、血清を含んでもよく、または無血清であってもよい（例えば、リン酸カルシウムおよび血清を用いて接着状態にある細胞、ＰＥＩを用い、血清なしで懸濁状態にある細胞）。
細胞は、その後、掻爬（接着性形態）および／またはペレット化（懸濁形態および掻爬された接着性形態）によって収集し、容器に移してもよい。産生された細胞を完全に収集するために、必要に応じて収集工程を繰り返してもよい。次に、細胞溶解を、連続的な凍結融解サイクル（－８０℃～３７℃）、化学溶解（洗浄剤トリトンの添加など）、もしくは機械的溶解によって、または約０％のバイアビリティに達した後に細胞培養物を分解させることによって達成してもよい。細胞残屑は、遠心分離および／または深度濾過によって除去する。試料は、ＤＮＡ ｑＰＣＲによるＤＮａｓｅ耐性ゲノム滴定によって、ＡＡＶ粒子について定量する。
ＡＡＶ粒子力価は、ゲノムコピー数（１ミリリットル当たりのゲノム粒子）に応じて測定される。ゲノム粒子濃度は、以前に報告されたように、ベクターＤＮＡのＤＮＡ ｑＰＣＲに基づく（クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１－１０３９、フェルトワイク（Ｖｅｌｄｗｉｊｋ）ら（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，６：２７２－２７８、これらの各々の内容は、粒子濃度の測定に関係して、全体として参照により援用される）。
昆虫細胞
本開示のウイルス産生は、ペイロードコンストラクト、例えばペイロード分子をコードするヌクレオチドを含む組換えウイルスコンストラクトを送達するために標的細胞に接触するＡＡＶ粒子またはウイルスベクターを作製するためのプロセスおよび方法を含む。特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子またはウイルスベクターは、昆虫細胞を含むウイルス産生細胞において作製されてもよい。
培養中の昆虫細胞の増殖条件、および培養中の昆虫細胞における異種産物の産生は、当該技術分野において周知である。米国特許第６，２０４，０５９号明細書を参照されたい（その内容は、ウイルス産生における昆虫細胞の増殖および使用に関係して、本明細書において全体として参照により援用される）。
パルボウイルスの複製を可能にし、培養中に維持され得る任意の昆虫細胞を、本開示に従って使用し得る。組換えＡＡＶ粒子の作製に一般的に使用されるＡＡＶウイルス産生細胞としては、限定されないが、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞株を含むスポドプテラ・フルギペルダ、ショウジョウバエ細胞株、またはヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来細胞株などの蚊細胞株が挙げられる。異種タンパク質の発現のための昆虫細胞の使用は、ベクター、例えば昆虫細胞適合性ベクターなどの核酸をそのような細胞に導入する方法、およびそのような細胞を培養物中で維持する方法と同様に、十分に報告されている。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、リチャード（Ｒｉｃｈａｒｄ）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州所在（１９９５年）；オライリー（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）ら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）（１９９４年）；サムルスキ（Ｓａｍｕｌｓｋｉ）ら，Ｊ．Ｖｉｒ．第６３巻：３８２２－８（１９８９年）；カジガヤ（Ｋａｊｉｇａｙａ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第８８巻：４６４６－５０（１９９１年）；ラフィング（Ｒｕｆｆｉｎｇ）ら，Ｊ．Ｖｉｒ．第６６巻：６９２２－３０（１９９２年）；キムバウアー（Ｋｉｍｂａｕｅｒ）ら、Ｖｉｒ．第２１９巻：３７－４４（１９９６年）；チャオ（Ｚｈａｏ）ら、Ｖｉｒ．第２７２巻：３８２－９３（２０００年）、およびサムルスキ（Ｓａｍｕｌｓｋｉ）ら、米国特許第６，２０４，０５９号明細書が参照され、これらの各々の内容は、ウイルス産生における昆虫細胞の使用に関係して、本明細書において全体として参照により援用される。
一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、国際公開第２０１５／１９１５０８号パンフレット（その内容は、本開示と矛盾しない限り、本明細書において全体として参照により援用される）に記載される方法を使用して作製される。
特定の実施形態において、昆虫宿主細胞システムは、バキュロウイルスシステム（例えば、ラコウ（Ｌｕｃｋｏｗ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第６巻：４７（１９８８年）に記載されるような）と組み合わせて使用してもよい。特定の実施形態において、キメラペプチドを調製するための発現システムは、米国特許第６６６０５２１号明細書（その内容は、ウイルス粒子の作製に関係して、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されているように、高レベルのタンパク質に使用され得るイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ），Ｔｎ ５Ｂ１－４昆虫細胞／バキュロウイルスシステムである。
昆虫細胞の拡大、培養、トランスフェクション、感染、および保管は、当該技術分野で公知の任意の細胞培養培地、細胞トランスフェクション培地、または保管培地、例えば、Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＦＸ－Ｉｎｓｅｃｔ細胞培養培地、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＥＳＦ ＡＦ 昆虫細胞培養培地、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｆ９００ＩＩ 培地、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｆ－９００ＩＩＩ 培地、またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｇｒａｃｅ昆虫培地、において行い得る。本開示の昆虫細胞混合物は、本開示に記載される任意の製剤添加剤または要素、例えば、（限定はされないが）塩、酸、塩基、緩衝液、界面活性剤（ポロキサマー１８８／プルロニック（登録商標）Ｆ－６８など）および他の公知の培養培地要素を含んでもよい。製剤添加剤は、徐々に、または「スパイク」（短時間で大量の組込み）として組み込んでもよい。
バキュロウイルス産生システム
特定の実施形態において、本開示のプロセスは、ウイルス発現コンストラクトおよびペイロードコンストラクトベクターを使用するバキュロウイルスシステムにおける、ＡＡＶ粒子またはウイルスベクターの作製を含み得る。特定の実施形態において、バキュロウイルスシステムは、バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）および／またはバキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を含む。特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトまたはペイロードコンストラクトは、バキュロウイルスプラスミドまたは組換えバキュロウイルスゲノムとしても知られるバクミドであり得る。特定の実施形態において、本開示のウイルス発現コンストラクトまたはペイロードコンストラクトは、当業者によって行われる公知の標準的分子生物学的技法によって、バクミドへの相同組換え（トランスポゾンドナー／アクセプターシステム）によって組み込まれるポリヌクレオチドであり得る。別個のウイルス複製細胞集団のトランスフェクションは、バキュロウイルス（ＢＥＶ）の２つ以上の群（例えば２つ、３つ）、ウイルス発現コンストラクト（発現ＢＥＶ）を含み得る１つ以上の群、およびペイロードコンストラクト（ペイロードＢＥＶ）を含み得る１つ以上の群を作製する。バキュロウイルスを、ＡＡＶ粒子またはウイルスベクターの作製のためにウイルス産生細胞に感染させるために使用してもよい。
特定の実施形態において、プロセスは、ウイルス発現コンストラクトおよびペイロードコンストラクトの両方を含む単一バキュロウイルス（ＢＥＶ）群を作製するための単一のウイルス複製細胞集団のトランスフェクションを含む。これらのバキュロウイルスを、ＡＡＶ粒子またはウイルスベクターの作製のためにウイルス産生細胞に感染させるために使用してもよい。
特定の実施形態において、ＢＥＶは、バクミドトランスフェクション剤、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ、ＷＦＩ水、またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ ＩＩ試薬を使用して産生される。特定の実施形態において、ＢＥＶは、昆虫細胞などのウイルス産生細胞において産生され、拡大される。
特定の実施形態において、方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を含む、１つ以上のＢＥＶを含むウイルス産生細胞のシード培養を利用する。シードＢＩＩＣは、ウイルス発現コンストラクトを含む発現ＢＥＶ、およびペイロードコンストラクトを含むペイロードＢＥＶでトランスフェクト／形質導入／感染されている。特定の実施形態において、シード培養物は、回収され、アリコートに分割され、凍結される。更にシード培養物は、後の時点で、産生細胞のナイーブ集団のトランスフェクション／形質導入／感染を開始するために使用してもよい。特定の実施形態において、シードＢＩＩＣのバンクは、－８０℃でまたはＬＮ２蒸気中で保管される。
バキュロウイルスは、複製タンパク質、エンベロープタンパク質およびカプシドタンパク質などのバキュロウイルスの機能および複製に不可欠な幾つかの必須タンパク質から作られている。したがって、バキュロウイルスゲノムは、必須タンパク質をコードする幾つかの必須遺伝子ヌクレオチド配列を含む。非限定的な例として、ゲノムは、バキュロウイルスコンストラクトのための必須タンパク質をコードする必須遺伝子ヌクレオチド配列を含む、必須遺伝子領域を含み得る。必須タンパク質としては、ＧＰ６４バキュロウイルスエンベロープタンパク質、ＶＰ３９バキュロウイルスカプシドタンパク質、またはバキュロウイルスコンストラクトのための他の類似の必須タンパク質が挙げられ得る。
昆虫細胞、例えば、限定はされないが、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）細胞、においてＡＡＶ粒子を作製するためのバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）は、高力価のウイルスベクター生成物を提供する。ウイルス発現コンストラクトおよびペイロードコンストラクトをコードする組換えバキュロウイルスは、ウイルスベクター複製細胞の増殖性感染を開始する。一次感染から放出される感染性バキュロウイルス粒子は、培養物中の追加の細胞に二次的に感染し、感染の初期多重度の関数である幾つかの感染サイクルで細胞培養集団全体に指数関数的に感染する。ウラベ，Ｍ．（Ｕｒａｂｅ，Ｍ．）ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００６年２月；８０（４）：１８７４－８５を参照されたい（その内容は、ＢＥＶおよびウイルス粒子の作製および使用に関係して、本明細書において全体として参照により援用される）。
昆虫細胞システムにおけるバキュロウイルスによるＡＡＶ粒子の作製は、既知のバキュロウイルスの遺伝的および物理的不安定性に対処し得る。
特定の実施形態において、本開示の作製システムは、力価のない感染細胞の保存およびスケールアップシステムを利用することによって、複数継代にわたるバキュロウイルスの不安定性に対処する。ウイルス産生細胞の小規模シード培養物を、ＡＡＶ粒子の構造成分および／または非構造成分をコードするウイルス発現コンストラクトでトランスフェクトする。バキュロウイルス感染ウイルス産生細胞は、液体窒素中で凍結保存され得るアリコートに回収される；アリコートは、大規模ウイルス産生細胞培養物の感染のためのバイアビリティおよび感染性を保持する。ワシルコ ＤＪ（Ｗａｓｉｌｋｏ ＤＪ）ら Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２００９年６月；６５（２）：１２２－３２参照（その内容は、ＢＥＶおよびウイルス粒子の作製および使用に関係して、本明細書において全体として参照により援用される）。
遺伝的に安定なバキュロウイルスを使用して、無脊椎動物細胞においてＡＡＶ粒子を作製するための１つ以上の成分の供給源を作製してもよい。特定の実施形態において、欠損バキュロウイルス発現ベクターは、昆虫細胞内でエピソーム的に維持され得る。かかる実施形態において、対応するバクミドベクターは、複製制御エレメント、例えば、限定はされないが、プロモータ、エンハンサー、および／または細胞周期調節複製エレメントを用いて操作される。
特定の実施形態において、バキュロウイルスは、キチナーゼ／カテプシン遺伝子座中への組換えのためのマーカーを用いて操作されていてもよい。ｃｈｉａ／ｖ－ｃａｔｈ遺伝子座は、組織培養物中でバキュロウイルスを拡大増殖させるために必須ではなく、Ｖ－ｃａｔｈ（ＥＣ ３．４．２２．５０）は、Ａｒｇ－Ａｒｇジペプチド含有基質に対して最も活性が高いシステインエンドプロテアーゼである。Ａｒｇ－Ａｒｇジペプチドは、デンソウイルスおよびパルボウイルスのカプシド構造タンパク質中に存在するが、ディペンドウイルスＶＰ１中にはまれにしか存在しない。
特定の実施形態において、バキュロウイルス感染を許容する安定なウイルス産生細胞は、ＡＡＶ複製およびベクター産生に必要な任意のエレメント、例えば、限定はされないが、ＡＡＶゲノム全体、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子、別個の転写カセットとしての各Ｒｅｐタンパク質、別個の転写カセットとしての各ＶＰタンパク質、ＡＡＰ（アセンブリ活性化タンパク質）、または天然もしくは非天然プロモータを有する少なくとも１つのバキュロウイルスヘルパー遺伝子の少なくとも１つの安定に組み込まれたコピーを用いて操作される。
特定の実施形態において、バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）は、ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスまたはＢｍＮＰＶバキュロウイルスＢｍＮＰＶに基づく。特定の実施形態において、本開示のバクミドは、ｂｍｏｎ１４２７２、ｖＡｃｅ２５ｋｏまたはｖＡｃｌｅｆ１１ＫＯなど、ＡｃＭＮＰＶバクミドに基づく（即ち、その操作されたバリアントである）。
一般に、ＢＥＶは、ＡＡＶ産生のために最適化されていない。バクミドに基づくＢＥＶにおけるウイルスタンパク質の異常なタンパク質分解性分解は、予期せぬ問題をもたらす場合が多く、バキュロウイルス／Ｓｆ９システムを使用するＡＡＶカプシドタンパク質の信頼性のある大規模産生を除外する。
