JP4214239B2 - 二機能性レトロウイルス／アデノウイルス系 - Google Patents

Description

発明の背景
関連出願
本願は1996年11月19日出願の仮出願60/031,323及び1997年２月４日出願の仮出願60/037,081に基づくものである。
発明の分野
本願は一般的にはベクターの分子生物学及び遺伝子治療の分野に関するものである。より具体的には、本発明は二機能性アデノウイルス・ベクター系及びその利用法に関するものである。
関連技術の説明
心臓、肺、及び血液の疾患に対する多数の遺伝子治療は関連柔組織細胞の安定した遺伝子修正に基づいている。多くの場合、これはそれによって安定した形質導入が特定の箇所で達成される直接のイン・ビボ遺伝子伝達によってのみ達成することができる。この目的のために、種々のウイルス性ベクターが、安定した遺伝子性形質導入を達成するための手段としてその結合能力を向上させるために開発されている。このタイプのベクターとしては遺伝子組換えレトロウイルス及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）などがあり、標的細胞の安定した遺伝子性修正を達成するためにイクス・ビボ遺伝子伝達方式によって用いられている。
これらのイクス・ビボ例でのレトロウイルス及びＡＡＶベクターの利用性にも拘らず、直接イン・ビボ遺伝子伝達のためにこれらのベクターを用いるにはいくつかの問題がある。これに関連して、有効な力価及びイン・ビボでの安定性という問題が柔組織の直接特定箇所形質導入が必要となる多くの方式のためのこれらのベクターの利用性に限られたものにしている。一方、遺伝子組換えアデノウイルス性ベクターは高力価に調製することが可能で、イン・ビボでの安定性を有しており、両方の要素とも種々の標的細胞に対する直接イン・ビボ遺伝子伝達のためにそれらを用いることを可能にしている。しかしながら、アデノウイルス性ベクターの制約は誘導される異種遺伝子表現が一過性に過ぎないことである。これは、部分的にはアデノウイルス性ベクターによって形質導入された細胞が免疫的に宿主によって根絶されてしまうという事実に基づいている。加えて、親のアデノウイルスがそのゲノムを宿主クロモソームに結合させる能力を有していない。
先行技術は直接のイン・ビボでのベクター投与後の安定した遺伝子による細胞の修正を可能にしてくれるような有効なベクター系を欠いている点で不十分である。本発明はこの技術分野における長年望まれていたニーズと望みに応えるものである。
発明の要約
イン・ビボでの標的細胞の効率的で安定した形質導入を行うことができる系を誘導するために、アデノウイルス性ベクターで、レトロウイルス性結合機能をつくりだすことができる。本発明はレトロウイルス性ベクターの組み込み及びレトロウイルス性ベクター機能がアデノウイルス性ベクター構成物の中で機能することができ、結合性の子孫レトロウイルス性ベクターをうまく誘導することを示すものである。この方式においては、標的細胞はアデノウイルス性ベクターが媒介するレトロウイルス性ベクター配列の伝達とレトロウイルス性組み込み機能のアデノウイルス性ベクター表現との組み合わせによる一過性レトロウイルス性『プロデューサ細胞』として機能するように誘導される。このイン・ビボ状況では、レトロウイルス組み込み及びベクター機能の高効率な伝達は本来の場所でこれを達成するアデノウイルス性ベクターを介して柔組織個所で達成されるであろう。従って、その場所でつくりだされるレトロウイルス性ベクターは隣接細胞には二次的な影響を及ぼすだけで暗転した遺伝子性形質導入を達成することができるであろう。従って、各成分ベクターの好ましい性質をつくりだす『二機能性（chimeric）』ベクター系が開発されたのである。
本発明の目的はレトロウイルス性結合機能を含むアデノウイルス性ベクターを開発して、標的細胞の安定した形質導入のためにイン・ビトロでのその利用を最適化することである。
本発明の他の目的はこれらの二機能性ベクターを用いて心臓、肺、及び血液の疾患に関連した柔組織細胞の安定したイン・ビボでの遺伝子修正を行うことである。
結合能力を有するアデノウイルス性ベクターの開発はこれらのベクターがイン・ビボで導入遺伝子の安定した結合を可能にしてくれるであろう。こうした戦略は、従って、柔組織標的個所での安定した遺伝子表現を可能にする上で好ましい特性をつくりだし、心臓、肺及び血液の病気のための遺伝子治療に応用する上で効果的な遺伝子補正を行う可能性を大幅に改善してくれるであろう。
本発明のひとつの実施の形態においては、レトロウイルス性配列を含む少なくとも１つのアデノウイルス性ベクターで構成される二機能性のアデノウイルス性／レトロウイルス性ベクターが提供される。
本発明のひとつの実施の形態においては、本発明による上記の二機能性のアデノウイルス性／レトロウイルス性ベクターをそうした治療を必要とする個人に投与するステップを含む標的細胞に安定して形質導入する方法が提供される。
本発明の他の、そしてさらなる側面、特徴、及び利点は開示の目的で提供される本発明の現段階で好ましい実施の形態についての以下の説明を参照することで明らかになるであろう。
図面の説明
上に述べた、およびこれから明らかになる本発明の特徴、利点、及び目的を詳細に理解できるように、上に要約して述べた発明について、添付図面に示すそのいくつかの実施の形態を参照して、以下に具体的に説明する。これらの図面は明細書の一部を構成する。なお、添付図面は本発明の好ましい実施の形態を示すものであって、その範囲を限定することは意図していない。
図１は標的器官個所でのレトロウイルス性ベクターの局所的発生の図を示している。レトロウイルス性ベクター及び組み込み機能をコード表現するアデノウイルス性ベクターは標的柔組織細胞に対するイン・ビボでの遺伝子伝達を高効率で達成して、それらを一過性のレトロウイルス性プロデューサ細胞にしてしまう。局所的につくりだされるレトロウイルス性粒子は従って隣接細胞に直接影響を及ぼす場合がある。
図２Ａはレトロウイルス性組み込み機能を含むアデノウイルス性シャトル・プラスミドのマップを示し、図２Ｂはレトロウイルス性ベクター機能を含むアデノウイルス性シャトル・プラスミドのマップを示す。
図３は分子分析を介してのアデノウイルス性ベクターの構造的検証を示す。
図４はイン・ビボでの標的細胞増殖を誘発するためのＨＧＦ及びＫＧＦをコード表現する構成化アデノウイルス性ベクターのマップを示す。
図５は上記アデノウイルス性／レトロウイルス性の二機能性ベクター系を介して達成された持続性のある遺伝子表現を示す。標的細胞はＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ＋ＡｄＣＭＶｍｐｇあるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけで感染されて、安定した遺伝子性形質導入が行われたかどうかについての分析が行われた。Ｗ162細胞におけるＧＦＰ表現はアデノウイルス性ベクターの感染後示されている時点で蛍光顕微鏡で分析された。
図６は、持続性のある遺伝子表現を示している。標的細胞はＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ＋ＡｄＣＭＶｍｐｇあるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけで感染されて、安定した遺伝子性形質導入が行われたかどうかについての分析が行われた。図６Ａは感染後の示された時点でのＷ162細胞におけるＧＦＰ表現のＦＡＳＣ分析を示している。図６Ｂは感染後30日目に取り出されたＷ162細胞から抽出されたゲノム性ＤＮＡの分析を示している。細胞のＨＭＷＤＮＡをＭｕｎＩで消化して、レトロウイルス性ベクター部分でプローブした。レーン１のＤＮＡはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ＋ＡｄＣＭＶｍｐｇで感染した細胞から取り出したもので、レーン２のＤＮＡはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけで感染された細胞から抽出されたものであり、そしてレーン３はＭｕｎＩで消化したＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰゲノム性ＤＮＡを含む比較例である。
図７はアデノウイルス／レトロウイルス二機能性ベクターを介しての形質導入レトロウイルス粒子の誘導を示している。図に示されている細胞はＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけか、あるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ＋ＡｄＣＭＶｍｐｇで処理され、上澄液をＮＩＨ−３Ｔ３細胞上に滴下してレトロウイルス性ベクターについて調べた。上澄液を処理した細胞は蛍光顕微鏡で20日目に分析した。
図８はアデノウイルス／レトロウイルス二機能性ベクターを介してのイン・ビボでの遺伝子伝達を示している。ＳＫＯＶ3_ipl細胞を腹膜内に移植した。図８Ａはヘマトサイクリンで染色した腹膜内腫瘍塊である。供試動物は図８Ｂに示すようにＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけか、あるいは（図８Ｃに示すように）ＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰとＡｄＣＭＶｍｐｇで刺激を与えて、16日目にＧＦＰが表現されているかどうかを蛍光顕微鏡で分析した。
図９はアデノウイルス／レトロウイルス二機能性ベクターを介してのイン・ビボ遺伝子伝達を示している。ＳＫＯＶ3_ipl細胞をＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ（図９Ｂ）又はＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ＋ＡｄＣＭＶｍｐｇ（図９Ｃ）で感染させて、バージン腫瘍細胞と混合し、ヌード・マウスの皮下に移植した。20日目に、腫瘍を取り出して、蛍光顕微鏡で分析した。（図９Ａ）ヘマトサイクリンで染色された部分を２つのウイルス皮下塊から取り出した。ＳＫＯＶ3_iplを腹膜内に移植して、動物にＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけか（図９Ｅ）、あるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ＋ＡｄＣＭＶｍｐｇ（図９Ｆ）で刺激を与えた。16日目にＧＦＰの表現があるかどうかを蛍光顕微鏡で分析した。（図９Ｄ）ヘマトサイクリンで染色した腹膜内腫瘍塊。
発明の詳細な説明
本発明は血管投与後に効率的にイン・ビボ遺伝子伝達を行うと同時に異種遺伝子配列を結合して、形質導入後の安定した細胞の遺伝子的修正を行う能力を有するベクター系に関するものである。本発明の二機能性ベクターにおいては、細胞内にレトロウイルス性粒子を局所的に、本来の場所でつくりだす目的で、レトロウイルス性機能を伝達するためにアデノウイルス性ベクターが用いられる。これはレトロウイルス性『組み込み』機能（レトロウイルス性遺伝子ｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖ）かレトロウイルス性『ベクター』機能（『治療用』遺伝子を側鎖しているレトロウイルス性ＬＴＲ配列）のいずれかを含んでいる複製不全アデノウイルス性・ベクターの構成によって達成される。これらのアデノウイルス性ベクターは血管を通じてのベクター投与後に効率的なイン・ビボ形質導入を達成することが知られているアデノウイルス性ベクターの能力に基づいて非常に効率的に細胞に対して遺伝子生成物を共伝達することができる。
これらのアデノウイルス性ベクターによって形質導入された肝臓細胞などの細胞は、その後、一過性のレトロウイルス性ベクター『プロデューサ細胞』にされる。これらの細胞はレトロウイルス性ベクターの機能を一過性的に表現する。従って、これらの細胞は治療用遺伝子を含んだレトロウイルス性粒子をつくりだすことができる。レトロウイルス性粒子の『局所的』で本来の場所での産出のおかげで、このつくりだされたレトロウイルス性粒子によって、隣接細胞の効率的な形質導入が達成される。従ってこうした方法は『遠位』血管投与に伴って起きるレトロウイルス性ベクターの損失を克服することができる。加えて、形質導入された『隣接』細胞はレトロウイルス性ベクターが形質導入を行うという事実のせいで、安定して修正される。この方法は、従って結合による形質導入イベントを可能にすることによってアデノウイルス性ベクターの重要な限界性を克服するものでもある。
