JP2001500021A

JP2001500021A - 新規な内部リボソームエントリー部位およびそれを含有するベクター

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Publication number: JP2001500021A
Application number: JP10546672A
Authority: JP
Inventors: マルチェロ、ロペス、ラストラ; キャロリーヌ、ガビュ―ダルリクス; ジャン―リック、ダルリクス
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1997-04-28
Filing date: 1998-04-28
Publication date: 2001-01-09
Also published as: AU7536598A; US6783977B1; AU749250B2; CA2258490A1; WO1998049334A1; EP0918875A1; FR2762615B1; FR2762615A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、内部リボソームエントリー部位としてまたはレトロウイルスベクターパッケージングを可能または改善するエレメントとして、Friendネズミ白血病ウイルス（FMLV）およびMoloneyネズミ白血病ウイルス（MoMLV）を除くＣ型レトロウイルスのゲノムＲＮＡの５’末端の全部または一部から誘導されるヌクレオチド配列の使用に関する。本発明はまた、該ヌクレオチド配列を含むベクター、このベクターから作製されるウイルス粒子、このベクターを含むかまたはウイルス粒子を感染させた細胞、それらの治療的使用およびそれらを含有する医薬組成物に関する。本発明はさらに、多分化能性幹細胞を形質導入または感染するためのベクター、ウイルス粒子または医薬組成物の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】新規な内部リボソームエントリー部位およびそれを含有するベクター本発明は、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ：internal ribosome en try site）としておよび／またはレトロウイルスのキャプシド粒子形成のための細網内皮症ウイルスのゲノムＲＮＡまたはプロウイルスＤＮＡの５’末端から誘導されるヌクレオチド配列の使用に関する。より詳細には、この配列、および特に同じプロモーターの制御下でいくつかの目的の遺伝子の有効かつ安定な発現を可能にするポリシストロニックベクターに関する。本発明により、遺伝子治療用ｂｗクターの分野において有利なアプリケーションが認められる。遺伝子治療のヒトへの応用の可能性についてはもはや議論の余地はなく、これは、遺伝子疾患、感染性疾患およびガンなどの多くの治療に応用されうる。多くの先行技術文献は、特にウイルスベクターにより遺伝子治療を用いる手段について記載している。ベクターは、一般にウイルス遺伝子の少なくとも一部を欠失させることによって得られ、目的の治療用遺伝子に置き換えられる。そのようなベクターは、複製を欠損しているが宿主細胞に感染し得るウイルス粒子を作製するための機能をトランスで欠失した相補株において増殖することができる。これまでに、レトロウイルスのベクターが最も広範に使用されているが、上記のベクターはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルスおよびヘルペスウイルスから誘導してもよい。このタイプのベクター、それらの構成およびそれらの感染様式については、文献に広範に記載されており、当業者が入手可能である。提供すべき情報として、レトロウイルスのゲノムはプラス方向の一本鎖線状RN Aからなる。それぞれ5'および3'末端に存在する調節配列ＲおよびU5ならびにU3 およびＲに加えて、以下の３つの遺伝子を有する：キャプシドタンパク質をコードするgag、逆転写酵素およびインテグラーゼをコードするpolならびにエンベロープタンパク質をコードするenv。キャプシド粒子形成シグナルはU5配列の上流からgag遺伝子のコード領域の開始部分に位置し、ウイルスRNAのウイルス粒子への二量体化およびキャプシド粒子形成に関与する。ゲノムの5'末端はキャップを含み、3'末端はポリアでニル化されている。感染サイクルの間、ウイルスRNAは二本鎖線状プロウイルスDNAに変換されるが、それぞれの末端は転写の開始に必要な逆方向反復配列のLTR（末端反復配列）を伴う。転写は細胞の機構によって行われ、ゲノムおよび亜ゲノムRNAの産生を可能にする。このRNAからウイルスのタンパク質が合成される。レトロウイルスは、それらの形態に基づいてＡ〜Ｄの 4つのサブクラスに分類され得る。Ｃ型の群はともにレトロウイルスの大部分をなし、ほとんどの遺伝子治療ベクターに使用されるMLV（ネズミ白血病ウイルス）およびMSV（ネズミ肉腫ウイルス）ウイルスならびにREV（細網内皮症ウイルス）を含む。本発明のヌクレオチド配列はそれらから誘導される。それは、より有効かつ特にいくつかの目的のタンパク質を効率的に産生し得る遺伝子治療ベクターを有する点で有利でありえる。しかし、同じベクター内にいくつかのプロモーターが存在すると、多くの場合、時間の経過とともに発現の減少または消失さえ生じる。このことはプロモーター配列間の干渉という周知の現象による。このことに関連して、国際出願WO 93/03143の公開により、この問題が解決され、これは内部リボソームエントリー部位（IRES）を使用することを含んでいる。これは、同じプロモーターの制御下に置かれた２つの目的の遺伝子の発現のためのジシストロニックレトロウイルスベクターについて記載している。それらの間にピコルナウイルスのIRESが存在すれば、ジシストロニックmRNAの翻訳の内部開始機構により第２の目的の遺伝子から誘導される発現産物の産生が可能になる。