TW201905200A - 調節多核苷酸 - Google Patents

調節多核苷酸

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Abstract

本發明係關於腺相關病毒(AAV)顆粒，其包含編碼至少一種siRNA分子的調節多核苷酸，及其使用方法。

Description

調節多核苷酸
本發明係關於用於設計、製備、製造、使用及/或調配AAV顆粒的組合物、方法及製程，該等AAV顆粒包含調節多核苷酸，例如編碼至少一種靶向所關注之至少一種基因之小干擾RNA (siRNA)分子的多核苷酸。靶向所關注基因可以干擾基因表現及所引起之蛋白質產生。包含編碼至少一種siRNA分子之調節多核苷酸的AAV顆粒可以插入重組腺相關病毒(AAV)載體中。亦揭示利用AAV顆粒抑制所關注基因在個體中表現的方法。
微RNA (或miRNA或miR)為非編碼單股小核糖核酸分子(RNA)，其長度通常為19-25個核苷酸。已在哺乳動物基因組中鑑別出超過一千種微RNA。成熟微RNA經由與標靶mRNA之互補序列部分或完全配對而主要結合至標靶信使RNA (mRNA)之3'非轉譯區(3'-UTR)，從而在轉錄後層面促進標靶mRNA降解且在一些情況下抑制轉譯起始。微RNA在許多關鍵生物過程中起關鍵角色，諸如調控細胞週期及生長、細胞凋亡、細胞增殖及組織發育。
miRNA基因通常以miRNA之長初始轉錄物形式(亦即pri-miRNA)轉錄。pri-miRNA分裂成miRNA之前驅物(亦即pre-miRNA)，該前驅物進一步經處理而產生成熟的功能miRNA。
雖然許多標靶表現策略係採用基於核酸的模態，但仍需要特異性更高且脫靶效應更少的經改良之核酸模態。
本發明提供呈人工初始微RNA、前微RNA及成熟微RNA構築體形式之此類改良模態及其設計方法。此等新穎構築體可為合成的單獨分子或在遞送至細胞的質體或表現載體中編碼。此類載體包括(但不限於)腺相關病毒載體，諸如任何AAV血清型之載體基因組，或其他病毒遞送運載工具，諸如慢病毒等。
本文中描述用於投與包含編碼至少一種siRNA分子之調節多核苷酸之AAV顆粒以便治療、預防、減緩及/或緩解疾病及/或病症的方法、製程、組合物、套組及裝置。
本發明之多個實施例詳細闡述於以下說明中。本發明之其他特徵、目標及優點自說明書及圖式及申請專利範圍將為顯而易見的。
下文闡述代表本文所述標的物的非限制性實施例：
1. 一種腺相關病毒(AAV)病毒基因組，其包含位於兩個反向末端重複序列(ITR)之間的核酸序列，其中該核酸當表現時抑制或遏制靶基因在細胞中表現，其中該核酸序列依5'至3'次序包含：編碼第一有義股序列的第一區域、編碼第一反義股序列的第二區域、編碼第二有義股的第三區域及編碼第二反義股序列的第四區域，其中第一及第二有義股序列包含至少15個鄰接核苷酸且第一及第二反義股序列與靶基因所產生的mRNA互補且包含至少15個鄰接核苷酸，且其中該第一有義股序列與第一反義股序列共有長度至少四個核苷酸之互補區域且該第二有義股序列與第二反義股序列共有長度至少四個核苷酸之互補區域。
2. 一種腺相關病毒(AAV)病毒基因組，其包含位於兩個反向末端重複序列(ITR)之間的核酸序列，其中該核酸當表現時抑制或遏制第一靶基因及第二靶基因在細胞中表現，其中該核酸序列依5'至3'次序包含：編碼第一有義股序列的第一區域、編碼第一反義股序列的第二區域、編碼第二有義股的第三區域及編碼第二反義股序列的第四區域，其中該第一及第二有義股序列包含至少15個鄰接核苷酸且該第一反義股序列與第一靶基因所產生的mRNA互補且該第二反義股序列與第二靶基因所產生的mRNA互補且包含至少15個鄰接核苷酸，且其中該第一有義股序列與第一反義股序列共有長度至少四個核苷酸的互補區域且該第二有義股序列與第二反義股序列共有長度至少四個核苷酸的互補區域。
3. 如實施例2之AAV病毒基因組，依5'至3'次序進一步包含編碼第三有義股序列的第五區域及編碼第三反義股序列的第六區域，其中該第三有義股序列包含至少15個鄰接核苷酸且該第三反義股序列與第三靶基因所產生的mRNA互補且包含至少15個鄰接核苷酸，且其中該第三有義股序列與第三反義股序列共有至少四個核苷酸的互補區域。
4. 如實施例3之AAV病毒基因組，依5'至3'次序進一步包含編碼第四有義股序列的第七區域及編碼第四反義股序列的第八區域，其中該第四有義股序列包含至少15個鄰接核苷酸且該第四反義股序列與第四靶基因所產生的mRNA互補且包含至少15個鄰接核苷酸，且其中該第四有義股序列與第四反義股序列共有至少四個核苷酸的互補區域。
5. 如實施例2之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因與該第二靶基因相同。
6. 如實施例3之AAV病毒基因組，其中該第三靶基因與該第一靶基因相同。
7. 如實施例3之AAV病毒基因組，其中該第三靶基因與該第二靶基因相同。
8. 如實施例3之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因及該第三靶基因為相同的。
9. 如實施例4之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第一靶基因相同。
10. 如實施例4之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第二靶基因相同。
11. 如實施例4之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第三靶基因相同。
12. 如實施例4之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第一靶基因及該第二靶基因相同。
13. 如實施例4之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第二靶基因及該第三靶基因相同。
14. 如實施例4之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第一靶基因、該第二靶基因及該第三靶基因相同。
15. 如實施例1-14中任一例之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因、該第三靶基因及/或該第四靶基因為亨廷頓蛋白(Huntingtin)。
16. 如實施例1-14中任一例之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因、該第三靶基因及/或該第四靶基因為SOD1。
17. 如實施例1-14中任一例之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因、該第三靶基因及/或該第四靶基因為亨廷頓蛋白或SOD1。
18. 如實施例1或2之AAV病毒基因組，其中該第一有義股與該第一反義股之間的互補區域具有至少12個核苷酸的長度。
19. 如實施例18之AAV病毒基因組，其中該第一有義股與該第一反義股之間的互補區域具有14與21個核苷酸之間的長度。
20. 如實施例19之AAV病毒基因組，其中該第一有義股與該第一反義股之間的互補區域具有19個核苷酸的長度。
21. 如實施例1或2之AAV病毒基因組，其中該第二有義股與該第二反義股之間的互補區域具有至少12個核苷酸的長度。
22. 如實施例21之AAV病毒基因組，其中該第二有義股與該第二反義股之間的互補區域具有14與21個核苷酸之間的長度。
23. 如實施例22之AAV病毒基因組，其中該第二有義股與該第二反義股之間的互補區域具有19個核苷酸的長度。
24. 如實施例3之AAV病毒基因組，其中該第三有義股與該第三反義股之間的互補區域具有至少12個核苷酸的長度。
25. 如實施例24之AAV病毒基因組，其中該第三有義股與該第三反義股之間的互補區域具有14與21個核苷酸之間的長度。
26. 如實施例25之AAV病毒基因組，其中該第三有義股與該第三反義股之間的互補區域具有19個核苷酸的長度。
27. 如實施例4之AAV病毒基因組，其中該第四有義股與該第四反義股之間的互補區域具有至少12個核苷酸的長度。
28. 如實施例27之AAV病毒基因組，其中該第四有義股與該第四反義股之間的互補區域具有14與21個核苷酸之間的長度。
29. 如實施例25之AAV病毒基因組，其中該第四有義股與該第四反義股之間的互補區域具有19個核苷酸的長度。
30. 如實施例1或2之AAV病毒基因組，其中該第一有義股序列、該第二有義股序列、該第一反義股序列及該第二反義股序列獨立地具有30個或少於30個核苷酸。
31. 如實施例3之AAV病毒基因組，其中該第一有義股序列、該第二有義股序列、該第三有義股序列、該第一反義股序列、該第二反義股序列及該第三反義股序列獨立地具有30個或少於30個核苷酸。
32. 如實施例4之AAV病毒基因組，其中該第一有義股序列、該第二有義股序列、該第三有義股序列、該第四有義股序列、該第一反義股序列、該第二反義股序列、該第三反義股序列及該第四反義股序列獨立地具有30個或少於30個核苷酸。
33. 如實施例1或2之AAV病毒基因組，其中該第一有義股序列及該第一反義股序列或該第二有義股序列及該第二反義股序列中之至少一者包含至少1個核苷酸之3'突出端。
34. 如實施例1或2之AAV病毒基因組，其中該第一有義股序列及該第一反義股序列或該第二有義股序列及該第二反義股序列中之至少一者包含至少2個核苷酸之3'突出端。
35. 如實施例3之AAV病毒基因組，其中該第三有義股序列及該第三反義股序列包含至少1個核苷酸之3'突出端。
36. 如實施例3之AAV病毒基因組，其中該第三有義股序列及該第三反義股序列包含至少2個核苷酸之3'突出端。
37. 如實施例4之AAV病毒基因組，其中該第四有義股序列及該第四反義股序列包含至少1個核苷酸之3'突出端。
38. 如實施例4之AAV病毒基因組，其中該第四有義股序列及該第四反義股序列包含至少2個核苷酸之3'突出端。
39. 如實施例1-38中任一例之AAV病毒基因組，其中該第一區域包含第一有義股序列之啟動子5'、繼之為第一有義股序列，且該第二區域包含第一反義股序列、繼之為第一反義股序列之啟動子終止子3'；或該第三區域包含第二有義股序列之啟動子5'、繼之為第二有義股序列，且該第四區域包含第二反義股序列、繼之為第二反義股序列之啟動子終止子3'。
40. 如實施例1-38中任一例之AAV病毒基因組，其中該第一區域包含第一有義股序列之啟動子5'、繼之為第一有義股序列，且該第二區域包含第一反義股序列、繼之為第一反義股序列之啟動子終止子3'；且該第三區域包含第二有義股序列之啟動子5'、繼之為第二有義股序列，且該第四區域包含第二反義股序列、繼之為第二反義股序列之啟動子終止子3'。
41. 如實施例3-40中任一例之AAV病毒基因組，其中該第五區域包含第三有義股序列之啟動子5'、繼之為第三有義股序列且該第六區域包含第三反義股序列、繼之為第三反義股序列之啟動子終止子3'。
42. 如實施例4-41中任一例之AAV病毒基因組，其中該第七區域包含第四有義股序列之啟動子5'、繼之為第四有義股序列且第八區域包含第四反義股序列、繼之為第四反義股序列之啟動子終止子3'。
43. 如實施例3之AAV病毒基因組，其中該第五區域為第四區域之3'。
44. 如實施例4之AAV病毒基因組，其中該第七區域為該第六區域之3'。
45. 如實施例39-44中任一例之AAV病毒基因組，其中啟動子為Pol III啟動子且該啟動子終止子為Pol III啟動子終止子。
46. 如實施例45之AAV病毒基因組，其中各自地，該Pol III啟動子為U3、U6、U7、7SK、H1或MRP、EBER、硒基半胱胺酸tRNA、7SL、腺病毒VA-1，或端粒酶基因啟動子，且該Pol III啟動子終止子為U3、U6、U7、7SK、H1或MRP、EBER、硒基半胱胺酸tRNA、7SL、腺病毒VA-1，或端粒酶基因啟動子終止子。
47. 如實施例46之AAV病毒基因組，其中該Pol III啟動子為H1啟動子且該Pol III啟動子終止子為H1啟動子終止子。
48. 如實施例1-47中任一例之AAV病毒基因組，其中該AAV病毒基因組為單專一性多順反子AAV病毒基因組。
49 如實施例1-47中任一例之AAV病毒基因組，其中該AAV病毒基因組為雙專一性多順反子AAV病毒基因組。
50. 如實施例1或2之AAV病毒基因組，其中該第一區域及該第二區域編碼第一siRNA分子，且該第三區域及該第四區域編碼第二siRNA分子，其中該第一及該第二siRNA分子靶向不同靶基因。
51. 如實施例3之AAV病毒基因組，其中該第五區域與該第六區域編碼第三siRNA分子，其中該第一siRNA分子、該第二siRNA分子及該第三siRNA分子各自靶向不同靶基因。
52. 如實施例4之AAV病毒基因組，其中該第七區域及該第八區域編碼第四siRNA分子，其中該第一siRNA分子、該第二siRNA分子、該第三siRNA分子及該第四siRNA分子各自靶向不同靶基因。
53. 一種腺相關病毒(AAV)病毒基因組，包含位於兩個反向末端重複序列(ITR)之間的核酸序列，其中該核酸序列包含第一分子支架區域及第二分子支架區域，其中該第一分子支架區域包含第一分子支架核酸序列，該第一分子支架核酸序列編碼： (a)第一莖及環以形成第一莖環結構，該第一莖環結構之序列依5'至3'包含： i.第一UG模體，其位於第一莖環結構之第一5'莖的鹼基處或附近； ii.第一5'莖臂，其包含第一有義股及視情況存在之第一5'間隔子區域，其中該第一5'間隔子區域當存在時位於該第一UG模體與該第一有義股之間； iii.第一環區域，其包含位於該第一環區域之5'端的第一UGUG模體； iv.第一3'莖臂，其包含第一反義股及視情況存在之第一3'間隔子區域，其中尿苷存在於該第一反義股之5'端且其中該第一3'間隔子區域當存在時具有足以形成一個螺旋形轉彎的長度； (b)第一5'側接區域，其位於該第一莖環結構的5'；及 (c)第一3'側接區域，其位於該第一莖環結構之3'，該第一3'側接區域包含CNNC模體，及 第二分子支架區域包含第二分子支架核酸序列，該第二分子支架核酸序列編碼： (d)第二莖及環以形成第二莖環結構，該第二莖環結構之序列依5'至3'包含： v.第二UG模體，其位於該第二莖環結構之第二5'莖的鹼基處或附近； vi.第二5'莖臂，其包含第二有義股及視情況存在之第二5'間隔子區域，其中該第二5'間隔子區域當存在時位於該第二UG模體與該第二有義股之間； vii.第二環區域，其包含位於該第二環區域之5'端的第二UGUG模體； viii.第二3'莖臂，其包含第二反義股及視情況存在之第二3'間隔子區域，其中尿苷存在於該第二反義股之5'端且其中該第二3'間隔子區域當存在時具有足以形成一個螺旋形轉彎的長度； ix.第二5'側接區域，其位於該第二莖環結構之5'；及 (e)第二3'側接區域，其位於該第二莖環結構之3'，該第二3'側接區域包含CNNC模體，及 其中該第一反義股與該第一有義股形成第一siRNA雙螺旋體且該第二反義股與該第二有義股形成第二siRNA雙螺旋體，其中該第一siRNA雙螺旋體當表現時抑制或遏制第一靶基因在細胞中表現，且該第二siRNA雙螺旋體當表現時抑制或遏制第二靶基因在細胞中表現，其中該第一及第二有義股序列包含至少15個核苷酸，該第一反義股序列與第一靶基因所產生的mRNA互補且第二反義股序列與第二靶基因所產生的mRNA互補，且其中該第一有義股序列與第一反義股序列共有至少四個核苷酸長度的互補區域且該第二有義股序列與第二反義股序列共有至少四個核苷酸長度的互補區域。
54. 一種腺相關病毒(AAV)病毒基因組，包含位於兩個反向末端重複序列(ITR)之間的核酸序列，其中該核酸序列包含第一分子支架區域及第二分子支架區域，其中該第一分子支架區域包含第一分子支架核酸序列，該第一分子支架核酸序列編碼： (a)第一莖及環以形成第一莖環結構，該第一莖環結構之序列依5'至3'包含： i.第一UG模體，其位於第一莖環結構之第一5'莖的鹼基處或附近； ii.第一5'莖臂，其包含第一反義股及視情況存在之第一5'間隔子區域，其中該第一5'間隔子區域當存在時位於該第一UG模體與該第一反義股之間； iii.第一環區域，其包含位於該第一環區域之5'端的第一UGUG模體； iv.第一3'莖臂，其包含第一有義股及視情況存在之第一3'間隔子區域，其中尿苷存在於該第一有義股之5'端且其中該第一3'間隔子區域當存在時具有足以形成一個螺旋形轉彎的長度； (b)第一5'側接區域，其位於該第一莖環結構的5'；及 (c)第一3'側接區域，其位於該第一莖環結構之3'，該第一3'側接區域包含CNNC模體，及 第二分子支架區域包含第二分子支架核酸序列，該第二分子支架核酸序列編碼： (d)第二莖及環以形成第二莖環結構，該第二莖環結構依5'至3'順序包含： v.第二UG模體，其位於該第二莖環結構之第二5'莖的鹼基處或附近； vi.第二5'莖臂，其包含第二反義股及視情況存在之第二5'間隔子區域，其中該第二5'間隔子區域當存在時位於該第二UG模體與該第二反義股之間； vii.第二環區域，其包含位於該第二環區域之5'端的第二UGUG模體； viii.第二3'莖臂，其包含第二有義股及視情況存在之第二3'間隔子區域，其中尿苷存在於該第二有義股之5'端且其中該第二3'間隔子區域當存在時具有足以形成一個螺旋形轉彎的長度； (e)第二5'側接區域，其位於該第二莖環結構之5'；及 (f)第二3'側接區域，其位於該第二莖環結構之3'，該第二3'側接區域包含CNNC模體，及 其中該第一反義股與該第一有義股形成第一siRNA雙螺旋體且該第二反義股與該第二有義股形成第二siRNA雙螺旋體，其中該第一siRNA雙螺旋體當表現時抑制或遏制第一靶基因在細胞中表現，且該第二siRNA雙螺旋體當表現時抑制或遏制第二靶基因在細胞中表現，其中該第一及第二有義股序列包含至少15個核苷酸，該第一反義股序列與第一靶基因所產生的mRNA互補且第二反義股序列與第二靶基因所產生的mRNA互補，且其中該第一有義股序列與第一反義股序列共有至少四個核苷酸長度的互補區域且該第二有義股序列與第二反義股序列共有至少四個核苷酸長度的互補區域。
55. 如實施例53或54之AAV病毒基因組，其中該第一反義股序列或該第二反義股序列抑制或遏制亨廷頓蛋白表現。
56. 如實施例53或54之AAV病毒基因組，其中該第一反義股序列及該第二反義股序列抑制或遏制亨廷頓蛋白表現。
57. 如實施例53或54之AAV病毒基因組，其中該第一反義股序列或第二反義股序列抑制或遏制SOD1表現。
58. 如實施例53或54之AAV病毒基因組，其中該第一反義股序列及該第二反義股序列抑制或遏制SOD1表現。
59. 如實施例53或54之AAV病毒基因組，其中該第一5'側接區域係選自表10中所列的序列。
60. 如實施例53或54之AAV病毒基因組，其中該第二5'側接區域係選自表10中所列的序列。
61. 如實施例59之AAV病毒基因組，其中該第二5'側接區域係選自表10中所列的序列。
62. 如實施例53或54之AAV病毒基因組，其中該第一環區域係選自表11中所列的序列。
63. 如實施例53或54之AAV病毒基因組，其中該第二環區域係選自表11中所列的序列。
64. 如實施例62之AAV病毒基因組，其中該第二環區域係選自表11中所列的序列。
65. 如實施例53或54之AAV病毒基因組，其中該第一3'側接區域係選自表12中所列的序列。
66. 如實施例53或54之AAV病毒基因組，其中該第二3'側接區域係選自表12中所列的序列。
67. 如實施例65之AAV病毒基因組，其中該第二3'側接區域係選自表12中所列的序列。
68. 如實施例53或54之AAV病毒基因組，其中該核酸序列包含位於該第一分子支架核酸序列與該第二分子支架核酸序列之間的啟動子序列。
69. 如實施例53或54之AAV病毒基因組，進一步包含：在(b)中，第一5'側接區域之啟動子5'、繼之為第一5'側接區域；且在(c)中，第一3'側接區域、繼之為第一3'側接區域之啟動子終止子3'；且在(d)中，第二5'側接區域之啟動子5'、繼之為第二5'側接區域且在(e)中，第二3'側接區域、繼之為第二3'側接區域之啟動子終止子3'。
70. 如實施例69之AAV病毒基因組，其中該啟動子為Pol III啟動子。
71. 如實施例70之AAV病毒基因組，其中該Pol III啟動子序列為U3、U6、U7、7SK、H1或MRP、EBER、硒基半胱胺酸tRNA、7SL、腺病毒VA-1或端粒酶基因啟動子。
72. 如實施例71之AAV病毒基因組，其中該Pol III啟動子為H1啟動子。
73. 如實施例53之AAV病毒基因組，其中該核酸序列進一步包含含有第三分子支架核酸序列的第三分子支架區域，該第三分子支架核酸序列編碼： (g)第三莖及環以形成第三莖環結構，該第三莖環結構之序列依5'至3'包含： ix.第三UG模體，其位於第三莖環結構之第三5'莖的鹼基處或附近； x.第三5'莖臂，其包含第三有義股及視情況存在之第三5'間隔子區域，其中該第三5'間隔子區域當存在時位於該第三UG模體與該第三有義股之間； xi.第三環區域，其包含位於該第三環區域之5'端的第三UGUG模體； xii.第三3'莖臂，其包含第三反義股及視情況存在之第三3'間隔子區域，其中尿苷存在於該第三反義股之5'端且其中該第三3'間隔子區域當存在時具有足以形成一個螺旋形轉彎的長度； (h)第三5'側接區域，其位於該第三莖環結構之5'；及 (i)第三3'側接區域，其位於該第三莖環結構之3'，該第三3'側接區域包含CNNC模體，及 其中該第三反義股與該第三有義股形成第三siRNA雙螺旋體，其中該第三siRNA雙螺旋體當表現時抑制或遏制第三靶基因在細胞中表現，其中該第三有義股序列包含至少15個核苷酸，該第三反義股序列與該第三靶基因所產生的mRNA互補，且其中該第三有義股序列與第三反義股序列共有至少四個核苷酸長度的互補區域。
74. 如實施例73之AAV病毒基因組，進一步包含：在(h)中，第三5'側接區域之啟動子5'、繼之為第三5'側接區域；及在(i)中，第三3'側接區域、繼之為第三3'側接區域之啟動子終止子3'。
75. 如實施例74之AAV病毒基因組，其中該啟動子為Pol III啟動子。
76. 如實施例75之AAV病毒基因組，其中該Pol III啟動子序列為U3、U6、U7、7SK、H1或MRP、EBER、硒基半胱胺酸tRNA、7SL、腺病毒VA-1或端粒酶基因啟動子。
77. 如實施例76之AAV病毒基因組，其中該Pol III啟動子為H1啟動子。
78. 如實施例73之AAV病毒基因組，其中該核酸序列進一步包含含有第四分子支架核酸序列的第四分子支架區域，該第四分子支架核酸序列編碼： (j)第四莖及環以形成第四莖環結構，該第四莖環結構之序列依5'至3'包含： xiii.第四UG模體，其位於該第四莖環結構之第四5'莖的鹼基處或附近； xiv.第四5'莖臂，其包含第四有義股及視情況存在之第四5'間隔子區域，其中該第四5'間隔子區域當存在時位於該第四UG模體與該第四有義股之間； xv.第四環區域，其包含位於該第四環區域之5'端的第四UGUG模體； xvi.第四3'莖臂，其包含第四反義股及視情況存在之第四3'間隔子區域，其中尿苷存在於該第四反義股之5'端且其中該第四3'間隔子區域當存在時具有足以形成一個螺旋形轉彎的長度； (k)第四5'側接區域，其位於該第四莖環結構之5'；及 (l)第四3'側接區域，其位於該第四莖環結構之3'，該第四3'側接區域包含CNNC模體，及 其中該第四反義股與該第四有義股形成第四siRNA雙螺旋體，其中該第四siRNA雙螺旋體當表現時抑制或遏制第四靶基因在細胞中表現，其中該第四有義股序列包含至少15個核苷酸，該第四反義股序列與該第四靶基因所產生的mRNA互補，且其中該第四有義股序列與第四反義股序列共有至少四個核苷酸長度的互補區域。
79. 如實施例78之AAV病毒基因組，進一步包含：在(k)中，第四5'側接區域之啟動子5'、繼之為第四5'側接區域；及在(l)中，第四3'側接區域、繼之為第四3'側接區域之啟動子終止子3'。
80. 如實施例79之AAV病毒基因組，其中該啟動子為Pol III啟動子。
81. 如實施例80之AAV病毒基因組，其中該Pol III啟動子序列為U3、U6、U7、7SK、H1或MRP、EBER、硒基半胱胺酸tRNA、7SL、腺病毒VA-1或端粒酶基因啟動子。
82. 如實施例81之AAV病毒基因組，其中該Pol III啟動子為H1啟動子。
83. 如實施例53-82中任一例之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因與該第二靶基因相同。
84. 如實施例53-82中任一例之AAV病毒基因組，其中該第三靶基因與該第一靶基因相同。
85. 如實施例53-82中任一例之AAV病毒基因組，其中該第三靶基因與該第二靶基因相同。
86. 如實施例53-82中任一例之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因及該第三靶基因為相同的。
87. 如實施例53-82中任一例之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第一靶基因相同。
88. 如實施例53-82中任一例之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第二靶基因相同。
89. 如實施例53-82中任一例之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第三靶基因相同。
90. 如實施例53-82中任一例之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第一靶基因及該第二靶基因相同。
91. 如實施例53-82之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第二靶基因及該第三靶基因相同。
92. 如實施例53-82之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第一靶基因及該第三靶基因相同。
93. 如實施例53-82中任一例之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第一靶基因、該第二靶基因及該第三靶基因相同。
94. 如實施例53-93中任一例之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因、該第三靶基因及/或該第四靶基因為亨廷頓蛋白。
95. 如實施例53-93中任一例之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因、該第三靶基因及/或該第四靶基因為SOD1。
96. 如實施例53-93中任一例之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因、該第三靶基因及/或該第四靶基因為亨廷頓蛋白或SOD1。
97. 一種用於抑制靶基因在細胞中之基因表現的方法，包含向該細胞投與包含如實施例1-96中任一例之AAV病毒基因組的組合物。
98. 如實施例97之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
99. 如實施例98之方法，其中該哺乳動物細胞為中型多棘神經元。
100. 如實施例98之方法，其中該哺乳動物細胞為皮質神經元。
101. 如實施例98之方法，其中該哺乳動物細胞為運動神經元。
102. 如實施例98之方法，其中該哺乳動物細胞為星形細胞。
103. 一種用於治療有需要之個體之疾病及/或病症的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之包含如實施例1-96中任一例之AAV病毒基因組的組合物。
104. 如實施例103之方法，其中對靶基因表現加以抑制或遏制。
105. 如實施例104之方法，其中所關注靶基因之表現被抑制或遏制約30%至約70%。
106. 如實施例104之方法，其中靶基因表現被抑制或遏制約50%至約90%。
107. 一種用於抑制靶基因在細胞中表現的方法，其中該靶基因在該細胞內部引起功能獲得性效應，該方法包含向該細胞投與包含如實施例1-96中任一例之AAV病毒基因組的組合物。
108. 如實施例107之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
109. 如實施例108之方法，其中該哺乳動物細胞為中型多棘神經元。
110. 如實施例108之方法，其中該哺乳動物細胞為皮質神經元。
111. 如實施例108之方法，其中該哺乳動物細胞為運動神經元。
112. 如實施例108之方法，其中該哺乳動物細胞為星形細胞。
相關申請案之交叉參考 本申請案主張2017年5月5日申請之美國臨時專利申請案第62/501,787號、2017年5月18日申請之美國臨時專利申請案第62/507,923號及2017年6月15日申請之美國臨時專利申請案第62/520,093號的權益，該等申請案中之每一者的內容以全文引用的方式併入本文中。
序列表之參考 本申請案正連同作為ASCII正文檔案之序列表的電子格式一起申請。作為ASCII正文檔案提供之序列表的名稱為14482_155_228_SEQ_LISTING.txt，其於2018年5月3日建立，位元組大小為6,853,639。該序列表以全文引用之方式併入本文中。
I.本發明之組合物 根據本發明，提供藉由腺相關病毒(AAV)遞送調節多核苷酸的組合物及/或基於調節多核苷酸之組合物。本發明之AAV顆粒可以經由若干種投藥途徑中之任一者活體內、離體或活體外提供至細胞、組織、器官或生物體。
如本文所用，「AAV顆粒」為一種病毒，其包含具有至少一個負載區域及至少一個反向末端重複序列(ITR)區域的病毒基因組。
如本文所用，「病毒基因組」或「載體基因組」或「病毒載體」係指囊封於AAV顆粒內的核酸序列。病毒基因組包含至少一個編碼多肽或其片段的負載區域。
如本文所用，「有效負載」或「負載區域」為編碼本發明之一或多種多肽的任何核酸分子。在最低限度下，負載區域包含編碼有義及反義序列、基於siRNA之組合物或其片段的核酸序列，但視情況亦可包含一或多個功能或調控元件以促進轉錄表現及/或多肽轉譯。
本文揭示之核酸序列及多肽可加以工程改造以含有模組化元件及/或序列模體，該等模組化元件及/或序列模體經組裝以允許本發明之調節多核苷酸及/或基於調節多核苷酸之組合物表現。在一些實施例中，包含負載區域的核酸序列可以包含啟動子區域、內含子、Kozak序列、增強子或多腺苷酸化序列中之一或多者。本發明之有效負載區域典型地編碼至少一種有義及反義序列、基於siRNA之組合物，或前述者之片段彼此之組合或與其他多肽部分之組合。
本發明之有效負載區域可以在AAV顆粒之病毒基因組內遞送至一或多種靶細胞、組織、器官或生物體。 腺相關病毒(AAV)及AAV顆粒
細小病毒科病毒為以單股DNA基因組為特徵的非包膜二十面體小衣殼病毒。細小病毒科病毒係由兩種亞科組成：感染脊椎動物的細小病毒亞科(Parvovirinae)，及感染無脊椎動物的濃核病毒亞科(Densovirinae)。由於其結構相對簡單、利用標準分子生物學技術操縱容易，因此此病毒科適用作生物學工具。病毒基因組可加以修飾以含有用於組裝功能重組病毒或病毒顆粒的最少組分，該等組分負載有所需有效負載或經工程改造以表現或遞送所需有效負載，該有效負載可以遞送至靶細胞、組織、器官或生物體。
細小病毒及細小病毒科中之其他成員大體描述於Kenneth I. Berns, 「Parvoviridae: The Viruses and Their Replication,」第69章, 於LDS VIROLOGY (第3版, 1996)中，該文獻內容以全文引用之方式併入本文中。
細小病毒科包含依賴病毒屬，依賴病毒屬包括能夠在脊椎動物宿主中複製的腺相關病毒(AAV)，脊椎動物宿主包括(但不限於)人類、靈長類動物、牛、犬、馬及綿羊物種。
AAV病毒基因組為長度約5,000個核苷酸(nt)的線性單股DNA (ssDNA)分子。AAV病毒基因組可以包含負載區域及至少一個反向末端重複序列(ITR)或ITR區域。ITR傳統上側接非結構蛋白(由Rep基因編碼)及結構蛋白(由衣殼基因或Cap基因編碼)的編碼核苷酸序列。雖然不希望被理論束縛，但AAV病毒基因組典型地包含兩個ITR序列。AAV病毒基因組包含特徵性T形髮夾結構，該T形髮夾結構由ssDNA之5'及3'端的自互補末端145 nt限定，從而形成能量上穩定的雙股區域。該雙股髮夾結構包含多種功能，包括(但不限於)藉由充當宿主病毒複製細胞之內源DNA聚合酶複合物的引子來充當DNA複製的起點。
除經編碼的異源有效負載之外，AAV載體亦可包含天然存在之任何AAV血清型核苷酸序列及/或重組AAV血清型核苷酸序列或變異體之完整或部分病毒基因組。AAV變異體可以在核酸層面(基因組或衣殼)及胺基酸層面(衣殼)具有顯著同源序列，以產生在物理及功能上大體等效的構築體，該等構築體藉由類似機制複製且藉由類似機制組裝。Chiorini等人, J. Vir. 71: 6823-33(1997)；Srivastava等人, J. Vir. 45:555-64 (1983)；Chiorini等人, J. Vir. 73:1309-1319 (1999)；Rutledge等人, J. Vir. 72:309-319 (1998)；及Wu等人, J. Vir. 74: 8635-47 (2000)，各文獻之內容以全文引用的方式併入本文中。
在一個實施例中，本發明之AAV顆粒為缺乏複製的重組AAV載體，其病毒基因組內缺乏編碼功能Rep及Cap蛋白的序列。此等缺乏型AAV載體可能缺乏大部分或所有親本編碼序列且基本上僅攜帶一或兩種AAV ITR序列及所關注核酸以遞送至細胞、組織、器官或生物體。
在一個實施例中，本發明之AAV顆粒的病毒基因組包含至少一個為了其中所編碼之編碼序列的複製、轉錄及轉譯而提供的控制元件。並非所有的控制元件需要始終存在，只要編碼序列能夠在適當的宿主細胞中複製、轉錄及/或轉譯即可。表現控制元件之非限制性實例包括轉錄起始及/或終止序列、啟動子及/或增強子序列、有效RNA處理信號(諸如剪接及多腺苷酸化信號)、穩定細胞質mRNA的序列、增強轉譯功效的序列(例如Kozak共同序列)、增強蛋白質穩定性的序列，及/或增強蛋白質處理及/或分泌的序列。
根據本發明，治療及/或診斷用的AAV顆粒包含已蒸餾或濃縮為所關注之核酸有效負載或負荷轉導所必需之最少組分的病毒。以此方式，AAV顆粒經工程改造為用於特異性遞送、同時缺乏發現於野生型病毒中之有害複製及/或整合特徵的運載工具。
本發明之AAV載體可以重組方式產生且可以基於腺相關病毒(AAV)親本或參考序列。如本文所用，「載體」為轉運、轉導或以其他方式充當異源分子(諸如本文所述之核酸)運載體的任何分子或部分。
除單股AAV病毒基因組(例如ssAAV)之外，本發明亦提供自互補AAV (scAAV)病毒基因組。scAAV病毒基因組含有黏接在一起以形成雙股DNA的DNA股。藉由跳過第二股合成，scAAV在細胞中實現快速表現。
在一個實施例中，本發明之AAV顆粒為scAAV。
在一個實施例中，本發明之AAV顆粒為ssAAV。
用於產生及/或修飾AAV顆粒之方法揭示於此項技術中，諸如假型AAV載體(PCT專利公開案第WO200028004號、第WO200123001號、第WO2004112727號、第WO 2005005610號及第WO 2005072364號，該等公開案各自的內容以全文引用之方式併入本文中)。
AAV顆粒可加以修飾以增強遞送效率。此類經修飾的AAV顆粒可以有效地封裝且用於成功地以高頻率及最小毒性感染靶細胞。在一些實施例中，AAV顆粒的衣殼係根據美國公開案第US 20130195801號中所述的方法加以工程改造，該案內容以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中，可以將包含編碼本發明多肽之負載區域的AAV顆粒引入哺乳動物細胞中。 AAV血清型
本發明之AAV顆粒可以包含或來源於任何天然或重組AAV血清型。根據本發明，AAV顆粒可以利用或基於選自以下任一者之血清型：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突變體、AAVrh8R R533A突變體、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、綿羊AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、 AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV改組100-1、AAV改組100-3、AAV改組100-7、AAV改組10-2、AAV改組10-6、AAV改組10-8、AAV改組100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、true type AAV (ttAAV)、UPENN AAV 10、Japanese AAV 10 serotypes、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAV CHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAV CLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAV CLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAV CSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、AAV-PHP.B (PHP.B)、AAV-PHP.A (PHP.A)、G2B-26、G2B-13、TH1.1-32、TH1.1-35、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5及其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如美國公開案第US20030138772號中所述的序列，該公開案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV1 (US20030138772之SEQ ID NO: 6及64)、AAV2 (US20030138772之SEQ ID NO: 7及70)、AAV3 (US20030138772之SEQ ID NO: 8及71)、AAV4 (US20030138772之SEQ ID NO: 63)、AAV5 (US20030138772之SEQ ID NO: 114)、AAV6 (US20030138772之SEQ ID NO: 65)、AAV7 (US20030138772之SEQ ID NO: 1-3)、AAV8 (US20030138772之SEQ ID NO: 4及95)、AAV9 (US20030138772之SEQ ID NO: 5及100)、AAV10 (US20030138772之SEQ ID NO: 117)、AAV11 (US20030138772之SEQ ID NO: 118)、AAV12 (US20030138772之SEQ ID NO: 119)、AAVrh10 (US20030138772之SEQ ID NO: 81之胺基酸1至738)、AAV16.3 (US20030138772 SEQ ID NO: 10)、AAV29.3/bb.1 (US20030138772 SEQ ID NO: 11)、AAV29.4 (US20030138772 SEQ ID NO: 12)、AAV29.5/bb.2 (US20030138772 SEQ ID NO: 13)、AAV1.3 (US20030138772 SEQ ID NO: 14)、AAV13.3 (US20030138772 SEQ ID NO: 15)、AAV24.1 (US20030138772 SEQ ID NO: 16)、AAV27.3 (US20030138772 SEQ ID NO: 17)、AAV7.2 (US20030138772 SEQ ID NO: 18)、AAVC1 (US20030138772 SEQ ID NO: 19)、AAVC3 (US20030138772 SEQ ID NO: 20)、AAVC5 (US20030138772 SEQ ID NO: 21)、AAVF1 (US20030138772 SEQ ID NO: 22)、AAVF3 (US20030138772 SEQ ID NO: 23)、AAVF5 (US20030138772 SEQ ID NO: 24)、AAVH6 (US20030138772 SEQ ID NO: 25)、AAVH2 (US20030138772 SEQ ID NO: 26)、AAV42-8 (US20030138772 SEQ ID NO: 27)、AAV42-15 (US20030138772 SEQ ID NO: 28)、AAV42-5b (US20030138772 SEQ ID NO: 29)、AAV42-1b (US20030138772 SEQ ID NO: 30)、AAV42-13 (US20030138772 SEQ ID NO: 31)、AAV42-3a (US20030138772 SEQ ID NO: 32)、AAV42-4 (US20030138772 SEQ ID NO: 33)、AAV42-5a (US20030138772 SEQ ID NO: 34)、AAV42-10 (US20030138772 SEQ ID NO: 35)、AAV42-3b (US20030138772 SEQ ID NO: 36)、AAV42-11 (US20030138772 SEQ ID NO: 37)、AAV42-6b (US20030138772 SEQ ID NO: 38)、AAV43-1 (US20030138772 SEQ ID NO: 39)、AAV43-5 (US20030138772 SEQ ID NO: 40)、AAV43-12 (US20030138772 SEQ ID NO: 41)、AAV43-20 (US20030138772 SEQ ID NO: 42)、AAV43-21 (US20030138772 SEQ ID NO: 43)、AAV43-23 (US20030138772 SEQ ID NO: 44)、AAV43-25 (US20030138772 SEQ ID NO: 45)、AAV44.1 (US20030138772 SEQ ID NO: 46)、AAV44.5 (US20030138772 SEQ ID NO: 47)、AAV223.1 (US20030138772 SEQ ID NO: 48)、AAV223.2 (US20030138772 SEQ ID NO: 49)、AAV223.4 (US20030138772 SEQ ID NO: 50)、AAV223.5 (US20030138772 SEQ ID NO: 51)、AAV223.6 (US20030138772 SEQ ID NO: 52)、AAV223.7 (US20030138772 SEQ ID NO: 53)、AAVA3.4 (US20030138772 SEQ ID NO: 54)、AAVA3.5 (US20030138772 SEQ ID NO: 55)、AAVA3.7 (US20030138772 SEQ ID NO: 56)、AAVA3.3 (US20030138772 SEQ ID NO: 57)、AAV42.12 (US20030138772 SEQ ID NO: 58)、AAV44.2 (US20030138772 SEQ ID NO: 59)、AAV42-2 (US20030138772 SEQ ID NO: 9)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如美國公開案第US20150159173號中所述的序列，該公開案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV2 (US20150159173之SEQ ID NO: 7及23)、rh20 (US20150159173之SEQ ID NO: 1)、rh32/33 (US20150159173之SEQ ID NO: 2)、rh39 (US20150159173之SEQ ID NO: 3、20及36)、rh46 (US20150159173之SEQ ID NO: 4及22)、rh73 (US20150159173之SEQ ID NO: 5)、rh74 (US20150159173之SEQ ID NO: 6)、AAV6.1 (US20150159173之SEQ ID NO: 29)、rh.8 (US20150159173之SEQ ID NO: 41)、rh.48.1 (US20150159173之SEQ ID NO: 44)、hu.44 (US20150159173之SEQ ID NO: 45)、hu.29 (US20150159173之SEQ ID NO: 42)、hu.48 (US20150159173之SEQ ID NO: 38)、rh54 (US20150159173之SEQ ID NO: 49)、AAV2 (US20150159173之SEQ ID NO: 7)、cy.5 (US20150159173之SEQ ID NO: 8及24)、rh.10 (US20150159173之SEQ ID NO: 9及25)、rh.13 (US20150159173之SEQ ID NO: 10及26)、AAV1 (US20150159173之SEQ ID NO: 11及27)、AAV3 (US20150159173之SEQ ID NO: 12及28)、AAV6 (US20150159173之SEQ ID NO: 13及29)、AAV7 (US20150159173之SEQ ID NO: 14及30)、AAV8 (US20150159173之SEQ ID NO: 15及31)、hu.13 (US20150159173之SEQ ID NO: 16及32)、hu.26 (US20150159173之SEQ ID NO: 17及33)、hu.37 (US20150159173之SEQ ID NO: 18及34)、hu.53 (US20150159173之SEQ ID NO: 19及35)、rh.43 (US20150159173之SEQ ID NO: 21及37)、rh2 (US20150159173之SEQ ID NO: 39)、rh.37 (US20150159173之SEQ ID NO: 40)、rh.64 (US20150159173之SEQ ID NO: 43)、rh.48 (US20150159173之SEQ ID NO: 44)、ch.5 (US20150159173之SEQ ID NO 46)、rh.67 (US20150159173之SEQ ID NO: 47)、rh.58 (US20150159173之SEQ ID NO: 48)，或其變異體，包括(但不限於) Cy5R1、Cy5R2、Cy5R3、Cy5R4、rh.13R、rh.37R2、rh.2R、rh.8R、rh.48.1、rh.48.2、rh.48.1.2、hu.44R1、hu.44R2、hu.44R3、hu.29R、ch.5R1、rh64R1、rh64R2、AAV6.2、AAV6.1、AAV6.12、hu.48R1、hu.48R2及hu.48R3。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如美國專利第US 7198951號中所述的序列，該專利的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於)AAV9 (US 7198951之SEQ ID NO: 1-3)、AAV2 (US 7198951之SEQ ID NO: 4)、AAV1 (US 7198951之SEQ ID NO: 5)、AAV3 (US 7198951之SEQ ID NO: 6)及AAV8 (US7198951之SEQ ID NO: 7)。
在一些實施例中，AAV血清型可為或在AAV9序列中具有突變，如N Pulicherla等人(Molecular Therapy 19(6):1070-1078 (2011)，該文獻以全文引用之方式併入本文中)所述，諸如(但不限於) AAV9.9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如美國專利第US 6156303號中所述的序列，該專利的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV3B (US 6156303之SEQ ID NO: 1及10)、AAV6 (US 6156303之SEQ ID NO: 2、7及11)、AAV2 (US 6156303之SEQ ID NO: 3及8)、AAV3A (US 6156303之SEQ ID NO: 4及9)或其衍生物。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如美國公開案第US20140359799號中所述的序列，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV8 (US20140359799之SEQ ID NO: 1)、AAVDJ (US20140359799之SEQ ID NO: 2及3)或其變異體。
在一些實施例中，血清型可為AAVDJ (AAV-DJ)或其變異體，諸如AAVDJ8 (或AAV-DJ8)，如Grimm等人(Journal of Virology 82(12): 5887-5911 (2008)，該文獻以全文引用之方式併入本文中)所述。AAVDJ8之胺基酸序列可以包含兩個或超過兩個突變以便移除肝素結合域(HBD)。作為一個非限制性實例，美國專利第7,588,772號(其內容以全文引用的方式併入本文中)中描述為SEQ ID NO: 1的AAV-DJ序列可以包含兩個突變：(1) R587Q，其中胺基酸587處之精胺酸(R；Arg)變為麩醯胺酸(Q；Gln)；及(2) R590T，其中胺基酸590處之精胺酸(R；Arg)變為蘇胺酸(T；Thr)。作為另一個非限制性實例，可以包含三種突變：(1) K406R，其中胺基酸406處之離胺酸(K；Lys)變為精胺酸(R；Arg)；(2) R587Q，其中胺基酸587處之精胺酸(R；Arg)變為麩醯胺酸(Q；Gln)；及(3) R590T，其中胺基酸590處之精胺酸(R；Arg)變為蘇胺酸(T；Thr)。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如國際公開案第WO1998011244號中所述之AAV4的序列，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV4 (WO1998011244之(SEQ ID NO: 1-20)。
在一些實施例中，AAV血清型可為或在AAV2序列中具有突變以產生AAV2G9，如國際公開案第WO2014144229號中所述，該案以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如國際公開案第WO2005033321號中所述的序列，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV3-3 (WO2005033321之SEQ ID NO: 217)、AAV1 (WO2005033321之SEQ ID NO: 219及202)、AAV106.1/hu.37 (WO2005033321之SEQ ID No: 10)、AAV114.3/hu.40 (WO2005033321之SEQ ID No: 11)、AAV127.2/hu.41 (WO2005033321之SEQ ID NO:6及8)、AAV128.3/hu.44 (WO2005033321之SEQ ID No: 81)、AAV130.4/hu.48 (WO2005033321之SEQ ID NO: 78)、AAV145.1/hu.53 (WO2005033321之SEQ ID No: 176及177)、AAV145.6/hu.56 (WO2005033321之SEQ ID NO: 168及192)、AAV16.12/hu.11 (WO2005033321之SEQ ID NO:: 153及57)、AAV16.8/hu.10 (WO2005033321之SEQ ID NO:: 156及56)、AAV161.10/hu.60 (WO2005033321之SEQ ID No: 170)、AAV161.6/hu.61 (WO2005033321之SEQ ID No: 174)、AAV1-7/rh.48 (WO2005033321之SEQ ID NO: 32)、AAV1-8/rh.49 (WO2005033321之SEQ ID NOs: 103及25)、AAV2 (WO2005033321之SEQ ID NO: 211及221)、AAV2-15/rh.62 (WO2005033321之SEQ ID No: 33及114)、AAV2-3/rh.61 (WO2005033321之SEQ ID NO: 21)、AAV2-4/rh.50 (WO2005033321之SEQ ID No: 23及108)、AAV2-5/rh.51 (WO2005033321之SEQ ID NO: 104及22)、AAV3.1/hu.6 (WO2005033321之SEQ ID NO: 5及84)、AAV3.1/hu.9 (WO2005033321之SEQ ID NO: 155及58)、AAV3-11/rh.53 (WO2005033321之SEQ ID NO: 186及176)、AAV3-3 (WO2005033321之SEQ ID NO: 200)、AAV33.12/hu.17 (WO2005033321之SEQ ID NO:4)、AAV33.4/hu.15 (WO2005033321之SEQ ID No: 50)、AAV33.8/hu.16 (WO2005033321之SEQ ID No: 51)、AAV3-9/rh.52 (WO2005033321之SEQ ID NO: 96及18)、AAV4-19/rh.55 (WO2005033321之SEQ ID NO: 117)、AAV4-4 (WO2005033321之SEQ ID NO: 201及218)、AAV4-9/rh.54 (WO2005033321之SEQ ID NO: 116)、AAV5 (WO2005033321之SEQ ID NO: 199及216)、AAV52.1/hu.20 (WO2005033321之SEQ ID NO: 63)、AAV52/hu.19 (WO2005033321之SEQ ID NO: 133)、AAV5-22/rh.58 (WO2005033321之SEQ ID No: 27)、AAV5-3/rh.57 (WO2005033321之SEQ ID NO: 105)、AAV5-3/rh.57 (WO2005033321之SEQ ID No: 26)、AAV58.2/hu.25 (WO2005033321之SEQ ID No: 49)、AAV6 (WO2005033321之SEQ ID NO: 203及220)、AAV7 (WO2005033321之SEQ ID NO: 222及213)、AAV7.3/hu.7 (WO2005033321之SEQ ID No: 55)、AAV8 (WO2005033321之SEQ ID NO: 223及214)、AAVH-1/hu.1 (WO2005033321之EQ ID No: 46)、AAVH-5/hu.3 (WO2005033321之EQ ID No: 44)、AAVhu.1 (WO2005033321之EQ ID NO: 144)、AAVhu.10 (WO2005033321之EQ ID NO: 156)、AAVhu.11 (WO2005033321之EQ ID NO: 153)、AAVhu.12 (WO2005033321 SEQ ID NO: 59)、AAVhu.13 (WO2005033321之EQ ID NO: 129)、AAVhu.14/AAV9 (WO2005033321之EQ ID NO: 123及3)、AAVhu.15 (WO2005033321之EQ ID NO: 147)、AAVhu.16 (WO2005033321之EQ ID NO: 148)、AAVhu.17 (WO2005033321之EQ ID NO: 83)、AAVhu.18 (WO2005033321之EQ ID NO: 149)、AAVhu.19 (WO2005033321之EQ ID NO: 133)、AAVhu.2 (WO2005033321之EQ ID NO: 143)、AAVhu.20 (WO2005033321之EQ ID NO: 134)、AAVhu.21 (WO2005033321之EQ ID NO: 135)、AAVhu.22 (WO2005033321之EQ ID NO: 138)、AAVhu.23.2 (WO2005033321之EQ ID NO: 137)、AAVhu.24 (WO2005033321之EQ ID NO: 136)、AAVhu.25 (WO2005033321之EQ ID NO: 146)、AAVhu.27 (WO2005033321之EQ ID NO: 140)、AAVhu.29 (WO2005033321之EQ ID NO: 132)、AAVhu.3 (WO2005033321之EQ ID NO: 145)、AAVhu.31 (WO2005033321之EQ ID NO: 121)、AAVhu.32 (WO2005033321之EQ ID NO: 122)、AAVhu.34 (WO2005033321之EQ ID NO: 125)、AAVhu.35 (WO2005033321之EQ ID NO: 164)、AAVhu.37 (WO2005033321之EQ ID NO: 88)、AAVhu.39 (WO2005033321之EQ ID NO: 102)、AAVhu.4 (WO2005033321之EQ ID NO: 141)、AAVhu.40 (WO2005033321之EQ ID NO: 87)、AAVhu.41 (WO2005033321之EQ ID NO: 91)、AAVhu.42 (WO2005033321之EQ ID NO: 85)、AAVhu.43 (WO2005033321之EQ ID NO: 160)、AAVhu.44 (WO2005033321之EQ ID NO: 144)、AAVhu.45 (WO2005033321之EQ ID NO: 127)、AAVhu.46 (WO2005033321之EQ ID NO: 159)、AAVhu.47 (WO2005033321之EQ ID NO: 128)、AAVhu.48 (WO2005033321之EQ ID NO: 157)、AAVhu.49 (WO2005033321之EQ ID NO: 189)、AAVhu.51 (WO2005033321之EQ ID NO: 190)、AAVhu.52 (WO2005033321之EQ ID NO: 191)、AAVhu.53 (WO2005033321之EQ ID NO: 186)、AAVhu.54 (WO2005033321之EQ ID NO: 188)、AAVhu.55 (WO2005033321之EQ ID NO: 187)、AAVhu.56 (WO2005033321之EQ ID NO: 192)、AAVhu.57 (WO2005033321之EQ ID NO: 193)、AAVhu.58 (WO2005033321之EQ ID NO: 194)、AAVhu.6 (WO2005033321之EQ ID NO: 84)、AAVhu.60 (WO2005033321之EQ ID NO: 184)、AAVhu.61 (WO2005033321之EQ ID NO: 185)、AAVhu.63 (WO2005033321之EQ ID NO: 195)、AAVhu.64 (WO2005033321之EQ ID NO: 196)、AAVhu.66 (WO2005033321之EQ ID NO: 197)、AAVhu.67 (WO2005033321之EQ ID NO: 198)、AAVhu.7 (WO2005033321之EQ ID NO: 150)、AAVhu.8 (WO2005033321 SEQ ID NO: 12)、AAVhu.9 (WO2005033321之EQ ID NO: 155)、AAVLG-10/rh.40 (WO2005033321之EQ ID No: 14)、AAVLG-4/rh.38 (WO2005033321之EQ ID NO: 86)、AAVLG-4/rh.38 (WO2005033321之EQ ID No: 7)、AAVN721-8/rh.43 (WO2005033321之EQ ID NO: 163)、AAVN721-8/rh.43 (WO2005033321之EQ ID No: 43)、AAVpi.1 (WO2005033321 SEQ ID NO: 28)、AAVpi.2 (WO2005033321 SEQ ID NO: 30)、AAVpi.3 (WO2005033321 SEQ ID NO: 29)、AAVrh.38 (WO2005033321之EQ ID NO: 86)、AAVrh.40 (WO2005033321之EQ ID NO: 92)、AAVrh.43 (WO2005033321之EQ ID NO: 163)、AAVrh.44 (WO2005033321 SEQ ID NO: 34)、AAVrh.45 (WO2005033321 SEQ ID NO: 41)、AAVrh.47 (WO2005033321 SEQ ID NO: 38)、AAVrh.48 (WO2005033321之EQ ID NO: 115)、AAVrh.49 (WO2005033321之EQ ID NO: 103)、AAVrh.50 (WO2005033321之EQ ID NO: 108)、AAVrh.51 (WO2005033321之EQ ID NO: 104)、AAVrh.52 (WO2005033321之EQ ID NO: 96)、AAVrh.53 (WO2005033321之EQ ID NO: 97)、AAVrh.55 (WO2005033321 SEQ ID NO: 37)、AAVrh.56 (WO2005033321之EQ ID NO: 152)、AAVrh.57 (WO2005033321之EQ ID NO: 105)、AAVrh.58 (WO2005033321之EQ ID NO: 106)、AAVrh.59 (WO2005033321 SEQ ID NO: 42)、AAVrh.60 (WO2005033321 SEQ ID NO: 31)、AAVrh.61 (WO2005033321之EQ ID NO: 107)、AAVrh.62 (WO2005033321之EQ ID NO: 114)、AAVrh.64 (WO2005033321之EQ ID NO: 99)、AAVrh.65 (WO2005033321 SEQ ID NO: 35)、AAVrh.68 (WO2005033321 SEQ ID NO: 16)、AAVrh.69 (WO2005033321 SEQ ID NO: 39)、AAVrh.70 (WO2005033321 SEQ ID NO: 20)、AAVrh.72 (WO2005033321 SEQ ID NO: 9)，或其變異體，包括(但不限於) AVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVcy.6、AAVrh.12、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.25/42 15、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh14。變異體之非限制實例包括WO2005033321之SEQ ID NO: 13、15、17、19、24、36、40、45、47、48、51-54、60-62、64-77、79、80、82、89、90、93-95、98、100、101、109-113、118-120、124、126、131、139、142、151、154、158、161、162、165-183、202、204-212、215、219、224-236，其內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如國際公開案第WO2015168666號中所述的序列，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAVrh8R (WO2015168666之SEQ ID NO: 9)、AAVrh8R A586R突變體(WO2015168666之SEQ ID NO: 10)、AAVrh8R R533A突變體(WO2015168666之SEQ ID NO: 11)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如美國專利第US9233131號中所述的序列，該專利的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAVhE1.1 (US9233131之SEQ ID NO: 44)、AAVhEr1.5 (US9233131之SEQ ID NO: 45)、AAVhER1.14 (US9233131之SEQ ID NO: 46)、AAVhEr1.8 (US9233131之SEQ ID NO: 47)、AAVhEr1.16 (US9233131之SEQ ID NO: 48)、AAVhEr1.18 (US9233131之SEQ ID NO: 49)、AAVhEr1.35 (US9233131之SEQ ID NO: 50)、AAVhEr1.7 (US9233131之SEQ ID NO: 51)、AAVhEr1.36 (US9233131之SEQ ID NO: 52)、AAVhEr2.29 (US9233131之SEQ ID NO: 53)、AAVhEr2.4 (US9233131之SEQ ID NO: 54)、AAVhEr2.16 (US9233131之SEQ ID NO: 55)、AAVhEr2.30 (US9233131之SEQ ID NO: 56)、AAVhEr2.31 (US9233131之SEQ ID NO: 58)、AAVhEr2.36 (US9233131之SEQ ID NO: 57)、AAVhER1.23 (US9233131之SEQ ID NO: 53)、AAVhEr3.1 (US9233131之SEQ ID NO: 59)、AAV2.5T (US9233131之SEQ ID NO: 42)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如美國專利公開案第US20150376607號中所述的序列，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV-PAEC (US20150376607之SEQ ID NO: 1)、AAV-LK01 (US20150376607之SEQ ID NO: 2)、AAV-LK02 (US20150376607之SEQ ID NO: 3)、AAV-LK03 (US20150376607之SEQ ID NO: 4)、AAV-LK04 (US20150376607之SEQ ID NO: 5)、AAV-LK05 (US20150376607之SEQ ID NO: 6)、AAV-LK06 (US20150376607之SEQ ID NO: 7)、AAV-LK07 (US20150376607之SEQ ID NO: 8)、AAV-LK08 (US20150376607之SEQ ID NO: 9)、AAV-LK09 (US20150376607之SEQ ID NO: 10)、AAV-LK10 (US20150376607之SEQ ID NO: 11)、AAV-LK11 (US20150376607之SEQ ID NO: 12)、AAV-LK12 (US20150376607之SEQ ID NO: 13)、AAV-LK13 (US20150376607之SEQ ID NO: 14)、AAV-LK14 (US20150376607之SEQ ID NO: 15)、AAV-LK15 (US20150376607之SEQ ID NO: 16)、AAV-LK16 (US20150376607之SEQ ID NO: 17)、AAV-LK17 (US20150376607之SEQ ID NO: 18)、AAV-LK18 (US20150376607之SEQ ID NO: 19)、AAV-LK19 (US20150376607之SEQ ID NO: 20)、AAV-PAEC2 (US20150376607之SEQ ID NO: 21)、AAV-PAEC4 (US20150376607之SEQ ID NO: 22)、AAV-PAEC6 (US20150376607之SEQ ID NO: 23)、AAV-PAEC7 (US20150376607之SEQ ID NO: 24)、AAV-PAEC8 (US20150376607之SEQ ID NO: 25)、AAV-PAEC11 (US20150376607之SEQ ID NO: 26)、AAV-PAEC12 (US20150376607之SEQ ID NO: 27)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如美國專利第US9163261號中所述的序列，該專利的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV-2-pre-miRNA-101 (SEQ ID NO:1 US9163261)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如美國專利公開案第US20150376240號中所述的序列，該專利的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV-8h (US20150376240之SEQ ID NO: 6)、AAV-8b (US20150376240之SEQ ID NO: 5)、AAV-h (US20150376240之SEQ ID NO: 2)、AAV-b (US20150376240之SEQ ID NO: 1)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如美國專利公開案第US20160017295號中所述的序列，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV SM 10-2 (US20160017295之SEQ ID NO: 22)、AAV改組100-1 (US20160017295之SEQ ID NO: 23)、AAV改組100-3 (US20160017295之SEQ ID NO: 24)、AAV改組100-7 (US20160017295之SEQ ID NO: 25)、AAV改組10-2 (US20160017295之SEQ ID NO: 34)、AAV改組10-6 (US20160017295之SEQ ID NO: 35)、AAV改組10-8 (US20160017295之SEQ ID NO: 36)、AAV改組100-2 (US20160017295之SEQ ID NO: 37)、AAV SM 10-1 (US20160017295之SEQ ID NO: 38)、AAV SM 10-8 (US20160017295之SEQ ID NO: 39)、AAV SM 100-3 (US20160017295之SEQ ID NO: 40)、AAV SM 100-10 (US20160017295之SEQ ID NO: 41)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如美國專利公開案第US20150238550號中所述的序列，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) BNP61 AAV (US20150238550之SEQ ID NO: 1)、BNP62 AAV (US20150238550之SEQ ID NO: 3)、BNP63 AAV (US20150238550之SEQ ID NO: 4)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或可以具有如美國專利公開案第US20150315612號中所述的序列，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAVrh.50 (US20150315612之SEQ ID No: 108)、AAVrh.43 (US20150315612之SEQ ID No: 163)、AAVrh.62 (US20150315612之SEQ ID No: 114)、AAVrh.48 (US20150315612之SEQ ID No: 115)、AAVhu.19 (US20150315612之SEQ ID No: 133)、AAVhu.11 (US20150315612之SEQ ID No: 153)、AAVhu.53 (US20150315612之SEQ ID No: 186)、AAV4-8/rh.64 (US20150315612之SEQ ID No: 15)、AAVLG-9/hu.39 (US20150315612之SEQ ID No: 24)、AAV54.5/hu.23 (US20150315612之SEQ ID No: 60)、AAV54.2/hu.22 (US20150315612之SEQ ID No: 67)、AAV54.7/hu.24 (US20150315612之SEQ ID No: 66)、AAV54.1/hu.21 (US20150315612之SEQ ID No: 65)、AAV54.4R/hu.27 (US20150315612之SEQ ID No: 64)、AAV46.2/hu.28 (US20150315612之SEQ ID No: 68)、AAV46.6/hu.29 (US20150315612之SEQ ID No: 69)、AAV128.1/hu.43 (US20150315612之SEQ ID No: 80)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如國際公開案第WO2015121501號中所述的序列，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於)真實型AAV (ttAAV)(WO2015121501之SEQ ID NO: 2)、「UPenn AAV10」(WO2015121501之SEQ ID NO: 8)、「日本AAV10」(WO2015121501之SEQ ID NO: 9)，或其變異體。
根據本發明，AAV衣殼血清型選擇或用途可以來自多種物種。在一個實施例中，AAV可為禽類AAV (AAAV)。AAAV血清型可為或具有如美國專利第US 9238800號中所述的序列，該專利的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAAV (US 9,238,800之SEQ ID NO: 1、2、4、6、8、10、12及14)，或其變異體。
在一個實施例中，AAV可為牛AAV (BAAV)。BAAV血清型可為或具有如美國專利第US 9,193,769號中所述的序列，該專利的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) BAAV (US 9193769之SEQ ID NO: 1及6)，或其變異體。BAAV血清型可為或具有如美國專利第US7427396號中所述的序列，該專利的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) BAAV (US7427396之SEQ ID NO: 5及6)，或其變異體。
在一個實施例中，AAV可為山羊AAV。山羊AAV血清型可為或具有如美國專利第US7427396號中所述的序列，該專利的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於)山羊AAV (US7427396之SEQ ID NO: 3)，或其變異體。
在其他實施例中，AAV可加以工程改造為來自兩種或超過兩種親本血清型的雜合AAV。在一個實施例中，AAV可為包含來自AAV2及AAV9之序列的AAV2G9。AAV2G9 AAV血清型可為或具有如美國專利公開案第US20160017005號中所述的序列，該案的內容以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中，AAV可為胺基酸390-627 (VP1編號)具有突變之AAV9衣殼文庫所產生的血清型，如Pulicherla等人(Molecular Therapy 19(6):1070-1078 (2011)，該文獻的內容以全文引用的方式併入本文中)所述。血清型及相應的核苷酸及胺基酸取代可為(但不限於) AAV9.1 (G1594C；D532H)、AAV6.2 (T1418A及T1436X；V473D及I479K)、AAV9.3 (T1238A；F413Y)、AAV9.4 (T1250C及A1617T；F417S)、AAV9.5 (A1235G、A1314T、A1642G、C1760T；Q412R、T548A、A587V)、AAV9.6 (T1231A；F411I)、AAV9.9 (G1203A、G1785T；W595C)、AAV9.10 (A1500G、T1676C；M559T)、AAV9.11 (A1425T、A1702C、A1769T；T568P、Q590L)、AAV9.13 (A1369C、A1720T；N457H、T574S)、AAV9.14 (T1340A、T1362C、T1560C、G1713A；L447H)、AAV9.16 (A1775T；Q592L)、AAV9.24 (T1507C、T1521G；W503R)、AAV9.26 (A1337G、A1769C；Y446C、Q590P)、AAV9.33 (A1667C；D556A)、AAV9.34 (A1534G、C1794T；N512D)、AAV9.35 (A1289T、T1450A、C1494T、A1515T、C1794A、G1816A；Q430L、Y484N、N98K、V606I)、AAV9.40 (A1694T、E565V)、AAV9.41 (A1348T、T1362C；T450S)、AAV9.44 (A1684C、A1701T、A1737G；N562H、K567N)、AAV9.45 (A1492T、C1804T；N498Y、L602F)、AAV9.46 (G1441C、T1525C、T1549G；G481R、W509R、L517V)、9.47 (G1241A、G1358A、A1669G、C1745T；S414N、G453D、K557E、T582I)、AAV9.48 (C1445T、A1736T；P482L、Q579L)、AAV9.50 (A1638T、C1683T、T1805A；Q546H、L602H)、AAV9.53 (G1301A、A1405C、C1664T、G1811T；R134Q、S469R、A555V、G604V)、AAV9.54 (C1531A、T1609A；L511I、L537M)、AAV9.55 (T1605A；F535L)、AAV9.58 (C1475T、C1579A；T492I、H527N)、AAV.59 (T1336C；Y446H)、AAV9.61 (A1493T；N498I)、AAV9.64 (C1531A、A1617T；L511I)、AAV9.65 (C1335T、T1530C、C1568A；A523D)、AAV9.68 (C1510A；P504T)、AAV9.80 (G1441A；G481R)、AAV9.83 (C1402A、A1500T；P468T、E500D)、AAV9.87 (T1464C、T1468C；S490P)、AAV9.90 (A1196T；Y399F)、AAV9.91 (T1316G、A1583T、C1782G、T1806C；L439R、K528I)、AAV9.93 (A1273G、A1421G、A1638C、C1712T、G1732A、A1744T、A1832T；S425G、Q474R、Q546H、P571L、G578R、T582S、D611V)、AAV9.94 (A1675T；M559L)及AAV9.95 (T1605A；F535L).
