JP2002153278A - ウイルスベクターの製造に用いられる細胞、その製法およびその細胞を用いたウイルスベクターの製造方法 - Google Patents

ウイルスベクターの製造に用いられる細胞、その製法およびその細胞を用いたウイルスベクターの製造方法

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Abstract

(57)【要約】 【解決すべき課題】 煩雑な操作を必要とせず、ウイル
スベクターを効率よく製造するための新規細胞系を樹立
し、該細胞系を用いた高力価ウイルスベクターの製造方
法を提供すること。 【解決手段】 ウイルスベクターの製造に用いられる細
胞であって、細胞毒性を有するポリペプチドをコードす
る遺伝子が発現するセンスＲＮＡの全配列または一部配
列に対するアンチセンスＲＮＡを発現するアンチセンス
遺伝子を導入した細胞、その製法およびその細胞を用い
たウイルスベクターの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウイルスベクタ
ー、とくに高力価ウイルスベクターの製造に用いられる
細胞、その製法およびその細胞を用いたウイルスベクタ
ー、とくに高力価ウイルスベクターの製造方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】近年、ヒトを含む動物に対し、遺伝子を
導入する方法としてウイルスベクターを用いる方法が広
く知られており、用いられるウイルスベクターとして
は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイル
ス、アデノ随伴ウイルスなどを利用したウイルスベクタ
ーが知られている。
【０００３】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：Adeno-Asso
ciated Virus）ベクターは、ゲノムＤＮＡを宿主染色体
ＤＮＡへ組み込むことができるが、野生型ＡＡＶ自体は
非病原性である（N. Muzyczka, Current Topics in Mic
robiology and Immunology,158, 97, 1992）。ＡＡＶベ
クターは、造血幹細胞等の非分裂細胞へも遺伝子導入が
できることや、ヒトの第１９染色体に選択的に遺伝子導
入することができる等の特徴がある（M. Suwadogo and
R. G.Roder, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 439
4, 1985）。また、ＡＡＶ粒子は物理的に安定であるた
め、ショ糖密度勾配超遠心法や硫酸セルロースアフィニ
ティークロマトグラフィー等による濃縮により遺伝子導
入効率の高いベクターを調製することが可能である（K.
Tamayose, et al., Hum. Gene Ther., 7, 507-513, 19
96）。
【０００４】ＡＡＶは、自己複製能の欠損したウイルス
（Dependentvirus属）であり、増殖には、アデノウイル
ス（Ａｄ：Adenovirus）などのヘルパーウイルスの存在
が必要である。これまで、ＡＡＶベクターを用いる場
合、ヘルパープラスミドとベクタープラスミドとのコト
ランスフェクションに加え、ヘルパーウイルスであるア
デノウイルスの感染を同時におこなうことによって調製
されていた（R. M. Kotin, Hum. Gene Ther. 5, 793, 1
994）。しかし、リン酸カルシウム法に代表されるトラ
ンスフェクション法は、（１）プラスミドの細胞への遺
伝子導入効率に限界があり、臨床の場で必要とされる高
い力価のウイルスベクターを得ることは困難である、
（２）いくつかのロットに分けてトランスフェクション
をおこなった場合に、各ロット間の遺伝子導入効率に差
が生じ、一定の力価のウイルスベクターを安定的に供給
することができない、（３）トランスフェクションの操
作が繁雑であるために、一度に大量のベクターを調製す
るのは困難である、（４）大量のＡＡＶベクターを調製
するためには大量のトランスフェクション用プラスミド
を調製する必要がある、等の問題点が存在する。
【０００５】このような問題点を解決する手段として、
ヘルパープラスミドを、ウイルスベクター産生細胞のゲ
ノムＤＮＡに組み込んだパッケージング細胞が考えられ
ている。この細胞株は、プラスミド由来のＤＮＡがゲノ
ムＤＮＡに安定的に組み込まれているため細胞分裂の際
にも娘細胞に受け継がれることから、任意の規模で培養
することにより、必要に応じた量の組換えウイルスを安
定的に得ることができる。一般的に、これらのパッケー
ジング細胞株の樹立は、ネオマイシン耐性遺伝子や、ハ
イグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を保持し
たヘルパープラスミドを、ウイルスベクターを産生させ
るための細胞にトランスフェクションすることにより行
われ、その細胞を抗生物質の含有する培地で長期間培養
することにより、ゲノムＤＮＡにプラスミド由来の遺伝
子が組み込まれたパッケージング細胞が得られる。ＡＡ
Ｖベクターの調製には、アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１
Ｂ遺伝子を恒常的に発現している２９３細胞が用いられ
ている。２９３細胞は、ヒト胎児腎細胞がアデノウイル
ス５型（Ａｄ５）のＥ１遺伝子（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺
伝子）により形質転換して樹立された細胞株である。
【０００６】アデノウイルスのＥ１Ａ蛋白質は、ＡＡＶ
のｐ５プロモーターからの転写を誘導し、ＡＡＶのＲＥ
Ｐ蛋白質を発現させる。ＲＥＰ蛋白質は、ＡＡＶゲノム
がヒトの第１９染色体に選択的に遺伝子導入される際に
必要な蛋白質であると同時に、細胞の蛋白質合成系を、
ＡＡＶ粒子を作らせる方向に向かわせると考えられてい
る。しかしながら、ＲＥＰ蛋白質は細胞毒性を有し、細
胞の増殖を抑制する性質を有する。さらにまた、アデノ
ウイルスのＥ１ＢとＥ４はｍＲＮＡの蓄積、Ｅ２ＡとＶ
ＡはｍＲＮＡのスプライシングと翻訳に必要であると考
えられている（N. Muzyczka, Current Topics in Micro
biology and Immunology, 158, 97, 1992）。
【０００７】アデノウイルス５型のＥ１遺伝子を恒常的
に発現している２９３細胞では、アデノウイルスの混入
がなくてもＡＡＶのｐ５プロモーターが活性化され、Ｒ
ＥＰ蛋白質が発現する。このＲＥＰ蛋白質を恒常的に発
現させると細胞の増殖阻害が起こるため細胞が死滅す
る。このような理由から２９３細胞でのＡＡＶベクター
のパッケージング細胞の製造は困難であった。さらに、
ＲＥＰ蛋白質は、ヘルパーウイルスであるアデノウイル
スの増殖を抑制する作用があり、ｒｅｐ遺伝子が恒常的
に発現した細胞の中では、ＡＡＶベクターの製造が抑制
されてしまう。ｒｅｐ遺伝子産物（すなわち、ＲＥＰ蛋
白質）の細胞への毒性、およびヘルパーウイルスのアデ
ノウイルスの増殖抑制を回避するために、様々な方法が
検討されている。ＡＡＶベクターに組み込まれるベクタ
ープラスミド由来の遺伝子配列のみを導入して樹立した
パッケージング細胞に対して、ｒｅｐおよび／またはｃ
ａｐ遺伝子をコードする遺伝子を公知の方法により導入
し、ＡＡＶベクターを調製する方法も考えられている。
このｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子をコードする遺
伝子配列の細胞への導入法には、大きく分けて、組換え
ウイルスを用いる方法と用いない方法があるが、アデノ
ウイルスを用いる方法では遺伝子導入効率が高く、力価
がより高いＡＡＶベクターを産生するのに好ましい。
【０００８】パッケージング細胞に２９３細胞を使用し
た場合には、この細胞にすでにアデノウイルスのＥ１遺
伝子が保持されているため、ＡＡＶベクターを製造する
際、野生型アデノウイルスではなく、Ｅ１欠損型アデノ
ウイルスを感染させるだけでも、ＡＡＶベクターを製造
することができる。そこでこのＥ１欠損領域にＡＡＶの
ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子をコードする遺伝子
配列を組み込んだアデノウイルスによってＲＥＰおよび
／またはＣＡＰ蛋白を供給する方法が考えられた。しか
しながら、公知のＣＯＳ−ＴＰＣ法（鐘ケ江ら、実験医