通常、メッセンジャーRNA（mRNA）のレベルでのリボソームの侵入は、すべての真核細胞mRNAの5'末端に位置するキャップを介して生じる。40Sリボソームサブユニットは、タンパク質の合成を開始するための適切なAUGコドンに出合うまでRNAに沿って移動する。一般に、最初のAUGコドンのレベルで開始される。しかし、AUGが文脈中にある（あまり好ましいことではない）場合、40Sサブユニットはより良好な翻訳文中に存在する次のAUGコドンまで持続する（Kozak，1984，Nu cleic Acid Res．12，3873-3893;Kozak，1991，J．Biol．Chem．266，19867-198 70;Pain，1996，Eur．J．Biochem．236，747-771）。しかし、この一般法則にも例外がある。特定のウイルスmRNA中にキャップが存在しないことは、これらのRNAの内部部位でのリボソームの侵入を可能にする別の構造が存在することを示唆する。これまで、これらの構造の多くは、それらの機能のためIRESと呼ばれており、特にピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルス（Pelletier et al.，1988，Mol．Cell．Biol．8，1103-1112）およびEMCV（脳心筋炎ウイルス(Jang et al.，1988，J．Virol．62，2636-2643）））のmRNA などのキャップされていないウイルスmRNAの非コード5'領域において同定されている。IRESエレメントを有する細胞mRNAについても記載されている。BIPタンパク質をコードするmRNA（免疫グロブリン重鎖結合タンパク質について；Macejak and Samow,．1991,．Nature 353，90-94）、特定の増殖因子（Teerink et al.， 1995，Biochem．Biophy．Acts 1264，403-408;Vagner.，1995，Mol．Cell．Biol ．15，35-44）、転写開始因子eIF4G（Gan and Rhoads，1996，J．Biol．Chem．2 71，623-626）および２つの酵母転写因子TFIIDおよびHAP4（Iizuka et al.，199 4，Mol．Cell．Biol.，14，7322-7330）。IRES部位についてもまた、VL30型ネズミレトロトランスポゾン（Berlioz et al.，1995，J．Virol．69，6400-6407）において、およびより最近はFriend（FMLV）およびMoloney（MoMLV）ネズミ白血病ウイルスのgagプロモーターをコードするmRNA（Berlioz and Darlix，1995，J ．Virol．69，2214-2222;Vagner et al.，1995，J．Biol．Chem．270，20376-20 383）において明らかにされている。今回、トリ細網内皮症ウイルス（REV）Ａ型（REV-A）のRNAの非コード5’領域において新規の内部リボソームエントリ-部位を見出し、その後に配置されたコード配列の翻訳をモノシストロニックまたはジシストロニック様式で開始するためのその効率を明らかにした。本発明のIRES部位は、文献に既に記載されているIRESに比べて特に有利である。まず第１に、それは、それが制御するシストロンの高いレベルの発現を可能にする。さらにかつ予想以上に、それは、レトロウイルスベクターの枠組み構造内で、適切なキャプシド粒子形成領域と関連して二量体化またはキャプシド粒子形成機能に寄与するかまたは改善し得、ウイルス力価の増加を可能にする。最後に、それはヒトへの使用を意図したほとんどの遺伝子治療において使用されるネズミレトロウイルス配列に弱い相同性を有するため、その使用は複製-コンピテントウイルスの産生の危険性を顕著に減少する。米国のRAC（DNA組換え審査委員会）に承認されたほとんどの遺伝子治療プロトコルでは、MoMLVウイルスから誘導されるベクターが使用される。現在、特定の治療アプリケーションに特異的なレトロウイルスベクターの選択は、依然として経験によるものであり、ウイルスの力価に影響する因子および遺伝子の発現は未だ明確に解明されていない。キャプシド粒子形成を制御するシス作用配列について研究し、様々なIRESエレメントの相対的強度を確立すれば、力価および遺伝子発現に間して遺伝子治療ベクターを最適化することができる。本発明の目的の１つは、高い力価で増殖し、１つ以上の目的の遺伝子の最適な発現を可能にし得る新規のレトロウイルスベクターを提供することである。従って、本発明の課題は、ベクター内の内部リボソームエントリー部位としておよび／またはレトロウイルスベクターのキャプシド粒子形成を可能または改善するための、Ｆｒｉｅｎｄ（ＦＭＬＶ）およびＭｏｌｏｎｅｙ（ＭｏＭＬＶ）ネズミ白血病ウイルスを除くＣ型レトロウイルスのゲノムＲＮＡの５’末端の全部または一部から誘導されるヌクレオチド配列の使用である。ヌクレオチド配列とは、リボ-（RNA）またはデオキシヌクレオチド（DNA）を含む配列を意味するものと理解されている。本発明の読み取り枠構造内において、レトロウイルスのゲノムRNAの5'末端は、転写開始部位（ヌクレオチド番号１）から3'方向に約２Kb延長しているRNAの5'側の４分の１に相当する。用語「レトロウイルス」は、当業者に入手可能な基本的なウイルス学の手引書に広範に定義されており、上記の提供すべき情報として本質的な特徴が要約されている。用語「誘導される」とは、Ｃ型レトロウイルス由来であるが、天然の配列に比較して少なくとも1つ以上の改変を受けている配列をいう。予想され得る改変としては、1つ以上のヌクレオチド（nt）の欠失、付加、置換および/または変異が挙げられる。例えば、IRESの機能、キャプシド粒子形成機能または以後のクローニング工程を容易にするための適切な制限部位を導入する機能を高めるために、そのような改変を設計してもよい。用語「誘導物」もまた、改変されたまたは改変されていない形態でのゲノムRNAのDNA等価物を含む。 