CN110913866A - 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码siRNA分子的腺相关病毒(AAV)颗粒和治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法。本发明涉及用于设计、制备、制造、使用和/或配制包含调节性多核苷酸的AAV颗粒的组合物、方法和过程，所述调节性多核苷酸例如编码至少一种靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的小干扰RNA(siRNA)分子的多核苷酸。还公开了在患有神经退行性疾病(例如，肌萎缩性侧索硬化(ALS))的受试者中使用AAV颗粒抑制SOD1基因表达的方法。

Description

治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月5日提交的题为治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的组合物和方法的美国临时专利申请号62/501,788、2017年5月18日提交的题为治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的组合物和方法的美国临时专利号62/507,927、2017年6月15日提交的题为治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的组合物和方法的美国临时专利申请号62/520,100和2017年10月2日提交的题为治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的组合物和方法的美国临时专利申请号62/566,609的权益，其全部内容通过引用整体并入本文。
参考序列表
与本申请一起提交的序列表以ASCII文本文件的电子格式提交。序列表以ASCII文本文件的形式提供，标题为14482_0164_228_SEQ_LISTING.txt，创建于2018年4月30日，大小为6,635,467字节。序列表通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及用于设计、制备、制造、使用和/或配制包含调节性多核苷酸的AAV颗粒的组合物、方法和过程，所述调节性多核苷酸例如编码至少一种靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的小干扰RNA(siRNA)分子的多核苷酸。靶向SOD1基因可以干扰SOD1基因表达以及由此的SOD1蛋白生产。可以将包含编码至少一个siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV颗粒插入重组腺相关病毒(AAV)载体中。还公开了在患有神经退行性疾病(例如，肌萎缩性侧索硬化(ALS))的受试者中使用AAV颗粒抑制SOD1基因表达的方法。
发明背景
肌萎缩性侧索硬化(ALS)也被称作卢·格里格病(Lou Gehrig's disease)，是最致命的进行性神经变性疾病，其特征在于在初级运动皮质、脑干和脊髓中的运动神经元(MN)的显著损失。运动神经元的损失破坏基础性的基本动作，诸如呼吸，并通常在诊断以后2～5年内造成患者的死亡。患者中运动功能的进行性衰退严重地破坏他们的呼吸能力，因而患者的存活需要某种形式的呼吸辅助。其它症状也包括手、臂、腿或吞咽肌的肌无力。有些患者(例如，FTD-ALS)还可能发生额颞叶痴呆。
根据ALS协会，在美国每年诊断出大约5,600人患有ALS。ALS的发病率是每100,000人中2人，且据估测，多达30,000美国人在任何给定的时间可能患有该疾病。
已经描述了ALS的两种形式：一种是散发性ALS(sALS)，这是在美国最常见的ALS的形式，并占所有诊断的病例的90-95％；另一种是家族性ALS(fALS)，这发生在主要具有显性遗传的家族谱系中，且仅占美国所有病例的约5-10％。sALS和fALS在临床上是不能辨别的。
病理学研究发现，一些细胞过程的紊乱发生在疾病发作以后，包括增加的ER应激、自由基(即，活性氧(ROS))的产生、线粒体功能障碍、蛋白聚集、细胞凋亡、炎症和谷氨酸盐兴奋性中毒，特别是在运动神经元(MN)中。
ALS的成因是复杂的和不同的。一般而言，认为ALS是一种复杂的遗传性病症，其中与环境暴露组合的多个基因联合使得人成为易患病的。已经发现了十多个与ALS有关的基因，包括SOD-1(Cu2+/Zn2+超氧化物歧化酶)、TDP-43(TARDBP、TAR DNA结合蛋白-43)、FUS(在肉瘤中融合/在肉瘤中转移)、ANG(血管生成素)、ATXN2(共济失调蛋白2(Ataxin-2))、含缬酪肽蛋白(VCP)、OPTN(视神经病变诱导基因(Optineurin))和染色体9开放读码框72(C9ORF72)中的非编码GGGGCC六核苷酸重复的扩增。但是，运动神经元变性的确切机制仍然是难以捉摸的。
目前，不存在ALS的治愈性治疗。唯一的FDA批准的药物是利鲁唑，其拮抗谷氨酸盐应答以减少ALS的病理学发展。但是，已经报道了处于早期阶段的ALS患者的仅约3个月的寿命延长，尚未观察到对于处于晚期阶段的ALS患者而言的治疗益处，这表明了患者的治疗选择的缺乏(Bensimon G等人,J Neurol.2002,249,609-615)。因此，仍然需要可以有效地阻止疾病进展的新治疗策略。
正在针对散发性和家族性ALS的潜在治疗研究许多不同的策略。一个策略是基于可以促进神经元存活的神经营养因子(诸如胰岛素样生长因子I(IGF-I)、胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、Colivelin和活性依赖性神经营养因子(ADNF)衍生的肽)的神经保护和/或再生作用。几个研究证实，神经营养因子在SOD1转基因小鼠中可以维持运动神经元功能性，因此改善运动表现。但是，这样的治疗经常不能延长SOD1小鼠的存活，从而表明神经营养因子不足以延长神经元存活(参见Yacila和Sari,CurrMed Chem.,2014,21(31),3583-3593的综述)。
ALS治疗的另一个策略已经聚焦于基于干细胞的疗法。干细胞具有产生运动神经元的潜力，由此替代受ALS影响的CNS(诸如初级运动皮质、脑干和脊髓)中的退化运动神经元。已经研究了从多种来源衍生出的干细胞，包括诱导的多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)(例如骨髓间充质干细胞(BMSC)和脂肪细胞干细胞(ASC))和神经组织起源神经干细胞(例如，胎儿脊神经干细胞(NSC)、多能神经祖细胞(NPC))(例如，Kim C等人,Exp.Neurobiol.,2014,23(3),207-214的综述)。
超氧化物歧化酶I型(SOD1；Cu2+/Zn2+超氧化物歧化酶I型)基因中的突变是fALS的最常见原因，占所有fALS病例的约20-30％。近期的报告表明，SOD1突变也可能与所有sALS病例中的约4％有关(Robberecht和Philip,Nat.Rev.Neurosci.,2013,14,248-264)。SOD1有关的fALS最可能不是由正常SOD1活性的损失造成，而是由有毒功能的获得造成。关于突变体SOD1有关的fALS毒性的假设之一提出，异常的SOD1酶造成诸如过氧亚硝酸盐或过氧化氢的小分子以产生破坏性的自由基。关于突变体SOD1神经毒性的其它假设包括蛋白酶体活性的抑制、线粒体损伤、RNA加工的破坏和细胞内聚集体的形成。突变体SOD1变体和/或野生型SOD1在ALS中的异常积累形成不溶性的纤丝状聚集体，其被鉴别为病理性包涵体。聚集的SOD1蛋白可以诱导线粒体应激(Vehvilainen P等人,Front Cell Neurosci.,2014,8,126)和对细胞、特别是对运动神经元的其它毒性。
这些发现表明，SOD1可以是家族性和散发性ALS的潜在治疗靶标。可以减少在ALS患者的中枢神经系统中产生的SOD1蛋白的疗法可能改善患者中ALS的症状，例如运动神经元变性以及肌无力和肌萎缩。目的在于阻止野生型和/或突变体SOD1蛋白聚集的形成的试剂和方法可阻止疾病进展和允许改善ALS症状。近年来，RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默已经引起研究人员的兴趣。在现有技术中已经教导了靶向SOD1基因的小双链RNA(小干扰RNA)分子在治疗ALS中的潜力(参见，例如，美国专利号7,632,938和美国专利公开号20060229268，其内容通过引用整体并入本文)。
本发明开发了基于RNA干扰的方案来抑制或防止ALS患者中的SOD1的表达，用于治疗所述疾病。
本发明提供了新的双链RNA(dsRNA)构建体和siRNA构建体以及它们的设计方法。另外，这些新的siRNA构建体可以是合成的分子或在用于递送进细胞中的表达载体中编码(一条或两条链)。这样的载体包括但不限于腺相关病毒载体，例如任一种AAV血清型的载体基因组，或其它病毒递送媒介物，例如慢病毒等。
发明内容
本文描述了用于施用AAV颗粒(包含编码至少一种siRNA分子的调节性多核苷酸)来治疗、预防、缓解和/或改善疾病和/或病症(例如肌萎缩性侧索硬化(ALS))的方法、过程、组合物、试剂盒和装置。
本发明涉及RNA分子介导的基因特异性的对基因表达和蛋白生产的干扰。在本发明中还包括用于治疗诸如肌萎缩性侧索硬化的运动神经元变性疾病的方法。在本文表征的组合物中包括的siRNA包括具有反义链(反义链)的dsRNA，所述反义链具有长30个核苷酸或更少、通常19-24个核苷酸的区域，其与SOD1基因的mRNA转录物的至少部分基本上互补。
本发明提供了短双链RNA分子，如小干扰RNA(siRNA)双链体，其靶向SOD1 mRNA以干扰SOD1基因表达和/或SOD1蛋白生产。本发明的siRNA双链体可以干扰SOD1基因的两个等位基因(与SOD1基因中的任何特定突变无关)，且可以特别地与在ALS疾病中发现的那些相互作用。
在某些实施方案中，将这样的siRNA分子或所述siRNA分子的单链插入要引入中枢神经系统的细胞、特别是运动神经元和/或其它周围细胞中的腺相关病毒(AAV)载体中。AAV载体可以包含编码1、2、3、4或多于4条siRNA双链体的序列。
本发明的siRNA双链体包含杂交在一起从而形成双链体结构的反义链和有义链，其中所述反义链与靶向的SOD1基因的核酸序列互补，且其中所述有义链与靶向的SOD1基因的核酸序列同源。在某些方面，反义链的5’端具有5’磷酸基团，且有义链的3’端含有3’羟基。在其它方面，在每条链的3’端没有、有1个或有2个核苷酸突出端。
根据本发明，靶向SOD1基因的siRNA双链体的每条链是约19-25个核苷酸的长度，优选约19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸或25个核苷酸的长度。在某些方面，siRNA可以是未修饰的RNA分子。
在其它方面，siRNA可以含有至少一个修饰的核苷酸，诸如碱基、糖或主链修饰。
在一个实施方案中，siRNA或dsRNA包括至少两条彼此互补的序列。dsRNA包括具有第一序列的有义链和具有第二序列的反义链。反义链包括与编码SOD1的mRNA的至少部分基本上互补的核苷酸序列，且互补性区域是30个核苷酸或更少，和至少15个核苷酸的长度。通常，dsRNA是19-24(例如，19-21)个核苷酸的长度。在某些实施方案中，dsRNA是约15至约25个核苷酸的长度，且在其它实施方案中，dsRNA是约25至约30个核苷酸的长度。
在与表达SOD1的细胞接触后或在表达SOD1的细胞内转录后，dsRNA使SOD1基因的表达抑制或阻遏至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％或更多，诸如当通过如本文中所述的方法测定时。
根据本发明，生产AAV载体，其包含编码靶向SOD1基因的siRNA双链体、siRNA双链体的一条链或dsRNA的核酸，AAV载体血清型可以是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8和/或AAV-DJ及其变体。
本发明也提供了药物组合物，其包含至少一种靶向SOD1基因的siRNA双链体和药学上可接受的载体。在某些方面，将编码siRNA双链体的核酸序列插入AAV载体中。
在某些实施方案中，本发明提供了用于抑制/沉默细胞中的SOD1基因表达的方法。因此，siRNA双链体或dsRNA可以用于基本上抑制细胞中、特别是运动神经元中的SOD1基因表达。在某些方面，SOD1基因表达的抑制表示抑制至少约20％，优选地抑制至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。因此，可以将靶向的基因的蛋白产物抑制至少约20％，优选地抑制至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。SOD1基因可以是野生型基因或具有至少一个突变的经突变的SOD1基因。因此，SOD1蛋白是野生型蛋白或具有至少一个突变的突变多肽。
在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗或改善需要治疗的受试者中与异常的SOD1基因和/或SOD1蛋白有关的肌萎缩性侧索硬化的方法，所述方法包括：向受试者施用药学有效量的至少一种靶向SOD1基因的siRNA双链体，将所述siRNA双链体递送进靶向的细胞，抑制SOD1基因表达和蛋白生产，和改善受试者中的ALS症状。
在某些实施方案中，将AAV载体施用给需要治疗和/或改善ALS的受试者，所述AAV载体包含编码至少一种靶向SOD1基因的siRNA双链体的核酸序列。AAV载体血清型可以选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10和AAV-DJ及其变体。
在某些方面，ALS是与SOD1突变有关的家族性ALS。在其它方面，ALS是以SOD1蛋白的异常聚集或者SOD1蛋白功能或定位的破坏(尽管非必然地作为基因突变的结果)为特征的散发性ALS。通过本发明的方法改善的ALS症状可以包括运动神经元变性、肌无力、肌肉僵硬、言语不清和/或呼吸困难。
在某些实施方案中，可以将靶向SOD1基因的siRNA双链体或dsRNA或包含这样的编码siRNA的分子的AAV载体直接引入受试者的中枢神经系统中，例如，通过颅内注射。
在某些实施方案中，将本发明的药物组合物用作单独疗法。在其它实施方案中，将本发明的药物组合物用在联合疗法中。联合疗法可以与一种或多种神经保护剂(诸如小分子化合物、生长因子和激素，它们已经过测试，对运动神经元变性有神经保护作用)联合。
在某些实施方案中，本发明提供了通过给有此需要的受试者施用治疗有效量的本文描述的质粒或AAV载体来治疗或改善肌萎缩性侧索硬化的方法。所述ALS可以是家族性ALS或散发性ALS。
在以下描述中阐述了本发明的各种实施方案的细节。通过说明书和附图以及权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将变得显而易见。
附图简要说明
根据以下本发明的特定实施方案的描述，前述和其他目的、特征和优点将是显而易见的，如附图中所示。附图不必然按比例绘制，而是将重点放在说明本发明的各种实施方案的原理上。
图1是本发明的病毒基因组的示意图。
图2是本发明的病毒基因组的示意图。
图3是本发明的病毒基因组的示意图。
图4是本发明的病毒基因组的示意图。
图5是本发明的病毒基因组的示意图。
图6是本发明的病毒基因组的示意图。
图7是本发明的病毒基因组的示意图。
图8是本发明的病毒基因组的示意图。
图9是本发明的病毒基因组的示意图。
本发明的一个或多个实施方案的细节在以下所附描述中阐明。尽管与本文描述的那些材料或方法相似或等同的任何材料和方法都可以用于本发明的实践或测试中，但是现在描述优选的材料和方法。通过描述，本发明的其他特征、目的和优点将是显而易见的。在说明书中，单数形式也包括复数，除非上下文另外明确指出。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在有冲突的情况下，以本说明书为准。
发明详述
I.本发明的组成
根据本发明，提供了用于通过腺相关病毒(AAV)递送调节性多核苷酸和/或基于调节性多核苷酸的组合物的组合物。可通过几种途径中的任一种向细胞、组织、器官或生物体体内、离体或体外施用提供本发明的AAV颗粒。
如本文所用，“AAV颗粒”是包含具有至少一个有效载荷区和至少一个反向末端重复序列(ITR)区的病毒基因组的病毒。
如本文所用，“病毒基因组”或“载体基因组”或“病毒载体”是指包覆在AAV颗粒中的核酸序列。病毒基因组包含至少一个编码多肽或其片段的有效载荷区。
如本文所用，“有效载荷”或“有效载荷区”是编码本发明的一种或多种多肽的任何核酸分子。有效载荷区至少包含编码有义和反义序列的核酸序列(一种基于siRNA的组合物)或其片段，但也可任选包含一种或多种功能性或调节性元件，以促进转录表达和/或多肽翻译。
可以对本文公开的核酸序列和多肽进行工程化，以使其包含组装的实现本发明的调节性多核苷酸和/或基于调节性多核苷酸的组合物的表达的模块元件和/或序列基序。在一些实施方案中，包含有效载荷区的核酸序列可包含启动子区、内含子、Kozak序列、增强子或聚腺苷酸化序列中的一种或多种。本发明的有效载荷区通常编码至少一个有义和反义序列(一种基于siRNA的组合物)或前述彼此结合或与其他多肽部分结合的片段。
本发明的有效载荷区可以在AAV颗粒的病毒基因组内递送至一个或多个靶细胞、组织、器官或生物体。
腺相关病毒(AAV)和AAV颗粒
细小病毒科的病毒是小的非包膜二十面体衣壳病毒，其特征是单链DNA基因组。细小病毒科病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)和感染无脊椎动物的浓核病毒亚科(Densovirinae)。由于其结构相对简单，并且由于使用标准分子生物学技术易于操作的事实，因此该病毒科可用作生物学工具。可以修饰病毒的基因组以使其包含用于组装功能性重组病毒或病毒颗粒的最少组分，所述重组病毒或病毒颗粒装载有或工程化以表达或递送所需的有效载荷，该有效载荷可以递送至靶细胞、组织、器官或生物体。
细小病毒和细小病毒科的其他成员通常描述在Kenneth I.Berns的“Parvoviridae:The Viruses and Their Replication”(FIELDS VIROLOGY)(第3版，1996年)第69章中进行了描述，其内容通过引用整体并入。
细小病毒科包括依赖病毒属，其包括能够在脊椎动物宿主中复制的腺相关病毒(AAV)，宿主包括但不限于人类、灵长类、牛、犬、马和羊。
AAV病毒基因组是线性单链DNA(ssDNA)分子，长度约为5,000个核苷酸(nt)。AAV病毒基因组可包含有效载荷区和至少一个反向末端重复序列(ITR)或ITR区。传统上，ITR位于非结构蛋白(由Rep基因编码)和结构蛋白(由衣壳基因或Cap基因编码)的编码核苷酸序列的侧翼。尽管不希望受到理论的束缚，但AAV病毒基因组通常包含两个ITR序列。AAV病毒基因组包含特征性T形发夹结构，其由形成能量稳定双链区的ssDNA的5’和3’端的自互补末端145nt限定。双链发夹结构包含多种功能，包括但不限于通过充当宿主病毒复制细胞的内源性DNA聚合酶复合物的引物来用作DNA复制的起点。
除编码的异源有效载荷外，AAV载体还可全部或部分包含任何天然存在的和/或重组的AAV血清型核苷酸序列或变体的病毒基因组。AAV变体可在核酸(基因组或衣壳)和氨基酸水平(衣壳)上具有显著同源性的序列，以产生通常为物理和功能等同物的构建体，通过相似的机制复制，并通过相似的机制组装。Chiorini等人,J.Vir.71:6823-33(1997)；Srivastava等人,J.Vir.45:555-64(1983)；Chiorini等人,J.Vir.73:1309-1319(1999)；Rutledge等人,J.Vir.72:309-319(1998)；和Wu等人,J.Vir.74:8635-47(2000)，其各自内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，本发明的AAV颗粒是复制缺陷的重组AAV载体，在其病毒基因组中缺乏编码功能性Rep和Cap蛋白的序列。这些缺陷AAV载体可能缺乏大多数或全部亲本编码序列，并且基本上仅携带一个或两个AAV ITR序列和用于递送至细胞、组织、器官或生物体的目标核酸。
在一个实施方案中，本发明的AAV颗粒的病毒基因组包含至少一种控制元件，该控制元件提供了其中编码的编码序列的复制、转录和翻译。并非总是需要存在所有的控制元件，只要编码序列能够在适当的宿主细胞中复制、转录和/或翻译。表达控制元件的非限制性实例包括用于转录起始和/或终止的序列、启动子和/或增强子序列、有效的RNA加工信号(例如剪接和聚腺苷酸化信号)、稳定细胞质mRNA的序列、增强翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)、增强蛋白稳定性的序列和/或增强蛋白加工和/或分泌的序列。
根据本发明，用于治疗和/或诊断的AAV颗粒包含已被提取(distill)或减少至转导目标核酸有效载荷或货物所需的最小组分的病毒。以这种方式，AAV颗粒被工程化为用于特异性递送的载体，同时缺少在野生型病毒中发现的有害复制和/或整合特征。
本发明的AAV载体可以重组产生，并且可以基于腺相关病毒(AAV)的亲本或参考序列。如本文所用，“载体”是转运、转导或以其他方式充当异源分子(例如本文所述的核酸)的载体的任何分子或实体。
除了单链AAV病毒基因组(例如ssAAV)之外，本发明还提供了自互补AAV(scAAV)病毒基因组。scAAV病毒基因组包含DNA链，它们退火在一起形成双链DNA。通过跳过第二链合成，scAAV可在细胞中快速表达。
在一个实施方案中，本发明的AAV颗粒是scAAV。
在一个实施方案中，本发明的AAV颗粒是ssAAV。
本领域公开了产生和/或修饰AAV颗粒的方法，例如假型AAV载体(PCT专利公开号WO200028004；WO200123001；WO2004112727；WO 2005005610和WO 2005072364，其各自内容通过引用整体并入本文)。
可以修饰AAV颗粒以增强递送效率。这样的修饰AAV颗粒可以被有效地包装，并被用于以高频率和最小毒性成功地感染靶细胞。在一些实施方案中，根据美国公开号US20130195801中描述的方法工程化AAV颗粒的衣壳，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，可以将包含编码本发明的多肽的有效载荷区的AAV颗粒引入哺乳动物细胞中。
AAV血清型
本发明的AAV颗粒可以包含或衍生自任何天然或重组AAV血清型。根据本发明，AAV颗粒可以利用或基于选自以下任一种的血清型：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8RA586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV改组100-1、AAV改组100-3、AAV改组100-7、AAV改组10-2、AAV改组10-6、AAV改组10-8、AAV改组100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAVCBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAV CHt-6.1、AAVCHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAVCKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAVCKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAVCKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAVCLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAVCLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAVCLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAVCLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAV CLv-R1、AAVCLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAV CLv-R8、AAVCLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAV CSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAVCSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、AAV-PHP.B(PHP.B)、AAV-PHP.A(PHP.A)、G2B-26、G2B-13、TH1.1-32、TH1.1-35、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5及其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有美国公开号US20030138772中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV1(US20030138772的SEQ ID NO:6和64)、AAV2(US20030138772的SEQ ID NO:7和70)、AAV3(US20030138772的SEQ ID NO:8和71)、AAV4(US20030138772的SEQ ID NO:63)、AAV5(US20030138772的SEQ ID NO:114)、AAV6(US20030138772的SEQ ID NO:65)、AAV7(US20030138772的SEQ ID NO:1-3)、AAV8(US20030138772的SEQ ID NO:4和95)、AAV9(US20030138772的SEQ ID NO:5和100)、AAV10(US20030138772的SEQ ID NO:117)、AAV11(US20030138772的SEQ ID NO:118)、AAV12(US20030138772的SEQ ID NO:119)、AAVrh10(US20030138772的SEQ ID NO:81的氨基酸1至738)、AAV16.3(US20030138772SEQ ID NO:10)、AAV29.3/bb.1(US20030138772SEQ ID NO:11)、AAV29.4(US20030138772SEQ ID NO:12)、AAV29.5/bb.2(US20030138772SEQ ID NO:13)、AAV1.3(US20030138772SEQ ID NO:14)、AAV13.3(US20030138772SEQ ID NO:15)、AAV24.1(US20030138772SEQ ID NO:16)、AAV27.3(US20030138772SEQ ID NO:17)、AAV7.2(US20030138772SEQ ID NO:18)、AAVC1(US20030138772SEQ ID NO:19)、AAVC3(US20030138772SEQ ID NO:20)、AAVC5(US20030138772SEQ ID NO:21)、AAVF1(US20030138772SEQ ID NO:22)、AAVF3(US20030138772SEQ ID NO:23)、AAVF5(US20030138772SEQ ID NO:24)、AAVH6(US20030138772SEQ ID NO:25)、AAVH2(US20030138772SEQ ID NO:26)、AAV42-8(US20030138772SEQ ID NO:27)、AAV42-15(US20030138772SEQ ID NO:28)、AAV42-5b(US20030138772SEQ ID NO:29)、AAV42-1b(US20030138772SEQ ID NO:30)、AAV42-13(US20030138772SEQ ID NO:31)、AAV42-3a(US20030138772SEQ ID NO:32)、AAV42-4(US20030138772SEQ ID NO:33)、AAV42-5a(US20030138772SEQ ID NO:34)、AAV42-10(US20030138772SEQ ID NO:35)、AAV42-3b(US20030138772SEQ ID NO:36)、AAV42-11(US20030138772SEQ ID NO:37)、AAV42-6b(US20030138772SEQ ID NO:38)、AAV43-1(US20030138772SEQ ID NO:39)、AAV43-5(US20030138772SEQ ID NO:40)、AAV43-12(US20030138772SEQ ID NO:41)、AAV43-20(US20030138772SEQ ID NO:42)、AAV43-21(US20030138772SEQ ID NO:43)、AAV43-23(US20030138772SEQ ID NO:44)、AAV43-25(US20030138772SEQ ID NO:45)、AAV44.1(US20030138772SEQ ID NO:46)、AAV44.5(US20030138772SEQ ID NO:47)、AAV223.1(US20030138772SEQ ID NO:48)、AAV223.2(US20030138772SEQ ID NO:49)、AAV223.4(US20030138772SEQ ID NO:50)、AAV223.5(US20030138772SEQ ID NO:51)、AAV223.6(US20030138772SEQ ID NO:52)、AAV223.7(US20030138772SEQ ID NO:53)、AAVA3.4(US20030138772SEQ ID NO:54)、AAVA3.5(US20030138772SEQ ID NO:55)、AAVA3.7(US20030138772SEQ ID NO:56)、AAVA3.3(US20030138772SEQ ID NO:57)、AAV42.12(US20030138772SEQ ID NO:58)、AAV44.2(US20030138772SEQ ID NO:59)、AAV42-2(US20030138772SEQ ID NO:9)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有美国公开号US20150159173中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV2(US20150159173的SEQ ID NO:7和23)、rh20(US20150159173的SEQ ID NO:1)、rh32/33(US20150159173的SEQ ID NO:2)、rh39(US20150159173的SEQ ID NO:3、20和36)、rh46(US20150159173的SEQ ID NO:4和22)、rh73(US20150159173的SEQ ID NO:5)、rh74(US20150159173的SEQ ID NO:6)、AAV6.1(US20150159173的SEQ ID NO:29)、rh.8(US20150159173的SEQ ID NO:41)、rh.48.1(US20150159173的SEQ ID NO:44)、hu.44(US20150159173的SEQ ID NO:45)、hu.29(US20150159173的SEQ ID NO:42)、hu.48(US20150159173的SEQ ID NO:38)、rh54(US20150159173的SEQ ID NO:49)、AAV2(US20150159173的SEQ ID NO:7)、cy.5(US20150159173的SEQ ID NO:8和24)、rh.10(US20150159173的SEQ ID NO:9和25)、rh.13(US20150159173的SEQ ID NO:10和26)、AAV1(US20150159173的SEQ ID NO:11和27)、AAV3(US20150159173的SEQ ID NO:12和28)、AAV6(US20150159173的SEQ ID NO:13和29)、AAV7(US20150159173的SEQ ID NO:14和30)、AAV8(US20150159173的SEQ ID NO:15和31)、hu.13(US20150159173的SEQ ID NO:16和32)、hu.26(US20150159173的SEQ ID NO:17和33)、hu.37(US20150159173的SEQ ID NO:18和34)、hu.53(US20150159173的SEQ ID NO:19和35)、rh.43(US20150159173的SEQ ID NO:21和37)、rh2(US20150159173的SEQ ID NO:39)、rh.37(US20150159173的SEQ ID NO:40)、rh.64(US20150159173的SEQ ID NO:43)、rh.48(US20150159173的SEQ ID NO:44)、ch.5(US20150159173的SEQ ID NO 46)、rh.67(US20150159173的SEQ ID NO:47)、rh.58(US20150159173的SEQ ID NO:48)或其变体，包括但不限于Cy5R1、Cy5R2、Cy5R3、Cy5R4、rh.13R、rh.37R2、rh.2R、rh.8R、rh.48.1、rh.48.2、rh.48.1.2、hu.44R1、hu.44R2、hu.44R3、hu.29R、ch.5R1、rh64R1、rh64R2、AAV6.2、AAV6.1、AAV6.12、hu.48R1、hu.48R2和hu.48R3。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有美国专利号US 7198951中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV9(SEQ(US 7198951的SEQ ID NO:1-3)、AAV2(US 7198951的SEQ ID NO:4)、AAV1(US 7198951的SEQ ID NO:5)、AAV3(US7198951的SEQ ID NO:6)和AAV8(US7198951的SEQ ID NO:7)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如N Pulicherla等人(MolecularTherapy 19(6):1070-1078(2011)，通过引用整体并入本文)所述的AAV9序列中的突变，例如但不限于AAV9.9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有美国专利号US 6156303中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV3B(US 6156303的SEQ ID NO:1和10)、AAV6(US 6156303的SEQ ID NO:2、7和11)、AAV2(US 6156303的SEQ ID NO:3和8)、AAV3A(US6156303的SEQ ID NO:4和9)，或其衍生物。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有美国公开号US20140359799中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV8(US20140359799的SEQ ID NO:1)、AAVDJ(US20140359799的SEQ ID NO:2和3)或其变体。
在一些实施方案中，血清型可以是AAVDJ(或AAV-DJ)或其变体，例如AAVDJ8(或AAV-DJ8)，如Grimm等人((Journal of Virology 82(12):5887-5911(2008)，通过引用整体并入本文)所述。AAVDJ8的氨基酸序列可以包含两个或更多个突变，以去除肝素结合域(HBD)。作为非限制性实例，在美国专利号7,588,772中(其内容通过引用整体并入本文)被描述为SEQ ID NO:1的AAV-DJ序列可以包含两个突变：(1)R587Q，其中氨基酸587处的精氨酸(R；Arg)变为谷氨酰胺(Q；Gln)和(2)R590T，其中氨基酸590处的精氨酸(R；Arg)变为苏氨酸(T；Thr)。作为另一个非限制性实例，可包含3个突变：(1)K406R，其中氨基酸406处的赖氨酸(K；Lys)变为精氨酸(R；Arg)，(2)R587Q其中氨基酸587处的精氨酸(R；Arg)变为谷氨酰胺(Q；Gln)和(3)R590T，其中氨基酸590处的精氨酸(R；Arg)变为苏氨酸(T；Thr)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如国际公开号WO 1998011244中所述的AAV4序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV4(WO1998011244的SEQ IDNO:1-20)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有AAV2序列中的突变以产生AAV2G9，如国际公开号WO2014144229中所述，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有国际公开号WO2005033321中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV3-3(WO2005033321的SEQ ID NO:217)、AAV1(WO2005033321的SEQ ID NO:219和202)、AAV106.1/hu.37(WO2005033321的SEQID No:10)、AAV114.3/hu.40(WO2005033321的SEQ ID No:11)、AAV127.2/hu.41(WO2005033321的SEQ ID NO:6和8)、AAV128.3/hu.44(WO2005033321的SEQ ID No:81)、AAV130.4/hu.48(WO2005033321的SEQ ID NO:78)、AAV145.1/hu.53(WO2005033321的SEQID No:176和177)、AAV145.6/hu.56(WO2005033321的SEQ ID NO:168和192)、AAV16.12/hu.11(WO2005033321的SEQ ID NO:153和57)、AAV16.8/hu.10(WO2005033321的SEQ ID NO:156和56)、AAV161.10/hu.60(WO2005033321的SEQ ID No:170)、AAV161.6/hu.61(WO2005033321的SEQ ID No:174)、AAV1-7/rh.48(WO2005033321的SEQ ID NO:32)、AAV1-8/rh.49(WO2005033321的SEQ ID NO:103和25)、AAV2(WO2005033321的SEQ ID NO:211和221)、AAV2-15/rh.62(WO2005033321的SEQ ID No:33和114)、AAV2-3/rh.61(WO2005033321的SEQ ID NO:21)、AAV2-4/rh.50(WO2005033321的SEQ ID No:23和108)、AAV2-5/rh.51(WO2005033321的SEQ ID NO:104和22)、AAV3.1/hu.6(WO2005033321的SEQ ID NO:5和84)、AAV3.1/hu.9WO2005033321的(SEQ ID NO:155和58)、AAV3-11/rh.53(WO2005033321的SEQID NO:186和176)、AAV3-3(WO2005033321的SEQ ID NO:200)、AAV33.12/hu.17(WO2005033321的SEQ ID NO:4)、AAV33.4/hu.15(WO2005033321的SEQ ID No:50)、AAV33.8/hu.16(WO2005033321的SEQ ID No:51)、AAV3-9/rh.52(WO2005033321的SEQ IDNO:96和18)、AAV4-19/rh.55(WO2005033321的SEQ ID NO:117)、AAV4-4(WO2005033321的SEQ ID NO:201和218)、AAV4-9/rh.54(WO2005033321的SEQ ID NO:116)、AAV5(WO2005033321的SEQ ID NO:199和216)、AAV52.1/hu.20(WO2005033321的SEQ ID NO:63)、AAV52/hu.19(WO2005033321的SEQ ID NO:133)、AAV5-22/rh.58(WO2005033321的SEQ IDNo:27)、AAV5-3/rh.57(WO2005033321的SEQ ID NO:105)、AAV5-3/rh.57(WO2005033321的SEQ ID No:26)、AAV58.2/hu.25(WO2005033321的SEQ ID No:49)、AAV6(WO2005033321的SEQ ID NO:203和220)、AAV7(WO2005033321的SEQ ID NO:222和213)、AAV7.3/hu.7(WO2005033321的SEQ ID No:55)、AAV8(WO2005033321的SEQ ID NO:223和214)、AAVH-1/hu.1(WO2005033321的SEQ ID No:46)、AAVH-5/hu.3(WO2005033321的SEQ ID No:44)、AAVhu.1(WO2005033321的SEQ ID NO:144)、AAVhu.10(WO2005033321的SEQ ID NO:156)、AAVhu.11(WO2005033321的SEQ ID NO:153)、AAVhu.12(WO2005033321SEQ ID NO:59)、AAVhu.13(WO2005033321的SEQ ID NO:129)、AAVhu.14/AAV9(WO2005033321的SEQ ID NO:123和3)、AAVhu.15(WO2005033321的SEQ ID NO:147)、AAVhu.16(WO2005033321的SEQ IDNO:148)、AAVhu.17(WO2005033321的SEQ ID NO:83)、AAVhu.18(WO2005033321的SEQ IDNO:149)、AAVhu.19(WO2005033321的SEQ ID NO:133)、AAVhu.2(WO2005033321的SEQ IDNO:143)、AAVhu.20(WO2005033321的SEQ ID NO:134)、AAVhu.21(WO2005033321的SEQ IDNO:135)、AAVhu.22(WO2005033321的SEQ ID NO:138)、AAVhu.23.2(WO2005033321的SEQ IDNO:137)、AAVhu.24(WO2005033321的SEQ ID NO:136)、AAVhu.25(WO2005033321的SEQ IDNO:146)、AAVhu.27(WO2005033321的SEQ ID NO:140)、AAVhu.29(WO2005033321的SEQ IDNO:132)、AAVhu.3(WO2005033321的SEQ ID NO:145)、AAVhu.31(WO2005033321的SEQ IDNO:121)、AAVhu.32(WO2005033321的SEQ ID NO:122)、AAVhu.34(WO2005033321的SEQ IDNO:125)、AAVhu.35(WO2005033321的SEQ ID NO:164)、AAVhu.37(WO2005033321的SEQ IDNO:88)、AAVhu.39(WO2005033321的SEQ ID NO:102)、AAVhu.4(WO2005033321的SEQ ID NO:141)、AAVhu.40(WO2005033321的SEQ ID NO:87)、AAVhu.41(WO2005033321的SEQ ID NO:91)、AAVhu.42(WO2005033321的SEQ ID NO:85)、AAVhu.43(WO2005033321的SEQ ID NO:160)、AAVhu.44(WO2005033321的SEQ ID NO:144)、AAVhu.45(WO2005033321的SEQ ID NO:127)、AAVhu.46(WO2005033321的SEQ ID NO:159)、AAVhu.47(WO2005033321的SEQ ID NO:128)、AAVhu.48(WO2005033321的SEQ ID NO:157)、AAVhu.49(WO2005033321的SEQ ID NO:189)、AAVhu.51(WO2005033321的SEQ ID NO:190)、AAVhu.52(WO2005033321的SEQ ID NO:191)、AAVhu.53(WO2005033321的SEQ ID NO:186)、AAVhu.54(WO2005033321的SEQ ID NO:188)、AAVhu.55(WO2005033321的SEQ ID NO:187)、AAVhu.56(WO2005033321的SEQ ID NO:192)、AAVhu.57(WO2005033321的SEQ ID NO:193)、AAVhu.58(WO2005033321的SEQ ID NO:194)、AAVhu.6(WO2005033321的SEQ ID NO:84)、AAVhu.60(WO2005033321的SEQ ID NO:184)、AAVhu.61(WO2005033321的SEQ ID NO:185)、AAVhu.63(WO2005033321的SEQ ID NO:195)、AAVhu.64(WO2005033321的SEQ ID NO:196)、AAVhu.66(WO2005033321的SEQ ID NO:197)、AAVhu.67(WO2005033321的SEQ ID NO:198)、AAVhu.7(WO2005033321的SEQ ID NO:150)、AAVhu.8(WO2005033321SEQ ID NO:12)、AAVhu.9(WO2005033321的SEQ ID NO:155)、AAVLG-10/rh.40(WO2005033321的SEQ ID No:14)、AAVLG-4/rh.38(WO2005033321的SEQ IDNO:86)、AAVLG-4/rh.38(WO2005033321的SEQ ID No:7)、AAVN721-8/rh.43(WO2005033321的SEQ ID NO:163)、AAVN721-8/rh.43(WO2005033321的SEQ ID No:43)、AAVpi.1(WO2005033321SEQ ID NO:28)、AAVpi.2(WO2005033321SEQ ID NO:30)、AAVpi.3(WO2005033321SEQ ID NO:29)、AAVrh.38(WO2005033321的SEQ ID NO:86)、AAVrh.40(WO2005033321的SEQ ID NO:92)、AAVrh.43(WO2005033321的SEQ ID NO:163)、AAVrh.44(WO2005033321SEQ ID NO:34)、AAVrh.45(WO2005033321SEQ ID NO:41)、AAVrh.47(WO2005033321SEQ ID NO:38)、AAVrh.48(WO2005033321的SEQ ID NO:115)、AAVrh.49(WO2005033321的SEQ ID NO:103)、AAVrh.50(WO2005033321的SEQ ID NO:108)、AAVrh.51(WO2005033321的SEQ ID NO:104)、AAVrh.52(WO2005033321的SEQ ID NO:96)、AAVrh.53(WO2005033321的SEQ ID NO:97)、AAVrh.55(WO2005033321SEQ ID NO:37)、AAVrh.56(WO2005033321的SEQ ID NO:152)、AAVrh.57(WO2005033321的SEQ ID NO:105)、AAVrh.58(WO2005033321的SEQ ID NO:106)、AAVrh.59(WO2005033321SEQ ID NO:42)、AAVrh.60(WO2005033321SEQ ID NO:31)、AAVrh.61(WO2005033321的SEQ ID NO:107)、AAVrh.62(WO2005033321的SEQ ID NO:114)、AAVrh.64(WO2005033321的SEQ ID NO:99)、AAVrh.65(WO2005033321SEQ ID NO:35)、AAVrh.68(WO2005033321SEQ ID NO:16)、AAVrh.69(WO2005033321SEQ ID NO:39)、AAVrh.70(WO2005033321SEQ ID NO:20)、AAVrh.72(WO2005033321SEQ ID NO:9)，或其变体，其包括但不限于AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVcy.6、AAVrh.12、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.25/42 15、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh14。变体的非限制性实例包括WO2005033321的SEQ ID NO:13、15、17、19、24、36、40、45、47、48、51-54、60-62、64-77、79、80、82、89、90、93-95、98、100、101、109-113、118-120、124、126、131、139、142、151、154、158、161、162、165-183、202、204-212、215、219、224-236，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有国际公开号WO2015168666中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAVrh8R(WO2015168666的SEQ ID NO:9)、AAVrh8R A586R突变体(WO2015168666的SEQ ID NO:10)、AAVrh8R R533A突变体(WO2015168666的SEQ ID NO:11)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有美国专利号US9233131中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAVhE1.1(US9233131的SEQ ID NO:44)、AAVhEr1.5(US9233131的SEQ ID NO:45)、AAVhER1.14(US9233131的SEQ ID NO:46)、AAVhEr1.8(US9233131的SEQ ID NO:47)、AAVhEr1.16(US9233131的SEQ ID NO:48)、AAVhEr1.18(US9233131的SEQ ID NO:49)、AAVhEr1.35(US9233131的SEQ ID NO:50)、AAVhEr1.7(US9233131的SEQ ID NO:51)、AAVhEr1.36(US9233131的SEQ ID NO:52)、AAVhEr2.29(US9233131的SEQ ID NO:53)、AAVhEr2.4(US9233131的SEQ ID NO:54)、AAVhEr2.16(US9233131的SEQ ID NO:55)、AAVhEr2.30(US9233131的SEQ ID NO:56)、AAVhEr2.31(US9233131的SEQ ID NO:58)、AAVhEr2.36(US9233131的SEQ ID NO:57)、AAVhER1.23(US9233131的SEQ ID NO:53)、AAVhEr3.1(US9233131的SEQ ID NO:59)、AAV2.5T(US9233131的SEQ ID NO:42)、或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有美国专利公开号US20150376607中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV-PAEC(US20150376607的SEQID NO:1)、AAV-LK01(US20150376607的SEQ ID NO:2)、AAV-LK02(US20150376607的SEQ IDNO:3)、AAV-LK03(US20150376607的SEQ ID NO:4)、AAV-LK04(US20150376607的SEQ ID NO:5)、AAV-LK05(US20150376607的SEQ ID NO:6)、AAV-LK06(US20150376607的SEQ ID NO:7)、AAV-LK07(US20150376607的SEQ ID NO:8)、AAV-LK08(US20150376607的SEQ ID NO:9)、AAV-LK09(US20150376607的SEQ ID NO:10)、AAV-LK10(US20150376607的SEQ ID NO:11)、AAV-LK11(US20150376607的SEQ ID NO:12)、AAV-LK12(US20150376607的SEQ ID NO:13)、AAV-LK13(US20150376607的SEQ ID NO:14)、AAV-LK14(US20150376607的SEQ ID NO:15)、AAV-LK15(US20150376607的SEQ ID NO:16)、AAV-LK16(US20150376607的SEQ ID NO:17)、AAV-LK17(US20150376607的SEQ ID NO:18)、AAV-LK18(US20150376607的SEQ ID NO:19)、AAV-LK19(US20150376607的SEQ ID NO:20)、AAV-PAEC2(US20150376607的SEQ ID NO:21)、AAV-PAEC4(US20150376607的SEQ ID NO:22)、AAV-PAEC6(US20150376607的SEQ ID NO:23)、AAV-PAEC7(US20150376607的SEQ ID NO:24)、AAV-PAEC8(US20150376607的SEQ IDNO:25)、AAV-PAEC11(US20150376607的SEQ ID NO:26)、AAV-PAEC12(US20150376607的SEQID NO:27)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有美国专利号US9163261中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV-2-pre-miRNA-101(SEQ ID NO:1US9163261)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有美国专利公开号US20150376240中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV-8h(US20150376240的SEQ IDNO:6)、AAV-8b(US20150376240的SEQ ID NO:5)、AAV-h(US20150376240的SEQ ID NO:2)、AAV-b(US20150376240的SEQ ID NO:1)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有美国专利公开号US20160017295中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV SM 10-2(US20160017295的SEQ ID NO:22)、AAV改组100-1(US20160017295的SEQ ID NO:23)、AAV改组100-3(US20160017295的SEQ ID NO:24)、AAV改组100-7(US20160017295的SEQ ID NO:25)、AAV改组10-2(US20160017295的SEQ ID NO:34)、AAV改组10-6(US20160017295的SEQ ID NO:35)、AAV改组10-8(US20160017295的SEQ ID NO:36)、AAV改组100-2(US20160017295的SEQ IDNO:37)、AAV SM 10-1(US20160017295的SEQ ID NO:38)、AAV SM 10-8(US20160017295的SEQ ID NO:39)、AAV SM 100-3(US20160017295的SEQ ID NO:40)、AAV SM 100-10(US20160017295的SEQ ID NO:41)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有美国专利公开号US20150238550中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于BNP61 AAV(US20150238550的SEQID NO:1)、BNP62AAV(US20150238550的SEQ ID NO:3)、BNP63 AAV(US20150238550的SEQ IDNO:4)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或可以具有美国专利公开号US20150315612中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAVrh.50(US20150315612的SEQ ID NO:108)、AAVrh.43(US20150315612的SEQ ID NO:163)、AAVrh.62(US20150315612的SEQ ID NO:114)、AAVrh.48(US20150315612的SEQ ID NO:115)、AAVhu.19(US20150315612的SEQ ID NO:133)、AAVhu.11(US20150315612的SEQ ID NO:153)、AAVhu.53(US20150315612的SEQ ID NO:186)、AAV4-8/rh.64(US20150315612的SEQ ID No:15)、AAVLG-9/hu.39(US20150315612的SEQ ID No:24)、AAV54.5/hu.23(US20150315612的SEQ ID No:60)、AAV54.2/hu.22(US20150315612的SEQ ID No:67)、AAV54.7/hu.24(US20150315612的SEQ ID No:66)、AAV54.1/hu.21(US20150315612的SEQ ID No:65)、AAV54.4R/hu.27(US20150315612的SEQ ID No:64)、AAV46.2/hu.28(US20150315612的SEQID No:68)、AAV46.6/hu.29(US20150315612的SEQ ID No:69)、AAV128.1/hu.43(US20150315612的SEQ ID No:80)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有国际公开号WO2015121501中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于真型AAV(ttAAV)(WO2015121501的SEQID NO:2)、“UPenn AAV10”(WO2015121501的SEQ ID NO:8)，“日本AAV10”(WO2015121501的SEQ ID NO:9)或其变体。
根据本发明，AAV衣壳血清型的选择或使用可以来自多种物种。在一个实施方案中，AAV可以是禽类AAV(AAAV)。AAAV血清型可以是或具有美国专利号US 9238800中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAAV(US 9,238,800的SEQ ID NO:1、2、4、6、8、10、12和14)或其变体。
在一个实施方案中，AAV可以是牛AAV(BAAV)。BAAV血清型可以是或具有美国专利号US 9,193,769中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于BAAV(US9193769的SEQ ID NO:1和6)或其变体。BAAV血清型可以是或具有美国专利号US7427396中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于BAAV(US7427396的SEQ ID NO:5和6)或其变体。
在一个实施方案中，AAV可以是山羊AAV。山羊AAV血清型可以是或具有美国专利号US7427396中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于山羊AAV(US7427396的SEQ ID NO:3)或其变体。