学 Vol. 12, No. 3, 1994, S. Miyake. Et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, 1320, 1996、特開平８
−８４５８９号、特開平７−２９８８７７号）によりア
デノウイルスを調製しようとすると、２９３細胞におい
てＲＥＰ蛋白質の発現が起こるため、ｒｅｐ遺伝子をゲ
ノム配列内に保持したアデノウイルスを得ることができ
ない。
【０００９】特開平１０−３３１７５号では、Ｃｒｅ／
ｌｏｘＰ発現制御システムを用いてｒｅｐ遺伝子の発現
を制御することによって、２９３細胞における組換えＡ
ＡＶベクターを製造する方法が開示されている。しかし
ながら、この方法を用いても、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ発現制
御システムでのｒｅｐ遺伝子の発現制御は完全ではな
い。また、ＡＡＶベクターを製造する場合に、Ｃｒｅを
供給してｌｏｘＰを切り出す必要があり、操作が煩雑
で、さらにＣｒｅの供給についても非常に調整が難しく
発現制御が不安定となるなどの問題点があった。
【００１０】このように、従来の方法では、操作が煩雑
であること、プラスミドではすべての細胞に一様に遺伝
子導入できないこと、プラスミドDNAが残留すること、
コストが高いことなどの理由から、所望のＡＡＶベクタ
ーを効率よく製造する方法が望まれていた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、煩雑な操作を必要とせず、ウイルスベクターを
効率よく製造するための新規細胞系を樹立し、該細胞系
を用いた高力価ウイルスベクターの製造方法を提供する
ことにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者は、前記課題を
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ウイルスベクターの
製造に用いる新規細胞系を樹立し、該細胞系を用いた高
力価ウイルスベクターの製造方法を見出し、本発明を完
成するに至った。
【００１３】すなわち、本発明は、ウイルスベクターの
製造に用いられる細胞であって、細胞毒性を有するポリ
ペプチドをコードする遺伝子が発現するセンスＲＮＡの
全配列または一部配列に対するアンチセンスＲＮＡを発
現するアンチセンス遺伝子が１又は２以上導入された、
前記細胞に関する。また本発明は、細胞毒性を有するポ
リペプチドをコードする遺伝子が、ウイルスベクター由
来の遺伝子である、前記細胞に関する。さらに本発明
は、ウイルスベクター由来の遺伝子が、アデノ随伴ウイ
ルスベクター由来の遺伝子である、前記細胞に関する。
【００１４】また本発明は、アデノ随伴ウイルスベクタ
ー由来の遺伝子が、ｒｅｐ遺伝子である、前記細胞に関
する。さらに本発明は、アンチセンス遺伝子が、配列番
号１で示される配列および／または該配列の一部が欠
失、置換若しくは付加された配列に対するアンチセンス
ＲＮＡを発現するアンチセンス遺伝子である、前記細胞
に関する。また本発明は、細胞が、受託番号がＦＥＲＭ
ＢＰ−７３７７の細胞である、前記細胞に関する。さ
らに本発明は、細胞毒性を有するポリペプチドが、ヘル
パーウイルスの増殖を阻害するポリペプチドである、前
記細胞に関する。また本発明は、ヘルパーウイルスが、
アデノウイルスである、前記細胞に関する。
【００１５】さらに本発明は、ウイルスベクターの製造
に用いられる細胞を製造する方法であって、細胞毒性を
有するポリペプチドをコードする遺伝子が発現するセン
スＲＮＡの全配列または一部配列に対するアンチセンス
ＲＮＡを発現するアンチセンス遺伝子を１又は２以上導
入することを特徴とする、前記方法に関する。また本発
明は、細胞毒性を有するポリペプチドをコードする遺伝
子が、ウイルスベクター由来の遺伝子である、前記方法
に関する。さらに本発明は、ウイルスベクター由来の遺
伝子が、アデノ随伴ウイルスベクター由来の遺伝子であ
る、前記方法に関する。
【００１６】また本発明は、アデノ随伴ウイルスベクタ
ー由来の遺伝子が、ｒｅｐ遺伝子である、前記方法に関
する。さらに本発明は、アンチセンス遺伝子が、配列番
号１で示される配列および／または該配列の一部が欠
失、置換若しくは付加された配列に対するアンチセンス
ＲＮＡを発現するアンチセンス遺伝子である、前記方法
に関する。また本発明は、細胞が、受託番号がＦＥＲＭ
ＢＰ−７３７７の細胞である、前記方法に関する。
【００１７】さらに本発明は、細胞毒性を有するポリペ
プチドが、ヘルパーウイルスの増殖を阻害するポリペプ
チドである、前記方法に関する。また本発明は、ヘルパ
ーウイルスが、アデノウイルスである、前記方法に関す
る。さらに本発明は、前記細胞を用いてウイルスベクタ
ーを製造する方法であって、ウイルスベクター由来の遺
伝子を発現するヘルパーウイルスを得る工程、およびア
ンチセンス遺伝子が導入されていない細胞に、ウイルス
ベクター由来の遺伝子を発現するヘルパーウイルスとウ
イルスベクタープラスミドをトランスフェクションする
工程を含むことを特徴とする、前記方法に関する。
【００１８】本発明によれば、目的のウイルスベクター
を製造するために、細胞毒性を有するポリペプチドをコ
ードする遺伝子が、ウイルスベクターの製造に用いられ
る細胞に導入され、細胞内で発現する可能性がある場合
でも、細胞内ではアンチセンス遺伝子が恒常的に発現し
ており、細胞毒性を有するポリペプチドをコードする遺
伝子の発現を抑えることができる。
【００１９】すなわち、本発明の細胞自体が、細胞毒性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑え
るので、従来のＣｒｅ／ｌｏｘＰ発現制御システムを利
用した場合のように、細胞毒性を有するポリペプチドを
コードする遺伝子に特別な配列を挿入しておく必要もな
く、また、遺伝子の発現制御をするために、特別な酵素
を細胞内に与える必要もなくなるので、簡便な操作で効
率的に目的のウイルスベクターを製造することができ
る。なお、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−７３７７の細胞
は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に２
０００年１１月２１日付で寄託された細胞である。
【００２０】
【発明の実施の形態】本明細書でいう「ウイルスベクタ
ー」とは、自然界に存在するウイルスを組換えDNA技術
により改変したもので、任意の遺伝子をウイルスのゲノ
ムに挿入したものをさす。ウイルスベクターは、ウイル
スゲノムがDNAであるDNAウイルスベクターと、ウイルス
ゲノムがRNAであるRNAウイルスベクターに大別できる。
ウイルスベクターは、ウイルスがもともと持つ遺伝子導
入活性をを利用して、任意の遺伝子を標的細胞に導入し
て発現させる機能を有している。このようなウイルスベ
クターとしては、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクタ
ー、アデノウイルスベクター、マウス白血病ウイルス
（MoMLV）ベクター、ヒト免疫不全ウイルス（HＩV）ベ
クター、サル免疫不全ウイルス（SＩV）ベクター、セン
ダイウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなど
があげられる。また、ウイルスベクターの構成蛋白質群
のうち１つ以上を、異種ウイルスの構成蛋白質に置換す
る、もしくは、遺伝子情報を構成する核酸配列のうち１
部を異種ウイルスの核酸配列に置換する、シュードタイ
プ型のウイルスベクターも本発明に使用できる。
【００２１】また、高力価ウイルスベクターとは、力価
の高いウイルスベクターのことをいい、遺伝子導入効率
が高いウイルスベクターのことをいう。ウイルスベクタ
ーの力価は、通常、CFU（colony forming units）で表
される。例えば、ウイルスゲノムにネオマイシン耐性遺
伝子を挿入、もしくは置換したウイルスベクターを任意
の細胞に遺伝子導入して、ネオマイシン含有培地で生育
した細胞のコロニー数を数えるという方法で評価され
る。
【００２２】本明細書でいう「ヘルパーウイルス」と
は、単独では複製し得ないウイルスベクターの複製を誘
導するために必要とされるウイルスをいう。例えば、Ａ
ＡＶでは、自己複製能の欠損したウイルスであり、それ
自身の複製にはアデノウイルスあるいはヘルペスウイル
スのいずれかが必要である。このようなアデノウイルス
あるいはヘルペスウイルスが、ＡＡＶのヘルパーウイル