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如國際公開案第WO2016049230號中所述的序列，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAVF1/HSC1 (WO2016049230之SEQ ID NO: 2及20)、AAVF2/HSC2 (WO2016049230之SEQ ID NO: 3及21)、AAVF3/HSC3 (WO2016049230之SEQ ID NO: 5及22)、AAVF4/HSC4 (WO2016049230之SEQ ID NO: 6及23)、AAVF5/HSC5 (WO2016049230之SEQ ID NO: 11及25)、AAVF6/HSC6 (WO2016049230之SEQ ID NO: 7及24)、AAVF7/HSC7 (WO2016049230之SEQ ID NO: 8及27)、AAVF8/HSC8 (WO2016049230之SEQ ID NO: 9及28)、AAVF9/HSC9 (WO2016049230之SEQ ID NO: 10及29)、AAVF11/HSC11 (WO2016049230之SEQ ID NO: 4及26)、AAVF12/HSC12 (WO2016049230之SEQ ID NO: 12及30)、AAVF13/HSC13 (WO2016049230之SEQ ID NO: 14及31)、AAVF14/HSC14 (WO2016049230之SEQ ID NO: 15及32)、AAVF15/HSC15 (WO2016049230之SEQ ID NO: 16及33)、AAVF16/HSC16 (WO2016049230之SEQ ID NO: 17及34)、AAVF17/HSC17 (WO2016049230之SEQ ID NO: 13及35)，或其變異體或衍生物。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如美國專利第US 8734809號中所述的序列，該專利的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV CBr-E1 (US8734809之SEQ ID NO: 13及87)、AAV CBr-E2 (US8734809之SEQ ID NO: 14及88)、AAV CBr-E3 (US8734809之SEQ ID NO: 15及89)、AAV CBr-E4 (US8734809之SEQ ID NO: 16及90)、AAV CBr-E5 (US8734809之SEQ ID NO: 17及91)、AAV CBr-e5 (US8734809之SEQ ID NO: 18及92)、AAV CBr-E6 (US8734809之SEQ ID NO: 19及93)、AAV CBr-E7 (US8734809之SEQ ID NO: 20及94)、AAV CBr-E8 (US8734809之SEQ ID NO: 21及95)、AAV CLv-D1 (US8734809之SEQ ID NO: 22及96)、AAV CLv-D2 (US8734809之SEQ ID NO: 23及97)、AAV CLv-D3 (US8734809之SEQ ID NO: 24及98)、AAV CLv-D4 (US8734809之SEQ ID NO: 25及99)、AAV CLv-D5 (US8734809之SEQ ID NO: 26及100)、AAV CLv-D6 (US8734809之SEQ ID NO: 27及101)、AAV CLv-D7 (US8734809之SEQ ID NO: 28及102)、AAV CLv-D8 (US8734809之SEQ ID NO: 29及103)、AAV CLv-E1 (US8734809之SEQ ID NO: 13及87)、AAV CLv-R1 (US8734809之SEQ ID NO: 30及104)、AAV CLv-R2 (US8734809之SEQ ID NO: 31及105)、AAV CLv-R3 (US8734809之SEQ ID NO: 32及106)、AAV CLv-R4 (US8734809之SEQ ID NO: 33及107)、AAV CLv-R5 (US8734809之SEQ ID NO: 34及108)、AAV CLv-R6 (US8734809之SEQ ID NO: 35及109)、AAV CLv-R7 (US8734809之SEQ ID NO: 36及110)、AAV CLv-R8 (US8734809之SEQ ID NO: 37及111)、AAV CLv-R9 (US8734809之SEQ ID NO: 38及112)、AAV CLg-F1 (US8734809之SEQ ID NO: 39及113)、AAV CLg-F2 (US8734809之SEQ ID NO: 40及114)、AAV CLg-F3 (US8734809之SEQ ID NO: 41及115)、AAV CLg-F4 (US8734809之SEQ ID NO: 42及116)、AAV CLg-F5 (US8734809之SEQ ID NO: 43及117)、AAV CLg-F6 (US8734809之SEQ ID NO: 43及117)、AAV CLg-F7 (US8734809之SEQ ID NO: 44及118)、AAV CLg-F8 (US8734809之SEQ ID NO: 43及117)、AAV CSp-1 (US8734809之SEQ ID NO: 45及119)、AAV CSp-10 (US8734809之SEQ ID NO: 46及120)、AAV CSp-11 (US8734809之SEQ ID NO: 47及121)、AAV CSp-2 (US8734809之SEQ ID NO: 48及122)、AAV CSp-3 (US8734809之SEQ ID NO: 49及123)、AAV CSp-4 (US8734809之SEQ ID NO: 50及124)、AAV CSp-6 (US8734809之SEQ ID NO: 51及125)、AAV CSp-7 (US8734809之SEQ ID NO: 52及126)、AAV CSp-8 (US8734809之SEQ ID NO: 53及127)、AAV CSp-9 (US8734809之SEQ ID NO: 54及128)、AAV CHt-2 (US8734809之SEQ ID NO: 55及129)、AAV CHt-3 (US8734809之SEQ ID NO: 56及130 )、AAV CKd-1 (US8734809之SEQ ID NO: 57及131)、AAV CKd-10 (US8734809之SEQ ID NO: 58及132)、AAV CKd-2 (US8734809之SEQ ID NO: 59及133)、AAV CKd-3 (US8734809之SEQ ID NO: 60及134)、AAV CKd-4 (US8734809之SEQ ID NO: 61及135)、AAV CKd-6 (US8734809之SEQ ID NO: 62及136)、AAV CKd-7 (US8734809之SEQ ID NO: 63及137)、AAV CKd-8 (US8734809之SEQ ID NO: 64及138)、AAV CLv-1 (US8734809之SEQ ID NO: 35及139)、AAV CLv-12 (US8734809之SEQ ID NO: 66及140)、AAV CLv-13 (US8734809之SEQ ID NO: 67及141)、AAV CLv-2 (US8734809之SEQ ID NO: 68及142)、AAV CLv-3 (US8734809之SEQ ID NO: 69及143)、AAV CLv-4 (US8734809之SEQ ID NO: 70及144)、AAV CLv-6 (US8734809之SEQ ID NO: 71及145)、AAV CLv-8 (US8734809之SEQ ID NO: 72及146)、AAV CKd-B1 (US8734809之SEQ ID NO: 73及147)、AAV CKd-B2 (US8734809之SEQ ID NO: 74及148)、AAV CKd-B3 (US8734809之SEQ ID NO: 75及149)、AAV CKd-B4 (US8734809之SEQ ID NO: 76及150)、AAV CKd-B5 (US8734809之SEQ ID NO: 77及151)、AAV CKd-B6 (US8734809之SEQ ID NO: 78及152)、AAV CKd-B7 (US8734809之SEQ ID NO: 79及153)、AAV CKd-B8 (US8734809之SEQ ID NO: 80及154)、AAV CKd-H1 (US8734809之SEQ ID NO: 81及155)、AAV CKd-H2 (US8734809之SEQ ID NO: 82及156)、AAV CKd-H3 (US8734809之SEQ ID NO: 83及157)、AAV CKd-H4 (US8734809之SEQ ID NO: 84及158)、AAV CKd-H5 (US8734809之SEQ ID NO: 85及159)、AAV CKd-H6 (US8734809之SEQ ID NO: 77及151)、AAV CHt-1 (US8734809之SEQ ID NO: 86及160)、AAV CLv1-1 (US8734809之SEQ ID NO: 171)、AAV CLv1-2 (US8734809之SEQ ID NO: 172)、AAV CLv1-3 (US8734809之SEQ ID NO: 173)、AAV CLv1-4 (US8734809之SEQ ID NO: 174)、AAV Clv1-7 (US8734809之SEQ ID NO: 175)、AAV Clv1-8 (US8734809之SEQ ID NO: 176)、AAV Clv1-9 (US8734809之SEQ ID NO: 177)、AAV Clv1-10 (US8734809之SEQ ID NO: 178)、AAV.VR-355 (US8734809之SEQ ID NO: 181)、AAV.hu.48R3 (US8734809之SEQ ID NO: 183)，或其變異體或衍生物。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如國際公開案第WO2016065001號中所述的序列，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV CHt-P2 (WO2016065001之SEQ ID NO: 1及51)、AAV CHt-P5 (WO2016065001之SEQ ID NO: 2及52)、AAV CHt-P9 (WO2016065001之SEQ ID NO: 3及53)、AAV CBr-7.1 (WO2016065001之SEQ ID NO: 4及54)、AAV CBr-7.2 (WO2016065001之SEQ ID NO: 5及55)、AAV CBr-7.3 (WO2016065001之SEQ ID NO: 6及56)、AAV CBr-7.4 (WO2016065001之SEQ ID NO: 7及57)、AAV CBr-7.5 (WO2016065001之SEQ ID NO: 8及58)、AAV CBr-7.7 (WO2016065001之SEQ ID NO: 9及59)、AAV CBr-7.8 (WO2016065001之SEQ ID NO: 10及60)、AAV CBr-7.10 (WO2016065001之SEQ ID NO: 11及61)、AAV CKd-N3 (WO2016065001之SEQ ID NO: 12及62)、AAV CKd-N4 (WO2016065001之SEQ ID NO: 13及63)、AAV CKd-N9 (WO2016065001之SEQ ID NO: 14及64)、AAV CLv-L4 (WO2016065001之SEQ ID NO: 15及65)、AAV CLv-L5 (WO2016065001之SEQ ID NO: 16及66)、AAV CLv-L6 (WO2016065001之SEQ ID NO: 17及67)、AAV CLv-K1 (WO2016065001之SEQ ID NO: 18及68)、AAV CLv-K3 (WO2016065001之SEQ ID NO: 19及69)、AAV CLv-K6 (WO2016065001之SEQ ID NO: 20及70)、AAV CLv-M1 (WO2016065001之SEQ ID NO: 21及71)、AAV CLv-M11 (WO2016065001之SEQ ID NO: 22及72)、AAV CLv-M2 (WO2016065001之SEQ ID NO: 23及73)、AAV CLv-M5 (WO2016065001之SEQ ID NO: 24及74)、AAV CLv-M6 (WO2016065001之SEQ ID NO: 25及75)、AAV CLv-M7 (WO2016065001之SEQ ID NO: 26及76)、AAV CLv-M8 (WO2016065001之SEQ ID NO: 27及77)、AAV CLv-M9 (WO2016065001之SEQ ID NO: 28及78)、AAV CHt-P1 (WO2016065001之SEQ ID NO: 29及79)、AAV CHt-P6 (WO2016065001之SEQ ID NO: 30及80)、AAV CHt-P8 (WO2016065001之SEQ ID NO: 31及81)、AAV CHt-6.1 (of WO2016065001之SEQ ID NO: 32及82 )、AAV CHt-6.10 (WO2016065001之SEQ ID NO: 33及83)、AAV CHt-6.5 (WO2016065001之SEQ ID NO: 34及84)、AAV CHt-6.6 (WO2016065001之SEQ ID NO: 35及85)、AAV CHt-6.7 (WO2016065001之SEQ ID NO: 36及86)、AAV CHt-6.8 (WO2016065001之SEQ ID NO: 37及87)、AAV CSp-8.10 (WO2016065001之SEQ ID NO: 38及88)、AAV CSp-8.2 (WO2016065001之SEQ ID NO: 39及89)、AAV CSp-8.4 (WO2016065001之SEQ ID NO: 40及90)、AAV CSp-8.5 (WO2016065001之SEQ ID NO: 41及91)、AAV CSp-8.6 (WO2016065001之SEQ ID NO: 42及92)、AAV CSp-8.7 (WO2016065001之SEQ ID NO: 43及93)、AAV CSp-8.8 (WO2016065001之SEQ ID NO: 44及94)、AAV CSp-8.9 (WO2016065001之SEQ ID NO: 45及95)、AAV CBr-B7.3 (WO2016065001之SEQ ID NO: 46及96)、AAV CBr-B7.4 (WO2016065001之SEQ ID NO: 47及97)、AAV3B (WO2016065001之SEQ ID NO: 48及98)、AAV4 (WO2016065001之SEQ ID NO: 49及99)、AAV5 (WO2016065001SEQ ID NO: 50及100)，或其變異體或衍生物。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如美國公開案第US 20160361439號中所述的修飾，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於)野生型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12及其雜合體之Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F及Y720F。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如美國專利第US 9546112號中所述的突變，該專利的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV6 (US 9546112之SEQ ID NO: 4)、AAV1 (US 9546112之SEQ ID NO: 6)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV9、AAV10或AAV11或其衍生物之序列中之F129L、D418E、K531E、L584F、V598A及H642N突變中的至少兩者，但非全部。在又另一個實施例中，AAV血清型可為或具有包含K531E突變之AAV6序列(US 9546112之SEQ ID NO: 5)。
在一些實施例中，AAV血清型可為或在AAV1序列中具有突變，如美國公開案第US 20130224836號中所述，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於)表面所暴露之至少一個酪胺酸殘基(較佳位於AAV1 (US 20130224836之SEQ ID NO: 2)之位置252、273、445、701、705及731)經另一個胺基酸(較佳經苯丙胺酸)殘基取代。在一個實施例中，AAV血清型可為或在AAV9序列中具有突變，諸如(但不限於)表面所暴露之至少一個酪胺酸殘基(較佳位於AAV2之位置252、272、444、500、700、704及730 (US 20130224836之SEQ ID NO: 4))經另一個胺基酸(較佳經苯丙胺酸)殘基取代。在一個實施例中，AAV9 (SEQ ID NO: 6 US 20130224836)之位置446的酪胺酸殘基經苯丙胺酸殘基取代。
在一些實施例中，血清型可為AAV2或其變異體，如國際公開案第WO2016130589號中所述，該案以全文引用之方式併入本文中。AAV2之胺基酸序列可以包含N587A、E548A或N708A突變。在一個實施例中，任何AAV之胺基酸序列可以包含V708K突變。
在一個實施例中，AAV可為選自表1中所發現之任何血清型的血清型。
在一個實施例中，AAV可以包含表1中之序列、該序列的片段或其變異體。
在一個實施例中，AAV可由如表1中所述的序列、片段或變異體編碼。 表1. AAV血清型
表1中所列之專利、申請案及/或公開案各自以全文引用的方式併入本文中。
在一個實施例中，AAV血清型可為或可具有如國際專利公開案WO2015038958中所述的序列，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV9 (WO2015038958之SEQ ID NO: 2及11或在本文中分別為SEQ ID NO: 127及126)、PHP.B (WO2015038958之SEQ ID NO: 8及9，本文中為SEQ ID NO: 868及869)、G2B-13 (WO2015038958之SEQ ID NO: 12，本文中為SEQ ID NO: 870)、G2B-26 (WO2015038958之SEQ ID NO: 13，本文中為SEQ ID NO: 868及869)、TH1.1-32 (WO2015038958之SEQ ID NO: 14，本文中為SEQ ID NO: 871)、TH1.1-35 (WO2015038958之SEQ ID NO: 15，本文中為SEQ ID NO: 872)或其變異體。另外，可以將WO2015038958中所述的任一種靶肽或胺基酸插入序列插入任何親本AAV血清型中，諸如(但不限於) AAV9 (SEQ ID NO: 126作為DNA序列及SEQ ID NO: 127作為胺基酸序列)。在一個實施例中，胺基酸插入序列係插入親本AAV (例如AAV9)之胺基酸586-592之間。在另一個實施例中，胺基酸插入序列係插入親本AAV序列之胺基酸588-589之間。胺基酸插入序列可為(但不限於)以下胺基酸序列中之任一者：TLAVPFK (WO2015038958之SEQ ID NO: 1；本文中為SEQ ID NO: 873)、KFPVALT (WO2015038958之SEQ ID NO: 3；本文中為SEQ ID NO: 874)、LAVPFK (WO2015038958之SEQ ID NO: 31；本文中為SEQ ID NO: 875)、AVPFK (WO2015038958之SEQ ID NO: 32；本文中為SEQ ID NO: 876)、VPFK (WO2015038958之SEQ ID NO: 33；本文中為SEQ ID NO: 877)、TLAVPF (WO2015038958之SEQ ID NO: 34；本文中為SEQ ID NO: 878)、TLAVP (WO2015038958之SEQ ID NO: 35；本文中為SEQ ID NO: 879)、TLAV (WO2015038958之SEQ ID NO: 36；本文中為SEQ ID NO: 880)；SVSKPFL (WO2015038958之SEQ ID NO: 28；本文中為SEQ ID NO: 881)、FTLTTPK (WO2015038958之SEQ ID NO: 29；本文中為SEQ ID NO: 882)、MNATKNV (WO2015038958之SEQ ID NO: 30；本文中為SEQ ID NO: 883)、QSSQTPR (WO2015038958之SEQ ID NO: 54；本文中為SEQ ID NO: 884)、ILGTGTS (WO2015038958之SEQ ID NO: 55；本文中為SEQ ID NO: 885)、TRTNPEA (WO2015038958之SEQ ID NO: 56；本文中為SEQ ID NO: 886)、NGGTSSS (WO2015038958之SEQ ID NO: 58；本文中為SEQ ID NO: 887)或YTLSQGW (WO2015038958之SEQ ID NO: 60；本文中為SEQ ID NO: 888)。可以編碼胺基酸插入序列之核苷酸序列的非限制性實例包括以下：AAGTTTCCTGTGGCGTTGACT (WO2015038958之SEQ ID NO: 3；本文中為SEQ ID NO: 889)、ACTTTGGCGGTGCCTTTTAAG (WO2015038958之SEQ ID NO: 24及49；本文中為SEQ ID NO: 890)、AGTGTGAGTAAGCCTTTTTTG (WO2015038958之SEQ ID NO: 25；本文中為SEQ ID NO: 891)、TTTACGTTGACGACGCCTAAG (WO2015038958之SEQ ID NO: 26；本文中為SEQ ID NO: 892)、ATGAATGCTACGAAGAATGTG (WO2015038958之SEQ ID NO: 27；本文中為SEQ ID NO: 893)、CAGTCGTCGCAGACGCCTAGG (WO2015038958之SEQ ID NO: 48；本文中為SEQ ID NO: 894)、ATTCTGGGGACTGGTACTTCG (WO2015038958之SEQ ID NO: 50及52；本文中為SEQ ID NO: 895)、ACGCGGACTAATCCTGAGGCT (WO2015038958之SEQ ID NO: 51；本文中為SEQ ID NO: 896)、AATGGGGGGACTAGTAGTTCT (WO2015038958之SEQ ID NO: 53；本文中為SEQ ID NO: 897)，或TATACTTTGTCGCAGGGTTGG (WO2015038958之SEQ ID NO: 59；本文中為SEQ ID NO: 898)。
在一個實施例中，AAV血清型可以經工程改造以包含AAV2之至少一種AAV衣殼CD8+ T細胞抗原決定基，諸如(但不限於) SADNNNSEY (SEQ ID NO: 899)、LIDQYLYYL (SEQ ID NO: 900)、VPQYGYLTL (SEQ ID NO: 901)、TTSTRTWAL (SEQ ID NO: 902)、YHLNGRDSL (SEQ ID NO: 903)、SQAVGRSSF (SEQ ID NO: 904)、VPANPSTTF (SEQ ID NO: 905)、FPQSGVLIF (SEQ ID NO: 906)、YFDFNRFHCHFSPRD (SEQ ID NO: 907)、VGNSSGNWHCDSTWM (SEQ ID NO: 908)、QFSQAGASDIRDQSR (SEQ ID NO: 909)、GASDIRQSRNWLP (SEQ ID NO: 910)及GNRQAATADVNTQGV (SEQ ID NO: 911)。
在一個實施例中，AAV血清型可以經工程改造以包含AAV1之至少一種AAV衣殼CD8+ T細胞抗原決定基，諸如(但不限於) LDRLMNPLI (SEQ ID NO: 912)、TTSTRTWAL (SEQ ID NO: 902)及QPAKKRLNF (SEQ ID NO: 913))。
在一個實施例中，AAV血清型可為或可具有如國際專利公開案WO2017100671中所述的序列，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV9 (WO2017100671之SEQ ID NO: 45，本文中為SEQ ID NO: 1861)、PHP.N (WO2017100671之SEQ ID NO: 46，本文中為SEQ ID NO: 1859)、PHP.S (WO2017100671之SEQ ID NO: 47，本文中為SEQ ID NO: 1860)，或其變異體。另外，WO2017100671中所述的任何靶肽或胺基酸插入序列可以插入任何親本AAV血清型中，諸如(但不限於) AAV9 (SEQ ID NO: 127或SEQ ID NO: 1861)。在一個實施例中，胺基酸插入序列係插入親本AAV (例如AAV9)之胺基酸586-592之間。在另一個實施例中，胺基酸插入序列係插入親本AAV序列之胺基酸588-589之間。胺基酸插入序列可為(但不限於)以下胺基酸序列中之任一者：AQTLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 1；本文中為SEQ ID NO: 2245)、AQSVSKPFLAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 2；本文中為SEQ ID NO: 2246)、AQFTLTTPKAQ (WO2017100671之序列表中的SEQ ID NO: 3；本文中為SEQ ID NO: 2247)、DGTLAVPFKAQ (WO2017100671之序列表中的SEQ ID NO: 4；本文中為SEQ ID NO: 2248)、ESTLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 5；本文中為SEQ ID NO: 2249)、GGTLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 6；本文中為SEQ ID NO: 2250)、AQTLATPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 7及33；本文中為SEQ ID NO: 2251)、ATTLATPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 8；本文中為SEQ ID NO: 2252)、DGTLATPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 9；本文中為SEQ ID NO: 2253)、GGTLATPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 10；本文中為SEQ ID NO: 2254)、SGSLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 11；本文中為SEQ ID NO: 2255)、AQTLAQPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 12；本文中為SEQ ID NO: 2256)、AQTLQQPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 13；本文中為SEQ ID NO: 2257)、AQTLSNPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 14；本文中為SEQ ID NO: 2258)、AQTLAVPFSNP (WO2017100671之SEQ ID NO: 15；本文中為SEQ ID NO: 2259)、QGTLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 16；本文中為SEQ ID NO: 2260)、NQTLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 17；本文中為SEQ ID NO: 2261)、EGSLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 18；本文中為SEQ ID NO: 2262)、SGNLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 19；本文中為SEQ ID NO: 2263)、EGTLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 20；本文中為SEQ ID NO: 2264)、DSTLAVPFKAQ (WO2017100671之表1中的SEQ ID NO: 21；本文中為SEQ ID NO: 2265)、AVTLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 22；本文中為SEQ ID NO: 2266)、AQTLSTPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 23；本文中為SEQ ID NO: 2267)、AQTLPQPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 24及32；本文中為SEQ ID NO: 2268)、AQTLSQPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 25；本文中為SEQ ID NO: 2269)、AQTLQLPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 26；本文中為SEQ ID NO: 2270)、AQTLTMPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 27及34以及WO2017100671之序列表中的SEQ ID NO: 35；本文中為SEQ ID NO: 2271)、AQTLTTPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 28；本文中為SEQ ID NO: 2272)、AQYTLSQGWAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 29；本文中為SEQ ID NO: 2273)、AQMNATKNVAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 30；本文中為SEQ ID NO: 2274)、AQVSGGHHSAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 31；本文中為SEQ ID NO: 2275)、AQTLTAPFKAQ (WO2017100671之表1中的SEQ ID NO: 35；本文中為SEQ ID NO: 2276)、AQTLSKPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 36；本文中為SEQ ID NO: 2277)、QAVRTSL (WO2017100671之SEQ ID NO: 37；本文中為SEQ ID NO: 2278)、YTLSQGW (WO2017100671之SEQ ID NO: 38；本文中為SEQ ID NO: 888)、LAKERLS (WO2017100671之SEQ ID NO: 39；本文中為SEQ ID NO: 2279)、TLAVPFK (WO2017100671之序列表中的SEQ ID NO: 40；本文中為SEQ ID NO: 873)、SVSKPFL (WO2017100671之SEQ ID NO: 41；本文中為SEQ ID NO: 881)、FTLTTPK (WO2017100671之SEQ ID NO: 42；本文中為SEQ ID NO: 882)、MNSTKNV (WO2017100671之SEQ ID NO: 43；本文中為SEQ ID NO: 2280)、VSGGHHS (WO2017100671之SEQ ID NO: 44；本文中為SEQ ID NO: 2281)、SAQTLAVPFKAQAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 48；本文中為SEQ ID NO: 2282)、SXXXLAVPFKAQAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 49，其中X可為任何胺基酸；本文中為SEQ ID NO: 2283)、SAQXXXVPFKAQAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 50，其中X可為任何胺基酸；本文中為SEQ ID NO: 2284)、SAQTLXXXFKAQAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 51，其中X可為任何胺基酸；本文中為SEQ ID NO: 2285)、SAQTLAVXXXAQAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 52，其中X可為任何胺基酸；本文中為SEQ ID NO: 2286)、SAQTLAVPFXXXAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 53，其中X可為任何胺基酸；本文中為SEQ ID NO: 2287)、TNHQSAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 65；本文中為SEQ ID NO: 2288)、AQAQTGW (WO2017100671之SEQ ID NO: 66；本文中為SEQ ID NO: 2289)、DGTLATPFK (WO2017100671之SEQ ID NO: 67；本文中為SEQ ID NO: 2290)、DGTLATPFKXX (WO2017100671之SEQ ID NO: 68，其中X可為任何胺基酸；本文中為SEQ ID NO: 2291)、LAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 80；本文中為SEQ ID NO: 2292)、VPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 81；本文中為SEQ ID NO: 2293)、FKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 82；本文中為SEQ ID NO: 2294)、AQTLAV (WO2017100671之SEQ ID NO: 83；本文中為SEQ ID NO: 2295)、AQTLAVPF (WO2017100671之SEQ ID NO: 84；本文中為SEQ ID NO: 2296)、QAVR (WO2017100671之SEQ ID NO: 85；本文中為SEQ ID NO: 2297)、AVRT (WO2017100671之SEQ ID NO: 86；本文中為SEQ ID NO: 2298)、VRTS (WO2017100671之SEQ ID NO: 87；本文中為SEQ ID NO: 2299)、RTSL (WO2017100671之SEQ ID NO: 88；本文中為SEQ ID NO: 2300)、QAVRT (WO2017100671之SEQ ID NO: 89；本文中為SEQ ID NO: 2301)、AVRTS (WO2017100671之SEQ ID NO: 90；本文中為SEQ ID NO: 2302)、VRTSL (WO2017100671之SEQ ID NO: 91；本文中為SEQ ID NO: 2303)、QAVRTS (WO2017100671之SEQ ID NO: 92；本文中為SEQ ID NO: 2304)，或AVRTSL (WO2017100671之SEQ ID NO: 93；本文中為SEQ ID NO: 2305)。
可以編碼胺基酸插入序列之核苷酸序列的非限制性實例包括以下：GATGGGACTTTGGCGGTGCCTTTTAAGGCACAG (WO2017100671之SEQ ID NO: 54；本文中為SEQ ID NO: 2306)、GATGGGACGTTGGCGGTGCCTTTTAAGGCACAG (WO2017100671之SEQ ID NO: 55；本文中為SEQ ID NO: 2307)、CAGGCGGTTAGGACGTCTTTG (WO2017100671之SEQ ID NO: 56；本文中為SEQ ID NO: 2308)、CAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAG (WO2017100671之SEQ ID NO: 57及78；本文中為SEQ ID NO: 2309)、CAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCG (WO2017100671之SEQ ID NO: 58；本文中為SEQ ID NO: 2310)、ACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCTAGAAC (WO2017100671之SEQ ID NO: 59；本文中為SEQ ID NO: 2311)、GGAAGTATTCCTTGGTTTTGAACCCA (WO2017100671之SEQ ID NO: 60；本文中為SEQ ID NO: 2312)、GGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGAT (WO2017100671之SEQ ID NO: 61；本文中為SEQ ID NO: 2313)、CGACCTTGAAGCGCATGAACTCCT (WO2017100671之SEQ ID NO: 62；本文中為SEQ ID NO: 2314)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNTTGGGCACTCTGGTGGTTTGTC (WO2017100671之SEQ ID NO: 63，其中N可為A、C、T或G；本文中為SEQ ID NO: 2315)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCMNNMNNMNNAAAAGGCACCGCCAAAGTTTG (WO2017100671之SEQ ID NO: 69，其中N可為A、C、T或G；本文中為SEQ ID NO: 2316)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCMNNMNNMNNCACCGCCAAAGTTTGGGCACT (WO2017100671之SEQ ID NO: 70，其中N可為A、C、T或G；本文中為SEQ ID NO: 2317)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCCTTAAAMNNMNNMNNCAAAGTTTGGGCACTCTGGTGG (SEQ ID NO: 71WO2017100671，其中N可為A、C、T或G；本文中為SEQ ID NO: 2318)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCCTTAAAAGGCACMNNMNNMNNTTGGGCACTCTGGTGGTTTGTG (WO2017100671之SEQ ID NO: 72，其中N可為A、C、T或G；本文中為SEQ ID NO: 2319)、ACTTTGGCGGTGCCTTTTAAG (WO2017100671之SEQ ID NO: 74；本文中為SEQ ID NO: 890)、AGTGTGAGTAAGCCTTTTTTG (WO2017100671之SEQ ID NO: 75；本文中為SEQ ID NO: 891)、TTTACGTTGACGACGCCTAAG (WO2017100671之SEQ ID NO: 76；本文中為SEQ ID NO: 892)、TATACTTTGTCGCAGGGTTGG (WO2017100671之SEQ ID NO: 77；本文中為SEQ ID NO: 898)或CTTGCGAAGGAGCGGCTTTCG (WO2017100671之SEQ ID NO: 79；本文中為SEQ ID NO: 2320)。
在一個實施例中，AAV血清型可為或可具有如美國專利第US 9624274號中所述的序列，該專利的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV1 (US9624274之SEQ ID NO: 181)、AAV6 (US9624274之SEQ ID NO: 182)、AAV2 (US9624274之SEQ ID NO: 183)、AAV3b (US9624274之SEQ ID NO: 184)、AAV7 (US9624274之SEQ ID NO: 185)、AAV8 (US9624274之SEQ ID NO: 186)、AAV10 (US9624274之SEQ ID NO: 187)、AAV4 (US9624274之SEQ ID NO: 188)、AAV11 (US9624274之SEQ ID NO: 189)、bAAV (US9624274之SEQ ID NO: 190)、AAV5 (US9624274之SEQ ID NO: 191)、GPV (US9624274之SEQ ID NO: 192；本文中為SEQ ID NO: 1862)、B19 (US9624274之SEQ ID NO: 193；本文中為SEQ ID NO: 1863)、MVM (US9624274之SEQ ID NO: 194；本文中為SEQ ID NO: 1864)、FPV (US9624274之SEQ ID NO: 195；本文中為SEQ ID NO: 1865)、CPV (US9624274之SEQ ID NO: 196；本文中為SEQ ID NO: 1866)，或其變異體。另外，US 9624274中所述的任一種結構蛋白插入序列可以插入(但不限於)：任何親本AAV血清型之I-453及I-587，諸如(但不限於) AAV2 (US9624274之SEQ ID NO: 183)。胺基酸插入序列可為(但不限於)以下胺基酸序列中之任一者：VNLTWSRASG (US9624274之SEQ ID NO: 50；本文中SEQ ID NO: 2321)、EFCINHRGYWVCGD (US9624274之SEQ ID NO:55；本文中SEQ ID NO: 2322)、EDGQVMDVDLS (US9624274之SEQ ID NO: 85；本文中SEQ ID NO: 2323)、EKQRNGTLT (US9624274之SEQ ID NO: 86；本文中SEQ ID NO: 2324)、TYQCRVTHPHLPRALMR (US9624274之SEQ ID NO: 87；本文中SEQ ID NO: 2325)、RHSTTQPRKTKGSG (US9624274之SEQ ID NO: 88；本文中SEQ ID NO: 2326)、DSNPRGVSAYLSR (US9624274之SEQ ID NO: 89；本文中SEQ ID NO: 2327)、TITCLWDLAPSK (US9624274之SEQ ID NO: 90；本文中SEQ ID NO: 2328)、KTKGSGFFVF (US9624274之SEQ ID NO: 91；本文中SEQ ID NO: 2329)、THPHLPRALMRS (US9624274之SEQ ID NO: 92；本文中SEQ ID NO: 2330)、GETYQCRVTHPHLPRALMRSTTK (US9624274之SEQ ID NO: 93；本文中SEQ ID NO: 2331)、LPRALMRS (US9624274之SEQ ID NO: 94；本文中SEQ ID NO: 2332)、INHRGYWV (US9624274之SEQ ID NO: 95；本文中SEQ ID NO: 2333)、CDAGSVRTNAPD (US9624274之SEQ ID NO: 60；本文中SEQ ID NO: 2334)、AKAVSNLTESRSESLQS (US9624274之SEQ ID NO: 96；本文中SEQ ID NO: 2335)、SLTGDEFKKVLET (US9624274之SEQ ID NO: 97；本文中SEQ ID NO: 2336)、REAVAYRFEED (US9624274之SEQ ID NO: 98；本文中SEQ ID NO: 2337)、INPEIITLDG (US9624274之SEQ ID NO: 99；本文中SEQ ID NO: 2338)、DISVTGAPVITATYL (US9624274之SEQ ID NO: 100；本文中SEQ ID NO: 2339)、DISVTGAPVITA (US9624274之SEQ ID NO: 101；本文中SEQ ID NO: 2340)、PKTVSNLTESSSESVQS (US9624274之SEQ ID NO: 102；本文中SEQ ID NO: 2341)、SLMGDEFKAVLET (US9624274之SEQ ID NO: 103；本文中SEQ ID NO: 2342)、QHSVAYTFEED (US9624274之SEQ ID NO: 104；本文中SEQ ID NO: 2343)、INPEIITRDG (US9624274之SEQ ID NO: 105；本文中SEQ ID NO: 2344)、DISLTGDPVITASYL (US9624274之SEQ ID NO: 106；本文中SEQ ID NO: 2345)、DISLTGDPVITA (US9624274之SEQ ID NO: 107；本文中SEQ ID NO: 2346)、DQSIDFEIDSA (US9624274之SEQ ID NO: 108；本文中SEQ ID NO: 2347)、KNVSEDLPLPTFSPTLLGDS (US9624274之SEQ ID NO: 109；本文中SEQ ID NO: 2348)、KNVSEDLPLPT (US9624274之SEQ ID NO: 110；本文中SEQ ID NO: 2349)、CDSGRVRTDAPD (US9624274之SEQ ID NO: 111；本文中SEQ ID NO: 2350)、FPEHLLVDFLQSLS (US9624274之SEQ ID NO: 112；本文中SEQ ID NO: 2351)、DAEFRHDSG (US9624274之SEQ ID NO: 65；本文中SEQ ID NO: 2352)、HYAAAQWDFGNTMCQL (US9624274之SEQ ID NO: 113；本文中SEQ ID NO: 2353)、YAAQWDFGNTMCQ (US9624274之SEQ ID NO: 114；本文中SEQ ID NO: 2354)、RSQKEGLHYT (US9624274之SEQ ID NO: 115；本文中SEQ ID NO: 2355)、SSRTPSDKPVAHWANPQAE (US9624274之SEQ ID NO: 116；本文中SEQ ID NO: 2356)、SRTPSDKPVAHWANP (US9624274之SEQ ID NO: 117；本文中SEQ ID NO: 2357)、SSRTPSDKP (US9624274之SEQ ID NO: 118；本文中SEQ ID NO: 2358)、NADGNVDYHMNSVP (US9624274之SEQ ID NO: 119；本文中SEQ ID NO: 2359)、DGNVDYHMNSV (US9624274之SEQ ID NO: 120；本文中SEQ ID NO: 2360)、RSFKEFLQSSLRALRQ (US9624274之SEQ ID NO: 121；本文中SEQ ID NO: 2361); FKEFLQSSLRA (US9624274之SEQ ID NO: 122；本文中SEQ ID NO: 2362)或QMWAPQWGPD (US9624274之SEQ ID NO: 123；本文中SEQ ID NO: 2363)。
在一個實施例中，AAV血清型可為或可具有如美國專利第US 9475845號中所述的序列，該專利的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於)在原生AAV2衣殼蛋白之胺基酸位置585至590處包含一或多個胺基酸修飾的AAV衣殼蛋白。此外，修飾可以產生(但不限於)胺基酸序列RGNRQA (US9475845之SEQ ID NO: 3；本文中為SEQ ID NO: 2364)、SSSTDP (US9475845之SEQ ID NO: 4；本文中為SEQ ID NO: 2365)、SSNTAP (US9475845之SEQ ID NO: 5；本文中為SEQ ID NO: 2366)、SNSNLP (US9475845之SEQ ID NO: 6；本文中為SEQ ID NO: 2367)、SSTTAP (US9475845之SEQ ID NO: 7；本文中為SEQ ID NO: 2368)、AANTAA (US9475845之SEQ ID NO: 8；本文中為SEQ ID NO: 2369)、QQNTAP (US9475845之SEQ ID NO: 9；本文中為SEQ ID NO: 2370)、SAQAQA (US9475845之SEQ ID NO: 10；本文中為SEQ ID NO: 2371)、QANTGP (US9475845之SEQ ID NO: 11；本文中為SEQ ID NO: 2372)、NATTAP (US9475845之SEQ ID NO: 12；本文中為SEQ ID NO: 2373)、SSTAGP (US9475845之SEQ ID NO: 13及20；本文中為SEQ ID NO: 2374)、QQNTAA (US9475845之SEQ ID NO: 14；本文中為SEQ ID NO: 2375)、PSTAGP (US9475845之SEQ ID NO: 15；本文中為SEQ ID NO: 2376)、NQNTAP (US9475845之SEQ ID NO: 16；本文中為SEQ ID NO: 2377)、QAANAP (US9475845之SEQ ID NO: 17；本文中為SEQ ID NO: 2378)、SIVGLP (US9475845之SEQ ID NO: 18；本文中為SEQ ID NO: 2379)、AASTAA (US9475845之SEQ ID NO: 19及27；本文中為SEQ ID NO: 2380)、SQNTTA (US9475845之SEQ ID NO: 21；本文中為SEQ ID NO: 2381)、QQDTAP (US9475845之SEQ ID NO: 22；本文中為SEQ ID NO: 2382)、QTNTGP (US9475845之SEQ ID NO: 23；本文中為SEQ ID NO:2383)、QTNGAP (US9475845之SEQ ID NO: 24；本文中為SEQ ID NO: 2384)、QQNAAP (US9475845之SEQ ID NO: 25；本文中為SEQ ID NO: 2385)，或AANTQA (US9475845之SEQ ID NO: 26；本文中為SEQ ID NO: 2386)。在一個實施例中，胺基酸修飾為原生AAV2衣殼蛋白中之胺基酸位置262至265處的取代或具有靶向序列之另一種AAV之衣殼蛋白中之相應位置處的取代。靶向序列可為(但不限於)以下胺基酸序列中之任一者：NGRAHA (US9475845之SEQ ID NO: 38；本文中為SEQ ID NO: 2387)、QPEHSST (US9475845之SEQ ID NO: 39及50；本文中為SEQ ID NO: 2388)、VNTANST (US9475845之SEQ ID NO: 40；本文中為SEQ ID NO: 2389)、HGPMQKS (US9475845之SEQ ID NO: 41；本文中為SEQ ID NO: 2390)、PHKPPLA (US9475845之SEQ ID NO: 42；本文中為SEQ ID NO: 2391)、IKNNEMW (US9475845之SEQ ID NO: 43；本文中為SEQ ID NO: 2392)、RNLDTPM (US9475845之SEQ ID NO: 44；本文中為SEQ ID NO: 2393)、VDSHRQS (US9475845之SEQ ID NO: 45；本文中為SEQ ID NO: 2394)、YDSKTKT (US9475845之SEQ ID NO: 46；本文中為SEQ ID NO: 2395)、SQLPHQK (US9475845之SEQ ID NO: 47；本文中為SEQ ID NO: 2396)、STMQQNT (US9475845之SEQ ID NO: 48；本文中為SEQ ID NO: 2397)、TERYMTQ (US9475845之SEQ ID NO: 49；本文中為SEQ ID NO: 2398)、DASLSTS (US9475845之SEQ ID NO: 51；本文中為SEQ ID NO: 2399)、DLPNKKT (US9475845之SEQ ID NO: 52；本文中為SEQ ID NO: 2400)、DLTAARL (US9475845之SEQ ID NO: 53；本文中為SEQ ID NO: 2401)、EPHQFNY (US9475845之SEQ ID NO: 54；本文中為SEQ ID NO: 2402)、EPQSNHT (US9475845之SEQ ID NO: 55；本文中為SEQ ID NO: 2403)、MSSWPSQ (US9475845之SEQ ID NO: 56；本文中為SEQ ID NO: 2404)、NPKHNAT (US9475845之SEQ ID NO: 57；本文中為SEQ ID NO: 2405)、PDGMRTT (US9475845之SEQ ID NO: 58；本文中為SEQ ID NO: 2406)、PNNNKTT (US9475845之SEQ ID NO: 59；本文中為SEQ ID NO: 2407)、QSTTHDS (US9475845之SEQ ID NO: 60；本文中為SEQ ID NO: 2408)、TGSKQKQ (US9475845之SEQ ID NO: 61；本文中為SEQ ID NO: 2409)、SLKHQAL (US9475845之SEQ ID NO: 62；本文中為SEQ ID NO: 2410)、SPIDGEQ (US9475845之SEQ ID NO: 63；本文中為SEQ ID NO: 2411)、WIFPWIQL (US9475845之SEQ ID NO: 64及112；本文中為SEQ ID NO: 2412)、CDCRGDCFC (US9475845之SEQ ID NO: 65；本文中為SEQ ID NO: 2413)、CNGRC (US9475845之SEQ ID NO: 66；本文中為SEQ ID NO: 2414)、CPRECES (US9475845之SEQ ID NO: 67；本文中為SEQ ID NO: 2415)、CTTHWGFTLC (US9475845之SEQ ID NO: 68及123；本文中為SEQ ID NO: 2416)、CGRRAGGSC (US9475845之SEQ ID NO: 69；本文中為SEQ ID NO: 2417)、CKGGRAKDC (US9475845之SEQ ID NO: 70；本文中為SEQ ID NO: 2418)、CVPELGHEC (US9475845之SEQ ID NO: 71及115；本文中為SEQ ID NO: 2419)、CRRETAWAK (US9475845之SEQ ID NO: 72；本文中為SEQ ID NO: 2420)、VSWFSHRYSPFAVS (US9475845之SEQ ID NO: 73；本文中為SEQ ID NO: 2421)、GYRDGYAGPILYN (US9475845之SEQ ID NO: 74；本文中為SEQ ID NO: 2422)、XXXYXXX (US9475845之SEQ ID NO: 75；本文中為SEQ ID NO: 2423)、YXNW (US9475845之SEQ ID NO: 76；本文中為SEQ ID NO: 2424)、RPLPPLP (US9475845之SEQ ID NO: 77；本文中為SEQ ID NO: 2425)、APPLPPR (US9475845之SEQ ID NO: 78；本文中為SEQ ID NO: 2426)、DVFYPYPYASGS (US9475845之SEQ ID NO: 79；本文中為SEQ ID NO: 2427)、MYWYPY (US9475845之SEQ ID NO: 80；本文中為SEQ ID NO: 2428)、DITWDQLWDLMK (US9475845之SEQ ID NO: 81；本文中為SEQ ID NO: 2429)、CWDDXWLC (US9475845之SEQ ID NO: 82；本文中為SEQ ID NO: 2430)、EWCEYLGGYLRCYA (US9475845之SEQ ID NO: 83；本文中為SEQ ID NO: 2431)、YXCXXGPXTWXCXP (US9475845之SEQ ID NO: 84；本文中為SEQ ID NO: 2432)、IEGPTLRQWLAARA (US9475845之SEQ ID NO: 85；本文中為SEQ ID NO: 2433)、LWXXX (US9475845之SEQ ID NO: 86；本文中為SEQ ID NO: 2434)、XFXXYLW (US9475845之SEQ ID NO: 87；本文中為SEQ ID NO: 2435)、SSIISHFRWGLCD (US9475845之SEQ ID NO: 88；本文中為SEQ ID NO: 2436)、MSRPACPPNDKYE (US9475845之SEQ ID NO: 89；本文中為SEQ ID NO: 2437)、CLRSGRGC (US9475845之SEQ ID NO: 90；本文中為SEQ ID NO: 2438)、CHWMFSPWC (US9475845之SEQ ID NO: 91；本文中為SEQ ID NO: 2439)、WXXF (US9475845之SEQ ID NO: 92；本文中為SEQ ID NO: 2440)、CSSRLDAC (US9475845之SEQ ID NO: 93；本文中為SEQ ID NO: 2441)、CLPVASC (US9475845之SEQ ID NO: 94；本文中為SEQ ID NO: 2442)、CGFECVRQCPERC (US9475845之SEQ ID NO: 95；本文中為SEQ ID NO: 2443)、CVALCREACGEGC (US9475845之SEQ ID NO: 96；本文中為SEQ ID NO: 2444)、SWCEPGWCR (US9475845之SEQ ID NO: 97；本文中為SEQ ID NO: 2445)、YSGKWGW (US9475845之SEQ ID NO: 98；本文中為SEQ ID NO: 2446)、GLSGGRS (US9475845之SEQ ID NO: 99；本文中為SEQ ID NO: 2447)、LMLPRAD (US9475845之SEQ ID NO: 100；本文中為SEQ ID NO: 2448)、CSCFRDVCC (US9475845之SEQ ID NO: 101；本文中為SEQ ID NO: 2449)、CRDVVSVIC (US9475845之SEQ ID NO: 102；本文中為SEQ ID NO: 2450)、MARSGL (US9475845之SEQ ID NO: 103；本文中為SEQ ID NO: 2451)、MARAKE (US9475845之SEQ ID NO: 104；本文中為SEQ ID NO: 2452)、MSRTMS (US9475845之SEQ ID NO: 105；本文中為SEQ ID NO: 2453)、KCCYSL (US9475845之SEQ ID NO: 106；本文中為SEQ ID NO: 2454)、MYWGDSHWLQYWYE (US9475845之SEQ ID NO: 107；本文中為SEQ ID NO: 2455)、MQLPLAT (US9475845之SEQ ID NO: 108；本文中為SEQ ID NO: 2456)、EWLS (US9475845之SEQ ID NO: 109；本文中為SEQ ID NO: 2457)、SNEW (US9475845之SEQ ID NO: 110；本文中為SEQ ID NO: 2458)、TNYL (US9475845之SEQ ID NO: 111；本文中為SEQ ID NO: 2459)、WDLAWMFRLPVG (US9475845之SEQ ID NO: 113；本文中為SEQ ID NO: 2460)、CTVALPGGYVRVC (US9475845之SEQ ID NO: 114；本文中為SEQ ID NO: 2461)、CVAYCIEHHCWTC (US9475845之SEQ ID NO: 116；本文中為SEQ ID NO: 2462)、CVFAHNYDYLVC (US9475845之SEQ ID NO: 117；本文中為SEQ ID NO: 2463)、CVFTSNYAFC (US9475845之SEQ ID NO: 118；本文中為SEQ ID NO: 2464)、VHSPNKK (US9475845之SEQ ID NO: 119；本文中為SEQ ID NO: 2465)、CRGDGWC (US9475845之SEQ ID NO: 120；本文中為SEQ ID NO: 2466)、XRGCDX (US9475845之SEQ ID NO: 121；本文中為SEQ ID NO: 2467)、PXXX (US9475845之SEQ ID NO: 122；本文中為SEQ ID NO: 2468)、SGKGPRQITAL (US9475845之SEQ ID NO: 124；本文中為SEQ ID NO: 2469)、AAAAAAAAAXXXXX (US9475845之SEQ ID NO: 125；本文中為SEQ ID NO: 2470)、VYMSPF (US9475845之SEQ ID NO: 126；本文中為SEQ ID NO: 2471)、ATWLPPR (US9475845之SEQ ID NO: 127；本文中為SEQ ID NO: 2472)、HTMYYHHYQHHL (US9475845之SEQ ID NO: 128；本文中為SEQ ID NO: 2473)、SEVGCRAGPLQWLCEKYFG (US9475845之SEQ ID NO: 129；本文中為SEQ ID NO: 2474)、CGLLPVGRPDRNVWRWLC (US9475845之SEQ ID NO: 130；本文中為SEQ ID NO: 2475)、CKGQCDRFKGLPWEC (US9475845之SEQ ID NO: 131；本文中為SEQ ID NO: 2476)、SGRSA (US9475845之SEQ ID NO: 132；本文中為SEQ ID NO: 2477)、WGFP (US9475845之SEQ ID NO: 133；本文中為SEQ ID NO: 2478)、AEPMPHSLNFSQYLWYT (US9475845之SEQ ID NO: 134；本文中為SEQ ID NO: 2479)、WAYXSP (US9475845之SEQ ID NO: 135；本文中為SEQ ID NO: 2480)、IELLQAR (US9475845之SEQ ID NO: 136；本文中為SEQ ID NO: 2481)、AYTKCSRQWRTCMTTH (US9475845之SEQ ID NO: 137；本文中為SEQ ID NO: 2482)、PQNSKIPGPTFLDPH (US9475845之SEQ ID NO: 138；本文中為SEQ ID NO: 2483)、SMEPALPDWWWKMFK (US9475845之SEQ ID NO: 139；本文中為SEQ ID NO: 2484)、ANTPCGPYTHDCPVKR (US9475845之SEQ ID NO: 140；本文中為SEQ ID NO: 2485)、TACHQHVRMVRP (US9475845之SEQ ID NO: 141；本文中為SEQ ID NO: 2486)、VPWMEPAYQRFL (US9475845之SEQ ID NO: 142；本文中為SEQ ID NO: 2487)、DPRATPGS (US9475845之SEQ ID NO: 143；本文中為SEQ ID NO: 2488)、FRPNRAQDYNTN (US9475845之SEQ ID NO: 144；本文中為SEQ ID NO: 2489)、CTKNSYLMC (US9475845之SEQ ID NO: 145；本文中為SEQ ID NO: 2490)、CXXTXXXGXGC (US9475845之SEQ ID NO: 146；本文中為SEQ ID NO: 2491)、CPIEDRPMC (US9475845之SEQ ID NO: 147；本文中為SEQ ID NO: 2492)、HEWSYLAPYPWF (US9475845之SEQ ID NO: 148；本文中為SEQ ID NO: 2493)、MCPKHPLGC (US9475845之SEQ ID NO: 149；本文中為SEQ ID NO: 2494)、RMWPSSTVNLSAGRR (US9475845之SEQ ID NO: 150；本文中為SEQ ID NO: 2495)、SAKTAVSQRVWLPSHRGGEP (US9475845之SEQ ID NO: 151；本文中為SEQ ID NO: 2496)、KSREHVNNSACPSKRITAAL (US9475845之SEQ ID NO: 152；本文中為SEQ ID NO: 2497)、EGFR (US9475845之SEQ ID NO: 153；本文中為SEQ ID NO: 2498)、AGLGVR (US9475845之SEQ ID NO: 154；本文中為SEQ ID NO: 2499)、GTRQGHTMRLGVSDG (US9475845之SEQ ID NO: 155；本文中為SEQ ID NO: 2500)、IAGLATPGWSHWLAL (US9475845之SEQ ID NO: 156；本文中為SEQ ID NO: 2501)、SMSIARL (US9475845之SEQ ID NO: 157；本文中為SEQ ID NO: 2502)、HTFEPGV (US9475845之SEQ ID NO: 158；本文中為SEQ ID NO: 2503)、NTSLKRISNKRIRRK (US9475845之SEQ ID NO: 159；本文中為SEQ ID NO: 2504)、LRIKRKRRKRKKTRK (US9475845之SEQ ID NO: 160；本文中為SEQ ID NO: 2505)、GGG、GFS、LWS、EGG、LLV、LSP、LBS、AGG、GRR、GGH及GTV。
在一個實施例中，AAV血清型可為或可具有如美國公開案第US 20160369298號中所述的序列，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) AAV2之定點突變衣殼蛋白(US 20160369298之SEQ ID NO: 97；本文中為SEQ ID NO: 2506)或其變異體，其中特異性位點為至少一種選自VP1或其片段之位點R447、G453、S578、N587、N587+1、S662的位點。
另外，US 20160369298中所述的任一種突變序列可為或可具有(但不限於)以下序列中之任一者：SDSGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 231；本文中為SEQ ID NO: 2507)、SPSGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 2；本文中為SEQ ID NO: 2508)、SHSGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 3；本文中為SEQ ID NO: 2509)、SRSGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 4；本文中為SEQ ID NO: 2510)、SKSGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 5；本文中為SEQ ID NO: 2511)、SNSGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 6；本文中為SEQ ID NO: 2512)、SGSGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 7；本文中為SEQ ID NO: 2513)、SASGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 8、175及221；本文中為SEQ ID NO: 2514)、SESGTSN (US20160369298之SEQ ID NO: 9；本文中為SEQ ID NO: 2515)、STTGGSN (US20160369298之SEQ ID NO: 10；本文中為SEQ ID NO: 2516)、SSAGSTN (US20160369298之SEQ ID NO: 11；本文中為SEQ ID NO: 2517)、NNDSQA (US20160369298之SEQ ID NO: 12；本文中為SEQ ID NO: 2518)、NNRNQA (US20160369298之SEQ ID NO: 13；本文中為SEQ ID NO: 2519)、NNNKQA (US20160369298之SEQ ID NO: 14；本文中為SEQ ID NO: 2520)、NAKRQA (US20160369298之SEQ ID NO: 15；本文中為SEQ ID NO: 2521)、NDEHQA (US20160369298之SEQ ID NO: 16；本文中為SEQ ID NO: 2522)、NTSQKA (US20160369298之SEQ ID NO: 17；本文中為SEQ ID NO: 2523)、YYLSRTNTPSGTDTQSRLVFSQAGA (US20160369298之SEQ ID NO: 18；本文中為SEQ ID NO: 2524)、YYLSRTNTDSGTETQSGLDFSQAGA (US20160369298之SEQ ID NO: 19；本文中為SEQ ID NO: 2525)、YYLSRTNTESGTPTQSALEFSQAGA (US20160369298之SEQ ID NO: 20；本文中為SEQ ID NO: 2526)、YYLSRTNTHSGTHTQSPLHFSQAGA (US20160369298之SEQ ID NO: 21；本文中為SEQ ID NO: 2527)、YYLSRTNTSSGTITISHLIFSQAGA (US20160369298之SEQ ID NO: 22；本文中為SEQ ID NO: 2528)、YYLSRTNTRSGIMTKSSLMFSQAGA (US20160369298之SEQ ID NO: 23；本文中為SEQ ID NO: 2529)、YYLSRTNTKSGRKTLSNLSFSQAGA (US20160369298之SEQ ID NO: 24；本文中為SEQ ID NO: 2530)、YYLSRTNDGSGPVTPSKLRFSQRGA (US20160369298之SEQ ID NO: 25；本文中為SEQ ID NO: 2531)、YYLSRTNAASGHATHSDLKFSQPGA US20160369298之(SEQ ID NO: 26；本文中為SEQ ID NO: 2532)、YYLSRTNGQAGSLTMSELGFSQVGA (US20160369298之SEQ ID NO: 27；本文中為 SEQ ID NO: 2533)、YYLSRTNSTGGNQTTSQLLFSQLSA (US20160369298之SEQ ID NO: 28；本文中為SEQ ID NO: 2534)、YFLSRTNNNTGLNTNSTLNFSQGRA (US20160369298之SEQ ID NO: 29；本文中為SEQ ID NO: 2535)、SKTGADNNNSEYSWTG (US20160369298之SEQ ID NO: 30；本文中為SEQ ID NO: 2536)、SKTDADNNNSEYSWTG (US20160369298之SEQ ID NO: 31；本文中為SEQ ID NO: 2537)、SKTEADNNNSEYSWTG (US20160369298之SEQ ID NO: 32；本文中為SEQ ID NO: 2538)、SKTPADNNNSEYSWTG (US20160369298之SEQ ID NO: 33；本文中為SEQ ID NO: 2539)、SKTHADNNNSEYSWTG (US20160369298之SEQ ID NO: 34；本文中為SEQ ID NO: 2540)、SKTQADNNNSEYSWTG (US20160369298之SEQ ID NO: 35；本文中為SEQ ID NO: 2541)、SKTIADNNNSEYSWTG (US20160369298之SEQ ID NO: 36；本文中為SEQ ID NO: 2542)、SKTMADNNNSEYSWTG (US20160369298之SEQ ID NO: 37；本文中為SEQ ID NO: 2543)、SKTRADNNNSEYSWTG (US20160369298之SEQ ID NO: 38；本文中為SEQ ID NO: 2544)、SKTNADNNNSEYSWTG (US20160369298之SEQ ID NO: 39；本文中為SEQ ID NO: 2545)、SKTVGRNNNSEYSWTG (US20160369298之SEQ ID NO: 40；本文中為SEQ ID NO: 2546)、SKTADRNNNSEYSWTG (US20160369298之SEQ ID NO: 41；本文中為SEQ ID NO: 2547)、SKKLSQNNNSKYSWQG (US20160369298之SEQ ID NO: 42；本文中為SEQ ID NO: 2548)、SKPTTGNNNSDYSWPG (US20160369298之SEQ ID NO: 43；本文中為SEQ ID NO: 2549)、STQKNENNNSNYSWPG (US20160369298之SEQ ID NO: 44；本文中為SEQ ID NO: 2550)、HKDDEGKF (US20160369298之SEQ ID NO: 45；本文中為SEQ ID NO: 2551)、HKDDNRKF (US20160369298之SEQ ID NO: 46；本文中為SEQ ID NO: 2552)、HKDDTNKF (US20160369298之SEQ ID NO: 47；本文中為SEQ ID NO: 2553)、HEDSDKNF (US20160369298之SEQ ID NO: 48；本文中為SEQ ID NO: 2554)、HRDGADSF (US20160369298之SEQ ID NO: 49；本文中為SEQ ID NO: 2555)、HGDNKSRF (US20160369298之SEQ ID NO: 50；本文中為SEQ ID NO: 2556)、KQGSEKTNVDFEEV (US20160369298之SEQ ID NO: 51；本文中為SEQ ID NO: 2557)、KQGSEKTNVDSEEV (US20160369298之SEQ ID NO: 52；本文中為SEQ ID NO: 2558)、KQGSEKTNVDVEEV (US20160369298之SEQ ID NO: 53；本文中為SEQ ID NO: 2559)、KQGSDKTNVDDAGV (US20160369298之SEQ ID NO: 54；本文中為SEQ ID NO: 2560)、KQGSSKTNVDPREV (US20160369298之SEQ ID NO: 55；本文中為SEQ ID NO: 2561)、KQGSRKTNVDHKQV (US20160369298之SEQ ID NO: 56；本文中為SEQ ID NO: 2562)、KQGSKGGNVDTNRV (US20160369298之SEQ ID NO: 57；本文中為SEQ ID NO: 2563)、KQGSGEANVDNGDV (US20160369298之SEQ ID NO: 58；本文中為SEQ ID NO: 2564)、KQDAAADNIDYDHV (US20160369298之SEQ ID NO: 59；本文中為SEQ ID NO: 2565)、KQSGTRSNAAASSV (US20160369298之SEQ ID NO: 60；本文中為SEQ ID NO: 2566)、KENTNTNDTELTNV 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ID NO: 2650)及YFLSRTNGEAGSATLSELRFSQPG (US20160369298之SEQ ID NO: 252；本文中為SEQ ID NO: 2651)。可以編碼胺基酸突變位點之核苷酸序列的非限制性實例包括以下：AGCVVMDCAGGARSCASCAAC (US20160369298之SEQ ID NO: 97；本文中為SEQ ID NO: 2652)、AACRACRRSMRSMAGGCA (US20160369298之SEQ ID NO: 98；本文中為SEQ ID NO: 2653)、CACRRGGACRRCRMSRRSARSTTT (US20160369298之SEQ ID NO: 99；本文中為SEQ ID NO: 2654)、TATTTCTTGAGCAGAACAAACRVCVVSRSCGGAMNCVHSACGMHSTCAVVSCTTVDSTTTTCTCAGSBCRGSGCG (US20160369298之SEQ ID NO: 100；本文中為SEQ ID NO: 2655)、TCAAMAMMAVNSRVCSRSAACAACAACAGTRASTTCTCGTGGMMAGGA (US20160369298之SEQ ID NO: 101；本文中為SEQ ID NO: 2656)、AAGSAARRCRSCRVSRVARVCRATRYCGMSNHCRVMVRSGTC (US20160369298之SEQ ID NO: 102；本文中為SEQ ID NO: 2657)、CAGVVSVVSMRSRVCVNSGCAGCTDHCVVSRNSGTCVMSACA (US20160369298之SEQ ID NO: 103；本文中為SEQ ID NO: 2658)、AACTWCRVSVASMVSVHSDDTGTGSWSTKSACT (US20160369298之SEQ ID NO: 104；本文中為SEQ ID NO: 2659)、TTGTTGAACATCACCACGTGACGCACGTTC (US20160369298之SEQ ID NO: 256；本文中為SEQ ID NO: 2660)、TCCCCGTGGTTCTACTACATAATGTGGCCG (US20160369298之SEQ ID NO: 257；本文中為SEQ ID NO: 2661)、TTCCACACTCCGTTTTGGATAATGTTGAAC (US20160369298之SEQ ID NO: 258；本文中為SEQ ID NO: 2662)、AGGGACATCCCCAGCTCCATGCTGTGGTCG (US20160369298之SEQ ID NO: 259；本文中為SEQ ID NO: 2663)、AGGGACAACCCCTCCGACTCGCCCTAATCC (US20160369298之SEQ ID NO: 260；本文中為SEQ ID NO: 2664)、TCCTAGTAGAAGACACCCTCTCACTGCCCG (US20160369298之SEQ ID NO: 261；本文中為SEQ ID NO: 2665)、AGTACCATGTACACCCACTCTCCCAGTGCC (US20160369298之SEQ ID NO: 262；本文中為SEQ ID NO: 2666)、ATATGGACGTTCATGCTGATCACCATACCG (US20160369298之SEQ ID NO: 263；本文中為SEQ ID NO: 2667)、AGCAGGAGCTCCTTGGCCTCAGCGTGCGAG (US20160369298之SEQ ID NO: 264；本文中為SEQ ID NO: 2668)、ACAAGCAGCTTCACTATGACAACCACTGAC (US20160369298之SEQ ID NO: 265；本文中為SEQ ID NO: 2669)、CAGCCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGAGAGTCTCAAMAMMAVNSRVCSRSAACAACAACAGTRASTTCTCCTGGMMAGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCCGGACCAGCTATGGCAAGCCACRRGGACRRCRMSRRSARSTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGSAARRCRSCRVSRVARVCRATRYCGMSNHCRVMVRSGTCATGATTACAGACGAAGAGGAGATCTGGAC (US20160369298之SEQ ID NO: 266；本文中為SEQ ID NO: 2670)、TGGGACAATGGCGGTCGTCTCTCAGAGTTKTKKT (US20160369298之SEQ ID NO: 267；本文中為SEQ ID NO: 2671)、AGAGGACCKKTCCTCGATGGTTCATGGTGGAGTTA (US20160369298之SEQ ID NO: 268；本文中為SEQ ID NO: 2672)、CCACTTAGGGCCTGGTCGATACCGTTCGGTG (US20160369298之SEQ ID NO: 269；本文中為SEQ ID NO: 2673)及TCTCGCCCCAAGAGTAGAAACCCTTCSTTYYG (US20160369298之SEQ ID NO: 270；本文中為SEQ ID NO: 2674)。
在一些實施例中，AAV血清型可以包含如國際專利公開案WO2016134375中所述的靶向眼細胞的肽，該案的內容以全文引用的方式併入本文中，諸如(但不限於) WO2016134375之SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 10。另外，WO2016134375中所述之任一種靶向眼細胞之肽或胺基酸可以插入任何親本AAV血清型中，諸如(但不限於) AAV2 (WO2016134375之SEQ ID NO: 8；本文中為SEQ ID NO: 2675)，或AAV9 (WO2016134375之SEQ ID NO: 11；本文中為SEQ ID NO: 2676)。在一些實施例中，諸如插入之修飾發生於AAV2蛋白中之P34-A35、T138-A139、A139-P140、G453-T454、N587-R588及/或R588-Q589。在某些實施例中，插入發生於AAV9之D384、G385、1560、T561、N562、E563、E564、E565、N704及/或Y705。靶向眼細胞之肽可為(但不限於)以下胺基酸序列中之任一者：GSTPPPM (WO2016134375之SEQ ID NO: 1；本文中為SEQ ID NO: 2677)，或GETRAPL (WO2016134375之SEQ ID NO: 4；本文中為SEQ ID NO: 2678)。
在一些實施例中，AAV血清型可為如美國公開案US 20170145405中所述的修飾，該案的內容以全文引用的方式併入本文中。AAV血清型可以包括經修飾的AAV2 (例如Y444F、Y500F、Y730F及/或S662V之修飾)、經修飾的AAV3 (例如Y705F、Y731F及/或T492V之修飾)，及經修飾的AAV6 (例如S663V及/或T492V之修飾)。
在一些實施例中，AAV血清型可如國際公開案WO2017083722中所述加以修飾，該案的內容以全文引用的方式併入本文中。AAV血清型可以包括AAV1 (Y705+731F+T492V)、AAV2 (Y444+500+730F+T491V)、AAV3 (Y705+731F)、AAV5、AAV 5 (Y436+693+719F)、AAV6 (VP3變異體Y705F/Y731F/T492V)、AAV8 (Y733F)、AAV9、AAV9 (VP3變異體Y731F)及AAV10 (Y733F)。
在一些實施例中，AAV血清型可以包含如國際專利公開案WO2017015102 (該案的內容以全文引用的方式併入本文中)中所述的工程化抗原決定基，該工程化抗原決定基包含胺基酸SPAKFA (WO2017015102之SEQ ID NO: 24；本文中為SEQ ID NO: 2679)或NKDKLN (WO2017015102之SEQ ID NO: 2；本文中為SEQ ID NO: 2680)。抗原決定基可以插入AAV8之胺基酸665至670 (根據VP1衣殼之編號)(WO2017015102之SEQ ID NO: 3)及/或AAV3B之殘基664至668 (SEQ ID NO: 3)之區域中。
在一個實施例中，AAV血清型可為或可具有如國際專利公開案WO2017058892中所述的序列，該案的內容以全文引用之方式併入本文中，諸如(但不限於)具有衣殼蛋白的AAV變異體，該等衣殼蛋白可以包含AAV1之胺基酸殘基262-268、370-379、451-459、472-473、493-500、528-534、547-552、588-597、709-710、716-722中之一或多者處之取代的任何組合，或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或禽類AAV中之等效胺基酸殘基。胺基酸取代可為(但不限於) WO2017058892中所述的任一種胺基酸序列。在一個實施例中，AAV可以包含AAV1 (WO2017058892之SEQ ID NO: 1)之殘基256L、258K、259Q、261S、263A、264S、265T、266G、272H、385S、386Q、S472R、V473D、N500E 547S、709A、710N、716D、717N、718N、720L、A456T、Q457T、N458Q、K459S、T492S、K493A、S586R、S587G、S588N、T589R及/或722T之胺基酸取代的任何組合、AAV5 (WO2017058892之SEQ ID NO: 5)之244N、246Q、248R、249E、250I、251K、252S、253G、254S、255V、256D、263Y、377E、378N、453L、456R、532Q、533P、535N、536P、537G、538T、539T、540A、541T、542Y、543L、546N、653V、654P、656S、697Q、698F、704D、705S、706T、707G、708E、709Y及/或710R的任何組合、AAV5 (SEQ ID NO: 5 WO2017058892)之248R、316V、317Q、318D、319S、443N、530N、531S、532Q、533P、534A、535N、540A、541 T、542Y、543L、545G、546N、697Q、704D、706T、708E、709Y及/或710R的任何組合、AAV6 (SEQ ID NO: 6 WO2017058892)之264S、266G、269N、272H、457Q、588S及/或589I的任何組合、AAV8 (SEQ ID NO: 8 WO2017058892)之457T、459N、496G、499N、500N、589Q、590N及/或592A的任何組合、AAV9 (SEQ ID NO: 9 WO2017058892)之451I、452N、453G、454S、455G、456Q、457N及/或458Q的任何組合。
在一些實施例中，AAV可以包括VP1之位置155、156及157或VP2之位置17、18、19及20之胺基酸的序列，如國際公開案第WO 2017066764號中所述，該案的內容以全文引用之方式併入本文中。胺基酸序列可為(但不限於) N-S-S、S-X-S、S-S-Y、N-X-S、N-S-Y、S-X-Y及N-X-Y，其中N、X及Y獨立地為(但不限於)非絲胺酸或非蘇胺酸胺基酸，其中AAV可為(但不限於) AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及AAV12。在一些實施例中，AAV可以包括VP1之位置156、157或158或VP2之位置19、20或21之至少一個胺基酸的缺失，其中AAV可為(但不限於) AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及AAV12。
在一個實施例中，包括於AAV血清型中的肽可以利用Hui等人(Molecular Therapy - Methods & Clinical Development (2015) 2, 15029 doi:10.1038/mtm.2015.29；該內容以全文引用之方式併入本文中)所述的方法鑑別。作為一個非限制性實例，程序包括分離人類脾細胞、活體外用跨越AAV衣殼蛋白之胺基酸序列的個別肽再刺激脾細胞、藉由用於活體外再刺激之個別肽進行IFN-γ ELISpot、進行生物資訊分析以測定藉由IFN-γ ELISpot所鑑別之侷限於HLA的15聚體、鑑別所指定HLA對偶基因之候選反應性9聚體抗原決定基、合成候選9聚體、對來自攜帶經預測結合所鑑別之AAV抗原決定基之HLA對偶基因之個體的脾細胞進行第二次IFN-γ ELISpot篩選、測定AAV衣殼反應性CD8+ T細胞抗原決定基及測定對所指定AAV抗原決定基有反應之個體的頻率。
在一個實施例中，AAV可為藉由基於Cre重組之AAV靶向演化(CREATE)所產生的血清型，如Deverman等人(Nature Biotechnology 34(2):204-209 (2016))所述，該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中。在一個實施例中，以此方式產生的AAV血清型相較於其他AAV血清型具有改良之CNS轉導及/或神經元及星形細胞向性。作為非限制性實例，AAV血清型可為PHP.B、PHP.B2、PHP.B3、PHP.A、G2A12、G2A15。在一個實施例中，此等AAV血清型可為AAV9 (SEQ ID NO: 126及127)衍生物，其中胺基酸588-589之間有7胺基酸插入序列。此等7胺基酸插入序列之非限制性實例包括TLAVPFK (SEQ ID NO: 873)、SVSKPFL (SEQ ID NO: 1249)、FTLTTPK (SEQ ID NO: 882)、YTLSQGW (SEQ ID NO: 888)、QAVRTSL (SEQ ID NO: 914)及/或LAKERLS (SEQ ID NO: 915)。
在一個實施例中，AAV血清型可如Jackson等人(Frontiers in Molecular Neuroscience 9:154 (2016))所述，該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，AAV血清型為PHP.B或AAV9。在一些實施例中，相較於使用更廣泛的啟動子(亦即CBA或CMV)，AAV血清型與增強神經元轉導的突觸蛋白啟動子配對。
在一個實施例中，用於包括於AAV血清型中的肽可以如下鑑別：分離出人類脾細胞、活體外用跨越AAV衣殼蛋白之胺基酸序列的個別肽再刺激脾細胞、藉由用於活體外再刺激之個別肽進行IFN-γ ELISpot、進行生物資訊分析以測定藉由IFN-γ ELISpot所鑑別之侷限於指定對偶基因之15聚體、鑑別所指定對偶基因之候選反應性9聚體抗原決定基、合成候選9聚體、對來自攜帶經預測結合所鑑別AAV抗原決定基之特定對偶基因之個體的脾細胞進行第二次IFN-γ ELISpot篩選、測定AAV衣殼反應性CD8+ T細胞抗原決定基及測定對所指定AAV抗原決定基有反應之個體的頻率。
包含編碼siRNA分子之調節多核苷酸的AAV顆粒可以利用AAV的各種血清型製備或來源於AAV的各種血清型，包括(但不限於) AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9 (hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8及AAV-DJ。在一些情況下，不同的AAV血清型可以混合在一起或與其他類型的病毒混合以產生嵌合AAV顆粒。作為一個非限制性實例，AAV顆粒來源於AAV9血清型。病毒基因組
在一個實施例中，如所示，AAV顆粒包含具有負載區域的病毒基因組。
在一個實施例中，病毒基因組可以包含如圖1中所示的組分。負載區域110 位於病毒基因組100 內。在病毒基因組100 之5'及/或3'端，可以存在至少一個反向末端重複序列(ITR)120 。在5' ITR120 與 負載區域110 之間，可以存在啟動子區域130。在一個實施例中，負載區域可以包含至少一種調節多核苷酸。
在一個實施例中，病毒基因組100 可以包含如圖2中所示的組分。負載區域110 位於病毒基因組100 內。在病毒基因組100 之5'及/或3'端，可以存在至少一個反向末端重複序列(ITR)120 。在5' ITR120 與負載區域110 之間，可以存在啟動子區域130 。在啟動子區域130 與負載區域110 之間，可以存在內含子區域140 。在一個實施例中，負載區域可以包含至少一種調節多核苷酸。
在一個實施例中，病毒基因組100 可以包含如圖3中所示的組分。在病毒基因組100 之5'及/或3'端，可以存在至少一個反向末端重複序列(ITR)120 。在病毒基因組100 內，可以存在增強子區域150 、啟動子區域130 、內含子區域140 及負載區域110 。在一個實施例中，負載區域可以包含至少一種調節多核苷酸。
在一個實施例中，病毒基因組100 可以包含如圖4中所示的組分。在病毒基因組100 之5'及/或3'端，可以存在至少一個反向末端重複序列(ITR)120 。在病毒基因組100 內，可以存在增強子區域150 、啟動子區域130 、內含子區域140 、負載區域110 及多腺苷酸化信號序列區域160 。在一個實施例中，負載區域可以包含至少一種調節多核苷酸。
在一個實施例中，病毒基因組100 可以包含如圖5中所示的組分。在病毒基因組100 之5'及/或3'端，可以存在至少一個反向末端重複序列(ITR)120 。在病毒基因組100 內，可以存在至少一個MCS區域170 、增強子區域150 、啟動子區域130 、內含子區域140 、負載區域110 及多腺苷酸化信號序列區域160 。在一個實施例中，負載區域可以包含至少一種調節多核苷酸。
在一個實施例中，病毒基因組100 可以包含如圖6中所示的組分。在病毒基因組100 之5'及/或3'端，可以存在至少一個反向末端重複序列(ITR)120 。在病毒基因組100 內，可以存在至少一個MCS區域170 、增強子區域150 、啟動子區域130 、至少一個外顯子區域180 、至少一個內含子區域140 、負載區域110 及多腺苷酸化信號序列區域160 。在一個實施例中，負載區域可以包含至少一種調節多核苷酸。
在一個實施例中，病毒基因組100 可以包含如圖7及8中所示的組分。在病毒基因組100 內，可以存在至少一個啟動子區域130 及負載區域110 。在一個實施例中，負載區域可以包含至少一種調節多核苷酸。
在一個實施例中，病毒基因組100 可以包含如圖9中所示的組分。在病毒基因組100 內，可以存在至少一個啟動子區域130 、負載區域110 及多腺苷酸化信號序列區域160 。在一個實施例中，負載區域可以包含至少一種調節多核苷酸。
病毒基因組尺寸 在一個實施例中，包含本文所述之有效負載的病毒基因組可為單股或雙股病毒基因組。病毒基因組尺寸可為小尺寸、中等尺寸、大尺寸或最大尺寸。另外，病毒基因組可以包含啟動子及多腺苷酸尾。
在一個實施例中，包含本文所述之有效負載的病毒基因組可為小單股病毒基因組。小單股病毒基因組可以具有2.7至3.5 kb尺寸，諸如約2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4及3.5 kb尺寸。作為一個非限制性實例，小單股病毒基因組可以具有3.2 kb尺寸。另外，病毒基因組可以包含啟動子及多腺苷酸尾。