在其他实施方案中，可以将AAV工程化为来自两种或更多种亲本血清型的杂种AAV。在一个实施方案中，AAV可以是AAV2G9，其包含来自AAV2和AAV9的序列。AAV2G9 AAV血清型可以是或具有美国专利公开号US20160017005中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，AAV可以是如Pulicherla等人(Molecular Therapy 19(6)：1070-1078(2011))所述的由AAV9衣壳文库产生的具有390-627位氨基酸中突变(VP1编号)的血清型，其内容通过引用整体并入本文。血清型以及相应的核苷酸和氨基酸取代可以是但不限于AAV9.1(G1594C；D532H)、AAV6.2(T1418A和T1436X；V473D和I479K)、AAV9.3(T1238A；F413Y)、AAV9.4(T1250C和A1617T；F417S)、AAV9.5(A1235G、A1314T、A1642G、C1760T；Q412R、T548A、A587V)、AAV9.6(T1231A；F411I)、AAV9.9(G1203A、G1785T；W595C)、AAV9.10(A1500G、T1676C；M559T)、AAV9.11(A1425T、A1702C、A1769T；T568P、Q590L)、AAV9.13(A1369C、A1720T；N457H、T574S)、AAV9.14(T1340A、T1362C、T1560C、G1713A；L447H)、AAV9.16(A1775T；Q592L)、AAV9.24(T1507C、T1521G；W503R)、AAV9.26(A1337G、A1769C；Y446C、Q590P)、AAV9.33(A1667C；D556A)、AAV9.34(A1534G、C1794T；N512D)、AAV9.35(A1289T、T1450A、C1494T、A1515T、C1794A、G1816A；Q430L、Y484N、N98K、V606I)、AAV9.40(A1694T、E565V)、AAV9.41(A1348T、T1362C；T450S)、AAV9.44(A1684C、A1701T、A1737G；N562H、K567N)、AAV9.45(A1492T、C1804T；N498Y、L602F)、AAV9.46(G1441C、T1525C、T1549G；G481R、W509R、L517V)、9.47(G1241A、G1358A、A1669G、C1745T；S414N、G453D、K557E、T582I)、AAV9.48(C1445T、A1736T；P482L、Q579L)、AAV9.50(A1638T、C1683T、T1805A；Q546H、L602H)、AAV9.53(G1301A、A1405C、C1664T、G1811T；R134Q、S469R、A555V、G604V)、AAV9.54(C1531A、T1609A；L511I、L537M)、AAV9.55(T1605A；F535L)、AAV9.58(C1475T、C1579A；T492I、H527N)、AAV.59(T1336C；Y446H)、AAV9.61(A1493T；N498I)、AAV9.64(C1531A、A1617T；L511I)、AAV9.65(C1335T、T1530C、C1568A；A523D)、AAV9.68(C1510A；P504T)、AAV9.80(G1441A；G481R)、AAV9.83(C1402A、A1500T；P468T、E500D)、AAV9.87(T1464C、T1468C；S490P)、AAV9.90(A1196T；Y399F)、AAV9.91(T1316G、A1583T、C1782G、T1806C；L439R、K528I)、AAV9.93(A1273G、A1421G、A1638C、C1712T、G1732A、A1744T、A1832T；S425G、Q474R、Q546H、P571L、G578R、T582S、D611V)、AAV9.94(A1675T；M559L)和AAV9.95(T1605A；F535L)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有国际公开号WO2016049230中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAVF1/HSC1(WO2016049230的SEQ IDNO:2和20)、AAVF2/HSC2(WO2016049230的SEQ ID NO:3和21)、AAVF3/HSC3(WO2016049230的SEQ ID NO:5和22)、AAVF4/HSC4(WO2016049230的SEQ ID NO:6和23)、AAVF5/HSC5(WO2016049230的SEQ ID NO:11和25)、AAVF6/HSC6(WO2016049230的SEQ ID NO:7和24)、AAVF7/HSC7(WO2016049230的SEQ ID NO:8和27)、AAVF8/HSC8(WO2016049230的SEQ ID NO:9和28)、AAVF9/HSC9(WO2016049230的SEQ ID NO:10和29)、AAVF11/HSC11(WO2016049230的SEQ ID NO:4和26)、AAVF12/HSC12(WO2016049230的SEQ ID NO:12和30)、AAVF13/HSC13(WO2016049230的SEQ ID NO:14和31)、AAVF14/HSC14(WO2016049230的SEQ ID NO:15和32)、AAVF15/HSC15(WO2016049230的SEQ ID NO:16和33)、AAVF16/HSC16(WO2016049230的SEQ ID NO:17和34)、AAVF17/HSC17(WO2016049230的SEQ ID NO:13和35)或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有美国专利号US 8734809中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于，AAV CBr-E1(US8734809的SEQ ID NO:13和87)、AAV CBr-E2(US8734809的SEQ ID NO:14和88)、AAV CBr-E3(US8734809的SEQ IDNO:15和89)、AAV CBr-E4(US8734809的SEQ ID NO:16和90)、AAV CBr-E5(US8734809的SEQID NO:17和91)、AAV CBr-e5(US8734809的SEQ ID NO:18和92)、AAV CBr-E6(US8734809的SEQ ID NO:19和93)、AAV CBr-E7(US8734809的SEQ ID NO:20和94)、AAV CBr-E8(US8734809的SEQ ID NO:21和95)、AAV CLv-D1(US8734809的SEQ ID NO:22和96)、AAVCLv-D2(US8734809的SEQ ID NO:23和97)、AAV CLv-D3(US8734809的SEQ ID NO:24和98)、AAV CLv-D4(US8734809的SEQ ID NO:25和99)、AAV CLv-D5(US8734809的SEQ ID NO:26和100)、AAV CLv-D6(US8734809的SEQ ID NO:27和101)、AAV CLv-D7(US8734809的SEQ IDNO:28和102)、AAV CLv-D8(US8734809的SEQ ID NO:29和103)、AAV CLv-E1(US8734809的SEQ ID NO:13和87)、AAV CLv-R1(US8734809的SEQ ID NO:30和104)、AAV CLv-R2(US8734809的SEQ ID NO:31和105)、AAV CLv-R3(US8734809的SEQ ID NO:32和106)、AAVCLv-R4(US8734809的SEQ ID NO:33和107)、AAV CLv-R5(US8734809的SEQ ID NO:34和108)、AAV CLv-R6(US8734809的SEQ ID NO:35和109)、AAV CLv-R7(US8734809的SEQ IDNO:36和110)、AAV CLv-R8(US8734809的SEQ ID NO:37和111)、AAV CLv-R9(US8734809的SEQ ID NO:38和112)、AAV CLg-F1(US8734809的SEQ ID NO:39和113)、AAV CLg-F2(US8734809的SEQ ID NO:40和114)、AAV CLg-F3(US8734809的SEQ ID NO:41和115)、AAVCLg-F4(US8734809的SEQ ID NO:42和116)、AAV CLg-F5(US8734809的SEQ ID NO:43和117)、AAV CLg-F6(US8734809的SEQ ID NO:43和117)、AAV CLg-F7(US8734809的SEQ IDNO:44和118)、AAV CLg-F8(US8734809的SEQ ID NO:43和117)、AAV CSp-1(US8734809的SEQID NO:45和119)、AAV CSp-10(US8734809的SEQ ID NO:46和120)、AAV CSp-11(US8734809的SEQ ID NO:47和121)、AAV CSp-2(US8734809的SEQ ID NO:48和122)、AAV CSp-3(US8734809的SEQ ID NO:49和123)、AAV CSp-4(US8734809的SEQ ID NO:50和124)、AAVCSp-6(US8734809的SEQ ID NO:51和125)、AAV CSp-7(US8734809的SEQ ID NO:52和126)、AAV CSp-8(US8734809的SEQ ID NO:53和127)、AAV CSp-9(US8734809的SEQ ID NO:54和128)、AAV CHt-2(US8734809的SEQ ID NO:55和129)、AAV CHt-3 US8734809的(SEQ ID NO:56和130)、AAV CKd-1(US8734809的SEQ ID NO:57和131)、AAV CKd-10(US8734809的SEQ IDNO:58和132)、AAV CKd-2(US8734809的SEQ ID NO:59和133)、AAV CKd-3(US8734809的SEQID NO:60和134)、AAV CKd-4(US8734809的SEQ ID NO:61和135)、AAV CKd-6(US8734809的SEQ ID NO:62和136)、AAV CKd-7(US8734809的SEQ ID NO:63和137)、AAV CKd-8(US8734809的SEQ ID NO:64和138)、AAV CLv-1(US8734809的SEQ ID NO:35和139)、AAVCLv-12(US8734809的SEQ ID NO:66和140)、AAV CLv-13(US8734809的SEQ ID NO:67和141)、AAV CLv-2(US8734809的SEQ ID NO:68和142)、AAV CLv-3(US8734809的SEQ ID NO:69和143)、AAV CLv-4(US8734809的SEQ ID NO:70和144)、AAV CLv-6(US8734809的SEQ IDNO:71和145)、AAV CLv-8(US8734809的SEQ ID NO:72和146)、AAV CKd-B1(US8734809的SEQID NO:73和147)、AAV CKd-B2(US8734809的SEQ ID NO:74和148)、AAV CKd-B3(US8734809的SEQ ID NO:75和149)、AAV CKd-B4(US8734809的SEQ ID NO:76和150)、AAV CKd-B5(US8734809的SEQ ID NO:77和151)、AAV CKd-B6(US8734809的SEQ ID NO:78和152)、AAVCKd-B7(US8734809的SEQ ID NO:79和153)、AAV CKd-B8(US8734809的SEQ ID NO:80和154)、AAV CKd-H1(US8734809的SEQ ID NO:81和155)、AAV CKd-H2(US8734809的SEQ IDNO:82和156)、AAV CKd-H3(US8734809的SEQ ID NO:83和157)、AAV CKd-H4(US8734809的SEQ ID NO:84和158)、AAV CKd-H5(US8734809的SEQ ID NO:85和159)、AAV CKd-H6(US8734809的SEQ ID NO:77和151)、AAV CHt-1(US8734809的SEQ ID NO:86和160)、AAVCLv1-1(US8734809的SEQ ID NO:171)、AAV CLv1-2(US8734809的SEQ ID NO:172)、AAVCLv1-3(US8734809的SEQ ID NO:173)、AAV CLv1-4(US8734809的SEQ ID NO:174)、AAVClv1-7(US8734809的SEQ ID NO:175)、AAV Clv1-8(US8734809的SEQ ID NO:176)、AAVClv1-9(US8734809的SEQ ID NO:177)、AAV Clv1-10(US8734809的SEQ ID NO:178)、AAV.VR-355(US8734809的SEQ ID NO:181)、AAV.hu.48R3(US8734809的SEQ ID NO:183)或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有国际公开号WO2016065001中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV CHt-P2(WO2016065001的SEQ IDNO:1和51)、AAV CHt-P5(WO2016065001的SEQ ID NO:2和52)、AAV CHt-P9(WO2016065001的SEQ ID NO:3和53)、AAV CBr-7.1(WO2016065001的SEQ ID NO:4和54)、AAV CBr-7.2(WO2016065001的SEQ ID NO:5和55)、AAV CBr-7.3(WO2016065001的SEQ ID NO:6和56)、AAV CBr-7.4(WO2016065001的SEQ ID NO:7和57)、AAV CBr-7.5(WO2016065001的SEQ IDNO:8和58)、AAV CBr-7.7(WO2016065001的SEQ ID NO:9和59)、AAV CBr-7.8(WO2016065001的SEQ ID NO:10和60)、AAV CBr-7.10(WO2016065001的SEQ ID NO:11和61)、AAV CKd-N3(WO2016065001的SEQ ID NO:12和62)、AAV CKd-N4(WO2016065001的SEQ ID NO:13和63)、AAV CKd-N9(WO2016065001的SEQ ID NO:14和64)、AAV CLv-L4(WO2016065001的SEQ IDNO:15和65)、AAV CLv-L5(WO2016065001的SEQ ID NO:16和66)、AAV CLv-L6(WO2016065001的SEQ ID NO:17和67)、AAV CLv-K1(WO2016065001的SEQ ID NO:18和68)、AAV CLv-K3(WO2016065001的SEQ ID NO:19和69)、AAV CLv-K6(WO2016065001的SEQ ID NO:20和70)、AAV CLv-M1(WO2016065001的SEQ ID NO:21和71)、AAV CLv-M11(WO2016065001的SEQ IDNO:22和72)、AAV CLv-M2(WO2016065001的SEQ ID NO:23和73)、AAV CLv-M5(WO2016065001的SEQ ID NO:24和74)、AAV CLv-M6(WO2016065001的SEQ ID NO:25和75)、AAV CLv-M7(WO2016065001的SEQ ID NO:26和76)、AAV CLv-M8(WO2016065001的SEQ ID NO:27和77)、AAV CLv-M9(WO2016065001的SEQ ID NO:28和78)、AAV CHt-P1(WO2016065001的SEQ IDNO:29和79)、AAV CHt-P6(WO2016065001的SEQ ID NO:30和80)、AAV CHt-P8(WO2016065001的SEQ ID NO:31和81)、AAV CHt-6.1(WO2016065001的SEQ ID NO:32和82)、AAV CHt-6.10(WO2016065001的SEQ ID NO:33和83)、AAV CHt-6.5(WO2016065001的SEQ ID NO:34和84)、AAV CHt-6.6(WO2016065001的SEQ ID NO:35和85)、AAV CHt-6.7(WO2016065001的SEQ IDNO:36和86)、AAV CHt-6.8(WO2016065001的SEQ ID NO:37和87)、AAV CSp-8.10(WO2016065001的SEQ ID NO:38和88)、AAV CSp-8.2(WO2016065001的SEQ ID NO:39和89)、AAV CSp-8.4(WO2016065001的SEQ ID NO:40和90)、AAV CSp-8.5(WO2016065001的SEQ IDNO:41和91)、AAV CSp-8.6(WO2016065001的SEQ ID NO:42和92)、AAV CSp-8.7(WO2016065001的SEQ ID NO:43和93)、AAV CSp-8.8(WO2016065001的SEQ ID NO:44和94)、AAV CSp-8.9(WO2016065001的SEQ ID NO:45和95)、AAV CBr-B7.3(WO2016065001的SEQ IDNO:46和96)、AAV CBr-B7.4(WO2016065001的SEQ ID NO:47和97)、AAV3B(WO2016065001的SEQ ID NO:48和98)、AAV4(WO2016065001的SEQ ID NO:49和99)、AAV5(WO2016065001的SEQID NO:50和100)或其变体或衍生物。
在一个实施方案中，AAV可以是选自存在于表1中的任何血清型的血清型。
在一个实施方案中，AAV可包含表1中序列中的序列、片段或变体。
在一个实施方案中，AAV可以由表1中所述的序列、片段或变体编码。
表1.AAV血清型
Figure BDA0002356059890000301
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Figure BDA0002356059890000881
表1中列出的每个专利、申请和/或出版物均通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，AAV血清型可以是或可以具有国际专利公开WO2015038958中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV9(WO2015038958的SEQ IDNO:2和11或本文中分别为SEQ ID NO:127和126)、PHP.B(WO2015038958的SEQ ID NO:8和9，本文的SEQ ID NO:868和869)、G2B-13(WO2015038958的SEQ ID NO:12，本文的SEQ ID NO:870)、G2B-26(WO2015038958的SEQ ID NO:13，本文的SEQ ID NO:868和869)、TH1.1-32(WO2015038958的SEQ ID NO:14，本文的SEQ ID NO:871)、TH1.1-35(WO2015038958的SEQID NO:15，本文的SEQ ID NO:872)或其变体。此外，WO2015038958中描述的任何靶向肽或氨基酸插入物均可插入到任何亲本AAV血清型，例如但不限于AAV9(DNA序列为SEQ ID NO:126，氨基酸序列为SEQ ID NO:127)。在一个实施方案中，将氨基酸插入物插入到亲本AAV(例如，AAV9)的氨基酸586-592之间。在另一个实施方案中，氨基酸插入物插入到亲本AAV序列的氨基酸588-589之间。氨基酸插入物可以是但不限于以下任何氨基酸序列：TLAVPFK(WO2015038958的SEQ ID NO:1；本文的SEQ ID NO:873)、KFPVALT(WO2015038958的SEQ IDNO:3；本文的SEQ ID NO:874)、LAVPFK(WO2015038958的SEQ ID NO:31；本文的SEQ ID NO:875)、AVPFK(WO2015038958的SEQ ID NO:32；本文的SEQ ID NO:876)、VPFK(WO2015038958的SEQ ID NO:33；本文的SEQ ID NO:877)、TLAVPF(WO2015038958的SEQ ID NO:34；本文的SEQ ID NO:878)、TLAVP(WO2015038958的SEQ ID NO:35；本文的SEQ ID NO:879)、TLAV(WO2015038958的SEQ ID NO:36；本文的SEQ ID NO:880)、SVSKPFL(WO2015038958的SEQ IDNO:28；本文的SEQ ID NO:881)、FTLTTPK(WO2015038958的SEQ ID NO:29；本文的SEQ IDNO:882)、MNATKNV(WO2015038958的SEQ ID NO:30；本文的SEQ ID NO:883)、QSSQTPR(WO2015038958的SEQ ID NO:54；本文的SEQ ID NO:884)、ILGTGTS(WO2015038958的SEQ IDNO:55；本文的SEQ ID NO:885)、TRTNPEA(WO2015038958的SEQ ID NO:56；本文的SEQ IDNO:886)、NGGTSSS(WO2015038958的SEQ ID NO:58；本文的SEQ ID NO:887)或YTLSQGW(WO2015038958的SEQ ID NO:60；本文的SEQ ID NO:888)。可以编码氨基酸插入物的核苷酸序列的非限制性实例包括以下：AAGTTTCCTGTGGCGTTGACT(对于WO2015038958的SEQ ID NO:3；本文的SEQ ID NO:889)、ACTTTGGCGGTGCCTTTTAAG(WO2015038958的SEQ ID NO:24和49；本文的SEQ ID NO:890)、AGTGTGAGTAAGCCTTTTTTG(WO2015038958的SEQ ID NO:25；本文的SEQ ID NO:891)、TTTACGTTGACGACGCCTAAG(WO2015038958的SEQ ID NO:26；本文的SEQ IDNO:892)、ATGAATGCTACGAAGAATGTG(WO2015038958的SEQ ID NO:27；本文的SEQ ID NO:893)、CAGTCGTCGCAGACGCCTAGG(WO2015038958的SEQ ID NO:48；本文的SEQ ID NO:894)、ATTCTGGGGACTGGTACTTCG(WO2015038958的SEQ ID NO:50和52；本文的SEQ ID NO:895)、ACGCGGACTAATCCTGAGGCT(WO2015038958的SEQ ID NO:51；本文的SEQ ID NO:896)、AATGGGGGGACTAGTAGTTCT(WO2015038958的SEQ ID NO:53；本文的SEQ ID NO:897)或TATACTTTGTCGCAGGGTTGG(WO2015038958的SEQ ID NO:59；本文的SEQ ID NO:898)。
在一个实施方案中，可以将AAV血清型工程化以包含用于AAV2的至少一种AAV衣壳CD8+T细胞表位，例如但不限于SADNNNSEY(SEQ ID NO:899)、LIDQYLYYL(SEQ ID NO:900)、VPQYGYLTL(SEQ ID NO:901)、TTSTRTWAL(SEQ ID NO:902)、YHLNGRDSL(SEQ ID NO:903)、SQAVGRSSF(SEQ ID NO:904)、VPANPSTTF(SEQ ID NO:905)、FPQSGVLIF(SEQ ID NO:906)、YFDFNRFHCHFSPRD(SEQ ID NO:907)、VGNSSGNWHCDSTWM(SEQ ID NO:908)、QFSQAGASDIRDQSR(SEQ ID NO:909)、GASDIRQSRNWLP(SEQ ID NO:910)和GNRQAATADVNTQGV(SEQ ID NO:911)。
在一个实施方案中，可以将AAV血清型工程化以包含至少一个用于AAV1的AAV衣壳CD8+T细胞表位，例如但不限于LDRLMNPLI(SEQ ID NO:912)、TTSTRTWAL(SEQ ID NO:902)和QPAKKRLNF(SEQ ID NO:913)。
在一个实施方案中，AAV血清型可以是或可以具有国际专利公开WO2017100671中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV9(WO2017100671的SEQ IDNO:45，本文的SEQ ID NO:1420)、PHP.N(WO2017100671的SEQ ID NO:46，本文的SEQ ID NO:1418)、PHP.S(WO2017100671的SEQ ID NO:47，本文的SEQ ID NO:1419)或其变体。此外，在WO2017100671中描述的任何靶向肽或氨基酸插入物可以插入到任何亲本AAV血清型，例如但不限于AAV9(SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:1420)。在一个实施方案中，将氨基酸插入物插入亲本AAV(例如，AAV9)的氨基酸586-592之间。在另一个实施方案中，氨基酸插入物插入亲本AAV序列的氨基酸588-589之间。氨基酸插入物可以是但不限于以下任何氨基酸序列AQTLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:1；本文的SEQ ID NO:1804)、AQSVSKPFLAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:2；本文的SEQ ID NO:1805)、AQFTLTTPKAQ(WO2017100671的序列表中的SEQ ID NO:3；本文的SEQ ID NO:1806)、DGTLAVPFKAQ(WO2017100671的序列表中的SEQ ID NO:4；本文的SEQ ID NO:1807)、ESTLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:5；本文的SEQ ID NO:1808)、GGTLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:6；本文的SEQ ID NO:1809)、AQTLATPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:7和33；本文的SEQ ID NO:1810)、ATTLATPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:8；本文的SEQ ID NO:1811)、DGTLATPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:9；本文的SEQ ID NO:1812)、GGTLATPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:10；本文的SEQ ID NO:1813)、SGSLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:11；本文的SEQ ID NO:1814)、AQTLAQPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:12；本文的SEQ ID NO:1815)、AQTLQQPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:13；本文的SEQ ID NO:1816)、AQTLSNPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:14；本文的SEQ ID NO:1817)、AQTLAVPFSNP(WO2017100671的SEQ ID NO:15；本文的SEQ ID NO:1818)、QGTLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:16；本文的SEQ ID NO:1819)、NQTLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:17；本文的SEQ ID NO:1820)、EGSLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:18；本文的SEQ ID NO:1821)、SGNLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:19；本文的SEQ ID NO:1822)、EGTLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:20；本文的SEQ ID NO:1823)、DSTLAVPFKAQ(WO2017100671的表1中的SEQ ID NO:21；本文的SEQ ID NO:1824)、AVTLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:22；本文的SEQ ID NO:1825)、AQTLSTPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:23；本文的SEQ ID NO:1826)、AQTLPQPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:24和32；本文的SEQ ID NO:1827)、AQTLSQPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:25；本文的SEQ IDNO:1828)、AQTLQLPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:26；本文的SEQ ID NO:1829)、AQTLTMPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:27和34和WO2017100671的序列表中的SEQ IDNO:35；本文的SEQ ID NO:1830)、AQTLTTPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:28；本文的SEQID NO:1831)、AQYTLSQGWAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:29；本文的SEQ ID NO:1832)、AQMNATKNVAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:30；本文的SEQ ID NO:1833)、AQVSGGHHSAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:31；本文的SEQ ID NO:1834)、AQTLTAPFKAQ(WO2017100671的表1中的SEQ ID NO:35；本文的SEQ ID NO:1835)、AQTLSKPFKAQ(WO2017100671的SEQ IDNO:36；本文的SEQ ID NO:1836)、QAVRTSL(WO2017100671的SEQ ID NO:37；本文的SEQ IDNO:1837)、YTLSQGW(WO2017100671的SEQ ID NO:38；本文的SEQ ID NO:888)、LAKERLS(WO2017100671的SEQ ID NO:39；本文的SEQ ID NO:1838)、TLAVPFK(WO2017100671的序列表中的SEQ ID NO:40；本文的SEQ ID NO:873)、SVSKPFL(WO2017100671的SEQ ID NO:41；本文的SEQ ID NO:881)、FTLTTPK(WO2017100671的SEQ ID NO:42；本文的SEQ ID NO:882)、MNSTKNV(WO2017100671的SEQ ID NO:43；本文的SEQ ID NO:1839)、VSGGHHS(WO2017100671的SEQ ID NO:44；本文的SEQ ID NO:1840)、SAQTLAVPFKAQAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:48；本文的SEQ ID NO:1841)、SXXXLAVPFKAQAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:49，其中X可以是任何氨基酸；本文的SEQ ID NO:1842)、SAQXXXVPFKAQAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:50，其中X可以是任何氨基酸；本文的SEQ ID NO:1843)、SAQTLXXXFKAQAQ(WO2017100671的SEQID NO:51，其中X可以是任何氨基酸；本文的SEQ ID NO:1844)、SAQTLAVXXXAQAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:52，其中X可以是任何氨基酸；本文的SEQ ID NO:1845)、SAQTLAVPFXXXAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:53，其中X可以是任何氨基酸；本文的SEQ IDNO:1846)、TNHQSAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:65；本文的SEQ ID NO:1847)、AQAQTGW(WO2017100671的SEQ ID NO:66；本文的SEQ ID NO:1848)、DGTLATPFK(WO2017100671的SEQID NO:67；本文的SEQ ID NO:1849)、DGTLATPFKXX(WO2017100671的SEQ ID NO:68，其中X可以是任何氨基酸；本文的SEQ ID NO:1850)、LAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:80；本文的SEQ ID NO:1851)、VPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:81；本文的SEQ ID NO:1852)、FKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:82；本文的SEQ ID NO:1853)、AQTLAV(WO2017100671的SEQ ID NO:83；本文的SEQ ID NO:1854)、AQTLAVPF(WO2017100671的SEQ ID NO:84；本文的SEQ ID NO:1855)、QAVR(WO2017100671的SEQ ID NO:85；本文的SEQ ID NO:1856)、AVRT(WO2017100671的SEQ ID NO:86；本文的SEQ ID NO:1857)、VRTS(WO2017100671的SEQ IDNO:87；本文的SEQ ID NO:1858)、RTSL(WO2017100671的SEQ ID NO:88；本文的SEQ ID NO:1859)、QAVRT(WO2017100671的SEQ ID NO:89；本文的SEQ ID NO:1860)、AVRTS(WO2017100671的SEQ ID NO:90；本文的SEQ ID NO:1861)、VRTSL(WO2017100671的SEQ IDNO:91；本文的SEQ ID NO:1862)、QAVRTS(WO2017100671的SEQ ID NO:92；本文的SEQ IDNO:1863)或AVRTSL(WO2017100671的SEQ ID NO:93；本文的SEQ ID NO:1864)。
可以编码氨基酸插入物的核苷酸序列的非限制性实例包括以下GATGGGACTTTGGCGGTGCCTTTTAAGGCACAG(WO2017100671的SEQ ID NO:54；本文的SEQ ID NO:1865)、GATGGGACGTTGGCGGTGCCTTTTAAGGCACAG(WO2017100671的SEQ ID NO:55；本文的SEQ ID NO:1866)、CAGGCGGTTAGGACGTCTTTG(WO2017100671的SEQ ID NO:56；本文的SEQ ID NO:1867)、CAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAG(WO2017100671的SEQ ID NO:57和78；本文的SEQ ID NO:1868)、CAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCG(WO2017100671的SEQ ID NO:58；本文的SEQID NO:1869)、ACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCTAGAAC(WO2017100671的SEQ ID NO:59；本文的SEQ ID NO:1870)、GGAAGTATTCCTTGGTTTTGAACCCA(WO2017100671的SEQ ID NO:60；本文的SEQ ID NO:1871)、GGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGAT(WO2017100671的SEQ ID NO:61；本文的SEQ ID NO:1872)、CGACCTTGAAGCGCATGAACTCCT(WO2017100671的SEQ ID NO:62；本文的SEQ ID NO:1873)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNTTGGGCACTCTGGTGGTTTGTC(WO2017100671的SEQ ID NO:63，其中N可以是A、C、T或G；本文的SEQ ID NO:1874)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCMNNMNNMNNAAAAGGCACCGCCAAAGTTTG(WO2017100671的SEQ ID NO:69，其中N可以是A、C、T或G；本文的SEQ ID NO:1875)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCMNNMNNMNNCACCGCCAAAGTTTGGGCACT(WO2017100671的SEQ ID NO:70，其中N可以是A、C、T或G；本文的SEQ ID NO:1876)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCCTTAAAMNNMNNMNNCAAAGTTTGGGCACTCTGGTGG(WO2017100671的SEQ ID NO:71，其中N可以是A、C、T或G；本文的SEQ ID NO:1877)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCCTTAAAAGGCACMNNMNNMNNTTGGGCACTCTGGTGGTTTGTG(WO2017100671的SEQ ID NO:72，其中N可以是A、C、T或G；本文的SEQ ID NO:1878)、ACTTTGGCGGTGCCTTTTAAG(WO2017100671的SEQ ID NO:74；本文的SEQ ID NO:890)、AGTGTGAGTAAGCCTTTTTTG(WO2017100671的SEQ ID NO:75；本文的SEQ ID NO:891)、TTTACGTTGACGACGCCTAAG(WO2017100671的SEQ ID NO:76；本文的SEQ ID NO:892)、TATACTTTGTCGCAGGGTTGG(WO2017100671的SEQ ID NO:77；本文的SEQ ID NO:898)或CTTGCGAAGGAGCGGCTTTCG(WO2017100671的SEQ ID NO:79；本文的SEQ ID NO:1879)。
在一个实施方案中，AAV血清型可以是或可以具有美国专利号US 9624274中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV1(US9624274的SEQ ID NO:181)、AAV6(US9624274的SEQ ID NO:182)、AAV2(US9624274的SEQ ID NO:183)、AAV3b(US9624274的SEQ ID NO:184)、AAV7(US9624274的SEQ ID NO:185)、AAV8(US9624274的SEQ ID NO:186)、AAV10(US9624274的SEQ ID NO:187)、AAV4(US9624274的SEQ ID NO:188)、AAV11(US9624274的SEQ ID NO:189)、bAAV(US9624274的SEQ ID NO:190)、AAV5(US9624274的SEQID NO:191)、GPV(US9624274的SEQ ID NO:192；本文的SEQ ID NO:1421)、B19(US9624274的SEQ ID NO:193；本文的SEQ ID NO:1422)、MVM(US9624274的SEQ ID NO:194；本文的SEQ IDNO:1423)、FPV(US9624274的SEQ ID NO:195；本文的SEQ ID NO:1424)、CPV(US9624274的SEQ ID NO:196；本文的SEQ ID NO:1425)或其变体。此外，US 9624274中描述的任何结构蛋白插入物都可以插入但不限于任何亲本AAV血清型的I-453和I-587，例如但不限于AAV2(US9624274的SEQ ID NO:183)。氨基酸插入物可以是但不限于任何以下氨基酸序列，VNLTWSRASG(US9624274的SEQ ID NO:50；本文的SEQ ID NO:1880)、EFCINHRGYWVCGD(US9624274的SEQ ID NO:55；本文的SEQ ID NO:1881)、EDGQVMDVDLS(US9624274的SEQ IDNO:85；本文的SEQ ID NO:1882)、EKQRNGTLT(US9624274的SEQ ID NO:86；本文的SEQ IDNO:1883)、TYQCRVTHPHLPRALMR(US9624274的SEQ ID NO:87；本文的SEQ ID NO:1884)、RHSTTQPRKTKGSG(US9624274的SEQ ID NO:88；本文的SEQ ID NO:1885)、DSNPRGVSAYLSR(US9624274的SEQ ID NO:89；本文的SEQ ID NO:1886)、TITCLWDLAPSK(US9624274的SEQ IDNO:90；本文的SEQ ID NO:1887)、KTKGSGFFVF(US9624274的SEQ ID NO:91；本文的SEQ IDNO:1888)、THPHLPRALMRS(US9624274的SEQ ID NO:92；本文的SEQ ID NO:1889)、GETYQCRVTHPHLPRALMRSTTK(US9624274的SEQ ID NO:93；本文的SEQ ID NO:1890)、LPRALMRS(US9624274的SEQ ID NO:94；本文的SEQ ID NO:1891)、INHRGYWV(US9624274的SEQ ID NO:95；本文的SEQ ID NO:1892)、CDAGSVRTNAPD(US9624274的SEQ ID NO:60；本文的SEQ ID NO:1893)、AKAVSNLTESRSESLQS(US9624274的SEQ ID NO:96；本文的SEQ ID NO:1894)、SLTGDEFKKVLET(US9624274的SEQ ID NO:97；本文的SEQ ID NO:1895)、REAVAYRFEED(US9624274的SEQ ID NO:98；本文的SEQ ID NO:1896)、INPEIITLDG(US9624274的SEQ IDNO:99；本文的SEQ ID NO:1897)、DISVTGAPVITATYL(US9624274的SEQ ID NO:100；本文的SEQ ID NO:1898)、DISVTGAPVITA(US9624274的SEQ ID NO:101；本文的SEQ ID NO:1899)、PKTVSNLTESSSESVQS(US9624274的SEQ ID NO:102；本文的SEQ ID NO:1900)、SLMGDEFKAVLET(US9624274的SEQ ID NO:103；本文的SEQ ID NO:1901)、QHSVAYTFEED(US9624274的SEQ ID NO:104；本文的SEQ ID NO:1902)、INPEIITRDG(US9624274的SEQ IDNO:105；本文的SEQ ID NO:1903)、DISLTGDPVITASYL(US9624274的SEQ ID NO:106；本文的SEQ ID NO:1904)、DISLTGDPVITA(US9624274的SEQ ID NO:107；本文的SEQ ID NO:1905)、DQSIDFEIDSA(US9624274的SEQ ID NO:108；本文的SEQ ID NO:1906)、KNVSEDLPLPTFSPTLLGDS(US9624274的SEQ ID NO:109；本文的SEQ ID NO:1907)、KNVSEDLPLPT(US9624274的SEQ ID NO:110；本文的SEQ ID NO:1908)、CDSGRVRTDAPD(US9624274的SEQ ID NO:111；本文的SEQ ID NO:1909)、FPEHLLVDFLQSLS(US9624274的SEQID NO:112；本文的SEQ ID NO:1910)、DAEFRHDSG(US9624274的SEQ ID NO:65；本文的SEQID NO:1911)、HYAAAQWDFGNTMCQL(US9624274的SEQ ID NO:113；本文的SEQ ID NO:1912)、YAAQWDFGNTMCQ(US9624274的SEQ ID NO:114；本文的SEQ ID NO:1913)、RSQKEGLHYT(US9624274的SEQ ID NO:115；本文的SEQ ID NO:1914)、SSRTPSDKPVAHWANPQAE(US9624274的SEQ ID NO:116；本文的SEQ ID NO:1915)、SRTPSDKPVAHWANP(US9624274的SEQ ID NO:117；本文的SEQ ID NO:1916)、SSRTPSDKP(US9624274的SEQ ID NO:118；本文的SEQ ID NO:1917)、NADGNVDYHMNSVP(US9624274的SEQ ID NO:119；本文的SEQ ID NO:1918)、DGNVDYHMNSV(US9624274的SEQ ID NO:120；本文的SEQ ID NO:1919)、RSFKEFLQSSLRALRQ(US9624274的SEQ ID NO:121；本文的SEQ ID NO:1920)；FKEFLQSSLRA(US9624274的SEQ IDNO:122；本文的SEQ ID NO:1921)或QMWAPQWGPD(US9624274的SEQ ID NO:123；本文的SEQID NO:1922)。
在一个实施方案中，AAV血清型可以是或可以具有美国专利号US 9475845中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV衣壳蛋白，其包含在天然AAV2衣壳蛋白的氨基酸位置585至590的一个或多个氨基酸修饰。进一步的修饰可以产生但不限于氨基酸序列RGNRQA(US9475845的SEQ ID NO:3；本文的SEQ ID NO:1923)、SSSTDP(US9475845的SEQ ID NO:4；本文的SEQ ID NO:1924)、SSNTAP(US9475845的SEQ ID NO:5；本文的SEQ ID NO:1925)、SNSNLP(US9475845的SEQ ID NO:6；本文的SEQ ID NO:1926)、SSTTAP(US9475845的SEQ ID NO:7；本文的SEQ ID NO:1927)、AANTAA(US9475845的SEQ IDNO:8；本文的SEQ ID NO:1928)、QQNTAP(US9475845的SEQ ID NO:9；本文的SEQ ID NO:1929)、SAQAQA(US9475845的SEQ ID NO:10；本文的SEQ ID NO:1930)、QANTGP(US9475845的SEQ ID NO:11；本文的SEQ ID NO:1931)、NATTAP(US9475845的SEQ ID NO:12；本文的SEQID NO:1932)、SSTAGP(US9475845的SEQ ID NO:13和20；本文的SEQ ID NO:1933)、QQNTAA(US9475845的SEQ ID NO:14；本文的SEQ ID NO:1934)、PSTAGP(US9475845的SEQ ID NO:15；本文的SEQ ID NO:1935)、NQNTAP(US9475845的SEQ ID NO:16；本文的SEQ ID NO:1936)、QAANAP(US9475845的SEQ ID NO:17；本文的SEQ ID NO:1937)、SIVGLP(US9475845的SEQ ID NO:18；本文的SEQ ID NO:1938)、AASTAA(US9475845的SEQ ID NO:19和27；本文的SEQ ID NO:1939)、SQNTTA(US9475845的SEQ ID NO:21；本文的SEQ ID NO:1940)、QQDTAP(US9475845的SEQ ID NO:22；本文的SEQ ID NO:1941)、QTNTGP(US9475845的SEQ ID NO:23；本文的SEQ ID NO:1942)、QTNGAP(US9475845的SEQ ID NO:24；本文的SEQ ID NO:1943)、QQNAAP(US9475845的SEQ ID NO:25；本文的SEQ ID NO:1944)或AANTQA(US9475845的SEQ ID NO:26；本文的SEQ ID NO:1945)。在一个实施方案中，氨基酸修饰是在天然AAV2衣壳蛋白中的氨基酸位置262至265或另一AAV的衣壳蛋白中的相应位置处用靶向序列取代。靶向序列可以是但不限于任何氨基酸序列，NGRAHA(US9475845的SEQ ID NO:38；本文的SEQ ID NO:1946)、QPEHSST(US9475845的SEQ ID NO:39和50；本文的SEQ ID NO:1947)、VNTANST(US9475845的SEQ ID NO:40；本文的SEQ ID NO:1948)、HGPMQKS(US9475845的SEQID NO:41；本文的SEQ ID NO:1949)、PHKPPLA(US9475845的SEQ ID NO:42；本文的SEQ IDNO:1950)、IKNNEMW(US9475845的SEQ ID NO:43；本文的SEQ ID NO:1951)、RNLDTPM(US9475845的SEQ ID NO:44；本文的SEQ ID NO:1952)、VDSHRQS(US9475845的SEQ ID NO:45；本文的SEQ ID NO:1953)、YDSKTKT(US9475845的SEQ ID NO:46；本文的SEQ ID NO:1954)、SQLPHQK(US9475845的SEQ ID NO:47；本文的SEQ ID NO:1955)、STMQQNT(US9475845的SEQ ID NO:48；本文的SEQ ID NO:1956)、TERYMTQ(US9475845的SEQ ID NO:49；本文的SEQ ID NO:1957)、DASLSTS(US9475845的SEQ ID NO:51；本文的SEQ ID NO:1958)、DLPNKKT(US9475845的SEQ ID NO:52；本文的SEQ ID NO:1959)、DLTAARL(US9475845的SEQ ID NO:53；本文的SEQ ID NO:1960)、EPHQFNY(US9475845的SEQ ID NO:54；本文的SEQ ID NO:1961)、EPQSNHT(US9475845的SEQ ID NO:55；本文的SEQ ID NO:1962)、MSSWPSQ(US9475845的SEQ ID NO:56；本文的SEQ ID NO:1963)、NPKHNAT(US9475845的SEQ ID NO:57；本文的SEQ ID NO:1964)、PDGMRTT(US9475845的SEQ ID NO:58；本文的SEQ ID NO:1965)、PNNNKTT(US9475845的SEQ ID NO:59；本文的SEQ ID NO:1966)、QSTTHDS(US9475845的SEQ ID NO:60；本文的SEQ ID NO:1967)、TGSKQKQ(US9475845的SEQ ID NO:61；本文的SEQ ID NO:1968)、SLKHQAL(US9475845的SEQ ID NO:62；本文的SEQ ID NO:1969)、SPIDGEQ(US9475845的SEQ ID NO:63；本文的SEQ ID NO:1970)、WIFPWIQL(US9475845的SEQ ID NO:64和112；本文的SEQ ID NO:1971)、CDCRGDCFC(US9475845的SEQ ID NO:65；本文的SEQ ID NO:1972)、CNGRC(US9475845的SEQ ID NO:66；本文的SEQ ID NO:1973)、CPRECES(US9475845的SEQ IDNO:67；本文的SEQ ID NO:1974)、CTTHWGFTLC(US9475845的SEQ ID NO:68和123；本文的SEQID NO:1975)、CGRRAGGSC(US9475845的SEQ ID NO:69；本文的SEQ ID NO:1976)、CKGGRAKDC(US9475845的SEQ ID NO:70；本文的SEQ ID NO:1977)、CVPELGHEC(US9475845的SEQ IDNO:71和115；本文的SEQ ID NO:1978)、CRRETAWAK(US9475845的SEQ ID NO:72；本文的SEQID NO:1979)、VSWFSHRYSPFAVS(US9475845的SEQ ID NO:73；本文的SEQ ID NO:1980)、GYRDGYAGPILYN(US9475845的SEQ ID NO:74；本文的SEQ ID NO:1981)、XXXYXXX(US9475845的SEQ ID NO:75；本文的SEQ ID NO:1982)、YXNW(US9475845的SEQ ID NO:76；本文的SEQID NO:1983)、RPLPPLP(US9475845的SEQ ID NO:77；本文的SEQ ID NO:1984)、APPLPPR(US9475845的SEQ ID NO:78；本文的SEQ ID NO:1985)、DVFYPYPYASGS(US9475845的SEQ IDNO:79；本文的SEQ ID NO:1986)、MYWYPY(US9475845的SEQ ID NO:80；本文的SEQ ID NO:1987)、DITWDQLWDLMK(US9475845的SEQ ID NO:81；本文的SEQ ID NO:1988)、CWDDXWLC(US9475845的SEQ ID NO:82；本文的SEQ ID NO:1989)、EWCEYLGGYLRCYA(US9475845的SEQID NO:83；本文的SEQ ID NO:1990)、YXCXXGPXTWXCXP(US9475845的SEQ ID NO:84；本文的SEQ ID NO:1991)、IEGPTLRQWLAARA(US9475845的SEQ ID NO:85；本文的SEQ ID NO:1992)、LWXXX(US9475845的SEQ ID NO:86；本文的SEQ ID NO:1993)、XFXXYLW(US9475845的SEQ IDNO:87；本文的SEQ ID NO:1994)、SSIISHFRWGLCD(US9475845的SEQ ID NO:88；本文的SEQID NO:1995)、MSRPACPPNDKYE(US9475845的SEQ ID NO:89；本文的SEQ ID NO:1996)、CLRSGRGC(US9475845的SEQ ID NO:90；本文的SEQ ID NO:1997)、CHWMFSPWC(US9475845的SEQ ID NO:91；本文的SEQ ID NO:1998)、WXXF(US9475845的SEQ ID NO:92；本文的SEQ IDNO:1999)、CSSRLDAC(US9475845的SEQ ID NO:93；本文的SEQ ID NO:2000)、CLPVASC(US9475845的SEQ ID NO:94；本文的SEQ ID NO:2001)、CGFECVRQCPERC(US9475845的SEQID NO:95；本文的SEQ ID NO:2002)、CVALCREACGEGC(US9475845的SEQ ID NO:96；本文的SEQ ID NO:2003)、SWCEPGWCR(US9475845的SEQ ID NO:97；本文的SEQ ID NO:2004)、YSGKWGW(US9475845的SEQ ID NO:98；本文的SEQ ID NO:2005)、GLSGGRS(US9475845的SEQID NO:99；本文的SEQ ID NO:2006)、LMLPRAD(US9475845的SEQ ID NO:100；本文的SEQ IDNO:2007)、CSCFRDVCC(US9475845的SEQ ID NO:101；本文的SEQ ID NO:2008)、CRDVVSVIC(US9475845的SEQ ID NO:102；本文的SEQ ID NO:2009)、MARSGL(US9475845的SEQ ID NO:103；本文的SEQ ID NO:2010)、MARAKE(US9475845的SEQ ID NO:104；本文的SEQ ID NO:2011)、MSRTMS(US9475845的SEQ ID NO:105；本文的SEQ ID NO:2012)、KCCYSL(US9475845的SEQ ID NO:106；本文的SEQ ID NO:2013)、MYWGDSHWLQYWYE(US9475845的SEQ ID NO:107；本文的SEQ ID NO:2014)、MQLPLAT(US9475845的SEQ ID NO:108；本文的SEQ ID NO:2015)、EWLS(US9475845的SEQ ID NO:109；本文的SEQ ID NO:2016)、SNEW(US9475845的SEQID NO:110；本文的SEQ ID NO:2017)、TNYL(US9475845的SEQ ID NO:111；本文的SEQ IDNO:2018)、WDLAWMFRLPVG(US9475845的SEQ ID NO:113；本文的SEQ ID NO:2019)、CTVALPGGYVRVC(US9475845的SEQ ID NO:114；本文的SEQ ID NO:2020)、CVAYCIEHHCWTC(US9475845的SEQ ID NO:116；本文的SEQ ID NO:2021)、CVFAHNYDYLVC(US9475845的SEQID NO:117；本文的SEQ ID NO:2022)、CVFTSNYAFC(US9475845的SEQ ID NO:118；本文的SEQID NO:2023)、VHSPNKK(US9475845的SEQ ID NO:119；本文的SEQ ID NO:2024)、CRGDGWC(US9475845的SEQ ID NO:120；本文的SEQ ID NO:2025)、XRGCDX(US9475845的SEQ ID NO:121；本文的SEQ ID NO:2026)、PXXX(US9475845的SEQ ID NO:122；本文的SEQ ID NO:2027)、SGKGPRQITAL(US9475845的SEQ ID NO:124；本文的SEQ ID NO:2028)、AAAAAAAAAXXXXX(US9475845的SEQ ID NO:125；本文的SEQ ID NO:2029)、VYMSPF(US9475845的SEQ ID NO:126；本文的SEQ ID NO:2030)、ATWLPPR(US9475845的SEQ ID NO:127；本文的SEQ ID NO:2031)、HTMYYHHYQHHL(US9475845的SEQ ID NO:128；本文的SEQ IDNO:2032)、SEVGCRAGPLQWLCEKYFG(US9475845的SEQ ID NO:129；本文的SEQ ID NO:2033)、CGLLPVGRPDRNVWRWLC(US9475845的SEQ ID NO:130；本文的SEQ ID NO:2034)、CKGQCDRFKGLPWEC(US9475845的SEQ ID NO:131；本文的SEQ ID NO:2035)、SGRSA(US9475845的SEQ ID NO:132；本文的SEQ ID NO:2036)、WGFP(US9475845的SEQ ID NO:133；本文的SEQ ID NO:2037)、AEPMPHSLNFSQYLWYT(US9475845的SEQ ID NO:134；本文的SEQ ID NO:2038)、WAYXSP(US9475845的SEQ ID NO:135；本文的SEQ ID NO:2039)、IELLQAR(US9475845的SEQ ID NO:136；本文的SEQ ID NO:2040)、AYTKCSRQWRTCMTTH(US9475845的SEQ ID NO:137；本文的SEQ ID NO:2041)、PQNSKIPGPTFLDPH(US9475845的SEQ ID NO:138；本文的SEQ ID NO:2042)、SMEPALPDWWWKMFK(US9475845的SEQ ID NO:139；本文的SEQ IDNO:2043)、ANTPCGPYTHDCPVKR(US9475845的SEQ ID NO:140；本文的SEQ ID NO:2044)、TACHQHVRMVRP(US9475845的SEQ ID NO:141；本文的SEQ ID NO:2045)、VPWMEPAYQRFL(US9475845的SEQ ID NO:142；本文的SEQ ID NO:2046)、DPRATPGS(US9475845的SEQ IDNO:143；本文的SEQ ID NO:2047)、FRPNRAQDYNTN(US9475845的SEQ ID NO:144；本文的SEQID NO:2048)、CTKNSYLMC(US9475845的SEQ ID NO:145；本文的SEQ ID NO:2049)、CXXTXXXGXGC(US9475845的SEQ ID NO:146；本文的SEQ ID NO:2050)、CPIEDRPMC(US9475845的SEQ ID NO:147；本文的SEQ ID NO:2051)、HEWSYLAPYPWF(US9475845的SEQID NO:148；本文的SEQ ID NO:2052)、MCPKHPLGC(US9475845的SEQ ID NO:149；本文的SEQID NO:2053)、RMWPSSTVNLSAGRR(US9475845的SEQ ID NO:150；本文的SEQ ID NO:2054)、SAKTAVSQRVWLPSHRGGEP(US9475845的SEQ ID NO:151；本文的SEQ ID NO:2055)、KSREHVNNSACPSKRITAAL(US9475845的SEQ ID NO:152；本文的SEQ ID NO:2056)、EGFR(US9475845的SEQ ID NO:153；本文的SEQ ID NO:2057)、AGLGVR(US9475845的SEQ ID NO:154；本文的SEQ ID NO:2058)、GTRQGHTMRLGVSDG(US9475845的SEQ ID NO:155；本文的SEQID NO:2059)、IAGLATPGWSHWLAL(US9475845的SEQ ID NO:156；本文的SEQ ID NO:2060)、SMSIARL(US9475845的SEQ ID NO:157；本文的SEQ ID NO:2061)、HTFEPGV(US9475845的SEQID NO:158；本文的SEQ ID NO:2062)、NTSLKRISNKRIRRK(US9475845的SEQ ID NO:159；本文的SEQ ID NO:2063)、LRIKRKRRKRKKTRK(US9475845的SEQ ID NO:160；本文的SEQ ID NO:2064)、GGG、GFS、LWS、EGG、LLV、LSP、LBS、AGG、GRR、GGH和GTV。
在一个实施方案中，AAV血清型可以是或可以具有美国公开号US 20160369298中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于，AAV2的位点特异性突变衣壳蛋白(US 20160369298的SEQ ID NO:97；本文的SEQ ID NO:2065)或其变体，其中所述特异性位点是选自VP1或其片段的位点R447、G453、S578、N587、N587+1、S662的至少一个位点。
此外，US 20160369298中描述的任何突变序列可以是或可以具有但不限于任何以下序列：SDSGASN(US20160369298的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:231；本文的SEQ ID NO:2066)、SPSGASN(US20160369298的SEQ ID NO:2；本文的SEQ ID NO:2067)、SHSGASN(US20160369298的SEQ ID NO:3；本文的SEQ ID NO:2068)、SRSGASN(US20160369298的SEQID NO:4；本文的SEQ ID NO:2069)、SKSGASN(US20160369298的SEQ ID NO:5；本文的SEQ IDNO:2070)、SNSGASN(US20160369298的SEQ ID NO:6；本文的SEQ ID NO:2071)、SGSGASN(US20160369298的SEQ ID NO:7；本文的SEQ ID NO:2072)、SASGASN(US20160369298的SEQID NO:8、175和221；本文的SEQ ID NO:2073)、SESGTSN(US20160369298的SEQ ID NO:9；本文的SEQ ID NO:2074)、STTGGSN(US20160369298的SEQ ID NO:10；本文的SEQ ID NO:2075)、SSAGSTN(US20160369298的SEQ ID NO:11；本文的SEQ ID NO:2076)、NNDSQA(US20160369298的SEQ ID NO:12；本文的SEQ ID NO:2077)、NNRNQA(US20160369298的SEQID NO:13；本文的SEQ ID NO:2078)、NNNKQA(US20160369298的SEQ ID NO:14；本文的SEQID NO:2079)、NAKRQA(US20160369298的SEQ ID NO:15；本文的SEQ ID NO:2080)、NDEHQA(US20160369298的SEQ ID NO:16；本文的SEQ ID NO:2081)、NTSQKA(US20160369298的SEQID NO:17；本文的SEQ ID 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NO:2214)、TCAAMAMMAVNSRVCSRSAACAACAACAGTRASTTCTCGTGGMMAGGA(US20160369298的SEQ ID NO:101；本文的SEQ ID NO:2215)、AAGSAARRCRSCRVSRVARVCRATRYCGMSNHCRVMVRSGTC(US20160369298的SEQ ID NO:102；本文的SEQ ID NO:2216)、CAGVVSVVSMRSRVCVNSGCAGCTDHCVVSRNSGTCVMSACA(US20160369298的SEQ ID NO:103；本文的SEQID NO:2217)、AACTWCRVSVASMVSVHSDDTGTGSWSTKSACT(US20160369298的SEQ ID NO:104；本文的SEQ ID NO:2218)、TTGTTGAACATCACCACGTGACGCACGTTC(US20160369298的SEQ ID NO:256；本文的SEQ ID NO:2219)、TCCCCGTGGTTCTACTACATAATGTGGCCG(US20160369298的SEQID NO:257；本文的SEQ ID NO:2220)、TTCCACACTCCGTTTTGGATAATGTTGAAC(US20160369298的SEQ ID NO:258；本文的SEQ ID NO:2221)、AGGGACATCCCCAGCTCCATGCTGTGGTCG(US20160369298的SEQ ID NO:259；本文的SEQ ID NO:2222)、AGGGACAACCCCTCCGACTCGCCCTAATCC(US20160369298的SEQ ID NO:260；本文的SEQ ID NO:2223)、TCCTAGTAGAAGACACCCTCTCACTGCCCG(US20160369298的SEQ ID NO:261；本文的SEQID NO:2224)、AGTACCATGTACACCCACTCTCCCAGTGCC(US20160369298的SEQ ID NO:262；本文的SEQ ID NO:2225)、ATATGGACGTTCATGCTGATCACCATACCG(US20160369298的SEQ ID NO:263；本文的SEQ ID NO:2226)、AGCAGGAGCTCCTTGGCCTCAGCGTGCGAG(US20160369298的SEQID NO:264；本文的SEQ ID NO:2227)、ACAAGCAGCTTCACTATGACAACCACTGAC(US20160369298的SEQ ID NO:265；本文的SEQ ID NO:2228)、CAGCCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGAGAGTCTCAAMAMMAVNSRVCSRSAACAACAACAGTRASTTCTCCTGGMMAGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCCGGACCAGCTATGGCAAGCCACRRGGACRRCRMSRRSARSTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGSAARRCRSCRVSRVARVCRATRYCGMSNHCRVMVRSGTCATGATTACAGACGAAGAGGAGATCTGGAC(US20160369298的SEQ ID NO:266；本文的SEQ ID NO:2229)、TGGGACAATGGCGGTCGTCTCTCAGAGTTKTKKT(US20160369298的SEQ ID NO:267；本文的SEQ ID NO:2230)、AGAGGACCKKTCCTCGATGGTTCATGGTGGAGTTA(US20160369298的SEQ ID NO:268；本文的SEQ ID NO:2231)、CCACTTAGGGCCTGGTCGATACCGTTCGGTG(US20160369298的SEQ ID NO:269；本文的SEQ ID NO:2232)和TCTCGCCCCAAGAGTAGAAACCCTTCSTTYYG(US20160369298的SEQ IDNO:270；本文的SEQ ID NO:2233)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以包含国际专利公开WO2016134375中所述的眼细胞靶向肽，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于WO2016134375的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。此外，可以将WO2016134375中描述的任何眼细胞靶向肽或氨基酸插入任何亲本AAV血清型，例如但不限于AAV2(WO2016134375的SEQ ID NO:8；本文的SEQ ID NO:2234)或AAV9(WO2016134375的SEQ ID NO:11；本文的SEQ ID NO:2235)。在一些实施方案中，在AAV2蛋白P34-A35、T138-A139、A139-P140、G453-T454、N587-R588和/或R588-Q589处进行修饰，例如插入。在某些实施方案中，在AAV9的D384、G385、1560、T561、N562、E563、E564、E565、N704和/或Y705处进行插入。眼细胞靶向肽可以是但不限于以下任何氨基酸序列：GSTPPPM(WO2016134375的SEQ ID NO:1；本文的SEQ ID NO:2236)或GETRAPL(WO2016134375的SEQ ID NO:4；本文的SEQ ID NO:2237)。
在一些实施方案中，可以如美国公开号US 20170145405中所述修饰AAV血清型，其内容通过引用整体并入本文。AAV血清型可包括修饰的AAV2(例如，在Y444F、Y500F、Y730F和/或S662V处的修饰)、修饰的AAV3(例如，在Y705F、Y731F和/或T492V处的修饰)和修饰的AAV6(例如，在S663 V和/或T492V处的修饰)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以如国际公开WO2017083722所述地修饰，其内容通过引用整体并入本文。AAV血清型可能包括AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3(Y705+731F)、AAV5、AAV 5(Y436+693+719F)、AAV6(VP3变体Y705F/Y731F/T492V)、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3变体Y731F)和AAV10(Y733F)。