スである。
【００２３】本明細書でいう「ヘルパープラスミド」と
は、例えば、野生型ＡＡＶのゲノムの５'末端側のＩＴ
Ｒおよび３'末端側のＩＴＲ配列の間の構造遺伝子を切
り出し、それ自身はパッケージングされず、ＡＡＶベク
ターの産生に必要な蛋白質を発現することを可能とする
遺伝子配列を保持するようなプラスミドのことである。
ヘルパープラスミドは、公知の方法により構築すること
ができる。ここで、野生型ＡＡＶのＩＴＲ（inverted t
erminal repeat）とは、ＡＡＶのゲノムＤＮＡの両末端
に存在する１４５塩基の配列であって、Ｔ型のヘアピン
構造を持ち、ウイルスの複製、パッケージング、染色体
への組み込み等に必須である（R. Samulski et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 2077, 1982）。この
ヘルパープラスミドにはプロモーター配列がなく、ＡＡ
Ｖ由来のプロモーターからのみＡＡＶ遺伝子は発現され
る。ＡＡＶベクターの製造に用いるヘルパープラスミド
は、パッケージング細胞を２９３細胞とすることによ
り、ｐ５からの転写ができる。ここでいうｐ５とは、Ａ
ＡＶのプロモーターであって、通常、ｒｅｐ遺伝子の上
流に存在する。
【００２４】本明細書でいう「ベクタープラスミド」と
は、導入する目的の外来遺伝子（導入用遺伝子）を有す
るプラスミドで、例えば、ｐｓｕｂ２０１に代表される
野生型ＡＡＶの全ゲノム配列をコードするプラスミドの
ゲノムの５'末端側のＩＴＲと３'末端側のＩＴＲ配列間
の野生型ＡＡＶゲノム配列が、少なくとも１つの遺伝子
マーカーおよび／または導入用遺伝子で置換されている
ＡＡＶベクタープラスミドをいう。導入用遺伝子は、少
なくとも１つのプロモーターとポリＡシグナルを含み、
プロモーターとしては、アデノウイルス（Aｄ）、サイ
トメガロウイルス（CMV）、ヒト免疫不全ウイルス（HＩ
V）、アデノ随伴ウイルス（AAV）、
【００２５】シミアンウイルス４０（SV40）、ラウス肉
腫ウイルス（RSV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、マ
ウス白血病ウイルス（MoMLV）、シンビスウイルス（Sin
dbisvirus）、センダイウイルス（SeV）、A型肝炎ウイ
ルス（HAV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイル
ス（HCV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、ウシパピ
ローマウイルス（BPV）、ヒトT細胞白血病ウイルス（HT
LV）、水疱性口内炎ウイルス（VSV）、インフルエンザ
ウイルス（Influenza virus）、日本脳炎ウイルス（Jap
anese encephalitis virus）、JCウイルス（JC viru
s）、パルボウイルスB19（Parvovirus B19）、ポリオウ
イルス（Poliovirus）等のウイルス由来のプロモータ
ー、
【００２６】SR−α（シグナル認識粒状レセプターのア
ルファサブユニット）、ミエリン塩基性蛋白質（MB
P）、グリア特異的グリア線維性酸性蛋白質（GFAP）、
β−アクチン、伸長因子−α（EF１−α）、グリセルア
ルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、多
剤耐性遺伝子（Mdr1）、アルブミンアルファフェトプロ
テイン（AFP）、熱ショック蛋白質（HSP）、低酸素誘導
蛋白質（HＩP）等の哺乳類由来のプロモーター、もしく
は、CMV初期エンハンサー／トリβアクチンプロモータ
ー／βグロビンポリAからなるキメラプロモーター（CA
G）、CMV初期エンハンサー／アルファ−スケルトンアク
チンプロモーターからなるキメラプロモーター等のキメ
ラ型プロモーター等を含む。また、遺伝子とそれらを発
現させるレトロウイルス由来のプロモーターであるLTR
を、LTRのU3領域を例えば、CAG、CMV、RSV、単純ヘルペ
スウイルス−チミジンキナーゼ（HSV−TK）、SV４０、S
R−α、MBP、β−アクチン、EF1−α等のプロモーター
に置換した、キメラ型LTR等が挙げられるが、遺伝子の
発現効率が高く、プロモーターに宿主、臓器特異性がな
いため、各種実験動物やヒトの様々な臓器で、遺伝子を
高発現できる等の理由からCAGプロモーターが好まし
い。ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を選択
のために組み込むこともできる。
【００２７】本明細書でいう「パッケージング細胞」と
は、感染性を有するウイルス粒子を産生するために、必
要な蛋白質をコードする遺伝子を染色体に組み込むなど
してあらかじめ導入した細胞のことであるが、パッケー
ジング細胞で産生されるウイルス粒子はウイルスゲノム
を保持しない。パッケージング細胞に、任意の遺伝子を
挿入、もしくは置換したウイルスゲノムを供給すること
によって、このウイルスゲノムはウイルス粒子に取り込
まれ、ウイルスベクターが産生されるというものであ
る。パッケージング細胞に用いられる細胞には、２９３
細胞、ＨｅＬａ細胞、COS細胞、３T３細胞などが挙げら
れる。AAVベクター作製に際してはヘルパーウイルスが
必要であるので、ヘルパーウイルスであるアデノウイル
スが感染しやすい２９３細胞が好ましい。
【００２８】本明細書でいう「細胞毒性を有するポリペ
プチド」とは、ウイルスベクターを製造するための細胞
内で産生された場合、細胞毒性によって該細胞が正常な
状態を保てなくなる原因となる蛋白質を含むポリペプチ
ドをいう。例えば、ｒｅｐ遺伝子にコードされるＲＥＰ
蛋白質、HＩVのenv遺伝子にコードされるウイルス皮膜
蛋白質（ENV）、VSVのG遺伝子にコードされるウイルス
皮膜蛋白質（VSV−G）などがあげられる。
【００２９】本明細書でいう「ｒｅｐ遺伝子」とは、Ａ
ＡＶ由来の遺伝子であって、ＡＡＶの複製に関与するＲ
ＥＰ蛋白質をコードしている遺伝子である。ｒｅｐ遺伝
子は、ウイルスｐ５プロモーターから転写、翻訳される
Large Rep（Rep78、Rep68）とｐ１９プロモーターから
転写、翻訳されるSmall Rep（Rep52、Rep40）の４つの
蛋白質をコードしている。Large RepとSmall Repはスプ
ライシングによってサイズが変わる。ｒｅｐ遺伝子にコ
ードされるＲＥＰ蛋白質は、ＡＡＶ複製に関与するが、
一方でアデノウイルスの複製は阻害し、細胞毒性を有す
る。ｒｅｐ遺伝子の塩基配列については配列番号５およ
び配列番号６で示しているが、この配列だけに限定され
るものではない。実質的に同等の機能および性質を有し
ていれば、配列の一部が欠失、置換または付加されてい
ても、本明細書でいうｒｅｐ遺伝子に含まれる。
【００３０】本発明の細胞に導入されるアンチセンス遺
伝子は、１又は２以上のアンチセンス遺伝子であってよ
い。アンチセンス遺伝子が２以上細胞に導入される場
合、アンチセンス遺伝子は、同種のアンチセンス遺伝子
が複数コピー導入されていてもよく、また、異種のアン
チセンス遺伝子、すなわち、異種のポリペプチドをコー
ドする複数の遺伝子に対する複数のアンチセンス遺伝子
が導入されていてもよい。さらに、細胞毒性を有するポ
リペプチドをコードする遺伝子の発現を抑える性質を有
する限り、アンチセンス遺伝子の塩基配列が一部が欠
失、置換若しくは付加された配列であってもよい。
【００３１】以下、本発明を実施例を示しながら、さら
に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定
されるものではない。
【００３２】
【実施例】実施例１ プラスミドpCAGS-r/anti-p5+p19/
LNの構築 ｒｅｐ遺伝子のｐ５プロモーターの転写開始点を含むよ
うに、ＢｇｌＩＩサイトをデザインしたプライマー（ｒ
ｅｐＳ；５’;−ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＴＧ
ＡＡＧＣＧＧＧＡＧＧＴＴＴＧＡＡＣＧ−３’;（配列
番号２）；下線はＢｇｌＩＩサイトを示す）と、ｐ１９
プロモーターの転写開始点から約２００bp下流に、Ｂｇ
ｌＩＩサイトをデザインしたプライマー（ｒｅｐＡ；
５’;−ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＡＴ
ＴＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＴＡＴＧＡＧＧ−３’;（配列