IRESは、キャップとは独立した様式でのリボソームのRNA分子への進入を促進し得る部位を示す。本発明により達成しようとする目的に従い、任意の発現カッセトまたはベクターにおいてIRESの機能を発揮することができる。本発明の読み取り枠構造内において使用されている配列はまた、2コピーのレトロウイルスゲノムの二量体化および／または二量体のウイルス粒子へのキャプシド粒子形成を促進することによって、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターのキャプシド粒子形成を活性化するエレメントとして作用し得る。好ましい実施態様に従い、該配列は、適切なレトロウイルスベクターに導入した時にIRESの機能を発揮し、かつキャプシド粒子形成機能を改善し得る。本発明の読み取り枠構造内で使用されるヌクレオチド配列は、ゲノムRNAの5' 末端またはＣ型レトロウイルスのプロウイルスDNAまたは目的のレトロウイルスフラグメントを保持する任意の状態の工業用プラスミドから単離してもよい。それは、当該分野において使用される任意の技術、例えば、適切なプローブの補助によるクローニング、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）あるいは化学合成によって作製することができるこというまでもない。有利なことに、該配列は5'LTRのU3 ドメインの後のgag遺伝子のイニシエーターであるAUGコドンまでの領域のすべてまたは一部を含む。本発明の目的のために、それは少なくとも50ヌクレオチド、有利には少なくとも100ヌクレオチド、好ましくは少なくとも200ヌクレオチド、好ましくは該5'末端に含まれる少なくとも300ヌクレオチドを含む。しかし、もちろんそれは5'または3'方向に延長するか、あるいはさらなる配列を含むことができる。有利なことに、該配列は100〜1500ヌクレオチド、特に300〜800ヌクレオチドを含む。本発明の枠組み構造内でFMLVおよびMoMLVウイルスを除くＣ型レトロウイルスを使用するのが好ましい。より適切なＣ型レトロウイルスは、REV（細網内皮症ウイルス）およびMSV（ネズミ肉腫ウイルス）ウイルス、特にMoloney（MMSV）、 MHV（Mus hortulanusウイルス）、MEV（マウス内因性レトロウイルス）、FM0V（ FBRネズミ骨肉腫ウイルス）、AMLV（AKVネズミ白血病ウイルス）、MEELV（マウス内因性エコトロピックネズミ白血病ウイルス）、SFFV（Friend脾臓フォーカス形成ウイルス）、RASV（ラット肉腫ウイルス）、FLV（ネコ白血病ウイルス）、F SV（ネコ肉腫ウイルス）、EFLV（ネコ内因性プロウイルスネコ白血病ウイルス）、SSV（サル肉腫ウイルス）、GALV（テナガザル白血病ウイルス）およびBAEV（ヒヒ内因性ウイルス）ウイルスから選択される。好ましい実施態様に従い、本発明において使用されるヌクレオチド配列は、細網内皮症ウイルス（REV）のゲノムRNAの5'末端の全部または一部から誘導される。REVウイルスは、特に様々なＡ、ＢおよびＴサブタイプならびにDIAV（アヒル感染性貧血ウイルス）、SNV（脾臓壊死ウイルス）およびCSV（ニワトリ多核ウイルス）ウイルス（例えば、Encyclopedia of Virology，1994，Enritto，Reticuloe ndotheliosis viruses，p．1227-1232 Ed．R．Webster and A．Granoff，Academ ic Press，Hartourt Brace & Company Publishersを参照のこと）を含む。特に最も適切なREVウイルスはトリ細網内皮症ウイルス、特にＡ型ウイルス（REV-A）である。後者の変異体によれば、REV-Aウイルスの非コード5'末端の少なくとも100ヌクレオチド、多くても800ヌクレオチド（nt）、より詳細には配列番号１に記載の配列の全部または一部に実質的に相同または同一であるヌクレオチドが好ましく使用される。好ましい実施例には、配列番号２の（ｉ）ヌクレオチド番号１で開始しヌクレオチド番号５７８で終了する、（ｉｉ）ヌクレオチド番号２６５で開始しヌクレオチド番号５７８で終了する、または（ｉｉｉ）ヌクレオチド番号４５２で開始しヌクレオチド番号５７８で終了する配列に実質的に相同または同一であるヌクレオチド配列が記載され得る。用語「実質的に相同」とは70％を超える、有利には80％を超える、好ましくは 90％を超える、最も好ましくは95％を超える相同性の程度をいう。既に示しているように、該ヌクレオチド配列は、配列番号１または２に記載の配列とは若干異なる配列を有してもよい。但し、改変はIRESおよび/またはキャプシド粒子形成機能には影響を与えない。有利な様式によれば、本発明の読み取り枠構造内で使用されるヌクレオチド配列は、配列番号２の（ｉ）ヌクレオチド番号１で開始しヌクレオチド番号５７８で終了する、（ｉｉ）ヌクレオチド番号２６５で開始しヌクレオチド番号５７８で終了する、または（ｉｉｉ）ヌクレオチド番号４５２で開始しヌクレオチド番号５７８で終了する配列に同一である。該ヌクレオチド配列のIRES機能は、マグネシウムイオンの低い状況、例えば、細胞の状況において特に有利である。高濃度のMg²⁺イオンは、配列によって媒介される翻訳の開始の効率を低下し得る。本発明において使用されるヌクレオチド配列は、より詳細には１つ以上の目的の遺伝子の導入および発現のためのベクターに組み込むことを意図する。そのようなベクターの選択は広範であり、選択されたベクターへのクローニングのための技術は当業者の能力の範囲内である。本発明により達成しようとする目的に従い、プラスミドベクターまたは動物ウイルス、特にポックスウイルス（カナリア痘ウイルスまたはワクシニアウイルス、特にCopenhageまたはMVA）、アデノウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルスから誘導されるベクターを考慮し得る。