この二機能性ウイルス・ベクター系の１つのユニークな特性は、有効な、本来の場所でのレトロウイルス性形質導入を達成するためのアデノウイルス性ベクター伝達要素をつくりだす点である。こうした考え方は『局所的に』つくりだされたレトロウイルス性ベクターに対して細胞をさらに敏感にしてしまう可能性のある他の遺伝子の伝達にも拡張して適用することができる。
本発明は、レトロウイルス性配列を含む少なくとも１つのアデノウイルス性ベクターで構成される二機能性アデノウイルス性／レトロウイルス性ベクターに関するものである。好ましくは、この二機能性アデノウイルス性／レトロウイルス性ベクターは、（ａ）レトロウイルス性ベクター機能を含む複製不全アデノウイルス性ベクターと、そして（ｂ）少なくとも１つのレトロウイルス性組み込み機能を含む複製不全アデノウイルス性ベクターとを含んでいる。好ましくは、このレトロウイルス性ベクター機能は異種遺伝子を含んでおり、そうした遺伝子がレトロウイルスの長い末端反復によって側鎖されている。一般的に、このレトロウイルス性組み込み機能はｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖ、あるいはそれらの組み合わせで構成されるグループから選択される。当業者であれば、ひとつの細胞により具体的に狙いをつけるために別のｅｎｖ遺伝子を用いることができることは容易に分かるであろう。例えば、以下に詳細に述べるような小水泡性口内炎ウイルスＧ−糖蛋白は利用が可能なｅｎｖ遺伝子である。好ましくは、異種遺伝子は治療用蛋白質をコード表現する遺伝子、選択可能なマーカー、そしてレポータ遺伝子で構成されるグループから選択される。当業者であれば、そうした蛋白質を置換したり、あるいは特定の生化学活性を増強したり抑制するために、例えば治療用蛋白質などの蛋白質をコード表現するいろいろな遺伝子を用いることができよう。
本発明はまた、そうした治療を必要とする個人に対して本発明による二機能性アデノウイルス性／レトロウイルス性ベクターを投与するステップを含む標的細胞を安定して形質導入する方法にも関連している。好ましくは、この二機能性アデノウイルス性／レトロウイルス性ベクターは、（ａ）レトロウイルス性ベクター機能を含む複製不全アデノウイルス性ベクターと、そして（ｂ）少なくとも１つのレトロウイルス性組み込み機能を含む複製不全アデノウイルス性ベクターとを含んでいる。好ましくは、レトロウイルス性ベクター機能は異種遺伝子を含んでおり、そうした遺伝子はレトロウイルス性の長い末端反復によって側鎖されている。一般的に、レトロウイルス性組み込み機能はｇａｐ，ｐｏｌ及びｅｎｖあるいはそれらの組み合わせで構成されるグループから選択される。当業者であれば、ひとつの細胞により具体的に狙いをつけるために別のｅｎｖ遺伝子を用いることができることは容易に分かるであろう。例えば、以下に詳細に述べるような小水泡性口内炎ウイルスＧ−糖蛋白は利用が可能なｅｎｖ遺伝子である。好ましくは、異種遺伝子は治療用蛋白質をコード表現する遺伝子、選択可能なマーカー、そしてレポータ遺伝子で構成されるグループから選択される。当業者であれば、そうした蛋白質を置換したり、あるいは特定の生化学活性を増強したり抑制するために、例えば治療用蛋白質などの蛋白質をコード表現するいろいろな遺伝子を用いることができよう。以下に述べるような方法を用いて、レトロウイルス性ベクター機能を含む複製不全アデノウイルス性ベクターを投与することができ、そうしたレトロウイルス性組み込み機能を含む複製不全アデノウイルス性ベクターは宿主細胞内に形質導入されて、その内部でそうしたアデノウイルス・シャトル・ベクターによってコード表現された遺伝子の表現は上に述べた治療用遺伝子を含むレトロウイルス性粒子の産出をもたらし、さらにそのレトロウイルス性粒子は隣接細胞に感染し、その内部でレトロウイルス性粒子は上記宿主細胞のゲノム性ＤＮＡ内にその治療遺伝子を結合させる。
当業者であれば種々の操作によって本発明による二機能性アデノウイルス性／レトロウイルス性ベクターを標的により特殊的に向かわせることができることは分かるであろう。例えば、細胞表面受容体を個別的に認識するリガンドを組み込むことによって、アデノウイルス性ベクターの繊維あるいはノブ成分を遺伝子的に修正することができる。また、この技術分野で知られているＦａｂフラグメントの単鎖抗体を用いて免疫的にアデノウイルスを標的に向かわせることも可能であろう。
以下の実施例は本発明の種々の実施の形態を示すために提供されるものであって、いかなる意味でも本発明を限定することは意図していない。
実施例１
標的細胞の安定した形質導入のための、レトロウイルス性結合機能を含んだアデノウイルス性ベクターの利用
効率的なイン・ビボ遺伝子伝達の結果としての長期にわたる異種遺伝子表現を達成するために、レトロウイルスの結合特性をアデノウイルス性ベクター系に結合することができる。これは、複製不全アデノウイルス性ベクターを用いて細胞にその場所でレトロウイルスの組み込み機能としてレトロウイルス性ベクター配列の両方を伝達することによって行うことができる。そうすると、共形質導入された細胞はレトロウイルス性プロデューサ細胞として機能する。こうした方式においては、局所的につくりだされるレトロウイルス性粒子がそれを取り囲んでいる柔組織内の『隣接細胞』を安定して形質導入し、従って、遺伝子治療のために関連標的器官の導入遺伝子配列の効率的な統合を達成する。アデノウイルス性ベクターが標的遺伝子の効率的な形質導入のための適切なレトロウイルス性機能を伝達してレトロウイルス性プロデューサ細胞として機能する能力が示されている。
実施例２
プラスミド・ベクター及び細胞
アデノウイルス／レトロウイルス・キメラをつくりだすために、レトロウイルスのゲノム成分の個々の要素を最初にｐＣＡＡｍｐｇ及びｐΔＥ１ＬＮＣＸと命名されている２つの別のアデノウイルス性シャトル・ベクターに組み込んだ。シャトル・ベクターはレポータ遺伝子も含むようにつくられ、ｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＧＦＰとなったが、これは緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡとエスケリチア・コリβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）をコード表現するｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬａｃＺをコード表現する。
ｐＣＡＡｍｇｐの場合，レトロウイルス性ｇａｇ／ｐｏｌと両性ｅｎｖ遺伝子をコード表現するＤＮＡフラグメントをｐＰＡＭ３（Dusty A. Miller博士、Fred Hutchinson Cancer ResearchCenter, Seattle, WA提供）から、以下のような二段階手順で単離した。つまり、ｇａｇ/ｐｏｌ転写開始箇所を含む133bp ＰＣＲフラグメントを、ＨindIIIサイトを含む上流プライマ、５’−ｇｇｇａａｇｃｔｔａｔｇｇｇｃｃａｇａｃｔｇｔｔａｃｃａｃ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）と、内部ＰｓｔＩサイトにまたがる下流プライマー，５’−ｃａａｇｇｃｔｔｃｃｃａｇｇｔｃａｃｇａｔｇｔａｇｇ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）を用いてｐＰＡＭ３から増幅した。このフラグメントをＨindIIIとＰstＩとを用いて消化してからクローニングを行った。残りの7.0kbのｇａｇ/ｐｏｌ/ｅｎｖセグメントはＰstＩ−ＨpaＩ消化によってｐＰＡＭ３から得た。これら２つのレトロウイルス性フラグメントをＨindIII−ＥcoＲＶサイトでアデノウイルス性シャトル・ベクターｐＣＡ13（Microbix Biosystems Inc., Ontario, Canada）に三重結紮させて、ｐｃＡＡｍｐｇベクター（13.9kb）を得た。
レトロウイルス性統合配列、ネオマイシン抵抗性ｃＤＮＡ、ＣＭＶプロモータ、及び多重クローニング・サイトを含んだアデノウイルス性シャトル・ベクターを構成するために、レトロウイルス性ベクターｐＬＮＣＸ（A. Dusty Miller博士提供）をＥcoＲＩとＨindIIIサイトで部分的に消化して、3.6kbフラグメントを得た。このフラグメントをその後、pＺｅro−１^TM（Invitrogen, La Jolla, CA, USA）の修正版にサブクローンしたところ、ＥcoＲＶサイトとＮotＩサイトの間に沈黙突然変異によってＣlaＩサイトが導入された。得られた構成物はpＥＨ3.6と標識された。残りのレトロウイルス性ベクター配列はＡpaＩ及びＨindIII消化で得、得られたフラグメントをＨindIII及びＥcoＲＶサイトでサブクローンしてpＨＡ0.9を得た。pＥＨ3.6からのこの3.6kbのＣlaＩ−ＨindIIIフラグメントとpＨＡ0.9からの1.0kbのＨindIII−ＸhoＩフラグメントをＣlaＩ及びＸhoＩサイトでｐΔＥｌＳＰｌＡ（Microbix, Biosystems Ic.）に三重結紮してｐΔＥ１ＬＮＣＸをつくった。0.9kbのＧＦＰ ｃＤＮＡセグメントをＨindIII−ＨpaＩ消化でｐＥＧＦＰ−ＮＩ（Clontech Inc., Palo Alto, CA, USA）から切り出して、ＨindIII及びＨpaＩサイトでｐΔＥ１ＬＮＣＸにサブクローンした。ｐΔＥ１ＬＮＣＸからｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬａｃＺを構成するために同様の方式を用いた。制限酵素分析によってシャトル・ベクター、ｐＣＡＡｍｐｇ，ｐΔＥ１ＬＮＣＸ，ｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＧＦＰ，ｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬａｃＺが確認され、ＵＳＢ70770配列キット（Amersham, Cleveland, Ohio, USA）を用いて部分的に配列決定を行った。
ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽腫、293細胞、ＥＪ膀胱癌細胞（ＡＴＣＣ，Rockville, Maryland）、Ｗ162（Gary Ketner, Princeton University）及びＳＫＯＶ3_ipl細胞（Janct Price博士、M. D. Anderson Cancer Center, Houston, TX）を、10％仔ウシ血清（ＦＢＳ、Hyclone;Logan, UT）、２mMグルタミン（Mediatech）、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Cellgro Mediatech）で補強したダルベッコの修正イーグルMedium/Ham’s Ｆ12（ＤＭＥＭ/Ｆ12、Mediatech, Inc.;Washington, D. c）で構成された完全培養液内に保持した。すべての細胞は５％ＣＯ₂下で37℃の温度で保持された。
実施例３
遺伝子組換えアデノウイルス性ベクターの生成
イン・ビトロ同種遺伝子組換え法によってＥ１Ａ／Ｂ及びＥ３消去複製不全遺伝子組換えアデノウイルス性ベクターを生成させた。これらの研究で、ｐＣＡＡｍｐｇ，ｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬａｃＺあるいはｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＧＦＰシャトル・プラスミドをｐＢＧＨ11（Microbix Biosystems Inc.）と共に293細胞内に共感染させてそれぞれＡｄＣＭＶＡｍｐｇ，ＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺあるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰをつくりだした。各アデノウイルスをプラーク精製を三回通過させて、その後、ＰＣＲ分析及び制限酵素マッピングで確認した。遺伝子組換えアデノウイルスを許容293細胞株上で増殖させて、ＣｓＣｌ勾配遠心分離で二度精製して、標準的な方法でプラーク滴定した。