本開示は、タンパク質分解の供給源および経路を同定する。本開示は、バキュロウイルス／Ｓｆ９システムにおける産生の間のｒＡＡＶカプシドおよびカプシドバリアントの分解を排除する改変されたＢＥＶ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＢＥＶ、ｍＢＥＶ）を含み得る対応するシステムを提示する。この新たなシステムは、タンパク質分解性分解の軽減を可能にするだけでなく、機能的ＡＡＶカプシドタンパク質の収率の増加も生じ、臨床試験を支持するための大規模ＡＡＶ製造を支持するより広い回収ウィンドウを提供する。
特定の実施形態において、本開示は、改変されたバキュロウイルス発現ベクター（ｍＢＥＶ）、およびバキュロウイルス／Ｓｆ９システムにおける組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の大規模製造におけるそれらの使用の方法を提示する。
特定の実施形態において、バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）は、バキュロウイルスｖ－ｃａｔｈ遺伝子が部分的もしくは完全に欠失された（「ｖ－ｃａｔｈ欠失ＢＥＶ」）または突然変異されたＢＥＶである。特定の実施形態において、ＢＥＶは、ｖ－ｃａｔｈ遺伝子を欠くまたはｖ－ｃａｔｈ遺伝子の、突然変異により不活性化されたバージョンを含む。特定の実施形態において、ＢＥＶは、ｖ－ｃａｔｈ遺伝子を欠く。特定の実施形態において、ＢＥＶは、ｖ－ｃａｔｈ遺伝子の、突然変異により不活性化されたバージョンを含む。
バキュロウイルスｖ－ｃａｔｈ遺伝子が部分的に欠失された、完全に欠失された、または突然変異により不活性化されたＢＥＶコンストラクトの非限定的な例としては、配列番号２、配列番号３または配列番号４から選択されるヌクレオチド配列を含むＢＥＶが挙げられる。特定の実施形態において、本開示のＢＥＶコンストラクトは、配列番号２、配列番号３または配列番号４を含む。特定の実施形態において、本開示のＢＥＶコンストラクトは、配列番号２を含む。特定の実施形態において、本開示のＢＥＶコンストラクトは、配列番号３を含む。特定の実施形態において、本開示のＢＥＶコンストラクトは、配列番号４を含む。
本開示のウイルス産生バクミドは、特定のバキュロウイルス遺伝子または遺伝子座の欠失を含み得る。
その他
特定の実施形態において、発現宿主としては、限定はされないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属内の細菌種が挙げられる。
特定の実施形態において、細胞の染色体内に安定に組込まれたＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む宿主細胞は、ＡＡＶ粒子産生のために使用され得る。非限定的な例において、少なくとも２コピーのＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子がその染色体中に安定に組込まれた宿主細胞が、米国特許第７２３８５２６号明細書（ウイルス粒子の産生に関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）に記載される方法およびコンストラクトに従ってＡＡＶ粒子を産生するために使用され得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、米国特許出願公開第２００３００９２１６１号明細書および欧州特許出願公開第１１８３３８０号明細書（ウイルス粒子の産生に関して、その内容は全体として本願明細書に援用される）に記載される通りの、宿主細胞における稀な制限酵素の発現の調節を可能にする核酸配列を含む分子で安定に形質転換された宿主細胞において産生され得る。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子を産生するための産生方法および細胞株としては、限定はされないが、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９６／０１０２４５号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１５７１６号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１５６９１号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９８／０１９４７９号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９８／０１９４６３号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０００／０００４１５号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０００／０４０８７２号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１６６１４号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１００５５号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００５８７０号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０００／００４７５５号、米国特許出願第０８／５４９４８９号明細書、米国特許出願第０８／４６２０１４号明細書、米国特許出願第０９／６５９２０３号明細書、米国特許出願第１０／２４６４４７号明細書、米国特許出願第１０／４６５３０２号明細書、米国特許第６２８１０１０号明細書、米国特許第６２７０９９６号明細書、米国特許第６２６１５５１号明細書、米国特許第５７５６２８３号明細書（ＮＩＨに譲渡された）、米国特許第６４２８９８８号明細書、米国特許第６２７４３５４号明細書、米国特許第６９４３０１９号明細書、米国特許第６４８２６３４号明細書（ＮＩＨに譲渡された：米国特許第７２３８５２６号明細書、米国特許第６４７５７６９）、米国特許第６３６５３９４（ＮＩＨに譲渡された）、米国特許第７４９１５０８号明細書、米国特許第７２９１４９８号明細書、米国特許第７０２２５１９号明細書、米国特許第６４８５９６６号明細書、米国特許第６９５３６９０号明細書、米国特許第６２５８５９５号明細書、欧州特許出願公開第２０１８４２１号明細書、欧州特許出願公開第１０６４３９３号明細書、欧州特許出願公開第１１６３３５４号明細書、欧州特許出願公開第８３５３２１号明細書、欧州特許出願公開第９３１１５８号明細書、欧州特許出願公開第９５０１１１号明細書、欧州特許出願公開第１０１５６１９号明細書、欧州特許出願公開第１１８３３８０号明細書、欧州特許出願公開第２０１８４２１号明細書、欧州特許出願公開第１２２６２６４号明細書、欧州特許出願公開第１６３６３７０号明細書、欧州特許出願公開第１１６３３５４号明細書、欧州特許出願公開第１０６４３９３号明細書、米国特許出願公開第２００３００３２６１３号明細書、米国特許出願公開第２００２０１０２７１４号明細書、米国特許出願公開第２００３００７３２３２号明細書、米国特許出願公開第２００３００４０１０１号明細書（ＮＩＨに譲渡された）、米国特許出願公開第２００６０００３４５１号明細書、米国特許出願公開第２００２００９０７１７号明細書、米国特許出願公開第２００３００９２１６１号明細書、米国特許出願公開第２００７０２３１３０３号明細書、米国特許出願公開第２００６０２１１１１５号明細書、米国特許出願公開第２００９０２７５１０７号明細書、米国特許出願公開第２００７００４０４２号明細書、米国特許出願公開第２００３０１１９１９１号明細書、米国特許出願公開第２００２００１９０５０号明細書（本開示と矛盾しない限り、その各々の内容は全体として本願明細書に援用される）に教示されるものが挙げられ得る。
ＩＩＩ．定義
本開示の様々な箇所において、本開示の化合物の置換基または特性は、群または範囲で開示されている。本開示は、かかる群および範囲のメンバーのありとあらゆる個々のまたは部分的な組合せを含むことが、具体的に意図される。
別途示されない限り、以下の用語および語句は、以下に記載される意味を有する。これらの定義は、事実上限定を意味せず、本開示の特定の態様のより明確な理解を提供するように働く。
約：本明細書で使用されるとき、用語「約」は、記載される値の＋／－１０％を意味する。
アデノ随伴ウイルス：用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、本明細書で使用されるとき、ディペンドウイルス属のメンバーを指し、それに由来する任意の粒子、配列、遺伝子、タンパク質、または成分を含む。
ＡＡＶ粒子：本明細書で使用されるとき、「ＡＡＶ粒子」は、カプシドと、少なくとも１つのペイロード領域および少なくとも１つのＩＴＲ領域を有するウイルスゲノムとを含むウイルスである。本開示のＡＡＶ粒子は、組換え的に産生され得、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）親または参照配列に基づき得る。ＡＡＶ粒子は、本明細書に記載されるもしくは当該技術分野において公知の任意の血清型（血清型の組合せ（すなわち、「シュードタイプ」ＡＡＶ）を含む）、または様々なゲノム（例えば、一本鎖もしくは自己相補的）に由来してもよい。加えて、ＡＡＶ粒子は複製欠損型および／またはターゲティング型であってもよい。
活性：本明細書で使用されるとき、用語「活性」は、物事が生じているまたは行われている状態を指す。本開示の組成物は、活性を有してもよく、この活性が、１つ以上の生物学的事象を伴ってもよい。
投与すること：本明細書で使用されるとき、用語「投与すること」は、医薬剤または組成物を対象に提供することを指す。
組み合わせて投与される：本明細書で使用されるとき、用語「組み合わせて投与される」または「組合せ投与」は、患者に各薬剤の効果のオーバーラップが存在し得るように、同時にまたはある間隔以内に、２つ以上の薬剤が対象に投与されることを意味する。特定の実施形態において、これらは、互いに約６０、３０、１５、１０、５または１分以内に投与される。特定の実施形態において、これらの薬剤の投与は、コンビナトリアル（例えば、相乗）効果が達成されるように、十分に一緒に近接した間隔となっている。
改善：本明細書で使用されるとき、用語「改善」または「改善すること」は、状態または疾患の少なくとも１つの指標の重症度を低下させることを指す。例えば、神経変性障害の文脈において、改善は、ニューロン喪失の低減を含む。
動物：本明細書で使用されるとき、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを指す。特定の実施形態において、「動物」は、発達の任意のステージにあるヒトを指す。特定の実施形態において、「動物」は、発達の任意のステージにある非ヒト動物を指す。特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯動物、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。特定の実施形態において、動物は、限定はされないが、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および蠕虫を含む。特定の実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作動物、またはクローンである。
アンチセンス鎖：本明細書で使用されるとき、用語、ｓｉＲＮＡ分子の「アンチセンス鎖」または「第１の鎖」または「ガイド鎖」は、サイレンシングのためにターゲティングされる遺伝子のｍＲＮＡの約１０～５０ヌクレオチド、例えば、約１５～３０、１６～２５、１８～２３または１９～２２ヌクレオチドのセクションと実質的に相補的な鎖を指す。アンチセンス鎖または第１の鎖は、標的特異的サイレンシングを指示するために所望の標的ｍＲＮＡ配列と十分に相補的な、例えば、ＲＮＡｉ機構またはプロセスによって所望の標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こすために十分な相補性の配列を有する。
およそ：本明細書で使用されるとき、１つ以上の目的の値に適用される用語「およそ」または「約」は、言及された参照値に類似である値を指す。特定の実施形態において、用語「およそ」は、別段に示されない限り、または文脈から明らかでない限り、言及された参照値のいずれかの方向で（より大きいかまたは小さい）、２５％以内、２０％以内、１９％以内、１８％以内、１７％以内、１６％以内、１５％以内、１４％以内、１３％以内、１２％以内、１１％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、またはそれ以下に入る値の範囲を指す（ただし、かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
会合している：本明細書で使用されるとき、用語「会合している」、「コンジュゲートされている」、「連結されている」、「結合している」、および「繋がれている」は、２つ以上の部分に関して使用される場合、これらの部分が、直接または連結剤として働く１つ以上の追加の部分を介してのいずれかで、互いに物理的に会合または接続されて、十分に安定な構造体を形成しており、その結果、それらの部分が、その構造体が使用される条件、例えば、生理学的条件下において、物理的に会合されたまま保たれることを意味する。「会合」は、必ずしも、厳密に、直接的な共有結合による化学結合を通じたものである必要はない。これは、イオン結合もしくは水素結合またはハイブリダイゼーションに基づく、「会合している」実体が、物理的に会合されたまま保たれるような十分に安定な接続も示唆し得る。
バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）：本明細書で使用されるとき、ＢＥＶは、バキュロウイルス発現ベクター、即ち、バキュロウイルス起源のポリヌクレオチドベクターである。ＢＥＶを使用するシステムは、バキュロウイルス発現ベクターシステム（ＢＥＶＳ）として公知である。
ｍＢＥＶまたは改変されたＢＥＶ：本明細書で使用されるとき、改変されたＢＥＶは、遺伝子；遺伝子断片；切断部位；制限部位；配列領域；目的のペイロードもしくは遺伝子をコードする配列（複数可）；または先述の組合せ、のうち１つ以上の付加および／または欠失および／または重複および／または逆位によって開始ＢＥＶ（野生型であれ人工的であれ）から変更された、バキュロウイルス起源の発現ベクターである。
二機能性：本明細書で使用されるとき、用語「二機能性」は、少なくとも２つの機能を行うことができる、またはそれを維持する任意の物質、分子、または部分を指す。機能は、同じ結果または異なる結果に影響を与えてもよい。機能をもたらす構造は同じであっても異なってもよい。
ＢＩＩＣ：本明細書で使用されるとき、ＢＩＩＣは、バキュロウイルス感染昆虫細胞である。
生体適合性：本明細書で使用されるとき、用語「生体適合性」は、損傷、毒性、または免疫系による拒絶のリスクをほとんど～全く有さずに、生きている細胞、組織、臓器またはシステムと適合性であることを意味する。
生分解性：本明細書で使用されるとき、用語「生分解性」は、生きものの作用によって無害な産物に分解されることができることを意味する。