番号３）；下線はＢｇｌＩＩサイトを示す）を設計し
た。
【００３３】ＡＡＶの全構造遺伝子を保持するプラスミ
ドpAAV/Ad（Samulski, R. J. et al., J. Virol., 63,
3822−3828, 1989；図５；Samulski氏より入手）を鋳型
にして、ｒｅｐ遺伝子のコーディング領域の一部をＰＣ
Ｒ（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅した。ＰＣＲ条
件は、９４℃で５分反応後、９４℃３０秒、６１℃３０
秒、７２℃１分を３０サイクルし、再度７２℃で反応を
行った。ＰＣＲ反応物を、常法にしたがい、２％アガロ
ースゲル、１×TAEバッファーを用いて電気泳動を行
い、終濃度２μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドにより
染色し、紫外線照射により観察したところ、約０．８ｋ
ｂの増幅産物が得られたことが確認された。
【００３４】この約０．８ｋｂの増幅産物をゲルから回
収し、ＢｇｌＩＩ消化した。一方で、pCAGS/LN（図３）
をBamHＩ消化後、末端をBAP処理により脱リン酸化し、
前述のＢｇｌＩＩ消化した増幅産物をサブクローニング
した。サブクローニングで得られたクローンの塩基配列
の解析を行い、ＣＡＧプロモーターからｒｅｐ遺伝子の
アンチセンスが転写される方向に断片が組み込まれたク
ローンを選択した（pCAGS-r/anti-p5+p19/LN；図４）。
【００３５】なお、増幅産物の塩基配列は図10に示す。
ここで、ＣＡＧプロモーターとは、CMV初期エンハンサ
ー／トリβアクチンプロモーター／βグロビンポリAか
らなるキメラプロモーターである。また、図中のamp
は、選択マーカーとして使用できるアンピシリン耐性遺
伝子を示す。CMV−ＩEエンハンサーは、サイトメガロウ
イルス（CMV）由来の初期プロモーターのエンハンサー
配列を示す。SV40 oriは、シミアンウイルス４０（SV4
0）由来で、SV40 Large T抗原により複製される複製起
点を示す。ウサギβ−グロビンpolyAは、ウサギβ−グ
ロビン遺伝子由来のポリAシグナルを示す。
【００３６】実施例２ プラスミドpAdex1w/AAVの構築 pAAV/Ad（図５）から、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃ
ａｐ遺伝子を含む約４．３ｋｂのＸｂａＩ断片を回収し
た。次にこのＸｂａＩ断片をコスミドpAdex1w（Miyake,
S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 1320-
1324, 1996.；図６；斉藤氏より入手）のＳｗａＩ部位
にサブクローニングし、コスミドpAdex1w/AAV（図７）
を構築した。なお、遺伝子断片の回収およびサブクロー
ニングは実施例１と同様にして行った。また、図中のア
デノウイルスＩＴＲ（ＡｄＩＴＲ）は、アデノウイルス
５型由来のＩＴＲ（Inverted Terminal Repeat）を示
す。repは、AAV２型由来のrep遺伝子を示す。capは、AA
V２型由来のcap遺伝子を示す。COSは、λファージ由来
のパッケージング認識配列を示す。pBR322 oriは、pBR3
22由来の大腸菌内でのプラスミド複製起点を示す。
【００３７】実施例３ ｒｅｐアンチセンス発現細胞株
の樹立 ｒｅｐアンチセンス発現細胞株を樹立するために２９３
細胞を用いた。２９３細胞を１０％牛胎児血清（Gibco
社製）および抗生物質を補充したダルベッコ改良イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ；Gibco社製）中に維持した。この細
胞を１０ｃｍのディッシュで約７０％コンフルエントの
状態に培養して、構築したプラスミドpCAGS/ anti-p5+p
19/LN（図4）を公知のリン酸カルシウム法（M. Kringl
er, Gene Transfer and Expression Protocol., A Lab
olatory Manua, Oxford University Press, 1990）に
よりトランスフェクションした。トランスフェクション
した２９３細胞をＣＯ２インキュベーター内（培養条
件；細胞は１０％ウシ胎仔血清（FBS、Gibco社製）を含
むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco社製）を
用いて５％酸素濃度、３７℃条件下で培養した）で４時
間インキュベーションした後、新鮮な培養液に置換して
さらに２日間インキュベーションした。
【００３８】次にトランスフェクタントのみを選択する
ために、リン酸バッファー（ＰＢＳ（−）、Gibco社
製）で細胞を２度洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡ混液に
より細胞を培養皿から剥がし、新しい１０ｃｍの培養皿
に再播種した。細胞が培養皿に接着したのを確認後、ネ
オマイシンの類縁物質であるＧ４１８（Gibco社製）を
培養液中に最終濃度１０００μｇ／ｍｌになるように添
加した。ＣＯ２インキュベーター内で１０日間インキュ
ベーションを続けた後、生き残った細胞集団（コロニ
ー）を１つずつ分離し、新鮮な培養液中でさらにインキ
ュベーションを続け、ネオマイシン耐性細胞株（ｒｅｐ
アンチセンス発現細胞）を得た。
【００３９】実施例４ ｒｅｐアンチセンス発現量の確
認 実施例３で得られたｒｅｐアンチセンス発現細胞からＡ
ＧＰＣ（Acid- Guanidium-Phenol-Chroloform）法によ
り全ＲＮＡを抽出して使用した。調製したトータルＲＮ
Ａ（１５μｇ）を１％ホルムアルデヒド−アガロースゲ
ルで電気泳動し、ニトロセルロースフィルター（Ｈｙｂ
ｏｎｄＮ＋：アマシャム社製）に固定化した。pAAV/Ad
（図５）をＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化し、約６３０
ｂｐのｒｅｐ遺伝子のＰ５プロモーター領域に特異的な
ＤＮＡ断片（配列番号４）を回収した。
【００４０】この断片を３２Ｐでラベルしたプローブを
用いてノーザンハイブリダイゼーション（４２℃、１２
時間）を行った。メンブレンを５×ＳＳＣ、５０％ホル
ムアミド、１×デンハールト水溶液、０．２％ＳＤＳ、
１０％硫酸デキストラン、熱変性させた２００μｇ／ｍ
ｌのサケ精巣ＤＮＡを含むバッファー中に入れ、ラジオ
アイソトープでラベルしたプローブＤＮＡを加え６５℃
でハイブリダイズした。その後フィルターを５５℃の２
×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳバッファー中で洗浄し、さら
に５５℃の０．１×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳバッファー
中でもう一度洗浄した。Ｘ線フィルム上でオートラジオ
グラフィーにかけて、ネオマイシン耐性細胞株における
ｒｅｐアンチセンスの発現を確認した（図１）。特にク
ローンＬ９／２９３（以下、Ｌ９／２９３細胞と称す
る）は、高いｒｅｐアンチセンスの発現を示した。
【００４１】なお、Ｌ９／２９３細胞はｒｅｐ遺伝子の
アンチセンス（配列番号１）を恒常的に発現する細胞株
であって、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所に２０００年１１月２１日付で寄託され、寄託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−７３７７として受託された。
【００４２】実施例５ ｒｅｐ−ｃａｐ発現アデノウイ
ルスの作製 本実験で用いられる組換えアデノウイルスベクターはＣ
ＯＳ−ＴＰＣ法（Miyake, S. et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA.,93, 1320, 1996）に従って作製した。構
築したコスミドpAdex1w/AAVを８μｇとＥｃｏＴ２２Ｉ
処理したＣＯＳ−ＴＰＣ（図８）を５μｇとを、リン酸
カルシウム法にて実施例４で樹立したｒｅｐアンチセン
ス発現細胞のＬ９／２９３細胞（図１）にトランスフェ
クションした。３７℃、５％ＣＯ２条件下で１２時間培
養した後、細胞を９６穴プレートに播種し、さらに１０
〜１５日間培養を続けた。細胞が死滅したウェルから死
滅細胞ごと培養液を回収し、凍結融解を６回繰り返した