そのようなベクターについては、文献に広範に記載されている。特に、アデノウイルスベクターを使用する場合、それをヒトアデノウイルス（好ましくは２または５型）、動物アデノウイルス（好ましくはイヌまたはウシ）から、あるいは様々な種のハイブリッドから誘導してもよい。アデノウイルスに関する一般的技術については、GrahamおよびPrev ecによって開示されている（1991，Methods in Molecular Biology，Vol．7，Ge ne Transfer and Expression Protocols;Ed．E.J．Murray，the Human Press In c.，p．109-118）。本発明により達成しようとする目的に従い、該配列は、それがコードする発現産物の翻訳を増強するために目的の遺伝子の上流に好ましく位置する。それを、（プロモーターの制御下に配置された目的の遺伝子の発現のための）モノシストロニックタイプまたは（同じプロモーターの制御下に配置された少なくとも２つの目的の遺伝子の発現のための）ポリシストロニックタイプの発現カセットにおいて使用してもよい。後者は、いくつかのエレメントをタンデムで含有してもよく、この「目的のIRES部位遺伝子」において少なくとも１つのIRES部位は上記のヌクレオチド配列からなる。第１の目的の遺伝子の上流または第２の上流のいずれかでのジシストロニックカセットの使用が最も好ましく、後者の変異体が好ましい。本発明のベクターがいくつかの発現カセットを含む場合、それらは、同方向（同じ方向でプロモーターが作用する）かまたは逆方向（反対の方向でプロモーターが作用する）のいずれかで相互に相対的に任意の方向で挿入され得る。さらに、本発明のベクターは、本発明に従って使用されるいくつかのヌクレオチド配列を含んでもよい。この場合、それらは、異なるＣ型レトロウイルスから誘導されるのが好ましい。本発明の最も好ましい実施態様によれば、本発明のベクターはレトロウイルスから誘導される。実施例には、トリ赤芽球症ウイルス（AEV）、トリ白血病ウイルス（AVL）、トリ肉腫ウイルス（ASV）、脾臓壊死ウイルス（SNV）およびRous 肉腫ウイルス（RSV）などのトリレトロウイルス、ウシレトロウイルス、ネコレトロウイルス（FLV、FSVなど）、ネズミ白血病ウイルス、Friendウイルス（FMLV ）およびネズミ肉腫ウイルス（MSV）などのネズミレトロウイルスならびに霊長類レトロウイルス（GALV、FSV、BAEVなど）が記載され得る。もちろん、他のレトロウイルスを使用してもよい。しかし、MoMLVウイルスが最も好ましい。文献に記載の多くのレトロウイルスベクターを本発明の枠組み構造内において使用することができる。本発明の目的のために考慮され得るレトロウイルスベクターは、少なくとも機能様式において関連の以下のエレメントを含む:レトロウイルス5'LTRおよびレトロウイルス3'LTR、１つ以上の目的の遺伝子、ならびに該ベクターへのウイルス粒子へのキャプシド粒子形成を可能または改善するための読み取り枠構造内で使用されるヌクレオチド配列および／または該ヌクレオチド配列の下流に位置する目的の遺伝子の発現を可能または促進するためのIRESとしてのヌクレオチド配列。レトロウイルス5'LTRをプロモーターとして使用してもよいが、内部プロモーターを使用することも可能であることはいうまでもない。さらに、5'およびおそらく3'LTRは、ヌクレオチド配列と同じレトロウイルス起源（例えば、REV）を有していてもよく、異なる起源を有していてもよい。例えば、モノシストロニックベクターは、5'から3'に向かって、5'LTR、ヌクレオチド配列、目的の遺伝子、および3'LTRを含む。もちろん、本発明のレトロウイルスベクターは、従来のキャプシド粒子形成領域（E+）も含んでもよい。しかし、本発明において使用されるヌクレオチド配列がそれ自体でキャプシド粒子形成機能を発揮する場合は、後者の存在は必要ではない。レトロウイルス5'LTRがREVウイルス、特にSNVから誘導される場合、そのような実施態様はより詳細に考慮され得、ヌクレオチド配列は、nt１で開始しnt 265で終了するか、またはnt 265で開始しnt 578で終了する配列番号２に記載の配列に実質的に相同または同一である。有利な実施態様によれば、本発明のレトロウイルスるベクターは、少なくとも：（ａ）レトロウイルス5’LRT、（ｂ）キャプシド粒子形成領域、（ｃ）場合によっては前記レトロウイルス5’LTRの起源とは異なる起源の内部プロモーター領域が後に続く第１の目的の遺伝子（ｄ）第２の目的の遺伝子（ｅ）IRES部位（ｆ）第３の目的の遺伝子、および（ｇ）レトロウイルス3’LTR、を含み、少なくとも１つのキャプシド粒子形成領域およびIRES部位は本発明に従って使用される該ヌクレオチド配列からなる。本発明のレトロウイルスベクターが内部プロモーター領域によって指令される発現カセットを含む場合、遺伝子発現を促進するために、後者はレトロウイルス 5'および3'LTRに対して反対の方向にあることが好ましい。他のエレメント、例えば、もう1つのIRES部位およびもう１つの目的の遺伝子またはもう１つの発現カセットを含むことも可能である。本発明の好ましいレトロウイルスベクターは、ネズミレトロウイルス、特にMo MLV、またはVL30型レトロトランスポゾンから誘導されるキャプシド粒子形成領域および配列番号２の（ｉ）ヌクレオチド番号１で開始しヌクレオチド番号578で終了する、（ii）ヌクレオチド番号265で開始しヌクレオチド番号578で終了する、または（iii）ヌクレオチド番号452で開始しヌクレオチド番号578で終了する配列に同一であるヌクレオチド配列を含むIRES部位を含む。特に、キャプシド粒子形成領域がMoMLVから誘導され、ヌクレオチド番号265で開始しヌクレオチド番号578で終了するか、またはヌクレオチド番号452で開始しヌクレオチド番号578で終了する配列番号２に記載の配列と同一のヌクレオチド配列からなるpREV HW-3およびHW-6型ジシストロニックレトロウイルスベクターが記載され得る。