生物学的に活性：本明細書で使用されるとき、語句「生物学的に活性」は、生物システムおよび／または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与された際に、その生物に対して生物学的効果を有する物質は、生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、コード化ペイロードの部分が生物学的に活性である、または生物学的に関連性があるとみなされる活性を模倣する場合でさえも、生物学的に活性であるとみなされ得る。
カプシド：本明細書で使用されるとき、用語「カプシド」は、ウイルス粒子のタンパク質シェルを指す。
コドン最適化された：本明細書で使用されるとき、用語「コドン最適化された」または「コドン最適化」は、親／参照配列と同じアミノ酸配列をコードするが、改変された核酸配列のコドンが特定のシステム（例えば、特定の種または種の群）における発現のために最適化または改善されるように変更されている、改変された核酸配列を指す。非限定的な例として、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む核酸配列は、昆虫細胞または特定の昆虫細胞、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞における発現のためにコドン最適化され得る。コドン最適化は、当業者に公知の方法およびデータベースを使用して完了され得る。
相補的および実質的に相補的：本明細書で使用されるとき、用語「相補的」は、ポリヌクレオチドが互いに塩基対を形成する能力を指す。塩基対は、典型的に、逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。相補的ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン・クリック方式で（例えば、ＡとＴ、ＡとＵ、ＣとＧ）、または二重鎖の形成を可能にする任意の他の方式で、塩基対を形成することができる。当業者は認識しているように、ＤＮＡとは対照的にＲＮＡを使用する際、チミンではなくウラシルがアデノシンと相補的であるとみなされる塩基である。しかし、本開示の文脈でＵと表記された際、別段に示されない限りは、Ｔに置き換え可能であることが含意される。完全な相補性または１００％の相補性とは、一方のポリヌクレオチド鎖の各ヌクレオチド単位が、第２のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド単位と水素結合を形成することができる状況を指す。完全でない相補性とは、２本の鎖の全てではないが一部のヌクレオチド単位が、互いに水素結合を形成することができる状況を指す。例えば、２本の２０量体について、各鎖の２個の塩基対のみが互いに水素結合を形成することができる場合、これらのポリヌクレオチド鎖は１０％の相補性を呈する。同じ例で、各鎖の１８個の塩基対が互いに水素結合を形成することができる場合、これらのポリヌクレオチド鎖は９０％の相補性を呈する。本明細書で使用されるとき、用語「実質的に相補的」は、ｓｉＲＮＡが、所望の標的ｍＲＮＡに結合し、標的ｍＲＮＡのＲＮＡサイレンシングを引き起こすために十分な配列を（例えば、アンチセンス鎖中に）有することを意味する。
化合物：本開示の化合物は、中間体または最終化合物において生じる原子の同位体の全てを含む。「同位体」は、同じ原子番号を有するが、核内の中性子の数が異なることから生じる、異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素の同位体は、トリチウムおよび重水素を含む。
本開示の化合物および塩は、ルーチン的な方法により、溶媒または水分子と組み合わせて、溶媒和物および水和物を形成して、調製することができる。
条件付きで活性：本明細書で使用されるとき、用語「条件付きで活性」は、野生型ポリペプチドの突然変異またはバリアントを指し、この突然変異またはバリアントは、生理学的条件において親ポリペプチドよりも活性が高いまたは低い。更に、条件付きで活性なポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、異常な条件において増加または減少した活性を有してもよい。条件付きで活性なポリペプチドは、正常な生理学的条件または異常な条件において、可逆的または不可逆的に不活性化されてもよい。
保存されている：本明細書で使用されるとき、用語「保存されている」は、比較されている２つ以上の配列の同じ位置に変更されずに生じる、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれ、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列中の別の箇所に出現するヌクレオチドまたはアミノ酸よりも、より関連する配列間で保存されているものである。
特定の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合に、「完全に保存されている」と言われる。特定の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合に、「高度に保存されている」と言われる。特定の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合に、「高度に保存されている」と言われる。特定の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合に、「保存されている」と言われる。特定の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合に、「保存されている」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの全長に適用され得るか、または、その一部分、領域、もしくは特徴に適用され得る。
制御エレメント：本明細書で使用されるとき、「制御エレメント」、「調節制御エレメント」または「調節配列」は、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳を提供する、プロモータ領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボゾーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを指す。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写および／または翻訳されることができる限り、これらの制御エレメントの全てが常に存在する必要があるわけではない。
徐放：本明細書で使用されるとき、用語「徐放」は、治療的結果に影響を与える特定の放出パターンに従う医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。
細胞分裂停止：本明細書で使用されるとき、「細胞分裂停止」は、細胞（例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プロリン、またはそれらの組合せの成長、分裂または増倍を阻害、低減、抑制することを指す。
細胞傷害性：本明細書で使用されるとき、「細胞傷害性」は、細胞（例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プロリン、もしくはそれらの組合せを死滅させる、またはそれに対する有害な、毒性の、もしくは致命的な影響を引き起こすことを指す。
送達：本明細書で使用されるとき、「送達」は、ＡＡＶ粒子、化合物、物質、実体、部分、カーゴまたはペイロードを送達する動作または方式を指す。
送達剤：本明細書で使用されるとき、「送達剤」は、少なくとも部分的に、ターゲティングされる細胞へのＡＡＶ粒子のインビボ送達を容易にする、任意の物質を指す。
不安定化：本明細書で使用されるとき、用語「不安定化された（ｄｅｓｔａｂｌｅｄ）」、「不安定化させる」、または「不安定化領域」は、同じ領域または分子の出発時点、野生型または天然の形態よりも安定性が低い、領域または分子を意味する。
検出可能な標識：本明細書で使用されるとき、「検出可能な標識」は、放射線撮影法、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などを含む、当該技術分野で公知の方法によって容易に検出される、別の実体に結合される、組み込まれる、または会合される、１つ以上のマーカー、シグナル、または部分を指す。検出可能な標識としては、放射性同位体、フルオロフォア、発色団、酵素、色素、金属イオン、リガンド、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびハプテン、量子ドットなどが挙げられる。検出可能な標識は、本明細書に開示されるペプチドまたはタンパク質中の任意の位置に配置されてもよい。それらは、アミノ酸、ペプチド、もしくはタンパク質内にあってもよく、またはＮ末端もしくはＣ末端に配置されてもよい。
消化する：本明細書で使用されるとき、用語「消化する」は、より小さい小片または成分へと崩壊させることを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に言及する場合、消化は、ペプチドの産生をもたらす。
遠位：本明細書で使用されるとき、用語「遠位」は、中央から離れて、または目的の地点もしくは領域から離れて位置していることを意味する。
投薬レジメン：本明細書で使用されるとき、「投薬レジメン」は、投与のスケジュール、または医師により決定される治療、予防、もしくは緩和ケアのレジメンである。
被包する：本明細書で使用されるとき、用語「被包する」は、封入、包囲、または内包することを意味する。
操作されている：本明細書で使用されるとき、本開示の実施形態は、出発点、野生型、または天然の分子から構造的であるか化学的であるかにかかわらず、変化した特徴または特性を有するように設計されている場合、「操作されている」。
有効量：本明細書で使用されるとき、用語、薬剤の「有効量」は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすために十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用されるコンテクストに依存する。例えば、がんを治療する薬剤を投与するコンテクストでは、薬剤の有効量は、例えば、その薬剤の投与なしで得られる応答と比較して、本明細書に定義される通りのがんの治療を達成するために十分な量である。
発現：本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」は、以下の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／もしくは３’末端プロセシングによる）；（３）ＲＮＡのポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳；および（４）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾。
特徴：本明細書で使用されるとき、「特徴」は、特徴、特性、または特有のエレメントを指す。
製剤：本明細書で使用されるとき、「製剤」は、少なくとも１つのＡＡＶ粒子と送達剤または賦形剤とを含む。
断片：「断片」は、本明細書で使用されるとき、部分を指す。例えば、タンパク質の断片としては、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することによって得られるポリペプチドが挙げられ得る。
機能的：本明細書で使用されるとき、「機能的」生物学的分子は、それを特徴付ける特性および／または活性を呈する形態の生物学的分子である。
遺伝子発現：用語「遺伝子発現」は、核酸配列が首尾よく転写およびほとんどの場合は翻訳を受けて、タンパク質またはペプチドを産生する過程を指す。明確にするため、「遺伝子発現」の測定に言及する場合、これは、測定が、核酸転写産物、例えばＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、またはアミノ酸翻訳産物、例えばポリペプチドもしくはペプチドの測定であり得ることを意味するものと理解されたい。ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、およびペプチドの量またはレベルを測定する方法は当該技術分野において周知である。
相同性：本明細書で使用されるとき、用語「相同性」は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間ならびに／またはポリペプチド分子間の全般的な関連性を指す。特定の実施形態において、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一または類似である場合に、互いに「相同」であるとみなされる。用語「相同」は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。本開示に従って、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約２０個のアミノ酸の少なくとも１つのストレッチに関して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または更には９９％である場合に、相同であるとみなされる。特定の実施形態において、相同的なポリヌクレオチド配列は、少なくとも４～５個の固有に指定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力によって特徴付けられる。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列については、相同性は、少なくとも４～５個の固有に指定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力によって決定される。本開示に従って、２つのタンパク質配列は、タンパク質が、少なくとも約２０個のアミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である場合に、相同であるとみなされる。
異種領域：本明細書で使用されるとき、用語「異種領域」は、相同領域とはみなされない領域を指す。
相同領域：本明細書で使用されるとき、用語「相同領域」は、位置、構造、進化起源、特徴、形態または機能が類似している領域を指す。