実施例４
レトロウイルス性粒子の生成と検出
細胞を10％ＦＢＳを含む完全培養液内で100−mm組織培養プレートに置いて（１０ ⁶ 細胞／プレート）、５％ＣＯ₂下で37℃の温度で一昼夜培養した。プラスミド構成物を最初にテストするために、293細胞をｐΔＥ１ＬＮＣＭＣＬａｃＺ＋ｐＣＡＡｍｇｐか、あるいはｐＬＮＣＸ及びｐＰＡＭ３のいずれかを用いて燐酸カルシウム沈殿によってトランスフェクトさせた。翌日、細胞に新鮮な完全培養液を与えた。トランスフェクションから48時間後に、上澄液を取り出して、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞上でレトロウイルスの力価を判定するために用いた。アデノウイルス感染を行うために、培養液を抜き取って、ＤＭＥＭ/Ｆ12＋ＡｄＣＭＶＡｍｇｐとＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ、あるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけを含んだ２％ＦＢＳで、各グループあたり50プラーク形成単位（pfu）／細胞の割合で置換した。３時間培養した後、培養液を抜き取って、細胞をＰＢＳで数回洗浄してから、完全培養液を与えた。感染48時間後に上澄液を滴下することによって直接的に、あるいはレトロウイルス感染に関して隣接細胞を観察することで間接的に判定した。安定した統合を行わせるための長期培養は８日間の間隔をおいて行われた。レトロウイルスの滴定はＮＩＨ−３Ｔ３細胞上で行われた。この分析のために、レトロウイルスプロデューサ細胞からの培養上澄液を取り出して、ろ過し（0.45μm）、受容細胞に１：１の割合で完全培養液＋10mg/mlポリブレンに加えた。48時間後、ＬacＺを表現している細胞をＸ−gal組織化学で視覚化し、総青色細胞／皿の定量で力価を判定した。力価は、感染性ヴリオン／ｍｌとして表した。
実施例５
ＬacＺ，ＧＦＰ及び複製可能レトロウイルス（ＲＣＲ）アッセイ
ＬacＺの細胞表現についてＸ−gal（５−ブロモ−４−コロル−３−インドリリル−β−Ｄ−ガラクトシド）で染色して定量分析を行った。細胞を0.25％グルタルアルデヒド／0.1Ｍリン酸ナトリウムで15分間室温で固定してから、ＰＢＳで洗浄して、Ｘ−gal染色溶液（0.2％Ｘ−gal/２mM ＭgＣl₂/４mM Ｋ₄Ｆe（ＣＮ）₆/４mM Ｋ₄Ｆe（ＣＮ）₆３Ｈ₂ＯをＰＢＳに溶解したもの）で室温で一昼夜培養した。Ｘ−gal陽性（青色）の細胞を光学顕微鏡で数えた。細胞のＧＦＰ表現ＦＡＣＳ分析及びメーカー（Clontech, CA, USA）の指示する手順で蛍光顕微鏡を用いて視覚化することで定量的に分析した。
フェリンＳ⁺Ｌ^-（ＰＧ-４）細胞をＭｃＣｏｙの５Ａ培養液（BioWhattaker, Walkersville, MD）＋15％ＦＢＳ内に蒔種し、60mm培養皿で約24時間培養してから接種した。５つの複製皿にサンプル希釈液を0.2mlずつ入れ、ポジティブ・コントロールとして両性ネズミ・レトロウィルス4070Ａを１及び10核形成単位として用い、そして培養液はネガティブ・コントロールとして機能した。36±２℃で２時間吸収させ、新鮮な培養液を加えた後、必要に応じて４−５日培養すると、形質変換された細胞の核がポジティブ・コントロールの皿には十分に形成された。これらの皿を顕微鏡で調べて、核を数えた。ネガティブ・コントロールに核が観察されず、ポジティブ・コントロール希釈液がポジティブ・コントロール・ウイルス・ロットの有効平均力価の１ログ以内で平均力価を持っている場合に、アッセイは有効と考えられた。
実施例６
イン・ビボ実験及びプロウイルス統合
雌のヌード・マウス（生後４−６週間）に１×10⁷ＳＫＯＶ3_ipl細胞の割合で腹膜接種した。５日後、供試動物にＡｄＣＭＶＡｍｐｇ＋ＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰか、あるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけを腹膜内接種した（各ウイルスあたりネズミ一匹につき１×10⁹）。動物はアデノウイルス接種から16日目に致死させた。腫瘍結節を取り出して、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ内で固定して、分解し、蛍光顕微鏡で分析した。皮下での混合を調べるために、ＳＫＯＶ3_ipl細胞を細胞１個あたり50pfuの割合でイクス・ビボで感染させた。感染から16時間後に、細胞をＰＢＳで二度洗浄してから、トリプシン化し、取り出して、数え、そして感染していないＳＫＯＶ3_ipl細胞と１：４の割合で混合した。全部で５×10⁶の混合細胞がヌード・マウスのわき腹に皮下接種された。動物は接種後20日目に致死された。腫瘍結節を取り出して蛍光顕微鏡で分析した。
プロウイルス統合を検出するために、アデノウイルスで処理した細胞から高分子量画分ＤＮＡを取り出した。このＤＮＡをＭunＩで消化して、0.8％アガロース・ゲルに溶解し、4.8kbから6.2kbのＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰのＰＣＲ増幅によって得たレトロウィルス性ベクター配列を含む³²Ｐでラベルした1.4kbフラグメントでプローブした。メーカー（Amersham）の決めた手順に従って、ＤＮＡラベリング、薄膜透過、交雑、そして洗浄手順を行った。
実施例７
隣接細胞を安定して形質導入するための柔組織標的部位でのレトロウィルス粒子の作成
本発明は遺伝子組換えアデノウイルス性ベクターの高効率イン・ビボ遺伝子伝達とレトロウィルスから誘導される結合能力とを合わせ持った『複合』ベクター系を開発した。これはアデノウイルス性ベクターに感染された標的細胞をアデノウイルス性ベクターに媒介されたレトロウィルスの組み込み機能とレトロウィルス・ベクター配列の伝達を介して一過性の『レトロウィルス・プロデューサ細胞』内に送り込むことによって達成される。こうした方法で、局所的につくりだされたレトロウィルス性ベクターは結合性ベクターを介して隣接柔組織細胞に感染することができる。こうした方式の概念的基礎を図１に示す。
こうした方式を実施するための最初のステップとして、レトロウィルス性ベクター配列とレトロウィルス性組み込み機能をコード表現するアデノウイルス性ベクターを誘導した。これらのアデノウイルス性ベクターの誘導は、その導入遺伝子を含んだアデノウイルス『シャトル』ベクターをアデノウイルス性組み込みプラスミドｐＪＭ17と共感染させる方法に基づいている。これらのプラスミド内部の同種領域の遺伝子組換えによって複製不全、ＥＩＡ／Ｂ消去、アデノウイルス性ベクターがもたらされる。アデノウイルス・シャトル・プラスミドはアデノウイルス性ベクターの組み込み特性を有している無傷の表現カセットを含んでいるので、それらはアプリオリな導入遺伝子配列の機能的有用性検証を行うための手段を提供してくれる。こうした考え方に基づいて、適切なレトロウィルス性導入遺伝子配列を含んだ一連のアデノウイルス性シャトル・ベクターが誘導された。このようにして、アデノウイルス性シャトル・ベクターｐＣＡ13（図２）のポリリンカーにクローンされたレトロウィルス性機能ｇａｇ/ｐｏｌ/ｅｎｖ，ｇａｇ/ｐｏｌあるいはｅｎｖを有する一連のプラスミドが誘導された。
これらのベクターは従ってＣＭＶ中間／初期エンハンサー−プロモータを介してレトロウィルス性組み込み機能の表現を可能にしてくれるであろう。加えて、レトロウィルス性ベクター配列をコード表現するアデノウイルス性シャトル・プラスミドが誘導された。この例では、その表現されたアデノウイルス性ベクターはコード表現された導入遺伝子配列の高効率伝達媒体としての機能を果たすであろう。これらのレトロウィルス性ベクター配列はその場合レトロウィルス性粒子内に組み込まれ、そのプロセスには標的細胞内でのベクター表現は必要とされないであろう。従って、これらの例においては、ネオマイシン選択可能マーカーと組み合わされたＥ．coli β−ガラクトシダーゼ（ＬacＺ）か、あるいはこれもネオマイシン選択可能なマーカーと組み合わされたレポータ遺伝子緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のいずれかをコード表現するレトロウィルス性ベクター配列が『プロモータを持たない』アデノウイルス性シャトル・ベクター（図２）のポリリンカーにクローンされた。
これらのレトロウィルス性ベクター遺伝子構成物は完全なレトロウィルス性長末端側面（ＬＴＲ）で側鎖されたマーカー／レポータ配列を含んでいる。これが達成されたのは、これらの機能がレトロウィルス性ベクターの統合にin cisで必要となる最低限の配列だからである。これらのプラスミドはすべて構成後に制限エンドヌクレアーゼ消化による間接的分析と、ジデオキシ鎖末端配列決定による直接的分析の両方で確認された。
アデノウイルス性シャトル・プラスミドでのレトロウィルス性組み込み機能が発揮されることを確認するために、機能分析が行われた。この調査のために、レトロウィルス性組み込み機能を含むアデノウィルス性シャトル・プラスミド（ｐＣＡＡｍｐｇ）の利用可能性を、マロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）ＬＴＲの制御下でエコトロピックはレトロウィルス遺伝子ｇａｇ/ｐｏｌ/ｅｎｖを含む標準組み込みプラスミド、ｐＰＡＭ３と比較した。これらのプラスミドをそれによってＬacＺレポータ遺伝子がレトロウィルス性ＬＴＲによって側鎖されるレトロウィルス性ベクター・カセットを含むコントロールのレトロウィルス性ベクター・プラスミドｐＬＮＣＬＺからレトロウィルス性ベクター配列を取り出す能力があるかどうかについての分析を行った。これらのプラスミドの293細胞への共感染後、上澄液を取り出して標準的な方法でネズミ線維芽腫細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３を感染するために用いた。これらの細胞は、その後、Ｘ−gal免疫化学的方法でＬacＺ生成物に対する染色を行ってから、感染後48時間で視覚化された。
レトロウィルス性組み込み機能を含んでいるアデノウイルス性シャトル・プラスミドの機能性検証を行ったところ、293細胞がＣaＰＯ₄によってそのプラスミドで形質導入されたことが示され、上澄液を用いて標的ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を感染し、ＬacＺ遺伝子の生成物を調べるために48時間後にＸ−gal染色を行った。トランスフェクションはａ）ｐＰＡＭ３及びｐＬＮＣＬＺ，ｂ）ｐＰＡＭ３，ｃ）ｐＬＮＣＬＺ、及びｄ）ｐＣＡＡｍｐｇ及びｐＬＮＣＬＺで行われた。ｐＰＡＭ３及びｐＬＮＣＬＺによるトランスフェクションの結果はポジティブであった。ｐＰＡＭ３及びｐＬＮＣＬＺによるトランスフェクションの結果はネガティブであった。ｐＣＡＡｍｐｇ及びｐＬＮＣＬＺによるトランスフェクションの結果はネガティブであった。
コントロールのｐＰＡＭ３及びｐＬＮＣＲＺの共トランスフェクションはＬacＺポジティブＮＩＨ−３Ｔ３細胞の存在で示されるように、レトロウィルス性形質導入性粒子をつくりだした。対照的に、これらのプラスミドのどちらか一方だけでトランスフェクションを行った場合には形質導入性レトロウィルス性粒子はつくりだされなかった。次に、レトロウィルス性組み込み機能をコード表現するアデノウイルス性シャトル・ベクターとレトロウィルス性ベクター・プラスミドｐＬＮＣＬＺによる共トランスフェクションを行った。コントロール・プラスミド（ｐＰＡＭ３及びｐＬＮＣＬＺ）の両方を用いた共トランスフェクションに関しては、この分析でＬacＺレトロウィルス性粒子が誘導された。従って、レトロウィルス性組み込み機能をアデノウイルス性シャトル・プラスミドの存在下でのレトロウィルス性粒子誘導のためにつくりだすことができる。