後、５，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。上清を１
次ウイルス液として−８０℃にて保存した。１次ウイル
ス液をＬ９／２９３細胞およびＨｅＬａ細胞にそれぞれ
感染させた。感染３日後にＨｅＬａ細胞では変性が認め
られず、Ｌ９／２９３細胞が完全に死滅した１次ウイル
ス液について、クローンのＬ９／２９３細胞から死滅細
胞ごと培養液を回収した。回収した培養液は、凍結融解
を６回行った後、５，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し
た。上清を２次ウイルス液として−８０℃にて保存し
た。
【００４３】２次ウイルス液を調製した際の細胞を回収
し、１×ＴＥＮ緩衝液（ＴＥＮ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍ
ＭＮａＣｌ）中に懸濁しホモジナイズした。ホモジナイ
ズした懸濁液にＳＤＳ（１０％）を終濃度０．１％、Pr
oteinase K（MERCK社製、２０ｍｇ／ｍｌ）を０．１ｍ
ｇ／ｍｌとなるように加え、緩やかに転倒混和し、５０
℃で１時間インキュベートした。フェノール・クロロホ
ルム抽出を２回行い、回収した上清からさらにクロロホ
ルム抽出を２回行い上清を回収した。エタノール沈澱に
より回収したＤＮＡに適量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を
加え、ＤＮＡを溶解した。このＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化
した後に、アガロースゲル電気泳動を行い、アデノウイ
ルスゲノムおよび、挿入遺伝子の有無を確認した。
【００４４】この操作で選択したクローンの２次ウイル
ス液から、Ｌ９／２９３細胞に感染させ、細胞が死滅し
たものについて、死滅細胞ごと培養液を回収し、凍結融
解を６回繰り返した後、３，０００ｒｐｍ、１０分間遠
心分離した。上清を３次ウイルス液として−８０℃にて
保存した。同様の操作でスケールアップを行い、最終的
に４次ウイルス液（以下、Ａｄ／ＡＡＶ溶液と称す）を
調製し、−８０℃にて保存した。
【００４５】実施例６ Ａｄ／ＡＡＶ溶液を利用した組
換えＡＡＶベクターの調製 Ａｄ／ＡＡＶ溶液を用いて、ＡＡＶベクターの調製を行
った。２９３細胞を１０ｃｍシャーレで、１０ｍｌのＤ
ＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）を用いて７０％コンフルエント
の状態になるまで培養した。
【００４６】実施例５で調製したＡｄ／ＡＡＶ溶液６０
μｌを加えたＤＭＥＭ（２％ＦＣＳ）１ｍｌを、培地を
除いたシャーレに加えて、１時間インキュベートした。
ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）を８ｍｌ加えた後、ＡＡＶ由
来のＩＴＲの間にＣＡＧプロモーターで誘導されるＥＧ
ＦＰ（オワンクラゲ由来の緑色蛍光蛋白質で、紫外線照
射下で緑色蛍光を発するという性質を有する）遺伝子
と、ＴＫプロモーター（単純ヘルペスウイルスのチミジ
ンキナーゼ遺伝子由来のプロモーター）で誘導されるネ
オマイシン耐性遺伝子を含む組換えＡＡＶベクターベク
タープラスミドpCAGSETN/sub（図９）１０μｇをリン酸
カルシウム法により２９３細胞にトランスフェクション
した。６時間後に培地を除去し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＣ
Ｓ）を６ｍｌ加えて、２日間培養した。細胞を培養液ご
とかき集め、凍結融解を繰り返して細胞を破壊した後、
３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を回収し
た。５６℃で４５分間加熱して、アデノウイルスを不活
化した後、３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上
清（組換えＡＡＶベクター溶液）を回収した。
【００４７】実施例７ ＡＡＶベクターの力価測定 実施例６で得られた組換えＡＡＶベクターの力価を、以
下に示すＨｅＬａ細胞を用いたバイオアッセイ法により
検定した。１×１０５個のＨｅＬａ細胞を６ウェルの培
養皿に播種し、一晩ＣＯ２インキュベーター内に放置し
た。細胞をＰＢＳ（−）で２度洗浄後、１ｍｌの組換え
ＡＡＶベクター溶液を添加した。４時間ＣＯ２インキュ
ベーター内に放置した後、１０％ＦＣＳを含む３ｍｌの
ＤＭＥＭを添加し、２日間ＣＯ２インキュベーター内で
インキュベーションした。ＰＢＳ（−）で洗浄後トリプ
シン−ＥＤＴＡ混液で細胞を培養皿から剥がし、新しい
１０ｃｍの培養皿に再播種した。細胞が培養皿に接着し
たのを確認後、ネオマイシンの類縁物質であるＧ４１８
（Gibco社製）を培養液中に最終濃度１０００μｇ／ｍ
ｌになるように添加した。ＣＯ２インキュベーター内で
１０日間インキュベーションを続けた後、生き残った細
胞集団（コロニー）をクリスタルバイオレットによって
染色し、染色されたコロニーをカウントした（図２）。
対照として、未処置のＨｅＬａ細胞をＧ４１８処理した
際のコロニー数を示す。その結果、repアンチセンス発
現細胞株を用いることによって、ＡＡＶベクターを作製
することが可能であることが明らかとなった。
【００４８】以上の結果から、（１）細胞毒性を有する
rep遺伝子をアデノウイルス（ヘルパーウイルス）ゲノ
ムに挿入する工程、（２）前記ヘルパーウイルスを大量
増殖させる工程、（３）前記ヘルパーウイルスを用いて
ＡＡＶベクターを作製する工程、を含むＡＡＶベクター
の製造方法において、（２）の工程で、本発明のアンチ
センス遺伝子を導入した細胞を用いることで、煩雑な操
作をする必要がなく細胞毒性を有するRep蛋白質の産生
を抑制することで、細胞の死滅を防ぎ、ヘルパーウイル
スを製造することができることが示された。
【００４９】
【発明の効果】本発明の、細胞毒性を有するポリペプチ
ドをコードする遺伝子が発現するセンスＲＮＡの全配列
または一部配列に対するアンチセンスＲＮＡを発現する
アンチセンス遺伝子を導入した細胞を用いることによっ
て、高力価ウイルスベクター溶液を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のｒｅｐアンチセンスを発現する細胞
を確認したノーザンハイブリダイゼーションの結果を示
す図面代用写真である。
【図２】 本発明のＡｄ／ＡＡＶ溶液を用いて調製した
組換えＡＡＶベクター溶液と、従来のプラスミドを用い
て調製した組換えＡＡＶベクター溶液との遺伝子導入効
率を比較したグラフである。
【図３】 プラスミドpCAGS/LNの構成を示す概略図であ
る。
【図４】 プラスミドpCAGS-r/anti-p5+p19/LNの構成を
示す概略図である。
【図５】 プラスミドpAAV/Adの構成を示す概略図であ
る。
【図６】 コスミドpAdex1wの構成を示す概略図であ
る。
【図７】 コスミドpAdex1w/AAVの構成を示す概略図で
ある。
【図８】 pAdex1w/AAVをＥｃｏＴ２２Ｉ処理したＣＯ
Ｓ−ＴＰＣを示す概略図である。
【図９】 組換えＡＡＶベクターベクタープラスミドpC
AGSETN/subの構成を示す概略図である。
【図１０】 本発明のｒｅｐアンチセンスを発現する細
胞に導入したＰＣＲ増幅産物（Ｐ５−１９／ＰＣＲ）の
塩基配列である。
【配列表フリーテキスト】［配列番号１］人工物の配列
の記載：rep遺伝子のｐ５とｐ１９との間のアンチセン
ス配列。 ［配列番号２］人工物の配列の記載：クローニング用セ
ンスプライマー。 ［配列番号３］人工物の配列の記載：クローニング用ア
ンチセンスプライマー。 ［配列番号４］人工物の配列の記載：ハイブリダイゼー