在一個實施例中，包含本文所述之有效負載的病毒基因組可為小雙股病毒基因組。小雙股病毒基因組可以具有1.3至1.7 kb尺寸，諸如約1.3、1.4、1.5、1.6及1.7 kb尺寸。作為一個非限制性實例，小雙股病毒基因組可以具有1.6 kb尺寸。另外，病毒基因組可以包含啟動子及多腺苷酸尾。
在一個實施例中，包含本文所述之有效負載的病毒基因組可為中等單股病毒基因組。中等單股病毒基因組可以具有3.6至4.3 kb尺寸，諸如約3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2及4.3 kb尺寸。作為一個非限制性實例，中等單股病毒基因組可以具有4.0 kb尺寸。另外，病毒基因組可以包含啟動子及多腺苷酸尾。
在一個實施例中，包含本文所述之有效負載的病毒基因組可為中等雙股病毒基因組。中等雙股病毒基因組可以具有1.8至2.1 kb尺寸，諸如約1.8、1.9、2.0及2.1 kb尺寸。作為一個非限制性實例，中等雙股病毒基因組可以具有2.0 kb尺寸。另外，病毒基因組可以包含啟動子及多腺苷酸尾。
在一個實施例中，包含本文所述之有效負載的病毒基因組可為大單股病毒基因組。大單股病毒基因組可以具有4.4至6.0 kb尺寸，諸如約4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0 kb尺寸。作為一個非限制性實例，大單股病毒基因組可以具有4.7 kb尺寸。作為另一個非限制性實例，大單股病毒基因組可以具有4.8 kb尺寸。作為又一個非限制性實例，大單股病毒基因組可以具有6.0 kb尺寸。另外，病毒基因組可以包含啟動子及多腺苷酸尾。
在一個實施例中，包含本文所述之有效負載的病毒基因組可為大雙股病毒基因組。大雙股病毒基因組可以具有2.2至3.0 kb尺寸，諸如約2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3.0 kb尺寸。作為一個非限制性實例，大雙股病毒基因組可以具有2.4 kb尺寸。另外，病毒基因組可以包含啟動子及多腺苷酸尾。病毒基因組組分 ： 反向末端重複序列 (ITR)
本發明的AAV顆粒包含具有至少一個ITR區域及負載區域的病毒基因組。在一個實施例中，病毒基因組具有兩個ITR。此兩個ITR在5'及3'端側接負載區域。ITR充當複製起點，包含用於複製之識別位點。ITR包含可以互補且對稱配置的序列區域。併入本發明之病毒基因組中的ITR可以包含天然存在之多核苷酸序列或重組衍生的多核苷酸序列。
ITR可以來源於與衣殼相同的血清型，選自表1中所列之任一種血清型，或其衍生物。ITR可具有與衣殼不同的血清型。在一個實施例中，AAV顆粒具有超過一個ITR。在一個非限制性實例中，AAV顆粒具有包含兩個ITR的病毒基因組。在一個實施例中，ITR為彼此相同的血清型。在另一個實施例中，ITR為不同的血清型。非限制性實例包括零個、一個或兩個具有與衣殼相同之血清型的ITR。在一個實施例中，AAV顆粒之病毒基因組的兩個ITR均為AAV2 ITR。
獨立地，各ITR可以具有約100至約150個核苷酸的長度。ITR可以具有約100-105個核苷酸的長度、106-110個核苷酸的長度、111-115個核苷酸的長度、116-120個核苷酸的長度、121-125個核苷酸的長度、126-130個核苷酸的長度、131-135個核苷酸的長度、136-140個核苷酸的長度、141-145個核苷酸的長度或146-150個核苷酸的長度。在一個實施例中，ITR具有140-142個核苷酸的長度。ITR長度之非限制實例具有102、140、141、142、145個核苷酸的長度，及與其具有至少95%一致性的彼等核苷酸。
在一個實施例中，AAV顆粒包含編碼siRNA分子的核酸序列，該核酸序列可以位於表現載體中之翻轉ITR的5'端附近。在另一個實施例中，AAV顆粒包含編碼siRNA分子的核酸序列，該核酸序列可以位於表現載體中之翻轉ITR的3'端附近。在又另一個實施例中，AAV顆粒包含編碼siRNA分子的核酸序列，該核酸序列可以位於表現載體中之觸發ITR的5'端附近。在又另一個實施例中，AAV顆粒包含編碼siRNA分子的核酸序列，該核酸序列可以位於表現載體中之觸發ITR的3'端附近。在一個實施例中，AAV顆粒包含編碼siRNA分子的核酸序列，該核酸序列可位於表現載體中之翻轉ITR的5'端與觸發ITR的3'端之間。在一個實施例中，AAV顆粒包含編碼siRNA分子的核酸序列，該核酸序列可位於表現載體中之翻轉ITR的3'端與翻轉ITR的5'端之間(例如翻轉ITR之5'端與觸發ITR之3'端之間的中途，或觸發ITR的3'端與翻轉ITR的5'端之間的中途)。作為一個非限制性實例，AAV顆粒包含編碼siRNA分子的核酸序列，該核酸序列可位於表現載體中之ITR (例如翻轉或觸發ITR)之5'或3'端下游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個核苷酸內。作為一個非限制性實例，AAV顆粒包含編碼siRNA分子之核酸序列，該核酸序列可位於表現載體中之ITR (例如翻轉或觸發ITR)之5'或3'端上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個核苷酸內。作為另一個非限制性實例，AAV顆粒包含編碼siRNA分子的核酸序列，該核酸序列可位於表現載體中之ITR (例如翻轉或觸發ITR)之5'或3'端下游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30個核苷酸內。作為另一個非限制性實例，AAV顆粒包含編碼siRNA分子之核酸序列，該siRNA分子可位於表現載體中之ITR (例如翻轉或觸發ITR)之5'或3'端上游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30內。作為一個非限制性實例，AAV顆粒包含編碼siRNA分子之核酸序列，該核酸序列可位於表現載體中之ITR (例如翻轉或觸發ITR)之5'或3'端上游的前1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%或超過25%核苷酸內。作為另一非限制性實例，AAV顆粒包含編碼siRNA分子之核酸序列，該核酸序列可位於表現載體中之ITR (例如翻轉或觸發ITR)之5'或3'端下游的前1-5%、1-10%、1-15%、1-20%、1-25%、5-10%、5-15%、5-20%、5-25%、10-15%、10-20%、10-25%、15-20%、15-25%或20-25%內。病毒基因組組分 ： 啟動子
在一個實施例中，病毒基因組之負載區域包含至少一種增強轉基因標靶特異性及表現的元件(參見例如Powell等人, Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015；該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中)。增強轉基因標靶特異性及表現之元件之非限制性實例包括啟動子、內源miRNA、轉錄後調控元件(PRE)、多腺苷酸化(PolyA)信號序列及上游增強子(USE)、CMV增強子及內含子。
熟習此項技術者可以認識到，本發明之多肽在靶細胞中的表現可能需要特異性啟動子，包括(但不限於)具有物種特異性、可誘導、組織特異性或細胞週期特異性的啟動子(Parr等人, Nat. Med.3:1145-9 (1997)；該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中)。
在一個實施例中，當啟動子時驅動AAV顆粒病毒基因組之負載區域中所編碼之多肽表現時，該啟動子視為有效的。
在一個實施例中，啟動子為視為有效驅動調節多核苷酸表現的啟動子。
在一個實施例中，當啟動子驅動所靶向之細胞表現時，該啟動子為視為有效的啟動子。
在一個實施例中，啟動子驅動有效負載在標靶組織中表現一段時間。啟動子驅動表現的時間為1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2週、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3週、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超過10年。表現可以維持1-5小時、1-12小時、1-2天、1-5天、1-2週、1-3週、1-4週、1-2個月、1-4個月、1-6個月、2-6個月、3-6個月、3-9個月、4-8個月、6-12個月、1-2年、1-5年、2-5年、3-6年、3-8年、4-8年或5-10年。
在一個實施例中，啟動子驅動有效負載表現至少1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年、23年、24年、25年、26年、27年、28年、29年、30年、31年、32年、33年、34年、35年、36年、37年、38年、39年、40年、41年、42年、43年、44年、45年、46年、47年、48年、49年、50年、55年、60年、65年或超過65年。
啟動子可為天然存在的或非天然存在的。啟動子之非限制性實例包括病毒啟動子、植物啟動子及哺乳動物啟動子。在一些實施例中，啟動子可為人類啟動子。在一些實施例中，啟動子可為截斷的。
驅動或促進大部分組織表現的啟動子包括(但不限於)人類延長因子1α-亞單元(EF1α)、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期增強子及/或啟動子、雞肉β-肌動蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β葡糖醛酸酶(GUSB)或泛素C (UBC)。組織特異性表現元件可以用於限制某些細胞類型的表現，諸如(但不限於)肌肉特異性啟動子、B細胞啟動子、單核球啟動子、白細胞啟動子、巨噬細胞啟動子、胰臟腺泡細胞啟動子、內皮細胞啟動子、肺組織啟動子、星形細胞啟動子，或可以用於限制神經元、星形細胞或寡樹突神經膠質細胞表現的神經系統啟動子。
肌肉特異性啟動子之非限制性實例包括哺乳動物肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、哺乳動物肌間線蛋白(DES)啟動子、哺乳動物肌鈣蛋白I (TNNI2)啟動子及哺乳動物骨架α-肌動蛋白(ASKA)啟動子(參見例如美國專利公開案US 20110212529，該案的內容以全文引用之方式併入本文中)。
神經元之組織特異性表現元件之非限制性實例包括神經元特異性烯醇酶(NSE)、血小板源生長因子(PDGF)、血小板源生長因子B鏈(PDGF-β)、突觸蛋白(Syn)、甲基-CpG結合蛋白2 (MeCP2)、Ca2+ /鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II (CaMKII)、代謝型麩胺酸受體2 (mGluR2)、神經纖毛輕鏈(NFL)或重鏈(NFH)、β-血球蛋白小型基因nβ2、前腦啡肽原(PPE)、腦啡肽(Enk)及激動性胺基酸轉運體2 (EAAT2)啟動子。用於星形細胞之組織特異性表現元件之非限制性實例包括膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)及EAAT2啟動子。用於寡樹突神經膠質細胞之組織特異性表現元件之非限制性實例包括髓磷脂鹼性蛋白(MBP)啟動子。
在一個實施例中，啟動子可以小於1 kb。啟動子可具有200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超過800個核苷酸的長度。啟動子可具有200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800之間的長度。
在一個實施例中，啟動子可為相同或不同起始或親本啟動子中之兩種或超過兩種組分的組合，諸如(但不限於) CMV與CBA。各組分可具有200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超過800之長度。各組分可具有200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800之間的長度。在一個實施例中，啟動子為382個核苷酸CMV增強子序列與260個核苷酸CBA啟動子序列之組合。
在一個實施例中，病毒基因組包含普遍存在的啟動子。普遍存在的啟動子之非限制性實例包括CMV、CBA (包括衍生物CAG、CBh等)、EF-1α、PGK、UBC、GUSB (hGBp)及UCOE (HNRPA2B1-CBX3之啟動子)。
Yu等人(Molecular Pain 2011, 7:63；該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中)評估在大鼠DRG細胞及初代DRG細胞中、利用慢病毒載體、在CAG、EFIα、PGK及UBC啟動子下表現eGFP且發現UBC展示的表現比其他3種啟動子弱且發現所有啟動子僅存在10-12%神經膠質表現。Soderblom等人(E. Neuro 2015；該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中)評估在注射至運動皮質之後，eGFP在具有CMV及UBC啟動子之AAV8中的表現及在具有CMV啟動子之AAV2中的表現。鼻內投與含有UBC或EFIα啟動子的質體展示持久的呼吸道表現，其大於使用CMV啟動子的表現(參見例如Gill等人, Gene Therapy 2001, 第8卷, 1539-1546；該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中)。Husain等人(Gene Therapy 2009；該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中)評估含有hGUSB啟動子、HSV-1LAT啟動子及NSE啟動子的HβH構築體且發現HβH構築體展示的表現比小鼠腦中的NSE弱。Passini及Wolfe (J. Virol. 2001, 12382-12392，該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中)評估HβH載體在心室內注射至新生兒小鼠之後的長期影響且發現存在至少1年的持久表現。使用NFL及NFH啟動子時，Xu等人(Gene Therapy 2001, 8, 1323-1332；該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中)發現所有腦區域中之表現低於CMV-lacZ、CMV-luc、EF、GFAP、hENK、nAChR、PPE、PPE + wpre、NSE (0.3 kb)、NSE (1.8 kb)及NSE (1.8 kb + wpre)。Xu等人發現啟動子活性依降序為NSE (1.8 kb)、EF、NSE (0.3 kb)、GFAP、CMV、hENK、PPE、NFL及NFH。NFL為650個核苷酸啟動子且NFH為920個核苷酸啟動子，此兩種啟動子在肝中均不存在，但NFH在感覺性本體感受性神經元、腦及脊髓中為豐裕的且NFH存在於心臟中。Scn8a為表現於整個DRG、脊髓及腦中的470個核苷酸啟動子，其中發現在海馬體神經元及小腦浦金埃氏細胞(Purkinje cell)、皮質、丘腦及下丘腦中的表現特別高(參見例如Drews等人, Identification of evolutionary conserved, functional noncoding elements in the promoter region of the sodium channel gene SCN8A, Mamm Genome (2007) 18:723-731；及Raymond等人, Expression of Alternatively Spliced Sodium Channel α-subunit genes, Journal of Biological Chemistry (2004) 279(44) 46234-46241；該等文獻各自的內容以全文引用的方式併入本文中)。
前述Yu, Soderblom, Gill, Husain, Passini, Xu, Drews或Raymond教示的任一種啟動子均可以用於本發明中。
在一個實施例中，啟動子不具有細胞特異性。
在一個實施例中，啟動子為泛素c (UBC)啟動子。UBC啟動子可具有300-350個核苷酸之尺寸。作為一個非限制性實例，UBC啟動子為332個核苷酸。
在一個實施例中，啟動子為β-葡糖醛酸酶(GUSB)啟動子。GUSB啟動子可具有350-400個核苷酸之尺寸。作為一個非限制性實例，GUSB啟動子為378個核苷酸。
在一個實施例中，啟動子為神經纖毛輕鏈(NFL)啟動子。NFL啟動子可具有600-700個核苷酸之尺寸。作為一個非限制性實例，NFL啟動子為650個核苷酸。作為一個非限制性實例，構築體可為AAV-啟動子-CMV/血球蛋白內含子-調節多核苷酸-RBG，其中AAV可以具有自互補性且AAV可以具有DJ血清型。
在一個實施例中，啟動子為神經纖毛重鏈(NFH)啟動子。NFH啟動子可具有900-950個核苷酸之尺寸。作為一個非限制性實例，NFH啟動子為920個核苷酸。作為一個非限制性實例，構築體可為AAV-啟動子-CMV/血球蛋白內含子-調節多核苷酸-RBG，其中AAV可以具有自互補性且AAV可以具有DJ血清型。
在一個實施例中，啟動子為scn8a啟動子。scn8a啟動子可具有450-500個核苷酸之尺寸。作為一個非限制性實例，scn8a啟動子為470個核苷酸。作為一個非限制性實例，構築體可為AAV-啟動子-CMV/血球蛋白內含子-調節多核苷酸-RBG，其中AAV可以具有自互補性且AAV可以具有DJ血清型。
在一個實施例中，病毒基因組包含Pol III啟動子。
在一個實施例中，病毒基因組包含P1啟動子。
在一個實施例中，病毒基因組包含FXN啟動子。
在一個實施例中，啟動子為磷酸甘油酸激酶1 (PGK)啟動子。
在一個實施例中，啟動子為雞肉β-肌動蛋白(CBA)啟動子。
在一個實施例中，啟動子為CAG啟動子，該CAG啟動子為包含細胞巨大病毒(CMV)增強子與雞肉β-肌動蛋白(CBA)啟動子融合的構築體。
在一個實施例中，啟動子為細胞巨大病毒(CMV)啟動子。
在一個實施例中，病毒基因組包含Pol III啟動子，例如Pol III 3型啟動子。
在一個實施例中，包含U3、U6、U7、7SK、H1或MRP、EBER、硒基半胱胺酸tRNA、7SL、腺病毒VA-1或端粒酶基因啟動子。
在一個實施例中，病毒基因組包含H1啟動子。
在一個實施例中，病毒基因組包含U6啟動子。
在一個實施例中，啟動子為肝臟或骨骼肌啟動子。肝臟啟動子之非限制性實例包括人類α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)及甲狀腺素結合球蛋白(TBG)。骨骼肌啟動子之非限制性實例包括肌間線蛋白、MCK或合成C5-12。
在一個實施例中，啟動子為RNA Pol III啟動子。作為一個非限制性實例，RNA Pol III啟動子為U6。作為一個非限制性實例，RNA Pol III啟動子為H1。
在一個實施例中，啟動子為RNA Pol II啟動子，包括例如截斷的RNA Pol II啟動子。
在一個實施例中，病毒基因組包含兩個啟動子。作為一個非限制性實例，啟動子為EF1α啟動子及CMV啟動子。
在一個實施例中，病毒基因組包含增強子元件、啟動子及/或5'UTR內含子。增強子元件,在本文中亦稱為「增強子」,可為(但不限於) CMV增強子，啟動子可為(但不限於) CMV、CBA、UBC、GUSB、NSE、突觸蛋白、MeCP2及GFAP啟動子且5'UTR/內含子可為(但不限於) SV40及CBA-MVM。作為一個非限制性實例，組合使用的增強子、啟動子及/或內含子可為：(1) CMV增強子、CMV啟動子、SV40 5'UTR內含子；(2) CMV增強子、CBA啟動子、SV 40 5'UTR內含子；(3) CMV增強子、CBA啟動子、CBA-MVM 5'UTR內含子；(4) UBC啟動子；(5) GUSB啟動子；(6) NSE啟動子；(7)突觸蛋白啟動子；(8) MeCP2啟動子、(9) GFAP啟動子、(10) H1啟動子；及(11) U6啟動子。
在一個實施例中，病毒基因組包含工程化啟動子。
在另一個實施例中，病毒基因組包含來自天然表現之蛋白質的啟動子。病毒基因組組分 ： 非轉譯區域 (UTR)
根據定義，基因之野生型非轉譯區域(UTR)被轉錄，但不轉譯。一般而言，5'UTR始於轉錄起始位點且始於起始密碼子，且3'UTR起點緊隨終止密碼子之後且持續直至轉錄終止信號。
典型地發現於經充分表現之特定靶器官基因中的特徵可加以工程改造於UTR中以增強穩定性及蛋白質產量。作為一個非限制性實例，本發明之AAV顆粒病毒基因組中可以使用正常表現於肝中之mRNA之5'UTR (例如白蛋白、血清澱粉樣蛋白A、脂蛋白元A/B/E、轉鐵蛋白、α胎蛋白、紅細胞生成素或因子VIII)以增強肝細胞株或肝臟中的表現。
雖然不希望受理論束縛，野生型5'非轉譯區域(UTR)包括在轉譯起始中起作用的特徵。5' UTR中通常包括Kozak序列，Kozak序列通常已知涉及核糖體藉以起始許多基因轉譯的過程。Kozak序列具有共同CCR(A /G)CCAUGG，其中R為起始密碼子上游的嘌呤(腺嘌呤或鳥嘌呤)三鹼基(ATG)，繼其之後為另一個『G』。
在一個實施例中，病毒基因組中的5'UTR包括Kozak序列。
在一個實施例中，病毒基因組中的5'UTR不包括Kozak序列。
雖然不希望受理論束縛，但已知野生型3' UTR中嵌有腺苷及尿苷之片段。此等富AU標誌在週轉率高的基因中特別盛行。富AU元件(ARE)基於其序列特徵及功能特性可以分成三類(Chen等人，1995，該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中)：I類 ARE，諸如(但不限於) c-Myc及MyoD，在富U區域內含有若干個分散的AUUUA模體複本。II類ARE，諸如(但不限於) GM-CSF及TNF-a，具有兩個或超過兩個重疊UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚體。III類ARES，諸如(但不限於) c-Jun及成肌素，定義不太明確。此等富U區域不含AUUUA模體。結合至ARE的大部分蛋白質已知使信使去穩定化，而ELAV家族成員(最顯著地，HuR)已記錄到可增強mRNA穩定性。HuR結合至所有三類ARE。將HuR特異性結合位點工程改造於核酸分子之3' UTR中將引起HuR結合且從而引起活體內訊息穩定。
3' UTR富AU元件(ARE)之引入、移除或修飾可以用於調節多核苷酸穩定性。對特定多核苷酸(例如病毒基因組之有效負載區域)進行工程改造時，可以引入ARE之一或多個複本以減少多核苷酸穩定性且藉此減少所得蛋白質之轉譯且減少其產量。同樣，可以鑑別出ARE且將其移除或突變以增強胞內穩定性且從而增強所得蛋白質之轉譯及產量。
在一個實施例中，病毒基因組之3' UTR可以包括用於模板化添加多腺苷酸尾的寡聚(dT)序列。
在一個實施例中，病毒基因組可以包括至少一個miRNA種子、結合位點或完整序列。微RNA (或miRNA或miR)為19-25個核苷酸非編碼RNA，其結合至核酸靶點且藉由降低核酸分子穩定性或藉由抑制轉譯來下調基因表現。微RNA序列包含「種子」區域，亦即成熟微RNA之位置2-8區域中的序列，該序列相對於核酸之miRNA靶序列具有完美的沃森-克里克互補性(Watson-Crick complementarity)。
在一個實施例中，病毒基因組可加以工程改造以包括、改變或移除至少一個miRNA結合位點、序列或種子區域。
來自此項技術中已知之任何基因的任何UTR可以併入AAV顆粒病毒基因組中。此等UTR或其一部分的放置取向可以與其在其中所選或其取向或位置可以改變的基因相同。在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組中所用的UTR可以倒轉，縮短，延長，經製備而具有此項技術中已知的一或多個其他5' UTR或3' UTR。如本文所用，術語「改變」當其指UTR時，意謂UTR已以某種方式相對於參考序列變化。舉例而言，3'或5' UTR可以如上文教示根據取向或位置的變化而相對於野生型或原生UTR發生改變或可以藉由包括額外核苷酸、核苷酸缺失、核苷酸交換或轉位而發生改變。
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組包含至少一個人工UTR，該等UTR不為野生型UTR之變異體。
在一個實施例中，AAV顆粒之病毒基因組包含已選自轉錄物家族的UTR，該等轉錄物的蛋白質具有共同的功能、結構、特點或特性。病毒基因組組分 ： 多腺苷酸化序列
在一個實施例中，本發明之AAV顆粒病毒基因組包含至少一個多腺苷酸化序列。AAV顆粒之病毒基因組可以包含位於有效負載編碼序列之3'端與3' ITR之5'端之間的多腺苷酸化序列。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列或「polyA序列」的長度範圍可以為不存在至約500個核苷酸。多腺苷酸化序列可為(但不限於) 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499及500個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有50-100個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有50-150個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有50-160個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有50-200個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有60-100個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有60-150個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有60-160個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有60-200個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有70-100個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有70-150個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有70-160個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有70-200個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有80-100個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有80-150個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有80-160個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有80-200個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有90-100個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有90-150個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有90-160個核苷酸的長度。
在一個實施例中，多腺苷酸化序列具有90-200個核苷酸的長度。
在一個實施例中，AAV顆粒包含編碼siRNA分子之核酸序列，該核酸序列可以位於表現載體中之多腺苷酸化序列上游。另外，AAV顆粒包含編碼siRNA分子之核酸序列，該核酸序列可以位於表現載體中之具有SV40內含子或人類β血球蛋白內含子之啟動子下游，啟動子諸如(但不限於) CMV、U6、CAG、CBA或CBA啟動子。作為一個非限制性實例，AAV顆粒包含編碼siRNA分子的核酸序列，該核酸序列可以位於表現載體中之啟動子下游及/或多腺苷酸化序列上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個核苷酸內。作為另一個非限制性實例，AAV顆粒包含編碼siRNA分子之核酸序列，該核酸序列可以位於表現載體中之啟動子下游及/或多腺苷酸化序列上游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30個核苷酸內。作為一個非限制性實例，AAV顆粒包含編碼siRNA分子之核酸序列，該核酸序列可以位於表現載體中之啟動子下游及/或多腺苷酸化序列上游的前1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%或超過25%核苷酸內。作為另一非限制性實例，AAV顆粒包含編碼siRNA分子的核酸序列，該核酸序列可以位於表現載體中之啟動子下游及/或多腺苷酸化序列上游的前1-5%、1-10%、1-15%、1-20%、1-25%、5-10%、5-15%、5-20%、5-25%、10-15%、10-20%、10-25%、15-20%、15-25%或20-25%內。
在一個實施例中，AAV顆粒包含兔血球蛋白多腺苷酸化(polyA)信號序列。
在一個實施例中，AAV顆粒包含人類生長激素多腺苷酸化(polyA)信號序列。病毒基因組組分 ： 內含子
在一個實施例中，負載區域包含至少一個增強表現的元件，諸如一或多個內含子或其一部分。內含子之非限制性實例包括MVM (67-97 bps)、F.IX截斷的內含子1 (300 bps)、β-血球蛋白SD/免疫球蛋白重鏈剪接受體(250 bps)、腺病毒剪接供體/免疫球蛋白剪接受體(500 bps)、SV40晚期剪接供體/剪接受體(19S/16S)(180 bps)及雜合腺病毒剪接供體/IgG剪接受體(230 bps)。
在一個實施例中，內含子或內含子部分可以具有100-500個核苷酸的長度。內含子可具有80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500之長度。內含子可具有80-100、80-120、80-140、80-160、80-180、80-200、80-250、80-300、80-350、80-400、80-450、80-500、200-300、200-400、200-500、300-400、300-500或400-500之間的長度。
在一個實施例中，AAV病毒基因組可以包含諸如(但不限於)CMV或U6之啟動子。作為一個非限制性實例，包含本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV啟動子為CMV啟動子。作為另一個非限制性實例，包含本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV啟動子為U6啟動子。
在一個實施例中，AAV病毒基因組可以包含CMV啟動子。
在一個實施例中，AAV病毒基因組可以包含U6啟動子。
在一個實施例中，AAV病毒基因組可以包含CMV及U6啟動子。
在一個實施例中，AAV病毒基因組可以包含Pol III啟動子。
在一個實施例中，AAV病毒基因組可以包含Pol III 3型啟動子。
在一個實施例中，AAV病毒基因組可以包含H1啟動子。
在一個實施例中，AAV病毒基因組可以包含U6啟動子。
在一個實施例中，AAV病毒基因組可以包含CBA啟動子。
在一個實施例中，所編碼的siRNA分子可以位於表現載體中之具有內含子(諸如SV40或此項技術中已知的其他內含子)的啟動子下游，啟動子諸如(但不限於) CMV、U6、H1、CBA、CAG或CBA啟動子。另外，所編碼的siRNA分子亦可位於表現載體中之多腺苷酸化序列上游。作為一個非限制性實例，所編碼的siRNA分子可以位於表現載體中之啟動子下游及/或多腺苷酸化序列上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個核苷酸內。作為另一個非限制性實例，所編碼之siRNA分子可以位於表現載體中之啟動子下游及/或多腺苷酸化序列上游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5 -15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30個核苷酸內。作為一個非限制性實例，所編碼之siRNA分子可以位於表現載體中之啟動子下游及/或多腺苷酸化序列上游的前1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%或超過25%核苷酸內。作為另一個非限制性實例，所編碼的siRNA分子可以位於表現載體中之啟動子下游及/或多腺苷酸化序列上游的前1-5%、1-10%、1-15%、1-20%、1-25%、5-10%、5-15%、5-20%、5-25%、10-15%、10-20%、10-25%、15-20%、15-25%或20-25%內。病毒基因組組分 ： 填充序列
在一個實施例中，病毒基因組包含一或多個填充序列。
在一個實施例中，病毒基因組包含一或多個填充序列以便使病毒基因組的長度為最佳的封裝尺寸。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列以便使病毒基因組的長度為約2.3 kb。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列以便使病毒基因組的長度為約4.6 kb。
在一個實施例中，病毒基因組包含一或多個填充序列以便降低載體基因組(例如本文所述之調節多核苷酸)之髮夾結構可以在表現及/或封裝期間以反向末端重複序列(ITR)形式讀取的可能性。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列以便使病毒基因組的長度為約2.3 kb。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列以便使病毒基因組的長度為約4.6 kb。
在一個實施例中，病毒基因組為單股(ss)病毒基因組且包含一或多個填充序列，該等填充序列的長度大約在0.1 kb-3.8 kb之間，諸如(但不限於) 0.1 kb、0.2 kb、0.3 kb、0.4 kb、0.5 kb、0.6 kb、0.7 kb、0.8 kb、0.9 kb、1 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb、1.5 kb、1.6 kb、1.7 kb、1.8 kb、1.9 kb、2 kb、2.1 kb、2.2 kb、2.3 kb、2.4 kb、2.5 kb、2.6 kb、2.7 kb、2.8 kb、2.9 kb、3 kb、3.1 kb、3.2 kb、3.3 kb、3.4 kb、3.5 kb、3.6 kb、3.7 kb或3.8 kb。作為一個非限制性實例，載體基因組中的填充序列總長度為3.1 kb。作為一個非限制性實例，載體基因組中的填充序列總長度為2.7 kb。作為一個非限制性實例，載體基因組中的填充序列總長度為0.8 kb。作為一個非限制性實例，載體基因組中的填充序列總長度為0.4 kb。作為一個非限制性實例，載體基因組中的各填充序列長度為0.8 kb。作為一個非限制性實例，載體基因組中的各填充序列長度為0.4 kb。
在一個實施例中，病毒基因組為自互補(sc)病毒基因組且包含一或多個填充序列，該等填充序列的長度大約在0.1 kb-1.5 kb之間，諸如(但不限於) 0.1 kb、0.2 kb、0.3 kb、0.4 kb、0.5 kb、0.6 kb、0.7 kb、0.8 kb、0.9 kb、1 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb。作為一個非限制性實例，載體基因組中的填充序列總長度為0.8 kb。作為一個非限制性實例，載體基因組中的填充序列總長度為0.4 kb。作為一個非限制性實例，載體基因組中的各填充序列長度為0.8 kb。作為一個非限制性實例，載體基因組中的各填充序列長度為0.4 kb。
在一個實施例中，病毒基因組包含填充序列之任何部分。病毒基因組可以包含填充序列之1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一個實施例中，病毒基因組為單股(ss)病毒基因組且包含一或多個填充序列以便使病毒基因組的長度為約4.6 kb。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列且該填充序列位於5' ITR序列的3'。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列且該填充序列位於啟動子序列的5'。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列且該填充序列位於多腺苷酸化信號序列的3'。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列且該填充序列位於3' ITR序列的5'。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列，且該填充序列位於兩個內含子序列之間。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列，且該填充序列位於內含子序列內。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含兩個填充序列，且第一填充序列位於5' ITR序列的3'且第二填充序列位於多腺苷酸化信號序列的3'。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含兩個填充序列，且第一填充序列位於啟動子序列的5'且第二填充序列位於多腺苷酸化信號序列的3'。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含兩個填充序列，且第一填充序列位於5' ITR序列的3'且第二填充序列位於5' ITR的5'。
在一個實施例中，病毒基因組為自互補(sc)病毒基因組且包含一或多個填充序列以便使病毒基因組長度為約2.3 kb。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列且該填充序列位於5' ITR序列的3'。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列且該填充序列位於啟動子序列的5'。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列且該填充序列位於多腺苷酸化信號序列的3'。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列且該填充序列位於3' ITR序列的5'。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列，且該填充序列位於兩個內含子序列之間。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含至少一個填充序列，且該填充序列位於內含子序列內。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含兩個填充序列，且第一填充序列位於5' ITR序列的3'且第二填充序列位於多腺苷酸化信號序列的3'。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含兩個填充序列，且第一填充序列位於啟動子序列的5'且第二填充序列位於多腺苷酸化信號序列的3'。作為一個非限制性實例，病毒基因組包含兩個填充序列，且第一填充序列位於5' ITR序列的3'且第二填充序列位於5' ITR的5'。
在一個實施例中，病毒基因組可以包含位於病毒基因組之一或多個區域之間的一或多個填充序列。在一個實施例中，填充區域可以位於諸如(但不限於)以下之區域之前：負載區域、反向末端重複序列(ITR)、啟動子區域、內含子區域、增強子區域、多腺苷酸化信號序列區域、多選殖位點(MCS)區域，及/或外顯子區域。在一個實施例中，填充區域可以位於諸如(但不限於)以下之區域之後：負載區域、反向末端重複序列(ITR)、啟動子區域、內含子區域、增強子區域、多腺苷酸化信號序列區域、多選殖位點(MCS)區域，及/或外顯子區域。在一個實施例中，填充區域可以位於諸如(但不限於)以下之區域之前及之後：負載區域、反向末端重複序列(ITR)、啟動子區域、內含子區域、增強子區域、多腺苷酸化信號序列區域、多選殖位點(MCS)區域，及/或外顯子區域。
在一個實施例中，病毒基因組可以包含一或多個將病毒基因組之至少一個區域分開的填充序列。病毒基因組之分支區域可以包含位於填充序列區域5'之該區域的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。作為一個非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的10%位於填充序列的5'且該區域的90%位於填充序列的3'。作為一個非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的20%位於填充序列的5'且該區域的80%位於填充序列的3'。作為一個非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的30%位於填充序列的5'且該區域的70%位於填充序列的3'。作為一個非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的40%位於填充序列的5'且該區域的60%位於填充序列的3'。作為一個非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的50%位於填充序列的5'且該區域的50%位於填充序列的3'。作為一個非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的60%位於填充序列的5'且該區域的40%位於填充序列的3'。作為一個非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的70%位於填充序列的5'且該區域的30%位於填充序列的3'。作為一個非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的80%位於填充序列的5'且該區域的20%位於填充序列的3'。作為一個非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的90%位於填充序列的5'且該區域的10%位於填充序列的3'。
在一個實施例中，病毒基因組包含位於5' ITR之後的填充序列。
在一個實施例中，病毒基因組包含位於啟動子區域之後的填充序列。在一個實施例中，病毒基因組包含位於負載區域之後的填充序列。在一個實施例中，病毒基因組包含位於內含子區域之後的填充序列。在一個實施例中，病毒基因組包含位於增強子區域之後的填充序列。在一個實施例中，病毒基因組包含位於多腺苷酸化信號序列區域之後的填充序列。在一個實施例中，病毒基因組包含位於負載區域之後的填充序列。在一個實施例中，病毒基因組包含位於外顯子區域之後的填充序列。
在一個實施例中，病毒基因組包含位於啟動子區域之前的填充序列。在一個實施例中，病毒基因組包含位於負載區域之前的填充序列。在一個實施例中，病毒基因組包含位於內含子區域之前的填充序列。在一個實施例中，病毒基因組包含位於增強子區域之前的填充序列。在一個實施例中，病毒基因組包含位於多腺苷酸化信號序列區域之前的填充序列。在一個實施例中，病毒基因組包含位於MCS區域之前的填充序列。在一個實施例中，病毒基因組包含位於外顯子區域之前的填充序列。
在一個實施例中，病毒基因組包含位於3' ITR之前的填充序列。
在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於) 5' ITR與啟動子區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於) 5' ITR與負載區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於) 5' ITR與內含子區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於) 5' ITR與增強子區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於) 5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於) 5' ITR與MCS區域)之間。
在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於) 5' ITR與外顯子區域)之間。
在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)啟動子區域與負載區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)啟動子區域與內含子區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)啟動子區域與增強子區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)啟動子區域與多腺苷酸化信號序列區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)啟動子區域與MCS區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)啟動子區域與外顯子區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)啟動子區域與3' ITR)之間。
在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)負載區域與內含子區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)負載區域與增強子區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)負載區域與多腺苷酸化信號序列區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)負載區域與MCS區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)負載區域與外顯子區域)之間。
在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)負載區域與3' ITR)之間。
在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)內含子區域與增強子區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)啟動子區域與多腺苷酸化信號序列區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如(但不限於)內含子區域與MCS區域。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)內含子區域與外顯子區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)內含子區域與3' ITR)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)增強子區域與多腺苷酸化信號序列區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)增強子區域與MCS區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)增強子區域與外顯子區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)增強子區域與3' ITR)之間。
在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)多腺苷酸化信號序列區域與MCS區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)多腺苷酸化信號序列區域與外顯子區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)多腺苷酸化信號序列區域與3' ITR)之間。
在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於) MCS區域與外顯子區域)之間。在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於) MCS區域與3' ITR)之間。
在一個實施例中，填充序列可位於兩個區域(諸如(但不限於)外顯子區域與3' ITR)之間。
在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與負載區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與內含子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與增強子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與內含子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與增強子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與增強子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區域之間，且第二填充序列可位於外顯子區域與3' ITR之間。
在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與負載區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與內含子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與增強子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與內含子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與增強子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與增強子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與負載區域之間，且第二填充序列可位於外顯子區域與3' ITR之間。
在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與負載區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與內含子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與增強子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與內含子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與增強子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與增強子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與內含子區域之間，且第二填充序列可位於外顯子區域與3' ITR之間。
在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與負載區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與內含子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與增強子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與內含子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與增強子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與增強子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與增強子區域之間，且第二填充序列可位於外顯子區域與3' ITR之間。
在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與負載區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與內含子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與增強子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩種填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於啟動子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與內含子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與增強子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於負載區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與增強子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於內含子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩種填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩種填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可以包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於外顯子區域與3' ITR之間。
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在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於內含子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於內含子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於內含子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於內含子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於增強子區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於內含子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於內含子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於內含子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於內含子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於內含子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於內含子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於外顯子區域與3' ITR之間。
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在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間，且第二填充序列可位於外顯子區域與3' ITR之間。
在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與MCS區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與MCS區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與MCS區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與MCS區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與MCS區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與MCS區域之間，且第二填充序列可位於外顯子區域與3' ITR之間。
在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於外顯子區域與3' ITR之間。
在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與3' ITR之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與MCS區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與3' ITR之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與3' ITR之間，且第二填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與3' ITR之間，且第二填充序列可位於MCS區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與3' ITR之間，且第二填充序列可位於MCS區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於增強子區域與3' ITR之間，且第二填充序列可位於外顯子區域與3' ITR之間。
在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與MCS區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與MCS區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與MCS區域之間，且第二填充序列可位於外顯子區域與3' ITR之間。
在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於MCS區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於外顯子區域與3' ITR之間。
在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與3' ITR之間，且第二填充序列可位於MCS區域與外顯子區域之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與3' ITR之間，且第二填充序列可位於MCS區域與3' ITR之間。在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於多腺苷酸化信號序列區域與3' ITR之間，且第二填充序列可位於外顯子區域與3' ITR之間。
在一個實施例中，病毒基因組可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於MCS區域與外顯子區域之間，且第二填充序列可位於外顯子區域與3' ITR之間。本發明之負載
本發明之AAV顆粒包含至少一個負載區域。如本文所用，「負載」或「負載區域」係指一或多種多核苷酸或多核苷酸區域，其由或在病毒基因組或該多核苷酸或多核苷酸區域(例如編碼多肽或多元多肽或調節核酸或調控核酸的轉殖基因、多核苷酸)之表現產物內編碼。本發明之負載通常編碼調節多核苷酸或其片段或變異體。
負載區域可以反射與mRNA之天然組織類似或鏡像之區域的方式構造。
負載區域可包含編碼及非編碼核酸序列之組合。
在一些實施例中，AAV負載區域可對編碼或非編碼RNA進行編碼。
在一個實施例中，AAV顆粒包含具有包含編碼siRNA、miRNA或其他RNAi劑之核酸序列之負載區域的病毒基因組。在此類實施例中，編碼超過一種多肽之病毒基因組可複寫及封裝至病毒顆粒中。經病毒顆粒轉導的靶細胞可在單個細胞內部表現經編碼之siRNA、miRNA或其他RNAi劑。調節多核苷酸
在一個實施例中，調節多核苷酸，例如RNA或DNA分子，可用於治療至少一種神經退化性疾病。如本文所用，「調節多核苷酸」為任何核酸序列，其用以調節(增加或減少)靶基因之水平或量，例如，mRNA或蛋白質含量。
在一個實施例中，調節多核苷酸可包含至少一種編碼至少一個siRNA分子之核酸序列。若存在超過一種，則核酸可編碼1、2、3、4、5、6、7、8、9或超過9種siRNA分子。
在一個實施例中，分子支架可位於CMV啟動子、其片段或變異體下游。
在一個實施例中，分子支架可位於CBA啟動子、其片段或變異體下游。
在一個實施例中，分子支架可為位於CMV啟動子之下游之天然pri-miRNA支架。作為一非限制性實例，天然pri-miRNA支架衍生自人類miR155支架。
在一個實施例中，分子支架可為位於CBA啟動子之下游之天然pri-miRNA支架。
在一個實施例中，分子支架及調節多核苷酸之選擇藉由一種比較pri-miRNA中之調節多核苷酸的方法判定(參見例如由Miniarikova等人所述之方法：Design, Characterization, and Lead Selection of Therapeutic miRNAs Targeting Huntingtin for Development of Gene Therapy for Huntington's Disease. Molecular Therapy-Nucleic Acids (2016) 5, e297及國際公開案第WO2016102664號；該等文獻之各者的內容以全文引用之方式併入本文中)。為評估調節多核苷酸之活性，可用於人類pri-miRNA支架(例如，miR155支架)之所用分子支架及啟動子可為CMV。活性可使用HEK293T細胞及報導基因(例如，螢光素酶)活體外確定。
為評估調節多核苷酸之最佳分子支架，調節多核苷酸用於CAG啟動子之pri-miRNA支架。構築體經50 ng之報導基因(例如，螢光素酶報導基因)共轉染。在50 ng共轉染下具有超過80%阻斷基因表現之構築體視為高效的。在一個態樣中，具有強引導股活性之構築體係較佳的。分子支架可在HEK293T細胞中藉由NGS處理以判定引導-隨從比率及處理變化。
在一個實施例中，待治療之疾病為HD，且調節多核苷酸可但其不限於靶向外顯子1、CAG重複序列、外顯子50中之SNP rs362331及/或外顯子67中之SNP rs362307。對於外顯子1靶向，若阻斷基因表現為80%或更大，則判定調節多核苷酸在HTT阻斷基因表現下為高效的。對於CAG靶向，若阻斷基因表現為至少60%，則確定調節多核苷酸在HTT阻斷基因表現下為高效的。對於SNP靶向，若阻斷基因表現為至少60%，則判定調節多核苷酸在HTT阻斷基因表現下為高效的。對於CAG重複序列或SNP之對偶基因選擇率，靶向調節多核苷酸可包含至少1個取代基以提高對偶基因選擇率。作為一非限制性實例，取代基可為經T置換之G或C或對應U及A或經C置換之T/U。
為評估活體內分子支架及調節多核苷酸，包含調節多核苷酸之分子支架封裝於AAV中(例如，血清型可為AAV5 (參見例如WO2015060722中所述之方法及構築體，該案的內容以全文引用之方式併入本文中))，且向活體內模型(例如，對於HD，可使用Hu128/21 HD小鼠)投與，且引導-隨從比率、5'及3'端處理、引導及隨從股之逆轉及阻斷基因表現可在模型之不同區域中確定。
在一個實施例中，分子支架及調節多核苷酸之選擇藉由比較天然pri-miRNA及合成pri-miRNA中之調節多核苷酸的方法確定。除外顯子1外，調節多核苷酸可但其不限於靶向外顯子。為評估調節多核苷酸之活性，藉由CBA啟動子使用分子支架。在一個態樣中，活性可使用HEK293T細胞、海拉細胞(HeLa cell)及報導基因(例如，螢光素酶)活體外確定，且阻斷基因表現高效調節多核苷酸在細胞測試中展示至少80%的相關基因阻斷基因表現。另外，視為最高效之調節多核苷酸展示低至不顯著隨從股(p股)活性。在另一態樣中，相關內源性基因阻斷基因表現功效藉由使用HEK293T細胞、海拉細胞及報導基因活體外轉染而評估。高效調節多核苷酸展示超過50%的相關內源性基因阻斷基因表現。在又一態樣中，相關內源性基因阻斷基因表現功效藉由感染(例如，AAV2)在不同細胞類型(例如，來自患有待治療之疾病之個體的HEK293、海拉、初級星形細胞、U251星形細胞、SH-SY5Y神經元細胞及纖維母細胞)中評估。高效調節多核苷酸展示超過60%的相關內源性基因阻斷基因表現。
為評估活體內分子支架及調節多核苷酸，包含調節多核苷酸之分子支架封裝於AAV中，且向活體內模型(例如，對於治療HD，可使用YAC128 HD小鼠模型)投與，且引導-隨從比率、5'及3'端處理、引導股與隨從股之比率及阻斷基因表現可在模型之不同區域(例如，組織區域)中確定。分子支架可自活體內樣品中藉由NGS處理以判定引導-隨從比率及處理變化。
在一個實施例中，調節多核苷酸設計使用以下特性中之至少一者設計：環變異體、種菌失配/凸出/擺動變異體、莖失配、環變異體及從屬莖失配變異體、種菌失配及基部莖失配變異體、莖失配及基部莖失配變異體、種菌擺動及基部莖擺動變異體或莖序列變異體。 siRNA分子
本發明係關於用於治療神經退化性病症之基因表現之RNA干擾(RNAi)引發的抑制。本文提供siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA，其靶向相關基因(本文所提及統稱為「siRNA分子」)。該等siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可使細胞(諸如(但不限於)中型多棘神經元、皮質神經元及/或星形細胞)中之基因表現減少或沉默。
RNAi (亦稱為轉錄後基因沉默(PTGS)、抑制或共同遏制)為轉錄後基因沉默方法，其中RNA分子以序列特異性方式抑制基因表現，通常藉由使特異性mRNA分子毀壞。RNAi之活性組分為短/小雙股RNA (dsRNA)，稱為小干擾RNA(siRNA)，其通常含有15-30個核苷酸(例如，19至25、19至24或19-21個核苷酸)及2個核苷酸3'突出端，且其匹配靶基因之核酸序列。此等短RNA物種可藉由內切酶介導之裂解較大dsRNA而在活體內天然產生，且其在哺乳動物細胞中具功能性。
天然表現之小RNA分子，命名為微RNA (miRNA)，藉由調控mRNA之表現誘發基因沉默。含有RNA引發之沉默錯合物(RISC)的miRNA靶向表現與miRNA之5'區域(其稱為種菌區域)中之核苷酸2-7完美序列互補及其3'區域之其他鹼基對的mRNA。基因表現之miRNA介導之向下調控可由裂解靶mRNA、轉譯抑制靶mRNA或mRNA衰變引起。miRNA靶向序列通常位於靶mRNA之3'-UTR中。單個miRNA可靶向超過100個來自各種基因之轉錄物，且可藉由不同miRNA靶向一個mRNA。
靶向特異性mRNA之siRNA雙螺旋體或dsRNA可在活體外設計及合成，且引入用於活化RNAi過程之細胞中。Elbashir等人證明21-核苷酸siRNA雙螺旋體(稱為小干擾RNA)能夠在哺乳動物細胞中實現有效及特異性基因阻斷基因表現而不誘發免疫反應(Elbashir SM等人, Nature, 2001, 411, 494-498)。由於此初始報導，藉由siRNA之轉錄後基因沉默迅速出現為用於哺乳動物細胞中基因分析之有效工具，且可能產生新穎治療法。
經設計以靶向編碼多麩醯胺酸重複蛋白質(其引起多麩醯胺酸擴展疾病，諸如亨廷頓氏症(Huntington's Disease))之核酸序列的RNAi分子描述於美國專利第9,169,483號及第9,181,544號及國際專利公開案第WO2015179525號中，該等案之各者的內容以全文引用之方式併入本文中。美國專利第9,169,483號及第9,181,544號及國際專利公開案第WO2015179525 號各自提供包含RNA之第一股(例如，15個連續核苷酸)及RNA之第二股(例如，與至少12個第一股之連續核苷酸互補)的分離RNA雙螺旋體，其中RNA雙螺旋體之長度為約15至30個鹼基對。RNA之第一股及RNA之第二股可操作地藉由RNA環(約4至50個核苷酸)連接以形成髮夾結構，其可插入表現卡匣中。環部分之非限制性實例包括美國專利第9,169,483號的SEQ ID NO: 9-14，該案的內容以全文引用之方式併入本文中。可用於形成RNA雙螺旋體(全序列或序列之一部分)的RNA之股之非限制性實例包括美國專利第9,169,483號的SEQ ID NO: 1-8及美國專利第9,181,544號的SEQ ID NO: 1-11、33-59、208-210、213-215及218-221，該等案之各者的內容以全文引用之方式併入本文中。RNAi分子之非限制性實例包括美國專利第9,169,483號的SEQ ID NO: 1-8、美國專利第9,181,544號的SEQ ID NO: 1-11、33-59、208-210、213-215及218-221及國際專利公開案第WO2015179525號的SEQ ID NO: 1、6、7及35-38，該等案之各者的內容以全文引用之方式併入本文中。
活體外合成之siRNA分子可引入細胞中以活化RNAi。可組裝類似於內源性dsRNA的外源性siRNA雙螺旋體在其引入細胞中時以形成RNA引發之沉默錯合物(RISC)、與RNA序列(其與siRNA雙螺旋體之兩股中之一者(亦即，反義股)互補)相互作用的多單元錯合物。在過程期間，siRNA之有義股(或隨從股)自錯合物損失，而siRNA之反義股(或引導股)與其互補去氧核酸匹配。特定言之，含有RISC錯合物之siRNA之靶為表現完美序列互補的mRNA。隨後，siRNA介導之基因沉默藉由裂解、釋放及降解靶而出現。
與使用單股(ss)-siRNA(例如，反義股RNA或反義寡核苷酸)相比，在靶RNA毀壞的效率方面，由與靶mRNA同源之有義股及與靶mRNA互補之反義股組成的siRNA雙螺旋體提供多得多的優點。在多數情況下，其需要更高濃度之ss-siRNA以獲得對應雙螺旋體之有效基因沉默效能。
前述分子中之任一者可由病毒基因組編碼。靶向相關基因之 siRNA 雙螺旋體之設計及序列
本發明提供短小干擾RNA (siRNA)雙螺旋(及編碼其之調節多核苷酸)，其靶向mRNA以干擾基因表現及/或蛋白質產生。
本發明之經編碼之siRNA雙螺旋體含有混雜在一起形成雙螺旋結構的反義股及有義股，其中反義股與靶向基因之核酸序列互補，且其中有義股與靶向基因之核酸序列同源。在一些態樣中，反義股之5'端具有5'磷酸酯基，且有義股之3'端含有3'羥基。在其他態樣中，在各股之3'端無、有一個或2個核苷酸突出端。
設計siRNA之一些準則已在此項技術中提出。此等準則通常推薦產生靶向待沉默基因中之區域的19-核苷酸雙螺旋區域、對稱2-3核苷酸3'突出端、5'-磷酸酯及3'-羥基。可控管siRNA序列之其他法則較佳包括但不限於：(i)在反義股之5'端處的A/U；(ii)在有義股之5'端處的G/C；(iii)在反義股之5'末端三分之一中的至少五個A/U殘基；及(iv)缺乏大於長度為9個核苷酸之任何GC延伸。根據該等考慮，連同靶基因之特異性序列，可易於設計必要遏制哺乳動物靶基因表現的高效siRNA分子。
根據本發明，設計靶向相關基因之siRNA分子(例如，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA)。該等siRNA分子可具體言之，遏制基因表現及蛋白質產生。在一些態樣中，siRNA分子經設計且用於選擇性「基因敲除」細胞中之基因變異體，亦即，突變轉錄物。在一些態樣中，siRNA分子經設計且用於選擇性「阻斷基因表現」細胞中之基因變異體。在其他態樣中，siRNA分子能夠抑制或遏制野生型及突變型兩種相關基因。
在一個實施例中，本發明之siRNA分子包含有義股及互補反義股，其中兩種股混雜在一起以形成雙螺旋結構。反義股具有與靶mRNA序列足夠的互補以指導靶特異性RNAi，亦即，siRNA分子具有足夠的序列以藉由RNAi機制或處理觸發靶mRNA之毀壞。
在一個實施例中，本發明之siRNA分子包含有義股及互補反義股，其中兩種股混雜在一起以形成雙螺旋結構，且其中混雜至mRNA之起始位點在mRNA序列上之核苷酸10與7000之間。作為一非限制性實例，起始位點可在靶mRNA序列上之核苷酸10-20、20-30、30-40、40-50、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-70、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150、1150-1200、1200-1250、1250-1300、1300-1350、1350-1400、1400-1450、1450-1500、1500-1550、1550-1600、1600-1650、1650-1700、1700-1750、1750-1800、1800-1850、1850-1900、1900-1950、1950-2000、2000-2050、2050-2100、2100-2150、2150-2200、2200-2250、2250-2300、2300-2350、2350-2400、2400-2450、2450-2500、2500-2550、2550-2600、2600-2650、2650-2700、2700-2750、2750-2800、2800-2850、2850-2900、2900-2950、2950-3000、3000-3050、3050-3100、3100-3150、3150-3200、3200-3250、3250-3300、3300-3350、3350-3400、3400-3450、3450-3500、3500-3550、3550-3600、3600-3650、3650-3700、3700-3750、3750-3800、3800-3850、3850-3900、3900-3950、3950-4000、4000-4050、4050-4100、4100-4150、4150-4200、4200-4250、4250-4300、4300-4350、4350-4400、4400-4450、4450-4500、4500-4550、4550-4600、4600-4650、4650-4700、4700-4750、4750-4800、4800-4850、4850-4900、4900-4950、4950-5000、5000-5050、5050-5100、5100-5150、5150-5200、5200-5250、5250-5300、5300-5350、5350-5400、5400-5450、5450-5500、5500-5550、5550-5600、5600-5650、5650-5700、5700-5750、5750-5800、5800-5850、5850-5900、5900-5950、5950-6000、6000-6050、6050-6100、6100-6150、6150-6200、6200-6250、6250-6300、6300-6350、6350-6400、6400-6450、6450-6500、6500-6550、6550-6600、6600-6650、6650-6700、6700-6750、6750-6800、6800-6850、6850-6900、6900-6950、6950-7000、7000-7050、7050-7100、7100-7150、7150-7200、7200-7250、7250-7300、7300-7350、7350-7400、7400-7450、7450-7500、7500-7550、7550-7600、7600-7650、7650-7700、7700-7750、7750-7800、7800-7850、7850-7900、7900-7950、7950-8000、8000-8050、8050-8100、8100-8150、8150-8200、8200-8250、8250-8300、8300-8350、8350-8400、8400-8450、8450-8500、8500-8550、8550-8600、8600-8650、8650-8700、8700-8750、8750-8800、8800-8850、8850-8900、8900-8950、8950-9000、9000-9050、9050-9100、9100-9150、9150-9200、9200-9250、9250-9300、9300-9350、9350-9400、9400-9450、9450-9500、9500-9550、9550-9600、9600-9650、9650-9700、9700-9750、9750-9800、9800-9850、9850-9900、9900-9950、9950-10000、10000-10050、10050-10100、10100-10150、10150-10200、10200-10250、10250-10300、10300-10350、10350-10400、10400-10450、10450-10500、10500-10550、10550-10600、10600-10650、10650-10700、10700-10750、10750-10800、10800-10850、10850-10900、10900-10950、10950-11000、11050-11100、11100-11150、11150-11200、11200-11250、11250-11300、11300-11350、11350-11400、11400-11450、11450-11500、11500-11550、11550-11600、11600-11650、11650-11700、11700-11750、11750-11800、11800-11850、11850-11900、11900-11950、11950-12000、12000-12050、12050-12100、12100-12150、12150-12200、12200-12250、12250-12300、12300-12350、12350-12400、12400-12450、12450-12500、12500-12550、12550-12600、12600-12650、12650-12700、12700-12750、12750-12800、12800-12850、12850-12900、12900-12950、12950-13000、13050-13100、13100-13150、13150-13200、13200-13250、13250-13300、13300-13350、13350-13400、13400-13450及13450-13500之間。作為又一非限制性實例，起始位點可為靶mRNA序列上之核苷酸10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1375、1376、1377、1378、1379、1380、1381、1382、1383、1384、1385、1386、1387、1388、1389、1390、1391、1392、1393、1394、1395、1396、1397、1398、1399、1400、1401、1402、1403、1404、1405、1406、1407、1408、1409、1410、1411、1412、1413、1414、1415、1416、1417、1418、1419、1420、1421、1422、1423、1424、1425、1426、1427、1428、1429、1430、1431、1432、1433、1434、1435、1436、1437、1438、1439、1440、1441、1442、1443、1444、1445、1446、1447、1448、1449、1450、1660、1661、1662、1663、1664、1665、1666、1667、1668、1669、1670、1671、1672、1673、1674、1675、2050、2051、2052、2053、2054、2055、2056、2057、2058、2059、2060、2061、2062、2063、2064、2065、2066、2067、2068、2069、2070、2071、2072、2073、2074、2075、2076、2077、2078、2079、2080、2081、2082、2083、2084、2085、2086、2087、2088、2089、2090、2091、2092、2093、2094、2095、2096、2097、2098、2099、2100、2580、2581、2582、2583、2584、2585、2586、2587、2588、2589、2590、2591、2592、2593、2594、2595、2596、2597、2598、2599、2600、2601、2602、2603、2604、2605、4525、4526、4527、4528、4529、4530、4531、4532、4533、4534、4535、4536、4537、4538、4539、4540、4541、4542、4543、4544、4545、4546、4547、4548、4549、4550、4575、4576、4577、4578、4579、4580、4581、4582、4583、4584、4585、4586、4587、4588、4589、4590、4591、4592、4593、4594、4595、4596、4597、4598、4599、4600、4850、4851、4852、4853、4854、4855、4856、4857、4858、4859、4860、4861、4862、4863、4864、4865、4866、4867、4868、4869、4870、4871、4872、4873、4874、4875、4876、4877、4878、4879、4880、4881、4882、4883、4884、4885、4886、4887、4888、4889、4890、4891、4892、4893、4894、4895、4896、4897、4898、4899、4900、5460、5461、5462、5463、5464、5465、5466、5467、5468、5469、5470、5471、5472、5473、5474、5475、5476、5477、5478、5479、5480、6175、6176、6177、6178、6179、6180、6181、6182、6183、6184、6185、6186、6187、6188、6189、6190、6191、6192、6193、6194、6195、6196、6197、6198、6199、6200、6315、6316、6317、6318、6319、6320、6321、6322、6323、6324、6325、6326、6327、6328、6329、6330、6331、6332、6333、6334、6335、6336、6337、6338、6339、6340、6341、6342、6343、6344、6345、6600、6601、6602、6603、6604、6605、6606、6607、6608、6609、6610、6611、6612、6613、6614、6615、6725、6726、6727、6728、6729、6730、6731、6732、6733、6734、6735、6736、6737、6738、6739、6740、6741、6742、6743、6744、6745、6746、6747、6748、6749、6750、6751、6752、6753、6754、6755、6756、6757、6758、6759、6760、6761、6762、6763、6764、6765、6766、6767、6768、6769、6770、6771、6772、6773、6774、6775、7655、7656、7657、7658、7659、7660、7661、7662、7663、7664、7665、7666、7667、7668、7669、7670、7671、7672、8510、8511、8512、8513、8514、8515、8516、8715、8716、8717、8718、8719、8720、8721、8722、8723、8724、8725、8726、8727、8728、8729、8730、8731、8732、8733、8734、8735、8736、8737、8738、8739、8740、8741、8742、8743、8744、8745、9250、9251、9252、9253、9254、9255、9256、9257、9258、9259、9260、9261、9262、9263、9264、9265、9266、9267、9268、9269、9270、9480、9481、9482、9483、9484、9485、9486、9487、9488、9489、9490、9491、9492、9493、9494、9495、9496、9497、9498、9499、9500、9575、9576、9577、9578、9579、9580、9581、9582、9583、9584、9585、9586、9587、9588、9589、9590、10525、10526、10527、10528、10529、10530、10531、10532、10533、10534、10535、10536、10537、10538、10539、10540、11545、11546、11547、11548、11549、11550、11551、11552、11553、11554、11555、11556、11557、11558、11559、11560、11875、11876、11877、11878、11879、11880、11881、11882、11883、11884、11885、11886、11887、11888、11889、11890、11891、11892、11893、11894、11895、11896、11897、11898、11899、11900、11915、11916、11917、11918、11919、11920、11921、11922、11923、11924、11925、11926、11927、11928、11929、11930、11931、11932、11933、11934、11935、11936、11937、11938、11939、11940、13375、13376、13377、13378、13379、13380、13381、13382、13383、13384、13385、13386、13387、13388、13389及13390。
在一些實施例中，反義股及靶mRNA序列具有100%的互補。反義股可與靶mRNA序列之任何部分互補。
在其他實施例中，反義股及標靶mRNA序列包含至少一種失配。作為一非限制性實例，反義股及靶mRNA序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-99%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-99%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-99%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%的互補。
在一個實施例中，siRNA或dsRNA包括至少兩個彼此互補的序列。
根據本發明，siRNA分子之長度為約10-50或更多個核苷酸，亦即各股包含10-50個核苷酸(或核苷酸類似物)。較佳地，在各股中siRNA分子之長度為約15-30個，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸，其中各股中之一者與靶區域充分互補。在一個實施例中，siRNA分子之各股之長度為約19至25、19至24或19至21個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為19個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為20個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為21個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為22個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為23個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為24個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為25個核苷酸。
在一些實施例中，本發明之siRNA分子可為包含約19個核苷酸至約25個核苷酸及3'端之兩個突出核苷酸的合成RNA雙螺旋體。在一些態樣中，siRNA分子可為未經修飾之RNA分子。在其他態樣中，siRNA分子可含有至少一種經修飾之核苷酸，諸如鹼、糖或主鏈修飾。
在一個實施例中，本發明之siRNA分子可包含反義序列及有義序列或其片段或變異體。作為一非限制性實例，反義序列及有義序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-99%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-99%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-99%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%的互補。
在其他實施例中，本發明之siRNA分子可在質體載體、AAV顆粒、病毒基因組或其他核酸表現載體中經編碼以傳遞至細胞。
DNA表現質粒可用於在細胞中穩定地表現本發明之siRNA雙螺旋體或dsRNA且實現靶基因表現之長期抑制。在一個態樣中，siRNA雙螺旋體之有義股及反義股通常藉由短間隔子序列連接，使得表現稱為短髮夾RNA (shRNA)之莖環結構。髮夾藉由內切酶識別且裂解，因此產生成熟siRNA分子。
根據本發明，產生包含編碼靶向mRNA之siRNA分子的核酸之AAV顆粒，AAV血清型可為表1中所列出之血清型中的任一種。AAV血清型之非限制性實例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8、AAV-DJ、AAV-PHP.A及/或AAV-PHP.B、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5及其變異體。
在一些實施例中，本發明之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA遏制(或分解)靶mRNA。因此，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可用於實質上抑制細胞，例如神經元中之基因表現。在一些態樣中，基因表現之抑制係指抑制了至少約20%，較佳抑制了至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。因此，靶向基因之蛋白質產物可抑制了至少約20%，較佳抑制了至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
在一個實施例中，siRNA分子包含位於引導股中之靶的miRNA種菌匹配。在另一實施例中，siRNA分子包含位於隨從股中之靶的miRNA種菌匹配。在又一實施例中，靶向相關基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA不包含位於引導或隨從股中的靶之種菌匹配。
在一個實施例中，靶向相關基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA對於引導股可幾乎無顯著全長脫靶效果。在另一實施例中，靶向相關基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA對於隨從股可幾乎無顯著全長脫靶效果。靶向相關基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA對於隨從股可具有低於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、1-5%、2-6%、3-7%、4-8%、5-9%、5-10%、6-10%、5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、15-30%、15-40%、15-45%、20-40%、20-50%、25-50%、30-40%、30-50%、35-50%、40-50%、45-50%的全長脫靶效果。在又一實施例中，靶向相關基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA對於引導股或隨從股可幾乎無顯著全長脫靶效果。靶向相關基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA對於引導或隨從股可具有低於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、1-5%、2-6%、3-7%、4-8%、5-9%、5-10%、6-10%、5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、15-30%、15-40%、15-45%、20-40%、20-50%、25-50%、30-40%、30-50%、35-50%、40-50%、45-50%的全長脫靶效果。
在一個實施例中，靶向相關基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可具有活體外高活性。在另一實施例中，siRNA分子可具有活體外低活性。在又一實施例中，靶向相關基因之siRNA雙螺旋體或dsRNA可具有活體外高引導股活性及低隨從股活性。
在一個實施例中，siRNA分子具有活體外高引導股活性及低隨從股活性。藉由引導股之靶阻斷基因表現(KD)可為至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、99.5%或100%。藉由引導股之靶阻斷基因表現可為40-50%、45-50%、50-55%、50-60%、60-65%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、60-99%、60-99.5%、60-100%、65-70%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、65-99%、65-99.5%、65-100%、70-75%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、70-99%、70-99.5%、70-100%、75-80%、75-85%、75-90%、75-95%、75-99%、75-99.5%、75-100%、80-85%、80-90%、80-95%、80-99%、80-99.5%、80-100%、85-90%、85-95%、85-99%、85-99.5%、85-100%、90-95%、90-99%、90-99.5%、90-100%、95-99%、95-99.5%、95-100%、99-99.5%、99-100%或99.5-100%。作為一非限制性實例，藉由引導股之靶阻斷基因表現(KD)大於70%。作為一非限制性實例，藉由引導股之靶阻斷基因表現(KD)大於60%。
在一個實施例中，設計siRNA雙螺旋體，因此不存在有義或反義序列至非相關基因序列之miRNA種菌匹配。
在一個實施例中，最接近之脫靶的引導股之IC50 大於100乘以靶基因上的引導股之IC50 。作為一非限制性實例，若最接近之脫靶的引導股之IC50 大於100乘以靶的引導股之IC50 ，則稱siRNA分子具有抑制活體外相關基因之高引導股選擇率。
在一個實施例中，引導股之5'處理在5'端以至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%之活體外或活體內時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少99%之活體外時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少99%之活體內時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少90%之活體外時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少90%之活體內時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少85%之活體外時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少85%之活體內時間具有正確開始(n)。