レトロウィルス性ベクター配列をアデノウイルス性シャトル・ベクターから取り出すことができるかどうかについての研究が行われた。この分析のために、レトロウィルス性粒子が誘導され、形質導入性粒子を上に述べた方法で分析した。この分析のために用いられた組み込みプラスミドはｐＰＡＭ３である。これは、レトロウィルス性ＬＴＲで側鎖されたＬacＺ遺伝子を含む通常のレトロウィルス性ベクター・プラスミド、ｐＬＮＣＬＺか、あるいは同じＬＴＲ−neo−ＣＭＶ−ＬacＺ−ＬＴＲセグメント（ｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬacＺ）を含むアデノウイルス性シャトル・プラスミドのいずれかからレトロウィルス性粒子を取り出すために用いられた。上にも述べたように、ｐＰＡＭ３とｐＬＮＣＬＺによる293の共トランスフェクションはＮＩＨ−３Ｔ３インジケータ細胞のＸ−gal細胞によって示されるように、ＬacＺ形質導入性レトロウィルス性粒子を発生させた。さらに、いずれのプラスミドも単独ではこの能力を示さなかった。重要なことは、レトロウィルス性ベクター配列を含んだアデノウイルス性シャトル・プラスミド、ｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬacＺとコントロールのレトロウィルス性組み込みプラスミド，ｐＰＡＭ３による共トランスフェクションがＬacＺ形質導入性レトロウィルス性粒子を発生させることが実証できたことである。
レトロウィルス性ベクター機能を含んだアデノウイルス性シャトル・プラスミドの機能検証が行われた。この分析の目的のために、293細胞をＣaＰＯ₄によって示されたプラスミドでトランスフェクトし、上澄液を用いて標的のＮＩＨ−３Ｔ３細胞を感染して、48時間後にＬacＺ遺伝子の存在を確認するためにＸ−gal染色を行った。トランスフェクションはａ）ｐＰＡＭ３及びｐＬＮＣＬＺ，ｂ）ｐＰＡＭ３，ｃ）ｐＬＮＣＬＺ及びｄ）ｐＰＡＭ３及びｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬacＺのいずれかで行った。ｐＰＡＭ３とｐＬＮＮＣＬＺによるトランスフェクションの結果はポジティブであり、ｐＰＡＭ３によるトランスフェクションの結果はネガティブであり、ｐＬＮＣＬＺによるトランスフェクションの結果はネガティブであり、そしてｐＰＡＭ３及びｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬacＺによるトランスフェクションの結果はポジティブであった。従って、形質導入性粒子の誘導のためにレトロウィルス性ベクターをレトロウィルス性シャトル・プラスミドから誘導することができる。
これらの研究はそれぞれ個別的に、レトロウィルス性組み込み及びベクター機能がアデノウイルス性シャトル・プラスミドの存在下で発揮されてイン・ビボのレトロウィルス性粒子の発生を可能にしてくれる。これらの機能が、両方ともアデノウイルス性シャトル・プラスミドの存在下で存在している場合に、これらの機能がレトロウィルス粒子を生み出す機能も発揮することは実証できたことは重要である。この分析のために、アデノウイルス性シャトル・ベクター・プラスミド、ｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬacＺの存在下でレトロウィルス性ベクター機能を取り出すレトロウィルス性組み込み機能の能力を評価した。ｐＰＡＭ３及びｐＬＮＣＬＺによるコントロール（比較）実験はこのアッセイで粒子を誘導する能力を実証した。さらに、ｐＣＡＡｍｐｇとｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬacＺによる比較のためのトランスフェクションも独立で粒子を生み出すことはできなかった。しかしながら、これら２つのプラスミドの共トランスフェクションはポジティブ・コントロール研究で示されたように、ＬacＺ形質導入性レトロウィルス性粒子をつくりだした。
レトロウィルス性ベクター機能を含んだアデノウイルス性シャトル・プラスミドの機能的検証を行った。トランスフェクション及び上澄液アッセイは上に述べた通りである。トランスフェクションは、ａ）ｐＰＡＭ３とｐＬＮＣＬＺ，ｂ）ｐＣＡＡｍｐｇ，ｃ）ｐΔＥ１ＰＬＣＭＶＬacＺ及びｄ）ｐＣＡＡｍｐｇ及びｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬacＺによって行われた。ｐＰＡＭ３とｐＬＮＣＬＺによるトランスフェクションの結果はポジティブであり、ｐΔＥ１ＰＬＣＭＶＬacＺによるトランスフェクションの結果はネガティブであり、そしてｐＣＡＡｍｐｇとｐΔＥ１ＰＬＣＭＶＬacＺによるトランスフェクションの結果はネガティブであった。従って、この実験は必要最小限のレトロウィルス性機能を含んだアデノウイルス性シャトル・プラスミドからアデノウイルス性粒子が発生されることを確認した。この知見は従って、これをベースとして構成されるアデノウイルス性ベクターを誘導できる根拠を実証している。
こうした結果に基づいて、組み込み機能あるいはレトロウィルス性ベクター機能をコード表現するアデノウイルス性ベクターが構成された。これらのベクターは、上に述べたようなアデノウイルス性組み込みプラスミドｐＪＭ17で示されたシャトル・プラスミドを共トランスフェクションすることを介して通常の方法で発生された。取り出されたプラークを拡大して、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）でその同一性を確認した後、３つのシリアル・パッセージでプラーク精製を行った。拡大後、ベクターの同一性をアデノウイルス性ゲノムのＥ１Ａ領域の異種ＤＮＡセグメントの制限酵素による消化及びＰＣＲ分析で確認した。この確認の一例を図４に示す。これらのベクターはすべてＥ１Ａ/Ｂ消去、複製不能アデノウイルス性ベクターであった。これらのベクターがレトロウィルス性組み込み及びベクター機能に関して利用できるかどうかを調べるために対応するシャトル・プラスミドに対して行ったのと同様にイン・ビトロで特徴付けを行った。アデノウイルス性ベクターの存在下でのこれらレトロウィルス性ベクターの機能的利用性の実証はイン・ビボ研究の実行を可能にしてくれる。
こうした考え方に基づき、本発明は増殖を誘発させるために関連する標的柔組織に成長因子を提供するためにアデノウイルス性ベクターが用いられる戦略を開示する。こうした方法はレトロウィルス性ベクター及び／又は組み込み機能のアデノウイルス媒介遺伝子伝達を介してのレトロウィルス性ベクターのその場所での発生と組み合わせて用いることができる。この方法では、アデノウイルスは適切な成長因子遺伝子の標的柔組織に対しての高効率のイン・ビボ遺伝子伝達を達成する。関連のあるサイトでの高効率伝達は成長因子の高い局所的濃縮を可能にしてくれ、標的細胞の増殖をさらに誘発してくれる。
アデノウイルス／レトロウィルス二機能性ベクターを構成して、その機能について検証した。レトロウィルス性ベクター配列、ＡｄＬＮＣＭＶＬacＺを含む遺伝子組換えアデノウイルスを構成して、機能的な検証を行った。アデノウイルス性ゲノムからレトロウィルス性ベクター配列を取り出せたかどうかを判定するためにレトロウィルス性組み込み機能を有する非293細胞の高度の、そして一過性のトランスフェクションを達成するための方針が考えられた。この必要性のために、アデノウイルス−ポリリシン・ベクタ（ＡｄｐＬ）を用いた。この研究のために、ＨeＬa細胞をプラスミドｐＰＡＭ３を含むＡｄｐＬ複合体でトランスフェクトしたところ、レトロウィルス性組み込み機能の表現がもたらされ、その後、ＡｄＬＮＣＣＭＬacＺで感染された。比較のための実験は、ＡｄｐＬを介してのｐＰＡＭ３とＰＬＮＣＬＺでのＨeＬaの共トランスフェクションはレトロウィルス性粒子の産出をもたらした。対照的に、プラスミドＰＬＣＣＬＺのＡｄｐＬ−トランスフェクションは何の結果ももたらさなかった。ｐＰＡＭ３によるＡｄｐＬトランスフェクションの後にＡｄＬＮＣＭＶＬacＺでの感染を行ったところ、ＬacＺ形質導入性レトロウィルス性粒子を得ることができた。ＨeＬa細胞をＡｄｐＬ/ｐＰＡＭ３で前処理しない場合は、そうしたレトロウィルス性粒子を得ることができなかったことは注目に値する。従って、標的細胞へのプロデユーサ細胞からのＬacＺコード表現アデノウイルスの『キャリー・オーバー』（譲り渡し）はこの結果を説明することにはならない。従って、レトロウィルス性ベクター配列をアデノウイルス性ベクターから取り出して、形質導入性レトロウィルス性粒子をうまく誘導することができる。
ＡｄＬＮＣＭＶＬacＺの機能的検証を行った。この分析を行うために、ＨeＬa細胞をＡｄｐＬ法でレトロウィルス性組み込み及び／又はベクター・プラスミドでトランスフェクトした。いくつかの例で、細胞はＡｄＬＮＣＭＶＬacＺで感染させた。その後、上澄液を取り出して、前に述べたのと同様に、ＬacＺ形質導入性レトロウィルス性粒子の存在に関する分析を行った。形質導入／感染条件は、ａ）ｐＰＡＭ３及びＰＬＮＣＬＺでの’ＡｄｐＬトランスフェクション、ｂ）ＰＬＮＣＮＺでのＡｄｐＬトランスフェクション、ｃ）ｐＰＡＭ３でＡｄｐＬ感染に続いてのＡｄＬＮＣＭＶＬacＺによる感染、ｄ）ＡｄＬＮＣＭＶＬacＺだけでのＡｄ感染であった。ｐＰＡＭ３及びＰＬＮＣＬＺでのＡｄｐＬトランスフェクションによる形質導入／感染の結果はポジティブであり、ＰＬＮＣＬＺでのＡｄｐＬトランスフェクションの結果はネガティブであり、ｐＰＡＭ３でＡｄｐＬトランスフェクションを行い続いてＡｄＬＮＣＭＶＬacＺによる感染を行った結果はポジティブ、そしてＡｄＬＮＣＭＶＬacＺのみによるＡｄ感染の結果はネガティブであった。これらの研究に用いられたすべてのベクターはＥ１ Ａ/Ｂ消去、複製不能アデノウイルス性ベクターであった。
実施例８
アデノウイルス性ベクターで媒介された伝達で誘発されたレトロウィルス性プロデューサ細胞内での遺伝子表現のパターン
この戦略の基礎は、アデノウイルス性ベクター粒子からのレトロウィルス性ベクター配列の取り出しを可能にするための標的細胞内でのレトロウィルス性組み込み機能の効率的な表現である。レトロウィルス性組み込み機能ｇａｇ/ｐｏｌ/ｅｎｖの遺伝子表現のパターンを種々の『従来の』組み込みシステムで評価して、これらの機能をコード表現するアデノウイルス性ベクターＡｄＣＭＶＡｍｐｇによって達成されたパターンとの比較を行った。この点で、組み込み細胞株ＧＰ＋Ａｍ12は安定して形質導入され、両性レトロウィルス性機能を表現し、レトロウィルス性ベクター組み込みのための効率的な媒体として確認されている。加えて、ＣaＰＯ₄微結晶粒子を介してのヒト胎児腎臓細胞293のkat組み込みプラスミドｐＫａｔ２ampac及びＰＬＮＣＬＺによる一過性トランスフェクションは共形質導入されたレトロウィルス性ベクター・プラスミドを効率的に組み込むことが示されている。これら２つの細胞系をアデノウイルス性ベクターＡｄＣＭＶＡｍｐｇで形質導入されたＨeＬa細胞と比較して、達成された組み込み機能の強度とパターンの分析を行った。
これらの分析のために、組み込み細胞株ＧＰ＋Ａｍ12、プラスミドｐＫａｔ２ampacでＣaＰＯ₄を介して形質導入された293細胞、及びアデノウイルス性ベクターＡｄＣＭＶＡｍｐｇで感染されたＨeＬa細胞に対して誘導後のいろいろな時点でノーザン・ブロット分析を行った。比較可能な量の抽出総細胞ＲＮＡをニトロセルロース薄膜上に移して、得られたブロットをレトロウィルスｇａｇ，ｐｏｌあるいはｅｎｖ遺伝子に対応する³²Ｐでラベルしたオリゴヌクレオチドでプローブした。得られたブロットはアデノウイルス伝達を介して達成されたレトロウィルス性組み込み遺伝子機能の強度及びパターンと従来の組み込み技術で達成されたレベルとの比較を可能にしてくれる。このデータを用いることによって、アデノウイルス性媒体を介しての標的細胞の一過性トランスフェクションからのレトロウィルス性ベクター産出を最適化することが可能になる。
実施例９
アデノウイルス性ベクターの媒介による遺伝子伝達によって誘発される一過性プロデューサ細胞を介してのレトロウィルス性ベクターの産出