ション用XbaI−SacI断片。 ［配列番号５］REP68蛋白質をコードするrep遺伝子。 ［配列番号６］REP78蛋白質をコードするrep遺伝子。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. <120> A CELL FOR PREPARING A VIRUS VECTOR, A METHOD FOR PREPARING THEREOF, AND A METHOD FOR PREPARING A VIRUS VECTOR USING THE CELL <130> PP-1931 <140> <141> <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 826 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Antisense sequence between p5 and p19 of rep gene <400> 1 gaagatctga attcgccgca ttgaaggaga tgtatgaggc ctggtcctcc tggatccact 60 gcttctccga ggtaatcccc ttgtccacga gccacccgac cagctccatg tacctggctg 120 aagtttttga tctgatcacc ggcgcatcag aattgggatt ctgattctct ttgttctgct 180 cctgcgtctg cgacacgtgc gtcagatgct gcgccaccaa ccgtttacgc tccgtgagat 240 tcaaacaggc gcttaaatac tgttccatat tagtccacgc ccactggagc tcaggctggg 300 ttttggggag caagtaattg gggatgtagc actcatccac caccttgttc ccgcctccgg 360 cgccatttct ggtctttgtg accgcgaacc agtttggcaa agtcggctcg atcccgcggt 420 aaattctctg aatcagtttt tcgcgaatct gactcaggaa acgtcccaaa accatggatt 480 tcaccccggt ggtttccacg agcacgtgca tgtggaagta gctctctccc ttctcaaatt 540 gcacaaagaa aagggcctcc ggggccttac tcacacggcg ccattccgtc agaaagtcgc 600 gctgcagctt ctcggccacg gtcaggggtg cctgctcaat cagattcaga tccatgtcag 660 aatctggcgg caactcccat tccttctcgg ccacccagtt cacaaagctg tcagaaatgc 720 cgggcagatg cccgtcaagg tcgctgggga ccttaatcac aatctcgtaa aaccccggca 780 tggcggctgc gcgttcaaac ctcccgcttc aaaatggaag atcttc 826 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Sence primer for cloning <400> 2 gaagatcttc cattttgaag cgggaggttt gaacg 35 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Antisence primer for cloning <400> 3 gaagatctga attcgccgca ttgaaggaga tgtatgagg 39 <210> 4 <211> 631 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:XbaI-SacI fragment for hybridization <400> 4 tctagagtcc tgtattagag gtcacgtgag tgttttgcga cattttgcga caccatgtgg 60 tcacgctggg tatttaagcc cgagtgagca cgcagggtct ccattttgaa gcgggaggtt 120 tgaacgcgca gccgccatgc cggggtttta cgagattgtg attaaggtcc ccagcgacct 180 tgacgggcat ctgcccggca tttctgacag ctttgtgaac tgggtggccg agaaggaatg 240 ggagttgccg ccagattctg acatggatct gaatctgatt gagcaggcac ccctgaccgt 300 ggccgagaag ctgcagcgcg actttctgac ggaatggcgc cgtgtgagta aggccccgga 360 ggcccttttc tttgtgcaat ttgagaaggg agagagctac ttccacatgc acgtgctcgt 420 ggaaaccacc ggggtgaaat ccatggtttt gggacgtttc ctgagtcaga ttcgcgaaaa 480 actgattcag agaatttacc gcgggatcga gccgactttg ccaaactggt tcgcggtcac 540 aaagaccaga aatggcgccg gaggcgggaa caaggtggtg gatgagtgct acatccccaa 600 ttacttgctc cccaaaaccc agcctgagct c 631 <210> 5 <211> 1608 <212> DNA <213> adeno associated virus <220> <223> rep gene encoding REP68 protein <400> 5 atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg gcatctgccc 60 ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120 tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180 cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240 caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300 aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360 taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420 gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480 acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540 aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600 gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660 tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720 cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780 tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840 cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900 attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960 acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020 accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080 aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140 aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200 gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260 aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320 ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380 gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440 gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500 gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560 