同一性：本明細書で使用されるとき、用語「同一性」は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間ならびに／またはポリペプチド分子間の全般的な関連性を指す。２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、２つの配列を最適な比較の目的でアラインメントすることによって、行ってもよい（例えば、ギャップが、最適なアラインメントのために、第１および第２の核酸配列の一方または両方に導入することができ、非同一配列は比較目的で無視することができる）。特定の実施形態において、比較目的のためにアラインメントした配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドによって占有されている場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有される同一な位置の数の関数であり、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、レスクＡ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、スミスＤ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９３年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、フォン ヘインジェＧ．（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ、グリフィンＡ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィンＨ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、１９９４年；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、グリブスコフＭ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデヴェルーＪ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、Ｍストックトンプレス（Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９１年に記載されるものなどの方法を使用して、決定することができる。これらの各々は、本明細書においてそれらが本開示と矛盾しない限り参照により援用される。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、アライン（ＡＬＩＧＮ）プログラム（バージョン２．０）に組み込まれているマイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９年、４：ｐ．１１～１７）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０の重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用して決定することができる。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、代替として、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用し、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおいてＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般的に用いられる方法としては、限定はされないが、カリロＨ．（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．）およびリップマンＤ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．）、ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、第４８号：ｐ．１０７３（１９８８年）に開示されているものが挙げられ、これは本明細書においてそれらが本開示と矛盾しない限り参照により援用される。同一性を決定するための技法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて成文化されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアとしては、限定はされないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、（デヴェルーＪ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）ら、Ｎｕｃｅｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１２巻（第１号）、ｐ．３８７、１９８４年）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（アルチュルＳ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、ｐ．４０３（１９９０年））が挙げられる。
遺伝子の発現を阻害する：本明細書で使用されるとき、語句「遺伝子の発現を阻害する」は、遺伝子の発現産物の量における低減を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであり得る。典型的には、ｍＲＮＡのレベルの低減は、そこから翻訳されるポリペプチドのレベルの低減をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準的技法を使用して決定してもよい。
インビトロ：本明細書で使用されるとき、用語「インビトロ」は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）内ではなく、人工環境、例えば、試験管または反応槽内、細胞培養物中、ペトリ皿内等で起こる事象を指す。
インビボ：本明細書で使用されるとき、用語「インビボ」は、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物、またはその細胞もしくは組織）内で起こる事象を指す。
単離された：本明細書で使用されるとき、用語「単離された」は、物質または実体が、それらが関連付けられていた（天然または実験設定のいずれか）成分の少なくとも一部から分けられたものであることを指す。単離された物質は、それが会合していた物質に関して、様々なレベルの純度を有してもよい。単離された物質および／または実体は、それが最初に会合していた他の成分のうちの少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離されていてもよい。特定の実施形態において、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％より高く、または約９９％を上回って純粋である。本明細書で使用されるとき、物質は、他の成分を実質的に含まないなら、それは「純粋」である。
実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、物質が、それが形成または検出された環境から実質的に分離されていることを意味する。部分的な分離は、例えば、本開示の物質またはＡＡＶ粒子が濃縮された組成物を含むことができる。実質的な分離は、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、もしくは少なくとも約９９重量％の本開示の化合物、またはその塩を含有する組成物を含むことができる。化合物およびそれらの塩を単離する方法は当該技術分野においてルーチン的である。
リンカー：本明細書で使用されるとき、「リンカー」は、２つの分子を接続する分子または分子の群を指す。リンカーは、２つの異なるポリペプチドをコードする２つの核酸配列を接続する核酸配列であってもよい。リンカーは、翻訳されてもされなくてもよい。リンカーは、切断可能なリンカーであってもよい。
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位：本明細書で使用されるとき、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位は、ｍｉＲＮＡの少なくとも「シード」領域が結合する核酸転写物のヌクレオチド位置または領域を示す。
改変された：本明細書で使用されるとき、「改変された」は、本開示の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、および機能的なものを含めて、多くの様式で改変されてもよい。本明細書で使用されるとき、本開示の実施形態は、出発点、野生型または天然分子から構造的であるか化学的であるかにかかわらず、変化した特徴または特性を有するまたは保有する場合、「改変されている」。
突然変異：本明細書で使用されるとき、用語「突然変異」は、その後の世代に伝達され得る、バリアント（「突然変異体」とも呼ばれる）形態をもたらす遺伝子の構造の任意の変化を指す。遺伝子中の突然変異は、ＤＮＡ中の単一塩基の変更、または遺伝子もしくは染色体のより大きいセクションの欠失、挿入もしくは再編成によって引き起こされ得る。
天然に存在する：本明細書で使用されるとき、「天然に存在する」または「野生型」は、人工的な助け、または人の手という環境がない天然に存在することを意味する。
非ヒト脊椎動物：本明細書で使用されるとき、「非ヒト脊椎動物」は、野生種および家畜種を含む、ホモ・サピエンス以外の全ての脊椎動物を含む。非ヒト脊椎動物の例としては、限定はされないが、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、スイギュウ、およびヤクなどの哺乳動物が挙げられる。
オフターゲット：本明細書で使用されるとき、「オフターゲット」は、任意の１つ以上の標的、遺伝子、または細胞転写物に対する任意の意図しない効果を指す。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用されるとき、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、リーディングフレームの末端以外には、所与のリーディングフレーム内に終止コドンを含有しない配列を指す。
作動可能に連結された：本明細書で使用されるとき、語句「作動可能に連結された」は、２つ以上の分子、コンストラクト、転写物、実体、部分などの間の機能的接続を指す。
患者：本明細書で使用されるとき、「患者」は、治療を求め得る、もしくは必要とし得る対象、治療を必要としている対象、治療を受けている対象、治療を受けるであろう対象、または、特定の疾患もしくは状態について訓練された専門家によるケアを受けている対象を指す。
ペイロード：本明細書で使用されるとき、「ペイロード」または「ペイロード領域」は、ウイルスゲノムによりもしくはその内にコードされる１つ以上のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域、またはかかるポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域、例えば、トランス遺伝子、ポリペプチドもしくはマルチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現産物、または調節性核酸もしくは調節核酸を指す。
ペイロードコンストラクト：本明細書で使用されるとき、「ペイロードコンストラクト」は、一方または両方に末端逆位反復（ＩＴＲ）配列が隣接している、ペイロードをコードするまたは含むポリヌクレオチド領域を含む１つ以上のベクターコンストラクトである。ペイロードコンストラクトは、ウイルス産生細胞において複製されて治療的ウイルスゲノムを産生する鋳型を提示する。
ペイロードコンストラクトベクター：本明細書で使用されるとき、「ペイロードコンストラクトベクター」は、ペイロードコンストラクト、ならびに細菌細胞におけるペイロードコンストラクトの複製および発現のための制御性領域をコードするまたは含むベクターである。
ペイロードコンストラクト発現ベクター：本明細書で使用されるとき、「ペイロードコンストラクト発現ベクター」は、ペイロードコンストラクトをコードするまたは含み、ウイルス複製細胞におけるウイルス発現のための成分をコードするまたは含む１つ以上のポリヌクレオチド領域を更に含むベクターである。
ペプチド：本明細書で使用されるとき、「ペプチド」は、５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０アミノ酸長未満またはそれと等しい。
薬学的に許容可能：語句「薬学的に許容可能」は、本明細書では、妥当な医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしでヒトおよび動物の組織と接触して使用するために適しており、妥当なリスク対効果比に相応の、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指して用いられる。
薬学的に許容可能な賦形剤：語句「薬学的に許容可能な賦形剤」は、本明細書で使用されるとき、患者において実質的に非毒性かつ非炎症性である特性を有する、本明細書に記載される化合物以外の任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁または溶解させることができるビヒクル）を指す。賦形剤としては、例えば、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮補助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、エモリエント、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成剤またはコーティング剤、香味剤、香料、滑剤（流動増強剤）、潤沢剤、保存剤、印刷用インク、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味剤、および水和の水を挙げることができる。例示的な賦形剤としては、限定はされないが、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、α化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールが挙げられる。
薬学的に許容可能な塩：本開示は、本明細書に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩もまた含む。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容可能な塩」は、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって（例えば、遊離塩基基を適当な有機酸と反応させることによって）親化合物が改変されている、開示された化合物の誘導体を指す。薬学的に許容可能な塩の例としては、限定はされないが、アミン類などの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオンが挙げられ、限定はされないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに無毒性のアンモニウム、四級アンモニウム、およびアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むが、これらに限定されない、アミンカチオンを含む。本開示の薬学的に許容可能な塩は、形成された親化合物の従来の無毒性の塩、例えば、無毒性の無機酸または有機酸由来の従来の無毒性の塩を含む。本開示の薬学的に許容可能な塩は、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から、従来の化学的方法により合成され得る。一般に、かかる塩は、遊離酸または塩基形態のこれらの化合物を、化学量論量の適切な塩基または酸と、水中もしくは有機溶媒中、または２つの混合物中で；一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水溶液が使用され得、反応させることにより、調製することができる。適当な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７編、マック出版社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、ペンシルベニア州、１９８５、ｐ．１４１８、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄＵｓｅ、ピー エッチ シュタール（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ）およびシー ジー ワームース（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）（編）、Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、２００８、およびベルジュら（Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６、１－１９（１９７７）において見られ、その各々の全体を、それらが本開示と矛盾しない限り本明細書に援用する。