在一個實施例中，所表現之引導與隨從(G:P) (亦稱為反義與有義)股比率在活體外或活體內為1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:10、2:9、2:8、2:7、2:6、2:5、2:4、2:3、2:2、2:1、3:10、3:9、3:8、3:7、3:6、3:5、3:4、3:3、3:2、3:1、4:10、4:9、4:8、4:7、4:6、4:5、4:4、4:3、4:2、4:1、5:10、5:9、5:8、5:7、5:6、5:5、5:4、5:3、5:2、5:1、6:10、6:9、6:8、6:7、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1、7:10、7:9、7:8、7:7、7:6、7:5、7:4、7:3、7:2、7:1、8:10、8:9、8:8、8:7、8:6、8:5、8:4、8:3、8:2、8:1、9:10、9:9、9:8、9:7、9:6、9:5、9:4、9:3、9:2、9:1、10:10、10:9、10:8、10:7、10:6、10:5、10:4、10:3、10:2、10:1、1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或 99:1。引導與隨從比率係指在胞內處理pri-微RNA之後引導股與隨從股之比率。舉例而言，80:20之引導比隨從比率將在由前驅體處理的每2個隨從股中具有8個引導股。作為一非限制性實例，活體外引導股比隨從股比率為8:2。作為一非限制性實例，活體內引導股比隨從股比率為8:2。作為一非限制性實例，活體外引導股比隨從股比率為9:1。作為一非限制性實例，活體內引導股比隨從股比率為9:1。
在一個實施例中，所表現之引導比隨從(G:P) (亦稱為反義比有義)股比率大於1。
在一個實施例中，所表現之引導比隨從(G:P) (亦稱為反義比有義)股比率大於2。
在一個實施例中，所表現之引導比隨從(G:P) (亦稱為反義比有義)股比率大於5。
在一個實施例中，所表現之引導比隨從(G:P) (亦稱為反義比有義)股比率大於10。
在一個實施例中，所表現之引導比隨從(G:P) (亦稱為反義比有義)股比率大於20。
在一個實施例中，所表現之引導比隨從(G:P) (亦稱為反義比有義)股比率大於50。
在一個實施例中，所表現之引導比隨從(G:P) (亦稱為反義比有義)股比率為至少3:1。
在一個實施例中，所表現之引導比隨從(G:P) (亦稱為反義比有義)股比率為至少5:1。
在一個實施例中，所表現之引導比隨從(G:P) (亦稱為反義比有義)股比率為至少10:1。
在一個實施例中，所表現之引導比隨從(G:P) (亦稱為反義比有義)股比率為至少20:1。
在一個實施例中，所表現之引導比隨從(G:P) (亦稱為反義比有義)股比率為至少50:1。
在一個實施例中，活體外或活體內所表現之隨從比引導(P:G) (亦稱為有義比反義)股比率為1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:10、2:9、2:8、2:7、2:6、2:5、2:4、2:3、2:2、2:1、3:10、3:9、3:8、3:7、3:6、3:5、3:4、3:3、3:2、3:1、4:10、4:9、4:8、4:7、4:6、4:5、4:4、4:3、4:2、4:1、5:10、5:9、5:8、5:7、5:6、5:5、5:4、5:3、5:2、5:1、6:10、6:9、6:8、6:7、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1、7:10、7:9、7:8、7:7、7:6、7:5、7:4、7:3、7:2、7:1、8:10、8:9、8:8、8:7、8:6、8:5、8:4、8:3、8:2、8:1、9:10、9:9、9:8、9:7、9:6、9:5、9:4、9:3、9:2、9:1、10:10、10:9、10:8、10:7、10:6、10:5、10:4、10:3、10:2、10:1、1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或99:1。隨從比引導比率係指在胞內處理pri-微RNA之後隨從股比引導股之比率。舉例而言，80:20之隨從比引導比率將在由前驅體處理的每2個引導股中具有8個隨從股。作為一非限制性實例，活體外隨從股比引導股比率為80:20。作為一非限制性實例，活體內隨從股比引導股比率為80:20。作為一非限制性實例，活體外隨從股比引導股比率為8:2。作為一非限制性實例，活體內隨從股比引導股比率為8:2。作為一非限制性實例，活體外隨從股比引導股比率為9:1。作為一非限制性實例，活體內隨從股比引導股比率為9:1。
在一個實施例中，所表現之隨從比引導(P:G) (亦稱為有義比反義)股比率大於1。
在一個實施例中，所表現之隨從比引導(P:G) (亦稱為有義比反義)股比率大於2。
在一個實施例中，所表現之隨從比引導(P:G) (亦稱為有義比反義)股比率大於5。
在一個實施例中，所表現之隨從比引導(P:G) (亦稱為有義比反義)股比率大於10。
在一個實施例中，所表現之隨從比引導(P:G) (亦稱為有義比反義)股比率大於20。
在一個實施例中，所表現之隨從比引導(P:G) (亦稱為有義比反義)股比率大於50。
在一個實施例中，所表現之隨從比引導(P:G) (亦稱為有義比反義)股比率為至少3:1。
在一個實施例中，所表現之隨從比引導(P:G) (亦稱為有義比反義)股比率為至少5:1。
在一個實施例中，所表現之隨從比引導(P:G) (亦稱為有義比反義)股比率為至少10:1。
在一個實施例中，所表現之隨從比引導(P:G) (亦稱為有義比反義)股比率為至少20:1。
在一個實施例中，所表現之隨從比引導(P:G) (亦稱為有義比反義)股比率為至少50:1。
在一個實施例中，在量測處理時，當pri-微RNA或pre-微RNA (但此項技術中已知及本文所述之方法)表明大於引導股比隨從股比率的2倍時，隨從-引導股雙螺旋體視為有效的。作為一非限制性實例，當量測處理時，pri-微RNA或pre-微RNA表明大於2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、或2至5倍、2至10倍、2至15倍、3至5倍、3至10倍、3至15倍、4至5倍、4至10倍、4至15倍、5至10倍、5至15倍、6至10倍、6至15倍、7至10倍、7至15倍、8至10倍、8至15倍、9至10倍、9至15倍、10至15倍、11至15倍、12至15倍、13至15倍、或14至15倍的引導股比隨從股比率。
在一個實施例中，編碼dsRNA之載體基因組包含為至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或超過99%的構築體之全長的序列。作為一非限制性實例，載體基因組包含為至少80%的構築體之全長序列的序列。
在一個實施例中，siRNA分子可用於藉由靶向相關基因序列上之至少一個外顯子使野生型或突變型相關基因沉默。外顯子可為外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5、外顯子6、外顯子7、外顯子8、外顯子9、外顯子10、外顯子11、外顯子12、外顯子13、外顯子14、外顯子15、外顯子16、外顯子17、外顯子18、外顯子19、外顯子20、外顯子21、外顯子22、外顯子23、外顯子24、外顯子25、外顯子26、外顯子27、外顯子28、外顯子29、外顯子30、外顯子31、外顯子32、外顯子33、外顯子34、外顯子35、外顯子36、外顯子37、外顯子38、外顯子39、外顯子40、外顯子41、外顯子42、外顯子43、外顯子44、外顯子45、外顯子46、外顯子47、外顯子48、外顯子49、外顯子50、外顯子51、外顯子52、外顯子53、外顯子54、外顯子55、外顯子56、外顯子57、外顯子58、外顯子59、外顯子60、外顯子61、外顯子62、外顯子63、外顯子64、外顯子65、外顯子66及/或外顯子67。靶向 HTT 基因之 siRNA 雙螺旋體之設計及序列
本發明提供短小干擾RNA (siRNA)雙螺旋體(及編碼其之調節多核苷酸)，其靶向HTT mRNA以干擾HTT基因表現及/或HTT蛋白質產生。
本發明之經編碼之siRNA雙螺旋體含有混雜在一起形成雙螺旋結構的反義股及有義股，其中反義股與靶向HTT基因之核酸序列互補，且其中有義股與靶向HTT基因之核酸序列同源。在一些態樣中，反義股之5'端具有5'磷酸酯基，且有義股之3'端含有3'羥基。在其他態樣中，在各股之3'端無、有一個或2個核苷酸突出端。
設計siRNA之一些準則已在此項技術中提出。此等準則通常推薦產生靶向待沉默基因中之區域的19-核苷酸雙螺旋區域、對稱2-3核苷酸3'突出端、5'-磷酸酯及3'-羥基。可控管siRNA序列之其他法則較佳包括但不限於：(i)在反義股之5'端處的A/U；(ii)在有義股之5'端處的G/C；(iii)在反義股之5'末端三分之一中的至少五個A/U殘基；及(iv)缺乏大於長度為9個核苷酸之任何GC延伸。根據該等考慮，連同靶基因之特異性序列，可易於設計必要遏制Htt基因表現的高效siRNA分子。
根據本發明，設計靶向HTT基因之siRNA分子(例如，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA)。該等siRNA分子可具體言之，遏制HTT基因表現及蛋白質產生。在一些態樣中，siRNA分子經設計且用於選擇性「基因敲除」細胞中之HTT基因變異體，亦即，在患有HD疾病之患者中經識別的突變HTT轉錄物。在一些態樣中，siRNA分子經設計且用於選擇性「阻斷基因表現」細胞中之HTT基因變異體。在其他態樣中，siRNA分子能夠抑制或遏制野生型及突變HTT基因。
在一個實施例中，本發明之siRNA分子包含有義股及互補反義股，其中兩種股混雜在一起以形成雙螺旋結構。反義股具有與HTT mRNA序列足夠的互補以指導靶特異性RNAi，亦即，siRNA分子具有足夠的序列以藉由RNAi機制或處理觸發靶mRNA之毀壞。
在一個實施例中，本發明之siRNA分子包含有義股及互補反義股，其中兩種股混雜在一起以形成雙螺旋結構，且其中混雜至HTT mRNA之起始位點在HTT mRNA序列上之核苷酸100與7000之間。作為一非限制性實例，起始位點可在HTT mRNA序列上之核苷酸100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-70、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150、1150-1200、1200-1250、1250-1300、1300-1350、1350-1400、1400-1450、1450-1500、1500-1550、1550-1600、1600-1650、1650-1700、1700-1750、1750-1800、1800-1850、1850-1900、1900-1950、1950-2000、2000-2050、2050-2100、2100-2150、2150-2200、2200-2250、2250-2300、2300-2350、2350-2400、2400-2450、2450-2500、2500-2550、2550-2600、2600-2650、2650-2700、2700-2750、2750-2800、2800-2850、2850-2900、2900-2950、2950-3000、3000-3050、3050-3100、3100-3150、3150-3200、3200-3250、3250-3300、3300-3350、3350-3400、3400-3450、3450-3500、3500-3550、3550-3600、3600-3650、3650-3700、3700-3750、3750-3800、3800-3850、3850-3900、3900-3950、3950-4000、4000-4050、4050-4100、4100-4150、4150-4200、4200-4250、4250-4300、4300-4350、4350-4400、4400-4450、4450-4500、4500-4550、4550-4600、4600-4650、4650-4700、4700-4750、4750-4800、4800-4850、4850-4900、4900-4950、4950-5000、5000-5050、5050-5100、5100-5150、5150-5200、5200-5250、5250-5300、5300-5350、5350-5400、5400-5450、5450-5500、5500-5550、5550-5600、5600-5650、5650-5700、5700-5750、5750-5800、5800-5850、5850-5900、5900-5950、5950-6000、6000-6050、6050-6100、6100-6150、6150-6200、6200-6250、6250-6300、6300-6350、6350-6400、6400-6450、6450-6500、6500-6550、6550-6600、6600-6650、6650-6700、6700-6750、6750-6800、6800-6850、6850-6900、6900-6950、6950-7000、7000-7050、7050-7100、7100-7150、7150-7200、7200-7250、7250-7300、7300-7350、7350-7400、7400-7450、7450-7500、7500-7550、7550-7600、7600-7650、7650-7700、7700-7750、7750-7800、7800-7850、7850-7900、7900-7950、7950-8000、8000-8050、8050-8100、8100-8150、8150-8200、8200-8250、8250-8300、8300-8350、8350-8400、8400-8450、8450-8500、8500-8550、8550-8600、8600-8650、8650-8700、8700-8750、8750-8800、8800-8850、8850-8900、8900-8950、8950-9000、9000-9050、9050-9100、9100-9150、9150-9200、9200-9250、9250-9300、9300-9350、9350-9400、9400-9450、9450-9500、9500-9550、9550-9600、9600-9650、9650-9700、9700-9750、9750-9800、9800-9850、9850-9900、9900-9950、9950-10000、10000-10050、10050-10100、10100-10150、10150-10200、10200-10250、10250-10300、10300-10350、10350-10400、10400-10450、10450-10500、10500-10550、10550-10600、10600-10650、10650-10700、10700-10750、10750-10800、10800-10850、10850-10900、10900-10950、10950-11000、11050-11100、11100-11150、11150-11200、11200-11250、11250-11300、11300-11350、11350-11400、11400-11450、11450-11500、11500-11550、11550-11600、11600-11650、11650-11700、11700-11750、11750-11800、11800-11850、11850-11900、11900-11950、11950-12000、12000-12050、12050-12100、12100-12150、12150-12200、12200-12250、12250-12300、12300-12350、12350-12400、12400-12450、12450-12500、12500-12550、12550-12600、12600-12650、12650-12700、12700-12750、12750-12800、12800-12850、12850-12900、12900-12950、12950-13000、13050-13100、13100-13150、13150-13200、13200-13250、13250-13300、13300-13350、13350-13400、13400-13450及13450-13500之間。作為又一非限制性實例，起始位點可為HTT mRNA序列上之核苷酸315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、1375、1376、1377、1378、1379、1380、1381、1382、1383、1384、1385、1386、1387、1388、1389、1390、1391、1392、1393、1394、1395、1396、1397、1398、1399、1400、1401、1402、1403、1404、1405、1406、1407、1408、1409、1410、1411、1412、1413、1414、1415、1416、1417、1418、1419、1420、1421、1422、1423、1424、1425、1426、1427、1428、1429、1430、1431、1432、1433、1434、1435、1436、1437、1438、1439、1440、1441、1442、1443、1444、1445、1446、1447、1448、1449、1450、1660、1661、1662、1663、1664、1665、1666、1667、1668、1669、1670、1671、1672、1673、1674、1675、2050、2051、2052、2053、2054、2055、2056、2057、2058、2059、2060、2061、2062、2063、2064、2065、2066、2067、2068、2069、2070、2071、2072、2073、2074、2075、2076、2077、2078、2079、2080、2081、2082、2083、2084、2085、2086、2087、2088、2089、2090、2091、2092、2093、2094、2095、2096、2097、2098、2099、2100、2580、2581、2582、2583、2584、2585、2586、2587、2588、2589、2590、2591、2592、2593、2594、2595、2596、2597、2598、2599、2600、2601、2602、2603、2604、2605、4525、4526、4527、4528、4529、4530、4531、4532、4533、4534、4535、4536、4537、4538、4539、4540、4541、4542、4543、4544、4545、4546、4547、4548、4549、4550、4575、4576、4577、4578、4579、4580、4581、4582、4583、4584、4585、4586、4587、4588、4589、4590、4591、4592、4593、4594、4595、4596、4597、4598、4599、4600、4850、4851、4852、4853、4854、4855、4856、4857、4858、4859、4860、4861、4862、4863、4864、4865、4866、4867、4868、4869、4870、4871、4872、4873、4874、4875、4876、4877、4878、4879、4880、4881、4882、4883、4884、4885、4886、4887、4888、4889、4890、4891、4892、4893、4894、4895、4896、4897、4898、4899、4900、5460、5461、5462、5463、5464、5465、5466、5467、5468、5469、5470、5471、5472、5473、5474、5475、5476、5477、5478、5479、5480、6175、6176、6177、6178、6179、6180、6181、6182、6183、6184、6185、6186、6187、6188、6189、6190、6191、6192、6193、6194、6195、6196、6197、6198、6199、6200、6315、6316、6317、6318、6319、6320、6321、6322、6323、6324、6325、6326、6327、6328、6329、6330、6331、6332、6333、6334、6335、6336、6337、6338、6339、6340、6341、6342、6343、6344、6345、6600、6601、6602、6603、6604、6605、6606、6607、6608、6609、6610、6611、6612、6613、6614、6615、6725、6726、6727、6728、6729、6730、6731、6732、6733、6734、6735、6736、6737、6738、6739、6740、6741、6742、6743、6744、6745、6746、6747、6748、6749、6750、6751、6752、6753、6754、6755、6756、6757、6758、6759、6760、6761、6762、6763、6764、6765、6766、6767、6768、6769、6770、6771、6772、6773、6774、6775、7655、7656、7657、7658、7659、7660、7661、7662、7663、7664、7665、7666、7667、7668、7669、7670、7671、7672、8510、8511、8512、8513、8514、8515、8516、8715、8716、8717、8718、8719、8720、8721、8722、8723、8724、8725、8726、8727、8728、8729、8730、8731、8732、8733、8734、8735、8736、8737、8738、8739、8740、8741、8742、8743、8744、8745、9250、9251、9252、9253、9254、9255、9256、9257、9258、9259、9260、9261、9262、9263、9264、9265、9266、9267、9268、9269、9270、9480、9481、9482、9483、9484、9485、9486、9487、9488、9489、9490、9491、9492、9493、9494、9495、9496、9497、9498、9499、9500、9575、9576、9577、9578、9579、9580、9581、9582、9583、9584、9585、9586、9587、9588、9589、9590、10525、10526、10527、10528、10529、10530、10531、10532、10533、10534、10535、10536、10537、10538、10539、10540、11545、11546、11547、11548、11549、11550、11551、11552、11553、11554、11555、11556、11557、11558、11559、11560、11875、11876、11877、11878、11879、11880、11881、11882、11883、11884、11885、11886、11887、11888、11889、11890、11891、11892、11893、11894、11895、11896、11897、11898、11899、11900、11915、11916、11917、11918、11919、11920、11921、11922、11923、11924、11925、11926、11927、11928、11929、11930、11931、11932、11933、11934、11935、11936、11937、11938、11939、11940、13375、13376、13377、13378、13379、13380、13381、13382、13383、13384、13385、13386、13387、13388、13389及13390。
在一些實施例中，反義股及靶向Htt mRNA序列100%的互補。反義股可與靶Htt mRNA序列之任何部分互補。
在其他實施例中，反義股及標靶Htt mRNA序列包含至少一種失配。作為一非限制性實例，反義股及靶Htt mRNA序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-99%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-99%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-99%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%的互補。
在一個實施例中，靶向Htt之siRNA或dsRNA包括至少兩個彼此互補的序列。
根據本發明，靶向Htt之siRNA分子之長度為約10-50或更多個核苷酸，亦即，各股包含10-50個核苷酸(或核苷酸類似物)。較佳地，在各股中siRNA分子之長度為約15-30個，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸，其中各股中之一者與靶區域充分互補。在一個實施例中，siRNA分子之各股之長度為約19至25、19至24或19至21個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為19個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為20個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為21個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為22個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為23個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為24個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為25個核苷酸。
在一些實施例中，靶向Htt之本發明之siRNA分子可為包含約19個核苷酸至約25個核苷酸及3'端之兩個突出核苷酸的合成RNA雙螺旋體。在一些態樣中，siRNA分子可為未經修飾之RNA分子。在其他態樣中，siRNA分子可含有至少一種經修飾之核苷酸，諸如鹼、糖或主鏈修飾。
在一個實施例中，靶向Htt的本發明之siRNA分子可包含核苷酸序列，諸如(但不限於)，表2中之反義(引導)序列或其片段或變異體。作為一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子之反義序列為至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-99%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-99%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-99%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%的表2中之核苷酸序列。作為另一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子之反義序列包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或超過21個表2中的核苷酸序列之連續核苷酸。作為又一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子之反義序列包含表2中的序列之核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21或18至22。表 2 . 反義序列
在一個實施例中，靶向Htt的本發明之siRNA分子可包含核苷酸序列，諸如(但不限於)，表3中的有義(隨從)序列或其片段或變異體。作為一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子之有義序列為至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-99%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-99%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-99%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%的表3中之核苷酸序列。作為另一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子之有義序列包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或超過21個表3中的核苷酸序列之連續核苷酸。作為又一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子之有義序列包含表3中的序列之核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21或18至22。表 3. 有義序列
在一個實施例中，靶向Htt之本發明之siRNA分子可包含來自表2的反義序列及來自表3的有義序列或其片段或變異體。作為一非限制性實例，反義序列及有義序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-99%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-99%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-99%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%的互補。
在一個實施例中，靶向Htt之本發明之siRNA分子可包含如表4-6中所述的有義及反義siRNA雙螺旋體。作為一非限制性實例，對於對內源性HTT基因表現之活體外抑制活性，可測試此等siRNA雙螺旋體。有義序列及反義序列之起始位點與已知為來自NCBI之NM_002111.7 (SEQ ID NO: 1163)的HTT基因序列相比。表 4.HTT dsRNA 之有義股及反義股序列 表 5 . HTT dsRNA 之有義股及反義股序列 表 6 . HTT dsRNA 之反義股及有義股序列
在其他實施例中，靶向Htt之本發明之siRNA分子可在質體載體、AAV顆粒、病毒基因組或其他核酸表現載體中經編碼以傳遞至細胞。
DNA表現質粒可用於在細胞中穩定地表現靶向Htt的本發明之siRNA雙螺旋體或dsRNA且實現靶基因表現之長期抑制。在一個態樣中，siRNA雙螺旋體之有義股及反義股通常藉由短間隔子序列連接，使得表現稱為短髮夾RNA (shRNA)之莖環結構。髮夾藉由內切酶識別且裂解，因此產生成熟siRNA分子。
根據本發明，產生包含編碼靶向HTT mRNA之siRNA分子的核酸之AAV顆粒，AAV血清型可為表1中所列出之血清型中的任一種。AAV血清型之非限制性實例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8、AAV-DJ、AAV-PHP.A及/或AAV-PHP.B及其變異體。
在一些實施例中，本發明之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA遏制(或分解)HTT mRNA。因此，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可用於實質上抑制細胞，例如神經元中之HTT基因表現。在一些態樣中，HTT基因表現之抑制係指抑制了至少約20%，較佳抑制了至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。因此，靶向基因之蛋白質產物可抑制了至少約20%，較佳抑制了至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
根據本發明，siRNA分子經設計且測試其減少經培養細胞中HTT mRNA含量之能力。該等siRNA分子可形成雙螺旋體，諸如(但不限於)，包括表4、表5或表6中所列之彼等雙螺旋體。作為一非限制性實例，siRNA雙螺旋體可為siRNA雙螺旋體ID：D-3500至D-3570。
在一個實施例中，siRNA分子包含位於引導股中之HTT的miRNA種菌匹配。在另一實施例中，siRNA分子包含位於隨從股中之HTT的miRNA種菌匹配。在又一實施例中，靶向HTT基因的siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA不包含位於引導股或隨從股中之種菌匹配。
在一個實施例中，靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA對於引導股可幾乎無顯著全長脫靶效果。在另一實施例中，靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA對於隨從股可幾乎無顯著全長脫靶效果。靶向HTT基因的siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA對於隨從股可具有低於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%,11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、1-5%、2-6%、3-7%、4-8%、5-9%、5-10%、6-10%、5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、15-30%、15-40%、15-45%、20-40%、20-50%、25-50%、30-40%、30-50%、35-50%、40-50%、45-50%的全長脫靶效果。在又一實施例中，靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA對於引導股或隨從股可幾乎無顯著全長脫靶效果。靶向HTT基因的siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA對於引導股或隨從股可具有低於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%,11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、1-5%、2-6%、3-7%、4-8%、5-9%、5-10%、6-10%、5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、15-30%、15-40%、15-45%、20-40%、20-50%、25-50%、30-40%、30-50%、35-50%、40-50%、45-50%的全長脫靶效果。
在一個實施例中，靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可具有活體外高活性。在另一實施例中，siRNA分子可具有活體外低活性。在又一實施例中，靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體或dsRNA可具有活體外高引導股活性及低隨從股活性。
在一個實施例中，靶向HTT之siRNA分子具有活體外高引導股活性及低隨從股活性。藉由引導股之靶阻斷基因表現(KD)可為至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、99.5%或100%。藉由引導股之靶阻斷基因表現可為40-50%、45-50%、50-55%、50-60%、60-65%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、60-99%、60-99.5%、60-100%、65-70%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、65-99%、65-99.5%、65-100%、70-75%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、70-99%、70-99.5%、70-100%、75-80%、75-85%、75-90%、75-95%、75-99%、75-99.5%、75-100%、80-85%、80-90%、80-95%、80-99%、80-99.5%、80-100%、85-90%、85-95%、85-99%、85-99.5%、85-100%、90-95%、90-99%、90-99.5%、90-100%、95-99%、95-99.5%、95-100%、99-99.5%、99-100%或99.5-100%。作為一非限制性實例，藉由引導股之靶阻斷基因表現(KD)大於70%。作為一非限制性實例，藉由引導股之靶阻斷基因表現(KD)大於60%。
在一個實施例中，設計靶向HTT之siRNA雙螺旋體，因此不存在有義序列或反義序列至非Htt序列之miRNA種菌匹配。
在一個實施例中，對於最接近之脫靶之靶向HTT的siRNA雙螺旋體中之引導股之IC50 大於100乘以靶基因Htt上的引導股之IC50 。作為一非限制性實例，若最接近之脫靶的引導股之IC50 大於100乘以靶的引導股之IC50 ，則稱siRNA分子具有抑制活體外Htt之高引導股選擇率。
在一個實施例中，靶向HTT的siRNA雙螺旋體之引導股之5'處理在5'端以至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%之活體外或活體內時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少99%之活體外時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少99%之活體內時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少90%之活體外時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少90%之活體內時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少85%之活體外時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少85%之活體內時間具有正確開始(n)。
在一個實施例中，在量測處理時，當pri-微RNA或pre-微RNA藉由但此項技術中已知及本文所述之方法表明大於引導股比隨從股比率的2倍時，HTT之隨從-引導股雙螺旋體視為有效的。作為一非限制性實例，當量測處理時，pri-微RNA或pre-微RNA表明大於2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、或2至5倍、2至10倍、2至15倍、3至5倍、3至10倍、3至15倍、4至5倍、4至10倍、4至15倍、5至10倍、5至15倍、6至10倍、6至15倍、7至10倍、7至15倍、8至10倍、8至15倍、9至10倍、9至15倍、10至15倍、11至15倍、12至15倍、13至15倍、或14至15倍的引導股比隨從股比率。
在一個實施例中，siRNA分子可用於藉由靶向htt序列上之至少一個外顯子使野生型或突變型HTT沉默。外顯子可為外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5、外顯子6、外顯子7、外顯子8、外顯子9、外顯子10、外顯子11、外顯子12、外顯子13、外顯子14、外顯子15、外顯子16、外顯子17、外顯子18、外顯子19、外顯子20、外顯子21、外顯子22、外顯子23、外顯子24、外顯子25、外顯子26、外顯子27、外顯子28、外顯子29、外顯子30、外顯子31、外顯子32、外顯子33、外顯子34、外顯子35、外顯子36、外顯子37、外顯子38、外顯子39、外顯子40、外顯子41、外顯子42、外顯子43、外顯子44、外顯子45、外顯子46、外顯子47、外顯子48、外顯子49、外顯子50、外顯子51、外顯子52、外顯子53、外顯子54、外顯子55、外顯子56、外顯子57、外顯子58、外顯子59、外顯子60、外顯子61、外顯子62、外顯子63、外顯子64、外顯子65、外顯子66及/或外顯子67。作為一非限制性實例，siRNA分子可用於藉由靶向外顯子1使野生型或突變型HTT沉默。作為另一非限制性實例，siRNA分子可用於藉由靶向除外顯子1外的外顯子使野生型或突變型HTT沉默。作為另一非限制性實例，siRNA分子可用於藉由靶向外顯子50使野生型或突變型HTT沉默。作為另一非限制性實例，siRNA分子可用於藉由靶向外顯子67使野生型或突變型HTT沉默。
在一個實施例中，siRNA分子可用於藉由靶向htt序列上之至少一個外顯子使野生型及/或突變型HTT沉默。外顯子可為外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5、外顯子6、外顯子7、外顯子8、外顯子9、外顯子10、外顯子11、外顯子12、外顯子13、外顯子14、外顯子15、外顯子16、外顯子17、外顯子18、外顯子19、外顯子20、外顯子21、外顯子22、外顯子23、外顯子24、外顯子25、外顯子26、外顯子27、外顯子28、外顯子29、外顯子30、外顯子31、外顯子32、外顯子33、外顯子34、外顯子35、外顯子36、外顯子37、外顯子38、外顯子39、外顯子40、外顯子41、外顯子42、外顯子43、外顯子44、外顯子45、外顯子46、外顯子47、外顯子48、外顯子49、外顯子50、外顯子51、外顯子52、外顯子53、外顯子54、外顯子55、外顯子56、外顯子57、外顯子58、外顯子59、外顯子60、外顯子61、外顯子62、外顯子63、外顯子64、外顯子65、外顯子66及/或外顯子67。作為一非限制性實例，siRNA分子可用於藉由靶向外顯子1使野生型及/或突變型HTT沉默。作為另一非限制性實例，siRNA分子可用於藉由靶向除外顯子1外的外顯子使野生型及/或突變型HTT沉默。作為另一非限制性實例，siRNA分子可用於藉由靶向外顯子50使野生型及/或突變型HTT沉默。作為另一非限制性實例，siRNA分子可用於藉由靶向外顯子67使野生型及/或突變型HTT沉默。靶向 SOD1 基因之 siRNA 雙螺旋體之設計及序列
本發明提供短小干擾RNA (siRNA)雙螺旋體(及編碼其之調節多核苷酸)，其靶向SOD1 mRNA以干擾SOD1基因表現及/或SOD1蛋白質產生。
本發明之經編碼之siRNA雙螺旋體含有混雜在一起形成雙螺旋結構的反義股及有義股，其中反義股與靶向SOD1基因之核酸序列互補，且其中有義股與靶向SOD1基因之核酸序列同源。在一些態樣中，反義股之5'端具有5'磷酸酯基，且有義股之3'端含有3'羥基。在其他態樣中，在各股之3'端無、有一個或2個核苷酸突出端。
設計siRNA之一些準則已在此項技術中提出。此等準則通常推薦產生靶向待沉默基因中之區域的19-核苷酸雙螺旋區域、對稱2-3核苷酸3'突出端、5'-磷酸酯及3'-羥基。可控管siRNA序列之其他法則較佳包括但不限於：(i)在反義股之5'端處的A/U；(ii)在有義股之5'端處的G/C；(iii)在反義股之5'末端三分之一中的至少五個A/U殘基；及(iv)缺乏大於長度為9個核苷酸之任何GC延伸。根據該等考慮，連同靶基因之特異性序列，可易於設計必要遏制SOD1基因表現的高效siRNA分子。
根據本發明，設計靶向SOD1基因之siRNA分子(例如，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA)。該等siRNA分子可具體言之，遏制SOD1基因表現及蛋白質產生。在一些態樣中，siRNA分子經設計且用於選擇性「基因敲除」細胞中之SOD1基因變異體，亦即，在患有ALS疾病之患者中經識別的突變SOD1轉錄物。在一些態樣中，siRNA分子經設計且用於選擇性「阻斷基因表現」細胞中之SOD1基因變異體。在其他態樣中，siRNA分子能夠抑制或遏制野生型及突變SOD1基因。
在一個實施例中，本發明之siRNA分子包含有義股及互補反義股，其中兩種股混雜在一起以形成雙螺旋結構。反義股具有與SOD1 mRNA序列足夠的互補以指導靶特異性RNAi，亦即，siRNA分子具有足夠的序列以藉由RNAi機制或處理觸發靶mRNA之毀壞。
在一個實施例中，本發明之siRNA分子包含有義股及互補反義股，其中兩種股混雜在一起以形成雙螺旋結構，且其中混雜至SOD1 mRNA之起始位點在SOD1 mRNA序列上之核苷酸15與1000之間。作為一非限制性實例，起始位點可在SOD1 mRNA序列上之核苷酸15-25、15-50、15-75、15-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-70、750-800、800-850、850-900、900-950及950-1000之間。作為又一非限制性實例，起始位點可為SOD1 mRNA序列上之核苷酸26、27、28、29、30、32、33、34、35、36、37、74、76、77、78、149、153、157、160、177、192、193、195、196、197、198、199、206、209、210、239、241、261、263、264、268、269、276、278、281、284、290、291、295、296、316、317、329、330、337、350、351、352、354、357、358、364、375、378、383、384、390、392、395、404、406、417、418、469、470、475、476、480、487、494、496、497、501、504、515、518、522、523、524、552、554、555、562、576、577、578、579、581、583、584、585、587、588、589、593、594、595、596、597、598、599、602、607、608、609、610、611、612、613、616、621、633、635、636、639、640、641、642、643、644、645、654、660、661、666、667、668、669、673、677、692、698、699、700、701、706、749、770、772、775、781、800、804、819、829、832、833、851、854、855、857、858、859、861、869、891、892、906、907、912、913、934、944及947。
在一些實施例中，反義股及靶向SOD1 mRNA序列100%的互補。反義股可與靶SOD1 mRNA序列之任何部分互補。
在其他實施例中，反義股及標靶SOD1 mRNA序列包含至少一種失配。作為一非限制性實例，反義股及靶SOD1 mRNA序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-99%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-99%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-99%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%的互補。
在一個實施例中，靶向SOD1之siRNA或dsRNA包括至少兩個彼此互補的序列。
根據本發明，靶向SOD1之siRNA分子之長度為約10-50或更多個核苷酸，亦即，各股包含10-50個核苷酸(或核苷酸類似物)。較佳地，在各股中siRNA分子之長度為約15-30個，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸，其中各股中之一者與靶區域充分互補。在一個實施例中，siRNA分子之各股之長度為約19至25、19至24或19至21個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為19個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為20個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為21個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為22個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為23個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為24個核苷酸。在一個實施例中，siRNA分子之至少一股為長度為25個核苷酸。
在一些實施例中，靶向SOD1之本發明之siRNA分子可為包含約19個核苷酸至約25個核苷酸及3'端之兩個突出核苷酸的合成RNA雙螺旋體。在一些態樣中，siRNA分子可為未經修飾之RNA分子。在其他態樣中，siRNA分子可含有至少一種經修飾之核苷酸，諸如鹼、糖或主鏈修飾。
在一個實施例中，靶向SOD1之本發明之siRNA分子可包含核苷酸序列，諸如(但不限於)，表7中的反義(引導)序列或其片段或變異體。作為一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子之反義序列為至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-99%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-99%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-99%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%的表7中之核苷酸序列。作為另一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子之反義序列包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或超過21個表7中的核苷酸序列之連續核苷酸。作為又一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子之反義序列包含表7中的序列之核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21、或18至22。表 7. 反義序列
在一個實施例中，靶向SOD1之本發明之siRNA分子可包含核苷酸序列，諸如(但不限於)，表8中的有義(隨從)序列或其片段或變異體。作為一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子之有義序列為至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-99%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-99%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-99%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%的表8中之核苷酸序列。作為另一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子之有義序列包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或超過21個表8中的核苷酸序列之連續核苷酸。作為又一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子之有義序列包含表8中的序列之核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21、或18至22。表 8 . 有義序列
在一個實施例中，靶向SOD1之本發明之siRNA分子可包含來自表7的反義序列及來自表8的有義序列或其片段或變異體。作為一非限制性實例，反義序列及有義序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-99%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-99%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-99%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%的互補。
在一個實施例中，靶向SOD1之本發明之siRNA分子可包含如表9中所述的有義及反義siRNA雙螺旋體。作為一非限制性實例，對於對內源性SOD1基因表現之活體外抑制活性，可測試此等siRNA雙螺旋體。有義序列及反義序列之起始位點與已知為來自NCBI之NM_000454.4 (SEQ ID NO: 1502)的SOD1基因序列相比。表 9 . SOD1 dsRNA 之有義股及反義股序列
在其他實施例中，靶向SOD1之本發明之siRNA分子可在質體載體、AAV顆粒、病毒基因組或其他核酸表現載體中經編碼以傳遞至細胞。
DNA表現質粒可用於在細胞中穩定地表現靶向SOD1的本發明之siRNA雙螺旋體或dsRNA且實現靶基因表現之長期抑制。在一個態樣中，siRNA雙螺旋體之有義股及反義股通常藉由短間隔子序列連接，使得表現稱為短髮夾RNA (shRNA)之莖環結構。髮夾藉由內切酶識別且裂解，因此產生成熟siRNA分子。
根據本發明，產生包含編碼靶向SOD1 mRNA之siRNA分子的核酸之AAV顆粒，AAV血清型可為表1中所列出之血清型中的任一種。AAV血清型之非限制性實例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8、AAV-DJ、AAV-PHP.A、AAV-PHP.B、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5及其變異體。
在一些實施例中，本發明之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA遏制(或分解)SOD1 mRNA。因此，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可用於抑制細胞中之SOD1基因表現。在一些態樣中，SOD1基因表現之抑制係指抑制了至少約20%，較佳抑制了至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。因此，靶向基因之蛋白質產物可抑制了至少約20%，較佳抑制了至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
根據本發明，siRNA分子經設計且測試其減少經培養細胞中SOD1 mRNA含量之能力。該等siRNA分子可形成雙螺旋體，諸如(但不限於)，包括表9中所列之彼等雙螺旋體。作為一非限制性實例，siRNA雙螺旋體可為siRNA雙螺旋體ID: D-2741至D-2909。
在一個實施例中，siRNA分子包含位於引導股中之SOD1的miRNA種菌匹配。在另一實施例中，siRNA分子包含位於隨從股中之SOD1的miRNA種菌匹配。在又一實施例中，靶向SOD1基因的siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA不包含位於引導股或隨從股中之SOD1的種菌匹配。
在一個實施例中，靶向SOD1基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA對於引導股可幾乎無顯著全長脫靶效果。在另一實施例中，靶向SOD1基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA對於隨從股可幾乎無顯著全長脫靶效果。靶向SOD1基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA對於隨從股可具有低於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%,11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、1-5%、2-6%、3-7%、4-8%、5-9%、5-10%、6-10%、5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、15-30%、15-40%、15-45%、20-40%、20-50%、25-50%、30-40%、30-50%、35-50%、40-50%、45-50%的全長脫靶效果。在又一實施例中，靶向SOD1基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA對於引導股或隨從股可幾乎無顯著全長脫靶效果。靶向SOD1基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA對於引導股或隨從股可具有低於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%,11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、1-5%、2-6%、3-7%、4-8%、5-9%、5-10%、6-10%、5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、15-30%、15-40%、15-45%、20-40%、20-50%、25-50%、30-40%、30-50%、35-50%、40-50%、45-50%的全長脫靶效果。
在一個實施例中，靶向SOD1基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可具有活體外高活性。在另一實施例中，siRNA分子可具有活體外低活性。在又一實施例中，靶向SOD1基因之siRNA雙螺旋體或dsRNA可具有活體外高引導股活性及低隨從股活性。
在一個實施例中，靶向SOD1之siRNA分子具有活體外高引導股活性及低隨從股活性。藉由引導股之靶阻斷基因表現(KD)可為至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、99.5%或100%。藉由引導股之靶阻斷基因表現可為40-50%、45-50%、50-55%、50-60%、60-65%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、60-99%、60-99.5%、60-100%、65-70%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、65-99%、65-99.5%、65-100%、70-75%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、70-99%、70-99.5%、70-100%、75-80%、75-85%、75-90%、75-95%、75-99%、75-99.5%、75-100%、80-85%、80-90%、80-95%、80-99%、80-99.5%、80-100%、85-90%、85-95%、85-99%、85-99.5%、85-100%、90-95%、90-99%、90-99.5%、90-100%、95-99%、95-99.5%、95-100%、99-99.5%、99-100%或99.5-100%。作為一非限制性實例，藉由引導股之靶阻斷基因表現(KD)大於70%。作為一非限制性實例，藉由引導股之靶阻斷基因表現(KD)大於60%。
在一個實施例中，設計靶向SOD1之siRNA雙螺旋體，因此不存在有義序列或反義序列至非SOD1序列之miRNA種菌匹配。
在一個實施例中，對於最接近之脫靶之靶向SOD1的siRNA雙螺旋體中之引導股之IC50 大於100乘以靶基因SOD1上的引導股之IC50 。作為一非限制性實例，若最接近之脫靶的引導股之IC50 大於100乘以靶的引導股之IC50 ，則稱siRNA分子具有抑制活體外SOD1之高引導股選擇率。
在一個實施例中，靶向SOD1的siRNA雙螺旋體之引導股之5'處理在5'端以至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%之活體外或活體內時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少99%之活體外時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少99%之活體內時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少90%之活體外時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少90%之活體內時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少85%之活體外時間具有正確開始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且在5'端以至少85%之活體內時間具有正確開始(n)。
在一個實施例中，在量測處理時，當pri-微RNA或pre-微RNA藉由但此項技術中已知及本文所述之方法表明大於引導股比隨從股比率的2倍時，SOD1之隨從-引導股雙螺旋體視為有效的。作為一非限制性實例，當量測處理時，pri-微RNA或pre-微RNA表明大於2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、或2至5倍、2至10倍、2至15倍、3至5倍、3至10倍、3至15倍、4至5倍、4至10倍、4至15倍、5至10倍、5至15倍、6至10倍、6至15倍、7至10倍、7至15倍、8至10倍、8至15倍、9至10倍、9至15倍、10至15倍、11至15倍、12至15倍、13至15倍、或14至15倍的引導股比隨從股比率。
在一個實施例中，siRNA分子可用於藉由靶向SOD1序列上之至少一個外顯子使野生型或突變型SOD1沉默。外顯子可為外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5、外顯子6、外顯子7、外顯子8、外顯子9、外顯子10、外顯子11、外顯子12、外顯子13、外顯子14、外顯子15、外顯子16、外顯子17、外顯子18、外顯子19、外顯子20、外顯子21、外顯子22、外顯子23、外顯子24、外顯子25、外顯子26、外顯子27、外顯子28、外顯子29、外顯子30、外顯子31、外顯子32、外顯子33、外顯子34、外顯子35、外顯子36、外顯子37、外顯子38、外顯子39、外顯子40、外顯子41、外顯子42、外顯子43、外顯子44、外顯子45、外顯子46、外顯子47、外顯子48、外顯子49、外顯子50、外顯子51、外顯子52、外顯子53、外顯子54、外顯子55、外顯子56、外顯子57、外顯子58、外顯子59、外顯子60、外顯子61、外顯子62、外顯子63、外顯子64、外顯子65、外顯子66及/或外顯子67。siRNA 修飾
在一些實施例中，本發明之siRNA分子在不以前驅體或DNA傳遞時可經化學修飾以調節RNA分子之一些特徵，諸如(但不限於)，提高活體內siRNA之穩定性。經化學修飾之siRNA分子可用於人類治療性應用，且經改良而不損害siRNA分子之RNAi活性。作為一非限制性實例，siRNA分子在有義股及反義股之3'端及5'端均經修飾。
在一些態樣中，本發明之siRNA雙螺旋體可含有一或多種經修飾之核苷酸，諸如(但不限於)，經糖修飾之核苷酸、核鹼基修飾及/或主鏈修飾。在一些態樣中，siRNA分子可含有組合修飾，例如，經組合之核鹼基及主鏈修飾。
在一個實施例中，經修飾之核苷酸可為經糖修飾之核苷酸。經修飾之核苷酸包括但不限於經2'-氟、2'-胺基及2'-硫基修飾之核糖核苷酸，例如，經2'-氟修飾之核糖核苷酸。經修飾之核苷酸可在糖部分上經修飾，以及具有糖或不為核糖基之其類似物的核苷酸。舉例而言，糖部分可為或基於甘露糖、阿拉伯糖、葡萄哌喃糖、半乳哌喃糖、4'-硫基核糖及其他糖、雜環或碳環。
在一個實施例中，經修飾之核苷酸可為經核鹼基修飾之核苷酸。
在一個實施例中，經修飾之核苷酸可為經主鏈修飾之核苷酸。在一些實施例中，本發明之siRNA雙螺旋體可進一步包含主鏈上之其他修飾。如本文所用，常用「主鏈」係指DNA或RNA分子中之重複交替磷酸糖序列。去氧核苷/核糖以酯鍵聯(亦稱為「磷酸二酯」鍵/鍵聯基團(PO鍵))在3'-羥基及5'-羥基連接至磷酸酯基。PO主鏈可經修飾為「硫代磷酸酯主鏈(PS鍵)」。在一些情況下，天然磷酸二酯鍵可經醯胺鍵置換，但保持兩個糖單元之間之四個原子。該等醯胺修飾可促進寡核苷酸之固相合成且提高由siRNA補體形成之雙螺旋體的熱力學穩定性。參見例如，Mesmaeker等人, Pure & Appl. Chem., 1997, 3, 437-440；該文獻的內容以全文引用之方式併入本文中。
經修飾之鹼係指核苷酸鹼，諸如，腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶、黃嘌呤、肌核苷及Q核苷，其已藉由置換或添加一或多個原子或基團修飾。核鹼基部分上之修飾之一些實例各自或以組合包括但不限於烷基化鹼、鹵化鹼、硫醇化鹼、胺化鹼、醯胺化鹼或乙醯化鹼。更具體實例包括例如5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、N,N,-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鳥嘌呤、2-胺基腺嘌呤、1-甲基肌核苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷及在5位具有修飾之其他核苷酸、5-(2-胺基)丙基尿苷、5-鹵胞苷、5-鹵尿苷、4-乙醯基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鳥苷、7-甲基鳥苷、2,2-二甲基鳥苷、5-甲基胺乙基尿苷、5-甲氧基尿苷、去氮核苷酸(諸如7-去氮-腺苷、6-偶氮基尿苷、6-偶氮基胞苷、6-偶氮基胸苷)、5-甲基-2-硫代尿苷、其他硫基鹼(諸如2-硫代尿苷及4-硫代尿苷及2-硫代胞苷)、二氫尿苷、假尿苷、Q核苷、古嘌苷、萘基及經取代之萘基、任何O-烷基化嘌呤及嘧啶及N-烷基化嘌呤及嘧啶(諸如N6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧基乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮)、苯基及經改質之苯基(諸如胺基苯酚或2,4,6-三甲氧基苯)、經修飾之胞嘧啶(其充當G形夾核苷酸)、8-經取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-經取代之尿嘧啶及胸嘧啶、氮雜嘧啶、羧基羥基烷基核苷酸、羧基烷基胺基核苷酸及烷基羰基烷基化核苷酸。
在一個實施例中，經修飾之核苷酸可僅僅在有義股上。
在另一實施例中，經修飾之核苷酸可僅僅在反義股上。
在一些實施例中，經修飾之核苷酸可在有義股及反義兩者中。
在一些實施例中，經化學修飾之核苷酸不影響反義股與靶mRNA序列配對之能力。
在一個實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV顆粒可編碼為多順反子分子之siRNA分子。siRNA分子可在siRNA分子之區域之間另外包含一或多個鍵聯基團。 分子支架
在一個實施例中，siRNA分子可在亦包含分子支架之調節多核苷酸中經編碼。如本文中所用，「分子支架」為形成針對其設計或製備後續分子之序列或結構性基礎之框架或起始分子。
在一個實施例中，分子支架包含至少一個5'側接區域。作為一非限制性實例，5'側接區域可包含5'側邊序列，其可具有任何長度，且可整體地或部分地衍生自野生型微RNA序列，或完全為人工序列。
在一個實施例中，分子支架包含至少一個3'側接區域。作為一非限制性實例，3'側接區域可包含3'側邊序列，其可具有任何長度，且可整體地或部分地衍生自野生型微RNA序列，或完全為人工序列。
在一個實施例中，分子支架包含至少一個環模體區域。作為一非限制性實例，環模體區域可包含可具有任何長度之序列。
在一個實施例中，分子支架包含5'側接區域、環模體區域及/或3'側接區域。
在一個實施例中，至少一種本文所述之siRNA劑、miRNA劑或其他RNAi劑可由亦可包含至少一種分子支架之調節多核苷酸編碼。分子支架可包含5'側邊序列，其可具有任何長度，且可整體地或部分地衍生自野生型微RNA序列，或完全為人工的。3'側邊序列可在大小及來源上與5'側邊序列及/或3'側邊序列成鏡面。任一側邊序列可不存在。3'側邊序列可視情況含有一或多種CNNC模體，其中「N」表示任何核苷酸。
形成莖環結構之莖為編碼至少一種本文所述之siRNA劑、miRNA劑或其他RNAi劑的調節多核苷酸的最小值。在一些實施例中，本文所述之siRNA劑、miRNA劑或其他RNAi劑包含至少一種核酸序列，其部分地互補或將混雜至靶序列。在一些實施例中，負載為siRNA分子或siRNA分子之片段。
在一些實施例中，調節多核苷酸之莖環結構之5'臂包含編碼有義序列的核酸序列。可由調節多核苷酸編碼之有義序列或其片段或變異體之非限制性實例在表3及表8中進行描述。
在一些實施例中，調節多核苷酸之莖環之3'臂包含編碼反義序列的核酸序列。在一些情況下，反義序列在5'最末端包含「G」核苷酸。可由調節多核苷酸編碼之反義序列或其片段或變異體之非限制性實例在表2及表7中進行描述。
在其他實施例中，有義序列可存在於調節多核苷酸之莖環結構之莖的3'臂上，而反義序列存在於5'臂上。可由調節多核苷酸編碼之有義序列及反義序列之非限制性實例在表2、表3、表7及表8中進行描述。
在一個實施例中，有義序列及反義序列可在其長度之實質性部分中完全互補。在其他實施例中，有義序列及反義序列可在獨立地至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%的各股之長度中至少70%、80%、90%、95%或99%的互補。
有義序列之同一性或反義序列之同源性均不需要與靶序列100%的互補。
在一個實施例中，分離調節多核苷酸之莖環結構之有義序列及反義序列為環序列(亦稱為環模體、鍵聯基團或鍵聯模體)。環序列可具有任何長度：在4-30個核苷酸之間、在4-20個核苷酸之間、在4-15個核苷酸之間、在5-15個核苷酸之間、在6-12個核苷酸之間、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸、10個核苷酸、11個核苷酸、12個核苷酸、13個核苷酸、14個核苷酸及/或15個核苷酸。
在一些實施例中，環序列包含編碼至少一種UGUG模體之核酸序列。在一些實施例中，編碼UGUG模體之核酸序列位於環序列之5'端。
在一個實施例中，間隔子區域可存在於調節多核苷酸中以使一或多個模塊(例如，5'側接區域、環模體區域、3'側接區域、有義序列反義序列)彼此分離。可存在一或多個該等間隔子區域。
在一個實施例中，8-20、亦即8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸之間之間隔子區域可存在於有義序列與側接區域序列之間。
在一個實施例中，間隔子區域之長度為13個核苷酸，且位於有義序列之5'端與側邊序列之3'端之間。在一個實施例中，間隔子具有足夠的長度以形成序列之大約一個螺旋形轉彎。
在一個實施例中，8-20、亦即8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸之間之間隔子區域可存在於反義序列與側邊序列之間。
在一個實施例中，間隔子序列在10-13、亦即10、11、12或13個核苷酸之間，且位於反義序列之3'端與側邊序列之5'端之間。在一個實施例中，間隔子具有足夠的長度以形成序列之大約一個螺旋形轉彎。
在一個實施例中，調節多核苷酸之分子支架在5'至3'方向包含5'側邊序列、5'臂、環模體、3'臂及3'側邊序列。作為一非限制性實例，5'臂可包含編碼有義序列之核酸序列，且3'臂包含編碼反義序列之核酸序列。在另一非限制性實例中，5'臂包含編碼反義序列之核酸序列，且3'臂包含編碼有義序列之核酸序列。
在一個實施例中，5'臂、有義序列及/或反義序列、環模體及/或3'臂序列可經更改(例如，取代1個或更多核苷酸、添加核苷酸及/或刪除核苷酸)。更改可引起構築體之功能的有益變化(例如，增加靶序列之阻斷基因表現、減少構築體之降解、減少脫靶效果、提高負載之效率及減少負載之降解)。
在一個實施例中，對準調節多核苷酸之分子支架以便使引導股(在本文中亦稱為反義股)之切除率大於隨從股(在本文中亦稱為有義股)之切除率。引導股或隨從股之切除率可獨立地為1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或超過99%。作為一非限制性實例，引導股之切除率為至少80%。作為另一非限制性實例，引導股之切速率為至少90%。
在一個實施例中，引導股之切除率大於隨從股之切除率。在一個態樣中，引導股之切除率可比隨從股大至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或超過99%。
在一個實施例中，引導股之切除效率為至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或超過99%。作為一非限制性實例，引導股之切除效率超過80%。
在一個實施例中，引導股之切除效率大於來自分子支架之隨從股的切除。引導股之切除可比來自分子支架之隨從股的切除更高效2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10倍。
在一個實施例中，分子支架包含雙重功能靶向調節多核苷酸。如本文所用，「雙重功能靶向」調節多核苷酸為引導股及隨從股阻斷基因表現相同靶或引導股及隨從股阻斷基因表現不同靶的多核苷酸。
在一個實施例中，本文所述之調節多核苷酸之分子支架可包含5'側接區域、環模體區域及3'側接區域。本文所述之調節多核苷酸中之可使用或其片段可使用的5'側接區域、環模體區域(亦可稱為鍵聯區域)及3'側接區域之序列之非限制性實例展示於表10-12中。表 10 . 分子支架之 5 '側接區域 表 11 . 分子支架之環模體區域 表 12 . 分子支架之 3 ' 側接區域
在一個實施例中，分子支架可包含表10中所列之至少一個5'側接區域、其片段或變異體。作為一非限制性實例，5'側接區域可為5F1、5F2、5F3、5F4、5F5、5F6、5F7、5F8或5F9。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F1側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F2側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F3側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F4側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F5側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F6側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F7側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F8側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F9側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含表11中所列之至少一個環模體區域、其片段或變異體。作為一非限制性實例，環模體區域可為L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9或L10。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L1環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L2環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L3環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L4環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L5環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一L6環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L7環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L8環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L9環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L10環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含表12中所列之至少一個3'側接區域、其片段或變異體。作為一非限制性實例，3'側接區域可為3F1、3F2、3F3、3F4、3F5、3F6或3F7。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個3F1側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個3F2側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個3F3側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個3F4側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個3F5側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個3F6側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個3F7側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含如表10及表11中所述之至少一個5'側接區域、其片段或變異體及至少一個環模體區域、其片段或變異體。作為一非限制性實例，5'側接區域及環模體區域可為5F1及L1、5F1及L2、5F1及L3、5F1及L4、5F1及L5、5F1及L6、5F1及L7、5F1及L8、5F1及L9、5F1及L10、5F2及L1、5F2及L2、5F2及L3、5F2及L4、5F2及L5、5F2及L6、5F2及L7、5F2及L8、5F2及L9、5F2及L10、5F3及L1、5F3及L2、5F3及L3、5F3及L4、5F3及L5、5F3及L6、5F3及L7、5F3及L8、5F3及L9、5F3及L10、5F4及L1、5F4及L2、5F4及L3、5F4及L4、5F4及L5、5F4及L6、5F4及L7、5F4及L8、5F4及L9、5F4及L10、5F5及L1、5F5及L2、5F5及L3、5F5及L4、5F5及L5、5F5及L6、5F5及L7、5F5及L8、5F5及L9、5F5及L10、5F6及L1、5F6及L2、5F6及L3、5F6及L4、5F6及L5、5F6及L6、5F6及L7、5F6及L8、5F6及L9、5F6及L10、5F7及L1、5F7及L2、5F7及L3、5F7及L4、5F7及L5、5F7及L6、5F7及L7、5F7及L8、5F7及L9、5F7及L10、5F8及L1、5F8及L2、5F8及L3、5F8及L4、5F8及L5、5F8及L6、5F8及L7、5F8及L8、5F8及L9、5F8及L10、5F9及L1、5F9及L2、5F9及L3、5F9及L4、5F9及L5、5F9及L6、5F9及L7、5F9及L8、5F9及L9、及5F9及L10。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F2側接區域及至少一個L1環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F1側接區域及至少一個L4環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F7側接區域及至少一個L8環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F3側接區域及至少一個L4環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F3側接區域及至少一個L5環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F4側接區域及至少一個L4環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F3側接區域及至少一個L7環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F5側接區域及至少一個L4環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F6側接區域及至少一個L4環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F3側接區域及至少一個L6環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F7側接區域及至少一個L4環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F2側接區域及至少一個L2環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F1側接區域及至少一個L1環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F1側接區域及至少一個L2環模體區域。
在一個實施例中，分子支架可包含如表11及表12中所述之至少一個3'側接區域、其片段或變異體及至少一個模體區域、其片段或變異體。作為一非限制性實例，3'側接區域及環模體區域可為3F1及L1、3F1及L2、3F1及L3、3F1及L4、3F1及L5、3F1及L6、3F1及L7、3F1及L8、3F1及L9、3F1及L10、3F2及L1、3F2及L2、3F2及L3、3F2及L4、3F2及L5、3F2及L6、3F2及L7、3F2及L8、3F2及L9、3F2及L10、3F3及L1、3F3及L2、3F3及L3、3F3及L4、3F3及L5、3F3及L6、3F3及L7、3F3及L8、3F3及L9、3F3及L10、3F4及L1、3F4及L2、3F4及L3、3F4及L4、3F4及L5、3F4及L6、3F4及L7、3F4及L8、3F4及L9、3F4及L10、3F5及L1、3F5及L2、3F5及L3、3F5及L4、3F5及L5、3F5及L6、3F5及L7、3F5及L8、3F5及L9、3F5及L10、3F6及L1、3F6及L2、3F6及L3、3F6及L4、3F6及L5、3F6及L6、3F6及L7、3F6及L8、3F6及L9、3F6及L10、3F7及L1、3F7及L2、3F7及L3、3F7及L4、3F7及L5、3F7及L6、3F7及L7、3F7及L8、3F7及L9、及3F7及L10。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L1環模體區域及至少一個3F2側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L4環模體區域及至少一個3F1側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L8環模體區域及至少一個3F5側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L5環模體區域及至少一個3F1側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L4環模體區域及至少一個3F4側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L7環模體區域及至少一個3F1側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L6環模體區域及至少一個3F1側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L4環模體區域及至少一個3F5側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L2環模體區域及至少一個3F2側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L1環模體區域及至少一個3F3側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L5環模體區域及至少一個3F4側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L1環模體區域及至少一個3F1側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個L2環模體區域及至少一個3F1側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含如表10及表12中所述之至少一個5'側接區域、其片段或變異體及至少一個3'側接區域、其片段或變異體。作為一非限制性實例，側接區域可為5F1及3F1、5F1及3F2、5F1及3F3、5F1及3F4、5F1及3F5、5F1及3F6、5F1及3F7、5F2及3F1、5F2及3F2、5F2及3F3、5F2及3F4、5F2及3F5、5F2及3F6、5F2及3F7、5F3及3F1、5F3及3F2、5F3及3F3、5F3及3F4、5F3及3F5、5F3及3F6、5F3及3F7、5F4及3F1、5F4及3F2、5F4及3F3、5F4及3F4、5F4及3F5、5F4及3F6、5F4及3F7、5F5及3F1、5F5及3F2、5F5及3F3、5F5及3F4、5F5及3F5、5F5及3F6、5F5及3F7、5F6及3F1、5F6及3F2、5F6及3F3、5F6及3F4、5F6及3F5、5F6及3F6、5F6及3F7、5F7及3F1、5F7及3F2、5F7及3F3、5F7及3F4、5F7及3F5、5F7及3F6、5F7及3F7、5F8及3F1、5F8及3F2、5F8及3F3、5F8及3F4、5F8及3F5、5F8及3F6、及5F8及3F7、5F9及3F1、5F9及3F2、5F9及3F3、5F9及3F4、5F9及3F5、5F9及3F6、及5F9及3F7。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F2 5'側接區域及至少一個3F2 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F1 5'側接區域及至少一個3F1 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F7 5'側接區域及至少一個3F5 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F3 5'側接區域及至少一個3F1 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F4 5'側接區域及至少一個3F4 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F5 5'側接區域及至少一個3F4 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F6 5'側接區域及至少一個3F1 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F2 5'側接區域及至少一個3F3 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F3 5'側接區域及至少一個3F4 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F1 5'側接區域及至少一個3F2 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含如表10-12中所述之至少一個5'側接區域、其片段或變異體、至少一個環模體區域、其片段或變異體及至少一個3'側接區域。作為一非限制性實例，側接區域及環模體區域可為5F1、L1及3F1；5F1、L1及3F2；5F1、L1及3F3；5F1、L1及3F4；5F1、L1及3F5；5F1、L1及3F6；5F1、L1及3F7；5F2、L1及3F1；5F2、L1及3F2；5F2、L1及3F3；5F2、L1及3F4；5F2、L1及3F5；5F2、L1及3F6；5F2、L1及3F7；5F3、L1及3F1；5F3、L1及3F2；5F3、L1及3F3；5F3、L1及3F4；5F3、L1及3F5；5F3、L1及3F6；5F3、L1及3F7；5F4、L1及3F1；5F4、L1及3F2；5F4、L1及3F3；5F4、L1及3F4；5F4、L1及3F5；5F4、L1及3F6；5F4、L1及3F7；5F5、L1及3F1；5F5、L1及3F2；5F5、L1及3F3；5F5、L1及3F4；5F5、L1及3F5；5F5、L1及3F6；5F5、L1及3F7；5F6、L1及3F1；5F6、L1及3F2；5F6、L1及3F3；5F6、L1及3F4；5F6、L1及3F5；5F6、L1及3F6；5F6、L1及3F7；5F7、L1及3F1；5F7、L1及3F2；5F7、L1及3F3；5F7、L1及3F4；5F7、L1及3F5；5F7、L1及3F6；5F7、L1及3F7；5F8、L1及3F1；5F8、L1及3F2；5F8、L1及3F3；5F8、L1及3F4；5F8、L1及3F5；5F8、L1及3F6；5F8、L1及3F7；5F9、L1及3F1；5F9、L1及3F2；5F9、L1及3F3；5F9、L1及3F4；5F9、L1及3F5；5F9、L1及3F6；5F9、L1及3F7；5F1、L2及3F1；5F1、L2及3F2；5F1、L2及3F3；5F1、L2及3F4；5F1、L2及3F5；5F1、L2及3F6；5F1、L2及3F7；5F2、L2及3F1；5F2、L2及3F2；5F2、L2及3F3；5F2、L2及3F4；5F2、L2及3F5；5F2、L2及3F6；5F2、L2及3F7；5F3、L2及3F1；5F3、L2及3F2；5F3、L2及3F3；5F3、L2及3F4；5F3、L2及3F5；5F3、L2及3F6；5F3、L2及3F7；5F4、L2及3F1；5F4、L2及3F2；5F4、L2及3F3；5F4、L2及3F4；5F4、L2及3F5；5F4、L2及3F6；5F4、L2及3F7；5F5、L2及3F1；5F5、L2及3F2；5F5、L2及3F3；5F5、L2及3F4；5F5、L2及3F5；5F5、L2及3F6；5F5、L2及3F7；5F6、L2及3F1；5F6、L2及3F2；5F6、L2及3F3；5F6、L2及3F4；5F6、L2及3F5；5F6、L2及3F6；5F6、L2及3F7；5F7、L2及3F1；5F7、L2及3F2；5F7、L2及3F3；5F7、L2及3F4；5F7、L2及3F5；5F7、L2及3F6；5F7、L2及3F7；5F8、L2及3F1；5F8、L2及3F2；5F8、L2及3F3；5F8、L2及3F4；5F8、L2及3F5；5F8、L2及3F6；5F8、L2及3F7；5F9、L2及3F1；5F9、L2及3F2；5F9、L2及3F3；5F9、L2及3F4；5F9、L2及3F5；5F9、L2及3F6；5F9、L2及3F7；5F1、L3及3F1；5F1、L3及3F2；5F1、L3及3F3；5F1、L3及3F4；5F1、L3及3F5；5F1、L3及3F6；5F1、L3及3F7；5F2、L3及3F1；5F2、L3及3F2；5F2、L3及3F3；5F2、L3及3F4；5F2、L3及3F5；5F2、L3及3F6；5F2、L3及3F7；5F3、L3及3F1；5F3、L3及3F2；5F3、L3及3F3；5F3、L3及3F4；5F3、L3及3F5；5F3、L3及3F6；5F3、L3及3F7；5F4、L3及3F1；5F4、L3及3F2；5F4、L3及3F3；5F4、L3及3F4；5F4、L3及3F5；5F4、L3及3F6；5F4、L3及3F7；5F5、L3及3F1；5F5、L3及3F2；5F5、L3及3F3；5F5、L3及3F4；5F5、L3及3F5；5F5、L3及3F6；5F5、L3及3F7；5F6、L3及3F1；5F6、L3及3F2；5F6、L3及3F3；5F6、L3及3F4；5F6、L3及3F5；5F6、L3及3F6；5F6、L3及3F7；5F7、L3及3F1；5F7、L3及3F2；5F7、L3及3F3；5F7、L3及3F4；5F7、L3及3F5；5F7、L3及3F6；5F7、L3及3F7；5F8、L3及3F1；5F8、L3及3F2；5F8、L3及3F3；5F8、L3及3F4；5F8、L3及3F5；5F8、L3及3F6；5F8、L3及3F7；5F9、L3及3F1；5F9、L3及3F2；5F9、L3及3F3；5F9、L3及3F4；5F9、L3及3F5；5F9、L3及3F6；5F9、L3及3F7；5F1、L4及3F1；5F1、L4及3F2；5F1、L4及3F3；5F1、L4及3F4；5F1、L4及3F5；5F1、L4及3F6；5F1、L4及3F7；5F2、L4及3F1；5F2、L4及3F2；5F2、L4及3F3；5F2、L4及3F4；5F2、L4及3F5；5F2、L4及3F6；5F2、L4及3F7；5F3、L4及3F1；5F3、L4及3F2；5F3、L4及3F3；5F3、L4及3F4；5F3、L4及3F5；5F3、L4及3F6；5F3、L4及3F7；5F4、L4及3F1；5F4、L4及3F2；5F4、L4及3F3；5F4、L4及3F4；5F4、L4及3F5；5F4、L4及3F6；5F4、L4及3F7；5F5、L4及3F1；5F5、L4及3F2；5F5、L4及3F3；5F5、L4及3F4；5F5、L4及3F5；5F5、L4及3F6；5F5、L4及3F7；5F6、L4及3F1；5F6、L4及3F2；5F6、L4及3F3；5F6、L4及3F4；5F6、L4及3F5；5F6、L4及3F6；5F6、L4及3F7；5F7、L4及3F1；5F7、L4及3F2；5F7、L4及3F3；5F7、L4及3F4；5F7、L4及3F5；5F7、L4及3F6；5F7、L4及3F7；5F8、L4及3F1；5F8、L4及3F2；5F8、L4及3F3；5F8、L4及3F4；5F8、L4及3F5；5F8、L4及3F6；5F8、L4及3F7；5F9、L4及3F1；5F9、L4及3F2；5F9、L4及3F3；5F9、L4及3F4；5F9、L4及3F5；5F9、L4及3F6；5F9、L4及3F7；5F1、L5及3F1；5F1、L5及3F2；5F1、L5及3F3；5F1、L5及3F4；5F1、L5及3F5；5F1、L5及3F6；5F1、L5及3F7；5F2、L5及3F1；5F2、L5及3F2；5F2、L5及3F3；5F2、L5及3F4；5F2、L5及3F5；5F2、L5及3F6；5F2、L5及3F7；5F3、L5及3F1；5F3、L5及3F2；5F3、L5及3F3；5F3、L5及3F4；5F3、L5及3F5；5F3、L5及3F6；5F3、L5及3F7；5F4、L5及3F1；5F4、L5及3F2；5F4、L5及3F3；5F4、L5及3F4；5F4、L5及3F5；5F4、L5及3F6；5F4、L5及3F7；5F5、L5及3F1；5F5、L5及3F2；5F5、L5及3F3；5F5、L5及3F4；5F5、L5及3F5；5F5、L5及3F6；5F5、L5及3F7；5F6、L5及3F1；5F6、L5及3F2；5F6、L5及3F3；5F6、L5及3F4；5F6、L5及3F5；5F6、L5及3F6；5F6、L5及3F7；5F7、L5及3F1；5F7、L5及3F2；5F7、L5及3F3；5F7、L5及3F4；5F7、L5及3F5；5F7、L5及3F6；5F7、L5及3F7；5F8、L5及3F1；5F8、L5及3F2；5F8、L5及3F3；5F8、L5及3F4；5F8、L5及3F5；5F8、L5及3F6；5F8、L5及3F7；5F9、L5及3F1；5F9、L5及3F2；5F9、L5及3F3；5F9、L5及3F4；5F9、L5及3F5；5F9、L5及3F6；5F9、L5及3F7；5F1、L6及3F1；5F1、L6及3F2；5F1、L6及3F3；5F1、L6及3F4；5F1、L6及3F5；5F1、L6及3F6；5F1、L6及3F7；5F2、L6及3F1；5F2、L6及3F2；5F2、L6及3F3；5F2、L6及3F4；5F2、L6及3F5；5F2、L6及3F6；5F2、L6及3F7；5F3、L6及3F1；5F3、L6及3F2；5F3、L6及3F3；5F3、L6及3F4；5F3、L6及3F5；5F3、L6及3F6；5F3、L6及3F7；5F4、L6及3F1；5F4、L6及3F2；5F4、L6及3F3；5F4、L6及3F4；5F4、L6及3F5；5F4、L6及3F6；5F4、L6及3F7；5F5、L6及3F1；5F5、L6及3F2；5F5、L6及3F3；5F5、L6及3F4；5F5、L6及3F5；5F5、L6及3F6；5F5、L6及3F7；5F6、L6及3F1；5F6、L6及3F2；5F6、L6及3F3；5F6、L6及3F4；5F6、L6及3F5；5F6、L6及3F6；5F6、L6及3F7；5F7、L6及3F1；5F7、L6及3F2；5F7、L6及3F3；5F7、L6及3F4；5F7、L6及3F5；5F7、L6及3F6；5F7、L6及3F7；5F8、L6及3F1；5F8、L6及3F2；5F8、L6及3F3；5F8、L6及3F4；5F8、L6及3F5；5F8、L6及3F6；5F8、L6及3F7；5F9、L6及3F1；5F9、L6及3F2；5F9、L6及3F3；5F9、L6及3F4；5F9、L6及3F5；5F9、L6及3F6；5F9、L6及3F7；5F1、L7及3F1；5F1、L7及3F2；5F1、L7及3F3；5F1、L7及3F4；5F1、L7及3F5；5F1、L7及3F6；5F1、L7及3F7；5F2、L7及3F1；5F2、L7及3F2；5F2、L7及3F3；5F2、L7及3F4；5F2、L7及3F5；5F2、L7及3F6；5F2、L7及3F7；5F3、L7及3F1；5F3、L7及3F2；5F3、L7及3F3；5F3、L7及3F4；5F3、L7及3F5；5F3、L7及3F6；5F3、L7及3F7；5F4、L7及3F1；5F4、L7及3F2；5F4、L7及3F3；5F4、L7及3F4；5F4、L7及3F5；5F4、L7及3F6；5F4、L7及3F7；5F5、L7及3F1；5F5、L7及3F2；5F5、L7及3F3；5F5、L7及3F4；5F5、L7及3F5；5F5、L7及3F6；5F5、L7及3F7；5F6、L7及3F1；5F6、L7及3F2；5F6、L7及3F3；5F6、L7及3F4；5F6、L7及3F5；5F6、L7及3F6；5F6、L7及3F7；5F7、L7及3F1；5F7、L7及3F2；5F7、L7及3F3；5F7、L7及3F4；5F7、L7及3F5；5F7、L7及3F6；5F7、L7及3F7；5F8、L7及3F1；5F8、L7及3F2；5F8、L7及3F3；5F8、L7及3F4；5F8、L7及3F5；5F8、L7及3F6；5F8、L7及3F7；；5F9、L7及3F1；5F9、L7及3F2；5F9、L7及3F3；5F9、L7及3F4；5F9、L7及3F5；5F9、L7及3F6；5F9、L7及3F7；5F1、L8及3F1；5F1、L8及3F2；5F1、L8及3F3；5F1、L8及3F4；5F1、L8及3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在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F2 5'側接區域、至少一個L1環模體區域及至少一個3F2 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F1 5'側接區域、至少一個L4環模體區域及至少一個3F1 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F7 5'側接區域、至少一個L8環模體區域及至少一個3F5 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F3 5'側接區域、至少一個L4環模體區域及至少一個3F1 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F3 5'側接區域、至少一個L5環模體區域及至少一個3F1 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F4 5'側接區域、至少一個L4環模體區域及至少一個3F4 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F3 5'側接區域、至少一個L7環模體區域及至少一個3F1 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F5 5'側接區域、至少一個L4環模體區域及至少一個3F4 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F6 5'側接區域、至少一個L4環模體區域及至少一個3F1 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F3 5'側接區域、至少一個L6環模體區域及至少一個3F1 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F7 5'側接區域、至少一個L4環模體區域及至少一個3F5 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F2 5'側接區域、至少一個L2環模體區域及至少一個3F2 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F2 5'側接區域、至少一個L1環模體區域及至少一個3F3 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F3 5'側接區域、至少一個L5環模體區域及至少一個3F4 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F1 5'側接區域、至少一個L1環模體區域及至少一個3F1 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F1 5'側接區域、至少一個L2環模體區域及至少一個3F1 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F1 5'側接區域、至少一個L1環模體區域及至少一個3F2 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可包含至少一個5F2 5'側接區域、至少一個L3環模體區域及至少一個3F3 3'側接區域。