gaagcttcga tcaactacgc agacagattg gctcgaggac actctctc 1608 <210> 6 <211> 1863 <212> DNA <213> adeno associated virus <220> <223> rep gene encoding REP78 protein <400> 6 atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg gcatctgccc 60 ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120 tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180 cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240 caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300 aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360 taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420 gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480 acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540 aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600 gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660 tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720 cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780 tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840 cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900 attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960 acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020 accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080 aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140 aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200 gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260 aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320 ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380 gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440 gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500 gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560 gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620 aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680 ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740 tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800 ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860 caa 1863

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ウイルスベクターの製造に用いられる細
    胞であって、細胞毒性を有するポリペプチドをコードす
    る遺伝子が発現するセンスＲＮＡの全配列または一部配
    列に対するアンチセンスＲＮＡを発現するアンチセンス
    遺伝子が１又は２以上導入された、前記細胞。
  2. 【請求項２】 細胞毒性を有するポリペプチドをコード
    する遺伝子が、ウイルスベクター由来の遺伝子である、
    請求項１に記載の細胞。
  3. 【請求項３】 ウイルスベクター由来の遺伝子が、アデ
    ノ随伴ウイルスベクター由来の遺伝子である、請求項２
    に記載の細胞。
  4. 【請求項４】 アデノ随伴ウイルスベクター由来の遺伝
    子が、ｒｅｐ遺伝子である、請求項３に記載の細胞。
  5. 【請求項５】 アンチセンス遺伝子が、配列番号１で示
    される配列および／または該配列の一部が欠失、置換若
    しくは付加された配列に対するアンチセンスＲＮＡを発
    現するアンチセンス遺伝子である、請求項１に記載の細
    胞。
  6. 【請求項６】 細胞が、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−７
    ３７７の細胞である、請求項５に記載の細胞。
  7. 【請求項７】 細胞毒性を有するポリペプチドが、ヘル
    パーウイルスの増殖を阻害するポリペプチドである、請
    求項１に記載の細胞。
  8. 【請求項８】 ヘルパーウイルスが、アデノウイルスで
    ある、請求項７記載の細胞。
  9. 【請求項９】 ウイルスベクターの製造に用いられる細
    胞を製造する方法であって、細胞毒性を有するポリペプ
    チドをコードする遺伝子が発現するセンスＲＮＡの全配
    列または一部配列に対するアンチセンスＲＮＡを発現す
    るアンチセンス遺伝子を１又は２以上導入することを特
    徴とする、前記方法。
  10. 【請求項１０】 細胞毒性を有するポリペプチドをコー
    ドする遺伝子が、ウイルスベクター由来の遺伝子であ
    る、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ウイルスベクター由来の遺伝子が、ア
    デノ随伴ウイルスベクター由来の遺伝子である、請求項
    １０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 アデノ随伴ウイルスベクター由来の遺
    伝子が、ｒｅｐ遺伝子である、請求項１１に記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】 アンチセンス遺伝子が、配列番号１で
    示される配列および／または該配列の一部が欠失、置換
    若しくは付加された配列に対するアンチセンスＲＮＡを
    発現するアンチセンス遺伝子である、請求項９に記載の
    方法。
  14. 【請求項１４】 細胞が、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−
    ７３７７の細胞である、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 細胞毒性を有するポリペプチドが、ヘ
    ルパーウイルスの増殖を阻害するポリペプチドである、
    請求項９に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ヘルパーウイルスが、アデノウイルス
    である、請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１〜８のいずれかに記載の細胞
    を用いてウイルスベクターを製造する方法であって、ウ
    イルスベクター由来の遺伝子を発現するヘルパーウイル