薬学的に許容可能な溶媒和物：用語「薬学的に許容可能な溶媒和物」は、本明細書で使用されるとき、好適な溶媒の分子が結晶格子内に取り込まれている、本開示の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投薬量で生理学的に忍容可能である。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはその混合物を含む溶液から結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製されてもよい。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、および三水和物）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と呼ばれる。
薬物動態：本明細書で使用されるとき、「薬物動態」は、生きている生物に投与される物質の運命の決定に関連する、分子または化合物の任意の１つ以上の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝、および排泄の程度および速度を含む、幾つかの領域へと分割される。これは一般的にＡＤＭＥと呼ばれ、ここで、（Ａ）吸収は、物質が血液循環に入るプロセスであり；（Ｄ）分布は、身体の体液および組織全体への物質の分散または拡散であり；（Ｍ）代謝（または生体内変換）は、親化合物の娘代謝物への不可逆的変換であり；（Ｅ）排泄（または排除）は、身体からの物質の排除を指す。珍しい事例では、一部の薬物は、身体組織中に不可逆的に蓄積される。
物理化学：本明細書で使用されるとき、用語「物理化学」は、物理的および／もしくは化学的特性に関することを意味する。
予防すること：本明細書で使用されるとき、用語「予防すること」または「予防」は、感染症、疾患、障害、および／もしくは状態の発症を部分的もしくは完全に遅延させること；特定の感染症、疾患、障害、および／もしくは状態の１つ以上の症状、特徴、もしくは臨床兆候の発症を部分的もしくは完全に遅延させること；特定の感染症、疾患、障害、および／もしくは状態の１つ以上の症状、特徴、もしくは兆候の発症を部分的もしくは完全に遅延させること；感染症、特定の疾患、障害、および／もしくは状態からの進行を部分的もしくは完全に遅延させること；ならびに／または、感染症、疾患、障害、および／もしくは状態と関連する病理を発生する危険性を減少させることを指す。
増殖する：本明細書で使用されるとき、用語「増殖する」は、成長、拡大もしくは増加すること、または成長、拡大もしくは増加を迅速に引き起こすことを意味する。「増殖性」とは、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖性」は、増殖性の特性に対抗するまたはそれに不適切な特性を有することを意味する。
予防的：本明細書で使用されるとき、「予防的」は、疾患の拡がり予防するために使用される療法剤または介入方針を指す。
予防：本明細書で使用されるとき、「予防」は、健康を維持し、疾患の拡がり予防するために取られる措置を指す。
目的のタンパク質：本明細書で使用されるとき、用語「目的のタンパク質」または「所望のタンパク質」は、本明細書に提供されるもの、およびその断片、突然変異体、バリアント、および変更形態を含む。
近位：本明細書で使用されるとき、用語「近位」は、中央により近く、または目的の地点もしくは領域により近くに位置していることを意味する。
精製された：本明細書で使用されるとき、「精製する」、「精製された」、「精製」は、実質的に純粋にするか、または不所望の成分、物質汚染、混合もしくは不完全なものを取り除くことを意味する。「精製された」は、純粋である状態を指す。「精製」は、純粋にするプロセスを指す。
領域：本明細書で使用されるとき、用語「領域」は、区域または一般的な範囲を指す。特定の実施形態において、タンパク質またはタンパク質モジュールに言及する場合、領域は、タンパク質もしくはタンパク質モジュールに沿ったアミノ酸の線形配列を含んでもよく、または、三次元の範囲、エピトープ、および／もしくはエピトープのクラスターを含んでもよい。特定の実施形態において、領域は、末端領域を含む。本明細書で使用されるとき、用語「末端領域」は、所定の薬剤の端または末端に位置する領域を指す。タンパク質を指すとき、末端領域は、Ｎおよび／またはＣ末端を含んでもよい。Ｎ末端は、遊離アミノ基を有するアミノ酸を含むタンパク質の端を指す。Ｃ末端は、遊離カルボキシル基を有するアミノ酸を含むタンパク質の端を指す。Ｎおよび／またはＣ末端領域は、したがって、Ｎおよび／またはＣ末端ならびに周囲のアミノ酸を含んでもよい。特定の実施形態において、Ｎおよび／またはＣ末端領域は、約３個のアミノ酸～約３０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸～約４０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸～約５０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸～約１００個のアミノ酸および／または少なくとも１００個のアミノ酸を含む。特定の実施形態において、Ｎ末端領域は、Ｎ末端を含むが、Ｃ末端を含まない、任意の長さのアミノ酸を含んでもよい。特定の実施形態において、Ｃ末端領域は、Ｃ末端を含むが、Ｎ末端を含まない、任意の長さのアミノ酸を含んでもよい。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドを指すとき、領域は、ポリヌクレオチドに沿った核酸の直線配列を含んでもよいか、または三次元範囲、二次構造、または三次構造を含んでもよい。特定の実施形態において、領域は、末端領域を含む。本明細書で使用されるとき、用語「末端領域」は、所定の薬剤の端または末端に見られる領域を指す。ポリヌクレオチドを指すとき、末端領域は、５’および３’末端を含んでもよい。５’末端は、遊離リン酸基を有する核酸を含むポリヌクレオチドの端を指す。３’末端は、遊離ヒドロキシル基を有する核酸を含むポリヌクレオチドの端を指す。そのため、５’および３’領域は、５’および３’末端ならびに周囲の核酸を含んでもよい。特定の実施形態において、５’および３’末端領域は、約９個の核酸～約９０個の核酸、約１５個の核酸～約１２０個の核酸、約３０個の核酸～約１５０個の核酸、約６０個の核酸～約３００個の核酸および／または少なくとも３００個の核酸を含んでもよい。特定の実施形態において、５’領域は、５’末端を含むが、３’末端を含まない、任意の長さの核酸を含んでもよい。特定の実施形態において、３’領域は、３’末端を含むが、５’末端を含まない、任意の長さの核酸を含んでもよい。
ＲＮＡまたはＲＮＡ分子：本明細書で使用されるとき、用語「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」は、リボヌクレオチドのポリマーを指し、用語「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」または「デオキシリボ核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡおよびＲＮＡは、例えば、それぞれＤＮＡの複製およびＤＮＡの転写によって、天然で合成することができるか、または化学的に合成することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖（すなわち、それぞれｓｓＲＮＡもしくはｓｓＤＮＡ）または多重鎖（例えば二本鎖、すなわち、それぞれｄｓＲＮＡおよびｄｓＤＮＡ）であることができる。用語「ｍＲＮＡ」または「メッセンジャーＲＮＡ」は、本明細書で使用されるとき、１本以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする一本鎖ＲＮＡを指す。
ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ：本明細書で使用されるとき、用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、対応するタンパク質をコードする遺伝子の発現の阻害または干渉または「サイレンシング」をもたらす、ＲＮＡ分子によって媒介される配列特異的調節機序を指す。ＲＮＡｉは、植物、動物および真菌を含む多数の型の生物において観察されている。ＲＮＡｉは、外来ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ）を除去するために、細胞において天然に生じる。天然ＲＮＡｉは、分解機序を他の類似のＲＮＡ配列に指向させる、遊離ｄｓＲＮＡから切断された断片を介して進行する。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって制御され、細胞の細胞質において短鎖／低分子ｄｓＲＮＡ分子によって開始され、この場所で、これらは、触媒性ＲＩＳＣ成分アルゴノートと相互作用する。ｄｓＲＮＡ分子は、細胞中に外因性に導入され得る。外因性ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡに結合しそれを切断して、各末端上のいくつかの未対合のオーバーハング塩基を伴って２１～２５塩基対の二本鎖断片を産生するリボヌクレアーゼタンパク質ダイサーを活性化することによって、ＲＮＡｉを開始する。これらの短鎖二本鎖断片は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。
試料：本明細書で使用されるとき、用語「試料」または「生物学的試料」は、その組織、細胞または成分部分（例えば、限定はされないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊水臍帯血、尿、膣液および精液を含む、体液）のサブセットを指す。試料は、全生物、あるいは、限定はされないが、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液；皮膚、呼吸器、腸、および尿生殖管の外切片；涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、または臓器を含む、その組織、細胞、もしくは成分部分のサブセット、またはその画分もしくは一部分から調製された、ホモジネート、ライセート、または抽出物を更に含んでもよい。試料は、タンパク質または核酸分子などの細胞成分を含有してもよい栄養培地またはゲルなどの培地を更に指す。
自己相補的ウイルス粒子：本明細書で使用されるとき、「自己相補的ウイルス粒子」は、タンパク質カプシドと、カプシド内に封入された自己相補的ゲノムをコードするポリヌクレオチド配列との、少なくとも２つの成分を含む粒子である。
センス鎖：本明細書で使用されるとき、用語、ｓｉＲＮＡ分子の「センス鎖」または「第２の鎖」または「パッセンジャー鎖」は、アンチセンス鎖または第１の鎖と相補的な鎖を指す。ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンスおよびセンス鎖は、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。本明細書で使用されるとき、「ｓｉＲＮＡ二重鎖」は、サイレンシングのためにターゲティングされた遺伝子のｍＲＮＡの約１０～５０個のヌクレオチドのセクションと十分な相補性を有するｓｉＲＮＡ鎖、および他方のｓｉＲＮＡ鎖と二重鎖を形成するために十分な相補性を有するｓｉＲＮＡ鎖を含む。
短鎖干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ：本明細書で使用されるとき、用語「短鎖干渉ＲＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡｉを指示または媒介することができる、約５～６０個のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ分子（またはＲＮＡ類似体）を指す。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５～３０個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、例えば、約１６～２５個のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、約１８～２３個のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、約１９～２２個のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）（例えば、１９、２０、２１または２２個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体）、約１９～２５個のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、および約１９～２４個のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含む。用語「短鎖」ｓｉＲＮＡは、５～２３個のヌクレオチド、例えば、２１個のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、例えば、１９、２０、２１または２２個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。用語「長鎖」ｓｉＲＮＡは、２４～６０個のヌクレオチド、例えば、約２４～２５個のヌクレオチド、例えば、２３、２４、２５または２６個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。短鎖ｓｉＲＮＡは、一部の場合において、１９個よりも少ないヌクレオチド、例えば、１６、１７もしくは１８個のヌクレオチド、またはわずか５個のヌクレオチドを含んでもよいが、ただし、より短いｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介する能力を保持している。同様に、長鎖ｓｉＲＮＡは、一部の場合において、２６個より多くのヌクレオチド、例えば、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または更には６０個のヌクレオチドを含んでもよいが、ただし、より長いｓｉＲＮＡは、短鎖ｓｉＲＮＡへの更なるプロセシング、例えば酵素的プロセシングなしに、ＲＮＡｉまたは翻訳抑制を媒介する能力を保持している。ｓｉＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓ－ｓｉＲＮＡ）、またはハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ二重鎖と呼ばれる二重鎖構造を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓ－ｓｉＲＮＡ）であることができる。