もちろん、当業者は、所望の治療効果に従って目的の遺伝子を変更することができる。本発明の目的のために、本発明において使用される目的の遺伝子は、従来の任意の分子生物学的技術により真核細胞生物、原核細胞生物またはウイルスから単離してもよい。目的の遺伝子は、（宿主細胞に相同な）天然において見出される天然のタンパク質に相当するペプチド、あるいはタンパク質フラグメント、様々な起源のポリペプチドの融合物から得られるキメラタンパク質または生物学的特性を改善および／または改変した変異体をコードすることができる。そのような変異体を、１個以上のアミノ酸残基の置換、欠失および／または付加により作製してもよい。さらに、ポリペプチドは、（ｉ）細胞内、（ii）膜（宿主細胞の表面に存在する）あるいは（iii）宿主細胞の外に分泌され得、従って、分泌シグナルまたは膜貫通足場に対する領域をコードする配列などの適切なさらなるエレメントを含み得る。遺伝性または後天性疾患の確立および／または進展を阻害または遅らせ得る発現産物をコードする目的の治療用遺伝子の使用が最も好ましい。本発明のベクターは、嚢胞性線維症、血友病ＡまたはＢ、デュシェンヌ型またはベッカー型ミオパシー、ガン、AIDS、循環器系疾患（再狭窄、動脈硬化症、虚血など）および病原性生物：ウイルス、細菌、寄生生物またはプリオンによる他の感染性疾患の予防または治療が特に意図される。本発明に使用することができる目的の遺伝子は、以下のタンパク質をコードする遺伝子である： −サイトカイン、特にインターロイキン（IL-2、IL-7、IL-10、IL-12など）、インターフェロン、組織壊死因子および増殖（特に造血性）因子（G-CSF、GM-CS F）、 −凝血に関与する因子または補因子、特に、第VIII因子、第IX因子、von Will ebrand因子、アンチトロンビンIII、プロテインＣ、トロンビンおよびヒルジン、 −酵素、特にトリプシン、リボヌクレアーゼ、アルカリホスファターゼ（plap ）およびβ−ガラクトシダーゼ、 −α1-アンチトリプシンおよびウイルスプロテアーゼ阻害剤などの酵素阻害剤 −HSVウイルス（ヘルペスウイルス）I型のチミジンキナーゼ、Saccharomycesc erevisiaeのfur1および／またはfcy1遺伝子の発現産物、リシン、 −イオンチャンネルの活性化剤または阻害剤、 −CFTRタンパク質、ジストロフィンまたはミニジストロフィン、インスリン、 ADA（アデノシンジアミナーゼ）、グルコセレブロシダーゼおよびフェニルヒドロキシラーゼ、 −ガン抑制遺伝子、例えば、p53、p73およびRb遺伝子の発現産物などのガンの開始または促進を阻害し得るタンパク質、 −免疫応答を刺激し得るタンパク質、抗体、主要組織適合性複合体の抗原またはイムノトキシン、 −ウイルス感染またはその発達を阻害し得るタンパク質、例えば、問題のウイルスの抗原性エピトープまたは天然のウイルスタンパク質とともに競合物に侵入し得るウイルスタンパク質の改変体、 −細胞または核受容体あるいはそれらのリガンドの1つ、 −増殖因子（FGF即ち繊維芽細胞増殖因子、VEGF即ち血管内皮細胞増殖因子など）、ならびに −アポトーシスの誘導物質（Baxなど）、アポトーシスの阻害剤（Bc12、Bc1x など）、細胞分裂抑制剤（p21、p16、Rbなど）、一酸化窒素合成酵素（NOS）、アポリポタンパク質（apoAI、apoEなど）、カタラーゼ、SOD、血管形成に作用する因子（PAI即ちプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤など）。さらに、本発明において使用される目的の遺伝子はまた、本発明のベクターをトランスフェクションした宿主細胞を選択または同定し得る選択マーカーをコードしてもよい。抗生物質G418に対する耐性を提供するneo（ネオマイシン）遺伝子、dhfr（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）遺伝子、CAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子あるいはgpt（キサンチンホスホリボシル）遺伝子についても記載され得る。一般に、考慮される宿主細胞において機能性を示すプロモーター、好ましくはヒト細胞は、１つ以上の目的の遺伝子の発現のために使用される。プロモーターの選択は極めて広範であり、当業者の能力の範囲内にある。それは、本発明において使用される目的の遺伝子の発現を自然に制御するプロモーターであっても、任意の起源の他のいずれのプロモーターであってもよい。さらに、それは、特に組織特異的または事象特異的細胞シグナルに対する応答において、構造上の性質または調節可能な性質を有する。例えば、AIDSの場合リンパ球細胞、嚢胞性線維症の場合肺細胞、ミオパシーの場合筋肉細胞のレベルで、目的の遺伝子の発現を標的とするのが有利であり得る。実施例により、本発明の枠組み構造内において適切なプロモーターは、SV40（シミアンウイルス40）、CMV（サイトメガロウイルス）、HMG（ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ）およびTK（チミジンキナーゼ）プロモーター、レトロウイルスを使用する場合はMoMLV、RSVまたはMSVのLTRのようなレトロウイルスLTR、特にアデノウイルスベクターの場合ではアデノウイルスプロモータ−E1Aおよび後期MLP（主要後期プロモーター）、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルスを意図した7.5K、H5R、pK1L、p28およびp11プロモーター、PGKプロモーター（ホスホグリセロキナーゼ）、α1-アンチトリプシン、第IX因子、アルブミンおよびトランスフェリンの肝特異的プロモーター、リンパ球における発現を可能にする免疫グロブリン遺伝子、ならびに最後に肺組織に特異性を示すサーファクタントまたはCFTRタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターから選択してもよい。