レトロウィルスの遺伝子ｇａｇ/ｐｏｌ/ｅｎｖをコード表現するアデノウイルス性ベクターから適切なレベルとパターンのレトロウィルス性組み込み機能を引き出すことができることを確認した後、形質導入性レトロウィルス粒子の産出を行った。プラスミドｐＬＮＣＬＺによる両性レトロウィルス・プロデューサ株ＧＰ＋Ａｍ12の形質導入によってつくられた安定したレトロウィルス性プロデューサ細胞株を含む『従来の』レトロウィルス性組み込み系との比較が行われた。この株はＬacＺ／ネオマイシンをコード表現するレトロウィルス粒子を安定してつくりだす。さらに、レトロウィルス性ベクターが両性レトロウィルス性組み込みプラスミドｐＰＡＭ３をレトロウィルス性ベクター・プラスミドＰＬＮＣＬＺと組み合わせて用いるＣaＰＯ₄手順での293細胞の一過性共トランスフェクションを介してつくりだされた。比較のために、ＨeＬa細胞を正規の量のレトロウィルス性組み込み機能かレトロウィルス性ベクター機能（ＡｄＬＮＣＭＶＬacＺ）をコード表現するアデノウイルス性ベクター（ＡｄＣＭＶｍｐｇ）を用いて共形質導入した。
導入48時間後に、標的細胞から上澄液を取り出して、つくられたレトロウィルス性粒子の中身を分析した。つくられたレトロウィルス性粒子の力価と機能を判定するために多数の分析が行われた。つくられた粒子の強度はノーザン・ブロットで直接判定してレトロウィルス性ベクター配列を調べるためにｃＤＮＡを介してプローブで上澄液の分析を行った。各上澄液のシリアル希釈液を公知の量のレトロウィルス性ベクター・プラスミドを含んだ標準と比較した。このアッセイは従って各組み込み系で産出されたレトロウィルス性粒子に組み込まれたレトロウィルス性ベクター配列のレベルに関する情報をつくりだす。さらに、つくりだされたレトロウィルス性ベクターの力価は２つの方法で直接判定された。第一に、上澄液を標準的な方法でインジケータ細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３に移した。48時間後に、これらの細胞を染色して、ＦＤＧによるＬacＺ遺伝子の生成物について調べ、形質導入頻度についてＦＡＣＳで分析した。さらに、同様に感染されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞をネオマイシン類似物Ｇ418の存在下で安定した選択にかけた。21日後、生き残っているコロニーを結晶性バイオレットで染色してスコアをとった。加えて、それらコロニーの一部を拡大して宿主ゲノム内でのレトロウィルス性ベクターＤＮＡセグメントの状態を分析した。限定分析でＤＮＡが統合しているか、あるいはエピソームとして存在しているかについて調べた。
これらの研究は従って一過性レトロウィルス性プロデューサ細胞がレトロウィルス性組み込み及びベクター機能のアデノウイルス性ベクターの媒介による伝達で誘導され得ることを裏づけている。さらに、プロウイルス性配列を含む導入遺伝子に基づいて標的細胞内に長期的な遺伝子表現を達成することができる形質導入能力を有するレトロウィルス性粒子をつくりだすことができる。加えて、レトロウィルス性組み込み株のアデノウイルス性ベクターが媒介する誘導を介して多数の機能性形質導入レトロウィルス性ベクターの比較を標準的な方法で行うことができる。
実施例10
アデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを介してのレトロウィルス性粒子の最適な産出のためのパラメータ
組み込み細胞からのレトロウィルス産出に影響を及ぼすパラメータは宿主細胞の因子、及び達成可能なレトロウィルス性組み込み／ベクター機能などである。この点で、アデノウイルス性ベクターが媒介する異種遺伝子表現のレベルは一般的には入力粒子数の線形関数である。この関係はアデノウイルス性ベクターに関連する毒性が形質導入された細胞によってつくられる異種遺伝子を減衰するまで続く。アデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを介しての最適化されたレトロウィルス産出の決定因子が示される。ＨeＬa細胞は等分子量のレトロウィルス性組み込み機能（ＡｄＣＭＶＡｍｐｇ）とレトロウィルス性ベクター機能（ＡｄＬＮＣＭＶＬacＺ)をコード表現するアデノウイルス性ベクターによって共形質導入された。前にも述べたのと同様に、上澄液を取り出してレトロウィルス性粒子が産出されているかどうかを調べた。レトロウィルス性ベクター産出との関連を調べるために入力アデノウイルス性ベクターの量は変えることができる。従って、ＨeＬa細胞は細胞１個あたり、１，10，100，500及び1,000個の割合でアデノウイルス性ベクターによって感染された。レトロウィルス性プロデューサ細胞（ＨeＬa）におけるアデノウイルス媒介細胞毒性は細胞増殖に関するＭＴＴアッセイを用いて直接判定された。この分析に基づいて、毒性の制限及び／又は反応の線形性から示されるような入力アデノウイルス性ベクターと出力レトロウィルス性ベクターとの関係が判定された。
ウイルス粒子の出力に影響を及ぼす可能性のある別の要因はレトロウィルス性組み込み機能とレトロウィルス性プロデューサ細胞内につくりだされるレトロウィルス性ベクター配列の比率である。これは最高のレトロウィルス性力価を有するプロデューサ細胞を判定することで安定したレトロウィルス性プロデューサ細胞の存在下で経験的に達成される。この系の両方の成分を独立に調節することができるので、レトロウィルス性ベクター産出を可能にする組み込み及びベクター機能の最適の比率を判定することができる。ＨeＬa細胞をレトロウィルス性組み込み機能（ＡｄＣＭＶＡｍｐｇ）をコード表現するアデノウイルス性ベクターとレトロウィルス性ベクター機能（ＡｄＬＮＣＭＶＬacＺ）をコード表現するアデノウイルス性ベクターの両方を用いて共感染し、生成物のレトロウィルス性粒子の分析を行った。二つの粒子の線形比率（１：１，１：２，１：４など）で共感染を行って、形質導入性レトロウィルス性粒子の最終的な分析を行った。これらの研究はアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムの存在下でのベクター産出に最も適合したレトロウィルス性機能の正確な比率の判定を可能にした。
実施例11
マウス細胞株内でのアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを介してのレトロウィルス産生
長期間の遺伝子表現をもたらす細胞固有伝達を行うための方法が気道上皮（肺）、血管上皮（心臓）、及び肝臓（代謝血液、血友病）に関して調べられた。レトロウィルス・プロデューサ細胞として機能するマウス肝臓細胞の能力について判定した。この分析のために、安定したレトロウィルス・プロデューサ細胞、レトロウィルス組み込み及びベクター・プラスミドで一過性的にトランスフェクトされた293細胞、及び組み込み及びベクター機能を有する等量のアデノウイルス・レトロウィルス・ベクターによって感染されたＨeＬa細胞及びマウス肝臓癌細胞の両方との間の直接的な比較が行われた。誘導されたレトロウィルス性粒子を分析した。この分析は関連する柔組織器官標的からのマウス細胞が一過性のレトロウィルス・プロデューサ細胞として機能できるレベルに関する直接の判定を示している。
マウス細胞は自己指向性及び両性レトロウィルス性ベクターによって感染させることができる。しかしながら、マウス細胞が自己指向性レトロウィルス性ベクターと両性レトロウィルス性ベクターに対してそれぞれ違って機能するのかどうかについてはまだはっきり分かっていない。本発明による方法はマウス柔組織細胞の存在下でのレトロウィルスの局所的産出を伴うので、アデノウイルス／レトロウィルス二機能性戦略による自己指向性レトロウィルス性ベクターと両性レトロウィルス性ベクターを産出するマウス肝臓癌細胞の能力が示された。これを達成するために、レトロウィルス粒子内のエンベロープ糖蛋白質を変性するための柔軟な方式が開発された。レトロウィルス組み込み機能ｇａｇ及びｐｏｌ（ＡｄＣＭＶＧＰ）をコード表現するアデノウイルス性ベクターを開発した。さらに、自己指向性あるいは両性ｅｎｖ糖蛋白質のいずれかをコード表現する別のアデノウイルス性ベクターを開発した。従って、ＡｄＬＮＣＭＶＬacＺとｇａｇ/ｐｏｌ（ＡｄＣＭＶＧＰ）及び両性ｅｎｖ（ＡｄＣＭＶＥｎｖａ）をコード表現するアデノウイルス性ベクターによる標的細胞の共トランスフェクションによって両性レトロウィルス粒子を誘導したり、あるいはＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺとｇａｇ/ｐｏｌ（ＡｄＣＭＶＧＰ）及び自己指向性ｅｎｖ（ＡｎＣＭＶＥｎｖｅ）をコード表現するアデノウイルス性ベクターによる標的細胞の共トランスフェクションによって本発明によるアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを介して自己指向性レトロウィルス粒子を誘導することは実行可能である。
この分析のために、マウス肝臓癌細胞株をアデノウイルス性ベクターの適切な組み合わせで感染させて、遺伝子組換え自己指向性あるいは両性レトロウィルス性ベクターのいずれかの一過性プロデューサとして機能させた。誘導されたベクターはＮＩＨ−３Ｔ３に対する力価で分析して、ＬacＺ遺伝子表現および新しい選択可能なクローンをスコアした。この分析はレトロウィルス・プロデューサ細胞として機能するマウス細胞に関する細胞の制約因子を明らかにする。この分析は自己指向性及び両性レトロウィルス性ベクターの産出に関連する具体的な問題の直接的判定についても寄与するであろう。
実施例12
マウス一次細胞でのアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを介してのレトロウィルス性ベクター産出
肝臓細胞のマウス一次培養体をコラーゲナーゼ消化及び精製という標準的な方法でつくりだした。これらの細胞のレトロウィルス産出に関連するパラメータ、つまり、１）アデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムによって誘発されるレトロウィルス組み込み機能のパターンと強度；２）アデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムによって誘発されるレトロウィルス性ベクターの産出の強度、３）アデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムによって誘発されるレトロウィルス性ベクターの産出に関するパラメータの最適化、４）アデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを介しての自己指向性及び両性レトロウィルス性ベクターの異なった産出などについての評価を行った。これらの研究は末端アッセイとしてＬacＺ組織化学陽性及びネオマイシン抵抗で評価される形質導入性レトロウィルス粒子の産出を用いる。これによって、イン・ビボ状況と最高度の類似性を有する適切な標的細胞の存在下のレトロウィルス性ベクター産出に関連した最適パラメータの判定が可能になる。
実施例13
アデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを介してのレトロウィルス形質導入を補強する手段としてレトロウィルス受容体の誘導
隣接柔組織細胞を形質導入するレトロウィルス性ベクターをその場所で発生させることはその安定した遺伝子修正を可能にしてくれる。一度アデノウイルス／レトロウィルス二機能性方式でアデノウイルス性ベクターの高度の局所的発生が行われると、他の因子が周辺の標的細胞の実際の形質導入に関与してくる。この点に関して、標的器官サイトでの安定したプロデューサ細胞がレトロウィルス性ベクターを介して起きるようにするためには、形質導入される細胞が増殖状態にあることが必要である。つくられるレトロウィルスに対する受容体の局所集中も隣接細胞が形質導入される有効性を示す因子であろう。自己指向性あるいは両性ベクターのための受容体レベルはこのベクターによる感染に対する標的細胞の全体的な感受性を示す限定的な因子である。さらに、同族レトロウィルス受容体の異種表現は、１）受容体−ｅｎｖ相互作用に基づく有効な形質導入イベントの数を増大することにより標的細胞の感受性を増大し、そして／又は２）受容体−ｅｎｖ相互作用を可能にする従来は不全であった機能を提供することによって、レトロウィルス感染に従来は抵抗性を示していた細胞をそれに対して感受性を示すようにしてくれる。レトロウィルス受容体群の調節はこれらのベクターによる形質導入の有効性の重要な決定因子であろう。