シグナル配列：本明細書で使用されるとき、語句「シグナル配列」は、タンパク質の輸送または局在化を誘導することができる配列を指す。
単一単位用量：本明細書で使用されるとき、「単一単位用量」は、１用量／１回／単一経路／単一接触点で、すなわち単一の投与イベントで投与される、任意の療法剤の用量である。特定の実施形態において、単一単位用量は、別個の剤形（例えば、錠剤、カプセル、パッチ、充填済みシリンジ、バイアルなど）として提供される。
類似性：本明細書で使用されるとき、用語「類似性」は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間ならびに／またはポリペプチド分子間の全般的な関連性を指す。ポリマー分子の互いに対する類似性パーセントの計算は、同一性パーセントの計算と同じ方式で行うことができるが、ただし、類似性パーセントの計算は、当該技術分野において理解される保存的置換を考慮に入れることを除く。
分割用量：本明細書で使用されるとき、「分割用量」は、単一単位用量または総１日用量を２つ以上の用量へと分割するものである。
安定：本明細書で使用されるとき、「安定」は、反応混合物から有用な程度の純度への単離に耐えるために十分に頑強であり、特定の実施形態において、有効な療法剤へと製剤化することができる、化合物を指す。
安定化された：本明細書で使用されるとき、用語「安定化する」、「安定化された」、「安定化された領域」は、安定にするまたは安定になることを意味する。
対象：本明細書で使用されるとき、用語「対象」または「患者」は、例えば、実験的、診断的、予防的、および／または治療的な目的で本開示に係る組成物を投与してもよい、任意の生物を指す。典型的な対象は、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒトなどの哺乳類）および／または植物を含む。
実質的に：本明細書で使用されるとき、用語「実質的に」は、目的の特徴または特性の完全またはほぼ完全な程度または度合を呈する定性的状態を指す。生物学分野の当業者には、生物学的および化学的な現象が完全となるおよび／もしくは完全性へと進行する、または絶対的な結果を達成するもしくは回避することは、あったとしても稀であることを理解されるであろう。したがって、用語「実質的に」は、本明細書において、多くの生物学的および化学的な現象において固有の完全性の潜在的な欠如を捉えるために使用される。
実質的に同等：本明細書で使用されるとき、用量間の時間的相違に関しての場合、この用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時に：本明細書で使用されるとき、複数の用量に関しての場合、この用語は、２秒以内を意味する。
罹患している：疾患、障害、および／または状態を「罹患している」個体は、疾患、障害、および／または状態を診断されている、またはその１つ以上の症状を呈する。
罹り易い：疾患、障害、および／または状態に「罹り易い」個体は、疾患、障害、および／または状態を診断されていない、および／またはその症状を呈さなくてもよいが、疾患またはその症状を発症する傾向を有する。特定の実施形態において、疾患、障害、および／または状態（例えば、がん）に罹り易い個体は、以下のうちの１つ以上によって特徴付けられてもよい：（１）疾患、障害、および／または状態の発症と関連する遺伝子突然変異；（２）疾患、障害、および／または状態の発症と関連する遺伝的多型；（３）疾患、障害、および／または状態と関連するタンパク質および／または核酸の発現および／または活性の増加および／または減少；（４）疾患、障害、および／または状態の発症と関連する習慣および／または生活様式；（５）疾患、障害、および／または状態の家族歴；ならびに（６）疾患、障害、および／または状態の発症と関連する微生物への曝露および／または感染。特定の実施形態において、疾患、障害、および／または状態に罹り易い個体は、疾患、障害、および／または状態を発症するであろう。特定の実施形態において、疾患、障害、および／または状態に罹り易い個体は、疾患、障害、および／または状態を発症しないであろう。
持続放出：本明細書で使用されるとき、用語「持続放出」は、特定の期間にわたる放出速度に適合する、医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
合成：用語「合成」は、人間の手によって生成、調製、および／または製造されることを意味する。本開示のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であってもよい。
ターゲティング：本明細書で使用されるとき、「ターゲティング」は、標的核酸にハイブリダイズして所望の効果を誘導するであろう核酸配列の設計および選択のプロセスを意味する。
ターゲティングされる細胞：本明細書で使用されるとき、「ターゲティングされる細胞」は、任意の１つ以上の目的の細胞を指す。細胞は、インビトロ、インビボ、インサイチュ、または生物の組織もしくは臓器において見出されてもよい。生物は、動物、例えば、哺乳動物、ヒトまたはヒト患者であってもよい。
末端領域：本明細書で使用されるとき、用語「末端領域」は、連結されたヌクレオシドまたはアミノ酸（それぞれ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）の領域の５’または３’末端上の領域を指す。
末端最適化された：用語「末端最適化された」は、核酸に言及する場合、核酸の末端領域が、天然または野生型末端領域にわたって、いくつかの方法で改善されること、例えばコドン最適化されることを意味する。
療法剤：用語「療法剤」は、対象に投与された際に、治療的、診断的、および／もしくは予防的な効果を有する、ならびに／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的効果を誘発する、任意の薬剤を指す。
治療有効量：本明細書で使用されるとき、用語「治療有効量」は、感染症、疾患、障害、および／または状態に罹患しているまたは罹り易い対象に投与された際に、感染症、疾患、障害、および／または状態を治療する、その症状を改善する、それを診断する、予防する、および／またはその発症を遅延させるために十分である、送達しようとする薬剤（例えば、核酸、薬物、療法剤、診断剤、予防剤など）の量を意味する。特定の実施形態において、治療有効量は単一用量で提供される。特定の実施形態において、治療有効量は、複数の用量を含む投薬レジメンで投与される。当業者には、特定の実施形態において、単位剤形は、かかる投薬レジメンの一部として投与された場合に有効である量を含む場合に、治療有効量の特定の薬剤または実体を含むとみなされてよいことが理解されよう。
治療上有効な結果：本明細書で使用されるとき、用語「治療上有効な結果」は、感染症、疾患、障害、および／または状態に罹患しているまたは罹り易い対象において、感染症、疾患、障害、および／または状態を治療する、その症状を改善する、それを診断する、予防する、および／またはその発症を遅延させるために十分である結果を意味する。
総１日用量：本明細書で使用されるとき、「総１日用量」は、２４時間の期間内に与えられるまたは処方される量である。これは単一単位用量として投与されてもよい。
トランスフェクション：本明細書で使用されるとき、用語「トランスフェクション」は、細胞中に外因性核酸を導入する方法を指す。トランスフェクション方法としては、限定はされないが、化学的方法、物理的処理、およびカチオン性脂質または混合物が挙げられる。
治療すること：本明細書で使用されるとき、用語「治療すること」は、特定の感染症、疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の症状または特徴を、部分的または完全に軽減させる、改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）、改善する（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ）、緩和させる、その発症を遅延させる、その進行を阻害する、その重症度を低減させる、および／またはその発生を低減させることを指す。例えば、がんを「治療すること」は、腫瘍の生存、成長、および／または拡がりを阻害することを指してもよい。治療は、疾患、障害、および／もしくは状態の兆候を呈さない対象、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは状態の初期兆候のみを呈する対象に、疾患、障害、および／または状態と関連する病理を発症する危険性を減少させる目的で投与されてもよい。
未改変（Ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ）：本明細書で使用されるとき、「未改変」は、任意の様式で変化される前の任意の物質、化合物、または分子を指す。未改変は、生体分子の野生型または天然の形態を指してもよいが、必ずしもそうとは限らない。分子は一連の改変を受けてもよく、その場合、各々の改変された分子は、後続の改変の「未改変」の出発分子として役割を果たしてもよい。
ベクター：本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、異種分子を輸送する、形質導入する、またはその他担体として働く、任意の分子または部分である。本開示のベクターは組換えにより産生されてもよく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）親または参照配列に基づいてもよい、および／またはそれを含んでもよい。かかる親または参照ＡＡＶ配列は、ベクターを操作するための元の、第２の、第３の、または後続の配列として働いてもよい。非限定的な例では、かかる親または参照ＡＡＶ配列は、次の配列：ポリペプチドまたは複数のポリペプチドをコードし、その配列が、野生型であり得るか、または野生型から改変され得、その配列が、全長または部分配列のタンパク質、タンパク質ドメイン、またはタンパク質の１つもしくは複数のサブユニットをコードし得るポリヌクレオチド配列；調節性または調節核酸を含み、その配列が、野生型であるか、または野生型から改変されてもよい、ポリヌクレオチド；ならびに野生型配列から改変されてもされなくてもよいトランス遺伝子、のいずれか１つ以上を含んでもよい。これらのＡＡＶ配列は、１つ以上のコドン（核酸レベルで）もしくはアミノ酸（ポリペプチドレベルで）の「ドナー」配列または１つ以上のコドン（核酸レベルで）もしくはアミノ酸（ポリペプチドレベルで）の「アクセプター」配列のいずれかとして働いてもよい。
ウイルスゲノム：本明細書で使用されるとき、「ウイルスゲノム」または「ベクターゲノム」は、ＡＡＶ粒子中に被包された核酸配列を指す。
ＩＶ．均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載される本開示に係る具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、またはルーチンに過ぎない実験を用いて確かめることが可能であろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることが意図されず、むしろ、添付の請求の範囲において説明される。
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、反する旨が示されない限り、または文脈上特に明らかでない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。ある群の１つ以上のメンバーの間に「または」を含むクレームまたは説明は、反する旨が示されない限り、または文脈上特に明らかでない限り、その群メンバーの１つ、２つ以上、または全てが所与の製品または方法に存在する、それに用いられる、または他の形でそれに関連する場合に満たされるものとみなされる。本開示は、群の正確に１つのメンバーが所与の製品または方法に存在する、それに用いられる、または他の形でそれに関連する実施形態を含む。本開示は、２つ以上の、または群メンバー全体が所与の製品または方法に存在する、それに用いられる、または他の形でそれに関連する実施形態を含む。
また、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は非限定的（ｏｐｅｎ）であることが意図され、追加の要素または工程の包含を許容するがそれは必須でないことにも注意されたい。したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本明細書で使用されるとき、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も包含され、開示される。
範囲が与えられる場合、端の値は含まれる。更に、示されない限り、またはそうでない場合は文脈および当業者の理解から明白でない限りは、範囲として表される値は、文脈により明白にそうでないと指示されない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１に至るまでの、本開示の様々な実施形態において記述された範囲内の任意の特定の値または部分範囲をとることができることが理解されよう。
加えて、先行技術に含まれる本開示の任意の特定の実施形態は、クレームの任意の１つ以上から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。かかる実施形態は当業者に公知であるとみなされるため、除外が本明細書に明示的に示されないとしても、それらは除外され得る。本開示の組成物の任意の詳細な実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療または有効成分；任意の製造方法；任意の使用方法など）が、先行技術の存在に関係するか否かにかかわらず、何らかの理由で任意の１つ以上のクレームから除外されることがある。
使用される語句は、制限よりむしろ説明の語句であり、より広い側面の本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく、添付の請求の範囲の範囲内で、修正がなされ得ることは、理解されるべきである。
本開示をかなり詳しく、幾つかの説明される実施形態に関するある具体性をもって説明したが、それが任意のかかる具体例もしくは実施形態または任意の具体的な実施形態に限定されるべきであることを意図するものではなく、しかし先行技術を考慮してかかる特許請求の範囲の最も広義の可能な解釈を提供し、したがって本開示の意図される範囲を有効に包含するように添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、全体として本願明細書に援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるものとする。加えて、セクション見出し、材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、限定することを意図しない。
実施例１．異常なカプシドタンパク質切断産物の同定