それらは、腫瘍またはガン細胞において発現を刺激するプロモーターであってもよい。特に、乳ガンおよび前立腺ガンにおいて過剰発現されるMUC-1遺伝子のプロモーター（Chen et al.，1995，J．Clin．Invest．96，2775-2782）、結腸ガンにおいて過剰発現されるCEA（即ち、ガン胎児性抗原）遺伝子（Schrewe et al.，1990，Mol．Cell．Biol．10，2738-2748）、黒色腫において過剰発現されるチロシナーゼ遺伝子（Vile et al.，1993，Cancer Res．53，3860-3864）、乳ガンおよび膵臓ガンにおいて過剰発現されるERB-2遺伝子（Harris et al.，1994 ，Gene Therapy 1，170-175）、肝ガンにおいて過剰発現されるα-フェトプロテイン（Kanai et al.，1997，Cancer Res．57，461-465）、大腸ガンにおいて過剰発現されるAPC、卵巣ガンにおいて過剰発現されるBRCA-1および２（Wooster et al.，1995，Nature 378，789-792）ならびに前立腺ガンにおいて過剰発現されるPSA（即ち、前立腺特異的抗原）について記載され得る。さらに、本発明のおいて使用される目的の遺伝子は、転写および翻訳の両方のレベルでその発現を改善する他の配列：例えば、エンハンサー型転写活性化配列、イントロン配列、転写終了シグナル（polyA）および上記の分泌シグナルまたは膜貫通領域を含んでもよい。本発明はまた、本発明のウイルスベクターから作製されるウイルス粒子を含む。手順は、一般にベクターを適切な細胞株にトランスフェクションすることによって行われる。使用されるウイルスベクターが複製欠損である場合、相補性の株が使用される。一般に、当業者は、感染性ウイルス粒子を作製するために使用され得る株ならびに使用されるベクターに依存して使用される方法を知っている。例えば、アデノウイルスベクターの場合、293株が使用され得る（Graham et a l.，1977，J．Gen．Virol.，36，59-72）。レトロウイルスベクターについては、CRE株（Danos and Mulligan，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85，6460- 6464）またはGP+E-86株（Markowitz et al.，1988，J．Virol.，62，1120-1124 ）などのエコトロピック細胞株の使用を考慮してもよい。しかし、PG13株（Mill er et al，1991，J.Virol.，65，2220-2224）またはPsi Env-am株（Markowitz e t al.，1988，T.A.A.P．Vol．CI，212-218）などのアンホロピック相補株の使用が最も好ましい。一般に、トランスフェクションした相補細胞に対する上清において、感染性ウイルス粒子が回収される。本発明はまた、本発明のベクターを含むか、または本発明の感染性ウイルス粒子で感染した細胞にまで及ぶ。トランスフェクションの方法は当業者に周知である。リン酸カルシウムによる沈殿、DEAE-デキストラン、マイクロインジェクションまたは脂質ビヒクルへのキャプシド粒子形成の技術が記載され得る。さらに、本発明のベクターは、細胞ゲノムに組み込まれた形態で、または核および細胞質の両方においてエピソームの形態で、宿主細胞中に存在し得る。本発明の細胞は、有利には真核細胞、特に哺乳動物の細胞、および好ましくはヒトの細胞である。それは、造血性起源（全能性幹細胞、白血球、リンパ球、単球、マクロファージなど）の初代または腫瘍細胞、肝臓起源、上皮細胞起源、繊維芽細胞、中枢神経系由来であってもよく、最も詳細には、筋肉細胞（筋芽細胞、筋細胞、衛星細胞、平滑筋細胞など）、心細胞、血管細胞、機関細胞、肺細胞または中枢神経系由来の細胞であってもよい。本発明はまた、治療を意図した医薬組成物の製造および/または遺伝子治療により治療可能である疾患、特に遺伝子疾患、ガンまたは感染性疾患などの後天性疾患の予防のための、本発明のベクター、ウイルス粒子または細胞の治療的使用に関する。しかし、そのような使用は、体細胞の遺伝子治療のタイプの応用には限定されない。特に、本発明のベクターを、原核または真核細胞における組換え経路による少なくとも１つの目的の遺伝子によってコードされる発現産物の産生などの他の目的のために使用してもよい。例えば、本発明のヌクレオチド配列を使用するジシストロニック発現ベクターにおける２つの目的の遺伝子の同時発現を考慮することが可能である。第２のシストロンとして抗生物質に対して耐性の遺伝子の同時発現により、第１のシストロンの発現を増加し得る。一方の発現産物が他方にコードされるポリペプチドの成熟を可能にする（例えば、ポリペプチド前駆体および前駆体を成熟ポリペプチドに切断するプロテアーゼ）２つの遺伝子の同時発現により、成熟産物を得ることが可能である。この場合、原核細胞（E．coli など）、下等な真核細胞（酵母、心筋、昆虫など）または動物細胞を使用することができる。次いで、そのような目的の発現産物を回収するべきであり、任意に上清または従来の技術による細胞培養物から精製される。もう１つの可能な使用は、１つ以上の目的の遺伝子のための発現カセットがゲノムに組込まれ、本発明のヌクレオチド配列を含むトランスジェニック動物の生産からなる。これらはマウス、ラット、ウサギ、魚、霊長類または養殖動物（ウシ、ヒツジ、ブタなど）であってもよい。これらのトランスジェニック動物を作製するための技術は公知である。目的のポリペプチドは、従来の様式で、例えば動物の生物学的液体（血液、乳汁など）から回収してもよい。本発明はまた、治療用または予防用薬剤として、本発明のベクター、ウイルス粒子または細胞、あるいは本発明の使用によって得られる目的のポリペプチドを、薬学的に受容可能なビヒクルと組み合わせて含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、従来の様式で製造され得る。