自己指向性レトロウィルス（eco−Ｒ）のエンベロープ糖蛋白質に対応する受容体と両性レトロウィルス（ampho−Ｒ）のエンベロープ糖蛋白質に対するｃＤＮＡクローンを得た。これらはアデノウイルス性ベクター内に組み入れられ、それによってレトロウィルス性ベクターがＥ１Ａ／Ｂ消去、複製不能アデノウイルス性ベクターの存在下でＣＭＶ中間初期プロモータ／エンハンサを介して表現された。これらのベクターを用いて標準的な手順で一次マウス肝臓細胞に感染させた。これらの標的肝臓細胞は、その後、ＬacＺ/ｎｅｏカセットをコード表現する自己指向性及び両性ベクターによって感染させられた。レトロウィルスがコード表現したｃＤＮＡによって形質導入されていないマウス一次肝臓細胞との比較が行われた。上にも述べた通り、インジケータ細胞をスコアしてＬａｃＺ組織化学活性とネオマイシン抵抗性とのレトロウィルスによる誘発について調べた。さらに評価可能なパラメータとしてはレトロウィルス性ベクターの感受性に対する標的レトロウィルス受容体数の影響がある。加えて、ecoＲとamphoＲ誘発のそれぞれの能力の比較が可能である。これらの調査はレトロウィルス受容体誘発が関連標的細胞のレトロウィルス形質導入を強化することが可能かどうかについて明らかにしてくれる。この戦略はその場所でのレトロウィルス受容体誘発を達成するためのアデノウイルス性ベクターの効率的なイン・ビボ遺伝子伝達特性をもたしてくれる。従って、アデノウイルス性ベクターはつくりだされたレトロウィルス粒子を介して隣接細胞を感染させるために標的器官サイトでプロデューサ細胞を発生させるために用いられる。隣接細胞でのレトロウィルス受容体の誘導を介してこのプロセスを強化することもアデノウイルス性ベクターが媒介する遺伝子伝達を可能にしてくれる。
実施例14
アデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムによるＶＳＶ−Ｇ偽型化レトロウィルス性ベクターの産出
レトロウィルス性ベクターを介しての効率的な遺伝子伝達を達成するという流れのなかでの標的細胞レトロウィルス受容体の制約を克服するために偽型化レトロウィルスが用いられた。この点で、最も一般的には小水泡性口内炎ウイルスＧ−糖蛋白質（ＶＳＶ−Ｇ）から誘導される、交互に繰り返されるｅｎｖ糖蛋白質を含む二機能性レトロウィルス粒子を発生させることができる。そして、これらの二機能性レトロウィルス粒子はＶＳＶ−Ｇ糖蛋白質と標的細胞受容体との相互作用の効能によって細胞に感染するかもしれない。交互細胞侵入を可能にするこの手段は両性あるいは自己指向性ｅｎｖ糖蛋白質に対する標的受容体の欠如を回避してくれる。こうしたやり方はレトロウィルス抵抗性細胞を感染させる目的と、形質導入効率を向上させるのとの両方の目的で用いられている。さらに、これら偽型化ベクターはイン・ビボでのより高いレベルの安定性を有しており、イン・ビボ伝達状況でのその場所でのより高いレベルの形質導入を可能にしてくれるであろう。これらのＶＳＶ−Ｇ偽型化レトロウィルスは両性あるいは自己指向性ｇａｇ/ｐｏｌとＶＳＶ−Ｇ糖蛋白質との協調表現によって発生される。集合レトロウィルス粒子は両性あるいは自己指向性ｅｎｖ対応物の代わりにＶＳＶ−Ｇを取り込む。この目的を達成するひとつの手段はレトロウィルス性ｇａｇ/ｐｏｌをコード表現するプラスミド及びＶＳＶ−Ｇ＋レトロウィルス性ベクター・プラスミドによる細胞の共トランスフェクションである。形質導入された細胞はレトロウィルス性偽型の一過性プロデューサにされる。この方法は望ましい偽型化レトロウィルス粒子をつくりだすことができるが、ＶＳＶ−Ｇ糖蛋白質に関連した毒性がプロデューサ細胞内で示され、このことは産出量の低下、ひいては全体的な力価の低下という結果をもたらす。組み込み細胞株方式は調節可能な表現単位をつくりだすことで開発されてきている。構成的にレトロウィルスｇａｇ/ｐｏｌを表現し、同時に誘導可能な表現カセットにＶＳＶ−Ｇを含んだ安定した細胞が開発されている。レトロウィルス性ベクター・プラスミドによるこれらの細胞の形質導入に続いて、偽型化ベクターの誘導を可能にすべくＶＳＶ−Ｇ表現が誘発された。こうしたやり方は偽型化粒子を発生できる細胞株の安定した維持と向上されたレベルのベクター産出を可能にしてくれる。
標的細胞をＶＳＶ−Ｇ偽型の一過性プロデューサ内に入れるためにアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを用いた。こうしたやり方はイン・ビボで隣接細胞を感染させる際に利点を有している。そうした補強された形質導入効率性は改良された標的細胞感染効率に反映する可能性がある。それとは別に、そうしたことは偽型化レトロウィルス粒子のより大きなイン・ビボ安定性に反映する可能性もある。この分析のために、標的細胞をより厳密さを向上させたモデル・システムとして用いた。従って、ＨeＬa細胞、マウス肝臓細胞株ＢＮＬ ＣＬ．２、そして最終的にマウス一次細胞をアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムによって一過性ＶＳＶ−Ｇ偽型化レトロウィルス・プロデューサとして誘発した。
偽型化レトロウィルスの発生のために、細胞をレトロウィルス性ｇａｇ/ｐｏｌを含むアデノウイルス性ベクター、ＣＡｄＣＭＶＧＰ、レトロウィルス性ベクター配列をコード表現するアデノウイルス（ＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺ）＋ＶＳＶ−Ｇ糖蛋白質をコード表現するアデノウイルスで共感染した。この後者のベクターはL. Prevec（McMaster University, Ontario, Canada）から入手した。これは種々の高レベルの真核性標的細胞でＶＳＶ−Ｇを表現することはできるＥ１Ａ／Ｂ消去、複製不能アデノウイルス性ベクターである。これらの細胞はそれぞれＡｄＣＭＶＥｎｖ ^e及びＡｄＣＭＶＥｎｖ^aを用いてアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを介しての自己指向性及び両性レトロウィルス性ベクターの発生のためにも誘発された。感染後、細胞上澄液を取り出して、標的細胞を感染するために用いられた。最初に、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を感染して、ＬacＺ誘発及びネオマイシン選択可能性クローンをスコアした。この分析は、ＶＳＶ−Ｇ偽型化に対して相対的な力価指数をつくりだして、それを両性及び自己指向性ベクターと比較する方法を可能にしてくれる。さらに、上澄液を用いてマウス肝臓一次細胞を感染させてＬacＺをスコアした。この分析は、偽型化方式がＶＳＶ−Ｇ標的細胞受領体相互作用に基づいて柔組織標的の感染性を増大させるかどうかを明らかにする。相関的研究は、ＶＳＶ−Ｇ形質導入がベクターのプロウイルス性の統合に関連しているのかどうかについて反転した。ＶＳＶ−Ｇは『偽形質導入』と関連づけられており、そのことによって異種遺伝子生成物の移送が標的細胞の安定した遺伝子修正の過程で起きるのであるから、これは重要なことである。さらに、ＶＳＶ−Ｇ糖蛋白質の誘発された表現がアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを介してベクター産出をさらに最適化することができるかどうかについて調べられた。この誘発性がより高い力価のＶＳＶ−Ｇ偽型の誘導を可能にするかどうかについての評価が行われた。これらの研究は、従ってアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムがＶＳＶ−Ｇ偽型化レトロウィルス粒子を生み出すように機能できるのかどうかについての判断を可能にしてくれる。さらに、これらの粒子がイン・ビトロでの関連柔組織標的のより増強された形質導入能力を有しているかどうかについても調べられた。
実施例１５
イン・ビボで柔組織細胞を修正するアデノウイルス／レトロウィルス二機能性ベクター
本発明は標的細胞をアデノウイルス・プロデューサ細胞として機能させるためにアデノウイルス性ベクターを用いる方法を提供する。さらにこの方法は心臓、肺、及び血液の病気のモデルに関連した標的組織に対して最適化することができる。この方式をイン・ビボで用いて、標的柔組織サイトでの長期間の安定した統合を達成することができる。１）全身血管伝達による肝臓細胞形質導入と、そして２）内腔気道伝達による気道上皮の２つの状況で、イン・ビボ研究が行われた。これらのルーティング方式は関連柔組織の高効率のイン・ビボ形質導入が達成できる伝達ルートを示している。従って、イン・ビボでの遺伝子機能のレトロウィルスによる伝達効率は人をまごつかせるような要因ではない。標的細胞をレトロウィルス・プロデューサとして機能させるためにアデノウイルス性ベクターが用いられた。つくりだされたレトロウィルスは周囲の柔組織細胞に形質導入するように機能した。
実施例16
柔組織サイトでのレトロウィルス産出のイン・ビボ誘発後の標的細胞のその場所でのレトロウィルス感染
レトロウィルスがイン・ビボでつくりだされる程度及び範囲について調べた。つくりだされるウイルス粒子はその場所では発生後に実際的な方法で検出することはできないので、この分析では隣接細胞がレトロウィルス性ベクターによって安定的に形質導入された程度を強化することで、その結果を間接的に判定した。これらの研究のために、気道上皮か、あるいは肝臓細胞上皮のいずれかでの伝達を実現するためにレトロウィルス性ベクター機能をコード表現するアデノウイルス性ベクターとレトロウィルス性ベクター配列をコード表現するアデノウイルス性ベクターの両方でマウスに刺激を与えた。組み込み機能の表現と、誘導されたレトロウィルス性ベクター（ＬacＺ/ｎｅｏ）の表現された生成物はｍＲＮＡトランスクリプト（ｇａｇ/ｐｏｌ/ｅｎｖ）の定量的ポリメラーゼ鎖反応及び／又はＤＮＡコピー数（ＬＴＲＬacＺ/ｎｅｏ）によって標的器官でそれぞれ独立に確認された。さらに、特にこれらのレトロウィルス性成分をつくりだす標的細胞は肺及び肝臓から誘導されるこれらの部分のその本来の場所での雑種形成によって判定された。これらの研究はアデノウイルス性ベクターの伝達が標的器官サイトでレトロウィルス組み込み機能の表現を達成することができることを裏づけている。さらに、レトロウィルス・プロデューサ細胞として強力に機能する特定の細胞サブセットも識別することができる。
つくりだされるレトロウィルスによる標的細胞の形質導入によって統合が行われる程度の判定は宿主器官ゲノム性ＤＮＡの存在下でのプロウイルス性ＤＮＡの状態の分析によって行われる。レトロウィルス粒子の局所的な産出の後、周辺の細胞の形質導入はレトロウィルス・プロウイルス性ゲノムの統合化コピーを発生された。総ＤＮＡはアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムによる誘発の後に抽出されて、プロウイルス性ＤＮＡの状態の分析にかけられた。最初、組織物質に対してＨirt ＤＮＡ抽出が行われた。誘導されたＤＮＡがサザン・ブロットで分析されて、アデノウイルス誘導配列の存在とその状態について調べられた。レトロウィルス性ベクターＤＮＡの大部分はＨirt画分内で非統合エピソームとして検出されるはずである。これはＡｄＣＭＶＡｍｐｇゲノムと、少なくともＡｄＬＮＣＭＶＬacＺゲノムの一部にも当てはまるであろう。次に、高分子量ＤＮＡを同様の方法で分析した。２つのアデノウイルス性ベクターのゲノムは、それらがエピソーム性で、Ｈirt抽出可能なＤＮＡの存在する場所に移行するので、ＨＭＷ ＤＮＡ画分で検出されるはずである。対照的に、統合がいずれかの程度で行われるのであれば、ＡｄＬＮＣＭＶＬacＺのプロウイルス性成分はサザン・ブロット分析で高分子量画分で検出される。このことは、これら２つの標的器官サイトから誘導されたＤＮＡのＨirt画分及びＨＭＷ画分のサザン・ブロットと組み合わせた制限エンドヌクレアーゼ消化によって確認された。比較対照との比較が行われ、それによってレトロウィルス組み込み機能、あるいはレトロウィルス・ベクター機能のいずれか１つだけのアデノウイルスを介しての伝達が行われた。この分析は統合イベントがアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムによるその本来の場所でのレトロウィルス性ベクター形質導入の結果として起きたのかどうかを判定する感受性『スクリーン』として機能する。