７アミノ酸のペプチドインサートを有する組換え合成ＡＡＶ９バリアントカプシド（配列番号５）を、Ｓｆ９昆虫細胞において商業的バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）システムを使用して発現させた。
プロセシングおよびＣｓＣｌ勾配精製の後、ＡＡＶカプシドタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分画し、タンパク質について銀染色した。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に加えて、予期せぬ１８ｋＤａ、４３ｋＤａおよび５２ｋＤａのタンパク質が、図１に示されるように、ＡＡＶ薬物物質において出現した。
これらの追加のタンパク質は、精製バッチによって、および保管の時間と共に、豊富さが変動した。したがって、ＢＥＶ／Ｓｆ９発現に由来するＡＡＶ薬物物質の安定性は損なわれた。
同じＡＡＶカプシドコンストラクトを哺乳類細胞（ＨＥＫ２９３）においてプラスミドトランスフェクションによって発現させた場合、予期せぬタンパク質は全く見られなかった。しかしながら、哺乳類細胞トランスフェクションは、非常に大量のＡＡＶベクターが遺伝子療法応用のために必要な場合には、ＡＡＶ産生のための望ましい選択肢ではない。
最も小さい１８ｋＤａタンパク質のＮ末端配列決定により、図２に示されるように、これは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に共通するＣ末端ペプチド断片であることが明らかになった。
銀染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおける５２ｋＤａおよび４３ｋＤａのペプチド断片の観察は、それらの共通のＣ末端から１８ｋＤａが切断されたＶＰ２およびＶＰ３タンパク質と相関した。
ＶＰ１の類似の切断から予測された６７ｋＤａのペプチド断片は、７０ｋＤａの未切断のＶＰ２タンパク質と泳動度が一致するであろうことから、観察できなかった。本発明者らは、切断産物への１００％変換を伴うＡＡＶ試料を産生することはできず、したがって、ＶＰ１が切断されていたことを確認できなかった。これらのデータは、プロテアーゼが、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のＣ末端から１８ｋＤａペプチドを切断しているという示唆をもたらした。
ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の共通のＣ末端領域に対する抗体を使用して抗体アフィニティーカラムによって精製した場合、ウェスタンブロット免疫検出により、１８ｋＤａのＣ末端切断産物のみが形成されることが明らかになった。一方で、セリン／システインプロテイナーゼ阻害剤カクテルの存在下では、１８ｋＤａペプチドはもはや検出されなかった。これらのデータは、セリンおよび／またはシステインプロテイナーゼが１８ｋＤａのＣ末端切断産物の出現に関与することを示唆している。
実施例２．プロテアーゼ同定
ほとんどの商業的ＢＥＶは、バキュロウイルス、ＡｃＭＮＰＶまたは密接に関連するバキュロウイルスＢｍＮＰＶに基づく。バキュロウイルスｖ－ｃａｔｈ遺伝子は、カテプシン様プロテアーゼ（ウイルスカテプシン）をコードする。ｖ－ｃａｔｈ遺伝子は、バキュロウイルスキチナーゼ遺伝子、ＣｈｉＡと連結される。若干の例外はあるものの、約８０個の配列決定されたバキュロウイルスゲノムのほぼ全てが、ｖ－ｃａｔｈおよびＣｈｉＡ遺伝子を有していた。ｖ－ｃａｔｈ遺伝子のアラインメントについては、図３を参照されたい。
保存性を考慮すると、ｖ－ｃａｔｈおよびＣｈｉＡは、必須のバキュロウイルス遺伝子であり、組換えタンパク質を作製するために使用されるバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）中にインタクトで保持されなければならないと結論付けられるかもしれない。
ｖ－ｃａｔｈ遺伝子の発見後すぐに、Ｖ－ＣＡＴＨプロテアーゼが、鱗翅目宿主におけるバキュロウイルス感染の組織液化および黒化病理において役割を果たすことが実証された（スラックら（Ｓｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．），１９９５ Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．１０９１－８）。
細胞培養物中のバキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）では、Ｖ－ＣＡＴＨの存在は、感染末期の細胞溶解および多角体（ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）放出と相関した。
しかしながら、Ｖ－ＣＡＴＨは、感染末期の宿主からのバキュロウイルス多角体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の散布の増強において役割を果たすが、Ｖ－ＣＡＴＨは、ＢＥＶによる昆虫細胞培養物における組換えタンパク質発現には必要ないと考えられている。
スクリーニングを実施して、利用されているＢＥＶシステム中のｖ－ｃａｔｈ遺伝子を同定した。Ｓｆ９細胞においてＡＡＶカプシドタンパク質を発現させるために使用したＢＥＶシステムは、組換えタンパク質発現のために一般に使用されるものであるが、ＢＥＶの完全な配列を入手してｖ－ｃａｔｈがＢＥＶシステム中になおも存在したかどうかを決定することはできなかった。
ＰＣＲスクリーニングを実施して、ｖ－ｃａｔｈ遺伝子が野生型ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルス中で見出されるかどうかを決定した。３つの異なるＰＣＲスクリーニングにより、ＢＥＶシステム中のｖ－ｃａｔｈ遺伝子座が、野生型ＡｃＭＮＰＶから予測されるものから変化していなかったことが確認された。図４を参照されたい。
実施例３．ＢＥＶシステムにおけるｖ－ｃａｔｈ欠失の生成および影響
ｖ－ｃａｔｈ遺伝子が欠失されたＢＥＶコンストラクトを、組換え合成ＡＡＶカプシドコンストラクトの産生に対するｖ－ｃａｔｈ遺伝子欠失の可能な影響を含めて調査した。対応するタンパク質切断、安定性、細胞バイアビリティ、細胞直径、細胞外観および産生効率も調査した。
１２０ｍｌのＳｆ９細胞を１．４×１０６細胞／ｍｌで含む振盪フラスコに、ＡＡＶ ＢＥＶ１（標準的ＢＥＶ発現ベクター）またはＡＡＶ ＢＥＶ２（配列番号２のコンストラクトを含むｖ－ｃａｔｈ欠失ＢＥＶ発現ベクター）のいずれかのバキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）１２０μｌを感染させた。未感染のＳｆ９細胞の対照フラスコも含めた。振盪フラスコを、２７℃で１３０ｒｐｍでインキュベートした。細胞試料を、６日間にわたり２４時間毎に収集した。
細胞バイアビリティ
細胞バイアビリティを、細胞を０．２％ｗ／ｖトリパンブルー色素と混合し、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏ Ｔ４で計数することによって決定した。標準的ＢＥＶ１感染およびｖ－ｃａｔｈ欠失ＢＥＶ２感染は、感染の過程にわたって、非常に類似したＳｆ９細胞バイアビリティプロファイル（図５）および細胞計数プロファイル（図６）を生じた。
細胞直径
細胞直径を、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏ Ｔ４を使用して決定した。標準的ＢＥＶ１感染およびｖ－ｃａｔｈ欠失ＢＥＶ２感染は、感染の９６時間後まで、非常に類似したＳｆ９細胞直径を生じた（図７）。直径は、感染後非常に遅い時間には異なっていた。
細胞外観
トリパンブルーによる染色後の未感染のＳｆ９細胞、ＡＡＶ－ＢＥＶ１およびＡＡＶ－ＢＥＶ２感染Ｓｆ９細胞の顕微鏡イメージにより、ＢＥＶ１細胞とＢＥＶ２細胞との間での類似の形態が明らかになった。
プロテアーゼ活性
アゾカゼインプロテアーゼ活性アッセイを、スラックら（Ｓｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．），２００４，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２１１－９によって実施されたアッセイから適応させたウイルス感染Ｓｆ９細胞ライセートに対して実施して、Ｖ－ＣＡＴＨを検出した。収集したＳｆ９細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中５×１０８細胞／ｍｌに希釈し、次いで、希釈系列を、ＰＢＳ中に５０μｌ体積で作製した。希釈物を、５０μｌのプロテアーゼアッセイ緩衝液Ｃ（６．７ｍＭクエン酸；１０ｍＭクエン酸Ｎａ；０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００；４６ｍＭ ＮａＣｌ；３．３ｍＭホスフェート；０．９ｍＭ ＫＣｌ；３．３ｍＭ ＥＤＴＡ）と合わせた。次いで、この混合物を、５０μｌの０．１７％ｗ／ｖアゾカゼインと合わせた。緩衝液Ｃ混合物の最終ｐＨは、ｐＨ５．８７と測定された。
試料を、振盪なしで、３７℃で１４時間、９６ウェルＵ底プレート中でインキュベートした。５０μｌ体積の２０％ｖ／ｖトリクロロ酢酸を各ウェルに添加し、混合後、９６ウェルプレートを、２１００×ｇで５分間遠心分離した。１５０μｌの上清体積を平底９６ウェルプレートに移し、ＯＤ４０５を分光光度計で測定した。
未感染のＳｆ９細胞およびｖ－ｃａｔｈ欠失ＢＥＶ２感染細胞は、アゾカゼイン基質に対する類似のレベルのプロテアーゼ活性を有した。対照的に、標準的ＢＥＶ１を感染させたＳｆ９細胞は、感染が進行するにつれて、アゾカゼイン基質に対する上昇したレベルのプロテアーゼ活性を示した。図８を参照されたい。
アゾカゼインプロテアーゼアッセイを、前述の緩衝液Ｃの代わりに緩衝液Ａを用いても実施した。緩衝液Ａ（２００ｍＭアルギニン；０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００；４６ｍＭ ＮａＣｌ；３．３ｍＭホスフェート；０．９ｍＭ ＫＣｌ）。次いで、この混合物を、５０μｌの０．１７％ｗ／ｖアゾカゼインと合わせた。緩衝液ＡのｐＨは、ｐＨ６．８９と測定された。
緩衝液Ａは、標準的ＢＥＶ１ Ｓｆ９細胞ライセートに関連するプロテアーゼ活性を増加させたことが観察された。ｖ－ｃａｔｈ欠失ＢＥＶ２ Ｓｆ９細胞ライセートは、緩衝液Ａの存在下であっても、低レベルのプロテアーゼ活性を保持した。図９を参照されたい。
以前の研究は、Ｖ－ＣＡＴＨが酸性条件を好むことを示していたので、中性ｐＨでＶ－ＣＡＴＨ関連プロテアーゼ活性の増加が見られることは、予期せぬことであった。
理論によって束縛されることを望むものではないが、アミン基の存在は、この基質のための溶媒として作用している可能性が高い。本発明者は、アゾカゼイン基質に対するｖ－ｃａｔｈ活性が、緩衝液中の尿素の存在下で有意に増強されることを、以前に示している（スラックら（Ｓｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．），１９９５）。したがって、アルギニン緩衝液は、類似の方式で働いている可能性が高い、即ち、これは、基質タンパク質またはカプシドのコンフォメーションを変化させ、残基をプロテアーゼに曝露させる。
したがって、本発明者らは、アルギニンがＡＡＶ精製収率を増強すると決定した。
ウェスタンブロット－分解産物の排除
標準的ＢＥＶ１感染およびｖ－ｃａｔｈ欠失ＢＥＶ２感染によって発現されたＡＡＶを、緩衝液Ａ溶解緩衝液中でプロセシングし、次いで、抗ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３抗体（アメリカンリサーチプロダクツ社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、製品番号：０３－６１０５８）を使用して、ウェスタンイムノブロットによってＡＡＶカプシドを検出した。ｖ－ｃａｔｈの欠失は、分解産物を排除した。図１０Ａおよび図１０Ｂを参照されたい。
結論
本開示は、Ｓｆ９／バキュロウイルスシステムにおいて産生されたＡＡＶカプシドの、バキュロウイルスによってコードされるプロテアーゼによる分解を解消するために使用することができるコンストラクト、システムおよび方法を提示する。プロテアーゼ阻害剤の添加は高くつくことが多く、残渣が下流の治療的製品において毒性効果を有し得るので、これは不十分な解決であった。
本明細書の証拠は、Ｖ－ＣＡＴＨが、バキュロウイルス発現されたＡＡＶ薬物物質中のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から１８ｋＤａのＣ末端断片を切断しているプロテアーゼであることを示している。
ＢＥＶシステム中に存在するＶ－ＣＡＴＨを有することに関する追加の潜在的問題は、ＡＡＶ薬物物質の長期安定性に対する潜在的な危険であるが、それは、このプロテアーゼが他のタンパク質にも結合でき、Ｖ－ＣＡＴＨが一部のＡＡＶと同時精製される可能性があるからである。

Claims (17)

  1. ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から選択される１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＶＰをコードする領域を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現コンストラクト。