在一些实施方案中，AAV血清型可包含如国际专利公开WO2017015102中所述的工程化表位，其内容通过引用整体并入本文，所述工程化表位包含氨基酸SPAKFA(WO2017015102的SEQ ID NO:24；本文为SEQ ID NO:2238)或NKDKLN(WO2017015102的SEQID NO:2；本文为SEQ ID NO:2239)。可以将表位插入基于AAV8的VP1衣壳的编号(WO2017015102的SEQ ID NO:3)氨基酸665至670和/或AAV3B的残基664至668(SEQ ID NO:3)，的区域中。
在一个实施方案中，AAV血清型可以是或可以具有国际专利公开WO2017058892中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于具有衣壳蛋白的AAV变体，其可包含AAV1的氨基酸残基262-268、370-379、451-459、472-473、493-500、528-534、547-552、588-597、709-710、716-722的一个或多个(例如2、3、4、5、6或7)处(以任意组合)或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或禽AAV的等同氨基酸残基处的取代。氨基酸取代可以是但不限于WO2017058892中描述的任何氨基酸序列。在一个实施方案中，AAV可包含在以下残基处的氨基酸取代：AAV1(WO2017058892的SEQ ID NO:l)的256L、258K、259Q、261S、263A、264S、265T、266G、272H、385S、386Q、S472R、V473D、N500E 547S、709A、710N、716D、717N、718N、720L、A456T、Q457T、N458Q、K459S、T492S、K493A、S586R、S587G、S588N、T589R和/或722T(以任意组合)；AAV5(WO2017058892的SEQ ID NO:5)的244N、246Q、248R、249E、250I、251K、252S、253G、254S、255V、256D、263Y、377E、378N、453L、456R、532Q、533P、535N、536P、537G、538T、539T、540A、541T、542Y、543L、546N、653V、654P、656S、697Q、698F、704D、705S、706T、707G、708E、709Y和/或710R(以任意组合)；AAV5(WO2017058892的SEQ ID NO:5)的248R、316V、317Q、318D、319S、443N、530N、531S、532Q 533P、534A、535N、540A、541T、542Y、543L、545G、546N、697Q、704D、706T、708E、709Y和/或710R(以任意组合)；AAV6(SEQ ID NO:6WO2017058892)的264S、266G、269N、272H、457Q、588S和/或589I(以任意组合)；AAV8(SEQ ID NO:8WO2017058892)的457T、459N、496G、499N、500N、589Q、590N和/或592A(以任意组合)；AAV9(SEQ ID NO:9WO2017058892)的451I、452N、453G、454S、455G、456Q、457N和/或458Q(以任意组合)。
在一些实施方案中，AAV可包含国际公开号WO 2017066764中所述的VP1的155、156和157位或VP2的17、18、19和20位的氨基酸序列，其内容为本文通过引用整体并入。氨基酸序列可以是但不限于N-S-S、S-X-S、S-S-Y、N-X-S、N-S-Y、S-X-Y和N-X-Y，其中N、X和Y独立地是但不限于非丝氨酸或非苏氨酸氨基酸，其中AAV可以是但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。在一些实施方案中，AAV可包含在VP1的156、157或158位或VP2的19、20或21位的至少一个氨基酸的缺失，其中AAV可以是但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
在一个实施方案中，可以使用Hui等人(Molecular Therapy–Methods&ClinicalDevelopment(2015)2,15029doi:10.1038/mtm.2015.29；其内容通过引用整体并入本文)描述的方法识别包含在AAV血清型中的肽。作为非限制性实例，该方法包括分离人脾细胞，使用跨越(spanning)AAV衣壳蛋白的氨基酸序列的个体肽体外再刺激脾细胞，使用用于体外再刺激的个体肽的IFN-γELISpot，用于确定由IFN-γELISpot识别的15-mer的HLA限制的生物信息学分析，给定HLA等位基因的候选反应性9-mer表位的识别，合成候选9-mer，对携带预期识别的AAV表位与之结合的HLA等位基因的受试者的脾细胞进行第2次IFN-γELISpot筛选，确定AAV衣壳反应性CD8+T细胞表位，并确定受试者对给定AAV表位反应的频率。
在一个实施方案中，AAV可以是由Deverman等人(Nature Biotechnology342):204-209(2016))描述的基于Cre重组的AAV靶向进化(CREATE)产生的血清型，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，与其他AAV血清型相比，以这种方式产生的AAV血清型具有改善的CNS转导和/或神经元和星形胶质细胞嗜性。作为非限制性实例，AAV血清型可以是PHP.B、PHP.B2、PHP.B3、PHP.A、G2A12、G2A15。在一个实施方案中，这些AAV血清型可以是在氨基酸588-589之间具有7氨基酸插入物的AAV9(SEQ ID NO:126和127)衍生物。这些7氨基酸插入物的非限制性实例包括LAVPFK(SEQ ID NO:873)、SVSKPFL(SEQ ID NO:1249)、FTLTTPK(SEQ ID NO:882)、YTLSQGW(SEQ ID NO:888)、QAVRTSL(SEQ ID NO:914)和/或LAKERLS(SEQ ID NO:915)。
在一个实施方案中，AAV血清型可以如Jackson等，Frontiers in MolecularNeuroscience 9:154(2016))中所述，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，AAV血清型是PHP.B或AAV9。在一些实施方案中，与使用更普遍的启动子(即，CBA或CMV)相比，AAV血清型与突触蛋白启动子配对以增强神经元转导。
在一个实施方案中，可以通过以下识别包含在AAV血清型中的肽：分离人脾细胞，使用跨越(spanning)AAV衣壳蛋白的氨基酸序列的个体肽体外再刺激脾细胞，使用用于体外再刺激的个体肽的IFN-γELISpot，用于确定由IFN-γELISpot识别的15-mer的给定等位基因限制的生物信息学分析，给定等位基因的候选反应性9-mer表位的识别，合成候选9-mer，对携带预期识别的AAV表位与之结合的特异性等位基因的受试者的脾细胞进行第2次IFN-γELISpot筛选，确定AAV衣壳反应性CD8+T细胞表位，并确定受试者对给定AAV表位反应的频率。
包含编码siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV颗粒可以制备或衍生自多种AAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8和AAV-DJ。在某些情况下，可以将不同血清型的AAV混合在一起或与其他类型的病毒混合，以产生嵌合AAV颗粒。作为非限制性实例，AAV颗粒衍生自AAV9血清型。
病毒基因组
在一个实施方案中，如所示，AAV颗粒包含具有有效载荷区的病毒基因组。
在一个实施方案中，病毒基因组可包含如图1所示的组分。有效载荷区110位于病毒基因组100内。在病毒基因组100的5’和/或3’端可以存在至少一个反向末端重复序列(ITR)120。在5’ITR 120和有效载荷区110之间，可以存在启动子区130。在一个实施方案中，有效载荷区可包含至少一个调节性多核苷酸。
在一个实施方案中，病毒基因组100可包含如图2所示的组分。有效载荷区110位于病毒基因组100内。在病毒基因组100的5’和/或3’端可以存在至少一个反向末端重复序列(ITR)120。在5’ITR 120和有效载荷区110之间，可以存在启动子区130。在启动子区130和有效载荷区110之间，可以存在内含子区140。在一个实施方案中，有效载荷区可包含至少一个调节性多核苷酸。
在一个实施方案中，病毒基因组100可包含如图3所示的组分。在病毒基因组100的5’和/或3’端可以存在至少一个反向末端重复序列(ITR)120。在病毒基因组100中，可以存在一个增强子区150、一个启动子区130、一个内含子区140和一个有效载荷区110。在一个实施方案中，有效载荷区可包含至少一个调节性多核苷酸。
在一个实施方案中，病毒基因组100可包含如图4所示的组分。在病毒基因组100的5’和/或3’端可以存在至少有一个反向末端重复序列(ITR)120。在病毒基因组100中，可以存在一个增强子区150、一个启动子区130、一个内含子区140、一个有效载荷区110和一个聚腺苷酸化信号序列区160。在一个实施方案中，有效载荷区可包含至少一个调节性多核苷酸。
在一个实施方案中，病毒基因组100可包含如图5所示的组分。在病毒基因组100的5’和/或3’端，可以存在至少一个反向末端重复序列(ITR)120。在病毒基因组100中，可以存在至少一个MCS区170、一个增强子区150、一个启动子区130、一个内含子区140、一个有效载荷区110和一个聚腺苷酸化信号序列区160。在一个实施方案中，有效载荷区可包含至少一个调节性多核苷酸。
在一个实施方案中，病毒基因组100可包含如图6所示的组分。在病毒基因组100的5’和/或3’端，可以存在至少一个反向末端重复序列(ITR)120。在病毒基因组100内，可以存在至少一个MCS区170、一个增强子区150、一个启动子区130、至少一个外显子区域180、至少一个内含子区140、一个有效载荷区110和一个聚腺苷酸化信号序列地区160。在一个实施方案中，有效载荷区可包含至少一个调节性多核苷酸。
在一个实施方案中，病毒基因组100可包含如图7和8所示的组分。在病毒基因组100中，可以存在至少一个启动子区130和一个有效载荷区110。一个实施方案中，有效载荷区可包含至少一个调节性多核苷酸。
在一个实施方案中，病毒基因组100可包含如图9所示的组分。在病毒基因组100中，可以存在至少一个启动子区130、一个有效载荷区110和一个聚腺苷酸化信号序列区160。在一个实施方案中，有效载荷区可包含至少一个调节性多核苷酸。
病毒基因组大小
在一个实施方案中，包含本文描述的有效载荷的病毒基因组可以是单链或双链病毒基因组。病毒基因组的大小可以是小、中等、大或最大大小。另外，病毒基因组可包含启动子和polyA尾。
在一个实施方案中，包含本文描述的有效载荷的病毒基因组可以是小单链病毒基因组。小单链病毒基因组的大小可以是2.7至3.5kb，例如约2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4和3.5kb。作为非限制性实例，小单链病毒基因组的大小可以是3.2kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polyA尾。
在一个实施方案中，包含本文描述的有效载荷的病毒基因组可以是小双链病毒基因组。小双链病毒基因组的大可以是1.3到1.7kb，例如约1.3、1.4、1.5、1.6和1.7kb。作为非限制性实例，小双链病毒基因组的大小可以是1.6kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polyA尾。
在一个实施方案中，包含本文描述的有效载荷的病毒基因组可以是中等单链病毒基因组。中等单链病毒基因组的大小可以是3.6至4.3kb，例如约3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2和4.3kb。作为非限制性实例，中等单链病毒基因组的大小可以是4.0kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polyA尾。
在一个实施方案中，包含本文描述的有效载荷的病毒基因组可以是中等双链病毒基因组。中等双链病毒基因组的大小可以是1.8至2.1kb，例如约1.8、1.9、2.0和2.1kb。作为非限制性实例，中等双链病毒基因组的大小可以是2.0kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polyA尾。
在一个实施方案中，包含本文描述的有效载荷的病毒基因组可以是大单链病毒基因组。大单链病毒基因组的大小可能为4.4至6.0kb，例如约4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9和6.0kb。作为非限制性实例，大单链病毒基因组的大小可以是4.7kb。作为另一个非限制性实例，大单链病毒基因组的大小可以是4.8kb。作为又一个非限制性实例，大单链病毒基因组的大小可以是6.0kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polyA尾。
在一个实施方案中，包含本文描述的有效载荷的病毒基因组可以是大双链病毒基因组。大双链病毒基因组的大小可以是2.2至3.0kb，例如约2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0kb。作为非限制性实例，大双链病毒基因组的大小可以是2.4kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polyA尾。
病毒基因组组分：反向末端重复序列(ITR)
本发明的AAV颗粒包含具有至少一个ITR区和一个有效载荷区的病毒基因组。在一个实施方案中，病毒基因组具有两个ITR。这两个ITR位于有效载荷区的侧翼，在5’和3’端。ITR用作包含复制识别位点的复制的起点。ITR包含可以互补和对称排列的序列区。掺入本发明的病毒基因组中的ITR可以由天然存在的多核苷酸序列或重组衍生的多核苷酸序列组成。
ITR可以衍生自与衣壳相同的血清型，选自表1中列出的任何血清型或其衍生物。ITR可以具有与衣壳具有不同的血清型。在一个实施方案中，AAV颗粒具有多于一个ITR。在非限制性实例中，AAV颗粒具有包含两个ITR的病毒基因组。在一个实施方案中，ITR具有彼此相同的血清型。在另一个实施方案中，ITR具有不同的血清型。非限制性实例包括具有与衣壳相同血清型的零个、一个或两个ITR。在一个实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组的两个ITR均为AAV2 ITR。
独立地，每个ITR可以具有约100-150个核苷酸长度。ITR可以具有约100-105个核苷酸长度、106-110个核苷酸长度、111-115个核苷酸长度、116-120个核苷酸长度、121-125个核苷酸长度、126-130个核苷酸长度、131-135个核苷酸长度、136-140个核苷酸长度、141-145个核苷酸长度或146-150个核苷酸长度。在一个实施方案中，ITR具有140-142个核苷酸长度。ITR长度的非限制性实例是102、140、141、142、145个核苷酸长度，以及与其具有至少95％同一性的核苷酸。
在一个实施方案中，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，该siRNA分子可以位于表达载体中flip ITR的5’端附近。在另一个实施方案中，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，该核酸序列可以位于表达载体中flip ITR的3’端附近。在又一个实施方案中，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，该核酸序列可以位于表达载体中flop ITR的5’端附近。在又一个实施方案中，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，该核酸序列可以位于表达载体中flop ITR的3’端附近。在一个实施方案中，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，该核酸序列可以位于表达载体中flip ITR的5’端和flop ITR的3’端之间。在一个实施方案中，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，该核酸序列可以位于表达载体中flipITR的3’端和flop ITR的5’端之间(例如，在flip ITR的5’端与flop ITR的3’端或在flopITR的3’端和flip ITR的5’端之间的中间)。作为非限制性实例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，该核酸序列可位于表达载体中ITR(例如Flip或Flop ITR)的5’或3’端下游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。作为非限制性实例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，该核酸序列可位于表达载体中ITR(例如Flip或Flop ITR)的5’或3’端上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，该核酸序列可以位于表达载体中ITR(例如Flip或Flop ITR)的5’或3’端下游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，该核酸序列可以位于表达载体中ITR(例如Flip或Flop ITR)的5’或3’端上游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。作为非限制性实例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，该核酸序列可位于表达载体中ITR(例如Flip或Flop ITR)的5’或3’端上游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或大于25％的核苷酸内。作为另一个非限制性实例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，该核酸序列可位于表达载体中ITR(例如Flip或Flop ITR)的5’或3’端下游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或大于25％的核苷酸内。
病毒基因组组分：启动子
在一个实施方案中，病毒基因组的有效载荷区包含至少一种增强转基因靶特异性和表达的元件(参见例如Powell等人，Viral Expression Cassette Elements to EnhanceTransgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy,2015；其内容通过引用整体并入本文)。增强转基因靶特异性和表达的元件的非限制性实例包括启动子、内源性miRNA、转录后调控元件(PRE)、聚腺苷酸化(PolyA)信号序列和上游增强子(USE)、CMV增强子和内含子。
本领域技术人员可以认识到，本发明的多肽在靶细胞中的表达可能需要特异性启动子，包括但不限于物种特异性、诱导型、组织特异性或细胞周期特异性的启动子。(Parr等人,Nat.Med.3:1145-9(1997)；其内容通过引用整体并入本文)。
在一个实施方案中，当启动子驱动在AAV颗粒的病毒基因组的有效载荷区中编码的多肽的表达时，该启动子被认为是有效的。
在一个实施方案中，启动子是被认为有效驱动调节性多核苷酸表达的启动子。
在一个实施方案中，启动子是当其在待靶向的细胞中驱动表达时被认为有效的启动子。
在一个实施方案中，启动子驱动有效载荷在靶组织中表达一段时间。由启动子驱动的表达可以持续1小时、2,小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1个星期、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2个星期、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3个星期、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或多于10年。表达可以持续1-5小时、1-12小时、1-2天、1-5天、1-2个星期、1-3个星期、1-4个星期、1-2个月、1-4个月、1-6个月、2-6个月、3-6个月、3-9个月、4-8个月、6-12个月、1-2年、1-5年、2-5年、3-6年、3-8年、4-8年或5-10年。
在一个实施方案中，启动子驱动有效负载的表达持续至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年、23年、24年、25年、26年、27年、28年、29年、30年、31年、32年、33年、34年、35年、36年、37年、38年、39年、40年、41年、42年、43年、44年、45年、46年、47年、48年、49年、50年、55年、60年、65年或多于65年。
启动子可以是天然存在的或非天然存在的。启动子的非限制性实例包括病毒启动子、植物启动子和哺乳动物启动子。在一些实施方案中，启动子可以是人启动子。在一些实施方案中，启动子可以被截短。
在大多数组织中驱动或启动表达的启动子包括但不限于人延伸因子1α亚基(EF1α)、巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β葡萄糖醛酸苷酸酶(GUSB)或泛素C(UBC)。组织特异性表达元件可用于将表达限制于某些细胞类型，例如但不限于肌肉特异性启动子、B细胞启动子、单核细胞启动子、白细胞启动子、巨噬细胞启动子、胰腺腺泡细胞启动子、内皮细胞启动子、肺组织启动子、星形胶质细胞启动子或神经系统启动子，其可用于将表达限制于神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。
肌肉特异性启动子的非限制性实例包括哺乳动物肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物结蛋白(DES)启动子、哺乳动物肌钙蛋白I(TNNI2)启动子和哺乳动物骨骼α-肌动蛋白(ASKA)启动子(参见例如美国专利公开US20110212529，其内容通过引用整体并入本文)。
神经元的组织特异性表达元件的非限制性实例包括神经元特异性烯醇化酶(NSE)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)、突触蛋白(Syn)、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)、神经丝轻肽(neurofilament light,NFL)或神经丝重肽(neurofilament heavy,NFH)、β-球蛋白小基因nβ2、前脑啡肽原(PPE)、脑啡肽(Enk)和兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)启动子。星形胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例包括神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和EAAT2启动子。少突胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例包括髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子。
在一个实施方案中，启动子可以小于1kb。启动子的长度可以是200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或多于800个核苷酸。启动子的长度可以是200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800。
在一个实施方案中，启动子可以是相同或不同的起始或亲本启动子的两个或更多个组分的组合，例如但不限于CMV和CBA。每个组分的长度可以是200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或多于800。每个组分的长度可以是200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800。在一个实施方案中，启动子是382个核苷酸的CMV-增强子序列和260个核苷酸的CBA-启动子序列的组合。
在一个实施方案中，病毒基因组包含遍在启动子。遍在启动子的非限制性实例包括CMV、CBA(包括衍生物CAG、CBh等)、EF-1α、PGK、UBC、GUSB(hGBp)和UCOE(HNRPA2B1-CBX3的启动子)。
Yu等人(Molecular Pain 2011,7:63；其内容通过引用整体并入本文)使用慢病毒载体评估了eGFP在大鼠DRG细胞和原代DRG细胞中在CAG、EFIα、PGK和UBC启动子下的表达，发现UBC显示出比其他3种启动子更弱的表达，并且所有启动子仅观察到10-12％的神经胶质表达。Soderblom等人(E.Neuro 2015；其内容通过引用整体并入本文)评价了在运动皮质注射后，eGFP在具有CMV和UBC启动子的AAV8中和在具有CMV启动子的AAV2中的表达。鼻内施用含有UBC或EFIα启动子的质粒显示比用CMV启动子表达更强的持续气道表达(参见，例如，Gill等人，Gene Therapy 2001，第8卷，1539-1546；其内容为通过引用整体并入本文)。Husain等人(Gene Therapy 2009；其内容通过引用整体并入本文)评估了具有hGUSB启动子、HSV-1LAT启动子和NSE启动子的HβH构建体，并且发现HβH构建体在小鼠脑中显示出比NSE弱的表达。Passini和Wolfe(J.Virol.2001,12382-12392，其内容通过引用整体并入本文)评估了在新生小鼠脑室内注射后HβH载体的长期作用，并发现其持续表达至少一年。Xu等人(Gene Therapy 2001,8,1323-1332；其内容通过引用整体并入本文)发现，与CMV-lacZ、CMV-luc、EF、GFAP、hENK、nAChR、PPE、PPE+wpre、NSE(0.3kb)、NSE(1.8kb)和NSE(1.8kb+wpre)相比，当使用NFL和NFH启动子时，在所有脑区域中表达低。Xu等人发现启动子活性按照降序是NSE(1.8kb)、EF、NSE(0.3kb)、GFAP、CMV、hENK、PPE、NFL和NFH。NFL是一个650个核苷酸的启动子，而NFH是一个920个核苷酸的启动子，它们在肝脏中都不存在，但是NFH在感觉本体感受神经元、大脑和脊髓中含量丰富，并且NFH存在于心脏中。Scn8a是一个470个核苷酸的启动子，可在整个DRG、脊髓和脑中表达，并在海马神经元和小脑浦肯野细胞、皮质、丘脑和下丘脑中表现出特别高的表达(参见例如Drews等人Identification ofevolutionary conserved,functional noncoding elements in the promoter regionof the sodium channel gene SCN8A,Mamm Genome(2007)18:723-731；和Raymond等人Expression of Alternatively Spliced Sodium Channelα-subunit genes,Journal ofBiological Chemistry(2004)279(44)46234-46241；其全部内容通过引用整体并入本文)。
由前述Yu、Soderblom、Gill、Husain、Passini、Xu、Drews或Raymond教导的任何启动子都可以用于本发明。
在一个实施方案中，启动子不是细胞特异性的。
在一个实施方案中，该启动子是泛素c(UBC)启动子。UBC启动子可以具有300-350个核苷酸的大小。作为非限制性实例，UBC启动子是332个核苷酸。
在一个实施方案中，启动子是β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)启动子。GUSB启动子的大小可以是350-400个核苷酸。作为非限制性实例，GUSB启动子是378个核苷酸。
在一个实施方案中，启动子是神经丝轻肽(NFL)启动子。NFL启动子可以具有600-700个核苷酸的大小。作为非限制性实例，NFL启动子是650个核苷酸。作为非限制性实例，构建体可以是AAV启动子-CMV/球蛋白内含子调节性多核苷酸-RBG，其中AAV可以是自互补的，而AAV可以是DJ血清型。
在一个实施方案中，启动子是神经丝重肽(FH)启动子。NFH启动子可以具有900-950个核苷酸的大小。作为非限制性实例，NFH启动子为920个核苷酸。作为非限制性实例，构建体可以是AAV-启动子-CMV/球蛋白内含子-调节性多核苷酸-RBG，其中AAV可以是自互补的并且AAV可以是DJ血清型。
在一个实施方案中，启动子是scn8a启动子。scn8a启动子的大小可以是450-500个核苷酸。作为非限制性实例，scn8a启动子为470个核苷酸。作为非限制性实例，构建体可以是AAV启动子-CMV/球蛋白内含子调节性多核苷酸-RBG，其中AAV可以是自我互补的，而AAV可以是DJ血清型。
在一个实施方案中，病毒基因组包含Pol III启动子。
在一个实施方案中，病毒基因组包含P1启动子。
在一个实施方案中，病毒基因组包含FXN启动子。
在一个实施方案中，启动子是磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子。
在一个实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。
在一个实施方案中，启动子是CAG启动子，其是包含与鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子融合的巨细胞病毒(CMV)增强子的构建体。
在一个实施方案中，启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。
在一个实施方案中，病毒基因组包含H1启动子。
在一个实施方案中，病毒基因组包含U6启动子。
在一个实施方案中，启动子是肝脏或骨骼肌启动子。肝启动子的非限制性实例包括人α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)和甲状腺素结合球蛋白(TBG)。骨骼肌启动子的非限制性实例包括结蛋白、MCK或合成C5-12。
在一个实施方案中，启动子是RNA pol III启动子。作为非限制性实例，RNA polIII启动子是U6。作为非限制性实例，RNA pol III启动子是H1。
在一个实施方案中，病毒基因组包含两个启动子。作为非限制性实例，启动子是EF1α启动子和CMV启动子。
在一个实施方案中，病毒基因组包含增强子元件、启动子和/或5’UTR内含子。增强子元件，在本文中也称为“增强子”，可以是但不限于CMV增强子，启动子可以是但不限于CMV、CBA、UBC、GUSB、NSE、突触蛋白、MeCP2和GFAP启动子，并且5’UTR/内含子可以是但不限于SV40和CBA-MVM。作为非限制性实例，组合使用的增强子、启动子和/或内含子可以是：(1)CMV增强子、CMV启动子、SV405’UTR内含子；(2)CMV增强子、CBA启动子、SV 405’UTR内含子；(3)CMV增强子、CBA启动子、CBA-MVM 5’UTR内含子；(4)UBC启动子；(5)GUSB启动子；(6)NSE发起人；(7)突触蛋白启动子；(8)MeCP2启动子、(9)GFAP启动子、(10)H1启动子；和(11)U6启动子。
在一个实施方案中，病毒基因组包含工程化启动子。
在另一个实施方案中，病毒基因组包含来自天然表达的蛋白的启动子。
病毒基因组组分：非翻译区(UTR)
根据定义，基因的野生型未翻译区(UTR)被转录但未翻译。通常，5’UTR在转录起始位点开始并在起始密码子处终止，3’UTR在终止密码子后立即开始，并一直持续到转录终止信号为止。
通常在特定靶器官的大量表达基因中发现的特征可以被工程化为UTR，以增强稳定性和蛋白生产。作为非限制性实例，来自正常在肝脏中表达的mRNA(例如白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、α甲胎蛋白、促红细胞生成素或因子VIII)的5’UTR可以用在本发明的AAV颗粒的病毒基因组中，以增强在肝细胞系或肝脏中的表达。
不希望受到理论的束缚，野生型5’非翻译区(UTR)包括在翻译起始中起作用的特征。通常已知参与核糖体启动许多基因翻译的过程的Kozak序列通常包含在5’UTR中。Kozak序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(ATG)上游3个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后是另一个’G’。
在一个实施方案中，病毒基因组中的5’UTR包括Kozak序列。
在一个实施方案中，病毒基因组中的5’UTR不包括Kozak序列。
不希望受到理论的束缚，已知野生型3’UTR具有嵌入其中的一段腺苷和尿苷。这些富含AU的特征在高周转率的基因中特别普遍。基于它们的序列特征和功能特性，富含AU的元件(ARE)可以分为3类(Chen等人,1995,其内容通过引用整体并入本文)：I类ARE，例如但不限于c-Myc和MyoD，在富含U的区域内包含数个AUUUA基序的分散拷贝。II类ARE，例如但不限于GM-CSF和TNF-a，具有两个或多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。III类ARE的定义不太明确，例如但不限于c-Jun和生肌蛋白(myogenin)。这些富含U的区域不包含AUUUA基序。已知大多数与ARE结合的蛋白都会使信使不稳定，而ELAV家族的成员(最值得注意的是HuR)已被证明可以增加mRNA的稳定性。HuR绑定到所有3类的ARE。将HuR特异性结合位点工程化到核酸分子的3’UTR中将导致HuR结合，并且从而使体内信息稳定。
可以使用3’UTR富含AU的元件(ARE)的引入、去除或修饰来调节多核苷酸的稳定性。当工程化特定多核苷酸，例如病毒基因组的有效载荷区时，可以引入一个或多个ARE拷贝，以使多核苷酸的稳定性降低，从而减少翻译并降低所得蛋白的生产。同样，可以识别并去除或突变ARE，以增加细胞内稳定性，并且从而增加所得蛋白的翻译和生产。
在一个实施方案中，病毒基因组的3’UTR可以包括寡聚(dT)序列，用于模板化添加poly-A尾。
在一个实施方案中，病毒基因组可以包括至少一个miRNA种子、结合位点或完整序列。microRNA(或miRNA或miR)是19-25个核苷酸的非编码RNA，可与核酸靶位点结合并通过降低核酸分子的稳定性或抑制翻译来下调基因表达。microRNA序列包含“种子”区域，即成熟microRNA的2-8位区域中的序列，该序列与核酸的miRNA靶序列具有完美的Watson-Crick互补性。
在一个实施方案中，可以对病毒基因工程化以包含、改变或去除至少一个miRNA结合位点、序列或种子区域。
可将来自本领域已知的任何基因的任何UTR引入AAV颗粒的病毒基因组中。这些UTR或其部分可以以与在选择它们的基因中相同的方向放置，或者可以改变方向或位置。在一个实施方案中，可以将AAV颗粒的病毒基因组中使用的UTR反转、缩短、延长、用本领域已知的一种或多种其他5’UTR或3’UTR制成。如本文所使用的，术语“改变”在涉及UTR时，表示相对于参考序列已经以某种方式改变了UTR。例如，可以通过如上所述的方向或位置的改变来相对于野生型或天然UTR改变3’或5’UTR，或者可以通过包含额外的核苷酸、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转座来改变3’或5’UTR。
在一个实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组包含至少一种人工UTR，其不是野生型UTR的变体。
在一个实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组包含UTR，该UTR选自其蛋白具有共同功能、结构、特征或特性的转录物家族。
病毒基因组组分：聚腺苷酸化序列
在一个实施方案中，本发明的AAV颗粒的病毒基因组包含至少一个聚腺苷酸化序列。AAV颗粒的病毒基因组可以在有效载荷编码序列的3’端与3’ITR的5’端之间包含聚腺苷酸化序列。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列或“polyA序列”的长度范围可以从不存在到约500个核苷酸。聚腺苷酸化序列的长度可以是但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499和500个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是50-100个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是50-150个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是50-160个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是50-200个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是60-100个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是60-150个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是60-160个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是60-200个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是70-100个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是70-150个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是70-160个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是70-200个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是80-100个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是80-150个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是80-160个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是80-200个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是90-100个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是90-150个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是90-160个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是90-200个核苷酸。
在一个实施方案中，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其在表达载体中可位于聚腺苷酸化序列的上游。此外，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其在表达载体中可位于启动子(例如但不限于CMV、U6、CAG、CBA或具有SV40内含子或人β球蛋白内含子的CBA启动子)的下游。作为非限制性实例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或多于25％的核苷酸内。作为非限制性实例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％的核苷酸内。
在一个实施方案中，AAV颗粒包含兔球蛋白聚腺苷酸化(poly A)信号序列。
在一个实施方案中，AAV颗粒包含人生长激素聚腺苷酸化(poly A)信号序列。
病毒基因组组分：内含子
在一个实施方案中，有效载荷区包括至少一个增强表达的元件，例如一个或多个内含子或其部分。内含子的非限制性实例包括MVM(67-97bp)、F.IX截短内含子1(300bp)、β-球蛋白SD/免疫球蛋白重链剪接受体(250bp)、腺病毒剪接供体/免疫球蛋白剪接受体(500bp)、SV40晚期剪接供体/剪接受体(19S/16S)(180bp)和杂种腺病毒剪接供体/IgG剪接受体(230bp)。
在一个实施方案中，内含子或内含子部分的长度可以是100-500个核苷酸。内含子的长度可以是80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500。内含子的长度可以是80-100、80-120、80-140、80-160、80-180、80-200、80-250、80-300、80-350、80-400、80-450、80-500、200-300、200-400、200-500、300-400、300-500或400-500。
在一个实施方案中，AAV病毒基因组可包含启动子，例如但不限于CMV或U6。作为非限制性实例，包含本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV的启动子是CMV启动子。作为另一个非限制性实例，包含本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV的启动子是U6启动子。
在一个实施方案中，AAV病毒基因组可包含CMV启动子。
在一个实施方案中，AAV病毒基因组可以包含U6启动子。
在一个实施方案中，AAV病毒基因组可包含CMV和U6启动子。
在一个实施方案中，AAV病毒基因组可包含H1启动子。
在一个实施方案中，AAV病毒基因组可包含CBA启动子。
在一个实施方案中，编码的siRNA分子在表达载体中可位于启动子的下游，该启动子例如但不限于CMV、U6、H1、CBA、CAG或具有内含子(例如SV40或本领域已知的其他内含子)的CBA启动子。此外，编码的siRNA分子在表达载体中还可位于聚腺苷酸化序列的上游。作为非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个氨基酸内。作为非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。作为非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或多于25％的核苷酸内。作为非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％的核苷酸内。
病毒基因组组分：填充序列
在一个实施方案中，病毒基因组包含一个或多个填充序列。
在一个实施方案中，病毒基因组包含一个或多个填充序列，以使病毒基因组的长度为用于包装的最佳大小。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，以使病毒基因组的长度为约2.3kb。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，以使病毒基因组的长度为约4.6kb。
在一个实施方案中，病毒基因组包含一个或多个填充序列，以减少在表达/或包装过程中载体基因组的发夹结构(例如本文所述的调节性多核苷酸)可以被读作反向末端重复序列(ITR)的可能性。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，以使病毒基因组的长度为约2.3kb。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列以使病毒基因组的长度为约4.6kb。
在一个实施方案中，病毒基因组是单链(ss)病毒基因组，并且包含一个或多个填充序列，其长度为约0.1kb-3.8kb，例如但不限于0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb或3.8kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为3.1kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为2.7kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为0.8kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为0.4kb。作为非限制性实例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.8kb。作为非限制性实例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.4kb。
在一个实施方案中，病毒基因组是自我互补(sc)病毒基因组，并包含一个或多个填充序列，其长度为约0.1kb-1.5kb，例如但不限于0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb或1.5kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为0.8kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为0.4kb。作为非限制性实例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.8kb。作为非限制性实例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.4kb。
在一个实施方案中，病毒基因组包含填充序列的任何部分。病毒基因组可包含填充序列的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一个实施方案中，病毒基因组是单链(ss)病毒基因组，并包含一个或多个填充序列，以使病毒基因组的长度为约4.6kb。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，且该填充序列位于5’ITR序列的3’端。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于启动子序列的5’端。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’端。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于3’ITR序列的5’端。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于两个内含子序列之间。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于内含子序列内。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于5’ITR序列的3’端，第二填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’端。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于启动子序列的5’端，第二填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’端。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于5’ITR序列的3’端，第二填充序列位于5’ITR序列的5’端。
在一个实施方案中，病毒基因组是自我互补(sc)病毒基因组，并包含一个或多个填充序列，以使病毒基因组的长度为约2.3kb。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，且该填充序列位于5’ITR序列的3’端。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于启动子序列的5’端。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’端。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于3’ITR序列的5’端。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于两个内含子序列之间。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于内含子序列内。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于5’ITR序列的3’端，第二填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’端。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于启动子序列的5’端，第二填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于5’ITR序列的3’端，第二填充序列位于5’ITR序列的5’端。
在一个实施方案中，病毒基因组可在病毒基因组的多个区域之一之间包含一个或多个填充序列。在一个实施方案中，填充区域可以位于诸如但不限于有效载荷区、反向末端重复序列(ITR)、启动子区、内含子区、增强子区、聚腺苷酸化信号序列区、多克隆位点(MCS)区和/或外显子区的区域之前。在一个实施方案中，填充区域可以位于诸如但不限于有效载荷区、反向末端重复序列(ITR)、启动子区、内含子区、增强子区、聚腺苷酸化信号序列区、多克隆位点(MCS)区和/或外显子区的区域之后。在一个实施方案中，填充区域可以位于诸如但不限于有效载荷区、反向末端重复序列(ITR)、启动子区、内含子区、增强子区、聚腺苷酸化信号序列区、多克隆位点(MCS)区和/或外显子区之前和之后。
在一个实施方案中，病毒基因组可包含一个或多个将病毒基因组的至少一个区域分叉的填充序列。病毒基因组的分叉区域可包含该区域到填充序列区的5’端1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。作为非限制性实例，填充序列可将至少一个区域分叉，以使该区域的10％位于填充序列的5′端，该区域的90％位于填充序列的3′端。作为非限制性实例，填充序列可将至少一个区域分叉，以使该区域的20％位于填充序列的5′端，该区域的80％位于填充序列的3′端。作为非限制性实例，填充序列可将至少一个区域分叉，以使该区域的30％位于填充序列的5’端，该区域的70％位于填充序列的3’端。作为非限制性实例，填充序列可以将至少一个区域分叉，以使该区域的40％位于填充序列的5′端，该区域的60％位于填充序列的3′端。作为非限制性实例，填充序列可将至少一个区域分叉，以使该区域的50％位于填充序列的5′端，该区域的50％位于填充序列的3′端。作为非限制性实例，填充序列可将至少一个区域分叉，以使该区域的60％位于填充序列的5′端，该区域的40％位于填充序列的3′端。作为非限制性实例，填充序列可以将至少一个区域分叉，以使该区域的70％位于填充序列的5′端，该区域的30％位于填充序列的3′端。作为非限制性实例，填充序列可将至少一个区域分叉，以使该区域的80％位于填充序列的5’端，该区域的20％位于填充序列的3’端。作为非限制性实例，填充序列可以将至少一个区域分叉，以使该区域的90％位于填充序列的5′端，该区域的10％位于填充序列的3′端。
在一个实施方案中，病毒基因组在5’ITR之后包含填充序列。
在一个实施方案中，病毒基因组在启动子区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在有效载荷区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在内含子区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在增强子区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在聚腺苷酸化信号序列区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在MCS区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在外显子区域之后包含填充序列。
在一个实施方案中，病毒基因组在启动子区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在有效载荷区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在内含子区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在增强子区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在聚腺苷酸化信号序列区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在MCS区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在外显子区域之前包含填充序列。
在一个实施方案中，病毒基因组在3’ITR之前包含填充序列。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和启动子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和有效载荷区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和内含子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和增强子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和MCS区。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和外显子区。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和有效载荷区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和内含子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和增强子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和MCS区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和外显子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和3’ITR。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和内含子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和增强子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和MCS区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和外显子区。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和3’ITR。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于内含子区和增强子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于内含子区和聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于内含子区和MCS区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于内含子区和外显子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于内含子区和3’ITR。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于增强子区和聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于增强子区和MCS区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于增强子区和外显子区域。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于增强子区和3’ITR。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于聚腺苷酸化信号序列区和MCS区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于聚腺苷酸化信号序列区和外显子区域。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于聚腺苷酸化信号序列区和3’ITR。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于MCS区和外显子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于MCS区和3’ITR。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于外显子区和3’ITR。
在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于启动子区和有效载荷区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于启动子区和内含子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于启动子区和增强子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于启动子区和聚腺苷酸化信号序列区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于启动子区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于启动子区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于启动子区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于有效载荷区和内含子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于有效载荷区和增强子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于有效载荷区和聚腺苷酸化信号序列区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于有效载荷区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于有效载荷区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于有效载荷区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于内含子区和增强子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于内含子区和聚腺苷酸化信号序列区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于内含子区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于内含子区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于内含子区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于增强子区和聚腺苷酸化信号序列区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于增强子区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于增强子区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于增强子区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于MCS区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于MCS区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，第二填充序列可以位于外显子区和3’ITR之间。
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本发明的有效载荷
本公开的AAV颗粒包括至少一个有效载荷区。如本文所用，“有效载荷”或“有效载荷区”是指由病毒基因组编码或在其中的一个或多个多核苷酸或多核苷酸区，这种多核苷酸或多核苷酸区的表达产物，例如转基因、编码多肽或多重多肽(multi-polypeptide)的多核苷酸，或调节性核酸(modulatory nucleic acid)或调控核酸(regulatory nucleicacid)。本发明的有效载荷通常编码调节性多核苷酸或其片段或变体。
有效载荷区可以构建成反映与mRNA的天然组织相似或镜像的区域。
有效载荷区可以包含编码和非编码核酸序列的组合。
在一些实施方案中，AAV有效载荷区可以编码编码RNA或非编码RNA。
在一个实施方案中，AAV颗粒包含具有有效载荷区的病毒基因组，该有效载荷区包含编码siRNA、miRNA或其他RNAi物质的核酸序列。在这样的实施方案中，可以复制编码多于一个多肽的病毒基因组，并将其包装到病毒颗粒中。用病毒颗粒转导的靶细胞可以在单个细胞内表达编码的siRNA、miRNA或其他RNAi物质。
调节性多核苷酸
在一个实施方案中，可将调节性多核苷酸(如RNA或DNA分子)用于治疗神经退行性疾病，特别是肌萎缩性侧索硬化(ALS)。如本文所用，“调节性多核苷酸”是起到调节(增加或降低)靶基因的水平或量(例如mRNA或蛋白质水平)的作用的任何核酸序列。
在一个实施方案中，调节性多核苷酸可包含至少一种编码至少一种siRNA分子的核酸序列。如果有多于一个，则核酸可以独立地编码1、2、3、4、5、6、7、8、9或多于9个的siRNA分子。
在一个实施方案中，分子支架可以位于CMV启动子，其片段或变体的下游。
在一个实施方案中，分子支架可以位于CBA启动子，其片段或变体的下游。
在一个实施方案中，分子支架可以是位于CMV启动子下游的天然pri-miRNA支架。作为非限制性实例，天然pri-miRNA支架来自人miR155支架。
在一个实施方案中，分子支架可以是位于CBA启动子下游的天然pri-miRNA支架。
在一个实施方案中，分子支架和调节性多核苷酸的选择是通过比较pri-miRNA中调节性多核苷酸的方法来确定的(例如，参见Miniarikova等人Design,Characterization,and Lead Selection of Therapeutic miRNAs Targeting Huntingtin for Developmentof Gene Therapy for Huntington’s Disease.Molecular Therapy-Nucleic Acids(2016)5,e297和国际公开号WO2016102664描述的方法；其各自内容通过引用整体并入本文)。为了评估调节性多核苷酸的活性，可以使用的分子支架是人pri-miRNA支架(例如，miR155支架)，启动子可以是CMV。可以使用HEK293T细胞和报道分子(例如，荧光素酶)在体外确定活性。
为了评估调节性多核苷酸的最佳分子支架，将调节性多核苷酸用于具有CAG启动子的pri-miRNA支架中。将构建体与报道分子(例如，荧光素酶报道分子)以50ng共转染。在50ng共转染时具有大于80％敲低的构建体被认为是有效的。一方面，优选具有强引导链活性的构建体。分子支架可以通过NGS在HEK293T细胞中进行处理，以确定引导-过客链比以及处理的变异性。
为了在体内评估分子支架和调节性多核苷酸，将包含调节性多核苷酸的分子支架包装在AAV中(例如，血清型可以是AAV5(参见例如WO2015060722中描述的方法和构建体，其内容通过引用整体并入本文))并施用于体内模型，引导-过客链比、5’和3’端加工、引导链与过客链的比和敲低可以在模型的不同区域(例如组织区域)确定。
在一个实施方案中，分子支架和调节性多核苷酸的选择通过比较天然pri-miRNA和合成pri-miRNA中的调节性多核苷酸的方法来确定。调节性多核苷酸可以是但不限于靶向除外显子1以外的外显子。为了评估调节性多核苷酸的活性，分子支架与CBA启动子一起使用。一方面，可以使用HEK293T细胞、HeLa细胞和报道分子(例如，荧光素酶)在体外测定活性，并且敲低有效调节性多核苷酸显示在所测试的细胞中敲低了至少80％的SOD1。另外，被认为是最有效的调节性多核苷酸显示出低至无显著的过客链(p链)活性。在另一方面，通过使用HEK293T细胞、HeLa细胞和报道基因在体外转染来评估内源性SOD1敲低效率。有效的调节性多核苷酸显示出超过50％的内源性SOD1敲低。在另一方面，通过感染(例如AAV2)在不同细胞类型(例如，HEK293、HeLa、原代星形胶质细胞、U251星形胶质细胞、SH-SY5Y神经元细胞和来自ALS患者的成纤维细胞)中评估内源性SOD1敲低的效率。有效的调节性多核苷酸显示出超过60％的内源性SOD1敲低。
为了在体内评估分子支架和调节性多核苷酸，将包含调节性多核苷酸的分子支架包装在AAV中并施用于体内模型，并且引导-过客链比、5’和3’端加工、引导与过客链的比和敲低可以在模型的不同区域(例如组织区域)中确定。分子支架可以通过NGS从体内样品中处理出来，以确定引导-过客链比以及加工变异性。
在一个实施方案中，使用以下特性中的至少一种来设计调节性多核苷酸：环变体、种子错配/凸起/摆动变体、茎错配、环变体和附生茎错配变体(vassal stem mismatchvariant)、种子错配和基茎错配变体(basal stem mismatch variant)、茎错配和基茎错配变体、种子摆动和基茎摆动变体或茎序列变体。
siRNA分子
本发明涉及用于治疗神经变性疾病的RNA干扰(RNAi)诱导的基因表达抑制。本文提供了靶向目标基因的siRNA双链体或编码的dsRNA(本文统称为“siRNA分子”)。此类siRNA双链体或编码的dsRNA可减少或沉默细胞(例如但不限于中型多棘神经元、皮质神经元和/或星形胶质细胞)中的基因表达。