特に、治療上有効な量のそのような薬剤は、受容可能なキャリア、希釈剤またはアジュバントと組み合わせられる。それは、任意の投与経路で、単回用量または特定の時間間隔後の反復用量で投与され得る。静脈内、筋肉内、肺内（任意にエアゾル化による）または腫瘍内投与が好ましい。投与しようとする量は、様々な基準、特に治療またはワクチンとしての使用、投与経路、患者、治療しようとする疾患のタイプおよびその進行状態、治療期間、選択されるベクターなどに従って選択される。提供すべき情報として、本発明の医薬組成物は、10⁴と10¹⁴pfu（プラーク形成単位）との間、有利には10⁵と10¹³pfuとの間、好ましくは10¹⁶と10¹¹pfuとの間のウイルス粒子を含む。ベクターを基剤とする組成物は、0.01〜100mgのDNA、好ましくは0. 05〜10mg、最も好ましくは0.1〜５mgを含む用量の形態で処方され得る。処方物はまた、単独または組み合わせて、薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバントまたは賦形剤、ならびに可溶化剤、安定化剤、または保存剤を含んでもよい。組成物は、単回用量で、または複数回用量で、液体形態あるいは使用直前に適切な希釈剤で再構築され得る乾燥形態（凍結乾燥した生成物など）で存在してもよい。さらに、本発明は、遺伝子疾患、ガンおよび感染性疾患を治療する方法に関し、この方法により、治療上有効な量の本発明のベクター、ウイルス粒子または細胞がそのような治療を必要とする患者に投与される。第１の治療プロトコルに従い、それらは直接インビボで、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腫瘍内注射または肺へのエアゾル化により投与され得る。あるいは、患者から細胞（骨髄幹細胞、末梢血リンパ球など）を回収すること、それらを本発明のベクターでトランスフェクションすること、およびそれらを患者に再移植する前にインビトロでそれらを培養することからなるエクスビボ遺伝子治療プロトコルを適応することが可能である。最後に、本発明は、多分化能性細胞、特に中枢神経系の多分化能性細胞のトランスフェクションまたは感染のための本発明のベクター、ウイルス粒子または医薬組成物の使用に関する。以下の図によって、本発明を以下に例示する。図１は、キャップ処理されたまたはキャップ処理されていないRNAのインビトロ合成のためにテンプレートとして使用されるモノシストロニックプラスミドの略図である。それらは、インビボ発現のために使用することができるサイトメガロウイルス前期プロモーター（Po CMV）、インビトロ実験のために使用することができるT7ファージRNAポリメラーゼ（Po T7）をコードする遺伝子のプロモーター、REV-Aウイルスの非翻訳5'末端（リーダー）の様々な部分（pREV CB-95に対する１〜578、pREV CG-53に対する578〜１、pREV CG-54に対してnt268〜452を欠失した１〜578、pREV CG-55に対する265〜578およびpREV CG-56に対する452〜57 8）ならびにＣ末端を切断した分子量約46 kDaのβ−ガラクトシダーゼをコードするLacZ遺伝子（ΔLacZ）を含有する。図２は、キャップ処理されたまたはキャップ処理されていないRNAのインビトロ合成のためにテンプレートとして使用されるジシストロニックモノシストロニックプラスミドの略図である。それらは、インビボ発現のために使用することができるサイトメガロウイルス前期プロモーター（Po CMV）、インビトロ実験のために使用することができるT7ファージRNAポリメラーゼ（Po T7）をコードする遺伝子のプロモーター、neo遺伝子、REV-Aウイルスの非翻訳5'末端（リーダー）の様々な部分（pREV CB-54に対する１〜578、pREV CG-50に対する578〜１、pREV C G-52に対してnt 268〜452を欠失した１〜578、pREV CG-55に対する265〜578およびpREV CG-58に対する452〜578）ならびにＣ末端を切断した分子量約46 kDaのβ −ガラクトシダーゼをコードするLacZ遺伝子（ΔLacZ）を含有する。図3Aは、IRESおよびキャプシド粒子形成領域（Ｅ）として異なるレトロウイルス起源の２つのエレメントならびにレポーター遺伝子としての２つの目的の遺伝子である胎盤アルカリホスファターゼをコードするplapおよびホスホトランスフェラーゼをコードするneoを有するジシストロニックレトロウイルスベクターの略図である。B)MLV由来かつpBR322プラスミド内に配置されたLTRを有するpREVのレトロウイルスベクター。VL30E+は、HaMSLの非翻訳5'領域に対応し、MoMLV E+ はMoMLVのキャプシド粒子形成領域に対応する。C）MoMLVのLTRおよびキャプシド粒子形成領域ならびにEMCVのIRESを有する対照ベクターのpEMCV-CBTV。すべての場合において、ゲノムRNAのキャップ部位（+1位）に対して配列に番号を付す。図４は、トランスフェクションしていないか、または様々なベクターpREV HW またはpEMCV-CBTV（pCB100）でトランスフェクションしラパマイシンで処理する（黒塗りの棒グラフ）かもしくは処理しない（コントロール、点の棒グラフ）GP +E-86細胞において産生されるA)アルカリホスファターゼおよびB)ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを示す。図５は、神経外胚葉細胞Devに適用された形質導入プロトコルの最適化を示す。pEMCV-CBTVウイルス（IRES EMCV)およびpREV HW-3ウイルス（IRES REV-A）を形質導入したDev細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定する。