在一個實施例中，分子支架可為天然pri-miRNA支架。作為一非限制性實例，分子支架可為衍生自人類miR155支架之支架。
在一個實施例中，分子支架可包含一或多種此項技術中已知之鍵聯基團。鍵聯基團可分離區域或來自另一區域的一個分子支架。作為一非限制性實例，分子支架可為多順反子。 包含分子支架及靶向HTT之siRNA分子之調節多核苷酸
在一個實施例中，調節多核苷酸可包含如表13及表14中所述之5'側接區域及3'側接區域、環模體區域及編碼有義序列及反義序列之核酸序列。在表13及表14中，描述隨從股及引導股之DNA序列識別符以及5'側接區域及3'側接區域及環區域(亦稱為鍵聯區域)。在表13及表14中，序列之名稱之「miR」組分不必對應於miRNA基因之序列編號(例如，VOYHTmiR-102為序列之名稱，且不必意謂miR-102為序列之一部分)。表 13 . HTT 調節多核苷酸序列區域 ( 5 ' 至 3 ') 表 14 . HTT 調節多核苷酸序列區域 ( 5 ' 至 3 ') 包含分子支架及靶向SOD1之siRNA分子之調節多核苷酸
在一個實施例中，調節多核苷酸可包含如表15及表16中所述之5'側接區域及3'側接區域、環模體區域及編碼有義序列及反義序列之核酸序列。在表15及表16中，描述隨從股及引導股之DNA序列識別符以及5'側接區域及3'側接區域及環區域(亦稱為鍵聯區域)。在表15及表16中，序列之名稱之「miR」組分不必對應於miRNA基因之序列編號(例如，VOYSOD1miR-102為序列之名稱，且不必意謂miR-102為序列之一部分)。表 15 . SOD1 調節多核苷酸序列區域 ( 5 '至 3 ') 表 16 . SOD1 調節多核苷酸序列區域 ( 5 '至 3 ') 包含調節多核苷酸之 AAV 顆粒
在一個實施例中，AAV顆粒包含具有包含調節多核苷酸序列之負載區域之病毒基因組。在此類實施例中，編碼超過一種多肽之病毒基因組可複寫及封裝至病毒顆粒中。包含調節多核苷酸之經病毒顆粒轉導的靶細胞可在單個細胞中表現經編碼之有義序列及/或反義序列。
在一些實施例中，AAV顆粒適用於治療、預防、減輕或改善神經疾病及/或病症的藥物領域。
在一個實施例中，可將包含調節多核苷酸序列之AAV顆粒引入哺乳動物細胞中，該調節多核苷酸序列包含編碼至少一種siRNA分子的核酸序列。
其中AAV顆粒負載區域包含調節多核苷酸，調節多核苷酸可包含有義序列及/或反義序列以阻斷基因表現靶基因。編碼本文所述之調節多核苷酸之AAV病毒基因組可適用於人類疾病、病毒、感染獸醫應用及各種活體內及活體外設定的領域。
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組可包含至少一個反向末端重複(ITR)區域。ITR區域可獨立地具有以下長度，諸如(但不限於) 75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174及175個核苷酸。病毒基因組之ITR區域之長度可為75-80、75-85、75-100、80-85、80-90、80-105、85-90、85-95、85-110、90-95、90-100、90-115、95-100、95-105、95-120、100-105、100-110、100-125、105-110、105-115、105-130、110-115、110-120、110-135、115-120、115-125、115-140、120-125、120-130、120-145、125-130、125-135、125-150、130-135、130-140、130-155、135-140、135-145、135-160、140-145、140-150、140-165、145-150、145-155、145-170、150-155、150-160、150-175、155-160、155-165、160-165、160-170、165-170、165-175及170-175個核苷酸。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約105個核苷酸之ITR。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約141個核苷酸之ITR。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約130個核苷酸之ITR。
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組可包含兩個反向末端重複(ITR)區域。ITR區域中之各者可獨立地具有以下長度，諸如(但不限於) 75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174及175個核苷酸。病毒基因組之ITR區域之長度可為75-80、75-85、75-100、80-85、80-90、80-105、85-90、85-95、85-110、90-95、90-100、90-115、95-100、95-105、95-120、100-105、100-110、100-125、105-110、105-115、105-130、110-115、110-120、110-135、115-120、115-125、115-140、120-125、120-130、120-145、125-130、125-135、125-150、130-135、130-140、130-155、135-140、135-145、135-160、140-145、140-150、140-165、145-150、145-155、145-170、150-155、150-160、150-175、155-160、155-165、160-165、160-170、165-170、165-175及170-175個核苷酸。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約105個核苷酸及長度為約141個核苷酸之ITR。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約105個核苷酸及長度為約130個核苷酸之ITR。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約130個核苷酸及長度為約141個核苷酸之ITR。
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組可包含如表17-24中所述之至少一個序列區域。該等區域可位於本文所述之其他序列區域中之任一者之前或之後。
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組包含至少一個反向末端重複(ITR)序列區域。ITR序列區域之非限制性實例描述於表17中。表 17. 反向末端重複 (ITR) 序列區域
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組包含兩個ITR序列區域。在一個實施例中，ITR序列區域為ITR1序列區域及ITR3序列區域。在一個實施例中，ITR序列區域為ITR1序列區域及ITR4序列區域。在一個實施例中，ITR序列區域為ITR2序列區域及ITR3序列區域。在一個實施例中，ITR序列區域為ITR2序列區域及ITR4序列區域。
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組可包含至少一個多選殖位點(MCS)序列區域。MCS區域可獨立地具有以下長度，諸如(但不限於) 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149及150個核苷酸。病毒基因組之MCS區域之長度可為2-10、5-10、5-15、10-20、10-30、10-40、15-20、15-25、20-30、20-40、20-50、25-30、25-35、30-40、30-50、30-60、35-40、35-45、40-50、40-60、40-70、45-50、45-55、50-60、50-70、50-80、55-60、55-65、60-70、60-80、60-90、65-70、65-75、70-80、70-90、70-100、75-80、75-85、80-90、80-100、80-110、85-90、85-95、90-100、90-110、90-120、95-100、95-105、100-110、100-120、100-130、105-110、105-115、110-120、110-130、110-140、115-120、115-125、120-130、120-140、120-150、125-130、125-135、130-140、130-150、135-140、135-145、140-150及145-150個核苷酸。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約5個核苷酸之MCS區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約10個核苷酸之MCS區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約14個核苷酸之MCS區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約18個核苷酸之MCS區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約73個核苷酸之MCS區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約121個核苷酸之MCS區域。
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組包含至少一個多選殖位點(MCS)序列區域。MCS序列區域之非限制性實例描述於表18中。表 18 . 多選殖位點 ( MCS ) 序列區域
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組包含一個MCS序列區域。在一個實施例中，MCS序列區域為MCS1序列區域。在一個實施例中，MCS序列區域為MCS2序列區域。在一個實施例中，MCS序列區域為MCS3序列區域。在一個實施例中，MCS序列區域為MCS4序列區域。在一個實施例中，MCS序列區域為MCS5序列區域。在一個實施例中，MCS序列區域為MCS6序列區域。
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組包含兩個MCS序列區域。在一個實施例中，兩個MCS序列區域為MCS1序列區域及MCS2序列區域。在一個實施例中，兩個MCS序列區域為MCS1序列區域及MCS3序列區域。在一個實施例中，兩個MCS序列區域為MCS1序列區域及MCS4序列區域。在一個實施例中，兩個MCS序列區域為MCS1序列區域及MCS5序列區域。在一個實施例中，兩個MCS序列區域為MCS1序列區域及MCS6序列區域。在一個實施例中，兩個MCS序列區域為MCS2序列區域及MCS3序列區域。在一個實施例中，兩個MCS序列區域為MCS2序列區域及MCS4序列區域。在一個實施例中，兩個MCS序列區域為MCS2序列區域及MCS5序列區域。在一個實施例中，兩個MCS序列區域為MCS2序列區域及MCS6序列區域。在一個實施例中，兩個MCS序列區域為MCS3序列區域及MCS4序列區域。在一個實施例中，兩個MCS序列區域為MCS3序列區域及MCS5序列區域。在一個實施例中，兩個MCS序列區域為MCS3序列區域及MCS6序列區域。在一個實施例中，兩個MCS序列區域為MCS4序列區域及MCS5序列區域。在一個實施例中，兩個MCS序列區域為MCS4序列區域及MCS6序列區域。在一個實施例中，兩個MCS序列區域為MCS5序列區域及MCS6序列區域。
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組包含兩個或更多個MCS序列區域。
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組包含三個MCS序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS1序列區域、MCS2序列區域及MCS3序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS1序列區域、MCS2序列區域及MCS4序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS1序列區域、MCS2序列區域及MCS5序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS1序列區域、MCS2序列區域及MCS6序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS1序列區域、MCS3序列區域及MCS4序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS1序列區域、MCS3序列區域及MCS5序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS1序列區域、MCS3序列區域及MCS6序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS1序列區域、MCS4序列區域及MCS5序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS1序列區域、MCS4序列區域及MCS6序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS1序列區域、MCS5序列區域及MCS6序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS2序列區域、MCS3序列區域及MCS4序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS2序列區域、MCS3序列區域及MCS5序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS2序列區域、MCS3序列區域及MCS6序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS2序列區域、MCS4序列區域及MCS5序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS2序列區域、MCS4序列區域及MCS6序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS2序列區域、MCS5序列區域及MCS6序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS3序列區域、MCS4序列區域及MCS5序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS3序列區域、MCS4序列區域及MCS6序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS3序列區域、MCS5序列區域及MCS6序列區域。在一個實施例中，三個MCS序列區域為MCS4序列區域、MCS5序列區域及MCS6序列區域。
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組可包含至少一個多填充序列區域。填充區域可獨立地具有以下長度，諸如(但不限於) 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3250個核苷酸。病毒基因組之任何填充區域之長度可為50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150、1150-1200、1200-1250、1250-1300、1300-1350、1350-1400、1400-1450、1450-1500、1500-1550、1550-1600、1600-1650、1650-1700、1700-1750、1750-1800、1800-1850、1850-1900、1900-1950、1950-2000、2000-2050、2050-2100、2100-2150、2150-2200、2200-2250、2250-2300、2300-2350、2350-2400、2400-2450、2450-2500、2500-2550、2550-2600、2600-2650、2650-2700、2700-2750、2750-2800、2800-2850、2850-2900、2900-2950、2950-3000、3000-3050、3050-3100、3100-3150、3150-3200及3200-3250個核苷酸。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約55個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約56個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約97個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約103個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約105個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約357個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約363個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約712個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約714個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約1203個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約1209個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約1512個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約1519個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約2395個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約2403個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約2405個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約3013個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約3021個核苷酸之填充區域。
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組可包含至少一個多填充序列區域。填充區域可獨立地具有以下長度，諸如(但不限於) 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2250、2251、2252、2253、2254、2255、2256、2257、2258、2259、2260、2261、2262、2263、2264、2265、2266、2267、2268、2269、2270、2271、2272、2273、2274、2275、2276、2277、2278、2279、2280、2281、2282、2283、2284、2285、2286、2287、2288、2289、2290、2291、2292、2293、2294、2295、2296、2297、2298、2299、2300、2301、2302、2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2310、2311、2312、2313、2314、2315、2316、2317、2318、2319、2320、2321、2322、2323、2324、2325、2326、2327、2328、2329、2330、2331、2332、2333、2334、2335、2336、2337、2338、2339、2340、2341、2342、2343、2344、2345、2346、2347、2348、2349、2350、2351、2352、2353、2354、2355、2356、2357、2358、2359、2360、2361、2362、2363、2364、2365、2366、2367、2368、2369、2370、2371、2372、2373、2374、2375、2376、2377、2378、2379、2380、2381、2382、2383、2384、2385、2386、2387、2388、2389、2390、2391、2392、2393、2394、2395、2396、2397、2398、2399、2400、2401、2402、2403、2404、2405、2406、2407、2408、2409、2410、2411、2412、2413、2414、2415、2416、2417、2418、2419、2420、2421、2422、2423、2424、2425、2426、2427、2428、2429、2430、2431、2432、2433、2434、2435、2436、2437、2438、2439、2440、2441、2442、2443、2444、2445、2446、2447、2448、2449、2450、2451、2452、2453、2454、2455、2456、2457、2458、2459、2460、2461、2462、2463、2464、2465、2466、2467、2468、2469、2470、2471、2472、2473、2474、2475、2476、2477、2478、2479、2480、2481、2482、2483、2484、2485、2486、2487、2488、2489、2490、2491、2492、2493、2494、2495、2496、2497、2498、2499、2500、2501、2502、2503、2504、2505、2506、2507、2508、2509、2510、2511、2512、2513、2514、2515、2516、2517、2518、2519、2520、2521、2522、2523、2524、2525、2526、2527、2528、2529、2530、2531、2532、2533、2534、2535、2536、2537、2538、2539、2540、2541、2542、2543、2544、2545、2546、2547、2548、2549、2550、2551、2552、2553、2554、2555、2556、2557、2558、2559、2560、2561、2562、2563、2564、2565、2566、2567、2568、2569、2570、2571、2572、2573、2574、2575、2576、2577、2578、2579、2580、2581、2582、2583、2584、2585、2586、2587、2588、2589、2590、2591、2592、2593、2594、2595、2596、2597、2598、2599、2600、2601、2602、2603、2604、2605、2606、2607、2608、2609、2610、2611、2612、2613、2614、2615、2616、2617、2618、2619、2620、2621、2622、2623、2624、2625、2626、2627、2628、2629、2630、2631、2632、2633、2634、2635、2636、2637、2638、2639、2640、2641、2642、2643、2644、2645、2646、2647、2648、2649、2650、2651、2652、2653、2654、2655、2656、2657、2658、2659、2660、2661、2662、2663、2664、2665、2666、2667、2668、2669、2670、2671、2672、2673、2674、2675、2676、2677、2678、2679、2680、2681、2682、2683、2684、2685、2686、2687、2688、2689、2690、2691、2692、2693、2694、2695、2696、2697、2698、2699、2700、2701、2702、2703、2704、2705、2706、2707、2708、2709、2710、2711、2712、2713、2714、2715、2716、2717、2718、2719、2720、2721、2722、2723、2724、2725、2726、2727、2728、2729、2730、2731、2732、2733、2734、2735、2736、2737、2738、2739、2740、2741、2742、2743、2744、2745、2746、2747、2748、2749、2750、2751、2752、2753、2754、2755、2756、2757、2758、2759、2760、2761、2762、2763、2764、2765、2766、2767、2768、2769、2770、2771、2772、2773、2774、2775、2776、2777、2778、2779、2780、2781、2782、2783、2784、2785、2786、2787、2788、2789、2790、2791、2792、2793、2794、2795、2796、2797、2798、2799、2800、2801、2802、2803、2804、2805、2806、2807、2808、2809、2810、2811、2812、2813、2814、2815、2816、2817、2818、2819、2820、2821、2822、2823、2824、2825、2826、2827、2828、2829、2830、2831、2832、2833、2834、2835、2836、2837、2838、2839、2840、2841、2842、2843、2844、2845、2846、2847、2848、2849、2850、2851、2852、2853、2854、2855、2856、2857、2858、2859、2860、2861、2862、2863、2864、2865、2866、2867、2868、2869、2870、2871、2872、2873、2874、2875、2876、2877、2878、2879、2880、2881、2882、2883、2884、2885、2886、2887、2888、2889、2890、2891、2892、2893、2894、2895、2896、2897、2898、2899、2900、2901、2902、2903、2904、2905、2906、2907、2908、2909、2910、2911、2912、2913、2914、2915、2916、2917、2918、2919、2920、2921、2922、2923、2924、2925、2926、2927、2928、2929、2930、2931、2932、2933、2934、2935、2936、2937、2938、2939、2940、2941、2942、2943、2944、2945、2946、2947、2948、2949、2950、2951、2952、2953、2954、2955、2956、2957、2958、2959、2960、2961、2962、2963、2964、2965、2966、2967、2968、2969、2970、2971、2972、2973、2974、2975、2976、2977、2978、2979、2980、2981、2982、2983、2984、2985、2986、2987、2988、2989、2990、2991、2992、2993、2994、2995、2996、2997、2998、2999、3000、3001、3002、3003、3004、3005、3006、3007、3008、3009、3010、3011、3012、3013、3014、3015、3016、3017、3018、3019、3020、3021、3022、3023、3024、3025、3026、3027、3028、3029、3030、3031、3032、3033、3034、3035、3036、3037、3038、3039、3040、3041、3042、3043、3044、3045、3046、3047、3048、3049、3050、3051、3052、3053、3054、3055、3056、3057、3058、3059、3060、3061、3062、3063、3064、3065、3066、3067、3068、3069、3070、3071、3072、3073、3074、3075、3076、3077、3078、3079、3080、3081、3082、3083、3084、3085、3086、3087、3088、3089、3090、3091、3092、3093、3094、3095、3096、3097、3098、3099、3100、3101、3102、3103、3104、3105、3106、3107、3108、3109、3110、3111、3112、3113、3114、3115、3116、3117、3118、3119、3120、3121、3122、3123、3124、3125、3126、3127、3128、3129、3130、3131、3132、3133、3134、3135、3136、3137、3138、3139、3140、3141、3142、3143、3144、3145、3146、3147、3148、3149、3150、3151、3152、3153、3154、3155、3156、3157、3158、3159、3160、3161、3162、3163、3164、3165、3166、3167、3168、3169、3170、3171、3172、3173、3174、3175、3176、3177、3178、3179、3180、3181、3182、3183、3184、3185、3186、3187、3188、3189、3190、3191、3192、3193、3194、3195、3196、3197、3198、3199、3200、3201、3202、3203、3204、3205、3206、3207、3208、3209、3210、3211、3212、3213、3214、3215、3216、3217、3218、3219、3220、3221、3222、3223、3224、3225、3226、3227、3228、3229、3230、3231、3232、3233、3234、3235、3236、3237、3238、3239、3240、3241、3242、3243、3244、3245、3246、3247、3248、3249及3250個核苷酸。病毒基因組之任何填充區域之長度可為50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150、1150-1200、1200-1250、1250-1300、1300-1350、1350-1400、1400-1450、1450-1500、1500-1550、1550-1600、1600-1650、1650-1700、1700-1750、1750-1800、1800-1850、1850-1900、1900-1950、1950-2000、2000-2050、2050-2100、2100-2150、2150-2200、2200-2250、2250-2300、2300-2350、2350-2400、2400-2450、2450-2500、2500-2550、2550-2600、2600-2650、2650-2700、2700-2750、2750-2800、2800-2850、2850-2900、2900-2950、2950-3000、3000-3050、3050-3100、3100-3150、3150-3200及3200-3250個核苷酸。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約55個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約56個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約97個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約103個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約105個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約357個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約363個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約712個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約714個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約1203個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約1209個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約1512個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約1519個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約2395個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約2403個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約2405個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約3013個核苷酸之填充區域。作為一非限制性實例，病毒基因組包含長度為約3021個核苷酸之填充區域。
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組包含至少一個填充序列區域填充序列區域之非限制性實例描述於表19中。表 19 . 填充序列區域
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組包含一個填充序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL4序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL5序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL6序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL7序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL18序列區域。
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組包含兩個填充序列區域。在一個實施例中，兩個填充序列區域為FILL1序列區域及FILL2序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL3序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL4序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL5序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL6序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL7序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域及FILL3序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域及FILL4序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域及FILL5序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域及FILL6序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域及FILL7序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL3序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL4序列區域及FILL5序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL4序列區域及FILL6序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL4序列區域及FILL7序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL4序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL4序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL4序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL4序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL4序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL4序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL4序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL4序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL4序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL4序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL4序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL5序列區域及FILL6序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL5序列區域及FILL7序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL5序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL5序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL5序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL5序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL5序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL5序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL5序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL5序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL5序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL5序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL5序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL6序列區域及FILL7序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL6序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL6序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL6序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL6序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL6序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL6序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL6序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL6序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL6序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL6序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL6序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL7序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL7序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL7序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL7序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL7序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL7序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL7序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL7序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL7序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL7序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL7序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL8序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL8序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL8序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL8序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL8序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL8序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL8序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL8序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL8序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL8序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL9序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL9序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL9序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL9序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL9序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL9序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL9序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL9序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL9序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL10序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL10序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL10序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL10序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL10序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL10序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL10序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL10序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL11序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL11序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL11序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL11序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL11序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL11序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL11序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL12序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL12序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL12序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL12序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL12序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL12序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL13序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL13序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL13序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL13序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL13序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL14序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL14序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL14序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL14序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL15序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL15序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL15序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL16序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL16序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL17序列區域及FILL18序列區域。
在一個實施例中，AAV顆粒病毒基因組包含三個填充序列區域。在一個實施例中，兩個填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL3序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL4序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL5序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL6序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL7序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL2序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL3序列區域及FILL4序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL3序列區域及FILL5序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL3序列區域及FILL6序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL3序列區域及FILL7序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL3序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL3序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL3序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL3序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL3序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL3序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL3序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL3序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL3序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL3序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL3序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL4序列區域及FILL5序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL4序列區域及FILL6序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL4序列區域及FILL7序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL4序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL4序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL4序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL4序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL4序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL4序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL4序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL4序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL4序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL4序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL4序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL5序列區域及FILL6序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL5序列區域及FILL7序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL5序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL5序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL5序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL5序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL5序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL5序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL5序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL5序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL5序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL5序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL5序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL6序列區域及FILL7序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL6序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL6序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL6序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL6序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL6序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL6序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL6序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL6序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL6序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL6序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL6序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL7序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL7序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL7序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL7序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL7序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL7序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL7序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL7序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL7序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL7序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL7序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL8序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL8序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL8序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL8序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL8序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL8序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL8序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL8序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL8序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL8序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL9序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL9序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL9序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL9序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL9序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL9序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL9序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL9序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL9序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL10序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL10序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL10序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL10序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL10序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL10序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL10序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL10序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL11序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL11序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL11序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL11序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL11序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL11序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL11序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL12序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL12序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL12序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL12序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL12序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL12序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL13序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL13序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL13序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL13序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL13序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL14序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL14序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL14序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL14序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL15序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL15序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL15序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL16序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL16序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL1序列區域、FILL17序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL3序列區域及FILL4序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL3序列區域及FILL5序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL3序列區域及FILL6序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL3序列區域及FILL7序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL3序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL3序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL3序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL3序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL3序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL3序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL3序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL3序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL3序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL3序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL3序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL4序列區域及FILL5序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL4序列區域及FILL6序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL4序列區域及FILL7序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL4序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL4序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL4序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL4序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL4序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL4序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL4序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL4序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL4序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL4序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL4序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL5序列區域及FILL6序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL5序列區域及FILL7序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL5序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL5序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL5序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL5序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL5序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL5序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL5序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL5序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL5序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL5序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL5序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL6序列區域及FILL7序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL6序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL6序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL6序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL6序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL6序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL6序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL6序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL6序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL6序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL6序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL6序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL7序列區域及FILL8序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL7序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL7序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL7序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL7序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL7序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL7序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL7序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL7序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL7序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL7序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL8序列區域及FILL9序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL8序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL8序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL8序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL8序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL8序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL8序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL8序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL8序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL8序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL9序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL9序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL9序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL9序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL9序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域為FILL2序列區域、FILL9序列區域及FILL15序列區域。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列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL7序列區域、FILL16序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL7序列區域、FILL16序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL7序列區域、FILL17序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL9序列區域及FILL10序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL9序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL9序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL9序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL9序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL9序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL9序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL9序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL9序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL10序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL10序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL10序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL10序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL10序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL10序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL10序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL10序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL11序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL11序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL11序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL11序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL11序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL11序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL11序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL12序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL12序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL12序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL12序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL12序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL12序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL13序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL13序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL13序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL13序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL13序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL14序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL14序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL14序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL14序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL15序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL15序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL15序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL16序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL16序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL8序列區域、FILL17序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL10序列區域及FILL11序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL10序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL10序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL10序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL10序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL10序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL10序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL10序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL11序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL11序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL11序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL11序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL11序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL11序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL11序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL12序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL12序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL12序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL12序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL12序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL12序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL13序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL13序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL13序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL13序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL13序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL14序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL14序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL14序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL14序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL15序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL15序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL15序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL16序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL16序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL9序列區域、FILL17序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL11序列區域及FILL12序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL11序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL11序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL11序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL11序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL11序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL11序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL12序列區域及FILL13序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL12序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL12序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL12序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL12序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL12序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL13序列區域及FILL14序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL13序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL13序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL13序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL13序列區域及FILL18序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL14序列區域及FILL15序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL14序列區域及FILL16序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL14序列區域及FILL17序列區域。在一個實施例中，填充序列區域係FILL10序列區域、FILL14序列區域及FILL18序列區域。在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在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組可包含至少一個增強子序列區域。增強子序列區域可獨立地具有諸如但不限於300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399及400個核苷酸的長度。病毒基因組之增強子區域之長度可為300-310、300-325、305-315、310-320、315-325、320-330、325-335、325-350、330-340、335-345、340-350、345-355、350-360、350-375、355-365、360-370、365-375、370-380、375-385、375-400、380-390、385-395及390-400個核苷酸。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約303個核苷酸之增強子區域。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約382個核苷酸之增強子區域。