RNAi(也称为转录后基因沉默(PTGS)、压抑或共抑制)是转录后基因沉默的过程，其中RNA分子以序列特异性方式抑制基因表达，通常是通过导致破坏特异性的mRNA分子。RNAi的活性组分是短/小双链RNA(dsRNA)，称为小干扰RNA(siRNA)，其通常包含15-30个核苷酸(例如19至25、19至24或19-21个核苷酸)和2个核苷酸的3’突出端，且其与靶基因的核酸序列匹配。这些短RNA物质可能是由Dicer介导的较大dsRNA的裂解在体内自然产生的，并且它们在哺乳动物细胞中具有功能。
天然表达的小RNA分子，称为microRNA(miRNA)，通过调节mRNA的表达引起基因沉默。包含RNA诱导沉默复合物(RISC)的miRNA靶向与在miRNA的5’区(称为种子区)和其他具有3’区的碱基对呈完美序列互补性的mRNA。miRNA介导的基因表达下调可能是由靶标mRNA的切割、靶标mRNA的翻译抑制或mRNA降解引起的。miRNA靶向序列通常位于靶mRNA的3’-UTR中。单个miRNA可以靶向来自多种基因的超过100个转录物，而一个mRNA可以被不同的miRNA靶向。
可以设计和合成靶向特定mRNA的siRNA双链体或dsRNA，并在体外合成并引入细胞中以激活RNAi过程。Elbashir等人证明了21个核苷酸的siRNA双链体(称为小干扰RNA)能够在不诱导哺乳动物细胞的免疫应答的情况下有效地强烈且特异性地敲低基因(ElbashirSM等人,Nature,2001,411,494-498)。自从这份初步报告以来，通过siRNA进行转录后基因沉默迅速成为哺乳动物细胞遗传分析的有力工具，并具有产生新疗法的潜力。
设计为靶向于编码引起多谷氨酰胺扩增疾病(例如亨廷顿病)的聚谷氨酰胺重复蛋白的核酸序列的RNAi分子描述于美国专利号9,169,483和9,181,544和国际专利公开号WO2015179525，其全部内容通过引用整体并入本文。美国专利号9,169,483和9,181,544和国际专利公开号WO2015179525各自提供了分离的RNA双链体，其包含RNA的第一链(例如15个连续核苷酸)和RNA的第二链(例如与第一链的至少12个连续核苷酸互补)，其中RNA双链体的长度约为15至30个碱基对。RNA的第一链和RNA的第二链可以通过RNA环(
Figure BDA0002356059890001761
4至50个核苷酸)有效地连接以形成发夹结构，该发夹结构可以插入表达盒中。环部分的非限制性实例包括美国专利号9,169,483的SEQ ID NO:9-14，其内容通过引用整体并入本文。可使用完整序列或序列部分以形成RNA双链体的RNA链的非限制性实例包括美国专利号9,169,483的SEQ ID NO:1-8和美国专利号9,181,544的SEQ ID NO:1-11、33-59、208-210、213-215和218-221，其各自内容通过引用整体并入本文。RNAi分子的非限制性实例包括美国专利号9,169,483的SEQ ID NO:1-8、美国专利号9,181,544的SEQ ID NO:1-11、33-59、208-210、213-215和218-221和国际专利公开号WO2015179525的SEQ ID NO:1、6、7和35-38，其各自内容通过引用整体并入本文。
可以将体外合成的siRNA分子引入细胞中以激活RNAi。与内源性dsRNA相似，当将外源性siRNA双链体引入细胞时，其可以组装形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，这是一种与RNA序列相互作用的多单位复合物，其与siRNA双链体的两条链之一互补(即反义链)。在此过程中，siRNA的有义链(或过客链)从复合物中丢失，而siRNA的反义链(或引导链)与其互补RNA匹配。尤其是，包含RISC复合物的siRNA的靶标是呈现完美序列互补性的mRNA。然后，通过切割、释放和降解靶标，发生siRNA介导的基因沉默。
siRNA双链体由与靶mRNA同源的有义链和与靶mRNA互补的反义链组成，与单链(ss)-siRNA(例如反义链RNA或反义寡核苷酸)的使用相比，在破坏靶RNA的效率方面，siRNA双链体具有更多优势。在许多情况下，需要更高浓度的ss-siRNA才能实现对应双链体的有效基因沉默效力。
任何前述分子可以由病毒基因组编码。
靶向目标基因的siRNA双链体的设计和序列
本发明提供了靶向mRNA以干扰基因表达和/或蛋白生产的小干扰RNA(siRNA)双链体(和编码它们的调节性多核苷酸)。
本发明的编码的siRNA双链体含有杂交在一起形成双链体结构的反义链和有义链，其中反义链与靶基因的核酸序列互补，并且其中有义链与靶基因的核酸序列同源。在一些方面，反义链的5’端具有5’磷酸基团，而有义链的3’端包含3’羟基。在其他方面，在每条链的3’端没有、有一个或有两个核苷酸突出端。
在本领域中已经提出了一些设计siRNA的指南。这些指南通常建议生成19个核苷酸的双链体区、对称的2-3个核苷酸的3’突出端、5’-磷酸基团和3’-羟基，靶向待沉默的基因中的区域。其他可能影响siRNA序列偏好的规则包括但不限于：(i)反义链5’端的A/U；(ii)有义链5’端的G/C；(iii)在反义链的5’端三分之一的至少有5个A/U残基；和(iv)不存在长度超过9个核苷酸的任何GC片段。根据这样的考虑以及靶基因的特定序列，可以容易地设计阻遏靶基因表达所必需的高效siRNA分子。
根据本发明，设计了靶向目标基因的siRNA分子(例如，siRNA双链体或编码的dsRNA)。这样的siRNA分子可以特异性地阻遏基因表达和蛋白生产。在某些方面，siRNA分子被设计并用于选择性“敲除”细胞中的基因变体，即突变的转录物。在一些方面，siRNA分子被设计并用于选择性“敲低”细胞中的基因变体。在其他方面，siRNA分子能够抑制或阻遏野生型和突变型的目标基因。
在一个实施方案中，本发明的siRNA分子包含有义链和互补反义链，其中两条链杂交在一起形成双链体结构。反义链与靶mRNA序列具有足够的互补性以引导靶特异性RNAi，即siRNA分子具有足以触发通过RNAi机制或过程破坏靶mRNA的序列。
在一个实施方案中，本发明的siRNA分子包含有义链和互补反义链，其中两条链杂交在一起形成双链体结构，并且其中与mRNA杂交的起始位点在mRNA序列的核苷酸10至1000之间。作为非限制性实例，起始位点可以在靶mRNA序列上的核苷酸10-20、20-30、30-40、40-50、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-70、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000之间。作为又一非限制性实例，起始位点可以是靶mRNA序列上的核苷酸10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999。
在一些实施方案中，反义链和靶mRNA序列具有100％的互补性。反义链可以与靶mRNA序列的任何部分互补。
在其他实施方案中，反义链和靶mRNA序列包含至少一个错配。作为非限制性实例，反义链和靶mRNA序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％的互补性。
在一个实施方案中，siRNA或dsRNA包括至少两条彼此互补的序列。
根据本发明，siRNA分子的长度为约10-50个或更多个核苷酸，即每条链包含10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)。优选地，siRNA分子的长度为每条链约15-30个核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，其中一条链与靶区域充分互补。在一个实施方案中，siRNA分子的每条链的长度为约19至25、19至24或19至21个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为19个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为20个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为21个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为22个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为23个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为24个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为25个核苷酸。
在一些实施方案中，本发明的siRNA分子可以是合成的RNA双链体，其包含约19个核苷酸至约25个核苷酸，以及在3’端的两个突出核苷酸。在一些方面，siRNA分子可以是未修饰的RNA分子。在其他方面，siRNA分子可包含至少一个修饰的核苷酸，例如碱基、糖或主链修饰。
在一个实施方案中，本发明的siRNA分子可以包含反义序列和有义序列，或其片段或变体。作为非限制性实例，反义序列和有义序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％的互补性。
在其他实施方案中，本发明的siRNA分子可以在用于递送至细胞的质粒载体、AAV颗粒、病毒基因组或其他核酸表达载体中编码。
DNA表达质粒可用于在细胞中稳定表达本发明的siRNA双链体或dsRNA，并实现对靶基因表达的长期抑制。一方面，siRNA双链体的有义和反义链通常通过短间隔序列连接，所述短间隔序列引起称为短发夹RNA(shRNA)的茎-环结构的表达。发夹被Dicer识别并切割，从而生成成熟的siRNA分子。
根据本发明，产生包含编码靶向mRNA的siRNA分子的核酸的AAV颗粒，AAV血清型可以是表1中列出的任何血清型。AAV血清型的非限制性实例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8、AAV-DJ、AAV-PHP.A、AAV-PHP.B、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5及其变体。
在一些实施方案中，本发明的siRNA双链体或编码的dsRNA阻遏(或降解)靶mRNA。因此，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于基本上抑制细胞(例如神经元)中的基因表达。在一些方面，基因表达的抑制是指抑制了至少约20％，优选抑制了至少约30％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可被抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。
在一些实施方案中，本发明的siRNA双链体或编码的dsRNA阻遏(或降解)脊髓运动神经元中的靶mRNA。在一些方面，基因表达的抑制是指抑制了至少约20％，优选抑制了至少约30％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可被抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。
在一个实施方案中，本发明的siRNA双链体或编码的dsRNA将脊髓运动神经元中的靶mRNA阻遏(或降解)了78％。
在一个实施方案中，本发明的siRNA双链体或编码的dsRNA将脊髓运动神经元中的靶mRNA阻遏(或降解)了45-55％。
在一个实施方案中，本发明的siRNA双链体或编码的dsRNA阻遏(或降解)运动神经元形态学的vg+细胞中的靶mRNA。在一些方面，基因表达的抑制是指抑制了至少约20％，优选抑制了至少约30％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可被抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。
在一些实施方案中，本发明的siRNA双链体或编码的dsRNA将运动神经元形态学的vg+细胞中的靶mRNA阻遏(或降解)了53％。
在一个实施方案中，siRNA分子包含与位于引导链中的靶标匹配的miRNA种子。在另一个实施方案中，siRNA分子包含与位于过客链中的靶标匹配的miRNA种子。在又一个实施方案中，靶向目标基因的siRNA双链体或编码的dsRNA不包含与位于引导链或过客链中的靶标匹配的种子。
在一个实施方案中，靶向目标基因的siRNA双链体或编码的dsRNA可对引导链几乎没有显著的全长脱靶效应。在另一个实施方案中，靶向目标基因的siRNA双链体或编码的dsRNA可对过客链几乎没有显著的全长脱靶效应。靶向目标基因的siRNA双链体或编码的dsRNA可对过客链具有少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶效应。在又一个实施方案中，靶向目标基因的siRNA双链体或编码的dsRNA可对引导链或过客链几乎没有显著的全长脱靶效应。靶向目标基因的siRNA双链体或编码的dsRNA可对引导链或过客链具有少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％,11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶效应。
在一个实施方案中，靶向目标基因的siRNA双链体或编码的dsRNA可以在体外具有高活性。在另一个实施方案中，siRNA分子可以在体外具有低活性。在又一个实施方案中，靶向目标基因的siRNA双链体或dsRNA在体外可具有高引导链活性和低过客链活性。
在一个实施方案中，siRNA分子在体外具有高引导链活性和低过客链活性。引导链的目标敲低(KD)可以是至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％。引导链的目标敲低可以是40-50％、45-50％、50-55％、50-60％、60-65％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、60-99％、60-99.5％、60-100％、65-70％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、65-99％、65-99.5％、65-100％、70-75％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、70-99％、70-99.5％、70-100％、75-80％、75-85％、75-90％、75-95％、75-99％、75-99.5％、75-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-99.5％、80-100％、85-90％、85-95％、85-99％、85-99.5％、85-100％、90-95％、90-99％、90-99.5％、90-100％、95-99％、95-99.5％、95-100％、99-99.5％、99-100％或99.5-100％。作为非限制性实例，引导链的目标敲低(KD)大于70％。作为非限制性实例，引导链的目标敲低(KD)大于60％。
在一个实施方案中，对siRNA双链体进行了设计，以不存在与非目标基因序列的有义或反义序列匹配的miRNA种子。
在一个实施方案中，最接近脱靶的引导链的IC50大于100乘以中靶基因的引导链的IC50。作为非限制性实例，如果最接近脱靶的引导链的IC50大于100乘以靶引导链的IC50，则认为siRNA分子具有体外抑制目标基因的高引导链选择性。
在一个实施方案中，引导链的5’加工在体外或体内至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的时间内在5’端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5’加工是精确的，并且在体外至少99％的时间内在5’端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5’加工是精确的，并且在体内至少99％的时间内在5’端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5’加工是精确的，并且在体外至少90％的时间内在5’端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5’加工是精确的，并且在体内至少90％的时间内在5’端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5’加工是精确的，并且在体外至少85％的时间内在5’端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5’加工是精确的，并且在体内至少85％的时间内在5’端正确开始(n)。
在一个实施方案中，在体外或体内，表达的引导链与过客链的比(G:P)(也称为反义链与有义链的比)为1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1；1、2:10、2:9、2:8、2:7、2:6、2:5、2:4、2:3、2:2、2:1、3:10、3:9、3:8、3:7、3:6、3:5、3:4、3:3、3:2、3:1、4:10、4:9、4:8、4:7、4:6、4:5、4:4、4:3、4:2、4:1、5:10、5:9、5:8、5:7、5:6、5:5、5:4、5:3、5:2、5:1、6:10、6:9、6:8、6:7、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1、7:10、7:9、7:8、7:7、7:6、7:5、7:4、7:3、7:2、7:1、8:10、8:9、8:8、8:7、8:6、8:5、8:4、8:3、8:2、8:1、9:10、9:9、9:8、9:7、9:6、9:5、9:4、9:3、9:2、9:1、10:10、10:9、10:8、10:7、10:6、10:5、10:4、10:3、10:2、10:1、1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或99:1。引导链与过客链的比是指在pri-microRNA的细胞内加工后引导链与过客链的比。例如，80:20的引导链与过客链的比为从前体加工的每2条过客链将有8条引导链。作为非限制性实例，体外引导链与过客链的比为8:2。作为非限制性实例，体内引导链与过客链的比为8:2。作为非限制性实例，体外引导链与过客链的比为9:1。作为非限制性实例，体内引导链与过客链的比为9:1。
在一个实施方案中，引导链与过客链的比(G:P)的范围是1-99、1.3-99、5-99、10-99、15-99、20-99、25-99、30-99、35-99、40-99、45-99、50-99、55-99、60-99、65-99、70-99、75-99、80-99、85-99、90-99、95-99、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-55、10-60、10-65、10-70、10-75、10-80、10-85、10-90、10-95、15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-45、15-50、15-55、15-60、15-65、15-70、15-75、15-80、15-85、15-90、15-95、20-25、20-30、20-35、20-40、20-45、20-50、20-55、20-60、20-65、20-70、20-75、20-80、20-85、20-90、20-95、25-30、25-35、25-40、25-45、25-50、25-55、25-60、25-65、25-70、25-75、25-80、25-85、25-90、25-95、30-35、30-40、30-45、30-50、30-55、30-60、30-65、30-70、30-75、30-80、30-85、30-90、30-95、35-40、35-45、35-50、35-55、35-60、35-65、35-70、35-75、35-80、35-85、35-90、35-95、40-45、40-50、40-55、40-60、40-65、40-70、40-75、40-80、40-85、40-90、40-95、45-50、45-55、45-60、45-65、45-70、45-75、45-80、45-85、45-90、45-95、50-55、50-60、50-65、50-70、50-75、50-80、50-85、50-90、50-95、55-60、55-65、55-70、55-75、55-80、55-85、55-90、55-95、60-65、60-70、60-75、60-80、60-85、60-90、60-95、65-70、65-75、65-80、65-85、65-90、65-95、70-75、70-80、70-85、70-90、70-95、75-80、75-85、75-90、75-95、80-85、80-90、80-95、85-90、85-95或90-95。作为非限制性实例，引导链与过客链的比的范围是1.3至99。作为非限制性实例，引导链与过客链的比的范围是10至99。
在一个实施方案中，引导链与过客链的比(G:P)是10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、35.5、36、36.5、37、37.5、38、38.5、39、39.5、40、40.5、41、41.5、42、42.5、43、43.5、44、44.5、45、45.5、46、46.5、47、47.5、48、48.5、49、49.5、50、50.5、51、51.5、52、52.5、53、53.5、54、54.5、55、55.5、56、56.5、57、57.5、58、58.5、59、59.5、60、60.5、61、61.5、62、62.5、63、63.5、64、64.5、65、65.5、66、66.5、67、67.5、68、68.5、69、69.5、70、70.5、71、71.5、72、72.5、73、73.5、74、74.5、75、75.5、76、76.5、77、77.5、78、78.5、79、79.5、80、80.5、81、81.5、82、82.5、83、83.5、84、84.5、85、85.5、86、86.5、87、87.5、88、88.5、89、89.5、90、90.5、91、91.5、92、92.5、93、93.5、94、94.5、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5或99。作为非限制性实例，引导链与过客链的比(G:P)是11.5。作为非限制性实例，引导链与过客链的比(G:P)是99。
在一个实施方案中，表达的引导链与过客链的比(G:P)(也称为反义链与有义链的比)大于1。
在一个实施方案中，表达的引导链与过客链的比(G:P)(也称为反义链与有义链的比)大于2。
在一个实施方案中，表达的引导链与过客链的比(G:P)(也称为反义链与有义链的比)大于5。
在一个实施方案中，表达的引导链与过客链的比(G:P)(也称为反义链与有义链的比)大于10。
在一个实施方案中，表达的引导链与过客链的比(G:P)(也称为反义链与有义链的比)大于20。
在一个实施方案中，表达的引导链与过客链的比(G:P)(也称为反义链与有义链的比)大于50。
在一个实施方案中，表达的引导链与过客链的比(G:P)(也称为反义链与有义链的比)为至少3:1。
在一个实施方案中，表达的引导链与过客链的比(G:P)(也称为反义链与有义链的比)为至少5:1。
在一个实施方案中，表达的引导链与过客链的比(G:P)(也称为反义链与有义链的比)为至少10:1。
在一个实施方案中，表达的引导链与过客链的比(G:P)(也称为反义链与有义链的比)为至少20:1。
在一个实施方案中，表达的引导链与过客链的比(G:P)(也称为反义链与有义链的比)为至少50:1。
在一个实施方案中，在体外或体内，表达的过客链与引导链的比(P:G)(也称为有义链与反义链的比)为1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1；1、2:10、2:9、2:8、2:7、2:6、2:5、2:4、2:3、2:2、2:1、3:10、3:9、3:8、3:7、3:6、3:5、3:4、3:3、3:2、3:1、4:10、4:9、4:8、4:7、4:6、4:5、4:4、4:3、4:2、4:1、5:10、5:9、5:8、5:7、5:6、5:5、5:4、5:3、5:2、5:1、6:10、6:9、6:8、6:7、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1、7:10、7:9、7:8、7:7、7:6、7:5、7:4、7:3、7:2、7:1、8:10、8:9、8:8、8:7、8:6、8:5、8:4、8:3、8:2、8:1、9:10、9:9、9:8、9:7、9:6、9:5、9:4、9:3、9:2、9:1、10:10、10:9、10:8、10:7、10:6、10:5、10:4、10:3、10:2、10:1、1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或99:1。过客链与引导链的比是指在pri-microRNA的细胞内加工后过客链与引导链的比。例如，80:20的过客链与引导链的比为从前体加工的每2条引导链将有8条过客链。作为非限制性实例，体外过客链与引导链的比为80:20。作为非限制性实例，体内过客链与引导链的比为80:20。作为非限制性实例，体外过客链与引导链的比为8:2。作为非限制性实例，体内过客链与引导链的比为8:2。作为非限制性实例，体外过客链与引导链的比为9:1。作为非限制性实例，体内过客链与引导链的比为9:1。
在一个实施方案中，过客链与引导链的比(P:G)的范围是1-99、1.3-99、5-99、10-99、15-99、20-99、25-99、30-99、35-99、40-99、45-99、50-99、55-99、60-99、65-99、70-99、75-99、80-99、85-99、90-99、95-99、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-55、10-60、10-65、10-70、10-75、10-80、10-85、10-90、10-95、15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-45、15-50、15-55、15-60、15-65、15-70、15-75、15-80、15-85、15-90、15-95、20-25、20-30、20-35、20-40、20-45、20-50、20-55、20-60、20-65、20-70、20-75、20-80、20-85、20-90、20-95、25-30、25-35、25-40、25-45、25-50、25-55、25-60、25-65、25-70、25-75、25-80、25-85、25-90、25-95、30-35、30-40、30-45、30-50、30-55、30-60、30-65、30-70、30-75、30-80、30-85、30-90、30-95、35-40、35-45、35-50、35-55、35-60、35-65、35-70、35-75、35-80、35-85、35-90、35-95、40-45、40-50、40-55、40-60、40-65、40-70、40-75、40-80、40-85、40-90、40-95、45-50、45-55、45-60、45-65、45-70、45-75、45-80、45-85、45-90、45-95、50-55、50-60、50-65、50-70、50-75、50-80、50-85、50-90、50-95、55-60、55-65、55-70、55-75、55-80、55-85、55-90、55-95、60-65、60-70、60-75、60-80、60-85、60-90、60-95、65-70、65-75、65-80、65-85、65-90、65-95、70-75、70-80、70-85、70-90、70-95、75-80、75-85、75-90、75-95、80-85、80-90、80-95、85-90、85-95或90-95。
在一个实施方案中，过客链与引导链的比(P:G)是10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、35.5、36、36.5、37、37.5、38、38.5、39、39.5、40、40.5、41、41.5、42、42.5、43、43.5、44、44.5、45、45.5、46、46.5、47、47.5、48、48.5、49、49.5、50、50.5、51、51.5、52、52.5、53、53.5、54、54.5、55、55.5、56、56.5、57、57.5、58、58.5、59、59.5、60、60.5、61、61.5、62、62.5、63、63.5、64、64.5、65、65.5、66、66.5、67、67.5、68、68.5、69、69.5、70、70.5、71、71.5、72、72.5、73、73.5、74、74.5、75、75.5、76、76.5、77、77.5、78、78.5、79、79.5、80、80.5、81、81.5、82、82.5、83、83.5、84、84.5、85、85.5、86、86.5、87、87.5、88、88.5、89、89.5、90、90.5、91、91.5、92、92.5、93、93.5、94、94.5、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5或99。
在一个实施方案中，表达的过客链与引导链的比(P:G)(也称为有义链与反义链的比)大于1。
在一个实施方案中，表达的过客链与引导链的比(P:G)(也称为有义链与反义链的比)大于2。
在一个实施方案中，表达的过客链与引导链的比(P:G)(也称为有义链与反义链的比)大于5。
在一个实施方案中，表达的过客链与引导链的比(P:G)(也称为有义链与反义链的比)大于10。
在一个实施方案中，表达的过客链与引导链的比(P:G)(也称为有义链与反义链的比)大于20。
在一个实施方案中，表达的过客链与引导链的比(P:G)(也称为有义链与反义链的比)大于50。
在一个实施方案中，表达的过客链与引导链的比(P:G)(也称为有义链与反义链的比)为至少3:1。
在一个实施方案中，表达的过客链与引导链的比(P:G)(也称为有义链与反义链的比)为至少5:1。
在一个实施方案中，表达的过客链与引导链的比(P:G)(也称为有义链与反义链的比)为至少10:1。
在一个实施方案中，表达的过客链与引导链的比(P:G)(也称为有义链与反义链的比)为至少20:1。
在一个实施方案中，表达的过客链与引导链的比(P:G)(也称为有义链与反义链的比)为至少50:1。
在一个实施方案中，当pri-或pre-microRNA通过本领域已知的和本文描述的方法证明比测量加工时的引导链与过客链的比大2倍时，过客链-引导链双链体被认为是有效的。作为非限制性实例，pri-或pre-microRNA证明比测量加工时的引导链与过客链的比大2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍，或2至5倍、2至10倍、2至15倍、3至5倍、3至10倍、3至15倍、4至5倍、4至10倍、4至15倍、5至10倍、5至15倍、6至10倍、6至15倍、7至10倍、7至15倍、8至10倍、8至15倍、9至10倍、9至15倍、10至15倍、11至15倍、12至15倍、13至15倍或14至15倍。
在一个实施方案中，编码dsRNA的载体基因组包含为构建体全长的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或多于99％的序列。作为非限制性实例，载体基因组包含为构建体全长序列的至少80％的序列。
在一个实施方案中，可通过靶向目标基因序列上的至少一个外显子，将siRNA分子用于沉默目标基因的野生型或突变形式。外显子可以是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66和/或外显子67。
靶向SOD1基因的siRNA双链体的设计与序列
本发明提供了靶向SOD1 mRNA以干扰SOD1基因表达和/或SOD1蛋白生产的小干扰RNA(siRNA)双链体(和编码它们的调节性多核苷酸)。
本发明的编码的siRNA双链体包含杂交在一起形成双链体结构的反义链和有义链，其中所述反义链与靶SOD1基因的核酸序列互补，并且其中有义链与靶SOD1基因的核酸序列同源。在一些方面，反义链的5’端具有5’磷酸基团，而有义链的3’端包含3’羟基。在其他方面，在每条链的3’端没有、有一个或有两个核苷酸突出端。
在本领域中已经提出了一些设计siRNA的指南。这些指南通常建议生成19个核苷酸的双链体区、对称的2-3个核苷酸的3’突出端、5’-磷酸基团和3’-羟基，靶向待沉默的基因中的区域。其他可能影响siRNA序列偏好的规则包括但不限于：(i)反义链5’端的A/U；(ii)有义链5’端的G/C；(iii)在反义链的5’端三分之一的至少5个A/U残基；和(iv)不存在长度超过9个核苷酸的任何GC片段。根据这样的考虑以及靶基因的特异性序列，可以容易地设计阻遏SOD1基因表达所必需的高效siRNA分子。
根据本发明，设计了靶向SOD1基因的siRNA分子(例如，siRNA双链体或编码的dsRNA)。这样的siRNA分子可以特异性地阻遏SOD1基因表达和蛋白生产。在一些方面，siRNA分子被设计用于选择性“敲除”细胞中的SOD1基因变体，即在ALS疾病患者中识别出的突变的SOD1转录物。在一些方面，siRNA分子被设计用于选择性“敲低”细胞中的SOD1基因变体。在其他方面，siRNA分子能够抑制或阻遏野生型和突变的SOD1基因。
在一个实施方案中，本发明的siRNA分子包含有义链和互补反义链，其中两条链杂交在一起形成双链体结构。反义链与SOD1 mRNA序列具有足够的互补性以引导靶特异性RNAi，即，siRNA分子具有足以触发通过RNAi机制或过程破坏靶mRNA的序列。
在一个实施方案中，本发明的siRNA分子包含有义链和互补反义链，其中两条链杂交在一起形成双链体结构，并且与SOD1 mRNA杂交的起始位点在SOD1 mRNA序列的核苷酸100至1000之间。作为非限制性实例，起始位点可以在SOD1 mRNA序列上的核苷酸15-25、15-50、15-75、15-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-70、750-800、800-850、850-900、900-950和950-1000之间。作为另一个非限制性实例，起始位点可以是SOD1mRNA序列上的核苷酸26、27、28、29、30、32、33、34、35、36、37、74、76、77、78、149、153、157、160、177、192、193、195、196、197、198、199、206、209、210、239、241、261、263、264、268、269、276、278、281、284、290、291、295、296、316、317、329、330、337、350、351、352、354、357、358、364、375、378、383、384、390、392、395、404、406、417、418、469、470、475、476、480、487、494、496、497、501、504、515、518、522、523、524、552、554、555、562、576、577、578、579、581、583、584、585、587、588、589、593、594、595、596、597、598、599、602、607、608、609、610、611、612、613、616、621、633、635、636、639、640、641、642、643、644、645、654、660、661、666、667、668、669、673、677、692、698、699、700、701、706、749、770、772、775、781、800、804、819、829、832、833、851、854、855、857、858、859、861、869、891、892、906、907、912、913、934、944和947。
在一些实施方案中，反义链和靶mRNA序列具有100％的互补性。反义链可以与靶SOD1 mRNA序列的任何部分互补。
在其他实施方案中，反义链和靶SOD1 mRNA序列包含至少一个错配。作为非限制性实例，反义链和靶SOD1 mRNA序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％的互补性。
在一个实施方案中，靶向SOD1的siRNA或dsRNA包括至少两条彼此互补的序列。
根据本发明，靶向SOD1的siRNA分子的长度为约10-50个或更多个核苷酸，即每条链包含10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)。优选地，siRNA分子的长度为每条链约15-30个核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，其中一条链与靶区域充分互补。在一个实施方案中，siRNA分子的每条链的长度为约19至25、19至24或19至21个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为19个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为20个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为21个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为22个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为23个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为24个核苷酸。在一个实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为25个核苷酸。
在一些实施方案中，靶向SOD1的本发明的siRNA分子可以是合成的RNA双链体，其包含约19个核苷酸至约25个核苷酸，以及在3’端的两个突出核苷酸。在一些方面，siRNA分子可以是未修饰的RNA分子。在其他方面，siRNA分子可包含至少一个修饰的核苷酸，例如碱基、糖或主链修饰。
在一个实施方案中，靶向SOD1的本发明的siRNA分子可以包含核苷酸序列，例如但不限于表2中的反义(引导)序列或其片段或变体。作为非限制性实例，用于本发明的siRNA分子的反义序列是表2中核苷酸序列的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％。作为另一个非限制性实例，用于本发明的siRNA分子中的反义序列包含表2中核苷酸序列的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或多于21个连续核苷酸。作为另一个非限制性实例，用于本发明的siRNA分子中的反义序列包含表2中序列的核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21或18至22。
表2.反义序列
Figure BDA0002356059890001961
Figure BDA0002356059890001971
Figure BDA0002356059890001981
Figure BDA0002356059890001991
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Figure BDA0002356059890002011
Figure BDA0002356059890002021
在一个实施方案中，靶向SOD1的本发明的siRNA分子可以包含核苷酸序列，例如但不限于表3中的有义(过客链)序列或其片段或变体。作为非限制性实例，用于本发明的siRNA分子中的有义序列是表3中核苷酸序列的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％。作为另一个非限制性实例，用于本发明的siRNA分子中的有义序列包含表3中核苷酸序列的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或多于21个连续核苷酸。作为另一个非限制性实例，用于本发明的siRNA分子中的有义序列包含表3中序列的核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21或18至22。
表3.有义序列
Figure BDA0002356059890002031
Figure BDA0002356059890002041
Figure BDA0002356059890002051
Figure BDA0002356059890002061
Figure BDA0002356059890002071
Figure BDA0002356059890002081
Figure BDA0002356059890002091
在一个实施方案中，靶向SOD1的本发明的siRNA分子可以包含来自表2的反义序列和来自表3的有义序列，或其片段或变体。作为非限制性实例，反义序列和有义序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％的互补性。
在一个实施方案中，靶向SOD1的本发明的siRNA分子可以包含表4中所述的有义和反义siRNA双链体。作为非限制性实例，可以测试这些siRNA双链体对内源性SOD1基因表达的体外抑制活性。将有义和反义序列的起始位点与来自NCBI的称为NM_000454.4(SEQ IDNO:1254)的SOD1基因序列进行比较。
表4.SOD1 dsRNA的有义链和反义链序列
Figure BDA0002356059890002101
Figure BDA0002356059890002111
Figure BDA0002356059890002121
Figure BDA0002356059890002131
Figure BDA0002356059890002141
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Figure BDA0002356059890002161
Figure BDA0002356059890002171
Figure BDA0002356059890002181
Figure BDA0002356059890002191
Figure BDA0002356059890002201
Figure BDA0002356059890002211
Figure BDA0002356059890002221
在其他实施方案中，靶向SOD1的本发明的siRNA分子可以在用于递送至细胞的质粒载体、AAV颗粒、病毒基因组或其他核酸表达载体中编码。
DNA表达质粒可用于在细胞中稳定表达靶向SOD1的本发明的siRNA双链体或dsRNA，并实现对靶基因表达的长期抑制。一方面，siRNA双链体的有义和反义链通常通过短间隔序列连接，所述短间隔序列引起称为短发夹RNA(shRNA)的茎-环结构的表达。发夹被Dicer识别并切割，从而生成成熟的siRNA分子。
根据本发明，产生了包含编码靶向SOD1 mRNA的siRNA分子的核酸的AAV颗粒，所述AAV血清型可以是表1中列出的任何血清型。AAV血清型的非限制性实例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8、AAV-DJ、AAV-PHP.A、和/或AAV-PHP.B、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5，及其变体。
在一些实施方案中，本发明的siRNA双链体或编码的dsRNA阻遏(或降解)SOD1mRNA。因此，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于基本上抑制细胞中的SOD1基因表达。在一些方面，SOD1基因表达的抑制是指抑制了至少约20％，优选抑制了至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可被抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。
根据本发明，设计并测试了siRNA分子降低培养细胞中SOD1 mRNA水平的能力。此类siRNA分子可以形成双链体，例如但不限于包括表4中列出的双链体。作为非限制性实例，siRNA双链体可以是siRNA双链体ID：D-2741至D-2909。
在一个实施方案中，siRNA分子包含位于引导链中的与SOD1匹配的miRNA种子。在另一个实施方案中，siRNA分子包含位于过客链中的与SOD1匹配的miRNA种子。在又一个实施方案中，靶向SOD1基因的siRNA双链体或编码的dsRNA不包含位于引导链或过客链中的与SOD1匹配的种子。
在一个实施方案中，靶向SOD1基因的siRNA双链体或编码的dsRNA可对引导链几乎没有显著的全长脱靶效应。在另一个实施方案中，靶向SOD1基因的siRNA双链体或编码的dsRNA可对过客链几乎没有显著的全长脱靶效应。靶向SOD1基因的siRNA双链体或编码的dsRNA可对过客链具有少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％,11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶效应。在又一个实施方案中，靶向SOD1基因的siRNA双链体或编码的dsRNA可对于引导链或过客链几乎没有显著的全长脱靶效应。靶向SOD1基因的siRNA双链体或编码的dsRNA可对引导链或过客链具有少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％,11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶效应。
在一个实施方案中，靶向SOD1基因的siRNA双链体或编码的dsRNA可以在体外具有高活性。在另一个实施方案中，siRNA分子可以在体外具有低活性。在又一个实施方案中，靶向SOD1基因的siRNA双链体或dsRNA在体外可以具有高引导链活性和低过客链活性。
在一个实施方案中，靶向SOD1的siRNA分子在体外具有高引导链活性和低过客链活性。引导链的目标敲低(KD)可以是至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％。引导链的目标敲低可以是40-50％、45-50％、50-55％、50-60％、60-65％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、60-99％、60-99.5％、60-100％、65-70％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、65-99％、65-99.5％、65-100％、70-75％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、70-99％、70-99.5％、70-100％、75-80％、75-85％、75-90％、75-95％、75-99％、75-99.5％、75-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-99.5％、80-100％、85-90％、85-95％、85-99％、85-99.5％、85-100％、90-95％、90-99％、90-99.5％、90-100％、95-99％、95-99.5％、95-100％、99-99.5％、99-100％或99.5-100％。作为非限制性实例，引导链的目标敲低(KD)大于70％。作为非限制性实例，引导链的目标敲低(KD)大于60％。
在一个实施方案中，对siRNA双链体靶SOD1进行了设计，以不存在与非SOD1基因序列的有义或反义序列匹配的miRNA种子。
在一个实施方案中，最接近脱靶的靶向SOD1的siRNA双链体中引导链的IC50大于100乘以中靶基因SOD1的引导链的IC50。作为非限制性实例，如果最接近脱靶的引导链的IC50大于100乘以靶引导链的IC50，则认为siRNA分子具有体外抑制SOD1的高引导链选择性。
在一个实施方案中，靶向SOD1的siRNA双链体的引导链的5’加工在体外或体内至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的时间内在5’端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5’加工是精确的，并且在体外至少99％的时间内在5’端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5’加工是精确的，并且在体内至少99％的时间内在5’端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5’加工是精确的，并且在体外至少90％的时间内在5’端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5’加工是精确的，并且在体内至少90％的时间内在5’端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5’加工是精确的，并且在体外至少85％的时间内在5’端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5’加工是精确的，并且在体内至少85％的时间内在5’端正确开始(n)。
在一个实施方案中，靶向SOD1的siRNA双链体的引导链的5’加工具有75-95％、75-90％、75-85％、75-80％、80-95％、80-90％、80-85％、85-95％、85-90％和90-95％的在5’端正确开始(n)。作为非限制性实例，靶向SOD1的siRNA双链体的引导链的5’加工具有75-95％的在5’端正确开始(n)。
在一个实施方案中，靶向SOD1的siRNA双链体的引导链的5’加工在表达的构建体的75％、75.1％、75.2％、75.3％、75.4％、75.5％、75.6％、75.7％、75.8％、75.9％、76％、76.1％、76.2％、76.3％、76.4％、76.5％、76.6％、76.7％、76.8％、76.9％、77％、77.1％、77.2％、77.3％、77.4％、77.5％、77.6％、77.7％、77.8％、77.9％、78％、78.1％、78.2％、78.3％、78.4％、78.5％、78.6％、78.7％、78.8％、78.9％、79％、79.1％、79.2％、79.3％、79.4％、79.5％、79.6％、79.7％、79.8％、79.9％、80％、80.1％、80.2％、80.3％、80.4％、80.5％、80.6％、80.7％、80.8％、80.9％、81％、81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％、81.6％、81.7％、81.8％、81.9％、82％、82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％、82.6％、82.7％、82.8％、82.9％、83％、83.1％、83.2％、83.3％、83.4％、83.5％、83.6％、83.7％、83.8％、83.9％、84％、84.1％、84.2％、84.3％、84.4％、84.5％、84.6％、84.7％、84.8％、84.9％、85％、85.1％、85.2％、85.3％、85.4％、85.5％、85.6％、85.7％、85.8％、85.9％、86％、86.1％、86.2％、86.3％、86.4％、86.5％、86.6％、86.7％、86.8％、86.9％、87％、87.1％、87.2％、87.3％、87.4％、87.5％、87.6％、87.7％、87.8％、87.9％、88％、88.1％、88.2％、88.3％、88.4％、88.5％、88.6％、88.7％、88.8％、88.9％、89％、89.1％、89.2％、89.3％、89.4％、89.5％、89.6％、89.7％、89.8％、89.9％、90％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％或95％中具有5’端正确开始(n)。作为非限制性实例，靶向SOD1的siRNA双链体的引导链的5’加工在表达的构建体的81％中具有5’端正确开始(n)。作为非限制性实例，靶向SOD1的siRNA双链体的引导链的5’加工在表达的构建体的90％中具有5’端正确开始(n)。
在一个实施方案中，当pri-或pre-microRNA通过本领域已知的和本文描述的方法证明比测量加工时的引导链与过客链的比大2倍时，SOD1的过客链-引导链双链体被认为是有效的。作为非限制性实例，pri-或pre-microRNA证明比测量加工时的引导链与过客链的比大2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍，或2至5倍、2至10倍、2至15倍、3至5倍、3至10倍、3至15倍、4至5倍、4至10倍、4至15倍、5至10倍、5至15倍、6至10倍、6至15倍、7至10倍、7至15倍、8至10倍、8至15倍、9至10倍、9至15倍、10至15倍、11至15倍、12至15倍、13至15倍或14至15倍。
在一个实施方案中，可通过靶向SOD1序列上的至少一个外显子，将siRNA分子用于沉默野生型或突变型SOD1。外显子可以是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66和/或外显子67。
在一个实施方案中，引导链与总内源性miRNA库的比的范围是0.001-0.6％、0.005-0.6％、0.01-0.6％、0.015-0.6％、0.02-0.6％、0.025-0.6％、0.03-0.6％、0.035-0.6％、0.04-0.6％、0.045-0.6％、0.05-0.6％、0.055-0.6％、0.06-0.6％、0.065-0.6％、0.07-0.6％、0.075-0.6％、0.08-0.6％、0.085-0.6％、0.09-0.6％、0.095-0.6％、0.1-0.6％、0.15-0.6％、0.2-0.6％、0.25-0.6％、0.3-0.6％、0.35-0.6％、0.4-0.6％、0.45-0.6％、0.5-0.6％、0.55-0.6％、0.001-0.5％、0.005-0.5％、0.01-0.5％、0.015-0.5％、0.02-0.5％、0.025-0.5％、0.03-0.5％、0.035-0.5％、0.04-0.5％、0.045-0.5％、0.05-0.5％、0.055-0.5％、0.06-0.5％、0.065-0.5％、0.07-0.5％、0.075-0.5％、0.08-0.5％、0.085-0.5％、0.09-0.5％、0.095-0.5％、0.1-0.5％、0.15-0.5％、0.2-0.5％、0.25-0.5％、0.3-0.5％、0.35-0.5％、0.4-0.5％、0.45-0.5％、0.001-0.4％、0.005-0.4％、0.01-0.4％、0.015-0.4％、0.02-0.4％、0.025-0.4％、0.03-0.4％、0.035-0.4％、0.04-0.4％、0.045-0.4％、0.05-0.4％、0.055-0.4％、0.06-0.4％、0.065-0.4％、0.07-0.4％、0.075-0.4％、0.08-0.4％、0.085-0.4％、0.09-0.4％、0.095-0.4％、0.1-0.4％、0.15-0.4％、0.2-0.4％、0.25-0.4％、0.3-0.4％、0.35-0.4％、0.001-0.3％、0.005-0.3％、0.01-0.3％、0.015-0.3％、0.02-0.3％、0.025-0.3％、0.03-0.3％、0.035-0.3％、0.04-0.3％、0.045-0.3％、0.05-0.3％、0.055-0.3％、0.06-0.3％、0.065-0.3％、0.07-0.3％、0.075-0.3％、0.08-0.3％、0.085-0.3％、0.09-0.3％、0.095-0.3％、0.1-0.3％、0.15-0.3％、0.2-0.3％、0.25-0.3％、0.001-0.2％、0.005-0.2％、0.01-0.2％、0.015-0.2％、0.02-0.2％、0.025-0.2％、0.03-0.2％、0.035-0.2％、0.04-0.2％、0.045-0.2％、0.05-0.2％、0.055-0.2％、0.06-0.2％、0.065-0.2％、0.07-0.2％、0.075-0.2％、0.08-0.2％、0.085-0.2％、0.09-0.2％、0.095-0.2％、0.1-0.2％、0.15-0.2％、0.001-0.1％、0.005-0.1％、0.01-0.1％、0.015-0.1％、0.02-0.1％、0.025-0.1％、0.03-0.1％、0.035-0.1％、0.04-0.1％、0.045-0.1％、0.05-0.1％、0.055-0.1％、0.06-0.1％、0.065-0.1％、0.07-0.1％、0.075-0.1％、0.08-0.1％、0.085-0.1％、0.09-0.1％或0.095-0.1％。作为非限制性实例，范围是0.06-0.6％。作为非限制性实例，范围是0.4-0.5％。
在一个实施方案中，引导链与总内源性miRNA库的比是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或0.6％。作为非限制性实例，百分比是0.06％。作为非限制性实例，百分比是0.4％。作为非限制性实例，百分比是0.5％。
siRNA修饰
在一些实施方案中，本发明的siRNA分子当不作为前体或DNA递送时，可以被化学修饰以调节RNA分子的一些特征，例如但不限于增加体内siRNA的稳定性。化学修饰的siRNA分子可用于人类治疗应用，并且在不损害siRNA分子的RNAi活性的情况下得到提高。作为非限制性实例，siRNA分子在有义链和反义链的3’和5’端均被修饰。
在一些方面，本发明的siRNA双链体可包含一个或多个修饰的核苷酸，例如但不限于糖修饰的核苷酸、核碱基修饰和/或主链修饰。在一些方面，siRNA分子可包含组合的修饰，例如组合的核碱基和主链修饰。
在一个实施方案中，修饰的核苷酸可以是糖修饰的核苷酸。糖修饰的核苷酸包括但不限于2’-氟、2’-氨基和2’-硫代修饰的核糖核苷酸，例如2’-氟修饰的核糖核苷酸。修饰的核苷酸可以在糖部分以及具有不是核糖基的糖或其类似物的核苷酸上被修饰。例如，糖部分可以是或基于甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖，4’-硫代核糖和其他糖、杂环或碳环。
在一个实施方案中，修饰的核苷酸可以是核碱基修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，修饰的核苷酸可以是主链修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本发明的siRNA双链体还可以在主链上包含其他修饰。本文所用的正常“主链”是指DNA或RNA分子中重复的交替糖-磷酸序列。脱氧核糖/核糖在3’-羟基和5’-羟基处均与酯键中的磷酸基团连接，也称为“磷酸二酯”键/接头(PO键)。PO主链可被修饰为“硫代磷酸酯主链(PS键)”。在某些情况下，天然磷酸二酯键可以被酰胺键取代，但两个糖单元之间仍保留4个原子。此类酰胺修饰可促进寡核苷酸的固相合成，并增加与siRNA互补物形成的双链体的热力学稳定性。参见例如Mesmaeker等人Pure&Appl.Chem.,1997,3,437-440；其内容通过引用整体并入本文。
修饰的碱基是指已经通过取代或添加一个或多个原子或基团修饰的核苷酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、肌苷和Q苷。核碱基部分的修饰的一些实例包括但不限于单独地或组合的烷基化、卤化、硫醇化、胺化、酰胺化或乙酰化的碱基。更具体的实例包括例如5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、N,N,-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和在5位具有修饰的其他核苷酸、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤代胞苷、5-卤代尿苷、4-乙酰基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鸟苷、7-甲基鸟苷、2,2-二甲基鸟苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲氧基尿苷、脱氮核苷酸(例如7-脱氮-腺苷)、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷、6-偶氮胸苷、5-甲基-2-硫代尿苷、其他硫代碱基(例如2-硫代尿苷和4-硫代尿苷和2-硫代胞苷)、二氢尿苷、假尿苷、Q苷、古嘌苷、萘基和取代的萘基、任何O-和N-烷基化的嘌呤和嘧啶(例如N6-甲基腺苷)、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基和修饰的苯基(例如氨基苯酚或2,4,6-三甲氧基苯)、充当G钳位核苷酸(G-clamp nucleotide)的修饰的胞嘧啶、8位取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶、羧基羟烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸和烷基羰基烷基化核苷酸。
在一个实施方案中，修饰的核苷酸可以仅在有义链上。
在另一个实施方案中，修饰的核苷酸可以仅在反义链上。
在一些实施方案中，修饰的核苷酸可以在有义链和反义链中。
在一些实施方案中，化学修饰的核苷酸不影响反义链与靶mRNA序列配对的能力。
在一个实施方案中，包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以编码作为多顺反子分子的siRNA分子。siRNA分子可在siRNA分子的区域之间另外包含一个或多个接头。
分子支架
在一个实施方案中，可以在还包含分子支架的调节性多核苷酸中编码siRNA分子。如本文所用，“分子支架”是框架或起始分子，其形成设计或制备后续分子所依据的序列或结构基础。
在一个实施方案中，分子支架包含至少一个5’侧翼区。作为非限制性实例，5’侧翼区可以包含5’侧翼序列，其可以具有任何长度，并且可以全部或部分源自野生型microRNA序列，或者是完全人工的序列。
在一个实施方案中，分子支架包含至少一个3’侧翼区。作为非限制性实例，3’侧翼区可以包含3’侧翼序列，其可以具有任何长度，并且可以全部或部分源自野生型microRNA序列，或者是完全人工的序列。
在一个实施方案中，分子支架包含至少一个环基序区。作为非限制性实例，环基序区可以包含可以具有任何长度的序列。
在一个实施方案中，分子支架包含5’侧翼区、环基序区和/或3’侧翼区。
在一个实施方案中，本文所述的至少一个siRNA、miRNA或其他RNAi物质可以由调节性多核苷酸编码，所述调节性多核苷酸也可以包含至少一种分子支架。分子支架可以包含5’侧翼序列，其可以具有任何长度，并且可以全部或部分源自野生型microRNA序列或是完全人工的。3’侧翼序列可以在大小和来源上镜像5’侧翼序列和/或3’侧翼序列。任一序列都可能不存在。3’侧翼序列可任选地包含一个或多个CNNC基序，其中“N”代表任何核苷酸。
形成茎环结构的茎至少是编码本文所述的至少一种siRNA，miRNA或其他RNAi物质的调节性多核苷酸的最低要求。在一些实施方案中，本文所述的siRNA、miRNA或其他RNAi物质包含至少一个与靶序列部分互补或将与其杂交的核酸序列。在一些实施方案中，有效载荷是siRNA分子或siRNA分子的片段。
在一些实施方案中，调节性多核苷酸的茎环结构的5’臂包含编码有义序列的核酸序列。表3描述了可以由调节性多核苷酸编码的有义序列或其片段或变体的非限制性实例。
在一些实施方案中，调节性多核苷酸的茎环的3’臂包含编码反义序列的核酸序列。在某些情况下，反义序列在最5’端包含一个“G”核苷酸。表2描述了可以由调节性多核苷酸编码的反义序列或其片段或变体的非限制性实例。
在其他实施方案中，有义序列可以位于调节性多核苷酸的茎环结构的茎的3’臂上，而反义序列位于5’臂上。可以由调节性多核苷酸编码的有义和反义序列的非限制性实例在表2和3中描述。
在一个实施方案中，有义和反义序列可以在其长度的大部分上完全互补。在其他实施方案中，有义序列和反义序列可以独立地在其长度的至少50、60、70、80、85、90、95或99％上具有至少70％、80％、90％、95％或99％的互补性。
有义序列的同一性或反义序列的同源性都不需要与靶序列具有100％的互补性。
在一个实施方案中，将调节性多核苷酸的茎环结构的有义和反义序列分开的是环序列(也称为环基序、接头或接头基序)。环序列可以具有任何长度，在4-30个核苷酸之间、在4-20个核苷酸之间、在4-15个核苷酸之间、在5-15个核苷酸之间、在6-12个核苷酸之间、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、11个核苷酸、12个核苷酸、13个核苷酸、14个核苷酸和/或15个核苷酸。
在一些实施方案中，环序列包含编码至少一个UGUG基序的核酸序列。在一些实施方案中，编码UGUG基序的核酸序列位于环序列的5’末端。
在一个实施方案中，间隔区可以存在于调节性多核苷酸中以将一个或多个模块(例如5’侧翼区、环基序区、3’侧翼区、有义序列、反义序列)彼此分开。可以存在一个或多个这样的间隔区。
在一个实施方案中，在有义序列和侧翼区序列之间可以存在8-20个(即8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)核苷酸的间隔区。
在一个实施方案中，间隔区的长度为13个核苷酸，并且位于有义序列的5’末端和侧翼序列的3’末端之间。在一个实施方案中，间隔子具有足以形成序列的大约一个螺旋转角的长度。
在一个实施方案中，在反义序列和侧翼区序列之间可以存在8-20个(即8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)核苷酸的间隔区。
在一个实施方案中，间隔序列的长度为10-13个(即10、11、12或13个)核苷酸，并且位于反义序列的3’末端和侧翼序列的5’末端之间。在一个实施方案中，间隔子具有足以形成序列的大约一个螺旋转角的长度。
在一个实施方案中，调节性多核苷酸的分子支架在5’至3’方向上包含5’侧翼序列、5’臂、环基序、3’臂和3’侧翼序列。作为非限制性实例，5’臂可包含编码有义序列的核酸序列，3’臂可包含编码反义序列的核酸序列。在另一个非限制性实例中，5’臂包含编码反义序列的核酸序列，而3’臂包含编码有义序列的核酸序列。
在一个实施方案中，可以改变5’臂、有义和/或反义序列、环基序和/或3’臂序列(例如，取代1个或更多个核苷酸、添加核苷酸和/或删除核苷酸)。该改变可引起构建体功能的有益变化(例如，增加靶序列的敲低、减少构建体的降解、降低靶效应、增加有效载荷的效率并减少有效载荷的降解)。
在一个实施方案中，将调节性多核苷酸的分子支架进行比对，以使引导链(在本文中也称为反义链)的切除率大于过客链(也称为有义链)的切除率。引导或过客链的切除率可以独立地为1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或超过99％。作为非限制性实例，引导链的切除率为至少80％。作为另一个非限制性实例，引导链的切除率为至少90％。
在一个实施方案中，引导链的切除率大于过客链的切除率。一方面，引导链的切除率可以比过客链高至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或大于99％。
在一个实施方案中，引导链的切除效率为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或大于99％。作为非限制性示例，引导线的切除效率大于80％。
在一个实施方案中，从分子支架上切除引导链的效率大于切除过客链的效率。从分子支架切除引导链可以比切除过客链的效率高2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10倍。