その本来の場所でのレトロウィルス感染の追加的アッセイを標的サイトでのベクター・プロウイルス性ＤＮＡあるいはＤＮＡコード表現配列の長さである。安定して、長期間の表現がこれらの表現の器官からその本来の場所でのレトロウィルス感染から誘導される。最初の例で、標的器官の柔組織細胞でのベクター・プロウイルスＤＮＡの統合は宿主ゲノムＤＮＡの存在下でのＤＮＡ配列の長期的持続として示されるであろう。従って、ベクター・プロウイルスＤＮＡの一時的パターンについて検査した。この点で、前にも述べたのと同様、肺及び肝臓の形質導入についてＡｄＣＭＶＡｍｐｇ及びＡｄＬＮＣＭＶＬacＺによって動物を検査した。処理後特定の時間的間隔をおいて、その器官を取り出して、Ｈirt ＤＮＡ抽出及びＨＭＷ ＤＮＡ抽出の両方を行った。アデノウイルス性ベクター・ゲノム性ＤＮＡとレトロウィルス性プロウイルスＤＮＡの両方の分析を定量性ＰＣＲを用いて行って、各時点での宿主ＨＭＷゲノム性ＤＮＡ内の統合レトロウィルス性ベクターＤＮＡの絶対量を判定した。ＨＭＷ画分内部の持続性プロウイルス性ベクター配列を示す一時的な特徴は安定した統合が起きた程度を示す。ベクター・プロウイルス統合に基づく持続性の別の指数が組織化学レポータを用いて求められた。ＬacＺとＧＦＰの両方を、その表現が適切に処理された組織部分の組織化学分析によって消去することができるレポータとして用いられた。レトロウィルス性ベクターの形質導入後に気道上皮及び肝臓に存在するこれらレポータ遺伝子の一過性表現特性についてはかなり資料として発表されている。従って、レポータ遺伝子の一時的パターンはその本来の場所でのレトロウィルス発生及びその結果としてのベクター・プロウイルス性ＤＮＡを示すものである。動物に肝臓及び肺での形質導入を行うためにＡｄＬＮＣＭＶＬacＺ又はＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰを用いて実験を行った。処理後のいろいろな時点で、関連する器官を取り出して、コード表現されたＬacＺ及びＧＦＰ遺伝子の生成物に関する組織化学分析を行った。この分析を補強するために、これらレポータ遺伝子のｍＲＮＡ産出を調べるために組織部分の、その本来の場所での雑種形成を行って、追加的な定量的指数を得た。この分析では、アデノウイルスだけをコード表現するレポータとは比べて、その本来の場所のレトロウィルス性ベクター・グループ内で持続性パターンの違いが明らかにされるであろう。
実施例17
レトロウィルス組み込み及びベクター機能のイン・ビボでのアデノウイルスによる伝達を介しての、その本来の場所でのレトロウィルス感染の増強
局所的につくられたレトロウィルス性ベクターが標的細胞に安定して形質導入できる能力は局所的な細胞因子によって影響を受ける。これらの因子には標的細胞の増殖状態と、その局所的につくりだされたレトロウィルス性ベクターに対する受容体の数などがある。細胞増殖を調節するために、成長因子に基づく戦略が用いられた。標的細胞の増殖を強化するために成長因子誘発の戦略が用いられたが、成長因子ＫＦＧ及び肝臓細胞成長因子（ＨＧＦ）をコード表現する遺伝子成長物の肺及び肝臓に対する効率的なイン・ビボ伝達を達成するためにアデノウイルス性ベクターが用いられた。この方法によって達成されたこれら成長因子の高い局所的濃度はこれらの器官サイトで柔組織増殖の最適化された誘発をもたらし、これらの増殖誘発は局所的につくられたレトロウィルス性ベクターによる標的細胞の形質導入強化を可能にしてくれる。
動物に対して、初めに、その肺あるいは肝臓に対してＫＧＦあるいはＨＧＦをコード表現するアデノウイルス性ベクターを伝達することで刺激を与えた。増殖の最適な誘発のための一時的な特性が確立した後、動物に対してその本来の場所でのレトロウィルス発生のためにアデノウイルス／レトロウィルス二機能性ベクターＡｄＣＭＶＡｍｐｇ及びＡｄＬＮＣＭＶＬacＺを与えた。その後、これらの動物を分析して統合されたプロウイルス性ベクター配列を判定した。これらの調査には肺と肝臓のＨＭＷＤＮＡ画分内での統合プロウイルス配列の定量と、安定して形質導入された細胞の数を判定するための、その本来の場所での雑種形成とが含まれていた。相関的な研究は誘発された増殖がどの程度に本来の場所でのレトロウィルス形質導入の成功に寄与するかについて判定するものである。これらの研究をまとめると、成長因子遺伝子のアデノウイルス・ベクターに媒介された伝達を介して誘発される増殖が柔組織標的の安定した形質導入を達成する上で本来の場所で発生されたレトロウィルス性ベクターの能力にどの程度好ましい影響を及ぼすかを明らかにしてくれる。
実施例18
アデノウイルス性ベクターは標的細胞をレトロウイルス・プロデューサとして機能させることができる
標的細胞をアデノウイルス・ベクター、ＡｄＣＭＶＡｍｐｇ及びＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰの組み合わせ、あるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけで感染させた。標的細胞はサル・ベロ細胞株Ｗ162、マウス腺維芽細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３、ヒト膀胱癌細胞株ＥＪ、あるいはヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ3_ipl（データ示さず）であった。細胞は３時間適切なアデノウイルス性ベクターで感染させてから、洗浄してすべての遊離アデノウイルスを取り除いた。これらの細胞をいろいろな期間組織培養に入れて、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）あるいは蛍光顕微鏡で緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の表現について分析した。
感染２日目のアデノウイルス性ベクター感染細胞の分析の結果、比較対称と推定されるレトロウィルス・プロデューサは高い頻度でＧＦＰレポータ遺伝子の表現を示した（図５）。これは両方のグループで起きたＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ感染の初期の高い頻度とも一致しており、その後のＧＦＰ遺伝子表現も両方のグループで同様に発生した。各グループのサブセットを８日間毎に通過させて、30日目と60日目に分析した。アデノウイルス性ベクター（ＡｄＣＭＶＡｍｐｇ及びＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ）の両方に露出させた細胞グループのＦＡＣＳ分析はＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけに露出させた細胞と比較してかなり多い数のＧＦＰ−ポジティブ細胞を示した（図６Ａ）。両方のウイルスに感染させたグループからのＧＦＰ−ポジティブ細胞は密集した状態で成長しており、これはレトロウィルスが局所的に分布していること、及び／又はクローンの発生原点を示している（図５）。これはＧＦＰ表現を失ってしまったＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけで感染された細胞と著しい対称を示しており、標準的なアデノウイルス方式（図５及び６Ａ）で伝達される遺伝子の公知の一過性表現と一致した傾向を示している。高分子量細胞ＤＮＡのレトロウィルス配列が示されたことでプロウイルス統合が確認された（図６Ｂ）。
実施例19
形質導入性レトロウィルス粒子の産出
ＮＩＨ−３Ｔ３あるいはＷ162細胞をＡｄＣＭＶＡｍｐｇとＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ、あるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけで感染させて、その後、上に述べたような手順で洗浄した。上澄液を感染後48時間で取り出して、その後、レトロウィルスの力価を調べるためにＮＩＨ−３Ｔ３細胞を感染するために用いた。上澄液で感染された細胞を培養内に20日間保持して、ＧＦＰ表現に関する分析を行った。ＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰウイルスから誘導された上澄液は標的細胞内で長期ＧＦＰ表現を誘発することはできなかった（図７）。対称的に、ＡｄＣＭＶＡｍｐｇ及びＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ上澄液で感染された細胞は20日目で高い割合のＧＦＰ表現を示した。この研究はＧＦＰ誘発が最初のアデノウイルスで感染された標的細胞から誘導されたレトロウィルスによる感染からもたらされたことを裏づけるものである。これら長期的なＧＦＰ表現に関する調査はレトロウィルス産出によって媒介される安定した形質導入からの移転アデノウイルス一過性遺伝子表現（＜２週間）を明確にするために考案されたものである。これらの結果は形質導入性レトロウィルス粒子が実際に標的内のアデノウイルス性ベクター伝達遺伝子によって発生されたことを示している。
こうした方法が複製能力を有するレトロウィルス（ＲＣＲ）の有意な産出に関連しているかどうかについて判定するため、プラスミドに基づくトランスフェクション方法を介して誘導されるＲＣＲ発生とアデノウイルス／レトロウィルス二機能性ベクターの使用との比較が行われた。従って、ＨeＬa細胞をｐＰＡＭ３＋ｐＬＮＣＬＺでトランスフェクトするか、あるいはＡｄＣＭＶＡｍｐｇ又はＡｄＬＮＣＶＧＦＰ、又はＡｄＣＭＶＡｍｐｇ＋ＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰによって感染された。これらの上澄液はその後複製能力を有するレトロウィルスがあるかどうかについて調べた。アデノウイルス／レトロウィルス二機能性によっては複製能力を有するレトロウィルスは検出されなかった（データ示さず）。従って、この方法による複製能力を有するレトロウィルスの発生は通常の方法を上回っているとは思われない。
実施例20
安定した統合によるイン・ビボ遺伝子伝達
こうした基本的な考え方を確立した後、安定した統合をもたらすイン・ビボ遺伝子伝達を行うためにこの方法を用いた。これは最も厳しい伝達状況でのこの方式の全体的な実用性について判定したために行われた。この分析のために、ヒト卵巣癌のマウス・モデルを用いた。無胸腺ヌード・マウスをヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ3_iplによってオルソトピックな方法で異種間移植した。腹膜腫瘍プラークを確立した後、動物に腹膜ルートでベクターを与えた。動物のいくつかのグループにアデノウイルス／レトロウィルス二機能性ベクターかこのベクター＋アデノウイルス／レトロウィルス二機能性組み込み機能のいずれかを与えた。前者のグループでは、用いられたベクター、ＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰはＧＦＰレポータ遺伝子を含むレトロウィルス性ベクター配列を含んでいた。後者のグループでは、ｐＣＡＡｍｐｇから誘導されたアデノウイルス性ベクターＡｄＣＭＶＡｍｐｇは、機能的に検証された組み込み機能を含んでいた。一方のウイルス・グループでは、ＧＦＰ表現カセットのアデノウイルス性ベクター媒介伝達はイン・ビボ遺伝子表現をもたらし、非統合性異種遺伝子伝達に基づく急速な消滅という一時的な特性を有している。対称的に、これら２つのウイルスは腫瘍細胞の本来の場所での誘発を達成してレトロウィルス・プロデューサ細胞として機能させることが予想された。局所的につくられたレトロウィルス性ベクターは増殖性の隣接細胞、この場合にはＳＫＯＶ3_ipl腫瘍標的の安定した形質導入を行うことが予想されるであろう。これらの考察に基づけば、２つのオリジナル・グループは安定した形質導入を達成する別の能力に基づいてＧＦＰレポータ遺伝子の表現の明確に異なった一時的特性を示すことが予想されるであろう。アデノウイルス／レトロウィルス二機能性ベクターＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰによって処理された動物を伝達後の早い時点と時間が経ってからＧＦＰ表現を示す腫瘍細胞があるかどうかを示すために蛍光顕微鏡で分析した。この分析で、単一のベクターを受けた動物のグループは図８に示すように遅い時点では稀にしかポジティブ細胞を示さなかった。対称的に、アデノウイルス／レトロウィルス二機能性ベクター＋アデノウイルス／レトロウィルス二機能性組み込み機能を与えられた動物は遅い時点ではっきりと異なったパターンを示した。この点で、このグループの分析はクラスター内でポジティブな細胞はより多く検出されている点が注目に値する。この知見は標的細胞の安定した形質導入がクローン表現で起きたとする考え方と一致している。