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含至少一個增強子序列區域。增強子序列區域之非限制性實例描述於表20中。表 20 . 增強子序列區域
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含一個增強子序列區域。在一個實施例中，增強子序列區域係增強子1序列區域。在一個實施例中，增強子序列區域係增強子2序列區域。
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含兩個增強子序列區域。在一個實施例中，增強子序列區域係增強子1序列區域及增強子2序列區域。
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組可包含至少一個啟動子序列區域。啟動子序列區域可獨立地具有諸如但不限於4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599及600個核苷酸的長度。病毒基因組之啟動子區域之長度可為4-10、10-20、10-50、20-30、30-40、40-50、50-60、50-100、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、100-150、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、150-200、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、200-250、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、250-300、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310、300-350、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、350-400、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、400-450、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、450-500、460-470、470-480、480-490、490-500、500-510、500-550、510-520、520-530、530-540、540-550、550-560、550-600、560-570、570-580、580-590及590-600個核苷酸。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約4個核苷酸之啟動子區。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約17個核苷酸之啟動子區。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約204個核苷酸之啟動子區。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約219個核苷酸之啟動子區。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約260個核苷酸之啟動子區。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約303個核苷酸之啟動子區。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約382個核苷酸之啟動子區。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約588個核苷酸之啟動子區。
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含至少一個啟動子序列區域。啟動子序列區域之非限制性實例描述於表21中。表 21 . 啟動子序列區域
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含一個啟動子序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子1。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子2。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子3。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子4。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子5。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子6。
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含兩個啟動子序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子1序列區域及啟動子2序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子1序列區域及啟動子3序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子1序列區域及啟動子4序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子1序列區域及啟動子5序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子1序列區域及啟動子6序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子2序列區域及啟動子3序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子2序列區域及啟動子4序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子2序列區域及啟動子5序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子2序列區域及啟動子6序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子3序列區域及啟動子4序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子3序列區域及啟動子5序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子3序列區域及啟動子6序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子4序列區域及啟動子5序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子4序列區域及啟動子6序列區域。在一個實施例中，啟動子序列區域係啟動子5序列區域及啟動子6序列區域。
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組可包含至少一個外顯子序列區域。外顯子區域可獨立地具有諸如但不限於2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149及150個核苷酸的長度。病毒基因組之外顯子區域之長度可為2-10、5-10、5-15、10-20、10-30、10-40、15-20、15-25、20-30、20-40、20-50、25-30、25-35、30-40、30-50、30-60、35-40、35-45、40-50、40-60、40-70、45-50、45-55、50-60、50-70、50-80、55-60、55-65、60-70、60-80、60-90、65-70、65-75、70-80、70-90、70-100、75-80、75-85、80-90、80-100、80-110、85-90、85-95、90-100、90-110、90-120、95-100、95-105、100-110、100-120、100-130、105-110、105-115、110-120、110-130、110-140、115-120、115-125、120-130、120-140、120-150、125-130、125-135、130-140、130-150、135-140、135-145、140-150及145-150核苷酸。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約53個核苷酸之外顯子區域。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約134個核苷酸之外顯子區域。
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含至少一個外顯子序列區域。外顯子序列區域之非限制性實例描述於表22中。表 22 . 外顯子序列區域
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含一個外顯子序列區域。在一個實施例中，外顯子序列區域係外顯子1序列區域。在一個實施例中，外顯子序列區域係外顯子2序列區域。
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含兩個外顯子序列區域。在一個實施例中，外顯子序列區域係外顯子1序列區域及外顯子2序列區域。
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組可包含至少一個內含子序列區域。內含子區域可獨立地具有諸如但不限於25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349及350個核苷酸的長度。病毒基因組之內含子區域之長度可為25-35、25-50、35-45、45-55、50-75、55-65、65-75、75-85、75-100、85-95、95-105、100-125、105-115、115-125、125-135、125-150、135-145、145-155、150-175、155-165、165-175、175-185、175-200、185-195、195-205、200-225、205-215、215-225、225-235、225-250、235-245、245-255、250-275、255-265、265-275、275-285、275-300、285-295、295-305、300-325、305-315、315-325、325-335、325-350及335-345個核苷酸。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約32個核苷酸之內含子區域。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約172個核苷酸之內含子區域。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約201個核苷酸之內含子區域。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約347個核苷酸之內含子區域。
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含至少一個內含子序列區域。內含子序列區域之非限制性實例描述於表23中。表 23 . 內含子序列區域
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含一個內含子序列區域。在一個實施例中，內含子序列區域係內含子1序列區域。在一個實施例中，內含子序列區域係內含子2序列區域。在一個實施例中，內含子序列區域係內含子3序列區域。在一個實施例中，內含子序列區域係內含子4序列區域。
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含兩個內含子序列區域。在一個實施例中，內含子序列區域係內含子1序列區域及內含子2序列區域。在一個實施例中，內含子序列區域係內含子1序列區域及內含子3序列區域。在一個實施例中，內含子序列區域係內含子1序列區域及內含子4序列區域。在一個實施例中，內含子序列區域係內含子2序列區域及內含子3序列區域。在一個實施例中，內含子序列區域係內含子2序列區域及內含子4序列區域。在一個實施例中，內含子序列區域係內含子3序列區域及內含子4序列區域。
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含三個內含子序列區域。在一個實施例中，內含子序列區域係內含子1序列區域、內含子2序列區域及內含子3序列區域。在一個實施例中，內含子序列區域係內含子1序列區域、內含子2序列區域及內含子4序列區域。在一個實施例中，內含子序列區域係內含子1序列區域、內含子3序列區域及內含子4序列區域。在一個實施例中，內含子序列區域係內含子2序列區域、內含子3序列區域及內含子4序列區域。
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組可包含至少一個多腺苷酸化信號序列區域。多腺苷酸化信號區域序列區域可獨立地具有諸如但不限於4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599及600個核苷酸的長度。病毒基因組之多腺苷酸化信號序列區域之長度可為4-10、10-20、10-50、20-30、30-40、40-50、50-60、50-100、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、100-150、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、150-200、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、200-250、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、250-300、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310、300-350、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、350-400、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、400-450、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、450-500、460-470、470-480、480-490、490-500、500-510、500-550、510-520、520-530、530-540、540-550、550-560、550-600、560-570、570-580、580-590及590-600個核苷酸。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約127個核苷酸之多腺苷酸化信號序列區域。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約225個核苷酸之多腺苷酸化信號序列區域。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約476個核苷酸之多腺苷酸化信號序列區域。作為非限制性實例，病毒基因組包含長度為約477個核苷酸之多腺苷酸化信號序列區域。
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含至少一個多腺苷酸化(polyA)信號序列區域。polyA信號序列區域之非限制性實例描述於表24中。表 24 . polyA 信號序列區域
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含一個polyA信號序列區域。在一個實施例中，polyA信號序列區域係PolyA1序列區域。在一個實施例中，polyA信號序列區域係PolyA2序列區域。在一個實施例中，polyA信號序列區域係PolyA3序列區域。在一個實施例中，polyA信號序列區域係PolyA4序列區域。
在一個實施例中，AAV粒子病毒基因組包含超過一個polyA信號序列區域。
AAV粒子可加以修飾以增強遞送效率。包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的此類經修飾之AAV粒子可經有效封裝且可用於以高頻率及最小毒性成功感染靶細胞。
在一些實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可為人類血清型AAV粒子。此類人類AAV粒子可源自任何已知血清型，例如血清型AAV1-AAV11中之任一者。作為非限制性實例，AAV粒子可為：包含AAV1衍生之蛋白殼中的AAV1衍生之基因組之載體；包含AAV2衍生之蛋白殼中的AAV2衍生之基因組之載體；包含AAV4衍生之蛋白殼中的AAV4衍生之基因組之載體；包含AAV6衍生之蛋白殼中的AAV6衍生之基因組之載體；或包含AAV9衍生之蛋白殼中的AAV9衍生之基因組之載體。
在其他實施例中，包含用於編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可為含有源自至少兩種不同AAV血清型之序列及/或組分之假型雜交或嵌合AAV粒子。假型AAV粒子可為包含以下之載體：源自一種AAV血清型之AAV基因組及至少部分源自不同AAV血清型之衣殼蛋白。作為非限制性實例，此類假型AAV粒子可為：包含AAV1衍生之蛋白殼中的AAV2衍生之基因組之載體；或包含AAV6衍生之蛋白殼中的AAV2衍生之基因組之載體；或包含AAV4衍生之蛋白殼中的AAV2衍生之基因組之載體；或包含AAV9衍生之蛋白殼中的AAV2衍生之基因組之載體。以類似方式，本發明涵蓋任何雜交或嵌合AAV粒子。
在其他實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可用於將siRNA分子遞送至中樞神經系統(例如美國專利第6,180,613號；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
在一些態樣中，包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可進一步包含包括來自非病毒來源之肽的經修飾之蛋白殼。在其他態樣中，AAV粒子可含有CNS特定嵌合蛋白殼以促進將經編碼之siRNA雙螺旋體遞送至大腦及脊髓中。舉例而言，來自展現CNS向性之AAV變體之帽核苷酸序列的對準可經構建以鑑別可變區(VR)序列及結構。包含調節多核苷酸之多順反子 AAV 粒子
在一個實施例中，AAV載體包含編碼超過一種調節多核苷酸之核酸序列。在一個實施例中，AAV載體包含編碼超過一種siRNA分子之核酸序列。AAV載體可包含編碼2、3、4、5、6、7、8、9或超過9種調節多核苷酸之核酸序列。AAV載體可包含編碼2、3、4、5、6、7、8、9或超過9種siRNA分子之核酸序列。
當AAV載體包含編碼超過一種調節多核苷酸(例如siRNA分子)之至少一種核酸序列時，AAV載體可稱為多順反子的。當AAV載體之核酸序列編碼靶向單一標靶之調節多核苷酸分子(例如siRNA分子)時，則AAV載體可稱為「單特異性多順反子」AAV載體。當AAV載體之核酸序列編碼靶向超過一個標靶之調節多核苷酸分子(例如siRNA分子)時，則AAV載體可稱為「多特異性多順反子」AAV載體。當AAV載體之核酸序列編碼靶向兩個標靶之調節多核苷酸分子時，則AAV載體可稱為「雙特異性多順反子」AAV載體。
在一個實施例中，AAV載體包含至少一種核酸序列，其編碼靶向單一靶基因之調節多核苷酸，例如siRNA分子。AAV載體可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或超過9種核酸序列，其編碼靶向單一靶基因之單一調節多核苷酸，例如siRNA分子。作為非限制性實例，靶基因係HTT。作為另一非限制性實例，靶基因係SOD1。
在一個實施例中，AAV載體係單特異性多順反子AAV載體且包含編碼靶向靶基因之兩種調節多核苷酸(例如siRNA分子)之核酸序列。在一個態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)包含同義股。在另一態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)包含異義股。在一個態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)包含具有與靶基因序列上之同一區域至少80%互補性(例如80%、85%、90%、95%、99%或超過99%、80-85%、80-90%、85-90%、85-95%、90-95%、90-100%)之異義股。在一個態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)包含具有與靶基因序列之不同區域之互補性的異義股。作為非限制性實例，靶基因係HTT。作為另一非限制性實例，靶基因係SOD1。
在一個實施例中，AAV載體係單特異性多順反子AAV載體且包含編碼靶向靶基因之三種調節多核苷酸(例如siRNA分子)之核酸序列。在一個態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)包含同義股。在另一態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)中之每一者包含異義股。在另一態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)中之兩種包含同義股且第三調節多核苷酸(例如siRNA分子)包含異義股。在一個態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)中之每一者包含具有與靶基因序列上之同一區域至少80%互補性(例如80%、85%、90%、95%、99%或超過99%、80-85%、80-90%、85-90%、85-95%、90-95%、90-100%)之異義股。在一個態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)中之兩種包含具有與靶基因序列上之同一區域至少80%互補性(例如80%、85%、90%、95%、99%或超過99%、80-85%、80-90%、85-90%、85-95%、90-95%、90-100%)之異義股。在一個態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)包含具有與靶基因序列之不同區域之互補性的異義股。作為非限制性實例，靶基因係HTT。作為另一非限制性實例，靶基因係SOD1。
在一個實施例中，AAV載體係單特異性多順反子AAV載體且包含編碼靶向靶基因之四種調節多核苷酸(例如siRNA分子)之核酸序列。在一個態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)包含同義股。在另一態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)中之每一者包含異義股。在另一態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)中之兩種包含第一有義股序列且其他兩種調節多核苷酸(例如siRNA分子)包含第二有義股序列。在另一態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)中之三種包含第一有義股序列且另一種調節多核苷酸(例如siRNA分子)包含第二有義股序列。在一個態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)中之每一者包含具有與靶基因序列上之同一區域至少80%互補性(例如80%、85%、90%、95%、99%或超過99%、80-85%、80-90%、85-90%、85-95%、90-95%、90-100%)之異義股。在一個態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)中之兩種包含具有與靶基因序列上之同一區域至少80%互補性(例如80%、85%、90%、95%、99%或超過99%、80-85%、80-90%、85-90%、85-95%、90-95%、90-100%)之異義股。在一個態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)包含具有與靶基因序列之不同區域之互補性的異義股。作為非限制性實例，靶基因係HTT。作為另一非限制性實例，靶基因係SOD1。
在一個實施例中，AAV粒子係雙特異性多順反子AAV粒子且包含編碼兩種調節多核苷酸(例如siRNA分子)之核酸序列。在一個態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)中之一種靶向第一靶基因且另一種調節多核苷酸(例如siRNA分子)靶向第二靶基因且可減少中樞神經系統之至少一個區域中蛋白質及/或mRNA之表現以治療中樞神經系統之疾病或病症。作為非限制性實例，標靶基因係HTT及SOD1且疾病係HD及ALS。
在一個實施例中，AAV粒子係多特異性多順反子AAV粒子且包含編碼兩種或更多種調節多核苷酸(例如siRNA分子)之核酸序列。在一個態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)中之一種靶向第一靶基因且另一種調節多核苷酸(例如siRNA分子)靶向第二靶基因且可減少中樞神經系統之至少一個區域中蛋白質及/或mRNA之表現以治療中樞神經系統之疾病或病症。在一個態樣中，調節多核苷酸(例如siRNA分子)中之每一種靶向不同mRNA以減少中樞神經系統之至少一個區域中蛋白質及/或mRNA之表現以治療中樞神經系統之疾病或病症。作為非限制性實例，標靶基因係HTT及SOD1且疾病係HD及ALS。
在一個實施例中，AAV粒子可包含調節多核苷酸，該等調節多核苷酸包含超過一種分子骨架序列。AAV粒子可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或超過9種分子骨架序列。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含至少一個反向末端重複序列區域、至少一個增強子序列區域、至少一個啟動子序列區域、兩個調節多核苷酸區域及至少一個多腺苷酸化信號序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子序列區域、CBA啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸序列區域及兔血球蛋白多腺苷酸化信號序列區域。具有全部上述序列模組之用於本發明之多順反子AAV粒子的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表25中。在表25中，描述序列區域之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區域之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYPC1 (SEQ ID NO: 1831))。表 25 . ITR 至 ITR 序列中之序列區域
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1831 (VOYPC1)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子序列區域、CBA啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及兔血球蛋白多腺苷酸化信號序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含至少一個反向末端重複(ITR)序列區域、至少一個增強子序列區域、至少一個啟動子序列區域、至少一個內含子序列區域、兩個調節多核苷酸區域及至少一個多腺苷酸化信號序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子序列區域、CBA啟動子序列區域、SV40內含子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸序列區域及兔血球蛋白多腺苷酸化信號序列區域。具有全部上述序列模組之用於本發明之多順反子AAV粒子的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表26及27中。在表26及27中，描述序列區域之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區域之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYPC2 (SEQ ID NO: 1832))。表 26 . ITR 至 ITR 序列中之序列區域 表 27 . ITR 至 ITR 序列中之序列區域
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1832 (VOYPC2)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子序列區域、CBA啟動子序列區域、SV40內含子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及兔血球蛋白多腺苷酸化信號序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1833 (VOYPC3)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子序列區域、CBA啟動子序列區域、SV40內含子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及兔血球蛋白多腺苷酸化信號序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1834 (VOYPC4)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子序列區域、CBA啟動子序列區域、SV40內含子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及兔血球蛋白多腺苷酸化信號序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1835 (VOYPC5)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子序列區域、CBA啟動子序列區域、SV40內含子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及兔血球蛋白多腺苷酸化信號序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1836 (VOYPC6)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子序列區域、CBA啟動子序列區域、SV40內含子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及兔血球蛋白多腺苷酸化信號序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1837 (VOYPC7)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子序列區域、CBA啟動子序列區域、SV40內含子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及兔血球蛋白多腺苷酸化信號序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1838 (VOYPC8)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子序列區域、CBA啟動子序列區域、SV40內含子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及兔血球蛋白多腺苷酸化信號序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含至少一個反向末端重複(ITR)序列區域、至少一個啟動子序列區域、兩個調節多核苷酸區域及至少一個多腺苷酸化信號序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含至少一個反向末端重複(ITR)序列區域、至少一個啟動子序列區域及兩個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CBA啟動子序列區域、H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸序列區域。具有全部上述序列模組之用於本發明之多順反子AAV粒子的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表28中。在表28中，描述序列區域之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區域之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYPC1 (SEQ ID NO: 1831))。表 28 . ITR 至 ITR 序列中之序列區域
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含Pol III啟動子。在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含3型Pol III啟動子。在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含H1啟動子。在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含U6啟動子。在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含U3啟動子。在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含U7啟動子。在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含7SK啟動子。在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含MRP啟動子。在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含Pol II啟動子。在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含截斷Pol II啟動子。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1839 (VOYPC9)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CBA啟動子序列區域、H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1840 (VOYPC10)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CBA啟動子序列區域、H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1841 (VOYPC11)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CBA啟動子序列區域、H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1842 (VOYPC12)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CBA啟動子序列區域、H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、兩個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因之兩個調節多核苷酸序列區域及兩個H1終止子序列，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身Pol III啟動子，例如3型Pol III啟動子，例如H1啟動子且之後其自身啟動子終止子序列，例如H1終止子序列驅動。具有此等序列模組之用於本發明之多順反子AAV粒子的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表29中。在表29中，描述序列區域之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區域之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYPC59 (SEQ ID NO: 2682))。 表29.ITR至ITR序列中之序列區域
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 2682 (VOYPC59)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、兩個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸序列區域及兩個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 2683 (VOYPC60)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、兩個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸序列區域及兩個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 2684 (VOYPC61)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、兩個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸序列區域及兩個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 2685 (VOYPC62)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、兩個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸序列區域及兩個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含兩個啟動子序列區域、兩個調節多核苷酸區域及至少一個多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸序列區域及多腺苷酸化序列區域。具有全部上述序列模組之用於本發明之多順反子AAV粒子的序列之非限制性實例描述於表30及31中。在表30及31中，描述序列區域之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區域之長度(區域長度)以及序列之名稱(例如VOYPC13)。表 30 . 序列區域 表 31 . 序列區域
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC13中所述之序列模組，其包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC14中所述之序列模組，其包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC15中所述之序列模組，其包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC16中所述之序列模組，其包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC17中所述之序列模組，其包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC18中所述之序列模組，其包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC19中所述之序列模組，其包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC20中所述之序列模組，其包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點、靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域及多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點、靶向不同相關基因(HTT及SOD1)之兩個調節多核苷酸序列區域及多腺苷酸化序列區域。具有全部上述序列模組之用於本發明之多順反子AAV粒子的序列之非限制性實例描述於表32中。在表32中，描述序列區域之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區域之長度(區域長度)以及序列之名稱(例如VOYPC25)。表 32 . 序列區域 在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC25中所述之序列模組，其包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點、靶向兩種不同相關基因(HTT及SOD1)之兩個調節多核苷酸區域及多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC26中所述之序列模組，其包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點、靶向兩種不同相關基因(HTT及SOD1)之兩個調節多核苷酸區域及多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含三個啟動子序列區域、兩個調節多核苷酸區域及至少一個多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含GTTG區域、兩個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸序列區域。具有全部上述序列模組之用於本發明之多順反子AAV粒子的序列之非限制性實例描述於表33中。在表33中，描述序列區域之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區域之長度(區域長度)以及序列之名稱(例如VOYPC21)。表 33. 序列區域
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC21中所述之序列模組，其包含GTTG區域、兩個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC22中所述之序列模組，其包含GTTG區域、兩個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC23中所述之序列模組，其包含GTTG區域、兩個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC24中所述之序列模組，其包含GTTG區域、兩個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之兩個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含至少一個反向末端重複(ITR)序列區域、至少一個增強子序列區域、至少一個啟動子序列區域、至少一個內含子序列區域、三個調節多核苷酸區域及至少一個多腺苷酸化信號序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子序列區域、GTTG區域、SV40內含子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸序列區域及兔血球蛋白多腺苷酸化信號序列區域。具有全部上述序列模組之用於本發明之多順反子AAV粒子的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表34中。在表34中，描述序列區域之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區域之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYPC27 (SEQ ID NO:1843))。表 34 . ITR 至 ITR 序列中之序列區域
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1843 (VOYPC27)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子序列區域、CBA啟動子序列區域、SV40內含子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸序列區域及兔血球蛋白多腺苷酸化信號序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1844 (VOYPC28)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子序列區域、CBA啟動子序列區域、SV40內含子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸序列區域及兔血球蛋白多腺苷酸化信號序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含至少一個反向末端重複(ITR)序列區域、至少一個啟動子序列區域及三個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、三個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸序列區域。具有全部上述序列模組之用於本發明之多順反子AAV粒子的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表35及36中。在表35及36中，描述序列區域之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區域之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYPC29 (SEQ ID NO:1845))。表 35 . ITR 至 ITR 序列中之序列區域 表 36 . ITR 至 ITR 序列中之序列區域
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1845 (VOYPC29)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、三個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸序列區域及三個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1846 (VOYPC30)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、三個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸序列區域及三個H1終止子序列區域，以及三個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1847 (VOYPC31)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、三個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸序列區域及三個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1848 (VOYPC32)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、三個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸序列區域及三個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1849 (VOYPC33)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、三個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸序列區域及三個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1850 (VOYPC34)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、三個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸序列區域及三個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含兩個啟動子序列區域、三個調節多核苷酸區域及至少一個多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點、靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸序列區域及多腺苷酸化序列區域。具有全部上述序列模組之用於本發明之多順反子AAV粒子的序列之非限制性實例描述於表37中。在表37中，描述序列區域之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區域之長度(區域長度)以及序列之名稱(例如VOYPC35)。表 37. 序列區域
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC35中所述之序列模組，其包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點、靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸區域及多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含三個啟動子序列區域及三個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含GTTG區域、兩個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸序列區域。具有全部上述序列模組之用於本發明之多順反子AAV粒子的序列之非限制性實例描述於表38及39中。在表38及39中，描述序列區域之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區域之長度(區域長度)以及序列之名稱(例如VOYPC37)。表 38. 序列區域 表 39. 序列區域
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC37中所述之序列模組，其包含GTTG區域、三個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC38中所述之序列模組，其包含GTTG區域、三個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC39中所述之序列模組，其包含GTTG區域、三個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC40中所述之序列模組，其包含GTTG區域、三個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC41中所述之序列模組，其包含GTTG區域、三個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC42中所述之序列模組，其包含GTTG區域、三個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之三個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含至少一個反向末端重複(ITR)序列區域、至少一個啟動子序列區域及四個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、四個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸序列區域及四個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
具有全部上述序列模組之用於本發明之多順反子AAV粒子的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表40及41中。在表40及41中，描述序列區域之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區域之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYPC43 (SEQ ID NO: 1851))。表 40 . ITR 至 ITR 序列中之序列區域 表 41. ITR 至 ITR 序列中之序列區域
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1851 (VOYPC43)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、四個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸序列區域及四個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1852 (VOYPC44)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、四個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸序列區域及四個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1853 (VOYPC45)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、四個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸序列區域及四個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1854 (VOYPC46)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、四個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸序列區域及四個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1855 (VOYPC47)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、四個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸序列區域及四個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1856 (VOYPC48)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、四個H1啟動子序列區域、靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸序列區域及四個H1終止子序列區域，其中各調節多核苷酸序列區域由其自身H1啟動子且之後其自身H1終止子驅動。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含至少一個反向末端重複(ITR)序列區域、至少一個增強子序列區域、至少一個內含子序列區域、至少一個啟動子序列區域及四個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子序列區域、四個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸序列區域。具有全部上述序列模組之用於本發明之多順反子AAV粒子的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表42中。在表42中，描述序列區域之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區域之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYPC49 (SEQ ID NO: 1857))。表 42 . ITR 至 ITR 序列中之序列區域
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1857 (VOYPC49)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子、SV40內含子、靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸區域及多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含SEQ ID NO: 1858 (VOYPC50)，其包含5'反向末端重複(ITR)序列區域及3' ITR序列區域、CMV增強子、SV40內含子、靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸區域及多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含兩個啟動子序列區域、四個調節多核苷酸區域及至少一個多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點區域、靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸序列區域及多腺苷酸化序列區域。具有全部上述序列模組之用於本發明之多順反子AAV粒子的序列之非限制性實例描述於表43中。在表43中，描述序列區域之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區域之長度(區域長度)以及序列之名稱(例如VOYPC51)。表 43. 序列區域
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC51中所述之序列模組，其包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點區域、靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸區域及多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC52中所述之序列模組，其包含CMV啟動子序列區域、T7引子結合位點區域、靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸區域及多腺苷酸化序列區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含五個啟動子序列區域及四個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含GTTG區域、四個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸序列區域。具有全部上述序列模組之用於本發明之多順反子AAV粒子的序列之非限制性實例描述於表44及45中。在表44及45中，描述序列區域之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區域之長度(區域長度)以及序列之名稱(例如VOYPC53)。表 44. 序列區域 表 45. 序列區域
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC53中所述之序列模組，其包含GTTG區域、四個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC54中所述之序列模組，其包含GTTG區域、四個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC55中所述之序列模組，其包含GTTG區域、四個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC56中所述之序列模組，其包含GTTG區域、四個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC57中所述之序列模組，其包含GTTG區域、四個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸區域。
在一個實施例中，多順反子AAV粒子病毒基因組包含VOYPC58中所述之序列模組，其包含GTTG區域、四個H1啟動子序列區域及靶向同一相關基因(HTT)之四個調節多核苷酸區域。病毒產生
本發明提供一種藉由在病毒複製細胞中進行病毒基因組複製來產生細小病毒粒子，例如AAV粒子之方法，該方法包含使病毒複製細胞與AAV聚核苷酸或AAV基因組接觸。
本發明提供一種用於產生具有提高(enhanced/increased/improved)之轉導效率之AAV粒子的方法，其包含以下步驟：1)用穿梭載體及病毒構築體載體及/或AAV負載構築體載體共同轉染勝任細菌細胞；2)分離所得病毒構築體表現載體及AAV負載構築體表現載體且分別轉染病毒複製細胞；3)分離及純化包含病毒構築體表現載體或AAV負載構築體表現載體之所得負載及病毒構築體粒子；4)用包含病毒構築體表現載體或AAV負載構築體表現載體之AAV負載及病毒構築體粒子兩者共同感染病毒複製細胞；5)收穫及純化包含細小病毒基因組之病毒粒子。
在一個實施例中，本發明提供一種用於產生AAV粒子之方法，該方法包含以下步驟：1)用負載區、表現rep及cap基因之構築體及輔助構築體同時共同轉染諸如但不限於HEK293細胞之哺乳動物細胞；2)收穫及純化包含病毒基因組之AAV粒子。細胞
本發明提供包含AAV聚核苷酸及/或AAV基因組之細胞。
本文所揭示之病毒產生描述用於產生AAV粒子之製程及方法，該等AAV粒子接觸靶細胞以遞送負載構築體(例如重組病毒構築體)，該負載構築體包含編碼負載分子之聚核苷酸序列。
在一個實施例中，AAV粒子可在包含昆蟲細胞之病毒複製細胞中產生。
在培養物中昆蟲細胞之生長條件及在培養物中昆蟲細胞中之異源產物之產生為此項技術中熟知的，參見美國專利第6,204,059號，其內容以全文引用之方式併入本文中。
可根據本發明使用允許小病毒之複製且可維持於培養物中之任何昆蟲細胞。可使用來自草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)之細胞株，包括但不限於Sf9或Sf21細胞株、果蠅細胞株、或諸如白紋伊蚊(Aedes albopictus)衍生之細胞株的蚊子細胞株。使用昆蟲細胞表現異源蛋白質為有據可查的，因為其作為將核酸，諸如載體，例如昆蟲-細胞相容載體引入至此類細胞中之方法及將此類細胞維持於培養物中之方法。參見例如Methods in Molecular Biology, 編 Richard, Humana Press, NJ (1995)；O'Reilly等人, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994)；Samulski等人, J. Vir.63:3822-8 (1989); Kajigaya等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991)；Ruffing等人, J. Vir. 66:6922-30 (1992)；Kimbauer等人, Vir.219:37-44 (1996)；Zhao等人, Vir.272:382-93 (2000)；及Samulski等人, 美國專利第6,204,059號，其各自內容以全文引用之方式併入本文中。
病毒複製細胞可選自任何生物生物體，包括原核(例如細菌)細胞，及真核細胞，包括昆蟲細胞、酵母細胞及哺乳動物細胞。病毒複製細胞可包含哺乳動物細胞，諸如A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO. W138、HeLa、HEK293、Saos、C2C12、L細胞、HT1080、HepG2及源自哺乳動物之原發性成纖維細胞、肝細胞及成肌細胞。病毒複製細胞包含源自哺乳動物物種(包括但不限於人類、猴、小鼠、大鼠、兔及倉鼠)之細胞或細胞型，包括但不限於成纖維細胞、肝細胞、腫瘤細胞、細胞株轉化之細胞等。AAV 粒子之小規模產生
本文所揭示之病毒產生描述用於產生AAV粒子之製程及方法，該等AAV粒子接觸靶細胞以遞送負載(例如重組病毒構築體)，該負載包含編碼負載之聚核苷酸序列。
在一個實施例中，AAV粒子可在包含哺乳動物細胞之病毒複製細胞中產生。
常用於產生重組AAV粒子之病毒複製細胞包括但不限於293細胞、COS細胞、HeLa細胞、KB細胞及如以下各者中所述之其他哺乳動物細胞株：美國專利第6,156,303號、美國專利第5,387,484號、美國專利第5,741,683號、美國專利第5,691,176號及美國專利第5,688,676號、美國專利申請案2002/0081721及國際專利申請案WO 00/47757、WO 00/24916及WO 96/17947，其各自內容以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中，AAV粒子在哺乳動物細胞中產生，其中全部三種VP蛋白質以接近1:1:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。允許此控制之表現水準之調節機制包括兩種mRNA之產生，一種針對VP1且另一種針對VP2及VP3，其藉由差別剪接產生。
在另一實施例中，AAV粒子使用三重轉染方法在哺乳動物細胞中產生，其中負載構築體、細小病毒Rep及細小病毒Cap以及輔助構築體包含於三種不同構築體內。AAV粒子產生之三種組分之三重轉染方法可用於產生小批量病毒以用於包括轉導效率、目標組織(向性)評估及穩定性之分析。桿狀病毒
本文所揭示之粒子產生描述用於產生AAV粒子之製程及方法，該等AAV粒子接觸靶細胞以遞送包含編碼負載之聚核苷酸序列之負載構築體。
簡言之，病毒構築體載體及AAV負載構築體載體藉由熟習此項技術者已知且執行之標準分子生物學技術由轉座子供體/受體系統各自合併至亦稱為桿狀病毒質體之穿梭載體中。分離病毒複製細胞群體之轉染產生兩種桿狀病毒，一種包含病毒構築體表現載體，且另一種包含AAV負載構築體表現載體。兩種桿狀病毒可用於感染用於產生AAV粒子之單個病毒複製細胞群體。
用於在昆蟲細胞(包括但不限於草地黏蟲(Sf9)細胞)中產生病毒粒子之桿狀病毒表現載體提供高效價之病毒粒子產物。編碼病毒構築體表現載體及AAV負載構築體表現載體之重組桿狀病毒起始病毒複製細胞之噬菌體感染。自原發性感染釋放之傳染性桿狀病毒粒子二次感染培養物中之其他細胞，在許多感染循環中按指數律感染整個細胞培養物群體，其為初始感染倍率之函數，參見Urabe, M.等人, J Virol. 2006年2月; 80 (4):1874-85，其內容以全文引用之方式併入本文中。
在昆蟲細胞系統中產生具有桿狀病毒之AAV粒子可解決已知桿狀病毒基因及物理不穩定性。在一個實施例中，生產系統藉由利用無效價之感染細胞保存及規模放大系統相比於多種通道解決桿狀病毒不穩定性。產生病毒之細胞之小規模種菌培養用編碼病毒粒子之結構性、非結構性組分之病毒表現構築體轉染。將產生桿狀病毒感染之病毒之細胞收集至可在液氮中低溫保藏之等分試樣中；等分試樣保留存活性及感染性以用於感染產生大規模病毒之細胞培養物，Wasilko DJ等人, Protein Expr Purif. 2009年6月; 65(2):122-32，其內容以全文引用之方式併入本文中。
基因穩定之桿狀病毒可用於產生用以在無脊椎細胞中產生AAV粒子之組分中的一或多者之源。在一個實施例中，缺陷桿狀病毒表現載體可游離地維持在昆蟲細胞中。在此類實施例中，穿梭載體用複製控制元件，包括但不限於啟動子、增強子及/或細胞週期調節之複製元件工程改造。
在一個實施例中，桿狀病毒可用(非)可選標記工程改造以用於重組至殼質酶/組織蛋白酶基因座中。chia/v-cath基因座對於在組織培養物中繁殖桿狀病毒為非必要的，且V-cath (EC 3.4.22.50)係對含有基質之Arg-Arg二肽活性最強之半胱胺酸內切蛋白酶。Arg-Arg二肽存在於濃核病毒及小病毒蛋白殼結構蛋白中但不頻繁出現於依賴病毒VP1中。
在一個實施例中，容許桿狀病毒感染之穩定的病毒複製細胞用AAV複製及病毒粒子產生必需之元件中之任一者的至少一個穩定整合拷貝工程改造，該拷貝包括但不限於完整AAV基因組、Rep及Cap 基因、Rep基因、Cap基因、作為獨立轉錄盒之各Rep蛋白質、作為獨立轉錄盒之各VP蛋白質、AAP (組裝活化蛋白)、或至少一種具有天然或非天然啟動子之桿狀病毒輔助基因。大規模生產
在一些實施例中，AAV粒子生產可經修改以增加生產規模。根據本發明之大規模病毒生產方法可包括教示於以下各者中之彼等中之任一者：美國專利第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號及第7,491,508號或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號，其各自內容以全文引用之方式併入本文中。提高病毒粒子生產規模之方法通常包含增加病毒複製細胞之數量。在一些實施例中，病毒複製細胞包含黏附細胞。為提高藉由黏附病毒複製細胞進行之病毒粒子生產之規模，需要較大細胞培養物表面。在一些情況下，大規模生產方法包含使用滾瓶以提高細胞培養物表面。具有增加之表面積的其他細胞培養基質係此項技術中已知的。具有增加之表面積之其他黏附細胞培養產物的實例包括但不限於CELLSTACK® 、CELLCUBE® (Corning Corp., Corning, NY)及NUNCTM CELL FACTORYTM (Thermo Scientific, Waltham, MA.)。在一些情況下，大規模黏附細胞表面可包含約1,000 cm2 至約100,000 cm2 。在一些情況下，大規模黏附細胞培養物可包含約107 至約109 個細胞、約108 至約1010 個細胞、約109 至約1012 個細胞或至少1012 個細胞。在一些情況下，大規模黏附培養物可產生約109 至約1012 個、約1010 至約1013 個、約1011 至約1014 個、約1012 至約1015 個或至少1015 個病毒粒子。
在一些實施例中，本發明之大規模病毒生產方法可包含使用懸浮液細胞培養物。懸浮液細胞培養物允許顯著增加細胞數量。通常，可在約10-50 cm2 表面積上生長之黏附細胞之數量可在懸浮液中之約1 cm3 體積中生長。
大規模培養物型式中之複製細胞之轉染可根據此項技術中已知之任何方法進行。對於大規模黏附細胞培養物而言，轉染方法可包括但不限於使用無機化合物(例如磷酸鈣)、有機化合物[例如聚乙二亞胺(PEI)]或使用非化學方法(例如電穿孔)。隨著細胞在懸浮液中生長，轉染方法可包括但不限於使用磷酸鈣及使用PEI。在一些情況下，大規模懸浮培養物之轉染可根據Feng, L.等人, 2008. Biotechnol Appl. Biochem. 50:121-32中所述之名為「Transfection Procedure」之章節進行，其內容以全文引用之方式併入本文中。根據此類實施例，可形成PEI-DNA錯合物以用於引入待轉染之質體。在一些情況下，用PEI-DNA錯合物轉染之細胞可在轉染之前受『電擊』。此包含將細胞培養物溫度降低至4℃，歷經約1小時之時段。在一些情況下，細胞培養物可經電擊歷經約10分鐘至約5小時之時段。在一些情況下，細胞培養物可在約0℃至約20℃之溫度下經電擊。
在一些情況下，轉染可包括用於表現RNA效應分子以減少來自一或多種AAV負載構築體之核酸之表現的一或多種載體。此類方法可藉由減少在表現負載構築體上廢棄之細胞來源來提高病毒粒子之生產。在一些情況下，此類方法可根據美國公開案第US2014/0099666號中所教示之彼等進行，該公開案以全文引用之方式併入本文中。生物反應器
在一些實施例中，細胞培養物生物反應器可用於大規模病毒生產。在一些情況下，生物反應器包含攪拌槽反應器。此類反應器一般包含具有攪拌器(例如葉輪)之容器，其形狀通常為圓柱形。在一些實施例中，此類生物反應器容器可置放於水套內以控制容器溫度及/或將環境溫度變化之影響將至最低。生物反應器容器體積之尺寸可在以下範圍：約500 ml至約2 L、約1 L至約5 L、約2.5 L至約20 L、約10 L至約50 L、約25 L至約100 L、約75 L至約500 L、約250 L至約2,000 L、約1,000 L至約10,000 L、約5,000 L至約50,000 L或至少50,000 L。容器底部可為圓形或平坦的。在一些情況下，動物細胞培養物可維持在具有圓形容器底部之生物反應器中。
在一些情況下，生物反應器容器可經由使用熱循環器升溫。熱循環器泵加熱水套周圍的水。在一些情況下，經加熱之水可經由存在於生物反應器容器內之管道(例如蛇形管)泵送。在一些情況下，暖氣可在生物反應器周圍循環，包括但不限於培養基正上方之空氣空間。另外，可維持pH值及CO2 含量以最優化細胞存活率。
在一些情況下，生物反應器包含中空纖維反應器。中空纖維生物反應器可支撐依賴貼壁及不依賴貼壁細胞兩者之培養物。其他生物反應器可包括但不限於填充床或固定床生物反應器。此類生物反應器可包含具有用於黏附細胞附著之玻璃珠的容器。其他填充床反應器可包含陶瓷珠粒。
在一些情況下，病毒粒子經由使用拋棄式生物反應器產生。在一些實施例中，此類生物反應器可包括WAVETM 拋棄式生物反應器。
在一些實施例中，動物細胞生物反應器培養物之AAV粒子生產可根據美國專利第5,064764號、第6,194,191號、第6,566,118號、第8,137,948號或美國專利申請第US2011/0229971號中所教示之方法進行，其各自內容以全文引用之方式併入本文中。細胞溶解
包括但不限於病毒生產細胞之本發明之細胞可根據此項技術中已知之任何方法經受細胞溶解。可進行細胞溶解以獲得存在於任何本發明細胞內之一或多種試劑(例如病毒粒子)。在一些實施例中，細胞溶解可根據以下各者中所列之方法中之任一者進行：美國專利第7,326,555號、第7,579,181號、第7,048,920號、第6,410,300號、第6,436,394號、第7,732,129號、第7,510,875號、第7,445,930號、第6,726,907號、第6,194,191號、第7,125,706號、第6,995,006號、第6,676,935號、第7,968,333號、第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號及第7,491,508號，或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號，其各自內容以全文引用之方式併入本文中。細胞溶解方法可為化學或機械的。化學細胞溶解通常包含使一或多種細胞與一或多種溶解試劑接觸。機械溶解通常包含使一或多種細胞經受一或多種溶解條件及/或一或多種溶解力。
在一些實施例中，化學溶解可用於溶解細胞。如本文所用，術語「溶解試劑」指代可有助於破壞細胞之任何試劑。在一些情況下，將溶解試劑引入稱為溶解溶液或溶解緩衝液之溶液中。如本文所用，術語「裂解溶液」指代包含一或多種溶解試劑之溶液(通常為含水的)。除了溶解試劑之外，溶解溶液可包括一或多種緩衝劑、增溶劑、界面活性劑、防腐劑、低溫保護劑、酶、酶抑制劑及/或螯合劑。溶解緩衝液係包含一或多種緩衝劑之溶解溶液。溶解溶液之其他組分可包括一或多種增溶劑。如本文所用，術語「增溶劑」指代提高溶液之一或多種組分之溶解度及/或塗覆溶液之一或多種實體之溶解度的化合物。在一些情況下，增溶劑提高蛋白質溶解度。在一些情況下，基於其能力選擇增溶劑以提高蛋白質溶解度同時維持蛋白質構形及/或活性。
例示性溶解試劑可包括描述於以下各者中之彼等中之任一者：美國專利第8,685,734號、第7,901,921號、第7,732,129號、第7,223,585號、第7,125,706號、第8,236,495號、第8,110,351號、第7,419,956號、第7,300,797號、第6,699,706號及第6,143,567號，其各自內容以全文引用之方式併入本文中。在一些情況下，溶解試劑可選自溶解鹽、兩性試劑、陽離子型試劑、離子型洗滌劑及非離子型洗滌劑。溶解鹽可包括但不限於氯化鈉(NaCl)及氯化鉀(KCl)。其他溶解鹽可包括描述於以下各者中之彼等中之任一者：美國專利第8,614,101號、第7,326,555號、第7,579,181號、第7,048,920號、第6,410,300號、第6,436,394號、第7,732,129號、第7,510,875號、第7,445,930號、第6,726,907號、第6,194,191號、第7,125,706號、第6,995,006號、第6,676,935號及第7,968,333號，其各自內容以全文引用之方式併入本文中。可提高或降低鹽濃度以獲得用於細胞膜破裂之有效濃度。如本文中所提及之兩性試劑係能夠作為酸或鹼反應之化合物。兩性試劑可包括但不限於溶血磷脂醯膽鹼、3-((3-膽醯胺基丙基) 二甲基銨)-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、ZWITTERGENT®及類似物。陽離子型試劑可包括但不限於溴化鯨蠟基三甲銨(C (16) TAB)及苯紮氯銨。包含洗滌劑之溶解試劑可包括離子型洗滌劑或非離子型洗滌劑。洗滌劑可用以分裂或溶解細胞結構，該等細胞結構包括但不限於細胞膜、細胞壁、脂質、碳水化合物、脂蛋白及糖蛋白。例示性離子型洗滌劑包括其各自內容以全文引用之方式併入本文中之美國專利第7,625,570號及第6,593,123號或美國公開案第US2014/0087361號中所教示之彼等中之任一者。一些離子型洗滌劑可包括但不限於十二烷基硫酸鈉(SDS)、膽酸鹽及去氧膽酸鹽。在一些情況下，離子型洗滌劑可包括於溶解溶液中作為增溶劑。非離子型洗滌劑可包括但不限於辛基葡糖苷、毛地黃皂苷、蘆布若爾(lubrol)、C12E8、TWEEN®-20、TWEEN®-80、Triton X-100及Noniodet P-40。非離子型洗滌劑通常係較弱溶解試劑，但可包括作為增溶劑以用於溶解細胞及/或病毒蛋白。其他溶解試劑可包括酶及脲。在一些情況下，一或多種溶解試劑可合併至裂解溶液中以便提高細胞溶解及蛋白質溶解度中之一或多者。在一些情況下，酶抑制劑可包括於溶解溶液中以便防止可由細胞膜破壞觸發之蛋白分解。
在一些實施例中，進行機械細胞溶解。機械細胞溶解方法可包括使用一或多種溶解條件及/或一或多種溶解力。如本文所用，術語「溶解條件」指代促進細胞破壞之狀態或情況。溶解條件可包含某些溫度、壓力、滲透純度、鹽度及類似者。在一些情況下，溶解條件包含增加或降低之溫度。根據一些實施例，溶解條件包含溫度變化以促進細胞破壞。根據此類實施例進行之細胞溶解可包括冷凍-融化溶解。如本文所用，術語「冷凍-融化溶解」指代其中細胞溶液經受一或多個冷凍-融化週期之細胞溶解。根據冷凍-融化溶解方法，溶液中之細胞經冷凍以誘導由冰晶體形成及擴張引起之細胞膜的機械破壞。根據冷凍-融化溶解方法使用之細胞溶液可進一步包含一或多種溶解試劑、增溶劑、緩衝劑、低溫保護劑、界面活性劑、防腐劑、酶、酶抑制劑及/或螯合劑。在經受凍結之細胞溶液經解凍後，此類組分可促進所需細胞產物之恢復。在一些情況下，一或多種低溫保護劑包括於經歷冷凍-融化溶解之細胞溶液中。如本文所用，術語「低溫保護劑」指代用於保護一或多種物質免於由於凍結引起之損壞的試劑。低溫保護劑可包括其各自內容以全文引用之方式併入本文中之美國公開案第US2013/0323302號或美國專利第6,503,888,號、第6,180,613號、第7,888,096號、第7,091,030號中所教示之彼等中之任一者。在一些情況下，低溫保護劑可包括但不限於二甲亞碸、1,2-丙二醇、2,3-丁二醇、甲醯胺、丙三醇、乙二醇、1,3-丙二醇及正二甲基甲醯胺、聚乙烯吡咯啶酮、羥乙基澱粉、瓊脂糖、聚葡萄糖、肌醇、葡萄糖、羥乙基澱粉、乳糖、山梨糖醇、甲基葡萄糖、蔗糖及脲。在一些實施例中，可根據美國專利第7,704,721號中所述之方法中之任一者進行冷凍-融化溶解，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。
如本文所用，術語「溶解力」指代用於破壞細胞之身體活動。溶解力可包括但不限於機械力、聲波力、重力、光學力、電力及類似者。藉由機械力進行之細胞溶解在本文中稱為「機械溶解」。可根據機械溶解使用之機械力可包括高剪切流體力。根據機械溶解之此類方法，可使用微流化床。微流化床通常包含其中可應用細胞溶液之入口儲集器。隨後可經由泵(例如高壓泵)在高速及/或高壓下將細胞溶液泵送至相互作用腔室以產生剪切流體力。所得溶解產物隨後可收集於一或多個輸出儲集器。可調節泵速度及/或壓力以調節細胞溶解且促進產物之恢復(例如病毒粒子)。其他機械溶解方法可包括藉由刮擦進行之細胞之物理破壞。
可基於待溶解之細胞之細胞培養物形式選擇細胞溶解方法。舉例而言，對於黏附細胞培養物，可使用一些化學及機械溶解方法。此類機械溶解方法可包括冷凍-融化溶解或刮擦。在另一實例中，黏附細胞培養物之化學溶解可經由與包含界面活性劑(諸如Triton-X-100)之溶解溶液一起培育來進行。在一些情況下，由黏附細胞培養物產生之細胞溶解產物可用一種以上核酸酶處理以降低由釋放之DNA引起之溶解產物的黏度。
在一個實施例中，用於在無溶解下收穫AAV粒子之方法可用於有效的及可擴展的AAV粒子生產。在一非限制性實例中，AAV粒子可藉由以下產生：培養缺乏肝素結合位點之AAV粒子，進而允許AAV粒子進入細胞培養物中之上清液中，自培養物收集上清液；及使AAV粒子與上清液分離，如美國專利申請案20090275107所述，該申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。澄清
包含病毒粒子之細胞溶解產物可經受澄清。澄清指代在純化來自細胞溶解產物之病毒粒子中所採取之初始步驟。澄清用以製備溶解產物以藉由移除較大的不溶性碎屑進行進一步純化。澄清步驟可包括但不限於離心及過濾。在澄清期間，離心可在低速下進行以僅移除較大碎屑。類似地，過濾可使用具有較大孔徑之過濾器進行使得僅移除較大碎屑。在一些情況下，可在澄清期間使用切向流過濾。病毒澄清之目的包括高通量處理細胞溶解產物及最優化最終病毒恢復。包括澄清步驟之優勢包括處理較大體積之溶解產物之可擴展性。在一些實施例中，澄清可根據以下各者中所呈現之方法中之任一者進行：美國專利第8,524,446號、第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號、第7,491,508號，美國公開案第US2013/0045186號、第US2011/0263027號、第US2011/0151434號、第US2003/0138772號，及國際公開案第WO2002012455號、第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號，其各自內容以全文引用之方式併入本文中。
藉由過濾進行細胞溶解產物澄清之方法為此項技術中所充分理解且可根據包括但不限於被動過濾及流式過濾之多種可用方法進行。所使用之過濾器可包含多種材料及孔徑。舉例而言，細胞溶解產物過濾器可包含約1 µM至約5 µM、約0.5 µM至約2 µM、約0.1 µM至約1 µM、約0.05 µM至約0.05 µM及約0.001 µM至約0.1 µM之孔徑。細胞溶解產物過濾器之例示性孔徑可包括但不限於2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.95、0.9、0.85、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.22、0.21、0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.02、0.019、0.018、0.017、0.016、0.015、0.014、0.013、0.012、0.011、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002、0.001及0.001 µM。在一個實施例中，澄清可包含經由孔隙尺寸為2.0 µM之過濾器進行過濾以移除大碎屑，之後傳遞通過孔隙尺寸為0.45 µM之過濾器以移除完整細胞。
過濾器材料可由多種材料構成。此類材料可包括但不限於聚合材料及金屬材料(例如燒結金屬及多孔鋁)。例示性材料可包括但不限於耐綸、纖維素材料(例如醋酸纖維素)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚碸、聚醯胺、聚碸、聚丙烯及聚對苯二甲酸伸乙酯。在一些情況下，適用於澄清細胞溶解產物之過濾器可包括但不限於ULTIPLEA TPROFILE™過濾器(Pall Corporation, Port Washington, NY)、SUPOR™膜過濾器(Pall Corporation, Port Washington, NY)。
在一些情況下，可進行流式過濾以提高過濾速度及/或效果。在一些情況下，流式過濾可包含真空過濾。根據此類方法，在與待過濾之細胞溶解產物之側面相對的過濾器側面產生真空。在一些情況下，細胞溶解產物可藉由離心力穿過過濾器。在一些情況下，使用泵迫使細胞溶解產物穿過澄清過濾器。細胞溶解產物穿過一或多個過濾器之流動速率可藉由調節通道尺寸及/或流體壓力中之一者來調節。
根據一些實施例，細胞溶解產物可藉由離心澄清。可使用離心使溶解產物中之不溶性粒子成糰粒。在澄清期間，離心強度[就重力單位(g)表示，其表示標準重力之倍數]可低於後續純化步驟中之離心強度。在一些情況下，可以約200 g至約800 g、約500 g至約1500 g、約1000 g至約5000 g、約1200 g至約10000 g或約8000 g至約15000 g對細胞溶解產物進行離心。在一些實施例中，細胞溶解產物離心在8000 g下進行15分鐘。在一些情況下，可進行密度梯度離心以便藉由沈降速率分隔細胞溶解產物中之顆粒。根據本發明之方法使用之梯度可包括但不限於氯化銫梯度及碘克沙醇步驟梯度。純化：層析
在一些情況下，AAV粒子可藉由一或多種層析方法自澄清之細胞溶解產物純化。層析指代用於自混合物分離出一或多種元素之此項技術中已知之任何數目的方法。此類方法可包括但不限於離子交換層析法(例如陽離子交換層析及陰離子交換層析)、免疫親和層析法及尺寸排外層析。在一些實施例中，病毒層析方法可包括教示於以下各者中之彼等中之任一者：美國專利第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號及第7,491,508號或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號，其各自內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，可使用離子交換層析法分離病毒粒子。使用離子交換層析法以基於存在於固定相(通常為病毒製劑(例如澄清溶解產物)傳遞通過之柱)上之蛋白殼蛋白質與帶電位點之間的電荷-電荷相互作用結合病毒粒子。在塗覆病毒製劑之後，隨後可藉由塗覆溶離溶液溶離結合之病毒粒子以破壞電荷-電荷相互作用。溶離溶液可藉由調節鹽濃度及/或pH值以促進結合病毒粒子之恢復來優化。視所分離之病毒蛋白殼之電荷而定，可選擇陽離子或陰離子交換層析法。離子交換層析之方法可包括但不限於美國專利第7,419,817號、第6,143,548號、第7,094,604號、第6,593,123號、第7,015,026號及第8,137,948號中所教示之彼等中之任一者，該等專利各自之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，可使用免疫親和層析法。免疫親和層析法係利用一或多種免疫化合物(例如抗體或抗體相關結構)保留病毒粒子之層析形式。免疫化合物可特異性地結合於病毒粒子表面上之一或多種結構，該等結構包括但不限於一或多種病毒鞘蛋白。在一些情況下，免疫化合物可對特定病毒變體具有特異性。在一些情況下，免疫化合物可與多種病毒變體結合。在一些實施例中，免疫化合物可包括重組單股抗體。此類重組單股抗體可包括其內容以全文引用之方式併入本文中之Smith, R.H.等人, 2009. Mol. Ther. 17(11):1888-96中所述之彼等。此類免疫化合物能夠與包括但不限於AAV1、AAV2、AAV6及AAV8之若干AAV蛋白殼變體結合。
在一些實施例中，可使用尺寸排外層析(size-exclusion chromatography；SEC)。SEC可包含使用凝膠以根據尺寸分離粒子。在病毒粒子純化中，SEC過濾有時稱作「拋光」。在一些情況下，可進行SEC以產生幾乎均質之最終產物。此類最終產物可在某些情況下用於臨床前研究及/或臨床研究(Kotin, R.M. 2011. Human Molecular Genetics. 20(1):R2-R6，其內容以全文引用之方式併入本文中)。在一些情況下，SEC可根據以下各者中所教示之方法中之任一者進行：美國專利第6,143,548號、第7,015,026號、第8,476,418號、第6,410,300號、第8,476,418號、第7,419,817號、第7,094,604號、第6,593,123號及第8,137,948號，其各自內容以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中，包含至少一種AAV粒子之組合物可使用美國專利第US 6146874號中所述之方法分離或純化，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中，包含至少一種AAV粒子之組合物可使用美國專利第US 6660514號中所述之方法分離或純化，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中，包含至少一種AAV粒子之組合物可使用美國專利第US 8283151號中所述之方法分離或純化，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中，包含至少一種AAV粒子之組合物可使用美國專利第US 8524446號中所述之方法分離或純化，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。II. 調配物及遞送 醫藥組合物及調配物
除了醫藥組合物(包含編碼siRNA分子之調節多核苷酸序列之AAV粒子)之外，本文提供適用於向人類投與之醫藥組合物，熟練技術人員應理解此類組合物一般適用於向任何其他動物(例如非人類動物，例如非人類哺乳動物)投與。應充分理解，為使組合物適用於向各種動物投與，對適用於向人類投與之醫藥組合物進行修改，且一般熟練的獸醫藥理學家可僅用一般實驗(若存在)設計及/或進行此類修改。醫藥組合物之投藥所涵蓋之個體包括但不限於人類及/或其他靈長類動物；哺乳動物，包括商業相關之哺乳動物，諸如牛、豬、馬、綿羊、貓、狗、小鼠及/或大鼠；及/或鳥類，包括商業相關之鳥類，諸如家禽、雞、鴨、鵝及/或火雞。
在一些實施例中，向人類、人類患者或個體投與組合物。出於本發明之目的，片語「活性成分」一般指代合成siRNA雙螺旋體、編碼siRNA雙螺旋體之調節多核苷酸、或包含編碼本文中所述之siRNA雙螺旋體之調節多核苷酸的AAV粒子。
本文中所述之醫藥組合物之調配物可藉由藥理學技術中已知或此後研發之任何方法製備。一般而言，此類預備方法包括以下步驟：使活性成分與賦形劑及/或一種或多種其他附屬成分締合，及隨後視需要及/或期望地將產物分割、塑形及/或封裝至所需單劑量或多劑量單元。
根據本發明之醫藥組合物中之活性成分、醫藥學上可接受的賦形劑及/或任何其他成分的相對量將視治療個體之身分、身材及/或病狀及進一步視投與組合物所藉由之途徑而變化。
本發明之包含編碼siRNA分子之調節多核苷酸序列的AAV粒子可使用一或多種賦形劑調配以：(1)提高穩定性；(2)增加細胞轉染或轉導；(3)容許持續或延遲釋放；或(4)改變生物分佈(例如將AAV粒子靶向諸如腦及神經元之特定組織或細胞型)。
本發明之調配物可包括不限於鹽水、類脂質、脂質體、脂質奈米粒子、聚合物、脂複合體、核殼奈米粒子、肽、蛋白質、用AAV粒子轉染之細胞(例如用於移入個體中)、奈米粒子模仿物以及其組合。另外，本發明之AAV粒子可使用自組裝核酸奈米粒子調配。
本文中所述之醫藥組合物之調配物可藉由藥理學技術中已知或此後研發之任何方法製備。一般而言，此類預備方法包括使活性成分與賦形劑及/或一種或多種其他附屬成分締合之步驟。
根據本發明之醫藥組合物可以散裝、以單個單位劑量形式及/或以複數個單個單位劑量形式製備、包裝及/或出售。如本文中所使用，「單位劑量」指代包含預定量之活性成分之醫藥組合物的個別量。活性成分之量通常等於將向個體投與之活性成分之劑量及/或此劑量之適宜分數，諸如此類劑量之一半或三分之一。
根據本發明之醫藥組合物中之活性成分、醫藥學上可接受的賦形劑及/或任何其他成分的相對量可視治療個體之身分、身材及/或病狀及進一步視投與組合物所藉由之途徑而變化。舉例而言，組合物可包含0.1%與99% (w/w)之間的活性成分。藉助於實例，組合物可包含0.1%與100%之間、例如0.5與50%之間、1-30%之間、5-80%之間、至少80% (w/w)的活性成分。
在一些實施例中，醫藥學上可接受的賦形劑可為至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%純度。在一些實施例中，賦形劑經批准用於人類及用於獸醫學用途。在一些實施例中，賦形劑可經美國食品與藥物管理局(the United States Food and Drug Administration)批准。在一些實施例中，賦形劑可具有醫藥級。在一些實施例中，賦形劑可滿足美國藥典(the United States Pharmacopoeia；USP)、歐洲藥典(the European Pharmacopoeia；EP)、英國藥典及/或國際藥典之標準。