  2. バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）である、請求項１に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  3. 前記ＢＥＶが、機能的バキュロウイルスｖ－ｃａｔｈ遺伝子を含まない、請求項２に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  4. 前記ＢＥＶが、前記バキュロウイルスｖ－ｃａｔｈ遺伝子の部分または全体を欠く、請求項３に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  5. 前記ＢＥＶが、前記バキュロウイルスｖ－ｃａｔｈ遺伝子の、突然変異により不活性化されたバージョンを含む、請求項３に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  6. 前記１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質の血清型が、ＶＯＹ１０１、ＶＯＹ２０１、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ（ＰＨＰ．Ｂ）、ＡＡＶＰＨＰ．Ａ（ＰＨＰ．Ａ）、ＡＡＶＧ２Ｂ－２６、ＡＡＶＧ２Ｂ－１３、ＡＡＶＴＨ１．１－３２、ＡＡＶＴＨ１．１－３５、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２（ＰＨＰ．Ｂ２）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３（ＰＨＰ．Ｂ３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３（Ｇ２Ａ３）、ＡＡＶＧ２Ｂ４（Ｇ２Ｂ４）、ＡＡＶＧ２Ｂ５（Ｇ２Ｂ５）、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ １９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ突然変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ突然変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－２－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶ ＳＭ １０－２、ＡＡＶシャッフル１００－１、ＡＡＶシャッフル１００－３、ＡＡＶシャッフル１００－７、ＡＡＶシャッフル１０－２、ＡＡＶシャッフル１０－６、ＡＡＶシャッフル１０－８、ＡＡＶシャッフル１００－２、ＡＡＶ ＳＭ １０－１、ＡＡＶ ＳＭ １０－８、ＡＡＶ ＳＭ １００－３、ＡＡＶ ＳＭ １００－１０、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、トゥルータイプＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ １０、ジャパニーズＡＡＶ １０血清型、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．１、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．１０、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．２、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．５、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．７、ＡＡＶ ＣＢｒ－７．８、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｂ７．３、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｂ７．４、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ１、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ２、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ３、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ４、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ－ｅ５、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ６、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ７、ＡＡＶ ＣＢｒ－Ｅ８、ＡＡＶ ＣＨｔ－１、ＡＡＶ ＣＨｔ－２、ＡＡＶ ＣＨｔ－３、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．１、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．１０、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．５、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．６、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．７、ＡＡＶ ＣＨｔ－６．８、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ１、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ２、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ５、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ６、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ８、ＡＡＶ ＣＨｔ－Ｐ９、ＡＡＶ ＣＫｄ－１、ＡＡＶ ＣＫｄ－１０、ＡＡＶ ＣＫｄ－２、ＡＡＶ ＣＫｄ－３、ＡＡＶ ＣＫｄ－４、ＡＡＶ ＣＫｄ－６、ＡＡＶ ＣＫｄ－７、ＡＡＶ ＣＫｄ－８、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ１、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ２、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ５、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ６、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ７、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｂ８、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ１、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ２、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ５、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｈ６、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ３、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ４、ＡＡＶ ＣＫｄ－Ｎ９、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ１、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ２、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ３、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ４、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ５、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ６、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ７、ＡＡＶ ＣＬｇ－Ｆ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－１、ＡＡＶ ＣＬｖ１－１、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－１０、ＡＡＶ ＣＬｖ１－２、ＡＡＶ ＣＬｖ－１２、ＡＡＶ ＣＬｖ１－３、ＡＡＶ ＣＬｖ－１３、ＡＡＶ ＣＬｖ１－４、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－７、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－８、ＡＡＶ Ｃｌｖ１－９、ＡＡＶ ＣＬｖ－２、ＡＡＶ ＣＬｖ－３、ＡＡＶ ＣＬｖ－４、ＡＡＶ ＣＬｖ－６、ＡＡＶ ＣＬｖ－８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｄ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｅ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｋ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｌ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ

    １１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｍ９、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ１、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ２、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ３、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ４、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ５、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ６、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ７、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ８、ＡＡＶ ＣＬｖ－Ｒ９、ＡＡＶ ＣＳｐ－１、ＡＡＶ ＣＳｐ－１０、ＡＡＶ ＣＳｐ－１１、ＡＡＶ ＣＳｐ－２、ＡＡＶ ＣＳｐ－３、ＡＡＶ ＣＳｐ－４、ＡＡＶ ＣＳｐ－６、ＡＡＶ ＣＳｐ－７、ＡＡＶ ＣＳｐ－８、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．１０、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．２、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．４、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．５、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．６、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．７、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．８、ＡＡＶ ＣＳｐ－８．９、ＡＡＶ ＣＳｐ－９、ＡＡＶ．ｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶ．ＶＲ－３５５、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶＦ１／ＨＳＣ１、ＡＡＶＦ１１／ＨＳＣ１１、ＡＡＶＦ１２／ＨＳＣ１２、ＡＡＶＦ１３／ＨＳＣ１３、ＡＡＶＦ１４／ＨＳＣ１４、ＡＡＶＦ１５／ＨＳＣ１５、ＡＡＶＦ１６／ＨＳＣ１６、ＡＡＶＦ１７／ＨＳＣ１７、ＡＡＶＦ２／ＨＳＣ２、ＡＡＶＦ３／ＨＳＣ３、ＡＡＶＦ４／ＨＳＣ４、ＡＡＶＦ５／ＨＳＣ５、ＡＡＶＦ６／ＨＳＣ６、ＡＡＶＦ７／ＨＳＣ７、ＡＡＶＦ８／ＨＳＣ８、ＡＡＶＦ９／ＨＳＣ９、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶｒｈ３２／３３、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４６、ＡＡＶｒｈ７３、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ．２６、またはそれらのバリアントもしくはキメラから選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  7. 前記１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質の血清型がＶＯＹ１０１である、請求項１～５のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクト。
  8. ＡＡＶウイルス産生細胞および請求項１～７のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクトを含むＡＡＶウイルス産生システム。
  9. ＡＡＶペイロードコンストラクトを含む、請求項８に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  10. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が昆虫細胞である、請求項８～９のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  11. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞がＳｆ９細胞である、請求項８～９のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  12. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞がＳｆ２１細胞である、請求項８～９のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルス産生システム。
  13. ＡＡＶウイルス産生細胞において組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生する方法であって、ＡＡＶ発現コンストラクトおよびＡＡＶペイロードコンストラクトを含むＡＡＶウイルス産生システムを提供する工程であって、前記ＡＡＶ発現コンストラクトが、請求項１～７のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現コンストラクトを含む、工程；前記ＡＡＶウイルス産生システムを、ＡＡＶウイルス産生細胞中にトランスフェクトする工程；前記ＡＡＶウイルス産生細胞が前記ＡＡＶ発現コンストラクトおよび前記ＡＡＶペイロードコンストラクトをｒＡＡＶ粒子へと加工することを可能にする条件に、前記ＡＡＶウイルス産生細胞を曝露させる工程；ならびに前記ＡＡＶウイルス産生細胞から前記ｒＡＡＶ粒子を収集する工程を含む方法。
  14. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞が昆虫細胞である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ＡＡＶウイルス産生細胞がＳｆ９細胞またはＳｆ２１細胞である、請求項１３に記載の方法。
  16. バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）を使用するバキュロウイルス発現システムにおけるＡＡＶタンパク質のプロテイナーゼ分解を低減させる方法であって、前記ＢＥＶのバキュロウイルスｖ－ｃａｔｈ遺伝子の部分または全体を欠失させる工程を含む方法。
  17. バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）を使用するバキュロウイルス発現システムにおけるＡＡＶタンパク質のプロテイナーゼ分解を低減させる方法であって、前記ＢＥＶのバキュロウイルスｖ－ｃａｔｈ遺伝子を突然変異により不活性化する工程を含む方法。
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