在一个实施方案中，分子支架包含双重功能的靶向调节性多核苷酸。如本文所用，“双功能靶向”调节性多核苷酸是其中引导链和过客链均敲低相同靶或引导链和过客链敲低不同靶的多核苷酸。
在一个实施方案中，本文所述的调节性多核苷酸的分子支架可包含5’侧翼区、环基序区和3’侧翼区。在本文所述的调节性多核苷酸中可使用或使用其片段的5’侧翼区、环基序区域(也可称为接头区)和3’侧翼区的序列的非限制性实例如表5-7所示。
表5.分子支架的5’侧翼区
Figure BDA0002356059890002331
Figure BDA0002356059890002341
表6.分子支架的环基序区
Figure BDA0002356059890002342
表7.分子支架的3’侧翼区
Figure BDA0002356059890002351
在一个实施方案中，分子支架可包含表5中列出的至少一个5’侧翼区，其片段或变体。作为非限制性实例，5’侧翼区可以是5F1、5F2、5F3、5F4、5F5、5F6、5F7、5F8或5F9。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F1侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F2侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F3侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F4侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F5侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F6侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F7侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F8侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F9侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含表6中列出的至少一个环基序区、其片段或变体。作为非限制性实例，环基序区域可以是L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9或L10。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L1环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L2环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L3环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L4环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L5环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L6环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L7环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L8环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L9环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L10环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含表7中所列的至少一个3’侧翼区、其片段或变体。作为非限制性实例，3’侧翼区可以是3F1、3F2、3F3、3F4、3F5、3F6或3F7。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个3F1侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个3F2侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个3F3侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个3F4侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个3F5侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个3F6侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个3F7侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含表5和6中所述的至少一个5’侧翼区、其片段或变体，以及至少一个环基序区、其片段或变体。作为非限制性实例，5’侧翼区和环基序区可以是5F1和L1、5F1和L2、5F1和L3、5F1和L4、5F1和L5、5F1和L6、5F1和L7、5F1和L8、5F1和L9、5F1和L10、5F2和L1、5F2和L2、5F2和L3、5F2和L4、5F2和L5、5F2和L6、5F2和L7、5F2和L8、5F2和L9、5F2和L10、5F3和L1、5F3和L2、5F3和L3、5F3和L4、5F3和L5、5F3和L6、5F3和L7、5F3和L8、5F3和L9、5F3和L10、5F4和L1、5F4和L2、5F4和L3、5F4和L4、5F4和L5、5F4和L6、5F4和L7、5F4和L8、5F4和L9、5F4和L10、5F5和L1、5F5和L2、5F5和L3、5F5和L4、5F5和L5、5F5和L6、5F5和L7、5F5和L8、5F5和L9、5F5和L10、5F6和L1、5F6和L2、5F6和L3、5F6和L4、5F6和L5、5F6和L6、5F6和L7、5F6和L8、5F6和L9、5F6和L10、5F7和L1、5F7和L2、5F7和L3、5F7和L4、5F7和L5、5F7和L6、5F7和L7、5F7和L8、5F7和L9、5F7和L10、5F8和L1、5F8和L2、5F8和L3、5F8和L4、5F8和L5、5F8和L6、5F8和L7、5F8和L8、5F8和L9、5F8和L10、5F9和L1、5F9和L2、5F9和L3、5F9和L4、5F9和L5、5F9和L6、5F9和L7、5F9和L8、5F9和L9，以及5F9和L10。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F2侧翼区和至少一个L1环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F1侧翼区和至少一个L4环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F7侧翼区和至少一个L8环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F3侧翼区和至少一个L4环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F3侧翼区和至少一个L5环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F4侧翼区和至少一个L4环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F3侧翼区和至少一个L7环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F5侧翼区和至少一个L4环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F6侧翼区和至少一个L4环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F3侧翼区和至少一个L6环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F7侧翼区和至少一个L4环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F2侧翼区和至少一个L2环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F1侧翼区和至少一个L1环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F1侧翼区和至少一个L2环基序区。
在一个实施方案中，分子支架可包含如表6和7所述的至少一个3’侧翼区、其片段或变体，和至少一个基序区、其片段或变体。作为非限制性实例，3’侧翼区和环基序区可以是3F1和L1、3F1和L2、3F1和L3、3F1和L4、3F1和L5、3F1和L6、3F1和L7、3F1和L8、3F1和L9、3F1和L10、3F2和L1、3F2和L2、3F2和L3、3F2和L4、3F2和L5、3F2和L6、3F2和L7、3F2和L8、3F2和L9、3F2和L10、3F3和L1、3F3和L2、3F3和L3、3F3和L4、3F3和L5、3F3和L6、3F3和L7、3F3和L8、3F3和L9、3F3和L10、3F4和L1、3F4和L2、3F4和L3、3F4和L4、3F4和L5、3F4和L6、3F4和L7、3F4和L8、3F4和L9、3F4和L10、3F5和L1、3F5和L2、3F5和L3、3F5和L4、3F5和L5、3F5和L6、3F5和L7、3F5和L8、3F5和L9、3F5和L10、3F6和L1、3F6和L2、3F6和L3、3F6和L4、3F6和L5、3F6和L6、3F6和L7、3F6和L8、3F6和L9、3F6和L10、3F7和L1、3F7和L2、3F7和L3、3F7和L4、3F7和L5、3F7和L6、3F7和L7、3F7和L8、3F7和L9，以及3F7和L10。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L1环基序区和至少一个3F2侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L4环基序区和至少一个3F1侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L8环基序区和至少一个3F5侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L5环基序区和至少3F1侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L4环基序区和至少一个3F4侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L7环基序区和至少一个3F1侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L6环基序区和至少一个3F1侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L4环基序区和至少一个3F5侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L2环基序区和至少一个3F2侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L1环基序区和至少一个3F3侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L5环基序区和至少一个3F4侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L1环基序区和至少一个3F1侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个L2环基序区和至少一个3F1侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含如表5和7所述的至少一个5’侧翼区、其片段或变体，和至少一个3’侧翼区、其片段或变体。作为非限制性实例，侧翼区可以是5F1和3F1、5F1和3F2、5F1和3F3、5F1和3F4、5F1和3F5、5F1和3F6、5F1和3F7、5F2和3F1、5F2和3F2、5F2和3F3、5F2和3F4、5F2和3F5、5F2和3F6、5F2和3F7、5F3和3F1、5F3和3F2、5F3和3F3、5F3和3F4、5F3和3F5、5F3和3F6、5F3和3F7、5F4和3F1、5F4和3F2、5F4和3F3、5F4和3F4、5F4和3F5、5F4和3F6、5F4和3F7、5F5和3F1、5F5和3F2、5F5和3F3、5F5和3F4、5F5和3F5、5F5和3F6、5F5和3F7、5F6和3F1、5F6和3F2、5F6和3F3、5F6和3F4、5F6和3F5、5F6和3F6、5F6和3F7、5F7和3F1、5F7和3F2、5F7和3F3、5F7和3F4、5F7和3F5、5F7和3F6、5F7和3F7、5F8和3F1、5F8和3F2、5F8和3F3、5F8和3F4、5F8和3F5、5F8和3F6，以及5F8和3F7、5F9和3F1、5F9和3F2、5F9和3F3、5F9和3F4、5F9和3F5、5F9和3F6，以及5F9和3F7。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F2 5’侧翼区和至少一个3F2 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F1 5’侧翼区和至少一个3F1 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F7 5’侧翼区和至少一个3F5 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F3 5’侧翼区和至少一个3F1 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F4 5’侧翼区和至少一个3F4 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F5 5’侧翼区和至少一个3F4 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F6 5’侧翼区和至少一个3F1 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F2 5’侧翼区和至少一个3F3 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F3 5’侧翼区和至少一个3F4 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F1 5’侧翼区和至少一个3F2 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含如表5-7所述的至少一个5’侧翼区、其片段或变体，至少一个环基序区、其片段或变体，和至少一个3’侧翼区。作为非限制性实例，侧翼区和环基序区可以是5F1、L1和3F1；5F1、L1和3F2；5F1、L1和3F3；5F1、L1和3F4；5F1、L1和3F5；5F1、L1和3F6；5F1、L1和3F7；5F2、L1和3F1；5F2、L1和3F2；5F2、L1和3F3；5F2、L1和3F4；5F2、L1和3F5；5F2、L1和3F6；5F2、L1和3F7；5F3、L1和3F1；5F3、L1和3F2；5F3、L1和3F3；5F3、L1和3F4；5F3、L1和3F5；5F3、L1和3F6；5F3、L1和3F7；5F4、L1和3F1；5F4、L1和3F2；5F4、L1和3F3；5F4、L1和3F4；5F4、L1和3F5；5F4、L1和3F6；5F4、L1和3F7；5F5、L1和3F1；5F5、L1和3F2；5F5、L1和3F3；5F5、L1和3F4；5F5、L1和3F5；5F5、L1和3F6；5F5、L1和3F7；5F6、L1和3F1；5F6、L1和3F2；5F6、L1和3F3；5F6、L1和3F4；5F6、L1和3F5；5F6、L1和3F6；5F6、L1和3F7；5F7、L1和3F1；5F7、L1和3F2；5F7、L1和3F3；5F7、L1和3F4；5F7、L1和3F5；5F7、L1和3F6；5F7、L1和3F7；5F8、L1和3F1；5F8、L1和3F2；5F8、L1和3F3；5F8、L1和3F4；5F8、L1和3F5；5F8、L1和3F6；5F8、L1和3F7；5F9、L1和3F1；5F9、L1和3F2；5F9、L1和3F3；5F9、L1和3F4；5F9、L1和3F5；5F9、L1和3F6；5F9、L1和3F7；5F1、L2和3F1；5F1、L2和3F2；5F1、L2和3F3；5F1、L2和3F4；5F1、L2和3F5；5F1、L2和3F6；5F1、L2和3F7；5F2、L2和3F1；5F2、L2和3F2；5F2、L2和3F3；5F2、L2和3F4；5F2、L2和3F5；5F2、L2和3F6；5F2、L2和3F7；5F3、L2和3F1；5F3、L2和3F2；5F3、L2和3F3；5F3、L2和3F4；5F3、L2和3F5；5F3、L2和3F6；5F3、L2和3F7；5F4、L2和3F1；5F4、L2和3F2；5F4、L2和3F3；5F4、L2和3F4；5F4、L2和3F5；5F4、L2和3F6；5F4、L2和3F7；5F5、L2和3F1；5F5、L2和3F2；5F5、L2和3F3；5F5、L2和3F4；5F5、L2和3F5；5F5、L2和3F6；5F5、L2和3F7；5F6、L2和3F1；5F6、L2和3F2；5F6、L2和3F3；5F6、L2和3F4；5F6、L2和3F5；5F6、L2和3F6；5F6、L2和3F7；5F7、L2和3F1；5F7、L2和3F2；5F7、L2和3F3；5F7、L2和3F4；5F7、L2和3F5；5F7、L2和3F6；5F7、L2和3F7；5F8、L2和3F1；5F8、L2和3F2；5F8、L2和3F3；5F8、L2和3F4；5F8、L2和3F5；5F8、L2和3F6；5F8、L2和3F7；5F9、L2和3F1；5F9、L2和3F2；5F9、L2和3F3；5F9、L2和3F4；5F9、L2和3F5；5F9、L2和3F6；5F9、L2和3F7；5F1、L3和3F1；5F1、L3和3F2；5F1、L3和3F3；5F1、L3和3F4；5F1、L3和3F5；5F1、L3和3F6；5F1、L3和3F7；5F2、L3和3F1；5F2、L3和3F2；5F2、L3和3F3；5F2、L3和3F4；5F2、L3和3F5；5F2、L3和3F6；5F2、L3和3F7；5F3、L3和3F1；5F3、L3和3F2；5F3、L3和3F3；5F3、L3和3F4；5F3、L3和3F5；5F3、L3和3F6；5F3、L3和3F7；5F4、L3和3F1；5F4、L3和3F2；5F4、L3和3F3；5F4、L3和3F4；5F4、L3和3F5；5F4、L3和3F6；5F4、L3和3F7；5F5、L3和3F1；5F5、L3和3F2；5F5、L3和3F3；5F5、L3和3F4；5F5、L3和3F5；5F5、L3和3F6；5F5、L3和3F7；5F6、L3和3F1；5F6、L3和3F2；5F6、L3和3F3；5F6、L3和3F4；5F6、L3和3F5；5F6、L3和3F6；5F6、L3和3F7；5F7、L3和3F1；5F7、L3和3F2；5F7、L3和3F3；5F7、L3和3F4；5F7、L3和3F5；5F7、L3和3F6；5F7、L3和3F7；5F8、L3和3F1；5F8、L3和3F2；5F8、L3和3F3；5F8、L3和3F4；5F8、L3和3F5；5F8、L3和3F6；5F8、L3和3F7；5F9、L3和3F1；5F9、L3和3F2；5F9、L3和3F3；5F9、L3和3F4；5F9、L3和3F5；5F9、L3和3F6；5F9、L3和3F7；5F1、L4和3F1；5F1、L4和3F2；5F1、L4和3F3；5F1、L4和3F4；5F1、L4和3F5；5F1、L4和3F6；5F1、L4和3F7；5F2、L4和3F1；5F2、L4和3F2；5F2、L4和3F3；5F2、L4和3F4；5F2、L4和3F5；5F2、L4和3F6；5F2、L4和3F7；5F3、L4和3F1；5F3、L4和3F2；5F3、L4和3F3；5F3、L4和3F4；5F3、L4和3F5；5F3、L4和3F6；5F3、L4和3F7；5F4、L4和3F1；5F4、L4和3F2；5F4、L4和3F3；5F4、L4和3F4；5F4、L4和3F5；5F4、L4和3F6；5F4、L4和3F7；5F5、L4和3F1；5F5、L4和3F2；5F5、L4和3F3；5F5、L4和3F4；5F5、L4和3F5；5F5、L4和3F6；5F5、L4和3F7；5F6、L4和3F1；5F6、L4和3F2；5F6、L4和3F3；5F6、L4和3F4；5F6、L4和3F5；5F6、L4和3F6；5F6、L4和3F7；5F7、L4和3F1；5F7、L4和3F2；5F7、L4和3F3；5F7、L4和3F4；5F7、L4和3F5；5F7、L4和3F6；5F7、L4和3F7；5F8、L4和3F1；5F8、L4和3F2；5F8、L4和3F3；5F8、L4和3F4；5F8、L4和3F5；5F8、L4和3F6；5F8、L4和3F7；5F9、L4和3F1；5F9、L4和3F2；5F9、L4和3F3；5F9、L4和3F4；5F9、L4和3F5；5F9、L4和3F6；5F9、L4和3F7；5F1、L5和3F1；5F1、L5和3F2；5F1、L5和3F3；5F1、L5和3F4；5F1、L5和3F5；5F1、L5和3F6；5F1、L5和3F7；5F2、L5和3F1；5F2、L5和3F2；5F2、L5和3F3；5F2、L5和3F4；5F2、L5和3F5；5F2、L5和3F6；5F2、L5和3F7；5F3、L5和3F1；5F3、L5和3F2；5F3、L5和3F3；5F3、L5和3F4；5F3、L5和3F5；5F3、L5和3F6；5F3、L5和3F7；5F4、L5和3F1；5F4、L5和3F2；5F4、L5和3F3；5F4、L5和3F4；5F4、L5和3F5；5F4、L5和3F6；5F4、L5和3F7；5F5、L5和3F1；5F5、L5和3F2；5F5、L5和3F3；5F5、L5和3F4；5F5、L5和3F5；5F5、L5和3F6；5F5、L5和3F7；5F6、L5和3F1；5F6、L5和3F2；5F6、L5和3F3；5F6、L5和3F4；5F6、L5和3F5；5F6、L5和3F6；5F6、L5和3F7；5F7、L5和3F1；5F7、L5和3F2；5F7、L5和3F3；5F7、L5和3F4；5F7、L5和3F5；5F7、L5和3F6；5F7、L5和3F7；5F8、L5和3F1；5F8、L5和3F2；5F8、L5和3F3；5F8、L5和3F4；5F8、L5和3F5；5F8、L5和3F6；5F8、L5和3F7；5F9、L5和3F1；5F9、L5和3F2；5F9、L5和3F3；5F9、L5和3F4；5F9、L5和3F5；5F9、L5和3F6；5F9、L5和3F7；5F1、L6和3F1；5F1、L6和3F2；5F1、L6和3F3；5F1、L6和3F4；5F1、L6和3F5；5F1、L6和3F6；5F1、L6和3F7；5F2、L6和3F1；5F2、L6和3F2；5F2、L6和3F3；5F2、L6和3F4；5F2、L6和3F5；5F2、L6和3F6；5F2、L6和3F7；5F3、L6和3F1；5F3、L6和3F2；5F3、L6和3F3；5F3、L6和3F4；5F3、L6和3F5；5F3、L6和3F6；5F3、L6和3F7；5F4、L6和3F1；5F4、L6和3F2；5F4、L6和3F3；5F4、L6和3F4；5F4、L6和3F5；5F4、L6和3F6；5F4、L6和3F7；5F5、L6和3F1；5F5、L6和3F2；5F5、L6和3F3；5F5、L6和3F4；5F5、L6和3F5；5F5、L6和3F6；5F5、L6和3F7；5F6、L6和3F1；5F6、L6和3F2；5F6、L6和3F3；5F6、L6和3F4；5F6、L6和3F5；5F6、L6和3F6；5F6、L6和3F7；5F7、L6和3F1；5F7、L6和3F2；5F7、L6和3F3；5F7、L6和3F4；5F7、L6和3F5；5F7、L6和3F6；5F7、L6和3F7；5F8、L6和3F1；5F8、L6和3F2；5F8、L6和3F3；5F8、L6和3F4；5F8、L6和3F5；5F8、L6和3F6；5F8、L6和3F7；5F9、L6和3F1；5F9、L6和3F2；5F9、L6和3F3；5F9、L6和3F4；5F9、L6和3F5；5F9、L6和3F6；5F9、L6和3F7；5F1、L7和3F1；5F1、L7和3F2；5F1、L7和3F3；5F1、L7和3F4；5F1、L7和3F5；5F1、L7和3F6；5F1、L7和3F7；5F2、L7和3F1；5F2、L7和3F2；5F2、L7和3F3；5F2、L7和3F4；5F2、L7和3F5；5F2、L7和3F6；5F2、L7和3F7；5F3、L7和3F1；5F3、L7和3F2；5F3、L7和3F3；5F3、L7和3F4；5F3、L7和3F5；5F3、L7和3F6；5F3、L7和3F7；5F4、L7和3F1；5F4、L7和3F2；5F4、L7和3F3；5F4、L7和3F4；5F4、L7和3F5；5F4、L7和3F6；5F4、L7和3F7；5F5、L7和3F1；5F5、L7和3F2；5F5、L7和3F3；5F5、L7和3F4；5F5、L7和3F5；5F5、L7和3F6；5F5、L7和3F7；5F6、L7和3F1；5F6、L7和3F2；5F6、L7和3F3；5F6、L7和3F4；5F6、L7和3F5；5F6、L7和3F6；5F6、L7和3F7；5F7、L7和3F1；5F7、L7和3F2；5F7、L7和3F3；5F7、L7和3F4；5F7、L7和3F5；5F7、L7和3F6；5F7、L7和3F7；5F8、L7和3F1；5F8、L7和3F2；5F8、L7和3F3；5F8、L7和3F4；5F8、L7和3F5；5F8、L7和3F6；5F8、L7和3F7；；5F9、L7和3F1；5F9、L7和3F2；5F9、L7和3F3；5F9、L7和3F4；5F9、L7和3F5；5F9、L7和3F6；5F9、L7和3F7；5F1、L8和3F1；5F1、L8和3F2；5F1、L8和3F3；5F1、L8和3F4；5F1、L8和3F5；5F1、L8和3F6；5F1、L8和3F7；5F2、L8和3F1；5F2、L8和3F2；5F2、L8和3F3；5F2、L8和3F4；5F2、L8和3F5；5F2、L8和3F6；5F2、L8和3F7；5F3、L8和3F1；5F3、L8和3F2；5F3、L8和3F3；5F3、L8和3F4；5F3、L8和3F5；5F3、L8和3F6；5F3、L8和3F7；5F4、L8和3F1；5F4、L8和3F2；5F4、L8和3F3；5F4、L8和3F4；5F4、L8和3F5；5F4、L8和3F6；5F4、L8和3F7；5F5、L8和3F1；5F5、L8和3F2；5F5、L8和3F3；5F5、L8和3F4；5F5、L8和3F5；5F5、L8和3F6；5F5、L8和3F7；5F6、L8和3F1；5F6、L8和3F2；5F6、L8和3F3；5F6、L8和3F4；5F6、L8和3F5；5F6、L8和3F6；5F6、L8和3F7；5F7、L8和3F1；5F7、L8和3F2；5F7、L8和3F3；5F7、L8和3F4；5F7、L8和3F5；5F7、L8和3F6；5F7、L8和3F7；5F8、L8和3F1；5F8、L8和3F2；5F8、L8和3F3；5F8、L8和3F4；5F8、L8和3F5；5F8、L8和3F6；5F8、L8和3F7；5F9、L8和3F1；5F9、L8和3F2；5F9、L8和3F3；5F9、L8和3F4；5F9、L8和3F5；5F9、L8和3F6；5F9、L8和3F7；5F1、L9和3F1；5F1、L9和3F2；5F1、L9和3F3；5F1、L9和3F4；5F1、L9和3F5；5F1、L9和3F6；5F1、L9和3F7；5F2、L9和3F1；5F2、L9和3F2；5F2、L9和3F3；5F2、L9和3F4；5F2、L9和3F5；5F2、L9和3F6；5F2、L9和3F7；5F3、L9和3F1；5F3、L9和3F2；5F3、L9和3F3；5F3、L9和3F4；5F3、L9和3F5；5F3、L9和3F6；5F3、L9和3F7；5F4、L9和3F1；5F4、L9和3F2；5F4、L9和3F3；5F4、L9和3F4；5F4、L9和3F5；5F4、L9和3F6；5F4、L9和3F7；5F5、L9和3F1；5F5、L9和3F2；5F5、L9和3F3；5F5、L9和3F4；5F5、L9和3F5；5F5、L9和3F6；5F5、L9和3F7；5F6、L9和3F1；5F6、L9和3F2；5F6、L9和3F3；5F6、L9和3F4；5F6、L9和3F5；5F6、L9和3F6；5F6、L9和3F7；5F7、L9和3F1；5F7、L9和3F2；5F7、L9和3F3；5F7、L9和3F4；5F7、L9和3F5；5F7、L9和3F6；5F7、L9和3F7；5F8、L9和3F1；5F8、L9和3F2；5F8、L9和3F3；5F8、L9和3F4；5F8、L9和3F5；5F8、L9和3F6；5F8、L9和3F7；5F9、L9和3F1；5F9、L9和3F2；5F9、L9和3F3；5F9、L9和3F4；5F9、L9和3F5；5F9、L9和3F6；5F9、L9和3F7；5F1、L10和3F1；5F1、L10和3F2；5F1、L10和3F3；5F1、L10和3F4；5F1、L10和3F5；5F1、L10和3F6；5F1、L10和3F7；5F2、L10和3F1；5F2、L10和3F2；5F2、L10和3F3；5F2、L10和3F4；5F2、L10和3F5；5F2、L10和3F6；5F2、L10和3F7；5F3、L10和3F1；5F3、L10和3F2；5F3、L10和3F3；5F3、L10和3F4；5F3、L10和3F5；5F3、L10和3F6；5F3、L10和3F7；5F4、L10和3F1；5F4、L10和3F2；5F4、L10和3F3；5F4、L10和3F4；5F4、L10和3F5；5F4、L10和3F6；5F4、L10和3F7；5F5、L10和3F1；5F5、L10和3F2；5F5、L10和3F3；5F5、L10和3F4；5F5、L10和3F5；5F5、L10和3F6；5F5、L10和3F7；5F6、L10和3F1；5F6、L10和3F2；5F6、L10和3F3；5F6、L10和3F4；5F6、L10和3F5；5F6、L10和3F6；5F6、L10和3F7；5F7、L10和3F1；5F7、L10和3F2；5F7、L10和3F3；5F7、L10和3F4；5F7、L10和3F5；5F7、L10和3F6；5F7、L10和3F7；5F8、L10和3F1；5F8、L10和3F2；5F8、L10和3F3；5F8、L10和3F4；5F8、L10和3F5；5F8、L10和3F6；5F8、L10和3F7；5F9、L10和3F1；5F9、L10和3F2；5F9、L10和3F3；5F9、L10和3F4；5F9、L10和3F5；5F9、L10和3F6；以及5F9、L10和3F7。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F2 5’侧翼区、至少一个L1环基序区和至少一个3F2 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F1 5’侧翼区、至少一个L4环基序区和至少一个3F1 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F7 5’侧翼区、至少一个L8环基序区和至少一个3F5 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F3 5’侧翼区、至少一个L4环基序区和至少一个3F1 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F3 5’侧翼区、至少一个L5环基序区和至少一个3F1 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F4 5’侧翼区、至少一个L4环基序区和至少一个3F4 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F3 5’侧翼区、至少一个L7环基序区和至少一个3F1 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F5 5’侧翼区、至少一个L4环基序区和至少一个3F4 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F6 5’侧翼区、至少一个L4环基序区和至少一个3F1 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F3 5’侧翼区、至少一个L6环基序区和至少一个3F1 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F7 5’侧翼区、至少一个L4环基序区和至少一个3F5 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F2 5’侧翼区、至少一个L2环基序区和至少一个3F2 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F2 5’侧翼区、至少一个L1环基序区和至少一个3F3 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F3 5’侧翼区、至少一个L5环基序区和至少一个3F4 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F1 5’侧翼区、至少一个L1环基序区和至少一个3F1 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F1 5’侧翼区、至少一个L2环基序区和至少一个3F1 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F1 5’侧翼区、至少一个L1环基序区和至少一个3F2 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5F2 5’侧翼区、至少一个L3环基序区和至少一个3F3 3’侧翼区。
在一个实施方案中，分子支架可以是天然的pri-miRNA支架。作为非限制性实例，分子支架可以是衍生自人miR155支架的支架。
在一个实施方案中，分子支架可包含一种或多种本领域已知的接头。接头可以将区域或一个分子支架与另一个区域或分子支架分开。作为非限制性实例，分子支架可以是多顺反子。
包含分子支架和靶向SOD1的siRNA分子的调节性多核苷酸
在一个实施方案中，调节性多核苷酸可包含表8和9中所述的5’和3’侧翼区、环基序区和编码有义序列和反义序列的核酸序列。在表8和9中，描述了过客链和引导链的DNA序列标识符，以及5’和3’侧翼区和环区(也称为接头区)。在表8和表9中，序列名称的“miR”组分不一定与miRNA基因的序列编号相对应(例如VOYSOD1miR-102是序列的名称，并不一定意味着miR-102是序列的一部分)。
表8.SOD1调节性多核苷酸序列区(5’至3’)
Figure BDA0002356059890002471
Figure BDA0002356059890002481
Figure BDA0002356059890002491
表9.SOD1调节性多核苷酸序列区(5’至3’)
Figure BDA0002356059890002492
包含调节性多核苷酸的AAV颗粒
在一个实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，其具有包含调节性多核苷酸序列的有效载荷区。在这样的实施方案中，可以复制编码多于一种多肽的病毒基因组，并将其包装到病毒颗粒中。用包含调节性多核苷酸的病毒颗粒转导的靶细胞可以在单个细胞中表达编码的有义和/或反义序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒在医学领域中可用于治疗、预防、缓解或改善神经学疾病和/或病症。
在一个实施方案中，可以将包含调节性多核苷酸序列的AAV颗粒引入哺乳动物细胞，所述调节性多核苷酸序列包含编码至少一个siRNA分子的核酸序列。
AAV颗粒有效载荷区包含调节性多核苷酸时，调节性多核苷酸可包含有义和/或反义序列以敲低靶基因。编码本文所述的调节性多核苷酸的AAV病毒基因组可用于人类疾病、病毒、感染、兽医应用以及各种体内和体外环境的领域。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个反向末端重复(ITR)区。一个或多个ITR区的长度可以独立地为例如但不限于75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174和175个核苷酸。病毒基因组的ITR区的长度可以是75-80、75-85、75-100、80-85、80-90、80-105、85-90、85-95、85-110、90-95、90-100、90-115、95-100、95-105、95-120、100-105、100-110、100-125、105-110、105-115、105-130、110-115、110-120、110-135、115-120、115-125、115-140、120-125、120-130、120-145、125-130、125-135、125-150、130-135、130-140、130-155、135-140、135-145、135-160、140-145、140-150、140-165、145-150、145-155、145-170、150-155、150-160、150-175、155-160、155-165、160-165、160-170、165-170、165-175和170-175个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸的ITR。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约141个核苷酸的ITR。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约130个核苷酸的ITR。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含两个反向末端重复(ITR)区。每个ITR区的长度可以独立是例如但不限于75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174和175个氨基酸。病毒基因组的ITR区的长度可以是75-80、75-85、75-100、80-85、80-90、80-105、85-90、85-95、85-110、90-95、90-100、90-115、95-100、95-105、95-120、100-105、100-110、100-125、105-110、105-115、105-130、110-115、110-120、110-135、115-120、115-125、115-140、120-125、120-130、120-145、125-130、125-135、125-150、130-135、130-140、130-155、135-140、135-145、135-160、140-145、140-150、140-165、145-150、145-155、145-170、150-155、150-160、150-175、155-160、155-165、160-165、160-170、165-170、165-175和170-175个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸和长度为约141个核苷酸的ITR。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸和长度为约130个核苷酸的ITR。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约130个核苷酸和长度为141个核苷酸的ITR。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个如表10-17中所述的序列区。这些区域可以位于本文所述的任何其他序列区域之前或之后。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含至少一个反向末端重复(ITR)序列区。表10中描述了ITR序列区的非限制性实例。
表10.反向末端重复(ITR)序列区
序列区名称 SEQ ID NO
ITR1 1370
ITR2 1371
ITR3 1372
ITR4 1373
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含两个ITR序列区。在一个实施方案中，ITR序列区是ITR1序列区和ITR3序列区。在一个实施方案中，ITR序列区是ITR1序列区和ITR4序列区。在一个实施方案中，ITR序列区是ITR2序列区和ITR3序列区。在一个实施方案中，ITR序列区是ITR2序列区和ITR4序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个多克隆位点(MCS)序列区。MCS区的长度可以独立地为例如但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149和150个核苷酸。病毒基因组的MCS区的长度可以是2-10、5-10、5-15、10-20、10-30、10-40、15-20、15-25、20-30、20-40、20-50、25-30、25-35、30-40、30-50、30-60、35-40、35-45、40-50、40-60、40-70、45-50、45-55、50-60、50-70、50-80、55-60、55-65、60-70、60-80、60-90、65-70、65-75、70-80、70-90、70-100、75-80、75-85、80-90、80-100、80-110、85-90、85-95、90-100、90-110、90-120、95-100、95-105、100-110、100-120、100-130、105-110、105-115、110-120、110-130、110-140、115-120、115-125、120-130、120-140、120-150、125-130、125-135、130-140、130-150、135-140、135-145、140-150和145-150个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约5个核苷酸的MCS区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约10个核苷酸的MCS区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约14个核苷酸的MCS区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约18个核苷酸的MCS区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约73个核苷酸的MCS区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约121个核苷酸的MCS区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含至少一个多克隆位点(MCS)序列区。表11描述了MCS序列区的非限制性实例。
表11.多个克隆位点(MCS)序列区
Figure BDA0002356059890002531
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含一个MCS序列区。在一个实施方案中，MCS序列区是MCS1序列区。在一个实施方案中，MCS序列区是MCS2序列区。在一个实施方案中，MCS序列区是MCS3序列区。在一个实施方案中，MCS序列区是MCS4序列区。在一个实施方案中，MCS序列区是MCS5序列区。在一个实施方案中，MCS序列区是MCS6序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含两个MCS序列区。在一个实施方案中，两个MCS序列区是MCS1序列区和MCS2序列区。在一个实施方案中，两个MCS序列区是MCS1序列区和MCS3序列区。在一个实施方案中，两个MCS序列区是MCS1序列区和MCS4序列区。在一个实施方案中，两个MCS序列区是MCS1序列区和MCS5序列区。在一个实施方案中，两个MCS序列区是MCS1序列区和MCS6序列区。在一个实施方案中，两个MCS序列区是MCS2序列区和MCS3序列区。在一个实施方案中，两个MCS序列区是MCS2序列区和MCS4序列区。在一个实施方案中，两个MCS序列区是MCS2序列区和MCS5序列区。在一个实施方案中，两个MCS序列区是MCS2序列区和MCS6序列区。在一个实施方案中，两个MCS序列区是MCS3序列区和MCS4序列区。在一个实施方案中，两个MCS序列区是MCS3序列区和MCS5序列区。在一个实施方案中，两个MCS序列区是MCS3序列区和MCS6序列区。在一个实施方案中，两个MCS序列区是MCS4序列区和MCS5序列区。在一个实施方案中，两个MCS序列区是MCS4序列区和MCS6序列区。在一个实施方案中，两个MCS序列区是MCS5序列区和MCS6序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含两个或更多个MCS序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含3个MCS序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS1序列区、MCS2序列区和MCS3序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS1序列区、MCS2序列区和MCS4序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS1序列区、MCS2序列区和MCS5序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS1序列区、MCS2序列区和MCS6序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS1序列区、MCS3序列区和MCS4序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS1序列区、MCS3序列区和MCS5序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS1序列区、MCS3序列区和MCS6序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS1序列区、MCS4序列区和MCS5序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS1序列区、MCS4序列区和MCS6序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS1序列区、MCS5序列区和MCS6序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS2序列区、MCS3序列区和MCS4序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS2序列区、MCS3序列区和MCS5序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS2序列区、MCS3序列区和MCS6序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS2序列区、MCS4序列区和MCS5序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS2序列区、MCS4序列区和MCS6序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS2序列区、MCS5序列区和MCS6序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS3序列区、MCS4序列区和MCS5序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS3序列区、MCS4序列区和MCS6序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS3序列区、MCS5序列区和MCS6序列区。在一个实施方案中，3个MCS序列区是MCS4序列区、MCS5序列区和MCS6序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个多重填充序列区(multiple filler sequence)。填充序列区的长度可以独立地是例如但不限于50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024、1025、1026、1027、1028、1029、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1036、1037、1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1071、1072、1073、1074、1075、1076、1077、1078、1079、1080、1081、1082、1083、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096、1097、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109、1110、1111、1112、1113、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1121、1122、1123、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133、1134、1135、1136、1137、1138、1139、1140、1141、1142、1143、1144、1145、1146、1147、1148、1149、1150、1151、1152、1153、1154、1155、1156、1157、1158、1159、1160、1161、1162、1163、1164、1165、1166、1167、1168、1169、1170、1171、1172、1173、1174、1175、1176、1177、1178、1179、1180、1181、1182、1183、1184、1185、1186、1187、1188、1189、1190、1191、1192、1193、1194、1195、1196、1197、1198、1199、1200、1201、1202、1203、1204、1205、1206、1207、1208、1209、1210、1211、1212、1213、1214、1215、1216、1217、1218、1219、1220、1221、1222、1223、1224、1225、1226、1227、1228、1229、1230、1231、1232、1233、1234、1235、1236、1237、1238、1239、1240、1241、1242、1243、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3244、3245、3246、3247、3248、3249和3250个核苷酸。病毒基因组的任何填充区的长度可以是50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150、1150-1200、1200-1250、1250-1300、1300-1350、1350-1400、1400-1450、1450-1500、1500-1550、1550-1600、1600-1650、1650-1700、1700-1750、1750-1800、1800-1850、1850-1900、1900-1950、1950-2000、2000-2050、2050-2100、2100-2150、2150-2200、2200-2250、2250-2300、2300-2350、2350-2400、2400-2450、2450-2500、2500-2550、2550-2600、2600-2650、2650-2700、2700-2750、2750-2800、2800-2850、2850-2900、2900-2950、2950-3000、3000-3050、3050-3100、3100-3150、3150-3200和3200-3250个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约55个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约56个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约97个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约103个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约357个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约363个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约712个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约714个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1203个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1209个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1512个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1519个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约2395个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约2403个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约2405个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约3013个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约3021个核苷酸的填充区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个多重填充序列区。填充区的长度可以独立地为例如但不限于50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024、1025、1026、1027、1028、1029、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1036、1037、1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1071、1072、1073、1074、1075、1076、1077、1078、1079、1080、1081、1082、1083、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096、1097、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109、1110、1111、1112、1113、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1121、1122、1123、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133、1134、1135、1136、1137、1138、1139、1140、1141、1142、1143、1144、1145、1146、1147、1148、1149、1150、1151、1152、1153、1154、1155、1156、1157、1158、1159、1160、1161、1162、1163、1164、1165、1166、1167、1168、1169、1170、1171、1172、1173、1174、1175、1176、1177、1178、1179、1180、1181、1182、1183、1184、1185、1186、1187、1188、1189、1190、1191、1192、1193、1194、1195、1196、1197、1198、1199、1200、1201、1202、1203、1204、1205、1206、1207、1208、1209、1210、1211、1212、1213、1214、1215、1216、1217、1218、1219、1220、1221、1222、1223、1224、1225、1226、1227、1228、1229、1230、1231、1232、1233、1234、1235、1236、1237、1238、123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9、2240、2241、2242、2243、2244、2245、2246、2247、2248、2249、2250、2251、2252、2253、2254、2255、2256、2257、2258、2259、2260、2261、2262、2263、2264、2265、2266、2267、2268、2269、2270、2271、2272、2273、2274、2275、2276、2277、2278、2279、2280、2281、2282、2283、2284、2285、2286、2287、2288、2289、2290、2291、2292、2293、2294、2295、2296、2297、2298、2299、2300、2301、2302、2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2310、2311、2312、2313、2314、2315、2316、2317、2318、2319、2320、2321、2322、2323、2324、2325、2326、2327、2328、2329、2330、2331、2332、2333、2334、2335、2336、2337、2338、2339、2340、2341、2342、2343、2344、2345、2346、2347、2348、2349、2350、2351、2352、2353、2354、2355、2356、2357、2358、2359、2360、2361、2362、2363、2364、2365、2366、2367、2368、2369、2370、2371、2372、2373、2374、2375、2376、2377、2378、2379、2380、2381、2382、2383、2384、2385、2386、2387、2388、2389、2390、2391、2392、2393、2394、2395、2396、2397、2398、2399、2400、2401、2402、2403、2404、2405、2406、2407、2408、2409、2410、2411、2412、2413、2414、2415、2416、2417、2418、2419、2420、2421、2422、2423、2424、2425、2426、2427、2428、2429、2430、2431、2432、2433、2434、2435、2436、2437、2438、2439、2440、2441、2442、2443、2444、2445、2446、2447、2448、2449、2450、2451、2452、2453、2454、2455、2456、2457、2458、2459、2460、2461、2462、2463、2464、2465、2466、2467、2468、2469、2470、2471、2472、2473、2474、2475、2476、2477、2478、2479、2480、2481、2482、2483、2484、2485、2486、2487、2488、2489、2490、2491、2492、2493、2494、2495、2496、2497、2498、2499、2500、2501、2502、2503、2504、2505、2506、2507、2508、2509、2510、2511、2512、2513、2514、2515、2516、2517、2518、2519、2520、2521、2522、2523、2524、2525、2526、2527、2528、2529、2530、2531、2532、2533、2534、2535、2536、2537、2538、2539、2540、2541、2542、2543、2544、2545、2546、2547、2548、2549、2550、2551、2552、2553、2554、2555、2556、2557、2558、2559、2560、2561、2562、2563、2564、2565、2566、2567、2568、2569、2570、2571、2572、2573、2574、2575、2576、2577、2578、2579、2580、2581、2582、2583、2584、2585、2586、2587、2588、2589、2590、2591、2592、2593、2594、2595、2596、2597、2598、2599、2600、2601、2602、2603、2604、2605、2606、2607、2608、2609、2610、2611、2612、2613、2614、2615、2616、2617、2618、2619、2620、2621、2622、2623、2624、2625、2626、2627、2628、2629、2630、2631、2632、2633、2634、2635、2636、2637、2638、2639、2640、2641、2642、2643、2644、2645、2646、2647、2648、2649、2650、2651、2652、2653、2654、2655、2656、2657、2658、2659、2660、2661、2662、2663、2664、2665、2666、2667、2668、2669、2670、2671、2672、2673、2674、2675、2676、2677、2678、2679、2680、2681、2682、2683、2684、2685、2686、2687、2688、2689、2690、2691、2692、2693、2694、2695、2696、2697、2698、2699、2700、2701、2702、2703、2704、2705、2706、2707、2708、2709、2710、2711、2712、2713、2714、2715、2716、2717、2718、2719、2720、2721、2722、2723、2724、2725、2726、2727、2728、2729、2730、2731、2732、2733、2734、2735、2736、2737、2738、2739、2740、2741、2742、2743、2744、2745、2746、2747、2748、2749、2750、2751、2752、2753、2754、2755、2756、2757、2758、2759、2760、2761、2762、2763、2764、2765、2766、2767、2768、2769、2770、2771、2772、2773、2774、2775、2776、2777、2778、2779、2780、2781、2782、2783、2784、2785、2786、2787、2788、2789、2790、2791、2792、2793、2794、2795、2796、2797、2798、2799、2800、2801、2802、2803、2804、2805、2806、2807、2808、2809、2810、2811、2812、2813、2814、2815、2816、2817、2818、2819、2820、2821、2822、2823、2824、2825、2826、2827、2828、2829、2830、2831、2832、2833、2834、2835、2836、2837、2838、2839、2840、2841、2842、2843、2844、2845、2846、2847、2848、2849、2850、2851、2852、2853、2854、2855、2856、2857、2858、2859、2860、2861、2862、2863、2864、2865、2866、2867、2868、2869、2870、2871、2872、2873、2874、2875、2876、2877、2878、2879、2880、2881、2882、2883、2884、2885、2886、2887、2888、2889、2890、2891、2892、2893、2894、2895、2896、2897、2898、2899、2900、2901、2902、2903、2904、2905、2906、2907、2908、2909、2910、2911、2912、2913、2914、2915、2916、2917、2918、2919、2920、2921、2922、2923、2924、2925、2926、2927、2928、2929、2930、2931、2932、2933、2934、2935、2936、2937、2938、2939、2940、2941、2942、2943、2944、2945、2946、2947、2948、2949、2950、2951、2952、2953、2954、2955、2956、2957、2958、2959、2960、2961、2962、2963、2964、2965、2966、2967、2968、2969、2970、2971、2972、2973、2974、2975、2976、2977、2978、2979、2980、2981、2982、2983、2984、2985、2986、2987、2988、2989、2990、2991、2992、2993、2994、2995、2996、2997、2998、2999、3000、3001、3002、3003、3004、3005、3006、3007、3008、3009、3010、3011、3012、3013、3014、3015、3016、3017、3018、3019、3020、3021、3022、3023、3024、3025、3026、3027、3028、3029、3030、3031、3032、3033、3034、3035、3036、3037、3038、3039、3040、3041、3042、3043、3044、3045、3046、3047、3048、3049、3050、3051、3052、3053、3054、3055、3056、3057、3058、3059、3060、3061、3062、3063、3064、3065、3066、3067、3068、3069、3070、3071、3072、3073、3074、3075、3076、3077、3078、3079、3080、3081、3082、3083、3084、3085、3086、3087、3088、3089、3090、3091、3092、3093、3094、3095、3096、3097、3098、3099、3100、3101、3102、3103、3104、3105、3106、3107、3108、3109、3110、3111、3112、3113、3114、3115、3116、3117、3118、3119、3120、3121、3122、3123、3124、3125、3126、3127、3128、3129、3130、3131、3132、3133、3134、3135、3136、3137、3138、3139、3140、3141、3142、3143、3144、3145、3146、3147、3148、3149、3150、3151、3152、3153、3154、3155、3156、3157、3158、3159、3160、3161、3162、3163、3164、3165、3166、3167、3168、3169、3170、3171、3172、3173、3174、3175、3176、3177、3178、3179、3180、3181、3182、3183、3184、3185、3186、3187、3188、3189、3190、3191、3192、3193、3194、3195、3196、3197、3198、3199、3200、3201、3202、3203、3204、3205、3206、3207、3208、3209、3210、3211、3212、3213、3214、3215、3216、3217、3218、3219、3220、3221、3222、3223、3224、3225、3226、3227、3228、3229、3230、3231、3232、3233、3234、3235、3236、3237、3238、3239、3240、3241、3242、3243、3244、3245、3246、3247、3248、3249和3250个核苷酸。病毒基因组的任何填充区的长度可以是50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150、1150-1200、1200-1250、1250-1300、1300-1350、1350-1400、1400-1450、1450-1500、1500-1550、1550-1600、1600-1650、1650-1700、1700-1750、1750-1800、1800-1850、1850-1900、1900-1950、1950-2000、2000-2050、2050-2100、2100-2150、2150-2200、2200-2250、2250-2300、2300-2350、2350-2400、2400-2450、2450-2500、2500-2550、2550-2600、2600-2650、2650-2700、2700-2750、2750-2800、2800-2850、2850-2900、2900-2950、2950-3000、3000-3050、3050-3100、3100-3150、3150-3200和3200-3250个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约55个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约56个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约97个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约103个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约357个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约363个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约712个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约714个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1203个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1209个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1512个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1519个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约2395个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约2403个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约2405个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约3013个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约3021个核苷酸的填充区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含至少一个填充序列区。表12中描述了填充序列区的非限制性实例。