如本文所用之賦形劑包括但不限於適用於所要特定劑型之形式的任何及全部溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體媒劑、分散或懸浮助劑、界面活性劑、等張劑、增稠或乳化劑、防腐劑及類似物。用於調配醫藥組合物之各種賦形劑及用於製備組合物之技術係此項技術中已知的(參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006；以全文引用之方式併入本文中)。除非任何習知載劑介質與物質或其衍生物不相容，諸如產生任何不期望生物作用或以有害的方式與醫藥組合物的任何其他組分另外相互作用，否則習知賦形劑介質之用途可涵蓋於本發明之範疇內。
例示性稀釋劑包括但不限於碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸二鈣、硫酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鈉乳糖、蔗糖、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化鈉、乾燥澱粉、玉米澱粉、粉末狀糖等，及/或其組合。
在一些實施例中，調配物可包含至少一種非活性成分。如本文所用，術語「非活性成分」指代包括於調配物中之一或多種非活性試劑。在一些實施例中，可用於本發明之調配物之非活性成分中的全部、無或一些可經美國食品及藥物管理局(FDA)批准。
包含用於本發明之siRNA分子之核酸序列的載體之調配物可包括陽離子或陰離子。在一個實施例中，調配物包括金屬陽離子，諸如但不限於Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg+以及其組合。
如本文所用，「醫藥學上可接受之鹽」指代所揭示之化合物之衍生物，其中母化合物藉由將現有酸或鹼部分轉化為其鹽形式(例如藉由使游離鹼基團與適合有機酸反應)來修飾。醫藥學上可接受之鹽的實例包括但不限於鹼性殘基(諸如胺)之礦物質或有機酸鹽；酸性殘基(諸如羧酸)之鹼金屬鹽或有機鹽；及其類似物。代表性酸加成鹽包括乙酸鹽、乙酸、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯磺酸、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及其類似者。代表性鹼或鹼土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂及其類似物，以及無毒性銨、四級銨及胺陽離子，包括但不限於銨、四甲銨、四乙銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺及其類似物。本發明之醫藥學上可接受之鹽包括例如由無毒無機酸或有機酸形成之母體化合物的習知無毒鹽。本發明之醫藥學上可接受之鹽可藉由習知化學方法由含有鹼性或酸性部分之母化合物合成。一般而言，此類鹽可藉由使此等化合物之游離酸或鹼形式與化學計算量之適當鹼或酸在水中或在有機溶劑中或在兩者之混合物中反應來製備；一般而言，非水性介質(如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈)較佳。適合鹽之清單發現於以下各者中：Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, 第1418頁, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (編), Wiley-VCH, 2008，及Berge等人, Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977)；其各自含量以全文引用之方式併入本文中。
如本文所用之術語「醫藥學上可接受之溶劑合物」意謂其中適合溶劑之分子併入晶格中之本發明化合物。適合溶劑在所投與之劑量下為生理學上可耐受的。舉例而言，溶劑合物可自包括有機溶劑、水或其混合物之溶液藉由結晶、再結晶或沈澱製備。適合溶劑之實例係乙醇、水(例如單水合物、二水合物及三水合物)、N-甲基吡咯啶酮(NMP)、二甲亞碸(DMSO)、N,N'-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N'-二甲基乙醯胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啶酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2-(1H)嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苄醇、2-吡咯啶酮、苯甲酸苯甲酯及類似物。當水為溶劑時，該溶劑合物稱為「水合物」。
根據本發明，包含編碼siRNA分子之調節多核苷酸序列之AAV粒子可經調配用於CNS遞送。可使用穿過腦血障壁之試劑。舉例而言，可將siRNA分子靶向腦血障壁內皮之一些細胞穿透肽可用於調配靶向相關基因之siRNA雙螺旋體。非活性成分
在一些實施例中，調配物可包含作為非活性成分之至少一種賦形劑。如本文所用，術語「非活性成分」指代包括於調配物中之一或多種非活性試劑。在一些實施例中，可用於本發明之調配物之非活性成分中的全部、無或一些可經美國食品及藥物管理局(FDA)批准。
本文中所述之AAV粒子之調配物可包括陽離子或陰離子。在一個實施例中，調配物包括金屬陽離子，諸如但不限於Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg+以及其組合。作為非限制性實例，調配物可包括與金屬陽離子錯合之本文中所述之聚合物及組合物(參見例如美國專利第6,265,389號及第6,555,525號，其各自以全文引用之方式併入本文中)。 遞送
在一個實施例中，本文中所述之AAV粒子可使用歐洲專利申請案第EP1857552號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所述之用於遞送AAV病毒粒子之方法投與或遞送。
在一個實施例中，本文中所述之AAV粒子可使用歐洲專利申請案第EP2678433號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所述之使用AAV粒子遞送蛋白質之方法投與或遞送。
在一個實施例中，本文中所述之AAV粒子可使用美國專利第US 5,858,351號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所述之使用AAV粒子遞送DNA分子之方法投與或遞送。
在一個實施例中，本文中所述之AAV粒子可使用美國專利第US 6,211,163號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所述之使用將DNA遞送至血流之方法投與或遞送。
在一個實施例中，本文中所述之AAV粒子可使用美國專利第US 6,325,998號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所述之用於遞送AAV病毒粒子之方法投與或遞送。
在一個實施例中，本文中所述之AAV粒子可使用美國專利第US 7,588,757號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所述之用於將負載遞送至中樞神經系統之方法投與或遞送。
在一個實施例中，本文中所述之AAV粒子可使用美國專利第US 8283151號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所述之用於遞送負載之方法投與或遞送。
在一個實施例中，本文中所述之AAV粒子可使用國際專利公開案第WO2001089583號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所述之使用麩胺酸去羧酶(GAD)遞送載體遞送負載之方法投與或遞送。
在一個實施例中，本文中所述之AAV粒子可使用國際專利公開案第WO2012057363號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所述之使用將負載遞送至神經細胞之方法投與或遞送。 遞送至細胞
本發明提供將上文所述之AAV聚核苷酸或AAV基因組中之任一者遞送至細胞或組織的方法，其包含使細胞或組織與該AAV聚核苷酸或AAV基因組接觸或使細胞或組織與包含該AAV聚核苷酸或AAV基因組之粒子接觸，或使細胞或組織與包括醫藥組合物之所述之組合物中的任一者接觸。將AAV聚核苷酸或AAV基因組遞送至細胞或組織之方法可活體外、離體或活體內完成。引入至細胞中 - 合成 dsRNA
為確保siRNA分子(例如siRNA雙螺旋體及dsRNA)之化學及生物穩定性，重要的為將siRNA分子遞送至靶細胞內部。在一些實施例中，細胞可包括但不限於哺乳動物來源之細胞、人類來源之細胞、胚胎幹細胞、誘導多能幹細胞、神經幹細胞及神經祖細胞。
包括siRNA之核酸在正常生理學條件下攜帶磷酸糖類主股上之淨負電荷。為進入細胞，siRNA分子必須與細胞膜之脂質雙層接觸，該脂質雙層之頭端亦為帶負電荷的。
siRNA雙螺旋體可與允許其穿越細胞膜之載劑(諸如封裝粒子)錯合以促進siRNA之細胞攝取。封裝粒子可包括但不限於脂質體、奈米粒子、陽離子型脂質、聚伸乙亞胺衍生物、樹枝狀聚合物、碳奈米管及碳製得之奈米粒子與樹枝狀聚合物之組合。脂質可為陽離子型脂質及/或中性脂質。除了siRNA分子與陽離子型載劑之間明確之親油性錯合物之外，siRNA分子可與諸如膽固醇之疏水性部分結合(例如美國專利公開案第20110110937號；其內容以全文引用之方式併入本文中)。此遞送方法可能提高siRNA分子之活體外細胞攝取及活體內藥理學特性。本發明之siRNA分子亦可與諸如MPG之某些陽離子型細胞穿透肽(cell-penetrating peptide；CPP)、共價或非共價運輸蛋白或穿膜肽結合(例如美國專利公開案第20110086425號；其內容以全文引用之方式併入本文中)。引入至細胞中 -AAV 粒子
可使用多種方法中之任一者(諸如但不限於AAV粒子)將本發明之siRNA分子(例如siRNA雙螺旋體)引入細胞中。此等AAV粒子經工程改造及優化以促進siRNA分子進入可被轉染輕易修改之細胞。此外，一些合成AAV粒子能夠將shRNA整合至細胞基因組中，進而引起靶基因之穩定siRNA表現及長期阻斷基因表現。以此方式，AAV顆粒經工程改造為用於特異性遞送、同時缺乏發現於野生型病毒中之有害複製及/或整合特徵的運載工具。
在一些實施例中，可藉由使細胞與包含編碼siRNA分子之調節多核苷酸序列之AAV粒子及親油性載劑接觸將本發明之siRNA分子引入細胞中。在其他實施例中，可藉由在轉錄於細胞中時用包含能夠產生siRNA分子之核酸序列之AAV粒子使細胞轉染或感染來將siRNA分子引入細胞中。在一些實施例中，可藉由在轉錄於細胞中時用包含能夠產生siRNA分子之核酸序列之AAV粒子注入細胞中來將siRNA分子引入細胞中。
在一些實施例中，在轉染之前，可將包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子轉染至細胞中。
在其他實施例中，可藉由電穿孔將包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子遞送至細胞中(例如美國專利公開案第20050014264號；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
本文中所述之用於引入包含編碼siRNA分子之核酸序列之AAV粒子的其他方法可包括如美國專利公開案第20120264807號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所述之光化學內化。
在一些實施例中，本文中所述之調配物可含有至少一種AAV粒子，該AAV粒子包含編碼本文中所述之siRNA分子之核酸序列。在一個實施例中，siRNA分子可靶向一個靶點處之相關基因。在另一實施例中，調配物包含複數種AAV粒子，各AAV粒子包含編碼靶向不同靶點處之相關基因之siRNA分子的核酸序列。可靶向2、3、4、5個或超過5個靶點處之相關基因。
在一個實施例中，可將來自任何相關物種(諸如但不限於人類、狗、小鼠、大鼠或猴)之AAV粒子引入細胞中。
在一個實施例中，可將AAV粒子引入與待治療之疾病有關之細胞中。作為非限制性實例，疾病係HD且靶細胞係神經元及星形細胞。作為另一非限制性實例，疾病係HD且靶細胞係中型多棘神經元、皮質神經元及星形細胞。
在一個實施例中，可將AAV粒子引入與待治療之疾病有關之細胞中。作為非限制性實例，疾病係ALS且靶細胞係神經元及星形細胞。作為另一非限制性實例，疾病係ALS且靶細胞係中型多棘神經元、皮質神經元及星形細胞。
在一個實施例中，可將AAV粒子引入具有高水準標靶序列之內源性表現之細胞中。
在另一實施例中，可將AAV粒子引入具有低水準標靶序列之內源性表現之細胞中。
在一個實施例中，細胞可為具有高效AAV轉導之彼等。 遞送至個體
本發明另外提供將上文所述之AAV聚核苷酸或AAV基因組中之任一者遞送至個體(包括哺乳動物個體)之方法，其包含向個體投與該AAV聚核苷酸或AAV基因組，或向個體投與包含該AAV聚核苷酸或AAV基因組之粒子，或向個體投與包括醫藥組合物之所述之組合物中的任一者。
本文中所述之AAV粒子之醫藥組合物的特徵可為生物可用性、治療窗及/或分佈體積中之一或多者。III. 投藥及給藥 投藥
包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可藉由導致治療有效之結果的任何途徑投與。此等包括但不限於器官之軟組織內，諸如但不限於腦(例如腦實質內)、紋狀體(紋狀體內)、腸內(至腸中)、胃腸病學、硬膜外、口服(藉助於嘴)、經皮、硬膜外、腦內(至大腦中)、腦室內(至腦室內)、軟膜下(在軟腦膜下)、上表皮(塗覆至皮膚上)、皮內(至皮膚自身中)、皮下(在皮膚下)、經鼻投藥(經由鼻)、靜脈內(至靜脈中)、靜脈內推注、靜脈內滴液、動脈內(至動脈中)、肌肉內(肌肉中)、心內(心臟中)、骨內輸注(至骨髓中)、鞘內(至脊髓管中)、神經節內(至神經節中)、腹膜內(輸注或注射至腹膜中)、膀胱內輸注、玻璃體內(經由眼睛)、海綿竇內注射(至病理性凹穴中)、腔內(至陰莖底部)、陰道內投藥、子宮內、羊膜外投藥、經皮(經由全身分佈之完整皮膚擴散)、經黏膜(經由黏膜擴散)、經陰道、吹入(噴鼻息)、舌下、唇下、灌腸、滴眼(至結膜上)、耳內滴液、經耳(在耳中或藉助於耳)、頰內(指向頰部)、結膜、皮膚、牙齒(至一或多個牙齒)、電滲透、子宮頸內、竇內、氣管內、體外、血液透析、滲入、間質、腹內、羊膜內、關節內、膽內、支氣管內、囊內、軟骨內(軟骨內)、尾部內(馬尾內)、腦池內(小腦延髓池小腦髓)、角膜內(角膜內部)、牙齒冠內、冠狀動脈內(冠狀動脈內部)、海綿體內孔(陽莖之海綿體之可膨脹空間)、椎間盤內(盤內)、管內(腺體之管道內)、十二指腸內(十二指腸內部)、硬膜內(硬腦膜內或下方)、表皮內(至表皮)、食管內(至食道)、胃內(胃內部)、齒齦內(齒齦內部)、迴腸內(小腸之遠端部分內)、病灶內(局部病變內或直接引入局部病變)、邊緣內(管腔內)、淋巴管內(淋巴內部)、髓內(骨之骨髓腔內)、腦脊膜內(腦膜內)、眼內(眼睛內部)、卵巢內(卵巢內部)、心包內(心包內部)、胸膜內(胸膜內部)、前列腺內(前列腺腺體內部)、肺內(肺部或其支氣管內部)、竇內(經鼻或眶周竇)、脊柱內(脊柱內部)、滑膜內(關節之滑液腔內)、腱內(肌腱內)、睾丸內(睾丸內部)、鞘內(在腦脊髓之任何水準下之腦脊髓液內部)、胸內(胸部內)、小管內(器官之小管內)、瘤內(腫瘤內部)、內鼓膜(中膜內)、血管內(一或多種血管內)、室內(腦室內)、離子電滲(藉助於電流，其中可溶性鹽之離子遷移至身體組織中)、沖洗(沖洗或沖刷哆開傷口或體腔)、喉部(直接在喉上)、鼻胃管(經由鼻且進入胃中)、包紮療法技術(隨後由堵塞區域之包紮覆蓋之局部途徑投藥)、經眼(至外眼)、口咽(直接至嘴及咽)、非經腸、經皮、關節周、硬膜外、神經周、牙周、經直腸、呼吸(藉由口服或經鼻吸入以實現局部或全身效果之呼吸道內)、眼球後(腦橋後方或眼球後方)、軟組織、蛛膜下、結膜下、黏膜下層、局部、經胎盤(經由或穿過胎盤)、經氣管(穿過氣管壁)、經鼓膜(穿過或經由鼓腔)、輸尿管(至輸尿管)、尿道(至尿道)、陰道、骶管阻滯、診斷、神經阻斷、膽道灌注、心肌灌注、光除去法或脊髓。
在具體實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子之組合物可以促進載體或siRNA分子進入中樞神經系統且穿入中型多棘及/或皮質神經元及/或星形細胞之方式投與。
在一些實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可藉由肌肉內注射投與。
在一個實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可藉由腦實質內注射投與。
在一個實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可經由腦實質內注射及鞘內注射投與。
在一個實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可經由紋狀體內注射投與。
在一個實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可經由紋狀體內注射及本文中所述之另一投藥途徑投與。
在一些實施例中，表現本發明之siRNA雙螺旋體之AAV粒子可藉由外周注射(例如靜脈內)及/或鼻內遞送投與個體。此項技術中揭示可將針對siRNA雙螺旋體之AAV粒子之外周投藥傳輸至中樞神經系統，例如至神經元(例如美國專利公開案第20100240739號及第20100130594號；其各自內容以全文引用之方式併入本文中)。
在其他實施例中，包含至少一種AAV粒子之組合物可藉由顱內遞送投與個體，該AAV粒子包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列(參見例如美國專利第8,119,611號；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可呈任何適合之形式投與，如呈液體溶液或懸浮液，如適用於液體溶液或液體溶液中之懸浮液之固體形式。siRNA雙螺旋體可使用任何適當及醫藥學上可接受的賦形劑調配。
包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可以「治療有效」量，亦即足以緩解及/或預防與疾病相關之至少一種症狀，或提供個體狀況之改善的量投與。
在一個實施例中，AAV粒子可以治療有效量投與CNS以改善患有亨廷頓氏病(Huntington's Disease；HD)之個體之功能及/或存活率。作為非限制性實例，載體可藉由直接輸入紋狀體投與。
在一個實施例中，AAV粒子可以針對siRNA雙螺旋體或dsRNA之治療有效量投與個體(例如經由鞘內投藥之個體之CNS)以靶向中型多棘神經元、皮質神經元及/或星形細胞。作為非限制性實例，siRNA雙螺旋體或dsRNA可靶向HTT且降低HTT蛋白質或mRNA之表現。作為另一非限制性實例，siRNA雙螺旋體或dsRNA靶向HTT且可抑制HTT且降低HTT介導之毒性。HTT蛋白質及/或mRNA以及HTT介導之毒性的降低可伴以近似無促進之炎症實現。
在一個實施例中，AAV粒子可以治療有效量投與個體(例如個體之CNS)以減緩個體之功能減退(例如使用已知的評估方法，諸如統一亨廷頓氏病評定量表(unified Huntington's disease rating scale；UHDRS)測定)。作為非限制性實例，載體可經由腦實質內注射投與。
在一個實施例中，可以治療有效量向小腦延髓池投與AAV粒子以轉導中型多棘神經元、皮質神經元及/或星形細胞。作為非限制性實例，載體可經鞘內投與。
在一個實施例中，AAV粒子可使用鞘內輸注以治療有效量投與從而轉導中型多棘神經元、皮質神經元及/或星形細胞。作為非限制性實例，載體可經鞘內投與。
在一個實施例中，可以治療有效量向小腦延髓池投與AAV粒子以轉導中型多棘神經元、皮質神經元及/或星形細胞。作為非限制性實例，載體可藉由腦實質內注射投與。
在一個實施例中，可調配包含調節多核苷酸之AAV粒子。作為非限制性實例，調配物之比密度(baricity)及/或重量莫耳滲透濃度可經優化與確保中樞神經系統或中樞神經系統之區域或組分中之最優藥物分佈。
在一個實施例中，包含調節多核苷酸之AAV粒子可經由單一途徑投藥遞送至個體。
在一個實施例中，包含調節多核苷酸之AAV粒子可經由多部位投藥途徑遞送至個體。可在2、3、4、5或超過5個部位處向個體投與包含調節多核苷酸之AAV粒子。
在一個實施例中，可使用快速注射向個體投與包含本文中所述之調節多核苷酸之AAV粒子。
在一個實施例中，可使用歷經數分鐘、數小時或數天時段之持續遞送向個體投與包含本文中所述之調節多核苷酸之AAV粒子。輸注速率可視個體、分佈、調配物或另一遞送參數而改變。
在一個實施例中，本文中所述之AAV粒子係經由殼核及尾狀輸注投與。作為非限制性實例，雙輸注提供廣泛的紋狀體分佈以及額葉及顳葉皮質分佈。
在一個實施例中，AAV粒子係經由單側殼核輸注投與之AAV-DJ8。作為非限制性實例，所投與之AAV-DJ8之分佈類似於經由單側殼核輸注遞送之AAV1之分佈。
在一個實施例中，本文中所述之AAV粒子係經由C1下之鞘內(IT)輸注投與。輸注可持續1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或超過15小時。
在一個實施例中，用於投與本文中所述之AAV粒子之個體及/或劑量效果、投藥途徑及/或投藥體積的選擇可使用亦稱為Virchow-Robin空間之血管周圍間隙(PVS)之成像評估。PVS在其穿孔腦實質且經腦脊髓液(CSF)/間質液填充時包圍小動脈及微靜脈。PVS在中腦、基底節及半卵圓中心中常見。不希望受理論束縛，PVS可在代謝物之正常清除中起作用且與較差之認知及包括帕金森氏病(Parkinson's disease)之若干疾病病況相關。PVS之尺寸通常為正常的但其尺寸在許多疾病病況中增加。Potter等人(Cerebrovasc Dis. 2015年1月;39(4): 224-231；其內容以全文引用之方式併入本文中)研發出一種分級法，其中其研究全範圍之PVS且分級基底節、半卵圓中心及中腦PVS。其使用Mac及Lullich等人(J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2004年11月;75(11):1519-23；其內容以全文引用之方式併入本文中)所使用之PVS之頻率及範圍且Potter等人為基底節及半卵圓中心PVS提供5個等級：0 (無)、1 (1-10)、2 (11-20)、3 (21-40)及4 (＞40)且為中腦PVS提供2個等級：0 (非可見)或1 (可見)。Potter等人所提供之分級系統之用戶手冊可發現於：www.sbirc.ed.ac.uk/documents/epvs-rating-scale-user-guide.pdf。給藥
本發明之醫藥組合物可使用對減少、預防及/或治療疾病及/或病症有效之任何量投與個體。視個體之物種、年齡及一般狀況、疾病之嚴重強度、特定組合物、其投藥模式、其活動模式及其類似因素而定，所需要之確切量將在個體間不同。
本發明之組合物通常以單位劑型調配以易於投藥及劑量均勻。然而，應理解，本發明之組合物之每天總用量可由主治醫師在合理醫學判斷範疇內決定。對於任何特定患者之特定治療性效果可視多種因素而定，該等因素包括所治療之病症及該病症之嚴重度；所採用之特定化合物之活性；所採用之特定組合物；患者之年齡、體重、總體健康狀況、性別及飲食；投藥時間、投藥途徑及所採用之siRNA雙螺旋體之排泄速率；治療持續時間；與所採用之特定化合物組合或同時使用之藥物及醫學技術中熟知之類似因素。
在一個實施例中，可使用個體之年齡及性別確定本發明之組合物之劑量。作為非限制性實例，較大齡個體相比於較年輕個體可接受較大劑量(例如多5-10%、10-20%、15-30%、20-50%、25-50%或至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或超過90%)之組合物。作為另一非限制性實例，較年輕個體相比於較大齡個體可接受較大劑量(例如多5-10%、10-20%、15-30%、20-50%、25-50%或至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或超過90%)之組合物。作為又一非限制性實例，女性個體相比於男性個體可接受較大劑量(例如多5-10%、10-20%、15-30%、20-50%、25-50%或至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或超過90%)之組合物。作為又一非限制性實例，男性個體相比於女性個體可接受較大劑量(例如多5-10%、10-20%、15-30%、20-50%、25-50%或至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或超過90%)之組合物。
在一些具體實施例中，用於遞送本發明之siRNA雙螺旋體之AAV粒子的劑量可視疾病狀況、個體及治療策略而調適。
在一個實施例中，向細胞遞送根據本發明之組合物包含由[VG/小時 = mL/小時 * VG/mL]定義之遞送速率，其中VG係病毒基因組；VG/mL係組合物濃度；且mL/小時係延長遞送之速率。
在一個實施例中，向細胞遞送根據本發明之組合物可包含在約1×106 VG與約1×1016 VG之間的總濃度/個體。在一些實施例中，遞送可包含約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、1.1×1011 、1.2×1011 、1.3×1011 、1.4×1011 、1.5×1011 、1.6×1011 、1.7×1011 、1.8×1011 、1.9×1011 、2×1011 、2.1×1011 、2.2×1011 、2.3×1011 、2.4×1011 、2.5×1011 、2.6×1011 、2.7×1011 、2.8×1011 、2.9×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、7.1×1011 、7.2×1011 、7.3×1011 、7.4×1011 、7.5×1011 、7.6×1011 、7.7×1011 、7.8×1011 、7.9×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.1 ×1012 、1.2×1012 、1.3×1012 、1.4×1012 、1.5×1012 、1.6×1012 、1.7×1012 、1.8×1012 、1.9×1012 、2×1012 、2.1×1012 、2.2×1012 、2.3×1012 、2.4×1012 、2.5×1012 、2.6×1012 、2.7×1012 、2.8×1012 、2.9×1012 、3×1012 、3.1×1012 、3.2×1012 、3.3×1012 、3.4×1012 、3.5×1012 、3.6×1012 、3.7×1012 、3.8×1012 、3.9×1012 、4×1012 、4.1×1012 、4.2×1012 、4.3×1012 、4.4×1012 、4.5×1012 ,4.6×1012 、4.7×1012 、4.8×1012 、4.9×1012 、5×1012 、6×1012 、6.1×1012 、6.2×1012 、6.3×1012 、6.4×1012 、6.5×1012 、6.6×1012 、6.7×1012 、6.8×1012 、6.9×1012 、7×1012 、8×1012 、8.1×1012 、8.2×1012 、8.3×1012 、8.4×1012 、8.5×1012 、8.6×1012 、8.7×1012 、8.8 ×1012 、8.9×1012 、9×1012 、1×1013 、1.1×1013 、1.2×1013 、1.3×1013 、1.4×1013 、1.5×1013 、1.6×1013 、1.7×1013 、1.8×1013 、1.9×1013 、2×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、6.7×1013 、7×1013 、8×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 、1×1015 、2×1015 、3×1015 、4×1015 、5×1015 、6×1015 、7×1015 、8×1015 、9×1015 、或1×1016 VG/個體之組合物濃度。
在一個實施例中，向細胞遞送根據本發明之組合物可包含在約1×106 VG/kg與約1×1016 VG/kg之間的總濃度/個體。在一些實施例中，遞送可包含約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、1.1×1011 、1.2×1011 、1.3×1011 、1.4×1011 、1.5×1011 、1.6×1011 、1.7×1011 、1.8×1011 、1.9×1011 、2×1011 、2.1×1011 、2.2×1011 、2.3×1011 、2.4×1011 、2.5×1011 、2.6×1011 、2.7×1011 、2.8×1011 、2.9×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、7.1×1011 、7.2×1011 、7.3×1011 、7.4×1011 、7.5×1011 、7.6×1011 、7.7×1011 、7.8×1011 、7.9×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.1 ×1012 、1.2×1012 、1.3×1012 、1.4×1012 、1.5×1012 、1.6×1012 、1.7×1012 、1.8×1012 、1.9×1012 、2×1012 、2.1×1012 、2.2×1012 、2.3×1012 、2.4×1012 、2.5×1012 、2.6×1012 、2.7×1012 、2.8×1012 、2.9×1012 、3×1012 、3.1×1012 、3.2×1012 、3.3×1012 、3.4×1012 、3.5×1012 、3.6×1012 、3.7×1012 、3.8×1012 、3.9×1012 、4×1012 、4.1×1012 、4.2×1012 、4.3×1012 、4.4×1012 、4.5×1012 ,4.6×1012 、4.7×1012 、4.8×1012 、4.9×1012 、5×1012 、6×1012 、6.1×1012 、6.2×1012 、6.3×1012 、6.4×1012 、6.5×1012 、6.6×1012 、6.7×1012 、6.8×1012 、6.9×1012 、7×1012 、8×1012 、8.1×1012 、8.2×1012 、8.3×1012 、8.4×1012 、8.5×1012 、8.6×1012 、8.7×1012 、8.8 ×1012 、8.9×1012 、9×1012 、1×1013 、1.1×1013 、1.2×1013 、1.3×1013 、1.4×1013 、1.5×1013 、1.6×1013 、1.7×1013 、1.8×1013 、1.9×1013 、2×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、6.7×1013 、7×1013 、8×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 、1×1015 、2×1015 、3×1015 、4×1015 、5×1015 、6×1015 、7×1015 、8×1015 、9×1015 、或1×1016 VG/kg之組合物濃度。
在一個實施例中，可投與約105 至106 病毒基因組(單元)/劑量。
在一個實施例中，向細胞遞送根據本發明之組合物可包含在約1×106 VG/mL與約1×1016 VG/mL之間的總濃度。在一些實施例中，遞送可包含約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、1.1×1011 、1.2×1011 、1.3×1011 、1.4×1011 、1.5×1011 、1.6×1011 、1.7×1011 、1.8×1011 、1.9×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.1×1012 、1.2×1012 、1.3×1012 、1.4×1012 、1.5×1012 、1.6×1012 、1.7×1012 、1.8×1012 、1.9×1012 、2×1012 、2.1×1012 、2.2×1012 、2.3×1012 、2.4×1012 、2.5×1012 、2.6×1012 、2.7×1012 、2.8×1012 、2.9×1012 、3×1012 、3.1×1012 、3.2×1012 、3.3×1012 、3.4×1012 、3.5×1012 、3.6×1012 、3.7×1012 、3.8×1012 、3.9×1012 、 4×1012 、4.1×1012 、4.2×1012 、4.3×1012 、4.4×1012 、4.5×1012 、4.6×1012 、4.7×1012 、4.8×1012 、4.9×1012 、5×1012 、6×1012 、6.1×1012 、6.2×1012 、6.3×1012 、6.4×1012 、6.5×1012 、6.6×1012 、6.7×1012 、6.8×1012 、6.9×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、1.1×1013 、1.2×1013 、1.3×1013 、1.4×1013 、1.5×1013 、1.6×1013 、1.7×1013 、1.8×1013 、1.9×1013 、2×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、6.7×1013 、7×1013 、8×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 、1×1015 、2×1015 、3×1015 、4×1015 、5×1015 、6×1015 、7×1015 、8×1015 、9×1015 、或1×1016 VG/mL之濃度。
在某些實施例中，所要siRNA雙螺旋體劑量可使用多次投藥遞送(例如兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或超過十四次投藥)。當採用多次投藥時，可使用分次給藥方案，諸如本文中所述之彼等。如本文所用，「分次劑量」係將單一單位劑量或總日劑量分為兩次或更多次劑量，例如單一單位劑量之兩次或更多次投藥。如本文所用，「單一單位劑量」係以一次劑量/一次性/單一途徑/單一接觸點，亦即單一投藥事件治療性投與之任何調節多核苷酸的劑量。如本文所用，「總日劑量」係在24小時時段中給定或開處方之量。其可以單一單位劑量形式投與。在一個實施例中，包含本發明之調節多核苷酸之AAV粒子以分次劑量投與個體。其可僅在緩衝液中或在本文中所述之調配物中調配。
在一個實施例中，本文所述之組合物之劑量、濃度及/或體積可視投藥之後尾狀或殼核與皮質及皮層下分佈之比重而調節。投藥可為腦室內、核殼內、丘腦內、腦實質內、軟膜下及/或鞘內投藥。
在一個實施例中，本文所述之組合物之劑量、濃度及/或體積可視在藉由腦室內、核殼內、丘腦內、腦實質內、軟膜下及/或鞘內遞送投與後皮質及腦脊髓分佈而調節。IV. 本發明之組合物之方法及用途 亨廷頓氏病 (HD)
亨廷頓氏病(HD)係單基因性致命神經退化性疾病，其特徵為進行性舞蹈症、神經精神及認知功能障礙。已知亨廷頓氏病由亨廷頓(HTT)基因中之常染色體顯性三聯體(CAG)重複擴增引起，該亨廷頓(HTT)基因編碼HTT蛋白質之N端處之聚麩醯胺酸。此重複擴增導致HTT之功能之有毒獲得且最終導致進展為廣泛腦萎縮之紋狀體神經退化。紋狀體之中型多棘神經元在HD中呈現為尤其脆弱，高達95%損失，而中間神經元大部分倖免。
亨廷頓氏病對生活品質具有深刻影響。症狀通常呈現在35-44歲之間且發作之後預期壽命為10-25年。在小百分比之HD群體(約6%)中，疾病發作出現在21歲之前，伴隨運動不能-強直綜合征之外觀。此等病例傾向於比後續發作種類之彼等更快地進展且已分類為幼年型或Westphal變體HD。據估計，在美國及歐洲中目前約35,000-70,000患者患有HD。目前，僅症狀緩解及支撐療法可用於治療HD，其中治癒尚待鑑別。最終，患有HD之個體死於肺炎、心臟衰竭或諸如來自跌倒之物理損傷之其他併發症。
不希望受理論束縛，野生型HTT蛋白質之功能可充當骨架以協調其他蛋白質之錯合物。HTT係極大蛋白質(67個外顯子、3144個胺基酸、約350kDa)，其經歷廣泛的翻譯後修飾且具有用於與其他蛋白質，尤其在其N端(同時攜帶HD中之重複之區域)處相互作用之大量位點。HTT主要定位於細胞質但已展示穿梭至其中其可調節基因轉錄之細胞核中。亦已表明HTT在囊泡傳輸及調節RNA遷移中起作用。
作為非限制性實例，HTT核酸序列係SEQ ID NO:1163 (NCBI NM_002111.7)。
起初認為CAG擴增之HTT干擾正常HTT功能且導致神經毒性所藉由之機制為單倍劑量不足之疾病，此理論在人類中之HTT基因之末端缺失未引起HD出現時證明有誤，從而表明完全表現之HTT蛋白質對存活率並非至關重要。然而，小鼠中之HTT之條件性基因敲除導致神經退化，從而表明一些量之HTT為細胞存活所需。亨廷頓蛋白質在全部細胞中均表現，但其濃度在大腦中最高，其中異常HTT之大集合體發現於神經元核中。在HD患者之大腦中，HTT聚集至異常核內涵體中。現認為其為錯誤摺疊及聚集過程以及導致神經毒性之相關蛋白中間產物(亦即可溶性物種及有毒N端片段)。實際上，HD屬於九種其他人類基因病症之家族，其特徵皆為CAG擴增之基因及所得多麩醯胺酸(聚-Q)蛋白質產物，後續形成神經元內聚集體。引起關注地，在全部此等疾病中，擴增長度與發作年齡及疾病進展速率相關，其中較長擴增與疾病之更高嚴重程度相關。
對以下之假設廣泛分佈：分子機制引起CAG擴增之HTT及其所得聚集體之神經毒性，但包括卡斯蛋白酶活化、轉錄途徑之失調、增加之活性氧物種之生產、粒線體功能障礙、破壞之軸突傳輸及/或細胞內之蛋白質降解系統之抑制。CAG擴增之HTT可能不僅具有功能之有毒獲得，且亦藉由干擾其他細胞蛋白質及過程之正常功能發揮主要的負面影響。HTT亦與非細胞自發神經毒性有關，其中容納HTT之細胞將HTT擴散至鄰近其他神經元。
在一個實施例中，個體具有完全外顯之HD，其中HTT基因具有41個或更多的CAG重複(例如41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或超過90個CAG重複)。
在一個實施例中，個體具有不完全外顯率，其中HTT基因具有在36與40個之間的CAG重複(例如36、37、38、39及40個CAG重複)。
HD之症狀可包括歸因於CNS退化之特徵，諸如但不限於舞蹈症、肌肉緊張不足、運動徐緩、協調不能、易怒及抑鬱、解決困難之問題、個人在其正常日常生活中工作之能力的降低、言語減弱及吞咽困難，以及並非歸因於CNS退化之特徵，諸如但不限於體重減輕、肌肉萎縮、代謝功能障礙及內分泌紊亂。
可用於本文中所述之調節多核苷酸及AAV粒子之用於研究亨廷頓氏病的模型系統包括但不限於細胞模型(例如原發性神經元及誘導多能幹細胞)、無脊椎動物模型(例如果蠅或秀麗隱桿線蟲)、小鼠模型(例如YAC128小鼠模型；R6/2小鼠模型；BAC、YAC及基因嵌入小鼠模型)、大鼠模型(例如BAC)及大哺乳動物模型(例如豬、綿羊或猴子)。
HD之動物模型中之研究已表明表型反轉為可實行的，例如在調節之表現模型中之基因切斷之後。在允許94-多麩醯胺酸重複HTT蛋白質之表現之切斷的小鼠模型中，不僅逆轉臨床綜合征且亦解決胞內聚集體。另外，其中測試HTT之靜默之動物模型證明有前景之結果，其中療法具有良好耐受性且展示潛在的治療益處。
此類siRNA介導之HTT表現抑制可用於治療HD。根據本發明，用於治療及/或改善患者中之HD之方法包含向患者投與有效量之AAV粒子，該等AAV粒子包含將本發明之siRNA分子編碼至細胞中之核酸序列。包含此類核酸序列之AAV粒子之投藥將編碼引起HTT基因表現之抑制/靜默之siRNA分子。
在一個實施例中，本文中所述之AAV粒子可用於降低有需要之個體中之HTT的量且因此提供如本文所述之治療益處。
在某些態樣中，HD之症狀包括行為困難及諸如但不限於以下之症狀：神氣呆滯或缺乏主動性、煩躁不安、易怒、躁動或焦慮、不良的自我照護、判斷力差、僵化、抑制解除、抑鬱、自殺觀念欣快症、攻擊性、妄想、強迫症、性慾亢進、幻覺、言語退化、言語不清、吞咽困難、體重減輕、損害執行功能(例如組織、規劃、檢查或適應替代方式及獲得新運動技能之延遲)之認知功能障礙、不穩定步態及非自主運動(舞蹈症)。在其他態樣中，將本發明之組合物應用於大腦及脊髓中之一或兩者。在一個實施例中，個體之存活藉由治療本文中所述之HD之症狀中的任一者延長。
本發明揭示用於治療與需要治療之個體中之HTT蛋白質相關的亨廷頓氏病(HD)之方法。該方法視情況包含向個體投與治療有效量之至少包含AAV粒子之組合物，該等AAV粒子包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列。作為非限制性實例，siRNA分子可靜默HTT基因表現，抑制HTT蛋白質生產且降低個體中之HD之一或多種症狀使得治療上治療HD。亨廷頓氏病之治療方法
本發明提供包含編碼靶向HTT基因之siRNA分子之調節多核苷酸的AAV粒子，及用於其設計及製造之方法。不希望受可操作性之單一理論束縛，本發明提供調節多核苷酸，其包括干擾HTT表現之siRNA，包括HTT突變型及/或野生型HTT基因表現。詳言之，本發明採用病毒基因組，諸如腺相關病毒(AAV)病毒基因組，其包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸序列。包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸的AAV粒子可增加活性劑遞送至所關注之神經元(諸如紋狀體及皮質神經元之中型多棘神經元)中。靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA能夠顯著抑制細胞內部之HTT基因表現(例如mRNA水準)；因此，降低HTT表現誘導細胞內部之應激，諸如蛋白質之聚集及包涵物之形成、增加之自由基、粒線體功能障礙及RNA代謝。
本發明中提供將包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸序列的AAV粒子引入細胞中之方法，該方法包含將AAV粒子中之任一者以足以使標靶HTT mRNA之降解發生的量引入該等細胞中，進而活化細胞中之標靶特異性RNAi。在一些態樣中，細胞可為幹細胞、諸如中型多棘或皮質神經元之神經元、肌肉細胞及諸如星形細胞之膠細胞。
在一些實施例中，本發明提供藉由向有需要之個體投與治療有效量之本文中所述之質體或AAV粒子來治療或改善亨廷頓氏病(HD)之方法。
在一些實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸的AAV粒子可用於治療及/或改善HD。
在一個實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸的AAV粒子可用於降低患有HD之個體之認知及/或運動減退，其中減退量係藉由標準評估系統，諸如但不限於統一亨廷頓氏病評定量表(UHDRS)及分項分數，及認知測試。
在一個實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸的AAV粒子可用於減少如藉由標準評估系統(諸如但不限於總功能能力(TFC)量表)所量測之功能能力及日常生活活動之減退。
在一些實施例中，本發明提供用於治療或改善需要治療之個體中之與HTT基因及/或HTT蛋白質相關的亨廷頓氏病之方法，該方法包含向個體投與醫藥學上有效量之AAV粒子，該等AAV粒子包含編碼至少一種siRNA雙螺旋體之調節多核苷酸，該siRNA雙螺旋體靶向HTT基因，抑制HTT基因表現及蛋白質生產，且改善個體中之HD之症狀。
在一個實施例中，本發明之AAV粒子可用作治療需要治療之個體之亨廷頓氏病的方法。可使用用於定義需要治療之個體之此項技術中已知的任何方法鑑別該(等)個體。個體可具有亨廷頓氏病之臨床診斷，或可為症狀前的。可利用用於診斷HD之任何已知方法，該方法包括但不限於認知評估及/或神經或神經精神檢查、動作測試、感官測試、精神評估、腦成像、家族病史及/或基因測試。
在一個實施例中，HD個體選擇係使用亨廷頓氏病之預後指數或其衍生物確定(Long JD等人, Movement Disorders, 2017, 32(2), 256-263，其內容以全文引用之方式併入本文中)。此預後指數使用四個組分預測運動診斷之機率：(1)來自統一亨廷頓氏病評定量表(UHDRS)之總運動評分(TMS)；(2) 符號數位模式測驗(SDMT)；(3)基準年齡；(4)胞嘧啶-腺嘌呤-鳥嘌呤(CAG)擴增。
在一個實施例中，亨廷頓氏病之預後指數利用下式計算：PIHD = 51×TMS+ (-34)×SDMT + 7×年齡×(CAG-34)，其中PIHD之較大值表明診斷或症狀發作風險較高。
在另一實施例中，亨廷頓氏病之預後指數用以下提供在50% 10年存活率之情形下解釋之標準差單位之正規化公式計算：PINHD = (PIHD - 883)/1044，其中PINHD ＜0表明大於50% 10年存活率，且PINHD ＞0表明小於50% 10年存活率。
在一個實施例中，預後指數可用於鑑別將在若干年內罹患HD之症狀但尚未具有臨床上可診斷之症狀的個體。另外，此等無症狀患者可在無症狀時段期間選擇及接受使用本發明之AAV粒子及組合物之治療。
在一個實施例中，可向進行生物標記物評估之個體投與AAV粒子。用於HD之顯示前及早期進展之血液中的潛在生物標記物包括但不限於8-OhdG氧化應激標記物、代謝標記物(例如肌酸激酶、分支股胺基酸)、膽固醇代謝物(例如24 -OH膽固醇)、免疫及炎性蛋白(例如群集素、補體組分、介白素6及8)、基因表現變化(例如轉錄組標記物)、內分泌標記物(例如皮質醇、胃內激素及瘦素)、BDNF、腺苷2A受體。用於HD之顯示前及早期進展之腦成像的潛在生物標記物包括但不限於紋狀體體積、皮層下白質體積、皮質厚度、全腦及腦室容積、功能成像(例如功能MRI)、PET (例如用氟去氧葡萄糖)及磁共振光譜學(例如乳酸鹽)。用於HD之顯示前及早期進展之定量臨床工具的潛在生物標記物包括但不限於定量運動評估、運動生理學評估(例如經顱磁刺激)及定量眼球運動量測。定量臨床生物標記評估之非限制性實例包括舌片力變化性、節拍器引導之輕敲、夾持力、眼球運動評估及認知測試。多中心觀測研究之非限制性實例包括PREDICT-HD及TRACK-HD。個體可具有HD之症狀，診斷患有HD或可無HD症狀。
在一個實施例中，可向已進行使用神經成像之生物標記評估之個體投與AAV粒子。個體可具有HD之症狀，診斷患有HD或可無HD症狀。
在一個實施例中，可向無HD症狀之個體投與AAV粒子。個體可為無症狀的但可已進行預測性基因測試或生物標記評估以判定其是否處於HD風險下及/或個體是否可能具有已診斷患有HD之家族成員(例如母親、父親、兄弟、姐妹、阿姨、叔叔、祖父母)。
在一個實施例中，可向處於HD早期之個體投與AAV粒子。在早期，個體具有協調之細微變化、一些非自主運動(舞蹈症)、諸如易怒及抑鬱之情緒變化、問題解決困難、個人在其正常日常生活中工作之能力的降低。
在一個實施例中，可向處於HD中期之個體投與AAV粒子。在中期中，個體運動障礙增加、言語減弱、吞咽困難且正常活動變得更難以執行。在此階段，個體可使職業及物理治療家幫助維持自發運動之控制且個體可具有語音語言病理學家。
在一個實施例中，可向處於HD晚期之個體投與AAV粒子。在晚期，患有HD之個體近似完全或完全依賴於他人護理，因為個體不再能夠行走且無法說話。個體一般仍可理解語言且認識家人及朋友但窒息係主要問題。
在一個實施例中，AAV粒子可用於治療患有HD之幼年形式之個體，該HD之幼年形式係在20歲之前HD之發作且早至2歲。
在一個實施例中，AAV粒子可用於治療具有完全外顯HD之患有HD之個體，其中HTT基因具有41個或更多個CAG重複(例如41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90個或超過90個CAG重複)。
在一個實施例中，AAV粒子可用於治療具有不完全外顯率之個體，其中HTT基因具有在36與40個之間的CAG重複(例如36、37、38、39及40個CAG重複)。
在一些實施例中，向個體之中樞神經系統投與包含AAV粒子之組合物，該等AAV粒子包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸。在其他實施例中，向個體組織(例如個體之大腦)投與包含AAV粒子之組合物，該等AAV粒子包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸。
在一個實施例中，可將包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸的AAV粒子遞送至靶向細胞之特定類型，該等特定類型包括但不限於：神經元，包括中型多棘或皮質神經元；膠細胞，包括寡樹突神經膠質細胞、星形細胞及微神經膠質細胞；及/或神經元周圍之其他細胞，諸如T細胞。
在一個實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸的AAV粒子可遞送至紋狀體中之神經元及/或皮質之神經元。
在一些實施例中，向有需要之個體靜脈內、肌肉內、皮下、腹膜內、實質內、軟膜下、鞘內及/或腦室內投與用於治療HD之本發明之組合物，從而使包含siRNA分子之siRNA分子或載體穿過血腦障壁及血液脊髓障壁一或兩者，或直接進入大腦及/或脊髓。在一些態樣中，方法包括向個體之中樞神經系統(CNS)直接投與(例如腦實質內投藥、軟膜下投藥、室內投藥及/或鞘內投藥) (使用例如輸注泵及/或遞送骨架)治療有效量之組合物，該組合物包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子。載體可用於靜默或抑制HTT基因表現，及/或減少個體中之HD之一或多種症狀，使得治療上治療HD。
在一些實施例中，siRNA分子或包含此類siRNA分子之AAV粒子可例如藉由輸注至個體白質直接引入個體之中樞神經系統中。不希望受理論束縛，經由直接白質輸注之分佈可與軸突傳輸機制無關，該等軸突傳輸機制在患有亨廷頓氏病之個體中可受損傷，此意謂白質輸注可允許AAV粒子之更多傳輸。
在一個實施例中，經由腦實質內注射向個體之中樞神經系統投與包含AAV粒子之組合物，該等AAV粒子包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸。
在一個實施例中，經由腦實質內注射及鞘內注射向個體之中樞神經系統投與包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸的AAV粒子組合物。
在一個實施例中，經由腦實質內注射及腦室內注射向個體之中樞神經系統投與包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸的AAV粒子組合物。
在一些實施例中，藉由腦實質內投藥向有需要之個體投與用於治療HD之本發明之組合物。
在一些實施例中，可例如藉由輸入殼核將包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸的AAV粒子組合物直接引入個體之中樞神經系統中。
在一些實施例中，可例如藉由輸入個體之視丘將包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸的AAV粒子組合物直接引入個體之中樞神經系統中。不希望受理論束縛，視丘係在患有亨廷頓氏病之個體中相對倖免之大腦區域，此意謂其可允許經由AAV粒子之軸突傳輸更加廣泛的皮質轉導。
在一些實施例中，可例如藉由靜脈內投藥將包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸的AAV粒子組合物間接引入個體之中樞神經系統中。 調節HTT表現
在一個實施例中，向個體投與AAV粒子將降低個體中之HTT表現且HTT表現之降低將降低個體中之HD的影響。
在一個實施例中，經編碼之dsRNA一經表現且接觸表將現HTT蛋白質之細胞，將HTT蛋白質之表現抑制至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%或更高，諸如在藉由如本文所述之方法分析時。
在一個實施例中，向個體投與包含編碼本發明之siRNA之調節多核苷酸序列的AAV粒子可降低個體中之HTT (例如突變型HTT、野生型HTT及/或突變型及野生型HTT)。在一個實施例中，向個體投與AAV粒子可降低個體中之野生型HTT。在又一實施例中，向個體投與AAV粒子可降低個體中之突變型HTT及野生型HTT兩者中。在個體(諸如但不限於CNS、CNS之區域、或個體之CNS之特異性細胞)中，突變型及/或野生型HTT可降低約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。在個體(諸如但不限於CNS、CNS之區域、或個體之CNS之特異性細胞)中，突變型HTT可降低約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。在個體(諸如但不限於CNS、CNS之區域、或個體之CNS之特異性細胞)中，野生型HTT可降低約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。在個體(諸如但不限於CNS、CNS之區域、或個體之CNS之特異性細胞)中，突變型及野生型HTT可降低約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為非限制性實例，AAV粒子可將中型多棘神經元中之HTT之表現降低至少50%。作為非限制性實例，AAV粒子可將中型多棘神經元中之HTT之表現降低至少40%。作為非限制性實例，AAV粒子可將殼核之中型多棘神經元中之HTT的表現降低至少40%。作為非限制性實例，AAV粒子可將殼核之中型多棘神經元中之HTT的表現降低至少30%。作為又一非限制性實例，AAV粒子可將殼核及皮質中之HTT之表現降低至少40%。作為又一非限制性實例，AAV粒子可將殼核及皮質中之HTT之表現降低至少30%。作為又一非限制性實例，AAV粒子可將殼核中之HTT之表現降低至少30%。作為又一非限制性實例，AAV粒子可將殼核中之HTT之表現降低至少30%且將皮質中之HTT之表現降低至少15%。
在一個實施例中，AAV粒子可用於將HTT蛋白質之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為非限制性實例，HTT蛋白質表現之表現可降低50-90%。作為非限制性實例，HTT蛋白質表現之表現可降低30-70%。
在一個實施例中，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可用於將HTT mRNA之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100% or 95-100%。作為非限制性實例，HTT mRNA之表現可降低50-90%。
在一個實施例中，AAV粒子可用於減少個體中之HTT蛋白質。減少可獨立地為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或超過95%、5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、5-35%、5-40%、5-45%、5-50%、5-55%、5-60%、5-65%、5-70%、5-75%、5-80%、5-85%、5-90%、5-95%、10-20%、10-25%、10-30%、10-35%、10-40%、10-45%、10-50%、10-55%、10-60%、10-65%、10-70%、10-75%、10-80%、10-85%、10-90%、10-95%、15-25%、15-30%、15-35%、15-40%、15-45%、15-50%、15-55%、15-60%、15-65%、15-70%、15-75%、15-80%、15-85%、15-90%、15-95%、20-30%、20-35%、20-40%、20-45%、20-50%、20-55%、20-60%、20-65%、20-70%、20-75%、20-80%、20-85%、20-90%、20-95%、25-35%、25-40%、25-45%、25-50%、25-55%、25-60%、25-65%、25-70%、25-75%、25-80%、25-85%、25-90%、25-95%、30-40%、30-45%、30-50%、30-55%、30-60%、30-65%、30-70%、30-75%、30-80%、30-85%、30-90%、30-95%、35-45%、35-50%、35-55%、35-60%、35-65%、35-70%、35-75%、35-80%、35-85%、35-90%、35-95%、40-50%、40-55%、40-60%、40-65%、40-70%、40-75%、40-80%、40-85%、40-90%、40-95%、45-55%、45-60%、45-65%、45-70%、45-75%、45-80%、45-85%、45-90%、45-95%、50-60%、50-65%、50-70%、50-75%、50-80%、50-85%、50-90%、50-95%、55-65%、55-70%、55-75%、55-80%、55-85%、55-90%、55-95%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、75-85%、75-90%、75-95%、80-90%、80-95%或90-95%。作為非限制性實例，個體可具有50% HTT蛋白質之減少。作為非限制性實例，個體可具有70% HTT蛋白質之減少及10%野生型HTT蛋白質之減少。作為非限制性實例，殼核之中型多棘神經元中之HTT的減少可為約40%。作為非限制性實例，殼核及皮質中之HTT之減少可為約40%。作為非限制性實例，殼核之中型多棘神經元中之HTT的減少可在40%-70%之間。作為非限制性實例，殼核及皮質中之HTT之減少可在40%-70%之間。
在一個實施例中，AAV粒子可用於減少個體中之野生型HTT蛋白質。減少可獨立地為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或超過95%、5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、5-35%、5-40%、5-45%、5-50%、5-55%、5-60%、5-65%、5-70%、5-75%、5-80%、5-85%、5-90%、5-95%、10-20%、10-25%、10-30%、10-35%、10-40%、10-45%、10-50%、10-55%、10-60%、10-65%、10-70%、10-75%、10-80%、10-85%、10-90%、10-95%、15-25%、15-30%、15-35%、15-40%、15-45%、15-50%、15-55%、15-60%、15-65%、15-70%、15-75%、15-80%、15-85%、15-90%、15-95%、20-30%、20-35%、20-40%、20-45%、20-50%、20-55%、20-60%、20-65%、20-70%、20-75%、20-80%、20-85%、20-90%、20-95%、25-35%、25-40%、25-45%、25-50%、25-55%、25-60%、25-65%、25-70%、25-75%、25-80%、25-85%、25-90%、25-95%、30-40%、30-45%、30-50%、30-55%、30-60%、30-65%、30-70%、30-75%、30-80%、30-85%、30-90%、30-95%、35-45%、35-50%、35-55%、35-60%、35-65%、35-70%、35-75%、35-80%、35-85%、35-90%、35-95%、40-50%、40-55%、40-60%、40-65%、40-70%、40-75%、40-80%、40-85%、40-90%、40-95%、45-55%、45-60%、45-65%、45-70%、45-75%、45-80%、45-85%、45-90%、45-95%、50-60%、50-65%、50-70%、50-75%、50-80%、50-85%、50-90%、50-95%、55-65%、55-70%、55-75%、55-80%、55-85%、55-90%、55-95%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、75-85%、75-90%、75-95%、80-90%、80-95%或90-95%。作為非限制性實例，個體可具有50%野生型HTT蛋白質之減少。作為非限制性實例，殼核之中型多棘神經元中之野生型HTT的減少可為約40%。作為非限制性實例，殼核及皮質中之野生型HTT之減少可為約40%。作為非限制性實例，殼核之中型多棘神經元中之野生型HTT的減少可在40%-70%之間。作為非限制性實例，殼核及皮質中之野生型HTT之減少可在40%-70%之間。
在一個實施例中，AAV粒子可用於減少個體中之突變型HTT蛋白質。減少可獨立地為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或超過95%、5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、5-35%、5-40%、5-45%、5-50%、5-55%、5-60%、5-65%、5-70%、5-75%、5-80%、5-85%、5-90%、5-95%、10-20%、10-25%、10-30%、10-35%、10-40%、10-45%、10-50%、10-55%、10-60%、10-65%、10-70%、10-75%、10-80%、10-85%、10-90%、10-95%、15-25%、15-30%、15-35%、15-40%、15-45%、15-50%、15-55%、15-60%、15-65%、15-70%、15-75%、15-80%、15-85%、15-90%、15-95%、20-30%、20-35%、20-40%、20-45%、20-50%、20-55%、20-60%、20-65%、20-70%、20-75%、20-80%、20-85%、20-90%、20-95%、25-35%、25-40%、25-45%、25-50%、25-55%、25-60%、25-65%、25-70%、25-75%、25-80%、25-85%、25-90%、25-95%、30-40%、30-45%、30-50%、30-55%、30-60%、30-65%、30-70%、30-75%、30-80%、30-85%、30-90%、30-95%、35-45%、35-50%、35-55%、35-60%、35-65%、35-70%、35-75%、35-80%、35-85%、35-90%、35-95%、40-50%、40-55%、40-60%、40-65%、40-70%、40-75%、40-80%、40-85%、40-90%、40-95%、45-55%、45-60%、45-65%、45-70%、45-75%、45-80%、45-85%、45-90%、45-95%、50-60%、50-65%、50-70%、50-75%、50-80%、50-85%、50-90%、50-95%、55-65%、55-70%、55-75%、55-80%、55-85%、55-90%、55-95%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、75-85%、75-90%、75-95%、80-90%、80-95%或90-95%。作為非限制性實例，個體可具有50%突變型HTT蛋白質之減少。作為非限制性實例，殼核之中型多棘神經元中之突變型HTT的減少可為約40%。作為非限制性實例，殼核及皮質中之突變型HTT之減少可為約40%。作為非限制性實例，殼核之中型多棘神經元中之突變型HTT的減少可在40%-70%之間。作為非限制性實例，殼核及皮質中之突變型HTT之減少可在40%-70%之間。
在一些實施例中，本發明提供用於抑制/靜默細胞中之HTT基因表現的方法。因此，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可用於實質上抑制細胞，尤其神經元中之HTT基因表現。在一些態樣中，HTT基因表現之抑制指代抑制至少約20%，諸如至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。因此，可將靶向基因之蛋白質產品抑制至少約20%、較佳至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
在一些實施例中，本發明提供用於抑制/靜默細胞，尤其中型多棘神經元中之HTT基因表現之方法。在一些態樣中，HTT基因表現之抑制指代抑制至少約20%，諸如至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。因此，可將靶向基因之蛋白質產品抑制至少約20%，較佳至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
在一些實施例中，本發明提供用於抑制/靜默細胞，尤其星形細胞中之HTT基因表現之方法。在一些態樣中，HTT基因表現之抑制指代抑制至少約20%，諸如至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。因此，可將靶向基因之蛋白質產品抑制至少約20%，較佳至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
在一個實施例中，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可用於降低CNS之至少一個區域(諸如但不限於中腦)中之HTT蛋白質及/或mRNA的表現。在CNS之至少一個區域中，HTT蛋白質及/或mRNA之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-90%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低30-70%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-70%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-70%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-60%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低51%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低52%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低53%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低54%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低55%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低56%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低57%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低58%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低59%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低60%。
在一個實施例中，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可用於降低CNS之至少一個區域(諸如但不限於前腦)中之HTT蛋白質及/或mRNA的表現。在CNS之至少一個區域中，HTT蛋白質及/或mRNA之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-90%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低30-70%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-70%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-70%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-60%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低51%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低52%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低53%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低54%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低55%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低56%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低57%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低58%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低59%。作為非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低60%。
在一個實施例中，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可用於降低紋狀體中之HTT蛋白質及/或mRNA之表現。HTT蛋白質及/或mRNA之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低30-70%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低至少30%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-70%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-70%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-60%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低51%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低52%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低53%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低54%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低55%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低56%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低57%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低58%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低59%。作為非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低60%。
在一些實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸的AAV粒子可用於抑制紋狀體及/或皮質之神經元及/或星形細胞中之HTT蛋白質。作為非限制性實例，HTT蛋白質之抑制處於紋狀體之中型多棘神經元及/或皮質之神經元中。
在一些實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之調節多核苷酸的AAV粒子可用於抑制紋狀體及/或皮質之神經元及/或星形細胞中之HTT蛋白質且降低相關之神經元毒性。紋狀體及/或皮質之神經元及/或星形細胞中之HTT蛋白質的抑制可獨立地經抑制5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或超過95%、5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、5-35%、5-40%、5-45%、5-50%、5-55%、5-60%、5-65%、5-70%、5-75%、5-80%、5-85%、5-90%、5-95%、10-20%、10-25%、10-30%、10-35%、10-40%、10-45%、10-50%、10-55%、10-60%、10-65%、10-70%、10-75%、10-80%、10-85%、10-90%、10-95%、15-25%、15-30%、15-35%、15-40%、15-45%、15-50%、15-55%、15-60%、15-65%、15-70%、15-75%、15-80%、15-85%、15-90%、15-95%、20-30%、20-35%、20-40%、20-45%、20-50%、20-55%、20-60%、20-65%、20-70%、20-75%、20-80%、20-85%、20-90%、20-95%、25-35%、25-40%、25-45%、25-50%、25-55%、25-60%、25-65%、25-70%、25-75%、25-80%、25-85%、25-90%、25-95%、30-40%、30-45%、30-50%、30-55%、30-60%、30-65%、30-70%、30-75%、30-80%、30-85%、30-90%、30-95%、35-45%、35-50%、35-55%、35-60%、35-65%、35-70%、35-75%、35-80%、35-85%、35-90%、35-95%、40-50%、40-55%、40-60%、40-65%、40-70%、40-75%、40-80%、40-85%、40-90%、40-95%、45-55%、45-60%、45-65%、45-70%、45-75%、45-80%、45-85%、45-90%、45-95%、50-60%、50-65%、50-70%、50-75%、50-80%、50-85%、50-90%、50-95%、55-65%、55-70%、55-75%、55-80%、55-85%、55-90%、55-95%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、75-85%、75-90%、75-95%、80-90%、80-95%、或90-95%。相關之神經元毒性之降低可為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或超過95%、5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、5-35%、5-40%、5-45%、5-50%、5-55%、5-60%、5-65%、5-70%、5-75%、5-80%、5-85%、5-90%、5-95%、10-20%、10-25%、10-30%、10-35%、10-40%、10-45%、10-50%、10-55%、10-60%、10-65%、10-70%、10-75%、10-80%、10-85%、10-90%、10-95%、15-25%、15-30%、15-35%、15-40%、15-45%、15-50%、15-55%、15-60%、15-65%、15-70%、15-75%、15-80%、15-85%、15-90%、15-95%、20-30%、20-35%、20-40%、20-45%、20-50%、20-55%、20-60%、20-65%、20-70%、20-75%、20-80%、20-85%、20-90%、20-95%、25-35%、25-40%、25-45%、25-50%、25-55%、25-60%、25-65%、25-70%、25-75%、25-80%、25-85%、25-90%、25-95%、30-40%、30-45%、30-50%、30-55%、30-60%、30-65%、30-70%、30-75%、30-80%、30-85%、30-90%、30-95%、35-45%、35-50%、35-55%、35-60%、35-65%、35-70%、35-75%、35-80%、35-85%、35-90%、35-95%、40-50%、40-55%、40-60%、40-65%、40-70%、40-75%、40-80%、40-85%、40-90%、40-95%、45-55%、45-60%、45-65%、45-70%、45-75%、45-80%、45-85%、45-90%、45-95%、50-60%、50-65%、50-70%、50-75%、50-80%、50-85%、50-90%、50-95%、55-65%、55-70%、55-75%、55-80%、55-85%、55-90%、55-95%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、75-85%、75-90%、75-95%、80-90%、80-95%、或90-95%。
在一個實施例中，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可用於降低皮質中之HTT蛋白質及/或mRNA之表現。HTT蛋白質及/或mRNA之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低30-70%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低至少30%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-70%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-70%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-60%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低51%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低52%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低53%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低54%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低55%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低56%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低57%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低58%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低59%。作為非限制性實例，皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低60%。
在一個實施例中，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可用於降低運動皮質中之HTT蛋白質及/或mRNA之表現。HTT蛋白質及/或mRNA之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低30-70%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低至少30%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-70%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-70%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-60%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低51%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低52%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低53%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低54%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低55%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低56%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低57%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低58%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低59%。作為非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低60%。
在一個實施例中，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可用於降低軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及/或mRNA之表現。HTT蛋白質及/或mRNA之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低30-70%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低至少30%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-70%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-70%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-60%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低51%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低52%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低53%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低54%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低55%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低56%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低57%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低58%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低59%。作為非限制性實例，軀體感覺皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低60%。
在一個實施例中，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可用於降低顳葉皮質中之HTT蛋白質及/或mRNA之表現。HTT蛋白質及/或mRNA之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低30-70%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低至少30%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-70%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-70%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-60%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低51%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低52%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低53%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低54%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低55%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低56%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低57%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低58%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低59%。作為非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低60%。
在一個實施例中，siRNA雙螺旋體或經編碼之dsRNA可用於降低殼核中之HTT蛋白質及/或mRNA之表現。在CNS之至少一個區域中，HTT蛋白質及/或mRNA之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-70%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低40-50%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-70%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50-60%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低50%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低51%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低52%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低53%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低54%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低55%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低56%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低57%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低58%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低59%。作為非限制性實例，殼核中之HTT蛋白質及mRNA之表現降低60%。 單獨及組合療法
在一些實施例中，本發明組合物以單獨療法或組合療法形式投與以用於治療HD。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合物用作單獨療法。在其他實施例中，本發明之醫藥組合物與療法組合使用。組合療法可與已針對其對神經元退化之神經保護作用進行測試之一或多種神經保護劑組合，該等神經保護劑諸如小分子化合物、生長因子及激素。
編碼靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體之AAV粒子可與一種或多種其他治療劑組合使用。「與……組合」不欲意謂試劑必須同時投與及/或調配成一起遞送，但此等遞送方法屬於本發明之範疇內。組合物可與一或多種其他所需療法或醫療程序同時、在一或多種其他所需療法或醫療程序之前、或在一或多種其他所需療法或醫療程序之後投與。一般而言，各試劑將以針對該試劑所確定之劑量及/或時間表來投與。
可與編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子組合使用之治療劑可為小分子化合物，該等小分子化合物為抗氧化劑、消炎劑、抗細胞凋亡劑、鈣調節劑、抗穀胺酸劑、結構蛋白抑制劑、涉及肌肉功能之化合物及涉及金屬離子調節之化合物。
可與本文中所述之載體組合使用之針對治療HD所測試的化合物包括但不限於：多巴胺耗竭劑(例如用於舞蹈症之四苯喹嗪)、苯并二氮呯(例如用於肌陣攣、舞蹈症、肌肉緊張不足、僵硬及/或痙攣之氯硝西泮)、抗驚厥劑(例如用於肌陣攣之丙戊酸鈉及左乙拉西坦)、多巴胺之胺基酸前驅體(例如用於與幼年型HD或年輕成年發作巴金森式表型尤其相關之僵硬)、骨骼肌鬆弛劑(例如用於僵硬及/或痙攣之氯苯胺丁酸、替紮尼定(tizanidine))、用於在肌神經接合點處乙醯膽鹼釋放以引起肌肉麻痹之抑制劑(例如用於睡中磨牙及/或肌肉緊張不足之肉毒桿菌毒素)、非典型精神安定劑(例如用於精神病及/或易怒之奧氮平及喹硫平、利培酮、舒必利及用於精神病、舞蹈症及/或易怒之氟哌啶醇、用於抗治療性精神病之氯氮平、用於具有明顯負性症狀之精神病之阿立哌唑)、用以提高ATP/細胞能量學之試劑(例如肌酸)、選擇性血清素再吸收抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors；SSRI) (例如用於抑鬱、焦慮、強迫行為及/或易怒之西他普蘭(citalopram)、氟西汀(fluoxetine)、帕羅西汀(paroxetine)、舍曲林(sertraline)、米氮平、文拉法辛(venlafaxine))、安眠藥(例如用於變化之睡眠-覺醒週期之佐匹克隆(xopiclone)及/或唑吡坦)、抗驚厥劑(例如用於躁症或輕躁症之丙戊酸鈉及卡馬西平)及情緒穩定劑(例如用於躁症或輕躁症之鋰)。
神經營養因子可用於組合療法以治療HD，該組合療法使用編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子。一般而言，神經營養因子定義為促進神經元之存活、生長、分化、增殖及/或成熟或刺激神經元之提高活性的物質。在一些實施例中，本發明方法進一步包含將一或多種營養因子遞送至需要治療之個體中。營養因子可包括但不限於IGF-I、GDNF、BDNF、CTNF、VEGF、Colivelin、紮利羅登(Xaliproden)、促甲狀腺素釋放激素及ADNF及其變體。
在一個態樣中，包含靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體之調節多核苷酸的AAV粒子可與表現神經營養因子之AAV粒子共同投與，該等AAV粒子諸如AAV-IGF-I(參見例如Vincent等人, Neuromolecular medicine, 2004, 6, 79-85；其內容以全文引用之方式併入本文中)及AAV-GDNF (參見例如Wang等人, J Neurosci., 2002, 22, 6920-6928；其內容以全文引用之方式併入本文中)。肌肉萎縮性側索硬化 (amyotrophic lateral sclerosis ； ALS) 肌肉萎縮性側索硬化(ALS)
作為成年發作神經退化性病症，肌肉萎縮性側索硬化(ALS)係進行性及致命疾病，其特徵為運動皮質、腦幹及脊髓中之運動神經元之選擇性死亡。ALS之發生率為約1.9/100,000。診斷患有ALS之患者出現進行性肌肉表型，其特徵為痙攣、反射亢進或反射減退、肌震束顫、肌肉萎縮及麻痹。此等運動損傷由歸因於運動神經元損失之肌肉的去神經引起。ALS之主要病理特徵包括皮質脊髓束之退化及下運動神經元(lower motor neurons；LMN)或前角細胞之廣泛損失(Ghatak等人, J Neuropathol Exp Neurol., 1986, 45, 385-395)；主要運動皮質中之貝氏細胞及其他錐體細胞之退化及損失(Udaka等人, Acta Neuropathol, 1986, 70, 289-295；Maekawa等人, Brain, 2004, 127, 1237-1251)及運動皮質及脊髓中之反應性神經膠瘤病(Kawamata等人, Am J Pathol., 1992, 140,691-707；及Schiffer等人, J Neurol Sci., 1996, 139, 27-33)。由於呼吸缺陷及/或炎症，ALS在診斷之後3至5年內通常為致命的(Rowland LP及Shneibder NA, N Engl. J. Med., 2001, 344, 1688-1700)。
ALS之細胞標誌係退化運動神經元及周圍細胞(例如星形細胞)中之蛋白質、泛素化、細胞質包涵體之存在。泛素化包涵體(亦即路易體樣包涵體或Skein樣包涵體)係ALS中最常見及特異類型之包涵體且發現於脊髓及腦幹之LMN，以及皮質脊髓上運動神經元(upper motor neurons；UMN)中(Matsumoto等人, J Neurol Sci., 1993, 115, 208-213；及Sasak及Maruyama, Acta Neuropathol., 1994, 87, 578-585)。若干蛋白質已鑑別為包涵體之組分，包括泛素、Cu/Zn超氧化歧化酶1 (SOD1)、外周蛋白及Dorfin。神經絲狀包涵體常常發現於ALS中之脊髓運動神經元中之透明聚結包涵體(hyaline conglomerate inclusion；HCI)及軸突『橢球體』。其他類型及較不特異之包涵體包括皮質之上部層中之Bunina小體(含胱抑素C包涵體)及月牙形包涵體(Crescent shaped inclusion；SCI)。ALS中所見之其他神經病理學特徵包括高基氏體之斷裂、粒線體空泡形成及突觸末梢之超微結構異常(Fujita等人, Acta Neuropathol. 2002, 103, 243-247)。
另外，在額顳葉型癡呆ALS (FTD-ALS)中，亦觀測到皮質萎縮(包括額葉及顳葉)，此可引起FTD-ALS患者中之認知障礙。
ALS係複雜及多因子疾病且假設為造成ALS發病機制之多種機制包括但不限於蛋白質降解之功能障礙、麩胺酸興奮性毒性、粒線體功能障礙、細胞凋亡、氧化應激、炎症、蛋白質錯誤摺疊及聚集、異常RNA代謝及變化之基因表現。
約10%-15% ALS病例具有疾病家族病史，且此等患者稱為家族性ALS (fALS)或遺傳患者，通常具有遺傳之孟德爾主模式及高外顯率。其餘部分(約85%-95%)分類為偶發性ALS (sALS)，因為其與所記錄之家族病史不相關，而係歸因於其他風險因素，包括但不限於環境因素、基因多態性、體細胞突變及可能的基因-環境相互作用。在多數情況下，家族性(或遺傳的)ALS遺傳為常染色體顯性疾病，但存在具有常染色體隱性及X性聯遺傳及不完全外顯率之譜系。偶發性及家族性形式為臨床上不可區分的，表明常見的發病機制。ALS中之運動神經元之選擇性死亡之準確病因仍不清楚。對理解fALS中之基因因子之進展可為疾病之兩種形式提供線索。
最近，對ALS之遺傳原因之探索已發現已知引起fALS之超過10種不同基因之突變。最常見之一者發現於在肉瘤中融合/在脂肪肉瘤中翻譯(FUS/TLS；1-5%)及TDP-43 (TARDBP；1-5%)之基因編碼Cu/Zn超氧化歧化酶1 (SOD1；約20%) (Rosen DR等人, Nature, 1993, 362, 59-62)。最近，C9或F72基因中之六核苷酸重複擴增(GGGGCC)鑑別為西方人群中之fALS之最常見病因(約40%) (Renton等人, Nat. Neurosci., 2014, 17, 17-23綜述)。在ALS中突變之其他基因包括alsin (ALS2)、senataxin (SETX)、囊泡相關之膜蛋白(vesicle-associated membrane protein；VAPB)及血管生成素(ANG)。fALS基因控制不同細胞機制，表明ALS之發病機制係複雜的且可與最後引起運動神經元退化之若干不同過程相關。