実施例21
アデノウイルス／レトロウィルス二機能体のイン・ビボでの有効性
卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ3_iplをＡｄＣＭＶＡｍｐｇ＋ＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ、あるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけのいずれかでイン・ビトロで感染させた。感染されたレトロウィルス粒子のイン・ビボでの発生と隣接細胞の感染を確認するために、感染された細胞を未感染の細胞と、アデノウイルス性ベクターによって感染された細胞25％、そして未処理ＳＫＯＶ3_ipl細胞75％の割合で混合して、腫瘍形成が行われるように無胸腺ヌード・マウス内に皮下接種した。移植から20日目に、両方の動物グループとも明白な腫瘍を有しており、この腫瘍を取り出してＧＦＰレポータ遺伝子の持続性および表現を分析した。ＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけで感染されたグループは、稀に、孤立した蛍光細胞だけを有していた（図９Ｂ）。対照的に、２−ウイルス・グループから誘導された腫瘍はＧＦＰポジティブ細胞の大きな膨張性クラスターを持っていた（図９Ｃ）。複数のフィールドでのポジティブ細胞を数えることによって、１−ウイルス・グループが80％以上のＧＦＰ−ポジティブ細胞を有しているという形質導入された細胞の推定を可能にしてくれた。従って、このグループでは、ポジティブ細胞の数は最初の移植混合体内のアデノウイルスで感染された細胞の割合よりかなり大きかった。２−ウイルス・グループでのＧＦＰ−ポジティブ細胞がかなり広く分布していることは、本来の場所のレトロウィルス性ベクターによる隣接細胞の安定した遺伝子修正を示唆している。
イン・ビボでのアデノウイルス性ベクター形質導入と本来の場所でのレトロウィルス・プロデューサ発生と結合させる可能性について検査した。ヌード・マウスにオルソトピックな方法でヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ3_iplを移植した。移植後５日目に動物にＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけか、あるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ＋ＡｄＣＭＶＡｍｐｇのいずれかで腹膜内接種した。アデノウイルス接種16日後、動物を致死させて、腫瘍を分析した。１−ウイルス・グループではＧＦＰ−ポジティブ細胞は検出されなかった（図９Ｅ）。対照的に、両方のアデノウイルス性ベクターを受けたグループではＧＦＰ−ポジティブ細胞の島が検出された（図９Ｆ）。複数の顕微鏡フィールドの分析は１−ウイルス・グループの場合全体的な形質導入率が１％以下、そして２−ウイルス・グループの場合10−15％であることが示された。レトロウィルス組み込みの十分な誘発を可能にする２つのアデノウイルス性ベクターを受けたグループでのイン・ビボでのＧＦＰ表現の持続性は二次的につくりだされるレトロウィルス性ベクターに基づいて発生する安定した形質導入に関するイン・ビトロでの知見と一貫している。
実施例22
要約
イン・ビボで標的細胞の効率的で安定した遺伝子修正を行うための新しいベクター方式が開発された。これはアデノウイルスをレトロウイルス性ベクター及び組み込み成分のための伝達システムとして用い、それによって標的細胞に一過性の、本来の場所でのレトロウイルス性ベクターの一過性プロデューサとして機能させることによって達成された。従ってこの方式は、隣接細胞を感染させ、安定した形質導入を達成することができるレトロウイルス性ベクター粒子の発生を可能にした。この方式においては、２つの重要な要因がこのレベルの安定したイン・ビボでの形質導入を可能にしてくれた。第一に、標的細胞のサイトでのレトロウイルス性ベクターの局所的産出がレトロウイルス粒子の、その不活性化につながるような体液因子への露出による不都合な影響を克服してくれる。第二に、アデノウイルス性ベクターの能力を利用して本来の場所でのレトロウイルス・プロデューサ細胞の効率的なアデノウイルス性ベクターに標的細胞への有効なイン・ビボ伝達を達成させた。この戦略は成分ベクター系の望ましい諸側面を遺伝子伝達という目的のために結合させるという新しい概念に基づく方式を示している。
本明細書で述べられている特許あるいは出版物は本発明が関連する技術分野の当業者のレベルを示している。これらの特許及び出版物はそれらを参照することによって、個々の出版物が具体的、個別的に組み込まれるのと同じ程度に、全体として本明細書に組み込まれる。
当業者であれば、本発明がここで述べられている目的や利点や、それと本質的に関連している目的や利点を実行、達成するのによく適合していることは容易に理解できるであろう。ここに述べられた実施例は、その方法、手順、処理、分子、及び具体的な化合物も含めて好ましい実施の形態を示すものであり、具体例であって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。その変更やその他の利用法は、権利請求の範囲で述べられるような本発明の範囲に含まれる技術分野の当業者なら容易に想起できるであろう。
配列リスト
（1） 一般的情報
（i） 出 願 人：Curiel, D.
（ii） 発明の名称：二機能性レトロウイルス／アデノウイルス系
（iii） 配列番号：２
（iv） 連絡住所
（Ａ） 住所：Benjamin A. Adler, Ph. D, J. D.
（Ｂ） 通り：8011 Candle Ln.
（Ｃ） 都市：Houston
（Ｄ） 州：ＴＸ
（Ｅ） ＺＩＰ：77071
（ｖ） コンピュータ読み取り形式
（Ａ） メディア・タイプ：フロッピー・ディスク
（Ｂ） コンピュータ：Apple Macintosh
（Ｃ） オペレーティング・システム：Macintosh
（Ｄ） ソフトウエア：Microsoft WORD6.0
（vi） 現行出願データ
（Ａ） 出願番号
（Ｂ） 出願日：
（Ｃ） 分類
（vii） 前回出願日
（Ａ） 出願番号
（Ｂ） 出願日：
（viii） 弁理士に関する情報
（Ａ） 氏名：Benjamin A. Adler
（Ｂ） 登録番号：35,423
（Ｃ） 参照・ドケット番号：Ｄ6015
（ix） 通信情報
（Ａ） 電話：（713）777−2321
（Ｂ） ＦＡＸ：（713）777−6908
（Ｃ） ＴＥＬＥＸ：
（２） 配列識別番号Ｎｏ．１に関する情報
（i） 配列特性：
（Ａ） 長さ：29bp
（Ｂ） タイプ：核酸
（Ｃ） ストランド性：単一ストランド
（Ｄ） トポロジー：線形
（ii） 分子タイプ：
（Ａ） 説明：他の核酸
（iii） 仮定：なし
（iv） 抗センス：なし
（v） フラグメント・タイプ
（vi） オリジナル・ソース
（vii） 緊急ソース：
（viii） ゲノムでの位置
（ix） 特徴
（x） 刊行物情報
（xi） 配列説明：配列識別番号：１

（３） 配列識別番号：２に関する情報
（i） 配列特性
（Ａ） 長さ：26
（Ｂ） タイプ：核酸
（Ｃ） ストランド性：単一ストランド
（Ｄ） トポロジー：線形
（ii） 分子タイプ
（iv） 抗センス：なし
（v） フラグメント・タイプ
（vi） オリジナル・ソース
（vii） 緊急ソース：
（viii） ゲノムでの位置
（ix） 特徴
（x） 刊行物情報
（xi） 配列説明：配列識別番号：２

Claims (9)

1. 二機能性（chimeric）アデノウイルス／レトロウイルスベクターシステムであって、前記システムが下記（a）及び（b）：
   （a）レトロウイルスの長端末反復（LTR）が両側に配置された異種遺伝子を含む第１の複製不全アデノウイルスベクター、及び
   （b）１つ又はそれ以上の第２の複製不全アデノウイルスベクターであって、前記第２の複製不全アデノウイルスベクターはレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを一緒にコード化するものである、
   を含んでいることを特徴とするベクターシステム。
2. 第２の複製不全アデノウイルスベクターが、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖをコード化するアデノウイルスベクター、ｇａｇ及びｐｏｌをコード化するアデノウイルスベクター、及びｅｎｖをコード化するアデノウイルスベクターから構成されるグループから選択され、前記第２の複製不全アデノウイルスベクターがレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを一緒にコード化することを特徴とする請求項１記載のベクターシステム。
3. ｅｎｖ遺伝子が小水泡性口内炎ウイルスＧ−糖蛋白質である請求項１又は２記載のベクターシステム。
4. 異種遺伝子が、治療用蛋白質をコード化する遺伝子、選択可能なマーカー及びレポータ遺伝子から構成されるグループから選択されることを特徴とする請求項１記載のベクターシステム。
5. イン ビボで、心臓、肺、及び血液の疾患に関する柔組織細胞の遺伝子修正を達成するための二機能性アデノウイルス／レトロウイルスベクターシステムを含有する組成物であって、前記二機能性アデノウイルス／レトロウイルスベクターシステムが下記（a）及び（b）：
   （a）レトロウイルスの長端末反復（LTR）が両側に配置された異種遺伝子を含む第１の複製不全アデノウイルスベクター、及び
   （b）１つ又はそれ以上の第２の複製不全アデノウイルスベクターであって、前記第２の複製不全アデノウイルスベクターはレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを一緒にコード化するものである、
   を含んでいることを特徴とする組成物。
6. 第２の複製不全アデノウイルスベクターが、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖをコード化するアデノウイルスベクター、ｇａｇ及びｐｏｌをコード化するアデノウイルスベクター、及びｅｎｖをコード化するアデノウイルスベクターから構成されるグループから選択されことを特徴とする請求項５記載の組成物。
7. ｅｎｖ遺伝子が小水泡性口内炎ウイルスＧ−糖蛋白質である請求項５又は６記載の組成物。
8. 異種遺伝子が、治療用蛋白質をコード化する遺伝子、選択可能なマーカー及びレポータ遺伝子から構成されるグループから選択されることを特徴とする請求項５記載の組成物。
9. 第１及び第２の複製不全アデノウイルスベクターが、宿主細胞に共形質導入され、そうすることによって、前記第１の複製不全アデノウイルスベクターによってコード化された治療用遺伝子を含むレトロウイルス粒子の産出をもたらし、前記レトロウイルス粒子が隣接細胞に感染し、前記治療用遺伝子を宿主細胞のゲノムＤＮＡ内に安定して統合させる請求項５〜８のいずれか１項に記載の組成物。

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