表12.填充序列区
序列区名称 SEQ ID NO
FILL1 1379
FILL2 1380
FILL3 1381
FILL4 1382
FILL5 1383
FILL6 1384
FILL7 1385
FILL8 1386
FILL9 1387
FILL10 1388
FILL11 1389
FILL12 1390
FILL13 1391
FILL14 1392
FILL15 1393
FILL16 1394
FILL17 1395
FILL18 1396
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含一个填充序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL2序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL4序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL5序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL6序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL7序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL8序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL9序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL18序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含两个填充序列区。在一个实施方案中，两个填充序列区是FILL1序列区和FILL2序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL3序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL4序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL5序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL6序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL7序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL8序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL9序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL2序列区和FILL3序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区和FILL4序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区和FILL5序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区和FILL6序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区和FILL7序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区和FILL8序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区和FILL9序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL3序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL4序列区和FILL5序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL4序列区和FILL6序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL4序列区和FILL7序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL4序列区和FILL8序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL4序列区和FILL9序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL4序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL4序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL4序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL4序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL4序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL4序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL4序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL4序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL4序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL5序列区和FILL6序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL5序列区和FILL7序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL5序列区和FILL8序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL5序列区和FILL9序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL5序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL5序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL5序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL5序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL5序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL5序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL5序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL5序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL5序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL6序列区和FILL7序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL6序列区和FILL8序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL6序列区和FILL9序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL6序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL6序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL6序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL6序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL6序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL6序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL6序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL6序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL6序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL7序列区和FILL8序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL7序列区和FILL9序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL7序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL7序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL7序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL7序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL7序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL7序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL7序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL7序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL7序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL8序列区和FILL9序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL8序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL8序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL8序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL8序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL8序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL8序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL8序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL8序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL8序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL9序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL9序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL9序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL9序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL9序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL9序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL9序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL9序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL9序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL10序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL10序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL10序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL10序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL10序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL10序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL10序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL10序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL11序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL11序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL11序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL11序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL11序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL11序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL11序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL12序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL12序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL12序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL12序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL12序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL12序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL13序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL13序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL13序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL13序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL13序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL14序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL14序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL14序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL14序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL15序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL15序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL15序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL16序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL16序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL17序列区和FILL18序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含3个填充序列区。在一个实施方案中，两个填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL3序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL4序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL5序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL6序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL7序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL8序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL9序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL2序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL3序列区和FILL4序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL3序列区和FILL5序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL3序列区和FILL6序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL3序列区和FILL7序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL3序列区和FILL8序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL3序列区和FILL9序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL3序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL3序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL3序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL3序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL3序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL3序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL3序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL3序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL3序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL4序列区和FILL5序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL4序列区和FILL6序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL4序列区和FILL7序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL4序列区和FILL8序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL4序列区和FILL9序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL4序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL4序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL4序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL4序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL4序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL4序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL4序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL4序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL4序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL5序列区和FILL6序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL5序列区和FILL7序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL5序列区和FILL8序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL5序列区和FILL9序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL5序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL5序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL5序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL5序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL5序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL5序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL5序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL5序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL5序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL6序列区和FILL7序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL6序列区和FILL8序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL6序列区和FILL9序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL6序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL6序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL6序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL6序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL6序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL6序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL6序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL6序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL6序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL7序列区和FILL8序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL7序列区和FILL9序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL7序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL7序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL7序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL7序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL7序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL7序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL7序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL7序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL7序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL8序列区和FILL9序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL8序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL8序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL8序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL8序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL8序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL8序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL8序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL8序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL8序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL9序列区和FILL10序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL9序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL9序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL9序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL9序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL9序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL9序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL9序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL9序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL10序列区和FILL11序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL10序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL10序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL10序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL10序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL10序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL10序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL10序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL11序列区和FILL12序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL11序列区和FILL13序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL11序列区和FILL14序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL11序列区和FILL15序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL11序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL11序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL11序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL1序列区、FILL12序列区和FIL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区是FILL13序列区、FILL16序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL13序列区、FILL17序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL14序列区、FILL15序列区和FILL16序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL14序列区、FILL15序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL14序列区、FILL15序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL14序列区、FILL16序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL14序列区、FILL16序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL14序列区、FILL17序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL15序列区、FILL16序列区和FILL17序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL15序列区、FILL16序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL15序列区、FILL17序列区和FILL18序列区。在一个实施方案中，填充序列区是FILL16序列区、FILL17序列区和FILL18序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个增强子序列区。增强子序列区的长度可以独立地是例如但不限于300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399和400个核苷酸。病毒基因组的增强子区的长度可以是300-310、300-325、305-315、310-320、315-325、320-330、325-335、325-350、330-340、335-345、340-350、345-355、350-360、350-375、355-365、360-370、365-375、370-380、375-385、375-400、380-390、385-395和390-400个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约303个核苷酸的增强子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约382个核苷酸的增强子区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含至少一个增强子序列区。表13中描述了增强子序列区的非限制性实例。
表13.增强子序列区
序列区名称 SEQ ID NO
增强子1 1397
增强子2 1398
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含一个增强子序列区。在一个实施方案中，增强子序列区是增强子1序列区。在一个实施方案中，增强子序列区是增强子2序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含两个增强子序列区。在一个实施方案中，增强子序列区是增强子1序列区和增强子2序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个启动子序列区。启动子序列区的长度可以独立地是例如但不限于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599和600个核苷酸。病毒基因组的启动子区的长度可以是4-10、10-20、10-50、20-30、30-40、40-50、50-60、50-100、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、100-150、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、150-200、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、200-250、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、250-300、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310、300-350、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、350-400、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、400-450、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、450-500、460-470、470-480、480-490、490-500、500-510、500-550、510-520、520-530、530-540、540-550、550-560、550-600、560-570、570-580、580-590和590-600个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约4个核苷酸的启动子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约17个核苷酸的启动子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约204个核苷酸的启动子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约219个核苷酸的启动子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约260个核苷酸的启动子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约303个核苷酸的启动子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约382个核苷酸的启动子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约588个核苷酸的启动子区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含至少一个启动子序列区。表14中描述了启动子序列区的非限制性实例。
表14.启动子序列区
Figure BDA0002356059890003131
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含一个启动子序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子1。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子2。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子3。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子4。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子5。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子6。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含两个启动子序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子1序列区和启动子2序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子1序列区和启动子3序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子1序列区和启动子4序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子1序列区和启动子5序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子1序列区和启动子6序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子2序列区和启动子3序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子2序列区和启动子4序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子2序列区和启动子5序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子2序列区和启动子6序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子3序列区和启动子4序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子3序列区和启动子5序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子3序列区和启动子6序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子4序列区和启动子5序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子4序列区和启动子6序列区。在一个实施方案中，启动子序列区是启动子5序列区和启动子6序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个外显子序列区。外显子区的长度可以独立地是例如但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149和150个核苷酸。病毒基因组的外显子区域的长度可以是2-10、5-10、5-15、10-20、10-30、10-40、15-20、15-25、20-30、20-40、20-50、25-30、25-35、30-40、30-50、30-60、35-40、35-45、40-50、40-60、40-70、45-50、45-55、50-60、50-70、50-80、55-60、55-65、60-70、60-80、60-90、65-70、65-75、70-80、70-90、70-100、75-80、75-85、80-90、80-100、80-110、85-90、85-95、90-100、90-110、90-120、95-100、95-105、100-110、100-120、100-130、105-110、105-115、110-120、110-130、110-140、115-120、115-125、120-130、120-140、120-150、125-130、125-135、130-140、130-150、135-140、135-145、140-150和145-150个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约53个核苷酸的外显子区域。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约134个核苷酸的外显子区域。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含至少一个外显子序列区。表15中描述了外显子序列区的非限制性实例。
表15.外显子序列区
序列区名称 SEQ ID NO
外显子1 1404
外显子2 1405
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含一个外显子序列区。在一个实施方案中，外显子序列区是外显子1序列区。在一个实施方案中，外显子序列区是外显子2序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含两个外显子序列区。在一个实施方案中，外显子序列区是外显子1序列区和外显子2序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个内含子序列区。内含子区的长度可以独立地是例如但不限于25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349和350个核苷酸。病毒基因组的内含子区的长度可以是25-35、25-50、35-45、45-55、50-75、55-65、65-75、75-85、75-100、85-95、95-105、100-125、105-115、115-125、125-135、125-150、135-145、145-155、150-175、155-165、165-175、175-185、175-200、185-195、195-205、200-225、205-215、215-225、225-235、225-250、235-245、245-255、250-275、255-265、265-275、275-285、275-300、285-295、295-305、300-325、305-315、315-325、325-335、325-350和335-345个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约32个核苷酸的内含子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约172个核苷酸的内含子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约201个核苷酸的内含子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约347个核苷酸的内含子区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含至少一个内含子序列区。表16中描述了内含子序列区的非限制性实例。
表16.内含子序列区
序列区名称 SEQ ID NO
内含子1 1406
内含子2 1407
内含子3 1408
内含子4 1409
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含一个内含子序列区。在一个实施方案中，内含子序列区是内含子1序列区。在一个实施方案中，内含子序列区是内含子2序列区。在一个实施方案中，内含子序列区是内含子3序列区。在一个实施方案中，内含子序列区是内含子4序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含两个内含子序列区。在一个实施方案中，内含子序列区是内含子1序列区和内含子2序列区。在一个实施方案中，内含子序列区是内含子1序列区和内含子3序列区。在一个实施方案中，内含子序列区是内含子1序列区和内含子4序列区。在一个实施方案中，内含子序列区是内含子2序列区和内含子3序列区。在一个实施方案中，内含子序列区是内含子2序列区和内含子4序列区。在一个实施方案中，内含子序列区是内含子3序列区和内含子4序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含3个内含子序列区。在一个实施方案中，内含子序列区是内含子1序列区、内含子2序列区和内含子3序列区。在一个实施方案中，内含子序列区是内含子1序列区、内含子2序列区和内含子4序列区。在一个实施方案中，内含子序列区是内含子1序列区、内含子3序列区和内含子4序列区。在一个实施方案中，内含子序列区是内含子2序列区、内含子3序列区和内含子4序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个聚腺苷酸化信号序列区。聚腺苷酸化信号区序列区的长度可以独立地是例如但不限于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599和600个核苷酸。病毒基因组的聚腺苷酸化信号序列区可以是4-10、10-20、10-50、20-30、30-40、40-50、50-60、50-100、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、100-150、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、150-200、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、200-250、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、250-300、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310、300-350、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、350-400、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、400-450、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、450-500、460-470、470-480、480-490、490-500、500-510、500-550、510-520、520-530、530-540、540-550、550-560、550-600、560-570、570-580、580-590和590-600个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约127个核苷酸的聚腺苷酸化信号序列区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约225个核苷酸的聚腺苷酸化信号序列区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约476个核苷酸的聚腺苷酸化信号序列区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约477个核苷酸的聚腺苷酸化信号序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含至少一个聚腺苷酸化(polyA)信号序列区。表17中描述了polyA信号序列区的非限制性实例。
表17.PolyA信号序列区
Figure BDA0002356059890003191
Figure BDA0002356059890003201
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含一个polyA信号序列区。在一个实施方案中，polyA信号序列区是PolyA1序列区。在一个实施方案中，polyA信号序列区是PolyA2序列区。在一个实施方案中，polyA信号序列区是PolyA3序列区。在一个实施方案中，polyA信号序列区是PolyA4序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含多于一个polyA信号序列区。
表18中描述了包含病毒基因组的AAV颗粒的ITR至ITR序列的非限制性实例，所述病毒基因组具有包含调节性多核苷酸序列的有效载荷。
表18.包含调节性多核苷酸的AAV颗粒的ITR至ITR序列
Figure BDA0002356059890003202
在一个实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，该病毒基因组包含与SEQ ID NO:1414-1417、2240和2241中任一个具有百分比同一性的序列。病毒基因组可能与SEQ ID NO:1414-1417、2240和2241中任一个具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。病毒基因组可能与SEQ ID NO:1414-1417、2240和2241中任一个具有1-10％、10-20％、30-40％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-99％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-99％、60-100％、70-80％、70-90％、70-99％、70-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-100％、90-95％、90-99％或90-100％的同一性。作为非限制性实例，病毒基因组包含与SEQ ID NO:1414-1417、2240和2241中任一个具有80％同一性的序列。作为另一个非限制性实例，病毒基因组包含与SEQ ID NO:1414-1417、2240和2241中任一个具有85％同一性的序列。作为另一个非限制性实例，病毒基因组包含与SEQ ID NO:1414-1417、2240和2241中任一个具有90％同一性的序列。作为另一个非限制性实例，病毒基因组包含与SEQ ID NO:1414-1417、2240和2241中任一个具有95％同一性的序列。作为另一个非限制性实例，病毒基因组包含与SEQ ID NO:1414-1417、2240和2241中任一个具有99％同一性的序列。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含至少一个反向末端重复(ITR)序列区、至少一个多克隆位点(MCS)序列区、至少一个外显子序列区、至少一个内含子序列区、至少一个调节性多核苷酸区和至少一个聚腺苷酸化信号序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含5’反向末端重复(ITR)序列区和3’ITR序列区、两个多克隆位点(MCS)序列区、外显子序列区、两个内含子序列区、调节性多核苷酸区和聚腺苷酸化信号序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含5’反向末端重复(ITR)序列区和3’ITR序列区、两个MCS序列区、外显子序列区(人β球蛋白(hb球蛋白)外显子3或其片段)、两个内含子序列区(iel内含子1和hb球蛋白内含子2或其片段)、调节性多核苷酸区和兔β球蛋白聚腺苷酸化信号序列区。表19描述了用于具有上述所有序列模块的本发明的AAV颗粒中的ITR至ITR序列的非限制性实例。在表19中，描述了序列区的序列标识符或序列(区域SEQ IDNO)和序列区长度(区域长度)，以及ITR至ITR序列的名称和序列标识符(例如，VOYSOD1(SEQID NO:1414))。
表19.ITR至ITR序列中的序列区
Figure BDA0002356059890003211
Figure BDA0002356059890003221
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含SEQ ID NO：1414(VOYSOD1)，其包含5’反向末端重复(ITR)序列区和3’ITR序列区、两个多克隆位点(MCS)序列区、外显子序列区域、两个内含子序列区(iel内含子1和hb球蛋白内含子2)、调节性多核苷酸区和兔球蛋白聚腺苷酸化信号序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含SEQ ID NO：1416(VOYSOD3)，其包含5’反向末端重复(ITR)序列区和3’ITR序列区、两个多克隆位点(MCS)序列区、外显子序列区域、两个内含子序列区域(iel内含子1和hb球蛋白内含子2)、调节性多核苷酸区和兔球蛋白聚腺苷酸化信号序列区域。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含5’反向末端重复(ITR)序列区和3’ITR序列区、多克隆位点(MCS)序列区、两个外显子序列区，两个内含子序列区、调节性多核苷酸区和聚腺苷酸化信号序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含5’反向末端重复(ITR)序列区和3’ITR序列区、MCS序列区、两个外显子序列区(iel外显子1、人β球蛋白(hb球蛋白)外显子3或其片段)、两个内含子序列区域(iel内含子1和hb球蛋白内含子2或其片段)、调节性多核苷酸区和兔β球蛋白聚腺苷酸化信号序列区。表20描述了用于具有上述所有序列模块的本发明的AAV颗粒中的ITR至ITR序列的非限制性实例。在表20中，描述了序列区)的序列标识符或序列(区域SEQ ID NO和序列区长度(区域长度)，以及ITR至ITR序列的名称和序列标识符(例如，VOYSOD2(SEQ ID NO:1415))。
表20.ITR至ITR序列中的序列区
Figure BDA0002356059890003231
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含SEQ ID NO：1415(VOYSOD2)，其包含5’反向末端重复(ITR)序列区和3’ITR序列区、多克隆位点(MCS)序列区、两个外显子序列区、两个内含子序列区(iel内含子1和hb球蛋白内含子2)、调节性多核苷酸区和兔球蛋白聚腺苷酸化信号序列区。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含SEQ ID NO：1416(VOYSOD4)，其包含5’反向末端重复(ITR)序列区和3’ITR序列区、多克隆位点(MCS)序列区、两个外显子序列区、两个内含子序列区域(iel内含子1和hb球蛋白内含子2)、调节性多核苷酸区和兔球蛋白聚腺苷酸化信号序列区。
可以修饰AAV颗粒以增强递送效率。这样的包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的修饰的AAV颗粒可以被有效地包装，并且可以被用于以高频率和最小的毒性成功地感染靶细胞。
在一些实施方案中，包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以是人血清型AAV颗粒。这样的人AAV颗粒可以源自任何已知的血清型，例如源自血清型AAV1-AAV11中的任何一种。作为非限制性实例，AAV颗粒可以是在AAV1衍生的衣壳中包含AAV1衍生的基因组的载体；在AAV2衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体；在AAV4衍生的衣壳中包含AAV4衍生的基因组的载体；在AAV6衍生的衣壳中包含AAV6衍生的基因组的载体或在AAV9衍生的衣壳中包含AAV9衍生的基因组的载体。
在其他实施方案中，包含用于编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以是假型杂交或嵌合AAV颗粒，其包含源自至少两个不同的AAV血清型的序列和/或组分。假型AAV颗粒可以是包含衍生自一种AAV血清型的AAV基因组和至少部分衍生自不同AAV血清型的衣壳蛋白的载体。作为非限制性实例，此类假型AAV颗粒可以是在AAV1衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体；或在AAV6衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体；或在AAV4衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体；或在AAV9衍生衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体。以类似的方式，本发明涵盖任何杂交或嵌合AAV颗粒。
在其他实施方案中，包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以用于将siRNA分子递送至中枢神经系统(例如，美国专利号6,180,613；其内容通过引用整体并入本文)。
在一些方面，包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以进一步包含修饰的衣壳，其包括来自非病毒来源的肽。在其他方面，AAV颗粒可以包含CNS特异性嵌合衣壳，以促进将编码的siRNA双链体递送至脑和脊髓。例如，可以构建来自显示CNS嗜性的AAV变体的cap核苷酸序列的比对，以识别可变区(VR)序列和结构。
病毒生产
本公开提供了通过在病毒复制细胞中进行病毒基因组复制来生产细小病毒颗粒(例如AAV颗粒)的方法，包括使病毒复制细胞与AAV多核苷酸或AAV基因组接触。
本公开提供了一种生产具有增强的(增加的、提高的)转导效率的AAV颗粒的方法，该方法包括以下步骤：1)用杆粒载体和病毒构建载体和/或AAV有效载荷构建体载体共转染感受态细菌细胞，2)分离所得的病毒构建体表达载体和AAV有效载荷构建体表达载体，并分别转染病毒复制细胞，3)分离并纯化所得的有效载荷和包含病毒构建体表达载体或AAV有效载荷构建体表达载体的病毒构建体颗粒；4)用AAV有效载荷和包含病毒构建体表达载体或AAV有效载荷构建体表达载体的病毒构建体颗粒共同感染病毒复制细胞，5)收获并纯化包含细小病毒基因组的病毒颗粒。
在一个实施方案中，本发明提供了一种生产AAV颗粒的方法，其包括以下步骤：1)同时用有效载荷区、表达rep和cap基因的构建体和辅助构建体共转染哺乳动物细胞(例如但不限于HEK293细胞)，2)收获并纯化包含病毒基因组的AAV颗粒。
细胞
本公开提供了包含AAV多核苷酸和/或AAV基因组的细胞。
本文公开的病毒生产描述了用于产生与靶细胞接触以递送有效载荷构建体(例如重组病毒构建体)的过程和方法，有效载荷构建体包含编码有效载荷分子的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，AAV颗粒可以在病毒复制细胞(包括昆虫细胞)中生产。
培养中昆虫细胞的生长条件以及培养中异源产物在昆虫细胞中的生产是本领域众所周知的，参见美国专利号6,204,059，其内容通过引用整体并入本文。
根据本发明，可以使用允许细小病毒复制并且可以在培养物中维持的任何昆虫细胞。可以使用来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的细胞系(包括但不限于Sf9或Sf21细胞系)、果蝇细胞系或蚊子细胞系(例如白纹伊蚊(Aedes albopictus)衍生的细胞系)。昆虫细胞表达异源蛋白质的用途已得到充分证明，将核酸(例如载体，例如昆虫细胞相容性载体)引入此类细胞的方法以及在培养中维持此类细胞的方法也是如此。参见例如Methods in Molecular Biology,ed.Richard,Humana Press,NJ(1995)；O’Reilly等人,Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,Oxford Univ.Press(1994)；Samulski等人,J.Vir.63:3822-8(1989)；Kajigaya等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 88:4646-50(1991)；Ruffing等人,J.Vir.66:6922-30(1992)；Kimbauer等人,Vir.219:37-44(1996)；Zhao等人,Vir.272:382-93(2000)；和Samulski等人,美国专利号6,204,059，其各自内容通过引用整体并入本文。