    スを得る工程、およびアンチセンス遺伝子が導入されて
    いない細胞に、ウイルスベクター由来の遺伝子を発現す
    るヘルパーウイルスとウイルスベクタープラスミドをト
    ランスフェクションする工程を含むことを特徴とする、
    前記方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018050624A (ja) * 2012-01-24 2018-04-05 ユニバーシティ オブ ジョージア リサーチ ファンデーション，インコーポレーテッド パラインフルエンザウイルス５型ベースのワクチン
JP2021509253A (ja) * 2017-10-10 2021-03-25 ナントバイオ，インコーポレイテッド ウイルス生成ペイロードに対して低い毒性を有する改変ｅｃ７細胞
JP2023519963A (ja) * 2020-03-30 2023-05-15 グレフェックス， インコーポレイテッド アデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターの産生の増強

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090055941A1 (en) * 2005-03-22 2009-02-26 Agency For Science, Technology And Research Novel Neural Cell Specific Promoter And Baculovirus And Method For Gene Delivery
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
CN112553229A (zh) 2014-11-05 2021-03-26 沃雅戈治疗公司 用于治疗帕金森病的aadc多核苷酸
RU2020108189A (ru) 2014-11-14 2020-03-11 Вояджер Терапьютикс, Инк. Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als)
MX2017006217A (es) 2014-11-14 2018-05-02 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos moduladores.
EP3230441A4 (en) 2014-12-12 2018-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
AU2016362477A1 (en) 2015-12-02 2018-06-14 Voyager Therapeutics, Inc. Assays for the detection of AAV neutralizing antibodies
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
BR112018073472A2 (pt) 2016-05-18 2019-08-27 Voyager Therapeutics, Inc. composições e métodos de tratamento da doença de huntington
AU2017267665C1 (en) 2016-05-18 2023-10-05 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
WO2018044933A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
CN111108198A (zh) 2017-05-05 2020-05-05 沃雅戈治疗公司 治疗亨廷顿病的组合物和方法
CA3061652A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
CN111132626B (zh) 2017-07-17 2024-01-30 沃雅戈治疗公司 轨迹阵列引导系统
AU2018338728B2 (en) 2017-09-29 2025-01-02 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Rescue of central and peripheral neurological phenotype of Friedreich's Ataxia by intravenous delivery
US20200237799A1 (en) 2017-10-16 2020-07-30 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
CN111479924B (zh) 2017-10-16 2024-06-14 沃雅戈治疗公司 肌萎缩性侧索硬化症(als)的治疗
AU2019268330A1 (en) 2018-05-15 2020-11-26 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of Parkinson's disease
CN110144364B (zh) * 2018-05-30 2023-05-12 宁波大学 辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统及其应用
EP3856762A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
GB202013060D0 (en) * 2020-08-21 2020-10-07 Oxford Genetics Ltd Cell line

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7906691A (en) * 1990-05-23 1991-12-10 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US6548286B1 (en) * 1997-04-14 2003-04-15 Cell Genesys, Inc. Methods for increasing the efficiency of recombinant AAV product
AU7739000A (en) * 1999-10-01 2001-05-10 University Of Florida Temperature-sensitive regulation of viral vector production

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018050624A (ja) * 2012-01-24 2018-04-05 ユニバーシティ オブ ジョージア リサーチ ファンデーション，インコーポレーテッド パラインフルエンザウイルス５型ベースのワクチン
US10752916B2 (en) 2012-01-24 2020-08-25 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Parainfluenza virus 5 based vaccines
US11542527B2 (en) 2012-01-24 2023-01-03 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Parainfluenza virus 5 based vaccines
JP2021509253A (ja) * 2017-10-10 2021-03-25 ナントバイオ，インコーポレイテッド ウイルス生成ペイロードに対して低い毒性を有する改変ｅｃ７細胞
US11485957B2 (en) 2017-10-10 2022-11-01 Nantbio, Inc. Modified EC7 cells having low toxicity to viral production payloads
JP2023519963A (ja) * 2020-03-30 2023-05-15 グレフェックス， インコーポレイテッド アデノウイルスベースの遺伝子導入ベクターの産生の増強

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Publication number Publication date
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