SOD1係在哺乳動物中鑑別及表徵之三種人類超氧歧化酶中之一者：銅-鋅超氧化歧化酶(Cu/ZnSOD或SOD1)、錳超氧化歧化酶(MnSOD或SOD2)及胞外超氧化歧化酶(ECSOD或SOD3)。SOD1係153-殘基多肽與一個銅結合位點及一個鋅結合位點/子單元之32 kDa均二聚體，其由人類染色體21上之SOD1基因(基因庫登錄號：NM_000454.4；SEQ ID NO: 1502)編碼。SOD1在結合銅離子處催化分子氧(O2 )及過氧化氫(H2 O2 )中之超氧陰離子(O2 − )之反應。SOD1之胞內濃度較高(在10至100 μM範圍內)，佔中樞神經系統(CNS)中之總蛋白質含量之1%。蛋白質不僅位於細胞質中而且位於真核細胞中之細胞核、溶酶體、過氧化體及粒線體膜間腔中(Lindenau J等人, Glia, 2000, 29, 25-34)。
SOD1基因之突變由15-20% fALS患者及全部ALS病例之1-2%攜帶。目前，已發現分佈遍及153-胺基酸SOD1多肽之至少170種不同突變引起ALS，且可在ALS在線基因數據庫(ALS online Genetic Database；ALSOD)發現經更新之清單(Wroe R等人, Amyotroph Lateral Scler., 2008, 9, 249-250)。表46列舉ALS中之SOD1之一些突變實例。此等突變主要係單胺基酸取代(亦即錯義突變)，但亦發生缺失、插入及C端截斷。不同SOD1突變顯示不同地理分佈圖案。舉例而言，患有由SOD1基因突變引起之ALS的全部美國人中之40-50%具有特定突變Ala4Val (或A4V)。A4V突變通常與更嚴重之徵象及症狀相關且存活時段通常為2-3年。I113T突變迄今為止在英國係最常見之突變。在歐洲，最普遍之突變係D90A取代且存活時段通常超過10年。表 46 . ALS 之 SOD1 突變之實例
為調查與SOD1基因缺陷相關之神經元死亡機制，此項技術中研發SOD1有關之ALS的若干嚙齒動物模型，其表現具有不同突變(包括錯義突變、小缺失或插入)之人類SOD1基因。ALS小鼠模型之非限制性實例包括SOD1G93A 、SOD1A4V 、SOD1G37R 、SOD1G85R 、SOD1D90A 、SOD1L84V 、SOD1I113T 、SOD1H36R/H48Q 、SOD1G127X 、SOD1L126X 及SOD1L126delTT 。存在攜帶兩種不同人類SOD1突變：SOD1H46R 及SOD1G93R 之兩種轉殖基因大鼠模型。此等嚙齒動物ALS模型可出現類似於人類ALS患者之肌無力及反映人類疾病之若干特徵之其他病原特徵，詳言之脊髓運動神經元之選擇性死亡、運動神經元中之蛋白質包涵體之聚集及微神經膠質細胞活化。此項技術中熟知轉殖基因嚙齒動物係人類SOD1相關之ALS疾病之良好模型且提供用於研究疾病發病機制及研發疾病治療之模型。
動物及細胞模型之研究展示SOD1病原性變體藉由功能獲得引起ALS。亦即，當藉由SOD1突變變化時，超氧化歧化酶獲得新型但有害的特性。舉例而言，ALS中之一些SOD1突變變體藉由妨礙氧化還原循環增加氧化應激(例如增加之有毒超氧自由基積累)。其他研究亦表明ALS中之一些SOD1突變變體可獲得與其正常生理學功能無關之有毒特性(諸如錯誤摺疊SOD1變體之異常聚集)。在異常氧化還原化學模型中，突變型SOD1為不穩定的且經由與非習知基質之異常化學相互作用造成活性氧物種(reactive oxygen species；ROS)之過度產生。在蛋白質毒性模型中，不穩定錯誤摺疊SOD1聚集至細胞質包涵體，隔離對細胞過程至關重要之蛋白質。此等兩種假設並不互相排斥。已展示結合活性位點中之金屬元素之所選擇組胺酸殘基的氧化介導SOD1聚集。
聚集之突變型SOD1蛋白質亦可誘導粒線體功能障礙(Vehvilainen P等人, Front Cell Neurosci., 2014, 8, 126)、軸突傳輸之損傷、異常RNA代謝、膠細胞病理學及麩胺酸興奮性毒性。在一些偶發性ALS病例中，錯誤摺疊野生型SOD1蛋白質發現於患病運動神經元中，該蛋白質形成類似於對家族性ALS有關之SOD1變體所見的「有毒構形」(Rotunno MS及Bosco DA, Front Cell Neurosci., 2013, 16, 7, 253)。此類證據表明ALS係類似於其他神經退化性疾病，諸如阿茲海默氏病及帕金森氏病的蛋白質摺疊疾病。
目前，尚無治癒性治療可用於患有ALS之患者。FDA批准之唯一藥物利魯唑(Riluzole)作為麩胺酸釋放之抑制劑對ALS具有中等影響，若其服用18個月則僅延長2-3個月之存活。不幸地，服用利魯唑之患者不經歷疾病進展之任何減緩或肌肉功能之改善。因此，利魯唑不存在治癒，或甚至有效治療。研究人員繼續尋找較佳治療劑。
先前已測試可預防或改善SOD1聚集之治療性方法。舉例而言，阿莫氯醇(arimoclomol)係羥胺衍生物，其為靶向熱休克蛋白之藥物，該等熱休克蛋白係對抗此等聚集體之細胞防禦機制。研究證明用阿莫氯醇治療改善SOD1小鼠模型中之肌肉功能。靶向ALS中之一或多種細胞缺陷之其他藥物可包括：諸如他侖帕奈(talampanel)、β-內醯胺抗生素之AMPA拮抗劑，其可降低對運動神經元之麩胺酸誘導之興奮性毒性；可抑制氧化誘導之運動神經元死亡之溴麥角環肽(例如美國專利公開案第20110105517號；其內容以全文引用之方式併入本文中)；可降低SOD1基因表現之1,3-均二苯脲衍生物或多重激酶抑制劑(例如美國專利公開案第20130225642號；其內容以全文引用之方式併入本文中)；可改善粒線體中之氧化反應之多巴胺促效劑普拉克索(pramipexole)及其對映異構體右旋普拉克索；抑制環加氧酶之尼美舒利(nimesulide) (例如美國專利公開案第20060041022號；其內容以全文引用之方式併入本文中)；充當自由基清除劑之藥物(例如美國專利第6,933,310號及PCT專利公開案第WO2006075434號；其各自內容以全文引用之方式併入本文中)。
抑制異常SOD1蛋白質聚集之另一方法為靜默/抑制ALS中之SOD1基因表現。已報導用於特異性基因靜默突變對偶基因之小干擾RNA對fALS之治療為治療上有益的(例如Ralgh GS等人, Nat. Medicine, 2005, 11(4), 429-433；及Raoul C等人, Nat. Medicine, 2005, 11(4), 423-428；及Maxwell MM等人, PNAS, 2004, 101(9), 3178-3183；及Ding H等人, Chinese Medical J., 2011, 124(1), 106-110；及Scharz DS等人, Plos Genet., 2006, 2(9), e140；其各自內容以全文引用之方式併入本文中)。
靶向SOD1基因且調節ALS中之SOD1表現之許多其他RNA治療劑教示於此項技術中。此類基於RNA之試劑包括反義寡核苷酸及雙股小干擾RNA。參見例如Wang H et al., J Biol. Chem., 2008, 283(23), 15845-15852)；美國專利第7,498,316號、第7,632,938號、第7,678,895號、第7,951,784號、第7,977,314號、第8,183,219號、第8,309,533號及第8, 586, 554號；及美國專利公開案第2006/0229268號及第2011/0263680號；其各自內容以全文引用之方式併入本文中。
本發明提供包含調節多核苷酸之AAV粒子，該等調節多核苷酸包含編碼靶向SOD1基因之siRNA分子之序列，及用於其設計及製造之方法。包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可增加活性劑至運動神經元中之遞送。siRNA雙螺旋體或靶向SOD1基因之編碼dsRNA能夠顯著抑制細胞內部之SOD1基因表現(例如mRNA水準)；因此，改善SOD1表現誘導細胞內部之應激，諸如蛋白質之聚集及包涵體之形成、增加之自由基、粒線體功能障礙及RNA代謝。
此類siRNA介導之SOD1表現抑制可用於治療ALS。根據本發明，用於治療及/或改善患者中之ALS的方法包含向患者投與有效量之AAV粒子，該AAV粒子包含將本發明之siRNA分子編碼至細胞之核酸序列。包含此類核酸序列之AAV粒子之投藥將編碼引起SOD1基因表現之抑制/靜默之siRNA分子。
在一個實施例中，包含調節多核苷酸之AAV粒子降低個體中之突變型SOD1之表現。突變型SOD1之減少亦可減少有毒聚集體之形成，此可引起毒性機制，諸如但不限於氧化應激、粒線體功能障礙、損傷之軸突傳輸、異常RNA代謝、膠細胞病理學及/或麩胺酸興奮性毒性。
在一個實施例中，載體(例如AAV粒子)降低有需要之個體中之SOD1量且因此提供如本文所述之治療益處。 ALS之治療方法
本發明中提供用於引入包含調節多核苷酸之AAV粒子之方法，該等調節多核苷酸包含序列，該等序列包含將本發明之siRNA分子編碼至細胞之核酸序列，該方法包含將載體中之任一者以足以使標靶SOD1 mRNA發生降解之量引入該等細胞中，進而活化細胞中之標靶特異性RNAi。在一些態樣中，細胞可為幹細胞、諸如運動神經元之神經元、肌肉細胞及諸如星形細胞之膠細胞。
本發明中揭示用於治療需要治療之個體中之與異常SOD1功能相關的ALS之方法。該方法視情況包含向個體投與治療有效量之組合物，該組合物至少包含AAV粒子，該等AAV粒子包含調節多核苷酸，該等調節多核苷酸包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列。作為非限制性實例，siRNA分子可靜默SOD1基因表現，抑制SOD1蛋白質生產，且減少個體中之ALS之一或多種症狀，使得治療上治療ALS。
在一些實施例中，向個體之中樞神經系統投與組合物，該組合物包含AAV粒子，該等AAV粒子包含調節多核苷酸，該等調節多核苷酸包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列。在其他實施例中，向個體之肌肉投與組合物，該組合物包含AAV粒子，該等AAV粒子包含調節多核苷酸，該等調節多核苷酸包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列。
詳言之，可向特異類型之靶向細胞，包括運動神經元；包括少突細胞、星形細胞及微神經膠質細胞之膠細胞；及/或圍繞神經元之其他細胞(諸如T細胞)中遞送AAV粒子，該等AAV粒子包含調節多核苷酸，該等調節多核苷酸包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列。對人類ALS患者及動物SOD1 ALS模型之研究表明，膠細胞在運動神經元之功能障礙及死亡中起早期作用。圍繞的保護性膠細胞中之正常SOD1可預防運動神經元死亡，儘管突變型SOD1存在於運動神經元中(例如Philips及Rothstein, Exp. Neurol., 2014年5月22日. pii: S0014-4886(14)00157-5所綜述；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
在一些具體實施例中，AAV粒子可用作ALS之療法，該等AAV粒子包含調節多核苷酸，該等調節多核苷酸包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列。
在一些實施例中，本發明組合物以單獨療法或組合療法形式投與以用於治療ALS。
包含調節多核苷酸之AAV粒子可與一或多種其他治療劑組合使用，該等AAV粒子包含編碼靶向SOD1基因之siRNA分子之核酸序列。「與……組合」不欲意謂試劑必須同時投與及/或調配成一起遞送，但此等遞送方法屬於本發明之範疇內。組合物可與一或多種其他所需療法或醫療程序同時、在一或多種其他所需療法或醫療程序之前、或在一或多種其他所需療法或醫療程序之後投與。一般而言，各試劑將以針對該試劑所確定之劑量及/或時間表來投與。
可與AAV粒子(其包含調節多核苷酸，該等調節多核苷酸包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列)組合使用之治療劑可為小分子化合物，該等小分子化合物為抗氧化劑、消炎劑、抗細胞凋亡劑、鈣調節劑、抗穀胺酸劑、結構蛋白抑制劑、及涉及金屬離子調節之化合物。
可與本文中所述之載體組合使用之經測試用於治療ALS的化合物包括但不限於抗穀胺酸劑：利魯唑、托吡酯(Topiramate)、他侖帕奈、拉莫三嗪、右甲嗎喃、加巴噴丁(Gabapentin)及AMPA拮抗劑；抗細胞凋亡劑：二甲胺四環素、苯丁酸鈉及阿莫氯醇；抗炎劑：神經節苷脂、塞內昔布(Celecoxib)、環孢靈、硫唑嘌呤、環磷醯胺、血漿去除術、醋酸格拉替雷及沙立度胺；頭孢曲松(Berry等人, Plos One, 2013, 8(4))；Beat內醯胺抗生素；普拉克索(多巴胺促效劑) (Wang等人, Amyotrophic Lateral Scler., 2008, 9(1), 50-58)；美國專利公開案第20060074991號中之尼美舒利；美國專利公開案第20130143873號中所揭示之二氮嗪)；美國專利公開案第20080161378號中所揭示之二氫吡唑酮衍生物；抑制氧化應激誘導之細胞死亡之自由基清除劑，諸如溴麥角環肽(美國專利公開案第20110105517號)；PCT專利公開案第2013100571號中所論述之胺基甲酸苯酯；美國專利第6,933,310號及第8,399,514號及美國專利公開案第20110237907號及第20140038927號中所揭示之神經保護性化合物；及美國專利公開案第20070185012號中所教示之糖肽；其各自內容以全文引用之方式併入本文中。
可用於使用包含調節多核苷酸(其包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列)之AAV粒子之組合療法中的治療劑可為可保護神經元損失之激素或變體，諸如促腎上腺皮質激素(ACTH)或其片段(例如美國專利公開案第20130259875號)；雌激素(例如美國專利第6,334,998號及第6,592,845號)；其各自內容以全文引用之方式併入本文中。
神經營養因子可用於使用AAV粒子之組合療法以用於治療ALS，該等AAV粒子包含調節多核苷酸，該等調節多核苷酸包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列。一般而言，神經營養因子定義為促進神經元之存活、生長、分化、增殖及/或成熟或刺激神經元之提高活性的物質。在一些實施例中，本發明方法進一步包含將一或多種營養因子遞送至需要治療之個體中。營養因子可包括但不限於IGF-I、GDNF、BDNF、CTNF、VEGF、Colivelin、紮利羅登、促甲狀腺素釋放激素及ADNF及其變體。
在一個態樣中，針對靶向SOD1基因之至少一種siRNA雙螺旋體編碼之核酸序列的載體(例如AAV粒子)可與表現神經營養因子之AAV粒子共同投與，該等AAV粒子諸如AAV-IGF-I(Vincent等人, Neuromolecular medicine, 2004, 6, 79-85；其內容以全文引用之方式併入本文中)及AAV-GDNF (Wang等人, J Neurosci., 2002, 22, 6920-6928；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，向有需要之個體靜脈內、肌肉內、皮下、腹膜內、鞘內及/或腦室內投與用於治療ALS之本發明之組合物，使siRNA分子或包含siRNA分子之載體穿過血腦障壁及血液脊髓障壁一者或兩者。在一些態樣中，該方法包括向個體之中樞神經系統(CNS)直接投與(例如腦室內投與及/或鞘內投與) (使用例如輸注泵及/或遞送骨架)治療有效量之包含AAV粒子之組合物，該等AAV粒子包含調節多核苷酸，該等調節多核苷酸包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列。載體可用於靜默或抑制SOD1基因表現，及/或減少個體中之ALS之一或多種症狀，使得治療上治療HD。
在某些態樣中，ALS之症狀包括但不限於運動神經元退化、肌無力、肌肉萎縮、肌肉僵硬、呼吸困難、言語不清、束化出現、額顳葉型癡呆且/或過早死亡在所治療之個體中改善。在其他態樣中，將本發明之組合物應用於大腦及脊髓中之一或兩者。在其他態樣中，肌肉協調及肌肉功能中之一或兩者經改善。在其他態樣中，個體存活經延長。
在一個實施例中，向個體投與包含調節多核苷酸之AAV粒子可降低個體之CNS中之突變型SOD1，該等調節多核苷酸包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列。在另一實施例中，向個體投與AAV粒子可降低個體之CNS中之野生型SOD1。在又一實施例中，向個體投與AAV粒子可降低個體之CNS中之突變型SOD1及野生型SOD1兩者。在CNS、CNS之區域、或個體之CNS之特異性細胞中，突變型及/或野生型SOD1可降低約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%、或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為非限制性實例，在運動神經元(例如下角運動神經元)及/或星形細胞中AAV粒子可將野生型SOD1之表現降低至少50%。作為另一非限制性實例，在運動神經元(例如下角運動神經元)及/或星形細胞中，AAV粒子可將突變型SOD1之表現降低至少50%。作為又一非限制性實例，在運動神經元(例如下角運動神經元)及/或星形細胞中，AAV粒子可將野生型SOD1及突變型SOD1之表現降低至少50%。
在一個實施例中，向AAV粒子投與個體將減少脊髓中之突變型及/或野生型SOD1之表現且突變型及/或野生型SOD1之表現之減少將降低個體中之ALS之影響。
在一個實施例中，可向處於ALS早期之個體投與AAV粒子。早期症狀包括但不限於虛弱及柔軟或僵硬、緊繃及痙攣之肌肉、肌肉之痙攣及抽搐(肌震束顫)、肌肉體積損失(萎縮)、疲乏、平衡性差、言語不清、 抓緊力弱、及/或行走時絆倒。症狀可限於單一身體區域或輕度症狀可影響超過一個區域。作為非限制性實例，AAV粒子之投藥可降低ALS症狀之嚴重程度及/或發生。
在一個實施例中，可向處於ALS中期之個體投與AAV粒子。ALS中期包括但不限於相比於早期更加廣泛之肌肉症狀，一些肌肉在其他肌肉減弱或不受影響時麻痹；持續的肌肉顫搐(肌震束顫)；未使用之肌肉可能引起攣縮，其中關節變得僵硬、疼痛及有時變形；吞咽肌肉虛弱可引起窒息及更大的進食及唾液控制困難；呼吸肌肉虛弱可導致躺下時顯著之呼吸功能不全，且/或個體可具有不可控及不當之發笑或哭泣之發作(假延髓病影響)。作為非限制性實例，AAV粒子之投藥可降低ALS症狀之嚴重程度及/或發生。
在一個實施例中，可向處於ALS晚期之個體投與AAV粒子。ALS之晚期包括但不限於大部分麻痹之隨意肌，有助於移動空氣進出肺部之肌肉嚴重受損，運動性嚴重受限，呼吸不良可引起疲乏，模糊思維，頭痛及感染或疾病(例如肺炎)易感性，言語困難且由嘴進食或飲用可能不太可能。
在一個實施例中，AAV粒子可用於治療具有C9orf72突變之患有ALS之個體。
在一個實施例中，AAV粒子可用於治療具有TDP-43突變之患有ALS之個體。
在一個實施例中，AAV粒子可用於治療具有FUS突變之患有ALS之個體。
在一個實施例中，本發明之AAV粒子包含AAVrh10蛋白殼及包含H1啟動子之自互補AAV病毒基因組，源自pLKO.1豆狀病毒載體之填充序列及靶向負載之SOD1。
在一個實施例中，本發明之AAV粒子包含AAV2蛋白殼及自互補AAV病毒基因組。
在一個實施例中，本發明之AAV粒子包含AAV2蛋白殼及包含H1啟動子之自互補AAV病毒基因組，源自pLKO.1豆狀病毒載體之填充序列及靶向負載之SOD1。V. 定義
除非另外說明，否則以下術語及片語具有下文描述之含義。定義本質上不意欲為限制性且用以提供本發明之某些態樣之更清晰理解。
如本文所用，術語「核酸」、「聚核苷酸」及「寡核苷酸」指代由以下各者構成之任何核酸聚合物：聚去氧核糖核苷酸(含有2-去氧-D-核糖)、或聚核糖核苷酸(含有D-核糖)、或作為嘌呤或嘧啶鹼基之N糖苷之聚核苷酸、或經修飾之嘌呤或嘧啶鹼基。術語「核酸」、「聚核苷酸」及「寡核苷酸」之間不存在預期長度區別，且此等術語將可互換使用。此等術語僅指代分子之主要結構。因此，此等術語包括雙股及單股DNA，以及雙股及單股RNA。
如本文所用，術語「RNA」或「RNA分子」或「核糖核酸分子」指代核糖核苷酸之聚合物；術語「DNA」或「DNA分子」或「去氧核糖核酸分子」指代去氧核糖核苷酸之聚合物。DNA及RNA可分別例如藉由DNA複製及DNA轉錄天然合成；或化學合成。DNA及RNA可為單股(亦即分別地ssRNA或ssDNA)或多股(例如雙股，亦即分別地dsRNA及dsDNA)。如本文所用之術語「mRNA」或「信使RNA」指代編碼一或多種多肽股之胺基酸序列之單股RNA。
如本文所用，術語「RNA干擾」或「RNAi」指代由RNA分子介導之序列特異性調節機制，其導致對應的蛋白質編碼基因之表現之抑制或干擾或「靜默」。已在許多類型之生物體中觀測到RNAi，該等生物體包括植物、動物及真菌。RNAi出現在天然移除外源RNA (例如病毒RNA)之細胞中。天然RNAi經由自游離dsRNA裂解之片段前進，其將降解機制引導至其他相似RNA序列。RNAi受RNA誘導靜默錯合物(RNA-induced silencing complex；RISC)控制且由細胞細胞質中之短/小dsRNA分子起始，其中其與催化RISC組分阿爾戈(argonaute)相互作用。可將dsRNA分子外源地引入細胞中。外源性dsRNA藉由活化核糖核酸酶蛋白質Dicer酶起始RNAi，該Dicer酶且分解dsRNA以產生具有21-25個鹼基對之雙股片段，其中若干未配對突出鹼基位於各端。此等短雙股片段稱為小干擾RNA (siRNA)。
如本文所用，術語「短干擾RNA」、「小干擾RNA」或「siRNA」指代能夠引導或調節RNAi之包含在約5-60個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)之RNA分子(或RNA類似物)。較佳地，siRNA分子包含在約15-30個之間的核苷酸或核苷酸類似物，諸如約16-25個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)、約18-23個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)、約19-22個之間的核苷酸(或核苷酸類似物) (例如19、20、21或22個核苷酸或核苷酸類似物)、約19-25個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)，及約19-24個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)。術語「短」siRNA指代包含5-23個核苷酸、較佳21個核苷酸(或核苷酸類似物)、例如19、20、21或22個核苷酸之siRNA。術語「長」siRNA指代包含24-60個核苷酸、較佳約24-25個核苷酸、例如23、24、25或26個核苷酸之siRNA。短siRNA在一些實例中可包括少於19個核苷酸，例如16、17或18個核苷酸、或少至5個核苷酸，其限制條件為較短的siRNA保留介導RNAi之能力。同樣地，長siRNA在一些實例中可包括超過26個核苷酸，例如27、28、29、30、35、40、45、50、55或甚至60個核苷酸，其限制條件為較長siRNA保留介導RNAi或翻譯阻遏而不需進一步處理，例如酶處理為短siRNA之能力。siRNA可為單股RNA分子(ss-siRNA)或雙股RNA分子(ds-siRNA)，其包含雜交以形成稱為siRNA雙螺旋體之雙螺旋結構之有義股及反義股。
如本文所用，術語siRNA分子之「反義股」或「第一股」或「引導股」指代與具有靶向以用於靜默之基因之mRNA的約10-50個核苷酸、例如約15-30個、16-25個、18-23個或19-22個核苷酸之部分實質上與互補之股。反義股或第一股具有與所需標靶mRNA序列充分互補以引導標靶特異性之靜默，例如足以藉由RNAi機構或製程觸發所需標靶mRNA之破壞的互補性。
如本文所用，術語siRNA分子之「有義股」或「第二股」或「隨從股」指代與反義股或第一股互補之股。siRNA分子之反義股及有義股雜交以形成雙螺旋結構。如本文所用，「siRNA雙螺旋體」包括siRNA股，該siRNA股具有與具有靶向以用於靜默之基因之mRNA的約10-50個核苷酸之部分的足夠互補性，及具有足夠互補性以形成具有另一siRNA股之雙螺旋體之siRNA股。
如本文所用，術語「互補」指代聚核苷酸彼此形成鹼基對之能力。鹼基對通常由反平行聚核苷酸股中之核苷酸單元之間的氫鍵形成。互補聚核苷酸股可以華特生—克里克方式(例如A至T、A至U、C至G)或以允許形成雙螺旋體之任何其他方式形成鹼基對。如熟習此項技術者所瞭解，當使用相對於DNA之RNA時，尿嘧啶而非胸腺嘧啶係認為與腺苷互補之鹼基。然而，除非另外說明，否則當在本發明之上下文中指示U時，則暗示取代T之能力。完美的互補性或100%互補性指代一個聚核苷酸股之各核苷酸單元可與第二聚核苷酸股之核苷酸單元形成氫鍵之情況。次完美互補性係指兩股之一些但並非所有核苷酸單元可彼此形成氫鍵的情況。舉例而言，對於兩種20-聚體，若僅各股上之兩個鹼基對可彼此形成氫鍵，則聚核苷酸股展現10%互補性。在同一實例中，若各股上之18個鹼基對可彼此形成氫鍵，則聚核苷酸股展現90%互補性。
如本文所用，術語「基本上互補」意謂siRNA具有足以結合所需標靶mRNA及觸發標靶mRNA之RNA靜默之序列(例如反義股中)。
如本文所用，「靶向」意謂將雜交至靶核酸且誘導所需作用之核酸序列之設計及選擇製程。
術語「基因表現」指代製程，藉由該製程核酸序列經歷成功轉錄且在大多數情況下經歷成功翻譯以產生蛋白質或肽。為了清晰起見，當參考「基因表現」之量測時，此應理解為意謂量測可具有轉錄之核酸產物，例如RNA或mRNA，或翻譯之胺基酸產物之核酸產物，例如多肽或肽。量測RNA、mRNA、多肽及肽之量或含量之方法在此項技術中熟知。
如本文所用，術語「突變」指代基因結構之任何變化，導致可傳輸至後代之變體(亦稱為「突變型」)形式。基因突變可由DNA中之單鹼基之交替、或基因或染色體之較大部分之缺失、插入或重排引起。
如本文所用，術語「載體」意謂傳輸、轉導或以其他方式充當異源分子(諸如本發明之siRNA分子)之載劑之任何分子或部分。「病毒基因組」或「載體基因組」或「病毒載體」指代包含編碼或包含所關注分子之一或多個聚核苷酸區域之序列，例如轉基因、編碼多肽或多個多肽之聚核苷酸或諸如小干擾RNA (siRNA)之調節核酸。病毒基因組常用於將基因物質遞送至細胞中。病毒基因組常常經修飾以用於特定應用。病毒基因組序列之類型包括逆轉錄病毒病毒基因組序列、慢病毒病毒基因組序列、腺病毒病毒基因組序列及腺相關病毒基因組序列。
如本文所用之術語「腺相關病毒」或「AAV」指代包含或源自腺相關載體之組分且適合於感染哺乳動物細胞、較佳人類細胞之任何載體。術語AAV載體通常表明包含負載之AAV型病毒粒子(viral particle/virion)。AAV載體可源自各種血清型，包括血清型(亦即「假型」AAV)之組合，或源自各種基因組(例如單股或自互補)。另外，AAV載體可為有缺陷及/或靶向複製。
如本文所用，片語「基因之抑制表現」意謂導致基因表現產物之量的減少。表現產物可為自基因(例如mRNA)轉錄之RNA分子或自mRNA翻譯之多肽，該mRNA自基因轉錄。通常，mRNA含量之減少導致自其翻譯之多肽之含量的減少。表現水準可使用量測mRNA或蛋白質之標準技術測定。
如本文所用之術語「活體外」係指發生在人造環境中，例如試管或反應容器中、細胞培養液中、皮氏培養皿中等，而非發生在生物體(例如動物、植物或微生物)內的事件。
如本文所用，術語「活體內」指代發生在生物體(例如動物、植物、或微生物或其細胞或組織)內之事件。
如本文所用，術語「經修飾」指代本發明之分子之變化的狀態或結構。分子可以包括化學上、結構上及功能上之許多方式修飾。
如本文所用，術語「合成」意謂藉由人手產生、製備及/或製造。聚核苷酸或多肽或本發明之其他分子之合成可為化學或酶合成。
如本文所用，術語「轉染」指代將外源性核酸引入細胞中之方法。轉染方法包括但不限於化學方法、物理治療及陽離子型脂質或混合物。可轉染至細胞中之試劑清單較長且包括但不限於siRNA、有義及/或反義序列、編碼一或多種基因及組織成表現質體之DNA、蛋白質、蛋白質片段及更多。
如本文所用，「脫靶」指代對任何一或多者標靶、基因或細胞轉錄物之任何非預期作用。
如本文所用，片語「醫藥學上可接受」在本文中用於指在合理醫學判斷之範疇內適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理益處/風險比相匹配的彼等化合物、物質、組合物及/或劑型。
如本文所用，術語試劑之「有效量」為足以實現有益或所需結果，例如臨床結果之彼量，且因此「有效量」視其應用情形而定。舉例而言，在投與治療HD之試劑之情形下，試劑之有效量係例如相比於在未投與試劑下所獲得之反應，足以實現HD之如本文所定義之治療的量。舉例而言，在投與治療ALS之試劑之情形下，試劑之有效量係例如相比於在未投與試劑下所獲得之反應，足以實現ALS之如本文所定義之治療的量。
如本文所用，術語「治療有效量」意謂待遞送之試劑(例如核酸、藥物、治療劑、診斷劑、預防劑等)之量，該量在投與患有或易於患有感染、疾病、病症及/或病狀之個體時足以治療、改善感染、疾病、病症及/或病狀之症狀，診斷、預防及/或延遲感染、疾病、病症及/或病狀之發作。
如本文所用，術語「個體」或「患者」指代可投與根據本發明之組合物例如以實現實驗性、診斷性、預防性及/或療法目的之任何生物體。典型的個體包括動物(例如諸如小鼠、大鼠、兔之哺乳動物，諸如黑猩猩及其他猿及猴物種之非人類靈長類動物，及人類)及/或植物。
如本文所用，術語「預防(preventing/prevention)」指代延遲或預先阻止病狀或疾病之發作、出現或進展持續一段時間，包括數週、數月或數年。
如本文所用之術語「治療(treatment/treating)」指代用於治癒或改善疾病之一或多種特異性程序之應用。在某些實施例中，特異性程序為一或多種醫藥劑之投藥。在本發明之上下文中，特異性程序係一或多種siRNA分子之投藥。
如本文所用，術語「改善(amelioration/ameliorating)」指代病狀或疾病之至少一種指標之嚴重程度的減輕。舉例而言，在神經退化病症之情形下，改善包括神經元損失之減少。
如本文所用，術語「投與」指代向個體提供醫藥劑或組合物。
如本文所用，術語「神經退化」指代導致神經細胞死亡之病理狀態。大量神經病症共有作為常見病理狀態之神經退化。舉例而言，阿茲海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏病及肌肉萎縮性側索硬化(ALS)均引起慢性神經退化，其特徵為經若干年之時段緩慢的進行性神經細胞死亡，而急性神經退化之特徵在於由諸如中風之局部缺血或諸如創傷性腦損傷之外傷引起，或由例如脊髓損傷或多發性硬化症引起之髓鞘脫失或外傷所造成之軸突橫斷引起的神經細胞死亡之突然發作。在一些神經病症中，主要地神經元細胞之一種類型為退化性的，例如早期HD中之中型多棘神經元退化。VI. 等效物及範疇
熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗即可確定本文所述之根據本發明之具體實施例的許多等效物。本發明之範疇不意欲限於以上描述，而是如所附申請專利範圍中所闡述。
在申請專利範圍中，除非相反地指示或另外從上下文顯而易見，否則諸如「一(a/an)」及「該」之冠詞可意謂一或大於一。除非相反地指示或另外從上下文顯而易見，否則若一個、大於一個或所有群組成員存在於、用於給定產物或方法中或另外與給定產物或方法有關，則在群組的一或多個成員之間包括「或」之申請專利範圍或描述被視為滿足。本發明包括群組中恰好一個成員存在於、用於給定產物或方法中或以其他方式與給定產物或方法相關之實施例。本發明包括超過一個或所有組成員存在於、用於給定產物或方法中或以其他方式與給定產物或方法相關之實施例。
亦應注意，術語「包含」意欲為開放的且容許但不需要包括額外要素或步驟。當本文中使用術語「包含」時，亦因此涵蓋及揭示術語「由……組成」。
當給出範圍時，包括端點。此外，除非另外指示或另外自上下文及一般技術者的理解顯而易見，否則表示為範圍之值可在本發明之不同實施例中採用所述範圍內之任何特定值或子範圍，除非上下文另外明確規定，否則達到該範圍下限之單位的十分之一。
另外，應瞭解屬於先前技術之本發明之任何特定實施例可自申請專利範圍中之任何一或多者明確排除。因為認為此類實施例係一般技術者已知的，所以其可經排除，即使未在本文中明確地闡述該排除。出於任何原因，無論是否與先前技術之存在相關，本發明之組合物之任何特定實施例(例如任何抗生素、療法或活性成分；任何生產方法；任何使用方法；等)可自任何一或多者申請專利範圍排除。
應瞭解，所使用之字組係描述而非限制之字組，且可在隨附申請專利範圍之範圍內進行變化而不背離其較廣泛態樣中之本發明之真實範疇及精神。
儘管相對於若干所述之實施例以一定篇幅及一些特殊性描述本發明，但並非意欲其應受限於任何此類特性或實施例或任何特定實施例，而應視為參考隨附申請專利範圍以便鑒於先前技術提供此類申請專利範圍之可能的最廣泛解釋且因此有效地涵蓋本發明之預期範疇。VII. 實例 實例 1. AAV-miRNA 表現載體
將包含pri-miRNA卡匣之構築體工程改造為AAV-miRNA表現載體(ss或sc)，該pri-miRNA卡匣含有靶向HTT之引導股及隨從股。來自ITR至ITR，所述5'至3'之AAV-miRNA表現載體構築體包含ITR (突變型或野生型)、包含CMV (包括SV40內含子)、U6、H1、CBA (包括CMVie增強子、CB啟動子及SV40內含子)或CAG啟動子(包括CMVie增強子、CB啟動子及兔β球蛋白內含子)之啟動子、pri-miRNA卡匣、兔血球蛋白polyA或人類生長激素及野生型ITR。進行活體外及活體內研究以評估AAV-miRNA表現載體之藥理學活性。實例 2.AAV-miRNA 之活體內研究 A. 功效之活體內研究
基於YAC128小鼠中之HTT抑制、引導與隨從比及5'端處理之精確度，將所選擇之AAV-miRNA表現載體封裝於具有CBA啟動子(AAV1.CBA.iHtt)之AAV1 (ss或sc形式)中，在具有0.001% F-68之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中調配且投與YAC128小鼠以評估功效。AAV1載體經由雙側紋狀體內輸注以約5 uL中之1E10至3E10 vg之劑量歷經10分鐘/半球投與7-12週齡YAC128小鼠。對照組以媒劑(具有0.001% F-68之PBS)治療。在試驗物品投藥之後，以預定時間間隔進行包括旋轉及Porsolt游泳測試之行為測試以評估功效。在給藥後預定天數，動物經安樂死，且收集及急凍紋狀體組織鑽取。組織樣品經均質化且純化總RNA。藉由qRT-PCR測定HTT之相對表現。用於正規化之管家基因包括小鼠XPNPEP1。HTT經正規化為管家基因表現，且隨後進一步正規化為媒劑組。樣品亦用於定量HTT蛋白質。 B. HTT 抑制之 NHP 、引導與隨從比及處理之 5' 端精確度的活體內研究
基於YAC128小鼠中之HTT抑制、引導與隨從比及5'端處理之精確度，將所選擇之AAV-miRNA表現載體封裝於具有CBA啟動子(AAV1.CBA.iHtt)之AAV1中，在具有0.001% F-68之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中調配且藉由腦實質內腦輸注投與非人類靈長類動物。對照組以媒劑(具有0.001% F-68之PBS)治療。HTT mRNA之相對表現、引導與隨從比及5'端處理之精確度在給藥後預定時間於各種組織樣品中測定。
實例 3. HEK293T 及 HeLa 細胞中之多順反子構築體之活性 將編碼VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)及VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之多順反子miRNA表現載體封裝於AAV2中，且感染至HEK293T細胞及HeLa細胞中。對於HEK293T，將細胞接種至96孔板(在100 ul細胞培養基中2.5E4個細胞/孔)中且用多順反子miRNA表現載體感染。將HeLa細胞接種於96孔板(在100 ul細胞培養基中1E4個細胞/孔)中。在感染24小時之後，收集細胞以用於立即細胞溶解及螢光素酶活性之量測或用於qRT-PCR之RNA之分離。 A. 多順反子構築體之活性 (125 pM 及 250 pM)
藉由HEK293T及HeLa細胞之螢光素酶活性測定在125 pM及250 pM下轉染48小時之後多順反子構築體之相對活性(相對螢光素酶)。藉由相對於如藉由雙螢光素酶分析所測定之內部對照螢火蟲螢光素酶含量正規化海腎螢光素酶含量來獲得相對活性。
多順反子構築體之RLU及所測試之構築體之描述展示於表47中。在表47中，在各載體中測試兩種調節多核苷酸且調節多核苷酸呈串聯方式。在表中，載體將A調節多核苷酸編碼在B調節多核苷酸之前。
對於HEK293T細胞，對照具有在125 pM下為1及在250 pM下為1.11之RLU。在125 pM下轉染之編碼一種VOYHTmiR-104.016調節多核苷酸(SEQ ID NO: 1589)之構築體提供0.13之RLU且在250 pM下提供0.14之RLU。在125 pM下轉染之編碼VOYHTmiR-127.579調節多核苷酸(SEQ ID NO: 1599)之構築體提供0.14之RLU且在250 pM下提供0.14之RLU。當各自在125 pM下同時轉染各自編碼兩種調節多核苷酸(VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589])及VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599))中之一者之兩種載體時，看見0.06之RLU。
對於HeLa細胞，對照具有在125 pM下為1及在250 pM下為0.99之RLU。在125 pM下轉染之編碼VOYHTmiR-104.016調節多核苷酸(SEQ ID NO: 1589)之構築體提供0.26之RLU且在250 pM下提供0.27之RLU。在125 pM下轉染之編碼VOYHTmiR-127.579調節多核苷酸(SEQ ID NO: 1599)之構築體提供0.20之RLU且在250 pM下提供0.12之RLU。當各自在125 pM下同時轉染各自編碼兩種調節多核苷酸(VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)及VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599))中之一者之兩種構築體時，看見0.22之RLU。表 47 . 多順反子活性
以串聯方式編碼VOYHTmiR-104.016及VOYHTmiR-127.579兩者之載體相比於對照展示最佳活性。 B. 多順反子構築體之活性 (62.5 pM 及 125 pM) 及載體長度
在62.5 pM及125 pM下轉染40小時之後的具有或不具有填充DNA (以使總DNA含量在各條件中相同)之多順反子構築體之相對活性(相對螢光素酶)係藉由HeLa細胞之雙螢光素酶分析測定。藉由相對於如藉由雙螢光素酶分析所測定之內部對照螢火蟲螢光素酶含量正規化海腎螢光素酶含量來獲得相對活性。多順反子構築體之RLU及所測試之構築體之描述展示於表48中。在表48中，在各構築體中測試兩種調節多核苷酸且調節多核苷酸呈串聯方式。在表中，構築體將A調節多核苷酸編碼在B調節多核苷酸之前。
對於具有填充DNA之構築體，對照具有在62.5 pM及125 pM下為1之RLU。在62.5 pM下轉染之編碼VOYHTmiR-104.016調節多核苷酸(SEQ ID NO: 1589)之構築體提供0.45之RLU且在125 pM下提供0.31之RLU。在62.5 pM下轉染之編碼VOYHTmiR-127.579調節多核苷酸(SEQ ID NO: 1599)之構築體提供0.25之RLU且在125 pM下提供0.20之RLU。當各自在62.5 pM下同時轉染各自編碼兩種調節多核苷酸(VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)及VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599))中之一者之兩種構築體時，看見0.26之RLU。
對於不具有填充DNA之構築體，對照具有在62.5 pM及125 pM下為1之RLU。在62.5 pM下轉染之編碼VOYHTmiR-104.016調節多核苷酸(SEQ ID NO: 1589)之構築體提供0.31之RLU且在125 pM下提供0.24之RLU。在62.5 pM下轉染之編碼VOYHTmiR-127.579調節多核苷酸(SEQ ID NO: 1599)之構築體提供0.29之RLU且在125 pM下提供0.24之RLU。當各自在62.5 pM下同時轉染各自編碼兩種調節多核苷酸(VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)及VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599))中之一者之兩種構築體時，看見0.23之RLU。表 48 . 多順反子活性
較高及降低劑量之構築體在具有及不具有填充DNA下均展示相似的表現。具有呈串聯方式之VOYHTmiR-127.579及VOYHTmiR-104.016調節多核苷酸之構築體對於兩種轉染條件均展示最低RLU。 C. 用多順反子構築體轉染之後的 HTT 抑制
在125 pM或250 pM下轉染48小時之後HTT mRNA之相對表現係藉由針對HeLa之qRT-PCR測定。相對HTT mRNA表現係藉由相對於如藉由qRT-PCR所測定之HTT mRNA水準正規化管家基因mRNA水準來獲得；此正規化HTT mRNA水準隨後相對於對照治療細胞中之正規化HTT mRNA水準表現。多順反子構築體之結果及所測試之構築體之描述展示於表49中。在表49中，在各構築體中測試兩種調節多核苷酸且調節多核苷酸呈串聯方式。在表中，構築體將A調節多核苷酸編碼在B調節多核苷酸之前。
在125 pM下轉染之編碼VOYHTmiR-104.016調節多核苷酸(SEQ ID NO: 1589)之構築體提供50%之相對Httm RNA水準(相對於對照正規化)且在250 pM下提供61%之相對Htt mRNA水準(相對於對照正規化)。在125 pM下轉染之編碼VOYHTmiR-127.579調節多核苷酸(SEQ ID NO: 1599)之構築體提供52%之相對Htt mRNA水準(相對於對照正規化)且在250 pM下提供56%之相對Htt mRNA水準(相對於對照正規化)。當各自在125 pM下同時轉染各自編碼兩種調節多核苷酸(VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)及VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599))中之一者之兩種構築體時，看見49%之相對Htt mRNA水準(相對於對照正規化)。表 49 . HTT 之阻斷基因表現
以串聯方式編碼VOYHTmiR-104.016及VOYHTmiR-127.579兩者之構築體相比於兩種轉染條件之對照展示最佳活性。 D. 在 1E4 及 1E5 vg/ 細胞之 MOI 下感染之後的 HTT 抑制
在1E4或1E5 vg/細胞之MOI下感染24小時之後HTT mRNA之相對表現係藉由針對HEK293T及HeLa細胞之qRT-PCR測定。相對HTT mRNA表現係藉由相對於如藉由qRT-PCR所測定之管家基因mRNA水準正規化HTT mRNA水準來獲得；此正規化HTT mRNA水準隨後相對於mCherry治療細胞中之正規化HTT mRNA水準表現。結果展示於表50及51中。表 50 . HTT 之阻斷基因表現 表 51 . HTT 之阻斷基因表現
以串聯方式編碼VOYHTmiR-104.016及VOYHTmiR-127.579兩者之載體相比兩種細胞型中之兩種感染水準之對照展示最佳活性。 E. 多順反子構築體之活性 (62.5 pM 及 125 pM)
藉由HEK293T及HeLa細胞之雙螢光素酶分析測定在62.5 pM及125 pM下轉染48小時之後多順反子構築體之相對活性(相對螢光素酶)。藉由相對於如藉由雙螢光素酶分析所測定之內部對照螢火蟲螢光素酶含量正規化海腎螢光素酶含量來獲得相對活性。多順反子構築體之RLU及所測試之構築體之描述展示於表52-53中。在表53中，兩種、三種或四種調節多核苷酸在各構築體中測試且調節多核苷酸呈串聯方式。舉例而言，若存在兩種調節多核苷酸，則構築體將A調節多核苷酸編碼在B調節多核苷酸之前。表 52 . HTT 之阻斷基因表現 表 53 . 多順反子活性
編碼超過兩種調節多核苷酸之構築體提供兩種細胞型中之兩種轉染條件之最低RLU值。實例 4. HEK293T 及 HeLa 細胞中之多順反子構築體之活性
將編碼VOYHTmiR-104.579 (SEQ ID NO: 1595)及VOYHTmiR-127.016 (SEQ ID NO: 1593)之多順反子miRNA表現構築體封裝於scAAV2中，且感染至HEK293T細胞及HeLa細胞。對於HEK293T，將細胞接種至96孔板(在100 ul細胞培養基中2.5E4個細胞/孔)中且用多順反子miRNA表現載體感染。將HeLa細胞接種於96孔板(在100 ul細胞培養基中1E4個細胞/孔)中。在感染24小時之後，收集細胞以用於立即細胞溶解及螢光素酶活性之量測或用於qRT-PCR之分離。 A. 多順反子構築體之活性 (62.5 pM 及 125 pM)
藉由HEK293T及HeLa細胞之qRT-PCR測定在62.5 pM及125 pM下轉染48小時之後多順反子構築體之相對活性(相對螢光素酶)。藉由相對於如藉由雙螢光素酶分析所測定之內部對照螢火蟲螢光素酶含量正規化海腎螢光素酶含量來獲得相對活性。多順反子構築體之RLU及所測試之構築體之描述展示於表54-55中。在表55中，在各構築體中測試兩種調節多核苷酸且調節多核苷酸呈串聯方式。在表中，構築體將A調節多核苷酸編碼在B調節多核苷酸之前。表 54 . HTT 之阻斷基因表現 表 55 . 多順反子活性
具有按任何次序呈串聯方式之VOYHTmiR-127.016及VOYHTmiR-104.579調節多核苷酸之構築體對於兩種轉染條件均展示最低RLU。 B. 在 48 及 72 小時時 HeLa 中之多順反子構築體 (62.5 pM 及 125 pM) 之活性
在62.5 pM及125 pM下轉染48及72小時之後HTT mRNA之相對表現係藉由針對HeLa細胞之qRT-PCR測定。相對HTT mRNA表現係藉由相對於如藉由qRT-PCR所測定之管家基因mRNA水準正規化HTT mRNA水準來獲得；此正規化HTT mRNA水準隨後相對於mCherry治療細胞中之正規化HTT mRNA水準表現。所測試構築體之結果及描述展示於表56-57中。在表57中，在各載體中測試兩種調節多核苷酸且調節多核苷酸呈串聯方式。在表中，載體將A調節多核苷酸編碼在B調節多核苷酸之前。表 56 . HTT 之阻斷基因表現 表 57 . HTT 之阻斷基因表現
具有按任何次序呈串聯方式之VOYHTmiR-127.016及VOYHTmiR-104.579調節多核苷酸之構築體對於兩個時間點均展示最低相對Htt mRNA含量。實例 5.HEK293T 細胞中之多順反子構築體之活性
為測定用於抑制靶基因之相對活性，單獨或呈包含兩種、三種或四種調節多核苷酸之各種串聯組合形式之編碼VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)及/或VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)的miRNA表現載體經構建且轉染至HEK293T細胞中成為質體，或封裝於AAV2中且感染至HEK293T細胞中，且隨後量測靶基因mRNA含量。 A. 在質體轉染之後具有達至 2 種調節多核苷酸之多順反子構築體的活性
將HEK293T細胞接種於96孔板(在100 ul細胞培養基中為2.5E4個細胞/孔)中且與miRNA表現質體(62.5或125 pM)及含有螢火蟲螢光素酶基因之雙螢光素酶質體共轉染以實現轉染效率之正規化且亨廷頓(HTT)基因之VOYHTmiR-104.016及VOYHTmiR-127.579靶區域在海腎螢光素酶基因之終止密碼子之下游選殖。在轉染24或36小時之後，用於抑制HTT標靶mRNA之多順反子構築體之相對活性係藉由使用Dual-Glo™螢光素酶分析系統(Dual-Glo™ Luciferase Assay System)量測海腎及螢火蟲螢光素酶活性，及相對於內部對照螢火蟲螢光素酶活性正規化海腎螢光素酶活性來測定。此等正規化海腎螢光素酶活性(RLU，相對光單位)隨後相對於用同一濃度下之對照質體(pcDNA)轉染之HEK293T細胞中的正規化海腎螢光素酶活性(平均值設定為1)表現。
對於轉染24及36小時之後各種構築體之相對RLU (平均值±標準偏差)及所測試構築體之描述展示於表58中。各自編碼單一調節多核苷酸-VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)或VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之兩種構築體充當各自以串聯方式編碼兩種調節多核苷酸(VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)及/或VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599))之四種構築體的參考，其中各聚核苷酸由其自身H1啟動子及之後其自身H1終止子驅動。在表58中，構築體將A調節多核苷酸編碼在B調節多核苷酸之前。N/A意謂不適用。表 58 . HEK293T 細胞轉染之後的多順反子活性
此等結果表明各自含有呈串聯方式之兩種調節多核苷酸(VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之兩個複本、或VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本與VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599))之一個複本之組合)之序列VOYPC59、VOYPC60及VOYPC61提供比含有單一調節多核苷酸(VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)或VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599))之構築體更多的靶降低。
B. 在用 AAV 感染之後具有達至 4 種調節多核苷酸之多順反子構築體的活性 將HEK293T細胞接種於96孔板(在100 ul細胞培養基中為2.5E4個細胞/孔)中，且用封裝於AAV2中之miRNA表現載體以1×103 個載體基因組/細胞之MOI感染，以及用含有螢火蟲螢光素酶基因之雙螢光素酶質體轉染以實現轉染效率之正規化且HTT基因之VOYHTmiR-104.016及VOYHTmiR-127.579靶區域在海腎螢光素酶基因之終止密碼子之下游選殖。在轉染48小時之後，用於抑制HTT標靶mRNA之構築體之相對活性係藉由使用Dual-Glo™螢光素酶分析系統量測海腎及螢火蟲螢光素酶活性，及相對於內部對照螢火蟲螢光素酶活性正規化海腎螢光素酶活性來測定。此等正規化海腎螢光素酶活性(RLU，相對光單位)隨後相對於用同一MOI下之對照載體(AAV2.mCherry)感染之HEK293T細胞，或未感染之HEK293T細胞中的正規化海腎螢光素酶活性(平均值設定為1)表現。
各種構築體之相對RLU (平均值± 標準偏差)及所測試構築體之描述展示於表59中。各自編碼單一調節多核苷酸-VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)或VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之兩種AAV載體充當含有呈串聯方式之兩種、三種或四種調節多核苷酸(VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)及/或VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599))之十六種AAV載體的參考，其中各聚核苷酸由其自身Pol III H1啟動子及之後其自身H1終止子驅動。在表59中，構築體將A調節多核苷酸編碼在B調節多核苷酸之前，該B調節多核苷酸繼而位於C調節多核苷酸之前，該C調節多核苷酸繼而位於D調節多核苷酸之前。N/A意謂不適用。 表59.HEK293T細胞之AAV感染之後的多順反子活性
結果展示含有呈串聯方式之4種相同調節多核苷酸(VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589))之序列VOYPC47提供比含有呈串聯方式之3種相同調節多核苷酸(VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589))之VOYPC33更多的靶降低。此等結果亦展示含有呈串聯方式之3種相同調節多核苷酸(VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589))之VOYPC33提供比含有呈串聯方式之2種相同調節多核苷酸(VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589))之VOYPC59更多的靶降低。
結果展示含有呈串聯方式之4種相同調節多核苷酸(VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599))之序列VOYPC43提供比含有呈串聯方式之3種相同調節多核苷酸(VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599))之VOYPC31更多的靶降低。此等結果亦展示含有呈串聯方式之3種相同調節多核苷酸(VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599))之VOYPC31提供比含有呈串聯方式之2種相同調節多核苷酸(VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599))之VOYPC62更多的靶降低。
綜合而言，具有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)及具有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之此等結果表明呈串聯方式之4種相同調節多核苷酸提供比呈串聯方式之3種相同調節多核苷酸更多的抑制劑活性(靶降低)，其繼而提供比呈串聯方式之2種相同調節多核苷酸更多的抑制劑活性(靶降低)。
結果展示含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之兩個複本、繼之為VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本的序列VOYPC34提供比VOYPC30更多的抑制活性(靶降低)。兩種序列含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之兩個複本及VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本，但此等調節多核苷酸之順序不同；VOYPC34含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之兩個複本、繼之為VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本，而VOYPC30含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本。
結果展示在含有包含兩種不同調節多核苷酸之四種調節多核苷酸之序列中，序列VOYPC44提供比VOYPC48、VOYPC46或VOYPC45更多的抑制活性(靶降低)。實例 6. HEK293T 細胞中之多順反子構築體之 pri-miRNA 處理
為測定 pri-miRNA 處理之精確度及效率，單獨或呈包含兩種調節多核苷酸之各種串聯組合形式之編碼 VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589) 及 / 或 VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599) 的 miRNA 表現載體經構建，封裝於具有一種 CMV 啟動子、或兩種 H1 啟動子之 AAV2 中，且轉染至 HEK293T 細胞中，且隨後藉由深度測序評估 pri-miRNA 處理之精確度及效率。
一式兩份地(Rep1，Rep2)，將HEK293T細胞接種於6孔板(在2 mL細胞培養基中為2E6個細胞/板)中，且以1×104 個載體基因組/細胞之MOI用封裝於AAV2中之miRNA表現載體感染；參見表60-65。在感染48小時之後，藉由深度測序針對pri-miRNA處理評估細胞培養物以評估相對於miRNA之總內源庫引導股之豐度(表60-61)，引導:隨從股比(表62-63)，及引導股之5'端處之處理的精確度(表64-65)。在表60-65中，構築體將B調節多核苷酸編碼在A調節多核苷酸之前。N/A意謂不適用。
對於CMV啟動子(表60)，VOYHTmiR-104.016之引導股豐度受AAV基因組中之第二調節多核苷酸的存在影響。含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之兩個複本之AAV基因組的引導股豐度(VOYPC13，相對於總內源性miRNA庫為0.26及0.27%)低於含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之單一複本之AAV基因組的引導股豐度(相對於總內源性miRNA庫為0.49及0.43%)。然而，VOYHTmiR-104.016之引導股豐度高於含有第二不同調節多核苷酸VOYHTmiR-127.579之AAV基因組。相比於相對於總內源性miRNA庫為0.49及0.43%之單一調節多核苷酸(VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589))的引導股豐度，VOYPC14之引導股豐度相對於總內源性miRNA庫為1.69及1.52%，且VOYPC15之引導股豐度相對於總內源性miRNA庫為2.17及2.11%。利用CMV啟動子之序列經組態有串聯3'至CMV啟動子之調節多核苷酸，使得調節多核苷酸之轉錄處於單一CMV啟動子的控制下。使用CMV啟動子獲得之結果展示於表60中。表60. 在AAV感染(CMV啟動子)之後HEK293T培養物中之pri-miRNA處理-引導股豐度 在其自身H1啟動子之控制下利用Pol III啟動子H1之序列經組態有各調節多核苷酸。如表61中所展示，利用H1啟動子，引導股豐度與AAV基因組中之對應的調節多核苷酸之數量呈正比。含有VOYHTmiR-104.016之兩個複本之AAV基因組的VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之引導股豐度(VOYPC59，相對於總內源性miRNA庫為3.81及3.84%)比含有VOYHTmiR-104.016之單個複本之AAV基因組的VOYHTmiR-104.016的引導股豐度(相對於總內源性miRNA庫為2.19及2.13%)高1.77倍。VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之引導股豐度類似於含有VOYHTmiR-104.016之一個複本之AAV基因組，無論不同調節多核苷酸VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之複本是否存在於AAV基因組中。含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本之AAV基因組、含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本的AAV基因組(VOYPC60)、及含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本的AAV基因組(VOYPC61)相對於VOYHTmiR-104.016之總內源性miRNA庫之引導股豐度分別為2.19及2.13%、2.61及2.52%、及2.21及2.3%。
類似地，利用H1啟動子(表61)，對於另一調節多核苷酸，含有VOYHTmiR-127.579之兩個複本之AAV基因組的VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之引導股豐度(VOYPC62，相對於總內源性miRNA庫為2.05及1.74%)比含有VOYHTmiR-127.579之單個複本之AAV基因組的VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之引導股豐度(相對於總內源性miRNA庫為0.75及0.67%)高2.67倍。VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之引導股豐度類似於含有VOYHTmiR-127.579之一個複本之AAV基因組，無論不同調節多核苷酸VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之複本是否存在於AAV基因組中。含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本之AAV基因組、含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本的AAV基因組(VOYPC60)、及含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本的AAV基因組(VOYPC61)相對於總內源性miRNA庫之VOYHTmiR-127.579的引導股豐度分別為0.75及0.67%、1.0及1.05%、及0.97及0.99%。 表61.在AAV感染(H1啟動子)之後HEK293T培養物中之pri-miRNA處理-引導股豐度 利用CMV啟動子(表62)，相較於僅含有VOYHTmiR-104.016之單個複本之AAV基因組的71.1及83，含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本的AAV基因組(VOYPC15)，及含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本的AAV基因組(VOYPC14)之VOYHTmiR-104.016之引導/隨從股比分別為114.2及121.6，及99.2及105.8。 表62.在AAV感染(CMV啟動子)之後HEK293T培養物中之pri-miRNA處理-引導/隨從比
當利用Pol III H1啟動子(表63)時，VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之引導/隨從比不受AAV基因組中之第二調節多核苷酸之存在影響。含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本之AAV基因組、含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之兩個複本之AAV基因組(VOYPC59)、含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本的AAV基因組(VOYPC60)及含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本的AAV基因組(VOYPC61)之VOYHTmiR-104.016的引導/隨從比分別為16.9及20.2、14.3及18.6、16.3及16.3、以及17.7及17.8。
類似地，利用Pol III H1啟動子(表63)，VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之引導/隨從比不受AAV基因組中之第二調節多核苷酸之存在不受影響。含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本之AAV基因組、含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之兩個複本之AAV基因組(VOYPC62)、含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本的AAV基因組(VOYPC60)、及含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本的AAV基因組(VOYPC61)之VOYHTmiR-127.579的引導/隨從比分別為6.4及5.9、5.7及6.4、5.6及6.2、以及6.2及5.8。
此等結果表明利用Pol III H1啟動子(表63)，引導/隨從比相同，無論第二調節多核苷酸存在與否。表 63 . 在 AAV 感染 ( H1 啟動子 ) 之後 HEK293T 培養物中之 pri - miRNA 處理 - 引導 / 隨從比
利用CMV啟動子(表64)，引導股之5'端處之處理的精確度相同，無論第二調節多核苷酸是否存在於AAV基因組中。利用CMV啟動子，含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本之AAV基因組、含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之兩個複本之AAV基因組(VOYPC13)、含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本的AAV基因組(VOYPC15)、及含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本的AAV基因組(VOYPC14)之 VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)的引導股之5'端出之處理的精確度分別為95.5及95%、94.9及95.4%、95.7及95.7%、以及95.6及95.3%。利用CMV啟動子，含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本之AAV基因組、含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之兩個複本之AAV基因組(VOYPC16)、含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本的AAV基因組(VOYPC15)、及含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本的AAV基因組(VOYPC14)之VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)的引導股之5'端處之處理的精確度分別為59及59.8%、60.1及60.8%、59.9及61.5%、以及61及61.2%。表 64 . AAV 感染 ( CMV 啟動子 ) 之後 HEK293T 培養物中之 pri - miRNA 處理 - 引導股 5 ' 之精確度 - 處理
利用H1啟動子(表65)，引導股之5'端處之處理的精確度相同，無論第二調節多核苷酸是否存在於AAV基因組中。利用H1啟動子，含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本之AAV基因組、含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之兩個複本之AAV基因組(VOYPC59)、含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本的AAV基因組(VOYPC60)、及含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本的AAV基因組(VOYPC61)的VOYHTmiR-104.016之引導股之5'端處的處理之精確度分別為92.6及92.6%、92.6及92.1%、92.1及91.8%、以及93及92.9%。利用H1啟動子，含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本的AAV基因組、含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之兩個複本的AAV基因組(VOYPC62)、含有VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本的AAV基因組(VOYPC60)、及含有VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之一個複本、繼之為VOYHTmiR-104.016 (SEQ ID NO: 1589)之一個複本的AAV基因組(VOYPC61)之VOYHTmiR-127.579 (SEQ ID NO: 1599)之引導股的5'端處之處理之精確度分別為59.5及59.6%、58.5及59.3%、59及59.8%、以及58.5及58.7%。
此等結果表明利用CMV (表64)或H1 (表65)啟動子，引導股之5'端處之處理的精確度相同，無論第二調節多核苷酸是否存在。表 65 . AAV 感染 ( H1 啟動子 ) 之後 HEK293T 培養物中之 pri - miRNA 處理 - 引導股 5 ' 之精確度 - 處理
儘管相對於若干所述之實施例以一定篇幅及一些特殊性描述本發明，但並非意欲其應受限於任何此類特性或實施例或任何特定實施例，而應視為參考隨附申請專利範圍以便鑒於先前技術提供此類申請專利範圍之可能的最廣泛解釋且因此有效地涵蓋本發明之預期範疇。
所有公開案、專利申請案、專利及所提及之其他參考案均以全文引用的方式併入本文中。倘若有衝突，本說明書(包括定義)將占主導。另外，章節標題、材料、方法及實例僅為說明性的且不意欲為限制的。
100‧‧‧病毒基因組
110‧‧‧負載區域
120‧‧‧反向末端重複序列(ITR)
130‧‧‧啟動子區域
140‧‧‧內含子區域
150‧‧‧增強子區域
160‧‧‧多腺苷酸化信號序列區域
170‧‧‧MCS區域
180‧‧‧外顯子區域
前述及其他目標、特點及優點自如附圖中所說明之本發明特定實施例的以下描述將顯而易見。此外，附圖不一定按比例繪製，相反側重說明本發明之各個實施例的原理。
圖1為本發明之病毒基因組的示意圖。
圖2為本發明之病毒基因組的示意圖。
圖3為本發明之病毒基因組的示意圖。
圖4為本發明之病毒基因組的示意圖。
圖5為本發明之病毒基因組的示意圖。
圖6為本發明之病毒基因組的示意圖。
圖7為本發明之病毒基因組的示意圖。
圖8為本發明之病毒基因組的示意圖。
圖9為本發明之病毒基因組的示意圖。
本發明之一或多個實施例詳細闡述於以下隨附說明中。雖然可以使用與本文所述類似或等效的任何材料及方法實施或測試本發明，但現描述較佳材料及方法。本發明之其他特點、目標及優點自說明書中將顯而易見。在說明書中，除非上下文另外明確規定，否則單數形式亦包括複數形式。除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所瞭解相同的含義。在有衝突的情況下，以本說明書為準。

Claims (112)

  1. 一種腺相關病毒(AAV)病毒基因組，其包含位於兩個反向末端重複序列(ITR)之間的核酸序列，其中該核酸當表現時抑制或遏制靶基因在細胞中表現，其中該核酸序列依5'至3'次序包含：編碼第一有義股序列的第一區域、編碼第一反義股序列的第二區域、編碼第二有義股的第三區域及編碼第二反義股序列的第四區域，其中該第一及第二有義股序列包含至少15個鄰接核苷酸且該第一及第二反義股序列與該靶基因所產生的mRNA互補且包含至少15個鄰接核苷酸，且其中該第一有義股序列與第一反義股序列共有長度至少四個核苷酸之互補區域且該第二有義股序列與第二反義股序列共有長度至少四個核苷酸之互補區域。
  2. 一種腺相關病毒(AAV)病毒基因組，其包含位於兩個反向末端重複序列(ITR)之間的核酸序列，其中該核酸當表現時抑制或遏制第一靶基因及第二靶基因在細胞中表現，其中該核酸序列依5'至3'次序包含：編碼第一有義股序列的第一區域、編碼第一反義股序列的第二區域、編碼第二有義股的第三區域及編碼第二反義股序列的第四區域，其中該第一及第二有義股序列包含至少15個鄰接核苷酸且該第一反義股序列與該第一靶基因所產生的mRNA互補且該第二反義股序列與該第二靶基因所產生的mRNA互補且包含至少15個鄰接核苷酸，且其中該第一有義股序列與第一反義股序列共有長度至少四個核苷酸的互補區域且該第二有義股序列與第二反義股序列共有長度至少四個核苷酸的互補區域。
  3. 如請求項2之AAV病毒基因組，依5'至3'次序進一步包含編碼第三有義股序列的第五區域及編碼第三反義股序列的第六區域，其中該第三有義股序列包含至少15個鄰接核苷酸且該第三反義股序列與第三靶基因所產生的mRNA互補且包含至少15個鄰接核苷酸，且其中該第三有義股序列與第三反義股序列共有至少四個核苷酸的互補區域。
  4. 如請求項3之AAV病毒基因組，依5'至3'次序進一步包含編碼第四有義股序列的第七區域及編碼第四反義股序列的第八區域，其中該第四有義股序列包含至少15個鄰接核苷酸且該第四反義股序列與第四靶基因所產生的mRNA互補且包含至少15個鄰接核苷酸，且其中該第四有義股序列與第四反義股序列共有至少四個核苷酸的互補區域。
  5. 如請求項2之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因與該第二靶基因相同。
  6. 如請求項3之AAV病毒基因組，其中該第三靶基因與該第一靶基因相同。
  7. 如請求項3之AAV病毒基因組，其中該第三靶基因與該第二靶基因相同。
  8. 如請求項3之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因及該第三靶基因為相同的。
  9. 如請求項4之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第一靶基因相同。
  10. 如請求項4之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第二靶基因相同。
  11. 如請求項4之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第三靶基因相同。
  12. 如請求項4之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第一靶基因及該第二靶基因相同。
  13. 如請求項4之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第二靶基因及該第三靶基因相同。
  14. 如請求項4之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第一靶基因、該第二靶基因及該第三靶基因相同。
  15. 如請求項1至14中任一項之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因、該第三靶基因及/或該第四靶基因為亨廷頓蛋白(Huntingtin)。
  16. 如請求項1至14中任一項之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因、該第三靶基因及/或該第四靶基因為SOD1。
  17. 如請求項1至14中任一項之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因、該第三靶基因及/或該第四靶基因為亨廷頓蛋白或SOD1。
  18. 如請求項1或2之AAV病毒基因組，其中該第一有義股與該第一反義股之間的該互補區域具有至少12個核苷酸的長度。
  19. 如請求項18之AAV病毒基因組，其中該第一有義股與該第一反義股之間的該互補區域具有14與21個核苷酸之間的長度。
  20. 如請求項19之AAV病毒基因組，其中該第一有義股與該第一反義股之間的該互補區域具有19個核苷酸的長度。
  21. 如請求項1或2之AAV病毒基因組，其中該第二有義股與該第二反義股之間的該互補區域具有至少12個核苷酸的長度。
  22. 如請求項21之AAV病毒基因組，其中該第二有義股與該第二反義股之間的該互補區域具有14與21個核苷酸之間的長度。
  23. 如請求項22之AAV病毒基因組，其中該第二有義股與該第二反義股之間的該互補區域具有19個核苷酸的長度。
  24. 如請求項3之AAV病毒基因組，其中該第三有義股與該第三反義股之間的該互補區域具有至少12個核苷酸的長度。
  25. 如請求項24之AAV病毒基因組，其中該第三有義股與該第三反義股之間的該互補區域具有14與21個核苷酸之間的長度。
  26. 如請求項25之AAV病毒基因組，其中該第三有義股與該第三反義股之間的該互補區域具有19個核苷酸的長度。
  27. 如請求項4之AAV病毒基因組，其中該第四有義股與該第四反義股之間的該互補區域具有至少12個核苷酸的長度。
  28. 如請求項27之AAV病毒基因組，其中該第四有義股與該第四反義股之間的該互補區域具有14與21個核苷酸之間的長度。
  29. 如請求項25之AAV病毒基因組，其中該第四有義股與該第四反義股之間的該互補區域具有19個核苷酸的長度。
  30. 如請求項1或2之AAV病毒基因組，其中該第一有義股序列、該第二有義股序列、該第一反義股序列及該第二反義股序列獨立地具有30個或少於30個核苷酸。
  31. 如請求項3之AAV病毒基因組，其中該第一有義股序列、該第二有義股序列、該第三有義股序列、該第一反義股序列、該第二反義股序列及該第三反義股序列獨立地具有30個或少於30個核苷酸。
  32. 如請求項4之AAV病毒基因組，其中該第一有義股序列、該第二有義股序列、該第三有義股序列、該第四有義股序列、該第一反義股序列、該第二反義股序列、該第三反義股序列及該第四反義股序列獨立地具有30個或少於30個核苷酸。
  33. 如請求項1或2之AAV病毒基因組，其中該第一有義股序列及該第一反義股序列或該第二有義股序列及該第二反義股序列中之至少一者包含至少1個核苷酸之3'突出端。
  34. 如請求項1或2之AAV病毒基因組，其中該第一有義股序列及該第一反義股序列或該第二有義股序列及該第二反義股序列中之至少一者包含至少2個核苷酸之3'突出端。
  35. 如請求項3之AAV病毒基因組，其中該第三有義股序列及該第三反義股序列包含至少1個核苷酸之3'突出端。
  36. 如請求項3之AAV病毒基因組，其中該第三有義股序列及該第三反義股序列包含至少2個核苷酸之3'突出端。
  37. 如請求項4之AAV病毒基因組，其中該第四有義股序列及該第四反義股序列包含至少1個核苷酸之3'突出端。
  38. 如請求項4之AAV病毒基因組，其中該第四有義股序列及該第四反義股序列包含至少2個核苷酸之3'突出端。
  39. 如請求項1至38中任一項之AAV病毒基因組，其中該第一區域包含該第一有義股序列之啟動子5'、繼之為該第一有義股序列，且該第二區域包含該第一反義股序列、繼之為該第一反義股序列之啟動子終止子3'；或該第三區域包含該第二有義股序列之啟動子5'、繼之為該第二有義股序列，且該第四區域包含該第二反義股序列、繼之為該第二反義股序列之啟動子終止子3'。
  40. 如請求項1至38中任一項之AAV病毒基因組，其中該第一區域包含該第一有義股序列之啟動子5'、繼之為該第一有義股序列，且該第二區域包含該第一反義股序列、繼之為該第一反義股序列之啟動子終止子3'；且該第三區域包含該第二有義股序列之啟動子5'、繼之為該第二有義股序列，且該第四區域包含該第二反義股序列、繼之為該第二反義股序列之啟動子終止子3'。
  41. 如請求項3至40中任一項之AAV病毒基因組，其中該第五區域包含該第三有義股序列之啟動子5'、繼之為該第三有義股序列且該第六區域包含該第三反義股序列、繼之為該第三反義股序列之啟動子終止子3'。
  42. 如請求項4至41中任一項之AAV病毒基因組，其中該第七區域包含該第四有義股序列之啟動子5'、繼之為該第四有義股序列且該第八區域包含該第四反義股序列、繼之為該第四反義股序列之啟動子終止子3'。
  43. 如請求項3之AAV病毒基因組，其中該第五區域為該第四區域之3'。
  44. 如請求項4之AAV病毒基因組，其中該第七區域為該第六區域之3'。
  45. 如請求項39至44中任一項之AAV病毒基因組，其中啟動子為Pol III啟動子且該啟動子終止子為Pol III啟動子終止子。
  46. 如請求項45之AAV病毒基因組，其中各自地，該Pol III啟動子為U3、U6、U7、7SK、H1或MRP、EBER、硒基半胱胺酸tRNA、7SL、腺病毒VA-1，或端粒酶基因啟動子，且該Pol III啟動子終止子為U3、U6、U7、7SK、H1或MRP、EBER、硒基半胱胺酸tRNA、7SL、腺病毒VA-1，或端粒酶基因啟動子終止子。
  47. 如請求項46之AAV病毒基因組，其中該Pol III啟動子為H1啟動子且該Pol III啟動子終止子為H1啟動子終止子。
  48. 如請求項1至47中任一項之AAV病毒基因組，其中該AAV病毒基因組為單專一性多順反子AAV病毒基因組。
  49. 如請求項1至47中任一項之AAV病毒基因組，其中該AAV病毒基因組為雙專一性多順反子AAV病毒基因組。
  50. 如請求項1或2之AAV病毒基因組，其中該第一區域及該第二區域編碼第一siRNA分子，且該第三區域及該第四區域編碼第二siRNA分子，其中該第一及第二siRNA分子靶向不同靶基因。
  51. 如請求項3之AAV病毒基因組，其中該第五區域及該第六區域編碼第三siRNA分子，其中該第一siRNA分子、該第二siRNA分子及該第三siRNA分子各自靶向不同靶基因。
  52. 如請求項4之AAV病毒基因組，其中該第七區域及該第八區域編碼第四siRNA分子，其中該第一siRNA分子、該第二siRNA分子、該第三siRNA分子及該第四siRNA分子各自靶向不同靶基因。
  53. 一種腺相關病毒(AAV)病毒基因組，包含位於兩個反向末端重複序列(ITR)之間的核酸序列，其中該核酸序列包含第一分子支架區域及第二分子支架區域，其中該第一分子支架區域包含第一分子支架核酸序列，該第一分子支架核酸序列編碼： (f)第一莖及環以形成第一莖環結構，該第一莖環結構之序列依5'至3'包含： x.第一UG模體，其位於該第一莖環結構之第一5'莖的鹼基處或附近； xi.第一5'莖臂，其包含第一有義股及視情況存在之第一5'間隔子區域，其中該第一5'間隔子區域當存在時位於該第一UG模體與該第一有義股之間； xii.第一環區域，其包含位於該第一環區域之5'端的第一UGUG模體； xiii.第一3'莖臂，其包含第一反義股及視情況存在之第一3'間隔子區域，其中尿苷存在於該第一反義股之5'端且其中該第一3'間隔子區域當存在時具有足以形成一個螺旋形轉彎的長度； (g)第一5'側接區域，其位於該第一莖環結構的5'；及 (h)第一3'側接區域，其位於該第一莖環結構之3'，該第一3'側接區域包含CNNC模體，及 第二分子支架區域包含第二分子支架核酸序列，該第二分子支架核酸序列編碼： (i)第二莖及環以形成第二莖環結構，該第二莖環結構之序列依5'至3'包含： xiv.第二UG模體，其位於該第二莖環結構之第二5'莖的鹼基處或附近； xv.第二5'莖臂，其包含第二有義股及視情況存在之第二5'間隔子區域，其中該第二5'間隔子區域當存在時位於該第二UG模體與該第二有義股之間； xvi.第二環區域，其包含位於該第二環區域之5'端的第二UGUG模體； xvii.第二3'莖臂，其包含第二反義股及視情況存在之第二3'間隔子區域，其中尿苷存在於該第二反義股之5'端且其中該第二3'間隔子區域當存在時具有足以形成一個螺旋形轉彎的長度； (j)第二5'側接區域，其位於該第二莖環結構之5'；及 (k)第二3'側接區域，其位於該第二莖環結構之3'，該第二3'側接區域包含CNNC模體，及 其中該第一反義股與該第一有義股形成第一siRNA雙螺旋體且該第二反義股與該第二有義股形成第二siRNA雙螺旋體，其中該第一siRNA雙螺旋體當表現時抑制或遏制第一靶基因在細胞中表現，且該第二siRNA雙螺旋體當表現時抑制或遏制第二靶基因在細胞中表現，其中該第一及第二有義股序列包含至少15個核苷酸，該第一反義股序列與該第一靶基因所產生的mRNA互補且第二反義股序列與該第二靶基因所產生的mRNA互補，且其中該第一有義股序列與第一反義股序列共有至少四個核苷酸長度的互補區域且該第二有義股序列與第二反義股序列共有至少四個核苷酸長度的互補區域。
  54. 一種腺相關病毒(AAV)病毒基因組，包含位於兩個反向末端重複序列(ITR)之間的核酸序列，其中該核酸序列包含第一分子支架區域及第二分子支架區域，其中該第一分子支架區域包含第一分子支架核酸序列，該第一分子支架核酸序列編碼： (m)第一莖及環以形成第一莖環結構，該第一莖環結構之序列依5'至3'包含： xvii.第一UG模體，其位於該第一莖環結構之第一5'莖的鹼基處或附近； xviii.第一5'莖臂，其包含第一反義股及視情況存在之第一5'間隔子區域，其中該第一5'間隔子區域當存在時位於該第一UG模體與該第一反義股之間； xix.第一環區域，其包含位於該第一環區域之5'端的第一UGUG模體； xx.第一3'莖臂，其包含第一有義股及視情況存在之第一3'間隔子區域，其中尿苷存在於該第一有義股之5'端且其中該第一3'間隔子區域當存在時具有足以形成一個螺旋形轉彎的長度； (n)第一5'側接區域，其位於該第一莖環結構的5'；及 (o)第一3'側接區域，其位於該第一莖環結構之3'，該第一3'側接區域包含CNNC模體，及 第二分子支架區域包含第二分子支架核酸序列，該第二分子支架核酸序列編碼： (p)第二莖及環以形成第二莖環結構，該第二莖環結構之序列依5'至3'包含： xxi.第二UG模體，其位於該第二莖環結構之第二5'莖的鹼基處或附近； xxii.第二5'莖臂，其包含第二反義股及視情況存在之第二5'間隔子區域，其中該第二5'間隔子區域當存在時位於該第二UG模體與該第二反義股之間； xxiii.第二環區域，其包含位於該第二環區域之5'端的第二UGUG模體； xxiv.第二3'莖臂，其包含第二有義股及視情況存在之第二3'間隔子區域，其中尿苷存在於該第二有義股之5'端且其中該第二3'間隔子區域當存在時具有足以形成一個螺旋形轉彎的長度； (q)第二5'側接區域，其位於該第二莖環結構之5'；及 (r)第二3'側接區域，其位於該第二莖環結構之3'，該第二3'側接區域包含CNNC模體，及 其中該第一反義股與該第一有義股形成第一siRNA雙螺旋體且該第二反義股與該第二有義股形成第二siRNA雙螺旋體，其中該第一siRNA雙螺旋體當表現時抑制或遏制第一靶基因在細胞中表現，且該第二siRNA雙螺旋體當表現時抑制或遏制第二靶基因在細胞中表現，其中該第一及第二有義股序列包含至少15個核苷酸，該第一反義股序列與該第一靶基因所產生的mRNA互補且第二反義股序列與該第二靶基因所產生的mRNA互補，且其中該第一有義股序列與第一反義股序列共有至少四個核苷酸長度的互補區域且該第二有義股序列與第二反義股序列共有至少四個核苷酸長度的互補區域。
  55. 如請求項53或54之AAV病毒基因組，其中該第一反義股序列或該第二反義股序列抑制或遏制亨廷頓蛋白表現。
  56. 如請求項53或54之AAV病毒基因組，其中該第一反義股序列及該第二反義股序列抑制或遏制亨廷頓蛋白表現。
  57. 如請求項53或54之AAV病毒基因組，其中該第一反義股序列或該第二反義股序列抑制或遏制SOD1表現。
  58. 如請求項53或54之AAV病毒基因組，其中該第一反義股序列及該第二反義股序列抑制或遏制SOD1表現。
  59. 如請求項53或54之AAV病毒基因組，其中該第一5'側接區域係選自表10中所列的序列。
  60. 如請求項53或54之AAV病毒基因組，其中該第二5'側接區域係選自表10中所列的該等序列。
  61. 如請求項59之AAV病毒基因組，其中該第二5'側接區域係選自表10中所列的該等序列。
  62. 如請求項53或54之AAV病毒基因組，其中該第一環區域係選自表11中所列的序列。
  63. 如請求項53或54之AAV病毒基因組，其中該第二環區域係選自表11中所列的該等序列。
  64. 如請求項62之AAV病毒基因組，其中該第二環區域係選自表11中所列的該等序列。
  65. 如請求項53或54之AAV病毒基因組，其中該第一3'側接區域係選自表12中所列的序列。
  66. 如請求項53或54之AAV病毒基因組，其中該第二3'側接區域係選自表12中所列的序列。
  67. 如請求項65之AAV病毒基因組，其中該第二3'側接區域係選自表12中所列的該等序列。
  68. 如請求項53或54之AAV病毒基因組，其中該核酸序列包含位於該第一分子支架核酸序列與該第二分子支架核酸序列之間的啟動子序列。
  69. 如請求項53或54之AAV病毒基因組，進一步包含：在(b)中，該第一5'側接區域之啟動子5'、繼之為該第一5'側接區域；且在(c)中，該第一3'側接區域、繼之為該第一3'側接區域之啟動子終止子3'；且在(d)中，該第二5'側接區域之啟動子5'、繼之為該第二5'側接區域且在(e)中，該第二3'側接區域、繼之為該第二3'側接區域之啟動子終止子3'。
  70. 如請求項69之AAV病毒基因組，其中該啟動子為Pol III啟動子。
  71. 如請求項70之AAV病毒基因組，其中該Pol III啟動子序列為U3、U6、U7、7SK、H1或MRP、EBER、硒基半胱胺酸tRNA、7SL、腺病毒VA-1或端粒酶基因啟動子。
  72. 如請求項71之AAV病毒基因組，其中該Pol III啟動子為H1啟動子。
  73. 如請求項53之AAV病毒基因組，其中該核酸序列進一步包含含有第三分子支架核酸序列的第三分子支架區域，該第三分子支架核酸序列編碼： (s)第三莖及環以形成第三莖環結構，該第三莖環結構之序列依5'至3'包含： xxv.第三UG模體，其位於該第三莖環結構之第三5'莖的鹼基處或附近； xxvi.第三5'莖臂，其包含第三有義股及視情況存在之第三5'間隔子區域，其中該第三5'間隔子區域當存在時位於該第三UG模體與該第三有義股之間； xxvii.第三環區域，其包含位於該第三環區域之5'端的第三UGUG模體； xxviii.第三3'莖臂，其包含第三反義股及視情況存在之第三3'間隔子區域，其中尿苷存在於該第三反義股之5'端且其中該第三3'間隔子區域當存在時具有足以形成一個螺旋形轉彎的長度； (t)第三5'側接區域，其位於該第三莖環結構之5'；及 (u)第三3'側接區域，其位於該第三莖環結構之3'，該第三3'側接區域包含CNNC模體，及 其中該第三反義股與該第三有義股形成第三siRNA雙螺旋體，其中該第三siRNA雙螺旋體當表現時抑制或遏制第三靶基因在細胞中表現，其中該第三有義股序列包含至少15個核苷酸，該第三反義股序列與該第三靶基因所產生的mRNA互補，且其中該第三有義股序列與第三反義股序列共有至少四個核苷酸長度的互補區域。
  74. 如請求項73之AAV病毒基因組，進一步包含：在(h)中，該第三5'側接區域之啟動子5'、繼之為該第三5'側接區域；及在(i)中，該第三3'側接區域、繼之為該第三3'側接區域之啟動子終止子3'。
  75. 如請求項74之AAV病毒基因組，其中該啟動子為Pol III啟動子。
  76. 如請求項75之AAV病毒基因組，其中該Pol III啟動子序列為U3、U6、U7、7SK、H1或MRP、EBER、硒基半胱胺酸tRNA、7SL、腺病毒VA-1或端粒酶基因啟動子。
  77. 如請求項76之AAV病毒基因組，其中該Pol III啟動子為H1啟動子。
  78. 如請求項73之AAV病毒基因組，其中該核酸序列進一步包含含有第四分子支架核酸序列的第四分子支架區域，該第四分子支架核酸序列編碼： (v)第四莖及環以形成第四莖環結構，該第四莖環結構之序列依5'至3'包含： xxix.第四UG模體，其位於該第四莖環結構之第四5'莖的鹼基處或附近； xxx.第四5'莖臂，其包含第四有義股及視情況存在之第四5'間隔子區域，其中該第四5'間隔子區域當存在時位於該第四UG模體與該第四有義股之間； xxxi.第四環區域，其包含位於該第四環區域之5'端的第四UGUG模體； xxxii.第四3'莖臂，其包含第四反義股及視情況存在之第四3'間隔子區域，其中尿苷存在於該第四反義股之5'端且其中該第四3'間隔子區域當存在時具有足以形成一個螺旋形轉彎的長度； (w)第四5'側接區域，其位於該第四莖環結構之5'；及 (x)第四3'側接區域，其位於該第四莖環結構之3'，該第四3'側接區域包含CNNC模體，及 其中該第四反義股與該第四有義股形成第四siRNA雙螺旋體，其中該第四siRNA雙螺旋體當表現時抑制或遏制第四靶基因在細胞中表現，其中該第四有義股序列包含至少15個核苷酸，該第四反義股序列與該第四靶基因所產生的mRNA互補，且其中該第四有義股序列與第四反義股序列共有至少四個核苷酸長度的互補區域。
  79. 如請求項78之AAV病毒基因組，進一步包含：在(k)中，該第四5'側接區域之啟動子5'、繼之為該第四5'側接區域；及在(l)中，該第四3'側接區域、繼之為該第四3'側接區域之啟動子終止子3'。
  80. 如請求項79之AAV病毒基因組，其中該啟動子為Pol III啟動子。
  81. 如請求項80之AAV病毒基因組，其中該Pol III啟動子序列為U3、U6、U7、7SK、H1或MRP、EBER、硒基半胱胺酸tRNA、7SL、腺病毒VA-1或端粒酶基因啟動子。
  82. 如請求項81之AAV病毒基因組，其中該Pol III啟動子為H1啟動子。
  83. 如請求項53至82中任一項之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因與該第二靶基因相同。
  84. 如請求項53至82中任一項之AAV病毒基因組，其中該第三靶基因與該第一靶基因相同。
  85. 如請求項53至82中任一項之AAV病毒基因組，其中該第三靶基因與該第二靶基因相同。
  86. 如請求項53至82中任一項之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因及該第三靶基因為相同的。
  87. 如請求項53至82中任一項之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第一靶基因相同。
  88. 如請求項53至82中任一項之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第二靶基因相同。
  89. 如請求項53至82中任一項之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第三靶基因相同。
  90. 如請求項53至82中任一項之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第一靶基因及該第二靶基因相同。
  91. 如請求項53至82之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第二靶基因及該第三靶基因相同。
  92. 如請求項53至82之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第一靶基因及該第三靶基因相同。
  93. 如請求項53至82中任一項之AAV病毒基因組，其中該第四靶基因與該第一靶基因、該第二靶基因及該第三靶基因相同。
  94. 如請求項53至93中任一項之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因、該第三靶基因及/或該第四靶基因為亨廷頓蛋白。
  95. 如請求項53至93中任一項之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因、該第三靶基因及/或該第四靶基因為SOD1。
  96. 如請求項53至93中任一項之AAV病毒基因組，其中該第一靶基因、該第二靶基因、該第三靶基因及/或該第四靶基因為亨廷頓蛋白或SOD1。
  97. 一種用於抑制靶基因在細胞中表現基因的方法，該方法包含向該細胞投與包含如請求項1至96中任一項之AAV病毒基因組的組合物。
  98. 如請求項97之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  99. 如請求項98之方法，其中該哺乳動物細胞為中型多棘神經元。
  100. 如請求項98之方法，其中該哺乳動物細胞為皮質神經元。
  101. 如請求項98之方法，其中該哺乳動物細胞為運動神經元。
  102. 如請求項98之方法，其中該哺乳動物細胞為星形細胞。
  103. 一種用於治療有需要之個體之疾病及/或病症的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之包含如請求項1至96中任一項之AAV病毒基因組的組合物。
  104. 如請求項103之方法，其中對靶基因之表現加以抑制或遏制。
  105. 如請求項104之方法，其中所關注之靶基因的表現被抑制或遏制約30%至約70%。
  106. 如請求項104之方法，其中靶基因的表現被抑制或遏制約50%至約90%。
  107. 一種用於抑制靶基因在細胞中表現的方法，其中該靶基因在該細胞內部引起功能獲得性效應，該方法包含向該細胞投與包含如請求項1至96中任一項之AAV病毒基因組的組合物。
  108. 如請求項107之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  109. 如請求項108之方法，其中該哺乳動物細胞為中型多棘神經元。
  110. 如請求項108之方法，其中該哺乳動物細胞為皮質神經元。
  111. 如請求項108之方法，其中該哺乳動物細胞為運動神經元。
  112. 如請求項108之方法，其中該哺乳動物細胞為星形細胞。
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