病毒复制细胞可以选自任何生物有机体，包括原核(例如细菌)细胞和真核细胞(包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞)。病毒复制细胞可包含哺乳动物细胞，例如A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO.W138、HeLa、HEK293、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、HepG2和衍生自哺乳动物的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。病毒复制细胞包含衍生自哺乳动物物种(包括但不限于人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠)的细胞，或细胞类型，包括但不限于成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞、细胞系转化细胞等。
小批量AAV颗粒生产
本文公开的病毒生产描述了用于生产与靶细胞接触以递送有效载荷(例如重组病毒构建体)的AAV颗粒的过程和方法，有效载荷包含编码有效载荷的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，可以在包括哺乳动物细胞的病毒复制细胞中生产AAV颗粒。
通常用于生产重组AAV颗粒的病毒复制细胞包括但不限于293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞和如以下中描述的其他哺乳动物细胞系：美国专利6,156,303、5,387,484、5,741,683、5,691,176和5,688,676；美国专利申请2002/0081721和国际专利申请WO 00/47757、WO 00/24916和WO 96/17947，其各自内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中生产AAV颗粒，其中所有3种VP蛋白均以接近1：1：10(VP1：VP2：VP3)的化学计量表达。允许这种受控表达水平的调节机制包括产生通过差异剪接产生的两种mRNA，一种用于VP1，另一种用于VP2和VP3。
在另一个实施方案中，使用3重转染方法在哺乳动物细胞中生产AAV颗粒，其中有效载荷构建体、细小病毒Rep和细小病毒cap以及辅助构建体包含在3个不同的构建体中。AAV颗粒生产的3个组分的3重转染方法可用于生产少量病毒，用于包括转导效率、靶组织(嗜性)评估和稳定性的测定。
杆状病毒
本文公开的颗粒生产描述了用于产生与靶细胞接触以递送有效载荷构建体的AAV颗粒的过程和方法，所述有效载荷构建体包括编码有效载荷的多核苷酸序列。
简而言之，通过本领域技术人员已知和执行的标准分子生物学技术，通过转座子供体/受体系统将病毒构建体载体和AAV有效载荷构建体载体各自并入杆粒(bacmid)，也称为杆状病毒质粒。分别的病毒复制细胞群的转染产生两种杆状病毒，一种包含病毒构建体表达载体，另一种包含AAV有效载荷构建体表达载体。两种杆状病毒可用于感染单个病毒复制细胞群以生产AAV颗粒。
用于在昆虫细胞(包括但不限于草地贪夜蛾(Sf9)细胞)中生产病毒颗粒的杆状病毒表达载体可提供高滴度的病毒颗粒产物。编码病毒构建体表达载体和AAV有效载荷构建体表达载体的重组杆状病毒引发了病毒复制细胞的生产性感染。从初次感染中释放出的感染性杆状病毒颗粒会二次感染培养物中的其他细胞，并在多个感染周期中指数性地感染整个细胞培养群体，其是感染初始多重性的函数，参见Urabe,M.等人,J Virol.2006年2月；80(4):1874-85,其内容通过引用整体并入本文。
用杆状病毒在昆虫细胞系统中生产AAV颗粒可解决已知的杆状病毒的遗传和物理不稳定性。在一个实施方案中，该生产系统通过利用无滴度的感染细胞保存和放大系统来解决杆状病毒多次传代后的不稳定性。用编码病毒颗粒的结构，非结构组分的病毒表达构建体转染病毒生产细胞的小规模接种培养物。将感染杆状病毒的病毒生产细胞收获为等分试样，其可以冷冻保存在液氮中；等分试样保留了感染大规模病毒生产细胞培养物的活力和感染性，Wasilko DJ等人,Protein Expr Purif.2009年6月；65(2):122-32,其内容通过引用整体并入本文。
遗传稳定的杆状病毒可用于生产一种或多种用于在无脊椎动物细胞中生产AAV颗粒的组分的来源。在一个实施方案中，缺陷型杆状病毒表达载体可以在昆虫细胞中游离地维持。在这样的实施方案中，杆粒载体用复制控制元件工程化，复制控制元件包括但不限于启动子、增强子和/或细胞周期调节的复制元件。
在一个实施方案中，杆状病毒可以用(非)选择性标记物工程化以重组成几丁质酶/组织蛋白酶基因座。chia/v-cath基因座对于在组织培养中传播杆状病毒不是必需的，而V-cath(EC 3.4.22.50)是半胱氨酸内切蛋白酶，其对含Arg-Arg二肽的底物最有活性。浓核病毒和细小病毒衣壳结构蛋白中存在Arg-Arg二肽，但在依赖病毒VP1中不常出现。
在一个实施方案中，允许杆状病毒感染的稳定病毒复制细胞用AAV复制和病毒颗粒生产所必需的元件的至少一个稳定的整合拷贝进行工程化，所述元件包括但不限于整个AAV基因组、Rep和Cap基因、Rep基因、Cap基因、作为一个单独的转录盒的各Rep蛋白、作为一个单独的转录盒的各VP蛋白、AAP(装配激活蛋白)或至少一个带有天然或非天然启动子的杆状病毒辅助基因。
大规模生产
在一些实施方案中，可以修改AAV颗粒生产以增加生产规模。根据本公开的大规模病毒生产方法可以包括任何以下文献教导的那些：美国专利号5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498和7,491,508，或国际公开号WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999015685、WO1999047691、WO2000055342、WO2000075353和WO2001023597，其各自内容通过引用整体并入本文。增加病毒颗粒生产规模的方法通常包括增加病毒复制细胞的数量。在一些实施方案中，病毒复制细胞包含贴壁细胞。为了增加贴壁的病毒复制细胞生产的病毒颗粒的规模，需要更大的细胞培养表面。在某些情况下，大规模生产方法包括使用滚瓶来增加细胞培养表面。具有增加的表面积的其他细胞培养衬底是本领域已知的。具有增加的表面积的其他贴壁细胞培养产物的实例包括但不限于
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(Corning Corp.,Corning,NY)和NuncTM Cell FactoryTM(Thermo Scientific,Waltham,MA.)。在一些情况下，大规模的贴壁细胞表面可以占约1,000cm2至约100,000cm2。在一些情况下，大规模贴壁细胞培养物可包含约107至约109个细胞、约108至约1010个细胞、约109至约1012个细胞或至少1012个细胞。在一些情况下，大规模贴壁培养物可产生约109至约1012、约1010至约1013、约1011至约1014、约1012至约1015或至少1015个病毒颗粒。
在一些实施方案中，本公开的大规模病毒生产方法可包括使用悬浮细胞培养物。悬浮细胞培养可以显著增加细胞数量。通常，可以在约10-50cm2的表面积上生长的贴壁细胞的数量可以在悬浮液中以约1cm3的体积生长。
可以按照本领域已知的任何方法进行大规模培养形式的复制细胞的转染。对于大规模贴壁细胞培养，转染方法可包括但不限于使用无机化合物(例如磷酸钙)、有机化合物[例如聚乙烯亚胺(PEI)]或使用非化学方法(例如电穿孔)。随着细胞在悬浮液中生长，转染方法可包括但不限于使用磷酸钙和PEI。在某些情况下，可以根据Feng，L.等人，2008.Biotechnol Appl.Biochem.50:121-32所述的题为“Transfection Procedure”的部分进行大规模悬浮培养物的转染，其内容通过引用整体并入本文。根据这样的实施方案，可以形成PEI-DNA复合物用于引入待转染的质粒。在某些情况下，用PEI-DNA复合物转染的细胞在转染前可能会被“休克(shocked)”。这包括将细胞培养温度降低至4℃约1小时。在某些情况下，细胞培养物可能会休克约10分钟至约5小时。在某些情况下，细胞培养物可在约0℃至约20℃的温度下休克。
在一些情况下，转染可包括一种或多种用于表达RNA效应分子以减少从一种或多种AAV有效载荷构建体的核酸表达的载体。这样的方法可以通过减少浪费在表达有效载荷构建体上的细胞资源来增强病毒颗粒的产生。在某些情况下，可以根据美国公开号US2014/0099666中教导的方法来实施这样的方法，其内容通过引用整体并入本文。
生物反应器
在一些实施方案中，细胞培养生物反应器可用于大规模病毒生产。在某些情况下，生物反应器包括搅拌釜反应器。这类反应器通常包括具有搅拌器(例如叶轮)的通常为圆柱形的容器。在一些实施方案中，可以将这样的生物反应器容器放置在水套内以控制容器温度和/或使环境温度变化的影响最小化。生物反应器容器体积的大小范围可以从约500ml至约2L、从约1L至约5L、从约2.5L至约20L、从约10L至约50L、从约25L至约100L、从约75L至约500L、从约250L至约2,000L、从约1,000L至约10,000L、从约5,000L至约50,000L或至少50,000L。容器底部可以是圆形或扁平的。在某些情况下，动物细胞培养物可维持在具有圆形容器底部的生物反应器中。
在某些情况下，可通过使用热循环器来加热生物反应器容器。热循环器将加热的水泵送到水套周围。在某些情况下，可将加热的水泵送通过生物反应器容器内存在的管道(例如盘管)。在某些情况下，热空气可以在生物反应器周围循环，包括但不限于培养基正上方的空气空间。另外，可以维持pH和CO2水平以优化细胞活力。
在某些情况下，生物反应器可以包括中空纤维反应器。中空纤维生物反应器可以支持锚定依赖性和锚定非依赖性细胞的培养。其他生物反应器可包括但不限于填充床或固定床生物反应器。这类生物反应器可以包括带有玻璃珠的容器，用于贴壁细胞贴壁。另外的填充床反应器可以包含陶瓷珠。
在某些情况下，病毒颗粒是通过使用一次性生物反应器生产的。在一些实施方案中，此类生物反应器可包括WaveTM一次性生物反应器。
在一些实施方案中，可以根据美国专利号5,064764、6,194,191、6,566,118、8,137,948或美国专利申请号US2011/0229971中教导的方法进行动物细胞生物反应器培养物中AAV颗粒的生产，其每个内容通过引用整体并入本文。
细胞裂解
本发明的细胞(包括但不限于病毒生产细胞)可以根据本领域已知的任何方法进行细胞裂解。可以进行细胞裂解以获得存在于本发明的任何细胞内的一种或多种试剂(例如病毒颗粒)。在一些实施方案中，可以根据以下中列出的任何方法进行细胞裂解：美国专利号7,326,555、7,579,181、7,048,920、6,410,300、6,436,394、7,732,129、7,510,875、7,445,930、6,726,907、6,194,191、7,125,706、6,995,006、6,676,935、7,968,333、5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498和7,491,508或国际公开号WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999015685、WO1999047691、WO2000055342、WO2000075353和WO2001023597，其各自内容通过引用整体并入本文。细胞裂解方法可以是化学的或机械的。化学细胞裂解通常包括使一种或多种细胞与一种或多种裂解剂接触。机械裂解通常包括使一种或多种细胞经受一种或多种裂解条件和/或一种或多种裂解力。
在一些实施方案中，化学裂解可用于裂解细胞。如本文所用，术语“裂解剂”是指可帮助破坏细胞的任何试剂。在某些情况下，将裂解剂引入溶液中，称为裂解溶液或裂解缓冲液。如本文所用，术语“裂解溶液”是指包含一种或多种裂解剂的溶液(通常为水溶液)。除裂解剂外，裂解溶液可包括一种或多种缓冲剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、防冻剂、酶、酶抑制剂和/或螯合剂。裂解缓冲液是包含一种或多种缓冲剂的裂解溶液。裂解溶液的其他组分可包括一种或多种增溶剂。本文所用的术语“增溶剂”是指增强溶液的一种或多种组分的溶解度和/或溶液所应用于的一个或多个实体的溶解度。在某些情况下，增溶剂会增加蛋白质的溶解度。在一些情况下，基于增溶剂在增强蛋白质溶解度同时保持蛋白质构象和/或活性的能力来选择增溶剂。
示例性裂解剂可包括以下中描述的任何裂解剂：美国专利号8,685,734、7,901,921、7,732,129、7,223,585、7,125,706、8,236,495、8,110,351、7,419,956、7,300,797、6,699,706和6,143,567，其各自内容通过引用整体并入本文。在某些情况下，裂解剂可以选自裂解盐、两性试剂、阳离子试剂、离子去污剂和非离子去污剂。裂解盐可包括但不限于氯化钠(NaCl)和氯化钾(KCl)。其他的裂解盐可包括以下中描述的任何裂解盐：美国专利号8,614,101、7,326,555、7,579,181、7,048,920、6,410,300、6,436,394、7,732,129、7,510,875、7,445,930、6,726,907、6,194,191、7,125,706、6,995,006、6,676,935和7,968,333，其各自内容通过引用整体并入本文。盐的浓度可以增加或减少以获得用于细胞膜破裂的有效浓度。如本文所指，两性试剂是能够作为酸或碱反应的化合物。两性试剂可包括但不限于溶血磷脂酰胆碱、3-((3-氯酰氨基丙基)二甲基铵)-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、
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等。阳离子试剂可包括但不限于十六烷基三甲基溴化铵(C(16)TAB)和苯扎氯铵。包含去污剂的裂解剂可以包括离子去污剂或非离子去污剂。清洁剂可以起到分解或溶解细胞结构的作用，包括但不限于细胞膜、细胞壁、脂质、碳水化合物、脂蛋白和糖蛋白。示例性的离子型去污剂包括美国专利号7,625,570和6,593,123或美国公开号US2014/0087361中教导的任何一种，其各自内容通过引用整体并入本文。一些离子型去污剂可包括但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)、胆酸盐和脱氧胆酸盐。在某些情况下，裂解溶液中可能包含离子型去污剂作为增溶剂。非离子型去污剂可包括但不限于辛基葡萄糖苷、毛地黄皂苷、芦布若尔、C12E8、
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Triton X-100和NoniodetP-40。非离子型去污剂通常是较弱的裂解剂，但可以作为增溶剂包括在内，以增溶细胞和/或病毒蛋白。其他裂解剂可包括酶和尿素。在某些情况下，可以将一种或多种裂解剂组合在裂解溶液中，以增强细胞裂解和蛋白质溶解度中的一种或多种。在某些情况下，裂解溶液中可包含酶抑制剂，以防止可能因细胞膜破裂而触发的蛋白水解。
在一些实施方案中，进行机械细胞裂解。机械细胞裂解方法可包括使用一种或多种裂解条件和/或一种或多种裂解力。如本文所用，术语“裂解条件”是指促进细胞破坏的状态或环境。裂解条件可包括某些温度、压力、渗透纯度、盐度等。在某些情况下，裂解条件包括增加或减少温度。根据一些实施方案，裂解条件包括温度变化以促进细胞破坏。根据这样的实施方案进行的细胞裂解可以包括冻融裂解。如本文所用，术语“冻融裂解”是指细胞裂解，其中细胞溶液经历一个或多个冻融循环。根据冻融裂解法，溶液中的细胞被冷冻以诱导由冰晶的形成和膨胀引起的细胞膜的机械破坏。根据冻融裂解方法使用的细胞溶液还可以包含一种或多种裂解剂、增溶剂、缓冲剂、防冻剂、表面活性剂、防腐剂、酶、酶抑制剂和/或螯合剂。一旦将要冷冻的细胞溶液融化，这些组分就可以提高所需细胞产物的回收率。在某些情况下，经历冻融裂解的细胞溶液中包含一种或多种防冻剂。本文所用的术语“防冻剂”是指用于保护一种或多种物质免于因冷冻而损坏的试剂。防冻剂可以包括美国公开号US2013/0323302或美国专利号6,503,888、6,180,613、7,888,096、7,091,030中教导的任何防冻剂，其各自内容通过引用整体并入本文。在某些情况下，防冻剂可包括但不限于二甲基亚砜、1,2-丙二醇、2,3-丁二醇、甲酰胺、甘油、乙二醇、1,3-丙二醇和正二甲基甲酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、琼脂糖、右旋糖酐、肌醇、葡萄糖、羟乙基淀粉、乳糖、山梨糖醇、甲基葡萄糖、蔗糖和尿素。在一些实施方案中，可根据美国专利号7,704,721中描述的任何方法进行冻融裂解，其内容通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“裂解力”是指用于破坏细胞的物理活动。裂解力可包括但不限于机械力、声力、重力、光学力、电力等。通过机械力进行的细胞裂解在本文中称为“机械裂解”。可以根据机械裂解作用使用的机械力可包括高剪切流体力。根据这类机械裂解方法，可以使用微流化器。微流化器通常包括入口池，可在其中施加细胞溶液。然后可以通过泵(例如高压泵)以高速和/或高压将细胞溶液泵入相互作用室以产生剪切流体力。然后，可以将得到的裂解物收集在一个或多个输出容器中。可以调节泵的速度和/或压力以调节细胞裂解并增强产物(例如病毒颗粒)的回收。其他机械裂解方法可能包括通过刮擦对细胞进行物理破坏。
可以基于要裂解的细胞的细胞培养形式来选择细胞裂解方法。例如，对于贴壁细胞培养，可以使用一些化学和机械裂解方法。此类机械裂解方法可包括冻融裂解或刮擦。在另一个实例中，贴壁细胞培养物的化学裂解可通过与包含表面活性剂的裂解溶液如Triton-X-100一起温育来进行。在某些情况下，可以用一种或多种核酸酶处理从贴壁细胞培养物中产生的细胞裂解物，以降低由释放的DNA引起的裂解物的粘度。
在一个实施方案中，一种无需裂解即可收集AAV颗粒的方法可用于有效且可扩展的AAV颗粒生产。在非限制性实例中，可以通过以下生产AAV颗粒：培养缺乏肝素结合位点的AAV颗粒，从而使AAV颗粒进入细胞培养物中的上清液中，从培养物中收集上清液；并从上清液中分离AAV颗粒，如美国专利申请20090275107中所述，其内容通过引用整体并入本文。
澄清
可以对包含病毒颗粒的细胞裂解物进行澄清。澄清是指从细胞裂解物中纯化病毒颗粒时采取的初始步骤。澄清的作用是通过除去较大的不溶性碎片来制备用于进一步纯化的裂解物。澄清步骤可包括但不限于离心和过滤。在澄清期间，离心可以低速进行，以仅除去较大的碎片。类似地，可以使用具有较大孔径的过滤器进行过滤，从而仅除去较大的碎片。在某些情况下，可以在澄清过程中使用切向流过滤。病毒澄清的目标包括细胞裂解物的高通量处理和优化最终病毒回收。包括澄清步骤的优点包括用于处理较大体积的裂解物的可扩展性。在一些实施方案中，可以根据以下提出的任何方法进行澄清：美国专利号8,524,446、5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498、7,491,508、美国公开号US2013/0045186、US2011/0263027、US2011/0151434、US2003/0138772和国际公开号WO2002012455、WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999015685、WO1999047691、WO2000055342、WO2000075353和WO2001023597,其各自内容通过引用整体并入本文。
通过过滤澄清细胞裂解物的方法在本领域中是众所周知的，并且可以根据多种可用方法进行，包括但不限于被动过滤和流动过滤。所使用的过滤器可包括多种材料和孔径。例如，细胞裂解物过滤器可包含约1μM至约5μM、约0.5μM至约2μM、约0.1μM至约1μM、约0.05μM至约0.05μM和约0.001μM至约0.1μM的孔径。细胞裂解物过滤器的示例性孔径可包括但不限于2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.95、0.9、0.85、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.22、0.21、0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.02、0.019、0.018、0.017、0.016、0.015、0.014、0.013、0.012、0.011、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002、0.001和0.001μM。在一个实施方案中，澄清可包括通过具有2.0μM孔径的过滤器过滤以去除大的碎片，然后通过具有0.45μM孔径的过滤器以去除完整的细胞。
过滤器材料可以由多种材料组成。这样的材料可以包括但不限于聚合物材料和金属材料(例如，烧结金属和多孔铝)。示例性材料可以包括但不限于尼龙、纤维素材料(例如乙酸纤维素)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜、聚酰胺、聚砜、聚丙烯和聚对苯二甲酸乙二酯。在某些情况下，用于澄清细胞裂解物的过滤器可能包括但不限于ULTIPLEAT PROFILETM过滤器(Pall Corporation,Port Washington,NY)、SUPORTM膜过滤器(Pall Corporation,Port Washington,NY)。
在某些情况下，可以进行流动过滤以提高过滤速度和/或效率。在某些情况下，流动过滤可以包括真空过滤。根据这样的方法，在过滤器的与要过滤的细胞裂解物相反的一侧上形成真空。在某些情况下，细胞裂解物可能会在离心力的作用下通过过滤器。在某些情况下，使用泵迫使细胞裂解物通过澄清过滤器。细胞裂解物通过一个或多个过滤器的流速可以通过调节通道大小和/或流体压力之一来调节。
根据一些实施方案，可以通过离心澄清细胞裂解物。离心可用于使裂解物中的不溶性颗粒沉淀。在澄清期间，离心强度[以重力单位(g)表示，其代表标准重力的倍数]可能低于随后的纯化步骤。在某些情况下，可以约200g至约800g、约500g至约1500g、约1000g至约5000g、约1200g至约10000g或约8000g至约15000g对细胞裂解物进行离心。在一些实施方案中，细胞裂解物离心以8000g进行15分钟。在某些情况下，可以进行密度梯度离心，以通过沉降速率分配细胞裂解物中的颗粒。根据本公开的方法使用的梯度可以包括但不限于氯化铯梯度和碘克沙醇分级梯度。
纯化：色谱
在某些情况下，可以通过一种或多种色谱方法从澄清的细胞裂解物纯化AAV颗粒。色谱法是指本领域已知的用于从混合物分离出一种或多种成分的许多方法。这样的方法可以包括但不限于离子交换色谱法(例如阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法)、免疫亲和色谱法和尺寸排阻色谱法。在一些实施方案中，病毒色谱方法可以包括以下中教导的任何方法：美国专利号5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498和7,491,508，或国际公开号WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999015685、WO1999047691、WO2000055342、WO2000075353和WO2001023597，其各自内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，离子交换色谱法可用于分离病毒颗粒。基于衣壳蛋白与固定相上存在的带电荷位点之间的电荷-电荷相互作用，离子交换色谱法用于结合病毒颗粒，所述固定相通常是病毒制备物(例如澄清的裂解物)通过的柱子。应用病毒制备物后，然后可通过应用洗脱溶液破坏电荷-电荷相互作用来洗脱结合的病毒颗粒。洗脱溶液可通过调节盐浓度和/或pH值以增强结合的病毒颗粒的回收来优化。依赖于分离的病毒衣壳的电荷，可以选择阳离子或阴离子交换色谱法。离子交换色谱方法可以包括但不限于以下中教导的任何方法：美国专利号7,419,817、6,143,548、7,094,604、6,593,123、7,015,026和8,137,948，其各自内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用免疫亲和色谱法。免疫亲和色谱法是利用一种或多种免疫化合物(例如抗体或抗体相关结构)保留病毒颗粒的色谱法形式。免疫化合物可以特异性结合病毒颗粒表面上的一种或多种结构，包括但不限于一种或多种病毒外壳蛋白。在某些情况下，免疫化合物可能对特定的病毒变体具有特异性。在某些情况下，免疫化合物可能会结合多种病毒变体。在一些实施方案中，免疫化合物可包括重组单链抗体。这样的重组单链抗体可以包括Smith,R.H.等人,2009.Mol.Ther.17(11):1888-96中描述的那些，其内容通过引用整体并入本文。这样的免疫化合物能够结合几种AAV衣壳变体，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV6和AAV8。
在一些实施方案中，可以使用尺寸排阻色谱法(SEC)。SEC可包括使用凝胶以根据尺寸分离颗粒。在病毒颗粒纯化中，SEC过滤有时称为“精细纯化(polishing)”。在某些情况下，可能会进行SEC以生成接近均质的最终产品。在某些情况下，此类最终产品可能会用于临床前研究和/或临床研究(Kotin,R.M.2011.Human Molecular Genetics.20(1):R2-R6,其内容通过引用整体并入本文)。在某些情况下，SEC可以根据以下美国专利中教导的任何方法进行：美国专利号6,143,548、7,015,026、8,476,418、6,410,300、8,476,418、7,419,817、7,094,604、6,593,123和8,137,948，其各自内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，包含至少一种AAV颗粒的组合物可以使用美国专利号US6146874中描述的方法分离或纯化，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，包含至少一种AAV颗粒的组合物可以使用美国专利号US6660514中描述的方法分离或纯化，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，包含至少一种AAV颗粒的组合物可以使用美国专利号US8283151中描述的方法分离或纯化，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，包含至少一种AAV颗粒的组合物可以使用美国专利号US8524446中描述的方法分离或纯化，其内容通过引用整体并入本文。
II.制剂和递送
药物组合物和制剂
除了药物组合物(包含编码siRNA分子的调节性多核苷酸序列的AAV颗粒)以外，本文还提供的是适合于施用于人的药物组合物，本领域技术人员应理解，此类组合物通常适合于施用于任何其他动物，例如非人类动物，例如非人类哺乳动物。修饰适合于施用于人的药物组合物以使组合物适合于施用于各种动物是众所周知的，并且本领域的兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有)设计和/或进行这种修饰。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类；哺乳动物，包括与商业有关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或禽类，包括与商业相关的禽类，例如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
在一些实施方案中，将组合物施用于人、人类患者或受试者。为了本公开的目的，短语“活性成分”通常是指合成的siRNA双链体、编码siRNA双链体的调节性多核苷酸或包含编码本文所述的siRNA双链体的调节性多核苷酸的AAV颗粒。
本文描述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，这样的制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，然后如果必要和/或期望的话，将产品分开、成形和/或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
根据本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量将依赖于待治疗的受试者的本性、大小和/或状况而变化，并进一步取决于组合物待施用的途径。
可以使用一种或多种赋形剂配制包含编码本发明的siRNA分子的调节性多核苷酸序列的AAV颗粒，以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染或转导；(3)允许持续释放或延迟释放；或(4)改变生物分布(例如，将AAV颗粒靶向特定的组织或细胞类型，例如脑和神经元)。
本发明的制剂可以包括但不限于盐水、类脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合物、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、用AAV颗粒转染的细胞(例如，用于移植到受试者中)、纳米颗粒模拟物及其组合。此外，可以使用自组装核酸纳米颗粒来配制本发明的AAV颗粒。
通过药理学领域中已知的或此后开发的任意方法，可以制备本文描述的药物组合物的制剂。一般而言，这样的制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分结合。
根据本公开的药物组合物可以散装、作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量制备、包装和/或销售。本文中使用的“单位剂量”表示包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将要施用给受试者的活性成分的剂量，和/或这样的剂量的合宜分数，如这样的剂量的二分之一或三分之一。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量可以变化，这取决于正在治疗的受试者的本性、大小和/或状况，并且还取决于要施用所述组合物的途径。例如，组合物可以包含0.1％至99％(w/w)的活性成分。作为例子，组合物可以包含0.1％至100％、例如0.5至50％、1-30％、5-80％、至少80％(w/w)的活性成分。
在某些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在某些实施方案中，赋形剂被批准用于人类和用于兽医学应用。在某些实施方案中，赋形剂可以被美国食品和药品管理局批准。在某些实施方案中，赋形剂可以属于药用级。在某些实施方案中，赋形剂可以满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
本文中使用的赋形剂包括但不限于溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等的任意种和所有，只要它们适合于所希望的特定剂型。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；通过引用整体并入本文)。在本公开的范围内可以预见到常规赋形剂介质的应用，但是除了任何常规赋形剂介质可能与物质或它的衍生物不相容以外，诸如通过产生任何不希望的生物学效应或另外以有害方式与药物组合物的任意其它组分相互作用。
示例性的稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干燥的淀粉、玉米淀粉、糖粉等，和/或它们的组合。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含至少一种无活性成分。本文使用的术语“无活性成分”表示在制剂中包括的一种或多种无活性试剂。在某些实施方案中，在本发明的制剂中可以使用的全部、没有或一些无活性成分可以被美国食品和药品管理局(FDA)批准。
包含本发明的siRNA分子的核酸序列的载体的制剂可以包括阳离子或阴离子。在一个实施方案中，所述制剂包括金属阳离子，例如，但不限于，Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg+和它们的组合。
本文中使用的“药学上可接受的盐”表示公开的化合物的衍生物，其中通过将现有的酸或碱部分转化成其盐形式(例如，通过使游离碱基团与合适的有机酸反应)来修饰母体化合物。药学上可接受的盐的例子包括但不限于碱性残基如胺的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱盐或有机盐；等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、乙酸、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚糖酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括形成的母体化合物的常规无毒盐，例如，从无毒的无机或有机酸形成。本公开的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的量的适当的碱或酸在水或有机溶剂或这两者的混合物中反应，可以制备这样的盐；通常，非水性介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适的盐的列表可在以下文献中找到：Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418页,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编),Wiley-VCH,2008,以及Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science,66,1-19(1977)；它们中的每一篇的内容通过引用整体并入本文。
本文中使用的术语“药学上可接受的溶剂合物”是指这样的本发明的化合物，其中合适的溶剂的分子掺入晶格中。合适的溶剂在施用的剂量是生理学上可耐受的。例如，通过从包括有机溶剂、水或其混合物的溶液结晶、重结晶或沉淀，可以制备溶剂合物。合适的溶剂的例子是乙醇、水(例如，一水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N’-二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯等。当水是溶剂时，溶剂合物被称作“水合物”。
根据本发明，可以配制包含编码siRNA分子的调节性多核苷酸序列的AAV颗粒用于CNS递送。可以使用穿过血脑屏障的物质。例如，可以将siRNA分子靶向血脑屏障内皮的一些细胞穿透肽可用于配制靶向目标基因的siRNA双链体。
无活性成分
在一些实施方案中，所述制剂可以包含至少一种为无活性成分的赋形剂。本文使用的术语“无活性成分”表示在制剂中包括的一种或多种无活性试剂。在某些实施方案中，在本公开的制剂中可以使用的全部、没有或一些无活性成分可以被美国食品和药品管理局(FDA)批准。
本文所述的AAV颗粒的制剂可包括阳离子或阴离子。在一个实施方案中，所述制剂包含金属阳离子，例如但不限于Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg+及其组合。作为非限制性实例，制剂可包括与金属阳离子络合的本文所述的聚合物和组合物(参见例如美国专利号6,265,389和6,555,525，各自通过引用整体并入本文)。
递送
在一个实施方案中，本文所述的AAV颗粒可以使用欧洲专利申请号EP1857552中描述的用于递送AAV病毒体的方法来施用或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的AAV颗粒可以使用欧洲专利申请号EP2678433中描述的使用AAV颗粒递送蛋白的方法来施用或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的AAV颗粒可以使用美国专利号US5,858,351中描述的使用AAV颗粒递送DNA分子的方法来施用或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的AAV颗粒可以使用美国专利号US6,211,163中描述的用于将DNA递送至血流的方法来施用或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的AAV颗粒可以使用美国专利号US6,325,998中所述的用于递送AAV病毒体的方法来施用或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的AAV颗粒可以使用美国专利号US7,588,757中描述的用于将有效载荷递送至中枢神经系统的方法来施用或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的AAV颗粒可以使用美国专利号US8283151中描述的用于递送有效载荷的方法来施用或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的AAV颗粒可以使用国际专利公开号WO2001089583中描述的使用谷氨酸脱羧酶(GAD)递送载体递送有效载荷的方法来施用或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的AAV颗粒可以使用国际专利公开号WO2012057363中描述的用于将有效载荷递送至神经细胞的方法来施用或递送，其内容通过引用整体并入本文。
递送至细胞
本公开提供了将任何上述AAV多核苷酸或AAV基因组递送至细胞或组织的方法，其包括使细胞或组织与所述AAV多核苷酸或AAV基因组接触或使细胞或组织与包含所述AAV多核苷酸或AAV基因组的颗粒接触，或使细胞或组织与任何上述组合物(包括药物组合物)接触。将AAV多核苷酸或AAV基因组递送至细胞或组织的方法可以在体外、离体或体内完成。
引入细胞-合成的dsRNA
为了确保siRNA分子(例如，siRNA双链体和dsRNA)的化学和生物稳定性，重要的是，将siRNA分子递送到靶细胞内。在某些实施方案中，所述细胞可以包括但不限于哺乳动物起源的细胞、人起源的细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、神经干细胞和神经祖细胞。
核酸(包括siRNA)在正常生理条件下在糖-磷酸主链上携带净负电荷。为了进入细胞，siRNA分子必须与细胞膜的脂质双层发生接触，所述脂质双层的头部基团也是带负电荷的。
siRNA双链体可以与允许它们穿过细胞膜的载体(诸如包装颗粒)形成复合物以促进siRNA的细胞摄取。所述包装颗粒可以包括但不限于脂质体、纳米颗粒、阳离子脂质、聚乙烯亚胺衍生物、树枝状聚合物、碳纳米管以及碳制成的纳米颗粒与树枝状聚合物的组合。脂质可以是阳离子脂质和/或中性脂质。除了充分确立的siRNA分子和阳离子载体之间的亲脂复合物以外，还可以将siRNA分子缀合至疏水部分，诸如胆固醇(例如，美国专利公开号20110110937；其内容通过引用整体并入本文)。该递送方法具有改善siRNA分子的体外细胞摄取和体内药理学性能的潜力。本发明的siRNA分子还可以共价地或非共价地缀合至某些阳离子的细胞穿透肽(CPP)，诸如MPG、transportan或penetratin(例如，美国专利公开号20110086425；其内容通过引用整体并入本文)。
引入细胞-AAV颗粒
本发明的siRNA分子(例如，siRNA双链体)可以使用多种方法中的任何一种引入细胞中，例如但不限于AAV颗粒。对这些AAV颗粒进行了工程化和优化，以促进siRNA分子进入不易被转染修饰的细胞。而且，一些合成的AAV粒子具有将shRNA整合到细胞基因组中的能力，从而导致稳定的siRNA表达和靶基因的长期敲低。以这种方式，将AAV颗粒工程化为用于特定递送的载体，同时缺乏在野生型病毒中发现的有害复制和/或整合特征。
在一些实施方案中，通过使细胞与包含编码siRNA分子的调节性多核苷酸序列的AAV颗粒和亲脂性载体接触，将本发明的siRNA分子引入细胞。在其他实施方案中，通过用AAV颗粒转染或感染细胞来将siRNA分子引入细胞，所述AAV颗粒包含当在细胞中转录时能够产生siRNA分子的核酸序列。在一些实施方案中，通过将包含当在细胞中转录时能够产生siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒注射到细胞中来将siRNA分子引入细胞。
在一些实施方案中，在转染之前，可以将包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒转染到细胞中。
在其他实施方案中，可以通过电穿孔将包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒递送到细胞中(例如，美国专利公开号20050014264；其内容通过引用整体并入本文)。
引入包含编码本文所述的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒的其他方法可包括如美国专利公开号20120264807中所述的光化学内在化，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的制剂可包含至少一种AAV颗粒，其包含编码本文所述的siRNA分子的核酸序列。在一个实施方案中，siRNA分子可在一个靶位点靶向目标基因。在另一个实施方案中，制剂包含多种AAV颗粒，每种AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，siRNA分子在不同靶位点靶向目标基因。可以在2、3、4、5或多于5个位点靶向目标基因。
在一个实施方案中，可以将来自任何相关物种(例如但不限于人、狗、小鼠、大鼠或猴)的AAV颗粒引入细胞中。
在一个实施方案中，可以将AAV颗粒引入与待治疗的疾病相关的细胞中。作为非限制性实例，该疾病是ALS，并且靶细胞是神经元和星形胶质细胞。作为另一个非限制性实例，该疾病是ALS，并且靶细胞是中型多棘神经元、皮质神经元和星形胶质细胞。
在一个实施方案中，可以将AAV颗粒引入具有高水平靶序列内源性表达的细胞中。
在另一个实施方案中，可以将AAV颗粒引入具有低水平靶序列内源性表达的细胞中。
在一个实施方案中，细胞可以是具有高AAV转导效率的细胞。
递送至受试者
本公开另外提供了向受试者(包括哺乳动物受试者)递送任何上述AAV多核苷酸或AAV基因组的方法，该方法包括向受试者施用所述AAV多核苷酸或AAV基因组，或向受试者施用包含所述AAV多核苷酸或AAV基因组的颗粒，或向受试者施用任何所述组合物，包括药物组合物。
本文所述的AAV颗粒的药物组合物可以通过生物利用度、治疗窗和/或分布体积中的一种或多种来表征。
III.施用和给药
施用
通过导致治疗上有效结果的任意途径，可以施用AAV颗粒，其包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列。这些包括但不限于器官的实质(parenchyma)内，例如但不限于脑(例如实质内)、纹状体(纹状体内)、肠内(进入肠)、胃肠内、硬膜外、口服(通过口腔)、透皮、硬膜外、大脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、软膜下(软膜下方，under the pia)、表皮(应用在皮肤上)、真皮内(进入皮肤本身)、皮下(在皮肤下)、鼻施用(通过鼻)、静脉内(进入静脉)、静脉内快速浓注、静脉内滴注、动脉内(进入动脉)、肌肉内(进入肌肉)、心内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、神经节内(进入神经节)、腹膜内(输注或注射进腹膜)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼)、海绵窦内注射(进入病理性腔体)、腔内(进入阴茎的基底)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、透皮(穿过完整皮肤扩散用于全身分布)、透粘膜(穿过粘膜扩散)、经阴道、吹入法(嗅吸法)、舌下、唇下、灌肠、滴眼(在结膜上)、滴耳、耳(在耳朵中或通过耳朵)、含服(朝向脸颊)、结膜、皮肤、牙(至一个或多个牙)、电渗透、宫颈内、窦内(endosinusial)、气管内、体外、血液透析、渗入、间质、腹部内、羊膜内、关节内、胆内、支气管内、囊内、软骨内(在软骨内)、脊尾内(在马尾内)、脑池内(在小脑延髓池内)、角膜内(在角膜内)、牙冠内(dental intracornal)、冠状动脉内(在冠状动脉内)、阴茎海绵体内(intracorporus cavernosum)(在阴茎海绵体的可扩张空间内)、椎间盘内(在椎间盘内)、导管内(在腺的导管内)、十二指肠内(在十二指肠内)、硬膜内(在硬膜内或下)、表皮内(至表皮)、食管内(至食管)、胃内(在胃内)、牙龈内(在牙龈内)、回肠内(在小肠的远侧部分内)、病灶内(在局部病灶内或直接引入局部病灶)、管腔内(在管腔内)、淋巴管内(在淋巴内)、骨髓内(在骨的骨髓腔内)、脑膜内(在脑膜内)、眼内(在眼内)、卵巢内(在卵巢内)、心包内(在心包内)、胸膜内(在胸膜内)、前列腺内(在前列腺内)、肺内(在肺或它的支气管内)、窦内(在鼻或眼窝窦内)、椎管内(在脊柱内)、滑膜内(在关节的滑液腔内)、腱内(在肌腱内)、睾丸内(在睾丸内)、鞘内(在脑脊髓轴的任何水平在脑脊液内)、胸腔内(在胸腔内)、小管内(在器官的管内)、肿瘤内(在肿瘤内)、鼓室内(在aurus介质内)、血管内(在一个或多个血管内)、心室内(在心室内)、离子透入法(借助于电流，其中可溶性盐的离子迁移进身体的组织中)、冲洗(浸泡或冲洗开放性创伤或体腔)、喉头(直接在喉上)、鼻胃(穿过鼻并进入胃)、封闭敷裹技术(局部途径施用，其然后被封闭该区域的敷料覆盖)、眼(至外眼)、口咽(直接至口和咽)、胃肠外、经皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸(在呼吸道内，为了局部或全身效应通过口或鼻吸入)、眼球后(脑桥后或眼球后)、软组织、蛛网膜下、结膜下、粘膜下、局部、经胎盘(通过或穿过胎盘)、经气管(穿过气管壁)、经鼓膜(穿过或通过鼓室)、输尿管(至输尿管)、尿道(至尿道)、阴道、骶管阻滞、诊断、神经传导阻滞、胆灌注、心脏灌注、体外光化学疗法或脊柱。
在具体实施方案中，可以以促进载体或siRNA分子进入中枢神经系统和透入中型多棘神经元和/或皮质神经元和/或星形胶质细胞的方式施用包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV载体的组合物。
在某些实施方案中，通过肌肉内注射可以施用包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV载体。
在一个实施方案中，通过实质内注射可以施用包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV载体。
在一个实施方案中，通过实质内注射和鞘内注射可以施用包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV载体。
在一个实施方案中，通过纹状体内注射可以施用包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV载体。
在一个实施方案中，通过纹状体内注射和本文描述的另一途径可以施用包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV载体。
在某些实施方案中，通过外周注射(例如静脉内)和/或鼻内递送，可以给受试者施用表达本发明的siRNA双链体的AAV颗粒。在本领域中公开了，siRNA双链体的AAV颗粒的外周施用可以运输至中枢神经系统，例如，运输至神经元(例如，美国专利公开号20100240739和20100130594；它们中的每一篇的内容通过引用整体并入本文)。
在其它实施方案中，通过颅内递送(参见，例如，美国专利号8,119,611；其内容通过引用整体并入本文)可以给受试者施用组合物，其包含至少一种包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒。
可以以任意适合形式(作为液体溶液或混悬液，作为适合用于液体溶液或在液体溶液中的混悬液的固体形式)施用包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒。可以用任意适当的和药学上可接受的赋形剂配制siRNA双链体。
可以以“治疗上有效的”量施用包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒，所述“治疗上有效的”量即这样的量：其足以减轻和/或预防至少一种与疾病有关的症状，或提供受试者的病症的改善。
在一个实施方案中，可以以治疗有效量将AAV颗粒施用给CNS，以改善患有ALS的受试者的功能和/或存活。作为一个非限制性实施例，可以通过直接输注到纹状体施用所述载体。
在一个实施方案中，可以以治疗有效量的siRNA双链体或dsRNA将AAV颗粒施用给受试者(例如，通过鞘内施用而施用至受试者的CNS)，以靶向中型多棘神经元、皮质神经元和/或星形胶质细胞。作为非限制性实例，siRNA双链体或dsRNA可靶向SOD1并降低SOD1蛋白或mRNA的表达。作为另一个非限制性实例，siRNA双链体或dsRNA靶向SOD1并且可以阻遏SOD1并降低SOD1介导的毒性。SOD1蛋白和/或mRNA的减少以及SOD1介导的毒性几乎可以在没有增强炎症的情况下完成。
在一个实施方案中，可以以治疗有效量将AAV颗粒施用于受试者(例如，施用于受试者的CNS)，以减慢受试者的功能衰退(例如，使用已知的评估方法来确定)。作为非限制性实例，可以通过实质内注射施用载体。
在一个实施方案中，可以以治疗有效量将AAV颗粒施用至小脑延髓池，以转导脊髓中型多棘神经元、皮质神经元和/或星形胶质细胞。作为一个非限制性实施例，可以鞘内施用所述载体。
在一个实施方案中，使用鞘内输注可以以治疗有效量施用所述AAV颗粒，以转导中型多棘神经元、皮质神经元和/或星形胶质细胞。作为一个非限制性实施例，可以鞘内施用所述载体。
在一个实施方案中，可以以治疗有效量将AAV颗粒施用至小脑延髓池，以转导中型多棘神经元、皮质神经元和/或星形胶质细胞。作为非限制性实例，可以通过实质内注射来施用载体。
在一个实施方案中，可以配制包含调节性多核苷酸的AAV颗粒。作为一个非限制性实施例，可以优化制剂的比重(baricity)和/或渗透压以确保在中枢神经系统或者中枢神经系统的区域或组分中的最佳药物分布。
在一个实施方案中，通过单途径施用可以将包含调节性多核苷酸的AAV颗粒递送给受试者。
在一个实施方案中，通过多位点施用途径可以将包含调节性多核苷酸的AAV颗粒递送给受试者。可以在2、3、4、5或超过5个部位给受试者施用包含调节性多核苷酸的AAV颗粒。
在一个实施方案中，使用快速浓注可以给受试者施用包含本文描述的调节性多核苷酸的AAV颗粒。
在一些实施方案中，使用快速浓注施用包含调节性多核苷酸的AAV颗粒的效率通过监控向脊髓、脑干或运动皮质的基因转移来测量。生物分布和细胞嗜性可通过本领域已知的任何方法(例如但不限于免疫染色)来监控，并且载体基因组水平可通过数字PCR测量。
在一个实施方案中，使用在数分钟、数小时或数天的时间段内的持久递送可以给受试者施用包含本文描述的调节性多核苷酸的AAV颗粒。根据受试者、分布、制剂或另一种递送参数，可以改变输注速率。
在一个实施方案中，本文所述的AAV颗粒是通过壳核和尾(caudate)输注来施用。作为非限制性实例，双重输注提供宽的纹状体分布以及额叶和颞皮质分布。
在一个实施方案中，AAV颗粒是AAV-DJ8，其通过单侧壳核输注施用。作为非限制性实例，所施用的AAV-DJ8的分布类似于经由单侧壳核输注递送的AAV1的分布。
在一个实施方案中，本文所述的AAV颗粒通过鞘内(IT)在C1处输注来施用。输注可以持续1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或多于15小时。
在一个实施方案中，可以使用血管周间隙(PVS，其也称为Virchow-Robin间隙)成像来评估施用本文所述的AAV颗粒的受试者的选择和/或剂量、施用途径和/或施用体积的有效性。当它们穿透脑实质时，PVS围绕着小动脉和小静脉，并充有脑脊液(CSF)/间质液。PVS常见于中脑、基底神经节和半卵圆中心。尽管不希望受到理论的束缚，PVS可能在代谢物的正常清除中起作用，并且与认知能力下降和包括帕金森氏病在内的多种疾病相关。PVS的大小通常是正常的，但在许多疾病状态下它们的大小可能会增加。Potter等人(Cerebrovasc Dis.2015Jan；39(4):224–231；其内容通过引用整体并入本文)开发了一种分级方法，在该方法中，他们研究了全范围的PVS和分级(rated)的基底神经节、半卵圆中心和中脑PVS。他们使用了Mac和Lullich等人(J Neurol Neurosurg Psychiatry.2004Nov；75(11):1519-23；其内容通过引用整体并入本文)使用的PVS的频率和范围，并且Potter等人对基底神经节和半卵圆中心PVS给予5个等级：0(无)、1(1-10)、2(11-20)、3(21-40)和4(>40)，并对中脑PVS给与2个等级：0(不可见)或1(可见)。Potter等人的评级系统用户指南可以在以下网址找到：www.sbirc.ed.ac.uk/documents/epvs-rating-scale-user-guide.pdf。
给药
通过使用有效地减轻、预防和/或治疗疾病和/或病症的任何量，可以将本发明的药物组合物施用给受试者。所要求的确切量将在受试者之间变化，这取决于受试者的物种、年龄和总体状况、疾病的严重程度、具体组合物、它的施用模式、它的活性模式等。
通常以易于施用和剂量均匀的单位剂型配制本发明的组合物。然而，应当理解，本发明的组合物的每日总用量可以由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者的具体治疗有效性将取决于多种因素，包括正在治疗的障碍和障碍的严重程度；使用的具体化合物的活性；所用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；采用的siRNA双链体的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所用的具体化合物组合或同时使用的药物；和医学领域中众所周知的类似因素。
作为非限制性实例，剂量可以基于受试者的CSF的总体积而确定。例如，恒河猴的脑脊髓液(CSF)的总评估体积为约6至12mL，并且人的总评估的CSF为约120至150mL，为至少10至12倍的系数。因此，基于恒河猴的剂量，可以使用10x至12x的系数确定人的剂量。在一个实施方案中，系数是10x。在另一个实施方案中，系数是11x。在又一个实施方案中，系数是12x。在又一个实施方案中，系数可以是但不限于10x、10.1x、10.2x、10.3x、10.4x、10.5x、10.6x、10.7x、10.8x、10.9x、11x、11.1x、11.2x、11.3x、11.4x、11.5x、11.6x、11.7x、11.8x、11.9x、12x、12.1x、12.2x、12.3x、12.4x和12.5x。
在一个实施方案中，受试者的年龄和性别可以用于确定本发明的组合物的剂量。作为一个非限制性实施例，较老的受试者可以接受与较年轻的受试者相比更大剂量(例如，多5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％)的组合物。作为另一个非限制性实施例，较年轻的受试者可以接受与较老的受试者相比更大剂量(例如，多5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％)的组合物。作为另一个非限制性实施例，女性受试者可以接受与男性受试者相比更大剂量(例如，多5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％)的组合物。作为另一个非限制性实施例，男性受试者可以接受与女性受试者相比更大剂量(例如，多5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％)的组合物。
在某些具体实施方案中，根据疾病状况、受试者和治疗策略可以改变用于递送本发明的siRNA双链体的AAV颗粒的剂量。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物向细胞的递送包含由[VG/小时＝mL/小时*VG/mL]定义的递送速度，其中VG是病毒基因组，VG/mL是组合物浓度，且mL/小时是延长的递送速度。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物向细胞的递送可以包含约1x106VG至约1x1016VG/受试者之间的总浓度。在某些实施方案中，递送可以包含约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、1.1x1011、1.2x1011、1.3x1011、1.4x1011、1.5x1011、1.6x1011、1.7x1011、1.8x1011、1.9x1011、2x1011、2.1x1011、2.2x1011、2.3x1011、2.4x1011、2.5x1011、2.6x1011、2.7x1011、2.8x1011、2.9x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、7.1x1011、7.2x1011、7.3x1011、7.4x1011、7.5x1011、7.6x1011、7.7x1011、7.8x1011、7.9x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.1x1012、1.2x1012、1.3x1012、1.4x1012、1.5x1012、1.6x1012、1.7x1012、1.8x1012、1.9x1012、2x1012、2.1x1012、2.2x1012、2.3x1012、2.4x1012、2.5x1012、2.6x1012、2.7x1012、2.8x1012、2.9x1012、3x1012、3.1x1012、3.2x1012、3.3x1012、3.4x1012、3.5x1012、3.6x1012、3.7x1012、3.8x1012、3.9x1012、4x1012、4.1x1012、4.2x1012、4.3x1012、4.4x1012、4.5x1012,4.6x1012、4.7x1012、4.8x1012、4.9x1012、5x1012、6x1012、6.1x1012、6.2x1012、6.3x1012、6.4x1012、6.5x1012、6.6x1012、6.7x1012、6.8x1012、6.9x1012、7x1012、8x1012、8.1x1012、8.2x1012、8.3x1012、8.4x1012、8.5x1012、8.6x1012、8.7x1012、8.8x1012、8.9x1012、9x1012、1x1013、1.1x1013、1.2x1013、1.3x1013、1.4x1013、1.5x1013、1.6x1013、1.7x1013、1.8x1013、1.9x1013、2x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、6.7x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016VG/受试者的组合物浓度。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物向细胞的递送可以包含每位受试者约1x106VG/kg至约1x1016VG/kg之间的总浓度。在某些实施方案中，递送可以包含约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、1.1x1011、1.2x1011、1.3x1011、1.4x1011、1.5x1011、1.6x1011、1.7x1011、1.8x1011、1.9x1011、2x1011、2.1x1011、2.2x1011、2.3x1011、2.4x1011、2.5x1011、2.6x1011、2.7x1011、2.8x1011、2.9x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、7.1x1011、7.2x1011、7.3x1011、7.4x1011、7.5x1011、7.6x1011、7.7x1011、7.8x1011、7.9x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.1x1012、1.2x1012、1.3x1012、1.4x1012、1.5x1012、1.6x1012、1.7x1012、1.8x1012、1.9x1012、2x1012、2.1x1012、2.2x1012、2.3x1012、2.4x1012、2.5x1012、2.6x1012、2.7x1012、2.8x1012、2.9x1012、3x1012、3.1x1012、3.2x1012、3.3x1012、3.4x1012、3.5x1012、3.6x1012、3.7x1012、3.8x1012、3.9x1012、4x1012、4.1x1012、4.2x1012、4.3x1012、4.4x1012、4.5x1012,4.6x1012、4.7x1012、4.8x1012、4.9x1012、5x1012、6x1012、6.1x1012、6.2x1012、6.3x1012、6.4x1012、6.5x1012、6.6x1012、6.7x1012、6.8x1012、6.9x1012、7x1012、8x1012、8.1x1012、8.2x1012、8.3x1012、8.4x1012、8.5x1012、8.6x1012、8.7x1012、8.8x1012、8.9x1012、9x1012、1x1013、1.1x1013、1.2x1013、1.3x1013、1.4x1013、1.5x1013、1.6x1013、1.7x1013、1.8x1013、1.9x1013、2x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、6.7x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016VG/kg的组合物浓度。
在一个实施方案中，每剂可以施用约105至106个病毒基因组(单位)。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物向细胞的递送可以包含约1x106VG/mL至约1x1016VG/mL之间的总浓度。在某些实施方案中，递送可以包含约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、1.1x1011、1.2x1011、1.3x1011、1.4x1011、1.5x1011、1.6x1011、1.7x1011、1.8x1011、1.9x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.1x1012、1.2x1012、1.3x1012、1.4x1012、1.5x1012、1.6x1012、1.7x1012、1.8x1012、1.9x1012、2x1012、2.1x1012、2.2x1012、2.3x1012、2.4x1012、2.5x1012、2.6x1012、2.7x1012、2.8x1012、2.9x1012、3x1012、3.1x1012、3.2x1012、3.3x1012、3.4x1012、3.5x1012、3.6x1012、3.7x1012、3.8x1012、3.9x1012、4x1012、4.1x1012、4.2x1012、4.3x1012、4.4x1012、4.5x1012、4.6x1012、4.7x1012、4.8x1012、4.9x1012、5x1012、6x1012、6.1x1012、6.2x1012、6.3x1012、6.4x1012、6.5x1012、6.6x1012、6.7x1012、6.8x1012、6.9x1012、7x1012、8x1012、9x1012、1x1013、1.1x1013、1.2x1013、1.3x1013、1.4x1013、1.5x1013、1.6x1013、1.7x1013、1.8x1013、1.9x1013、2x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、6.7x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016VG/mL的组合物浓度。
在某些实施方案中，通过使用多次施用(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多次施用)，可以递送期望的siRNA双链体剂量。当采用多次施用时，可以使用分次定量施用方案诸如本文描述的那些。本文中使用的“分次剂量”是将单一单位剂量或总每日剂量分成两个或更多个剂量，例如，单一单位剂量的两次或更多次施用。本文中使用的“单一单位剂量”是在一个剂量/在一个时间/单个途径/单个接触点(即，单个施用事件)中施用的任何调节性多核苷酸治疗剂的剂量。本文中使用的“总每日剂量”是在24小时时间段中给出或开处方的量。它可以作为单一单位剂量施用。在一个实施方案中，将包含本发明的调节性多核苷酸的AAV颗粒在分次剂量中施用给受试者。可以在仅缓冲液中或在本文描述的制剂中配制它们。
在一个实施方案中，本文描述的组合物的剂量、浓度和/或体积可根据施用后尾或壳核对皮质和皮质下分布的贡献来调节。施用可以是脑室内、壳核内、丘脑内、实质内、软膜下和/或鞘内施用。
在一个实施方案中，本文描述的组合物的剂量、浓度和/或体积可根据脑室内、壳核内、丘脑内、实质内、软膜下和/或鞘内施用后皮质和神经轴分布来调节。
IV.本发明组合物的方法和用途
肌萎缩性侧索硬化(ALS)
肌萎缩性侧索硬化(ALS)
肌萎缩性侧索硬化(ALS)(一种成年发作的神经变性障碍)是一种以运动皮质、脑干和脊髓中的运动神经元的选择性死亡为特征的进行性的和致命的疾病。ALS的发病率是约1.9/100,000。被诊断出ALS的患者发生以痉挛状态、反射亢进或反射减弱、肌束震颤、肌肉萎缩和麻痹为特征的进行性肌肉表型。这些运动病损由肌肉的去神经支配(由于运动神经元的损失)造成。ALS的主要病理学特征包括：皮质脊髓束的变性以及下运动神经元(LMN)或前角细胞的广泛损失(Ghatak等人,J Neuropathol Exp Neurol.,1986,45,385-395)，初级运动皮质中的Betz细胞和其它锥体细胞的变性和损失(Udaka等人,Acta Neuropathol,1986,70,289-295；Maekawa等人,Brain,2004,127,1237-1251)，和运动皮质和脊髓中的反应性神经胶质增生(Kawamata等人,Am J Pathol.,1992,140,691-707；和Schiffer等人,JNeurol Sci.,1996,139,27-33)。由于呼吸缺陷和/或炎症，ALS经常在诊断以后3-5年内是致命的(Rowland LP和Shneibder NA,N Engl.J.Med.,2001,344,1688-1700)。
ALS的一种细胞标志是蛋白性的、泛素化的、胞质包涵体在退化运动神经元和周围细胞(例如，星形胶质细胞)中的存在。泛素化的包涵体(即，露易小体样包涵体或Skein样包涵体)是ALS中的包涵体的最常见的和特异性的类型，且见于脊髓和脑干的LMN中以及皮质脊髓的上运动神经元(UMN)中(Matsumoto等人,J Neurol Sci.,1993,115,208-213；和Sasak和Maruyama,Acta Neuropathol.,1994,87,578-585)。已经将几种蛋白鉴别为包涵体的组分，包括泛素、Cu/Zn超氧化物歧化酶1(SOD1)、外周蛋白和Dorfin。神经丝性包涵体经常见于ALS中的脊髓运动神经元内的透明簇生包涵体(HCI)和轴突‘球状体’中。其它类型和更低特异性的包涵体包括在皮质的上层中的布尼纳小体(含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的包涵体)和新月形包涵体(SCI)。在ALS中看到的其它神经病理学特征包括高尔基体的片段化、线粒体空泡形成和突触末梢的超微结构异常(Fujita等人,Acta Neuropathol.2002,103,243-247)。
另外，在额颞叶痴呆ALS(FTD-ALS)中，也观察到皮质萎缩(包括额叶和颞叶)，其可以在FTD-ALS患者中造成认知损害。
ALS是一种复杂的和多因素的疾病，并且多种机制被假定为ALS发病机制的原因，包括但不限于蛋白降解的功能障碍、谷氨酸盐兴奋性中毒、线粒体功能障碍、细胞凋亡、氧化性应激、炎症、蛋白错误折叠和聚集、异常的RNA代谢和改变的基因表达。
约10％-15％的ALS病例具有该疾病的家族史，并且这些患者被称作家族性ALS(fALS)或遗传患者，通常具有孟德尔显性的遗传模式和高外显率。剩余者(大约85％-95％)被归类为散发性ALS(sALS)，因为它们与记录的家族史无关，但是相反被认为是归因于其它风险因素，包括但不限于环境因素、遗传多态性、体细胞突变和可能的基因-环境相互作用。在大多数情况下，家族性(或遗传性)ALS作为常染色体显性的疾病而遗传，但是存在具有常染色体隐性的和X-连锁的遗传和不完全外显率的系谱。散发性和家族性形式是临床上不能辨别的，从而提示共同的发病机制。ALS中的运动神经元的选择性死亡的精确原因仍然是难以捉摸的。理解fALS中的遗传因素的进展可能为该疾病的两种形式带来曙光。
近年来，对ALS的遗传原因的探究已经发现了已知造成fALS的超过10个不同基因中的突变。最常见的突变见于编码Cu/Zn超氧化物歧化酶1(SOD1；～20％)的基因(Rosen DR等人,Nature,1993,362,59-62)，在肉瘤中融合/在脂肪肉瘤中翻译(FUS/TLS；1-5％)和TDP-43(TARDBP；1-5％)。近年来，将C9orF72基因中的六核苷酸重复序列扩增(GGGGCC)n鉴别为西方人群中的fALS的最常见原因(～40％)(Renton等人,Nat.Neurosci.,2014,17,17-23的综述)。在ALS中突变的其它基因包括alsin(ALS2)、senataxin(SETX)、囊泡相关的膜蛋白(VAPB)和血管生成素(ANG)。fALS基因控制不同的细胞机制，从而提示，ALS的发病机制是复杂的，且可能与几个最终导致运动神经元变性的不同过程相关。
具有ALS和已知ALS成因基因的已识别的突变的受试者可称为具有“遗传定义的ALS”。ALS成因基因的非限制性实例包括SOD1、C9orf72、TARDBP(也称为TDP-43)、FUS/TLS、OPTN、UBQLN2、PFN1、DCTN1和TBK1。
SOD1是在哺乳动物中鉴别和表征的3种人超氧化物歧化酶之一：铜-锌超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD或SOD1)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD或SOD2)和细胞外超氧化物歧化酶(ECSOD或SOD3)。SOD1是153残基多肽的32kDa同源二聚体，每个亚基具有一个铜结合位点和一个锌结合位点，其由人染色体21上的SOD1基因(GeneBank登记号:NM_000454.4；SEQ IDNO:1254)编码。SOD1催化在结合的铜离子处超氧化物阴离子(O2-)向分子氧(O2)和过氧化氢(H2O2)的反应。细胞内SOD1浓度是高的(范围为10-100μM)，占中枢神经系统(CNS)中的总蛋白质含量的1％。该蛋白不仅定位在细胞质中，而且定位在真核细胞的细胞核、溶酶体、过氧化物酶体和线粒体膜间隙中(Lindenau J等人,Glia,2000,29,25-34)。
fALS患者中的15-20％和所有ALS病例中的1-2％携带SOD1基因中的突变。目前，已经发现分布在153个氨基酸的SOD1多肽中的至少170个不同突变会造成ALS，且更新列表可以在ALS在线遗传性数据库(ALSOD)中找到(Wroe R等人,Amyotroph Lateral Scler.,2008,9,249-250)。表21列出了ALS中的SOD1的突变的一些例子。这些突变主要是单个氨基酸置换(即错义突变)，尽管缺失、插入和C-末端截短也会发生。不同的SOD1突变表现出不同的地理分布模式。例如，具有由SOD1基因突变造成的ALS的所有美国人中的40-50％具有特定突变Ala4Val(或A4V)。A4V突变通常与更严重的征象和症状有关，且存活期通常是2-3年。I113T突变是迄今在英国最常见的突变。在欧洲最流行的突变是D90A置换，且存活期经常大于10年。
表21.ALS中SOD1突变的实例
Figure BDA0002356059890003561
为了研究与SOD1基因缺陷有关的神经元死亡的机制，本领域开发了SOD1有关的ALS的几种啮齿动物模型，它们表达具有不同突变(包括错义突变、小缺失或插入)的人SOD1基因。ALS小鼠模型的非限制性例子包括SOD1G93A、SOD1A4V、SOD1G37R、SOD1G85R、SOD1D90A、SOD1L84V、SOD1I113T、SOD1H36R/H48Q、SOD1G127X、SOD1L126X和SOD1L126delTT。存在两种携带两种不同人SOD1突变的转基因大鼠模型：SOD1H46R和SOD1G93R。这些啮齿动物ALS模型可以发生与人ALS患者类似的肌无力和反映人疾病的几个特征的其它病原性特征，具体地是脊柱运动神经元的选择性死亡、蛋白包涵体在运动神经元中的聚集和小神经胶质活化。本领域众所周知，转基因的啮齿类动物是人SOD1相关的ALS疾病的良好模型，并提供用于研究疾病发病机制和开发疾病治疗的模型。
在动物和细胞模型中的研究表明，SOD1病原性变体通过功能的获得而造成ALS。也就是说，当被SOD1突变改变时，超氧化物歧化酶获得新的但是有害的性质。例如，在ALS中的一些SOD1突变的变体通过破坏氧化还原循环而增加氧化性应激(例如，增加的有毒超氧化物残余物的积累)。其它研究也表明，ALS中的一些SOD1突变的变体可能获得独立于它的正常生理功能的有毒性质(诸如错误折叠的SOD1变体的异常聚集)。在异常的氧化还原化学模型中，突变体SOD1是不稳定的且通过与非常规底物的异常化学相互作用造成活性氧(ROS)的过度产生。在蛋白毒性模型中，不稳定的、错误折叠的SOD1聚集成细胞质包涵体，从而隔离对于细胞过程而言关键性的蛋白。这两种假设并不相互排斥。已经证实，结合活性部位中的金属的选定组氨酸残基的氧化会介导SOD1聚集。
聚集的突变体SOD1蛋白还可能诱导线粒体功能障碍(Vehvilainen P等人,FrontCell Neurosci.,2014,8,126)、轴突运输的病损、异常的RNA代谢、神经胶质细胞病理学和谷氨酸盐兴奋性中毒。在某些散发性ALS病例中，错误折叠的野生型SOD1蛋白见于患病的运动神经元中，其形成与家族性ALS相关的SOD1变体看到的那些类似的“有毒构象”(RotunnoMS和Bosco DA,Front Cell Neurosci.,2013,16,7,253)。这样的证据提示，ALS是一种与其它神经变性疾病(诸如阿尔茨海默氏病和帕金森病)类似的蛋白折叠疾病。
目前，没有治愈性治疗可用于遭受ALS的患者。唯一的FDA批准的药物利鲁唑(谷氨酸盐释放的抑制剂)对ALS具有中度作用，仅使存活延长2-3个月(如果施用18个月)。不幸的是，施用利鲁唑的患者不会经历疾病进展的任何减慢或肌肉功能的改善。因此，利鲁唑不代表治愈性的或甚至有效的治疗。研究人员继续寻找更好的治疗剂。
以前已经试验了可能阻止或改善SOD1聚集的治疗方案。例如，阿莫氯醇(arimoclomol，一种羟胺衍生物)是靶向热激蛋白的药物，其是针对这些聚集体的细胞防御机制。研究证实，阿莫氯醇治疗会改善SOD1小鼠模型中的肌肉功能。靶向ALS中的一种或多种细胞缺陷的其它药物可以包括：诸如他仑帕奈的AMPA拮抗剂，β-内酰胺抗生素(其可以减少谷氨酸盐诱导的运动神经元兴奋性中毒)；溴隐亭，其可以抑制氧化诱导的运动神经元死亡(例如美国专利公开号20110105517；其内容通过引用整体并入本文)；1,3-二苯基脲衍生物或多重激酶抑制剂，其可以减少SOD1基因表达(例如，美国专利公开号20130225642；其内容通过引用整体并入本文)；多巴胺激动剂普拉克索和它的对映异构体dexpramipexole，其可以改善线粒体中的氧化应答；尼美舒利，其抑制环加氧酶(例如，美国专利公开号20060041022；其内容通过引用整体并入本文)；充当自由基清除剂的药物(例如美国专利号:6,933,310和PCT专利公开号:WO2006075434；它们中的每一篇的内容通过引用整体并入本文)。
抑制异常的SOD1蛋白聚集的另一个方案是沉默/抑制ALS中的SOD1基因表达。已经报道，用于突变的等位基因的特异性基因沉默的小干扰RNA对于fALS的治疗而言是治疗上有益的(例如，Ralgh GS等人,Nat.Medicine,2005,11(4),429-433；和Raoul C等人,Nat.Medicine,2005,11(4),423-428；和Maxwell MM等人,PNAS,2004,101(9),3178-3183；和Ding H等人,Chinese Medical J.,2011,124(1),106-110；和Scharz DS等人,PlosGenet.,2006,2(9),e140；它们中的每一篇的内容通过引用整体并入本文)。
在本领域中教导了靶向SOD1基因并调节ALS中的SOD1表达的许多其它RNA治疗剂。这样的基于RNA的药剂包括反义寡核苷酸和双链小干扰RNA。参见，例如，Wang H等人,JBiol.Chem.,2008,283(23),15845-15852)；美国专利号7,498,316、7,632,938、7,678,895、7,951,784、7,977,314、8,183,219、8,309,533和8,586,554；和美国专利公开号2006/0229268和2011/0263680；它们中的每一篇的内容通过引用整体并入本文。
本发明提供了包含调节性多核苷酸的AAV颗粒及其设计和制造方法，该调节性多核苷酸包含编码靶向SOD1基因的siRNA分子的序列。包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以增加活性剂向运动神经元中的递送。靶向SOD1基因的所述siRNA双链体或编码的dsRNA能够在细胞内显著地抑制SOD1基因表达(例如，mRNA水平)；因此，改善细胞内SOD1表达诱导的应激，诸如蛋白的聚集和包涵体的形成、增加的自由基、线粒体功能障碍和RNA代谢。
这种siRNA介导的SOD1表达抑制可用于治疗ALS。根据本发明，用于治疗和/或改善患者的ALS的方法包括向患者施用有效量的包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒到细胞中。包含这种核酸序列的AAV颗粒的施用将编码引起SOD1基因表达的抑制/沉默的siRNA分子。
在一个实施方案中，包含调节性多核苷酸的AAV颗粒降低了受试者中突变体SOD1的表达。突变体SOD1的减少还可以减少有毒聚集体的形成，这些聚集体可以引起毒性机制，例如但不限于氧化应激、线粒体功能障碍、轴突运输受损、RNA代谢异常、神经胶质细胞病理和/或谷氨酸兴奋性毒性。
在一个实施方案中，载体(例如AAV颗粒)减少了需要其的受试者中SOD1的量，因此提供了本文所述的治疗益处。
ALS的治疗方法
在本发明中提供了向细胞中引入包含调节性多核苷酸(其包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列)的AAV颗粒的方法，所述方法包括：向所述细胞中引入足以使靶SOD1mRNA的降解发生的量的任何载体，由此激活细胞中的靶特异性RNAi。在某些方面，所述细胞可以是干细胞，诸如运动神经元的神经元、肌细胞和诸如星形胶质细胞的胶质细胞。
在本发明中公开了在需要治疗的受试者中治疗与异常的SOD1功能有关的ALS的方法。所述方法任选地包括向所述受试者施用治疗有效量的至少包含AAV颗粒的组合物，该AAV颗粒包含调节性多核苷酸，其包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列。作为一个非限制性实施例，所述siRNA分子可以沉默SOD1基因表达，抑制SOD1蛋白生产，和减轻受试者中的ALS的一种或多种症状，从而治疗性治疗ALS。
在一些实施方案中，向受试者的中枢神经系统施用包含AAV颗粒的组合物，该AAV颗粒包含调节性多核苷酸，其包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列。在其它实施方案中，向受试者的肌肉施用包含AAV颗粒的组合物，该AAV颗粒包含调节性多核苷酸，其包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列。
具体地，可以将包含调节性多核苷酸(其包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列)的AAV颗粒递送进特定类型的靶向的细胞，包括运动神经元；胶质细胞，包括少突神经胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞；和/或包围神经元的其它细胞，诸如T细胞。在人ALS患者和动物SOD1 ALS模型中的研究暗示胶质细胞在运动神经元的功能障碍和死亡中起早期作用。在周围的保护性胶质细胞中的正常SOD1可以阻止运动神经元死亡，即使突变体SOD1存在于运动神经元中(例如，Philips和Rothstein,Exp.Neurol.,2014年5月22日.pii:S0014-4886(14)00157-5的综述；其内容通过引用整体并入本文)。
在一些具体实施方案中，包含调节性多核苷酸(其包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列)的AAV颗粒可以用作ALS的疗法。
在一些实施方案中，将本发明的组合物作为用于治疗ALS的单独治疗剂或组合治疗剂施用。
包含调节性多核苷酸(其包含编码靶向SOD1基因的siRNA分子的核酸序列)的AAV颗粒可以与一种或多种其它治疗剂组合使用。“与......组合”并不意味着试剂必须同时施用和/或一起配制用于递送，尽管这些递送方法落入本公开的范围内。组合物可以与一种或多种其它所需治疗剂或医疗程序同时、在其之前或之后施用。通常，将以针对该药剂确定的剂量和/或按时间表施用每种试剂。
可以与包含调节性多核苷酸(其包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列)的AAV颗粒组合使用的治疗剂可以是小分子化合物，其是抗氧化剂、抗炎剂、抗凋亡剂、钙调节剂、抗谷氨酸能试剂、结构蛋白抑制剂、参与肌肉功能的化合物、以及参与金属离子调节的化合物。
可以与本文描述的载体组合使用的、针对治疗ALS试验过的化合物包括但不限于抗谷氨酸能剂：利鲁唑、托吡酯、他仑帕奈、拉莫三嗪、右美沙芬、加巴喷丁和AMPA拮抗剂；抗细胞凋亡剂:米诺环素、苯基丁酸钠和阿莫氯醇；抗炎剂:神经节苷脂、塞来考昔、环孢菌素、硫唑嘌呤、环磷酰胺、血浆去除术(Plasmaphoresis)、醋酸格拉替雷和沙利度胺；头孢曲松(Berry等人,Plos One,2013,8(4))；β-内酰胺抗生素；普拉克索(一种多巴胺激动剂)(Wang等人,Amyotrophic Lateral Scler.,2008,9(1),50-58)；在美国专利公开号20060074991中的尼美舒利；在美国专利公开号20130143873中公开的二氮嗪)；在美国专利公开号20080161378中公开的吡唑酮衍生物；抑制氧化性应激诱导的细胞死亡的自由基清除剂，诸如溴隐亭(美国专利公开号20110105517)；在PCT专利公开号2013100571中讨论的氨基甲酸苯酯化合物；在美国专利号6,933,310和8,399,514和美国专利公开号20110237907和20140038927中公开的神经保护性化合物；和在美国专利公开号20070185012中教导的糖肽；它们中的每一篇的内容通过引用整体并入本文。
可以与包含调节性多核苷酸(其包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列)的AAV颗粒一起用在联合疗法中的治疗剂可以是可保护神经元损失的激素或变体，诸如促肾上腺皮质激素(ACTH)或其片段(例如，美国专利公开号20130259875)；雌激素(例如，美国专利号6,334,998和6,592,845)；它们中的每一篇的内容通过引用整体并入本文。
神经营养因子可以与包含调节性多核苷酸(其包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列)的AAV颗粒一起用在联合疗法中用于治疗ALS。通常，将神经营养因子定义为促进神经元的存活、生长、分化、增殖和/或成熟或者刺激增加的神经元活性的物质。在某些实施方案中，本发明的方法还包括向需要治疗的受试者递送一种或多种营养因子。营养因子可以包括但不限于IGF-I、GDNF、BDNF、CTNF、VEGF、Colivelin、扎利罗登、促甲状腺素释放激素和ADNF、及其变体。
在一个方面，所述载体(例如，AAV颗粒，其编码至少一种靶向SOD1基因的siRNA双链体的核酸序列)可以与诸如AAV-IGF-I(Vincent等人,Neuromolecular medicine,2004,6,79-85；其内容通过引用整体并入本文)和AAV-GDNF(Wang等人,J Neurosci.,2002,22,6920-6928；其内容通过引用整体并入本文)的表达神经营养因子的AAV颗粒共同施用。
在一些实施方案中，将用于治疗ALS的本发明的组合物静脉内地、肌肉内地、皮下地、腹膜内地、鞘内地和/或心室内地施用给有需要的受试者，从而允许siRNA分子或包含siRNA分子的载体穿过血脑屏障和血液脊髓屏障中的一个或两个。在某些方面，所述方法包括(使用例如输液泵和/或递送支架)向受试者的中枢神经系统(CNS)直接施用(例如，心室内地施用和/或鞘内地施用)治疗有效量的包含AAV颗粒的组合物，该AAV颗粒包含调节性多核苷酸，其包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列。所述载体可以用于沉默或抑制SOD1基因表达，和/或减轻受试者中的ALS的一种或多种症状，从而在治疗上治疗ALS。
在某些方面，在治疗的受试者中改善ALS的症状，包括但不限于运动神经元变性、肌无力、肌肉萎缩、肌肉僵硬、呼吸困难、言语不清、肌束震颤发生、额颞叶痴呆和/或早产儿死亡。在其它方面，将本发明的组合物应用于脑和脊髓中的一个或两个。在其它方面，改善肌肉协调和肌肉功能中的一个或两个。在其它方面，延长受试者的存活。
在一个实施方案中，包含调节性多核苷酸(其包含编码本发明的siRNA分子的核酸序列)的AAV颗粒向受试者的施用可降低受试者的CNS中的突变体SOD1。在另一个实施方案中，所述AAV颗粒向受试者的施用可降低受试者的CNS中的野生型SOD1。在另一个实施方案中，所述AAV颗粒向受试者的施用可降低受试者的CNS中的突变体SOD1和野生型SOD1。可以使CNS、CNS的一个区域或受试者的CNS的特定细胞中的突变体和/或野生型SOD1降低约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为一个非限制性实施例，AAV颗粒可使运动神经元(例如，腹角运动神经元)和/或星形胶质细胞中的野生型SOD1的表达降低至少50％。作为另一个非限制性实施例，AAV颗粒可使运动神经元(例如，腹角运动神经元)和/或星形胶质细胞中的突变体SOD1的表达降低至少50％。作为另一个非限制性实施例，AAV颗粒可使运动神经元(例如，腹角运动神经元)和/或星形胶质细胞中的野生型SOD1和突变体SOD1的表达降低至少50％。
在一个实施方案中，AAV颗粒向受试者的施用将减少脊髓中的突变体和/或野生型SOD1的表达，且突变体和/或野生型SOD1的表达的减少将减少受试者中的ALS的效应。
在一个实施方案中，可以将AAV颗粒施用给处于ALS的早期阶段的受试者。早期阶段症状包括但不限于无力的和软的或僵硬的、紧的和痉挛的肌肉，肌肉的抽筋和颤搐(肌束震颤)，肌肉大小的损失(萎缩)，疲劳，差的平衡，言语不清，抓握无力，和/或行走时绊倒。所述症状可以限于单个身体区域，或轻度症状可以影响超过一个区域。作为一个非限制性实施例，AAV颗粒的施用可以减轻ALS的严重程度和/或症状的发生。
在一个实施方案中，可以将AAV颗粒施用给处于ALS的中期阶段的受试者。ALS的中期阶段包括但不限于与早期阶段相比更普遍的肌肉症状，一些肌肉是麻痹的，而其它肌肉是虚弱的或未受影响的，持续的肌肉颤搐(肌束震颤)、不使用的肌肉可能造成挛缩，此时关节变硬、疼痛且有时变形，吞咽肌的虚弱可能造成噎塞和较大困难的进食和控制唾液，呼吸肌的虚弱可以造成呼吸功能不全(其当躺下时可以是显著的)，和/或受试者可能具有失控的和不适当的笑或哭的发作(假延髓病侵袭)。作为一个非限制性实施例，AAV颗粒的施用可以减轻ALS的严重程度和/或症状的发生。
在一个实施方案中，可以将AAV颗粒施用给处于ALS的晚期阶段的受试者。ALS的晚期阶段包括但不限于大部分麻痹的随意肌，帮助移动空气进出肺的肌肉被严重损伤，活动性非常受限，差的呼吸可以造成疲劳、模糊思维、头痛和对感染或疾病(例如，肺炎)的易感性，言语困难，并且用嘴吃或喝可能是不可能的。
在一个实施方案中，AAV颗粒可以用于治疗患有ALS的受试者，所述受试者具有C9orf72突变。
在一个实施方案中，AAV颗粒可以用于治疗患有ALS的受试者，所述受试者具有TDP-43突变。
在一个实施方案中，AAV颗粒可以用于治疗患有ALS的受试者，所述受试者具有FUS突变。
在一个实施方案中，本发明的AAV颗粒包含AAVrh10衣壳和自我互补AAV病毒基因组，其包含H1启动子、源自pLKO.1慢病毒的填充序列和SOD1靶向有效载荷。
在一个实施方案中，本发明的AAV颗粒包含AAV2衣壳和自我互补AAV病毒基因组。
在一个实施方案中，本发明的AAV颗粒包含AAV2衣壳和自我互补AAV病毒基因组，其包含H1启动子、源自pLKO.1慢病毒载体的填充序列和SOD1靶向有效载荷。
V.定义
除非另外说明，否则以下术语和短语具有下面描述的含义。所述定义无意在性质上成为限制性的，且用于提供本发明的某些方面的更清楚理解。
本文使用的术语“核酸”、“多核苷酸”和‘寡核苷酸”表示由多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)或多核糖核苷酸(含有D-核糖)或任意其它类型的多核苷酸(其为嘌呤或嘧啶碱基或经修饰的嘌呤或嘧啶碱基的N糖苷)组成的任意核酸聚合物。在术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间无意区分长度，且这些术语将互换使用。这些术语仅表示分子的一级结构。因而，这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。
本文使用的术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”表示核糖核苷酸的聚合物；术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子”表示脱氧核糖核苷酸的聚合物。可以天然地合成(例如，分别通过DNA复制和DNA的转录)或化学地合成DNA和RNA。DNA和RNA可以是单链的(即，分别是ssRNA或ssDNA)或多链的(例如，双链的，即，分别是dsRNA和dsDNA)。本文中使用的术语“mRNA”或“信使RNA”表示编码一个或多个多肽链的氨基酸序列的单链RNA。
本文使用的术语“RNA干扰”或“RNAi”表示由RNA分子介导的序列特异性的调节机制，其导致对应的蛋白编码基因的表达的抑制或干扰或“沉默”。RNAi已经在许多类型的生物中观察到，包括植物、动物和真菌。RNAi天然地发生在细胞中以除去外来RNA(例如，病毒RNA)。天然RNAi通过从游离dsRNA切割的片段进行，其将降解机制引导至其它类似的RNA序列。RNAi由RNA诱导的沉默复合物(RISC)控制，且由细胞质中的短/小dsRNA分子起始，其中它们与催化性的RISC组分argonaute相互作用。可以将dsRNA分子外源地引入细胞中。外源dsRNA通过激活核糖核酸酶蛋白Dicer而起始RNAi，所述Dicer结合和切割dsRNA以产生21-25个碱基对的双链片段，其在每个末端上具有几个未配对的突出端碱基。这些短双链片段被称作小干扰RNA(siRNA)。
本文使用的术语“短干扰RNA”、“小干扰RNA”或“siRNA”表示能够指导或介导RNAi的包含约5-60个核苷酸(或核苷酸类似物)的RNA分子(或RNA类似物)。优选地，siRNA分子包含约15-30个核苷酸或核苷酸类似物，诸如约16-25个核苷酸(或核苷酸类似物)，约18-23个核苷酸(或核苷酸类似物)，约19-22个核苷酸(或核苷酸类似物)(例如，19、20、21或22个核苷酸或核苷酸类似物)，约19-25个核苷酸(或核苷酸类似物)，和约19-24个核苷酸(或核苷酸类似物)。术语“短”siRNA表示包含5-23个核苷酸、优选21个核苷酸(或核苷酸类似物)(例如，19、20、21或22个核苷酸)的siRNA。术语“长”siRNA表示包含24-60个核苷酸、优选约24-25个核苷酸(例如，23、24、25或26个核苷酸)的siRNA。在某些情况下，短siRNA可以包括少于19个核苷酸，例如，16、17或18个核苷酸，或少至5个核苷酸，前提条件是，较短的siRNA保留介导RNAi的能力。同样地，在某些情况下，长siRNA可以包括超过26个核苷酸，例如，27、28、29、30、35、40、45、50、55或甚至60个核苷酸，前提条件是，较长的siRNA保留介导RNAi或翻译抑制的能力，无需进一步加工(例如，酶促加工)成短siRNA。siRNA可以是单链RNA分子(ss-siRNA)或包含有义链和反义链的双链RNA分子(ds-siRNA)，所述有义链和反义链杂交以形成被称作siRNA双链体的双链体结构。
本文使用的术语siRNA分子的“反义链”或“第一链”或“引导链”表示这样的链：其与为了沉默而靶向的基因的mRNA的约10-50个核苷酸(例如，约15-30、16-25、18-23或19-22个核苷酸)的段基本上互补。所述反义链或第一链具有与期望的靶mRNA序列足够互补的序列以指导靶标特异性的沉默，例如，足以触发RNAi机制或过程对期望的靶mRNA的破坏的互补性。
本文使用的术语siRNA分子的“有义链”或“第二条链”或“过客链”表示与反义链或第一链互补的链。siRNA分子的反义链和有义链发生杂交以形成双链体结构。本文中使用的“siRNA双链体”包括与为了沉默而靶向的基因的mRNA的约10-50个核苷酸的段具有足够互补性的siRNA链和与所述siRNA链具有足够互补性以形成双链体的siRNA链。
本文使用的术语“互补的”表示多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反向平行的多核苷酸链中的核苷酸单元之间的氢键形成。互补的多核苷酸链可以以沃森-克里克方式(例如，A至T、A至U、C至G)或以允许形成双链体的任意其它方式形成碱基对。本领域技术人员知晓，当使用RNA而不是DNA时，尿嘧啶(而不是胸腺嘧啶)是被认为与腺苷互补的碱基。但是，当在本发明的上下文中提及U时，暗示置换T的能力，除非另有说明。完美互补性或100％互补性表示这样的情形：其中一个多核苷酸链的每个核苷酸单元都可以与第二个多核苷酸链的核苷酸单元形成氢键。小于完美互补性表示这样的情形：其中两个链的一些(但是并非全部)核苷酸单元可以彼此形成氢键。例如，对于两个20-聚体，如果在每个链上的仅两个碱基对可以彼此形成氢键，那么所述多核苷酸链表现出10％互补性。在相同的例子中，如果在每个链上的18个碱基对可以彼此形成氢键，那么所述多核苷酸链表现出90％互补性。
本文使用的术语“基本上互补的”是指，所述siRNA具有足以结合期望的靶mRNA和触发靶mRNA的RNA沉默的序列(例如，在反义链中)。
本文中使用的“靶向”是指设计和选择核酸序列的过程，所述核酸序列将与靶核酸杂交并诱导期望的效应。
术语“基因表达”表示这样的过程：核酸序列通过该过程发生成功转录和(在大多数情况下)翻译以生产蛋白或肽。为了清楚起见，当提及“基因表达”的测量时，这应当被理解为是指，可以测量转录的核酸产物(例如，RNA或mRNA)或翻译的氨基酸产物(例如，多肽或肽)。测量RNA、mRNA、多肽和肽的量或水平的方法是本领域众所周知的。
本文使用的术语“突变”表示基因的结构的任何变化，其导致可以传递至后代的变体(也称为“突变体”)形式。基因中的突变可以由DNA中的单个碱基的改变造成，或者由基因或染色体的更大段的缺失、插入或重排造成。
本文使用的术语“载体”是指运输、转导异源分子(诸如本发明的siRNA分子)或以其它方式充当异源分子(诸如本发明的siRNA分子)的载体的任何分子或部分。“病毒基因组”或“载体基因组”或“病毒载体”是指包含一个或多个多核苷酸区域的序列，所述多核苷酸区域编码或包含目标分子，例如，转基因，编码一个多肽或多个多肽的多核苷酸，或调节性核酸诸如小干扰RNA(siRNA)。病毒基因组通常用于将遗传物质递送进细胞中。经常为了特定应用修饰病毒基因组。病毒基因组的类型包括逆转录病毒基因组序列、慢病毒基因组序列、腺病毒基因组序列和腺相关病毒基因组序列。
本文中使用的术语“腺相关病毒”或“AAV”表示包含或源自腺相关载体的组分并且适合用于感染哺乳动物细胞、优选人细胞的任何载体。术语AAV载体通常表示AAV型病毒颗粒或病毒体，其包含有效载荷。所述AAV载体可以源自不同血清型，包括血清型的组合(即，“假型的”AAV)，或源自不同基因组(例如，单链的或自互补的)。另外，所述AAV载体可以是复制缺陷的和/或靶向的。
本文中使用的短语“抑制基因的表达”是指造成基因的表达产物的量的减少。所述表达产物可以是从基因转录的RNA分子(例如mRNA)或从基因转录的mRNA所翻译成的多肽。通常，mRNA水平的降低会导致从其翻译的多肽的水平的降低。通过使用用于测量mRNA或蛋白的标准技术，可以确定表达的水平。
本文使用的术语“体外”表示在人工环境中，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在培养皿等中，发生的事件，而不是在生物(例如，动物、植物或微生物)内发生的事件。
本文使用的术语“体内”表示在生物(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。
本文使用的术语“修饰的”表示本发明的分子的改变的状态或结构。可以以许多方式修饰分子，所述方式包括在化学上、在结构上和在功能上。
本文使用的术语“合成的”是指通过人手生产、制备和/或制造。本发明的多核苷酸或多肽或其它分子的合成可以是化学的或酶促的。
本文使用的术语“转染”表示将外源核酸引入细胞中的方法。转染的方法包括但不限于化学方法、物理处理和阳离子脂质或混合物。可以转染进细胞中的药剂的列表较大，且包括但不限于siRNA、有义序列和/或反义序列、编码一个或多个基因并被组织进表达质粒中的DNA、蛋白、蛋白片段和更多。
本文中使用的“脱靶”表示对任意一种或多种靶标、基因和/或细胞转录物的任何非目的效果。
本文中使用的短语“药学上可接受的”在本文中用于表示这样的化合物、物质、组合物和/或剂型：在合理的医学判断范围内，其适用于接触人类和动物的组织，而没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
本文使用的术语药剂的“有效量”是这样的量：所述量足以实现有益的或期望的结果，例如，临床结果，且这样，“有效量”取决于它所应用的上下文。例如，在施用治疗ALS的药剂的上下文中，药剂的有效量是例如这样的量：与在不施用所述药剂的情况下得到的应答相比，所述量足以实现如本文中定义的ALS的治疗。
本文使用的术语“治疗有效量”是指要递送的药剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量，当施用给遭受或易患感染、疾病、障碍和/或病症的受试者时，所述量足以治疗、诊断、预防所述感染、疾病、障碍和/或病症，改善其症状，和/或延迟其发作。
本文使用的术语“受试者”或“患者”表示可以给其施用根据本发明的组合物的任何生物，例如，为了实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型受试者包括动物(例如，哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔、诸如黑猩猩和其它猿类和猴物种的非人灵长类动物和人类)和/或植物。
本文使用的术语“预防”表示延迟或领先于病症或疾病的发作、发展或进展一段时间，包括数周、数月或数年。
本文中使用的术语“治疗”表示用于治愈或改善疾病的一个或多个具体操作的应用。在某些实施方案中，具体操作是一种或多种药学试剂的施用。在本发明的上下文中，具体操作是一种或多种siRNA分子的施用。
本文使用的术语“改善”表示减轻病症或疾病的至少一种指标的严重程度。例如，在神经变性障碍的上下文中，改善包括神经元损失的减少。
本文使用的术语“施用”表示给受试者提供药学试剂或组合物。
本文使用的术语“神经变性”表示导致神经细胞死亡的病理性状态。大数目的神经学障碍共享神经变性作为一种共同的病理学状态。例如，阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化(ALS)都造成慢性神经变性，其以在数年的时间段内缓慢的进行性神经细胞死亡为特征，而急性神经变性以神经细胞死亡的突然发作为特征，所述突然发作是因为缺血(诸如中风)或创伤(诸如创伤性脑损伤)，或者是因为由脱髓鞘或创伤(例如由脊髓损伤或多发性硬化造成)导致的轴突横断。在某些神经学障碍中，主要一类神经元细胞是变性的，例如，在早期ALS中的中型多棘神经元变性。
VI.等同方案和范围
本领域技术人员会认识到或使用不超过例行实验能够确定根据本文描述的发明的具体实施方案的许多等同方案。本发明的范围无意限于上面的描述，而是如所附权利要求所述。
在权利要求中，诸如“一个”、“一种”和“所述”的冠词可以是指一个/种或超过一个/种，除非指示相反情形或以其它方式从上下文显而易见。如果群体成员中的一个、超过一个或所有成员存在于指定的产品或过程中、在指定的产品或过程中使用或以其它方式与指定的产品或过程相关，则认为满足在一组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述，除非指示相反情形或以其它方式从上下文显而易见。本发明包括这样的实施方案，其中所述组的刚好一个成员存在于给定产品或方法中、用于给定产品或方法中或者以其它方式与给定产品或方法相关。本发明包括这样的实施方案，其中所述组成员中的超过一个或全部都存在于给定产品或方法中、用于给定产品或方法中或者以其它方式与给定产品或方法相关。
还应当指出，术语“包含”意图是开放式的，并且允许但不要求包括额外的要素或步骤。因此，当在本文中使用术语“包含”时，还包括和公开术语“由……组成”。
在给出范围的情况下，包括端点。此外，应当理解，除非另外指示或以其它方式从上下文和本领域普通技术人员的理解显而易见，以范围表述的数值在本发明的不同实施方案中可呈现处于所述范围内的任何具体数值或子范围，其精确至该范围的下限单位的十分之一，除非上下文另外清楚地指明。
另外，应当理解，可以从任意一项或多项权利要求中明确地排除落在现有技术内的本发明的任何特定实施方案。因为这样的实施方案被视为本领域普通技术人员已知的，所以可以排除它们，即使所述排除并未在本文中明确地阐明。可以因为任何原因从任意一项或多项权利要求排除本发明的组合物的任何特定实施方案(例如，任何抗生素、治疗剂或活性成分；任何生产方法；任何使用方法等)，无论是否与现有技术的存在相关。
应当理解，已经使用的词语是描述而不是限制的词语，并且可以在所附权利要求的范围内做出变化，而不背离在它的更宽方面的本发明的真实范围和精神。
尽管已经就几个描述的实施方案而言相当详尽地且相当特定地描述了本发明，但是无意将本发明限于任何这样的细节或实施方案或任何具体实施方案，而是应当参考所附权利要求来解释本发明，从而考虑到现有技术提供这类权利要求的最广泛的可能解释，并因此有效地包括本发明的预期范围。
VII.实施例
实施例1.SOD1 siRNA设计、合成和分析
SOD1 siRNA设计
进行siRNA设计以识别靶向人SOD1基因的siRNA。所述设计使用针对人的SOD1转录物(Genebank登记号NM_000454.4(SEQ ID NO:1254))。
将siRNA双链体设计成对于反义链的位置2-18与人SOD1转录物具有100％同一性，且对于反义链的位置2-18与非人灵长类动物SOD1转录物具有部分或100％同一性。在所有siRNA双链体中，将反义链的位置1工程化为U，且将有义链的位置19工程化为C，以便在该位置使双链体不配对。
SOD1 siRNA序列的选择和合成
基于预测的反义链对人、食蟹猴和恒河猴SOD1基因的选择性，以及反义链位置2-7的种子序列与miRBase20.0中的人类序列缺乏匹配，合成有义人SOD1衍生的寡核苷酸并形成双链体。SOD1衍生的寡核苷酸和双链体的实例可以在国际专利申请号PCT/US2015/060562的表3中找到，其内容通过引用整体并入本文。然后测试siRNA双链体对内源性SOD1基因表达(SOD1 mRNA水平)的体外抑制活性。如国际专利申请PCT/US2015/060562的实施例1，SOD1 siRNA合成中所述合成寡核糖核苷酸，其内容通过引用整体并入本文。
SOD1 siRNA的体外筛选
通过使用bDNA(分支DNA)测定来定量SOD1 mRNA，测定了靶向人SOD1的siRNA抑制HeLa细胞中内源性SOD1表达。将来自双剂量测定的结果用于选择SOD1 dsRNA双链体的子集，将其用于在4类培养的细胞中的剂量应答实验以计算IC50。
细胞培养、转染和测定
HeLa细胞得自ATCC(与LGC Standards合伙的ATCC,Wesel,德国)，并在保湿培养箱中于37℃、5％CO2的气氛下在补充含有10％胎牛血清(来自GIBCO/Life Technologies的超低IgG)和1％青霉素/链霉素(Biochrom GmbH,Berlin,德国)的HAM氏F-12培养基(BiochromGmbH,Berlin,德国)中培养。
对于使用siRNA的转染，将HeLa细胞以19,000-20,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。根据生产商的说明书，用Lipofectamine 2000(Invitrogen/Life Technologies)进行siRNA的转染。对于双剂量筛选，使用1nM或0.1nM的SOD1 siRNA浓度。用10、2.5、0.6、0.16、0.039、0.0098、0.0024、0.0006、0.00015和0.000038nM的SOD1 siRNA浓度进行剂量应答实验。用萤光素酶siRNA、Aha-1siRNA、PLGF siRNA或无关siRNA的对照混合物转染对照孔。
与siRNA一起孵育24小时后，将培养基去除，将细胞裂解并准备好进行QuantiGene2.0分析，然后按照国际专利申请号PCT/US2015/060562的实施例2中所述进行bDNA数据分析，其内容通过引用整体并入本文。
实施例2.在SH-SY5Y细胞、U87细胞和原代人星形胶质细胞中选择的SOD1 siRNA针 对内源性SOD1 mRNA表达的体外筛选
SH-SY5Y细胞得自ATCC(与LGC Standards合伙的ATCC,Wesel,德国)，并在保湿培养箱中于37℃、5％CO2的气氛下在补充含有15％FCS(来自GIBCO/Life Technologies的超低IgG)、1％L-谷氨酰胺(Biochrom GmbH,Berlin,德国)和1％青霉素/链霉素(BiochromGmbH,Berlin,德国)的Dulbecco氏MEM(Biochrom GmbH,Berlin,德国)中培养。
U87MG细胞得自ATCC(与LGC Standards合伙的ATCC,Wesel,德国)，并在保湿培养箱中于37℃、5％CO2的气氛下在补充含有10％FCS(来自GIBCO/Life Technologies的超低IgG)和1％青霉素/链霉素(Biochrom GmbH,Berlin,德国)的ATCC配制的Eagle氏最低基础培养基(与LGC Standards合伙的ATCC,Wesel,德国)中培养。
原代人星形胶质细胞得自LONZA(Lonza Sales Ltd,Basel,瑞士)，并在保湿培养箱中于37℃、5％CO2的气氛下在补充了AGM SingleQuot Kit(Lonza Sales Ltd,Basel,瑞士)的ABM基础培养基(Lonza Sales Ltd,Basel,瑞士)中培养。
除了用于SH-SY5Y细胞的转染试剂为Lipofectamine2000(Invitrogen/LifeTechnologies)、用于U87细胞的转染试剂为RNAiMAX(Invitrogen/Life Technologies)和用于原代人星形胶质细胞的转染试剂为Lipofectamine2000(Invitrogen/LifeTechnologies)以外，以与关于HeLa细胞描述的方式类似的方式，进行用选择的siRNA对SH-SY5Y细胞、U87MG细胞和原代人星形胶质细胞的转染以及用bDNA对SOD1和GAPDH mRNA水平的定量。
实施例3.靶向SOD1的siRNA
将发现有效的SOD1 siRNA的过客-引导链双链体工程化为表达载体并转染进中枢神经系统或神经元细胞系的细胞中。尽管在siRNA敲低研究中使用的突出端是对于siRNA而言规范的dTdT，所述构建体中的突出端可以包含任何二核苷酸突出端。
使用的细胞可以是原代细胞或源自诱导的多能干细胞(iPS细胞)。
然后测量SOD1敲低，并执行深度测序以确定从在表达载体中施用的每种构建体加工成的确切过客和引导链。
计算引导与过客链比率以确定敲低的效率，例如，RNA诱导的沉默复合物(RISC)加工的敲低的效率。
将N-末端测序以确定切割位点和确定靶的均匀切割百分比。如所预期的，切割高于90％。
在一个平行研究中共转染HeLa细胞以分析SOD1的体外敲低。使用萤光素酶构建体作为对照来确定脱靶效应。
再次执行深度测序。
实施例4.AAV-miRNA载体中的SOD1 siRNA构建体
将SOD1 siRNA的过客-引导链双链体工程化为AAV-miRNA表达载体。构建体从ITR到ITR(从5’到3’叙述)包含突变型ITR、启动子(CMV(包括SV40内含子或β-球蛋白内含子)、U6、H1或CBA启动子(其包括CMVie增强子、CB启动子和SV40内含子或β-球蛋白内含子)、过客链和引导链(在过客链和引导链之间具有环)、过客链之前的5’侧翼区和引导链之后的3’侧翼区、兔球蛋白polyA和野生型ITR。进行体外和体内研究，以测试AAV-miRNA表达载体的功效。
表22中显示了示例性ITR到ITR序列。这些序列包含具有β-球蛋白内含子的CBA启动子或具有β球蛋白(β-Globin)内含子的CMV启动子，以及包含5’侧翼区、过客链、环、引导链和3’侧翼区的调节性多核苷酸。
表22.ITR至ITR序列
Figure BDA0002356059890003731
实施例5构建体的活性
HeLa细胞
以1e4vg/细胞、1e3vg/细胞或1e2vg/细胞的MOI将SOD1 siRNA构建体和对照转染到HeLa细胞中，以测试构建体的活性。48-72小时后，使用本领域已知的方法评估内源性mRNA表达。
HEK293细胞
以1e4vg/细胞、1e3vg/细胞或1e2vg/细胞的MOI将SOD1 siRNA构建体和对照转染到HEK293细胞中，以测试构建体的活性。48-72小时后，使用本领域已知的方法评估内源性mRNA表达。
人运动神经元祖细胞(HMNP)
以1e4vg/细胞、1e3vg/细胞或1e2vg/细胞的MOI将SOD1 siRNA构建体和对照转染到人运动神经元祖细胞(HMNP)细胞中，以测试构建体的活性。48小时后，使用本领域已知的方法评估内源性mRNA表达。
U251MG
以1e4vg/细胞、1e3vg/细胞或1e2vg/细胞的MOI将SOD1 siRNA构建体和对照转染到人类星形胶质细胞系U251MG中，以测试构建体的活性。48-60小时后，使用本领域已知的方法评估内源性mRNA表达。
人星形胶质细胞(HA)
以1e4vg/细胞、1e3vg/细胞或1e2vg/细胞的MOI将SOD1 siRNA构建体和对照转染到原代人星形胶质细胞中，以测试构建体的活性。48-60小时后，使用本领域已知的方法评估内源性mRNA表达。
实施例6.SOD1体内敲低
将自互补的pri-miRNA包装在AAV中，并通过纹状体内输注10分钟施用。表达人SOD1且具有大约20-30g体重的雌性或雄性Tg(SOD1)3Cje/J小鼠(Jackson Laboratory,BarHarbor,ME)接受5uL靶向纹状体的试验物的单侧注射(前后位+0.5mm,中侧位+2mm，相对于前囟点；背腹3.8mm，相对于头盖骨表面)。使用具有33号针的、预填充的泵调节的Hamilton微注射器(1701型，10μl)，以0.5uL/min注射试验物(每种试验物5只动物)。在注射后1、2、3、4或6周，将动物处死，取出脑，将来自1mm冠状脑厚片(coronal slab)的同侧纹状体(包括输注部位)以及来自邻近1mm冠状脑厚片的纹状体组织切开并快速冷冻。将小鼠组织样品裂解，并定量人SOD1蛋白水平以及SOD1和小鼠GAPDH(mGAPDH)mRNA水平。通过ELISA(eBioscience(Affymetrix,San Diego,CA))定量SOD1蛋白水平，并通过BCA分析(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)定量总蛋白水平。对于每个组织样品，将归一化至总蛋白的SOD1蛋白水平计算为2次测定的平均值。将这些归一化的SOD1蛋白水平进一步归一化至媒介物组，然后平均化以得到组(治疗)平均值。通过qRT-PCR定量SOD1和mGAPDHmRNA水平。对于每个组织样品，将SOD1/mGAPDH的比率(归一化的SOD1 mRNA水平)计算为3次测定的平均值。然后将这些比率平均化以得到组(治疗)平均值。将这些组平均值进一步归一化至媒介物组。
在非人灵长类动物中，通过鞘内腰椎快速浓注施用试验物(1x 1013-3x1013vg的包装在AAV中的pri-miRNA)或媒介物。具有大约2.5-8.5kg体重的雌性食蟹猴(成束猴，CRResearch Model Houston,Houston,TX)接受植入的单个鞘内导管，所述导管的尖部位于腰椎处。以大约60分钟间隔施用试验物(每种试验物4只动物)3次1mL快速浓注(1mL/分钟)。在施用后4-6周，将动物处死，并将选择的组织收获用于生物分析和组织学评价。针对用包装在具有CBA启动子的AAV-DJ中的pri-miRNA治疗以后的抑制，相对于媒介物组评估SOD1蛋白和mRNA水平。
实施例7.SOD1体内敲低
hSOD1转基因小鼠
将如本文所述的靶向SOD1的自互补pri-miRNA包装在AAV-DJ中。表达人SOD1的雌性或雄性Tg(SOD1)3Cje/J小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)(n＝11-13/组)接受单侧注射5uL载体或靶向纹状体的媒介物，该载体包含自互补的靶向SOD1的pri-miRNA(VOYmir102.860、VOYmir104.861、VOYmir109.861、VOYmir109.866、VOYmir116.860、VOYmir116.866、VOYmir127.860、VOYmir127.866、VOYmir109.860、VOYmir114.861、VOYmir114.860或VOYmir102.861；表23和表24)包装在AAV-DJ或靶向纹状体的媒介物中。使用具有33号针的、预填充的泵调节的Hamilton微注射器(1701型，10μl)，以3.1至6.4x 1012 012vg/ml的载体浓度(总剂量为1.5至3.2x 1010vg)以0.5uL/min注射测试物。注射后第22(n＝6)或29(n＝5至7)天，将动物处死，取出脑，将来自1mm冠状脑厚片(coronal slab)的同侧纹状体(包含输注部位)以及来自邻近1mm冠状脑厚片的纹状体组织切开并快速冷冻。对于每个半球，合并来自相邻的1mm冠状脑厚片的纹状体组织样品，并用于hSOD1 mRNA定量。收集来自输注部位的纹状体组织样品，并将其用于hSOD1蛋白定量。通过qRT-PCR定量SOD1和mGAPDH mRNA水平。根据制造商的规程(QIAGEN)，使用RNeasy Mini Kit从纹状体组织样品中提取总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(High-Capability cDNA ReverseTranscription Kit,Applied Biosystems)通过逆转录进行互补DNA合成。所有TaqMan测定和预混液都是从Life Technologies订购的，并根据制造商的建议进行使用。使用LightCycler 480II(Roche)或CFX384实时系统(BIO-RAD)进行RT-qPCR，并使用ΔΔCT方法分析数据。将hSOD1 mRNA水平归一化至mGAPDH mRNA水平，然后进一步归一化为媒介物对照组。计算这些组平均值以获得组(治疗)平均值。通过ELISA(eBioscience(Affymetrix,SanDiego,CA))定量SOD1蛋白水平，通过BCA分析(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)定量总蛋白水平。将SOD1蛋白水平相对于媒介物组归一化，然后取平均值以获得组(治疗)平均值。下表23(qRT-PCR mRNA)和表24(ELISA蛋白)显示剂量与第22天和第29天的结果。
表23.调节性多核苷酸、剂量和qRT-PCR mRNA结果
Figure BDA0002356059890003761
表24.调节性多核苷酸、剂量和ELISA蛋白结果
Figure BDA0002356059890003762
Figure BDA0002356059890003771
相对于媒介物组，包装在AAV-DJ中的VOYmiR127.860和VOYmiR114.861导致最大的SOD1 mRNA阻遏，在第22天时分别为减少53％(p<0.0001)和42％(p<0.001)，以及在第29天时分别为减少46％(p<0.0001)和36％(p<0.001)。相对于媒介物组，包装在AAV-DJ中的VOYmiR127.860和VOYmiR14.861还导致了蛋白阻遏，在第22天时分别为减少25％(p<0.001)和14％，以及在第29天时分别为减少24％(p<0.0001)和22％(p<0.0001)。
此外，对来自以0.5ul/min单侧注射5uL载体(VOYmiR127.860的总剂量为2.9E10vg，或VOYmiR114.861的总剂量为3.2E10vg)后4周的小鼠纹状体样品(n＝2-3)的包装在AAV-DJ中的VOYmiR127.860和VOYmiR114.861进行深度测序。简而言之，使用mirVanamiRNA分离试剂盒(mirVana miRNA Isolation kit,Cat#AM1560，ThermoFisherScientific，Waltham，MA)从纹状体中分离出总RNA。根据制造商的协议，使用IlluminaTruSeq小RNA文库制备试剂盒(Illumina TruSeq Small RNAlibrary Prep Kit,Cat#RS-200-0012，Illumina，San Diego,CA)从1μg RNA开始制备小RNA测序文库。合并文库并在Illumina HiSeq2500上测序。结果显示出高的引导链：过客链比(VOYmiR127.860为99，而VOYmiR1 14.861为11.5)，表明初始miRNA主要加工成具有相对低水平过客链的引导链(靶向SOD1 mRNA的链，用于RNAi介导的降低)。还测量到相对于总内源性miRNA库的低水平的引导链和过客链(VOYmiR127.860和VOYmiR114.861均为0.3％)。
在另一项研究中，将表达人野生型SOD1的转基因小鼠(C57BL/6-Tg(SOD1)3Cje/J)(每组n＝4-5)通过以0.5ul/min单侧纹状体内输注5ul载体(1.6x 1012vg/ml，总剂量8x109vg)用包装在AAVrhl0中的靶向SOD1的自互补pri-miRNA(VOYmiR127.860或VOYmiR114.861)或媒介物处理。给药3周后，通过与上述相同的RT-qPCR方法评估来自施用部位的纹状体组织的SOD1 mRNA阻遏。用包装在AAVrh10中的VOYmiR127.860处理导致SOD1mRNA阻遏了36±17.5％(平均值±SD)(p<0.01)。用包装在AAVrh10中的VOYmiR11.861处理导致SOD1mRNA阻遏30±9.7％(平均值±SD)(p＜0.01)。
非人灵长类动物
在非人灵长类动物中，通过鞘内腰椎灌注施用1.1x 1013vg/ml的包装在AAVrh10中的靶向SOD1的自互补pri-miRNA(VOYmiR127.860)或媒介物。体重约2.5-8.5kg的4只雌性食蟹猕猴(成束猴，CR Research Model Houston,Houston,TX)接受植入的单个鞘内导管，导管尖端位于腰椎。每隔6小时进行两次2.5mL IT腰椎(LI)注射(在特伦德伦伯卧位超过20分钟)测试物品。施用的总剂量为每只动物5.4x1013vg。如下所述，通过体重、临床体征、临床病理、脑脊髓液(CSF)化学和CSF总细胞计数评估耐受性，以及给药前后血清和CSF中的中和抗体。施用后4周，处死动物，并收集选定的组织用于通过RT-qPCR评估SOD1 mRNA，通过双链RNAscope原位杂交测定共检测载体基因组(Vg)和食蟹猴SOD1 mRNA，通过液滴数字PCR检测载体基因组水平，通过深度测序检测pri-miRNA加工的精度和效率，以及检测组织病理学，如下所述。
所有动物均存活直至预定的终止。包装在AAVrh10中的VOYmiR127.860对体重、临床体征、临床病理(包括第15天和第29天的血清化学、血液学和凝血)、脑脊髓液(CSF)化学或第29天的CSF总细胞数没有显著测试物相关影响。
使用利用流式细胞分析定量AAVrh10.GFP(绿色荧光蛋白)感染的抑制的功能性体外测定，在给药前约一周，约第15天(仅血清)和尸检时约第29天，评估血清和CSF样品的中和抗体。在进入研究前，对非人类灵长类动物的血清中缺少或存在最少循环中和性抗体进行了预筛选。在给药前约1周，再次评估血清和CSF样品中的中和抗体，证实除了3只动物外，其它所有动物缺少或存在最少循环中和抗体。给药后第15天和第29天，所有动物的血清和CSF中均存在显著的中和抗体。
相对于媒介物组，在用包装在AAVrh10中的pri-miRNA VOYmiR127.860处理后，评估了SOD 1 mRNA水平的阻遏。评估了激光捕获的腰骶运动神经元上的RT-qPCR(腰椎样本每个库大约500个运动神经元，骶骨样本每个库大约250个运动神经元)。对于激光捕获的运动神经元样品，通过qRT-PCR测定了SOD1 mRNA、运动神经元特异性基因(胆碱乙酰转移酶(ChAT))和两个参考基因(丙氨酰-tRNA合成酶(AARS)和β-肌动蛋白(ACTB))的水平。相对于两个参考基因mRNA水平的几何平均值，将hSOD1 mRNA水平归一化，然后相对于媒介物对照组表达。鞘内输注包装在AAVrh10中的pri-miRNA VOYmiR127.860导致在来自腰椎和骶椎的激光捕获运动神经元中对SOD1 mRNA的阻遏为相对于媒介物组分别为33+/-17.8％(平均±SD，p<0.05)和78+/-12.7％(平均±SD，p<0.0001)。
此外，用包装在AAVrh10中的pri-miRNA VOYmiR127.860处理后，使用双链体RNAscope原位杂交(ISH)测定相对于媒介物组共检测非人灵长类动物腰脊髓运动神经元中的载体基因组(Vg)和食蟹猴SOD1 mRNA。按照制造商的说明，使用RNAscope 2.5LS DuplexReagent试剂盒(Advanced Cell Diagnostics，Inc.，Newark，CA)在自动化平台上进行vg和食蟹猴SOD1的RNAISH。简而言之，在与靶标寡核苷酸探针杂交之前，用热和蛋白酶预处理5μm福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)组织切片。然后将预扩增子、扩增子和HRP/AP标记寡核苷酸顺序杂交，然后进行生色沉淀显色。使用对PPIB/POLR2ARNA具有特异性的RNAscope探针对每个样品进行RNA完整性质量控制，用对细菌dapB RNA具有特异性的探针进行背景质量控制。特异性RNA染色信号被识别为绿色(C1)和红色(C2)的点状点。样品用梅耶苏木精复染。由合格的科学家进行视觉评分，以基于贯穿整个样本中每个细胞的平均点数为样品分配单个分数。对Vg+腰运动神经元中的SOD1表达水平进行评分，与媒介物对照腰运动神经元相比，在来自用包装在AAVrh10中的pri-miRNA VOYmiR127.860处理的动物的Vg+腰运动神经元中观察到SOD1信号降低了53+/-1 1.2％(平均±SD，p＝0.0002)。相反，与媒介物对照腰运动神经元相比，在来自用包装在AAVrh10中的pri-miRNA VOYmiR127.860处理的动物的Vg-腰运动神经元中观察到SOD1信号降低了10+/-13.4％(平均值±SD,p＝0.17)。
表25和表26显示了不同组织中载体基因组的水平。通过液滴数字PCR(ddPCR)确定载体基因组。简而言之，使用DNA清洗和浓缩试剂盒(DNA Clean and Concentration Kit,Zymoresearch)从LCM样品中纯化DNA，并在制造商推荐的条件下，通过DNeasy血液和组织试剂盒(DNeasy Blood and Tissue Kit,Qiagen，目录号69506)从组织中制备全细胞DNA。使用QX200液滴数字PCR系统(Bio-Rad)将该DNA用作ddPCR反应的模板。简而言之，建立了以下反应，其包括模板、2x Supermix(BioRad，目录号863023)，HindIII限制性核酸内切酶(NewEngland Biolabs)和寡核苷酸探针组，所述探针组具有与载体(FAM标记)和非人灵长类宿主RNA酶P基因(VIC标记，[ThermoFisher Scientific，#4403328])特异的同一性。按照制造商推荐的条件和试剂，用Bio-Rad自动液滴产生器将反应并入液滴中。液滴经历40轮热循环至终点。PCR完成后，在QX200 Droplet Reader(Bio-Rad)上读取样品。通过QuantaSoft软件分析数据以产生每个靶标的拷贝/反应。通过将载体的拷贝归一化为宿主拷贝的一半，载体基因组分布被报告为每个二倍体细胞的载体基因组拷贝(VG/DC)。表中包括了具有和不具有中和抗体阳性动物的平均组数据。中和抗体的存在没有减少采样的CNS组织中的VG/DC水平，而外周组织中的VG/DC水平低于对中和抗体呈阴性的动物。在激光捕获的运动神经元中(每个库大约75个运动神经元)，测量到平均13.64VG/DC的显著载体基因组。在脊髓白质切片(腹角灰质和pia中已耗尽)中，观察到平均水平(所有4只动物)为35.4vg/dc。在肝脏中，vg水平平均为120.36+/-121.01VG/DC(所有4只动物)，而血清阴性动物的平均水平为224.75+/-4.23VG/DC。心脏、肺、肾和卵巢中的载体基因组水平显著低于在肝或脊髓白质中观察到的水平，卵巢和肾脏中的水平处于或接近测定的检测限。
表25.非人灵长类动物周围组织中通过载体基因组测定的生物分布
Figure BDA0002356059890003811
表26.在非人类灵长类动物脊髓样品中通过载体基因组测定的生物分布
Figure BDA0002356059890003812
pri-miRNA加工的精度和效率通过使用与上述相同的方法对来自腰脊髓的腹角钻孔物(punch)进行深度测序来评估。这些结果表明，用包装在AAVrh10中的VOYmiR127.860处理可导致高的引导链与过客链的比(>30.5)、在5’端精确加工的miRNA的高百分比(90.7+/-4.5％)，和相对于总内源miRNA库低水平的引导链和过客链(0.00096+/-0.00054％)。
在第29天对处死的动物进行组织学检查。尸检时，任何处理组的动物均无眼观病变。在脊髓和肝脏上进行显微组织病理学检查，未检测到与包装在AAVrh10中的VOYmiR127.860相关的组织病理学发现。
实施例8.SOD1敲低哺乳动物研究
药理学和功效
为了研究VOYmiR127.860的功效和药理学，在ALS的SOD1-G93A小鼠模型中进行研究。
通过IT施用至少2个剂量水平(低和高vg)来向小鼠施用。或者，静脉内给药用作替代施用途径。
对于药理研究，3组小鼠(每组10只小鼠，鼠龄约40至50天，性别均衡)接受媒介物或高剂量或低剂量水平的包装在AAVrh10中的VOYmiR127.860。4周后将所有动物处死，并通过RT-qPCR对脊髓组织样品的SOD1阻遏进行评估。还收集体重和笼侧观察结果。
在药理学研究之后，在SOD1-G93A小鼠中进行包装在AAVrh10中的VOYmiR127.860的功效研究。两组小鼠(约32只小鼠/组，鼠龄约40至50天，性别平衡)接受媒介物或高剂量或低剂量水平的包装在AAVrh10中的VOYmiR27-860。终点包括体重、神经学监测和存活率。脊髓组织样品还通过RT-qPCR评估其SOD1阻遏。
NHP中的药理学、毒性和生物分布研究
为了评估包装在AAVrh10中的VOYmiR127.860的安全性和分布，在用一次性IT输注的NHP中进行研究。评估3个时间点-4、13和26周。一次性给药后的4周生存期旨在为获得SOD1阻遏提供足够的时间，并提供有关包装在AAVrh10中的VOYmiR127.860的短期作用的信息。13周和26周的时间点旨在提供有关包装在AAVrh10中的VOYmiR127.860的长期作用的信息。
在进入之前，针对抗AAVrh10衣壳的中和抗体的存在以及异常血清化学概况，对动物进行筛选。测试3个剂量水平。还测试单一媒介物对照。
在第4周，在所有剂量组中对载体基因组进行定量。在4周内没有可检测到的载体基因组的组织不会在13周或26周的时间点进行评估。在第13周的时间点评估在4周具有可检测的载体基因组的组织。所有组织和器官被存档以进行可能的vg定量。
主要测量结果包括在不同CNS区域和主要外围器官(包括心脏和肺脏)内的载体基因组的PCR分析、具有显著载体基因组水平的靶标和非靶标组织的组织病理学评估，以及临床病理学，包括血清化学、血液学和凝血。安全药理学(中枢神经、心血管和呼吸系统)和局部耐受性也进行评估。
尽管已经结合若干所述实施方案以一定的范围和某些特定性，对本发明进行了描述，但是并不意图将本发明限制于任何这样的细节或实施方案或任何特定实施方案，而是应当将其解释为参考所附权利要求，以便根据现有技术提供对这些权利要求尽可能广泛的解释，并因此有效地包含本发明的预期范围。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用整体并入本文。如果发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。另外，章节标题、材料、方法和实施例仅是说明性的，而非意图限制。

Claims (21)

1.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含第一核酸序列，所述第一核酸序列包含两个反向末端重复(ITR)、启动子、内含子和第二核酸序列，其中所述第二核酸序列在表达时抑制或阻遏SOD1在细胞中的表达，其中所述第二核酸序列包含有义链序列和反义链序列，其中有义链序列包含至少15个与表3中所列序列的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的连续核苷酸，并且反义链序列包含至少15个与表2中所列序列的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的连续核苷酸，并且其中所述有义链序列和反义链序列共享长度为至少4个核苷酸的互补区。
2.如权利要求1所述的AAV载体，其中启动子选自CMV、CBA和H1。
3.如权利要求2所述的AAV载体，其中内含子是β-球蛋白。
4.如权利要求3所述的AAV载体，其中启动子是CMV。
5.如权利要求3所述的AAV载体，其中启动子是CBA。
6.如权利要求3所述的AAV载体，其中启动子是H1。
7.如权利要求1所述的AAV载体，其中AAV载体包含衣壳血清型，其选自AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV改组100-1、AAV改组100-3、AAV改组100-7、AAV改组10-2、AAV改组10-6、AAV改组10-8、AAV改组100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAVCBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAV CHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAVCHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAVCKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAVCLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAVCLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAVCLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAVCLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAVCSp-3、AAV CSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、AAV-PHP.B、AAV-PHP.A、G2B-26、G2B-13、TH1.1-32、TH1.1-35、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5及其变体。
8.一种抑制SOD1基因在细胞中表达的方法，该方法包括向细胞施用包含权利要求1-7中任一项所述的AAV载体的组合物。
9.如权利要求8所述的方法，其中细胞是哺乳动物细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其中哺乳动物细胞是运动神经元。
11.如权利要求9所述的方法，其中哺乳动物细胞是星形胶质细胞。
12.一种在需要治疗的受试者中治疗和/或缓解肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含权利要求1-7中任一项所述AAV载体的组合物。
13.如权利要求12所述的方法，其中SOD1的表达被抑制或阻遏。
14.如权利要求13所述的方法，其中SOD1是野生型SOD1，具有至少一个突变的突变型SOD1，或野生型SOD1和具有至少一个突变的突变型SOD1两者。
15.如权利要求12所述的方法，其中SOD1的表达被抑制或阻遏了约20％至约100％。
16.如权利要求12所述的方法，其中ALS是具有已识别的SOD1基因突变的家族性ALS。
17.如权利要求12所述的方法，其中ALS是散发性ALS。
18.一种抑制SOD1基因在细胞中表达的方法，其中SOD1基因包含引起细胞内功能效应获得的突变，所述方法包括向细胞施用包含权利要求1-7中任一项所述的AAV载体的组合物。
19.如权利要求18所述的方法，其中细胞是哺乳动物细胞。
20.如权利要求19所述的方法，其中细胞是运动神经元。
21.如权利要求19所述的方法，其中哺乳动物细胞是星形胶质细胞。
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