実施例 Sambrookら（1989,Molecular cloning:A Laboratory Manual,2nd ed,Cold Spr ing Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY）に詳述されている一般的な遺伝子工学および分子クローニング技術または市販のキットを使用す際の製造者の推奨に従って、以下に記載の構築を行った。PCR技術は当業者に公知であり、PCRプロトコル、方法およびアプリケーションの手引書（Ed:Innis，Gelfa nd，Sninsky and White，Academic Press，Inc.）に広範に記載されている。プラスミドの増幅はE．coli HB101株1035（recA−）において行われる。さらに、構築において使用されるREV-A配列の位置は、RNA分子を参考にして示し、+1位は、RNA分子の最初のヌクレオチド、即ち転写開始部位に対応する（Darlix et al. ，1992，J．Virol．66:7245-7252）。実施例１：REV-A RNAのリーダー５'末端に位置するIRES部位の同定リボソームの内部結合によるシストロンの翻訳が可能かどうかを決定するために、タンパク質のインビトロ合成の研究を、REV-AのゲノムRNAの５'リーダーフラグメントを含有する一連のモノシストロニックプラスミドおよびジシストニックプラスミドを用いて開始した。１．モノシストロニックプラスミドおよびジシストニックプラスミドの構築 REV-A RNAの配列１〜578、配列265〜578および配列452〜578に対応するDNAフラグメントを、PCRによって、pREVSC-1テンプレート（Darlix et al.，1992，J ．Virol．66，7245-7252）から単離する。当業者によって設計することができる適切なプライマーであって、その末端にNheI部位を有するプライマーが使用される。この酵素で消化した後に、PCRフラグメントを、前もってNheIで切断したベクターpEMCV-M260-837（Berlioz et al.，1995，J．Virol．69，6400-6407）内のLacZ遺伝子の上流に挿入する。使用したLacZ遺伝子は、Ｃ末端側を欠くβ−ガラクトシダーゼ産物をコードする。図１に示すモノシストロニックプラスミドの pREV CB-95（１-578）、pREV CG-55（265-578）およびpREV CG-56（452-578）を得る。ジシストニックプラスミドのpREV CB-54（１-578）、pREV CB-55（265−5 78）およびpREV CG-58（452-578）を図２に示す。これらのジシストニックプラスミドは、前記PCRフラグメントを、NheIで同様に消化したpEMCV-D260-837（pCB 101）（Berlioz et al.，1995，J．Virol．69，6400-6407）のneo遺伝子とLacZ 遺伝子との間に挿入することによって得られる。配列268−452を欠失させたヌクレオチド１−578の増幅は、KpnIおよびSacIによる消化、E．coliのDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントによる処理および再連結を前もって行ったベクター pREVSC-1を使用して行われる。NheIで消化した増幅フラグメントを、NheIで消化したpEMCV-M260-837のLacZ遺伝子の上流、またはNheIで消化したpEMCV-D260-837 のneo遺伝子とLacZ遺伝子との間にクローン化して、それぞれ、pREV CG-54（図１）およびpREV CG-52（図２）を得る。最後に、モノシストロニックなコントロールプラスミドpREV CG-53（図１）およびジシストロニックなプラスミドpREV C G-50（図２）を、REV-Aの配列１−578を有するPCRフラグメントを前記ベクターに逆方向（578−１）で導入することによって構築した。REV-A配列をセンス方向で含有するすべての構築物において、β−ガラクトシダーゼの翻訳開始は、574 −576位に位置するREV-Aのgag遺伝子のAUGコドンの制御下にある。一方、コントロールプラスミドでは、β−ガラクトシダーゼの合成は、PCRにより導入された好ましいコザック配列内に位置するAUGに依存する。２．RNA合成およびインビトロでの翻訳キャップ化RNAおよび非キャップ化RNAを、SspI（LacZ遺伝子内の1240位）によって線状化した１μｇのプラスミドDNAから、T7 RNAポリメラーゼ（mMessage mM achine^TMまたはMAXIscript^TM、Ambion）を使用して、20μｌの反応容量中、供給者により推奨されるプロトコルに従って合成する。DNaseI酵素を用いてDNAテンプレートを処理することによって転写を停止させた後、塩化リチウムの存在下でRNAを沈澱させる。RNAを50μｌのTE緩衝液（10mM Tris-HCl（pH7.5）、１mM E DTA）に溶かした後に、供給者の指示に従って、S-300 MicroSpin^TMカラム（Phar macia BioTech）に通すことによって精製および脱塩を行う。転写されたRNAが損なわれていないことを、臭化エチジウム（0.5μｇ/ml）を含有する0.7％アガロースゲルでの電気泳動により調べる。RNAの最終濃度を分光光度測定により決定する。キャップ化RNAおよび非キャップ化RNA（10μｇ/ml）の翻訳を、RRLセルシステム（Promega）をその初期濃度が50％で使用し、１mCi/mlの[35S]メチオニン（Am ersham）の存在下、31℃で１時間行う。反応液には、酢酸カリウムを120mMの最終濃度で補充する。さらに、ルシフェラーゼRNAを、同じ反応条件下で試験する（陽性コントロール）。RNAの非存在下で行った試験は、陰性コントロールである。平行して、ジシストロニックRNAの翻訳におけるFMDVウイルス（口蹄疫ウイルス）のＬプロテアーゼの効果を調べる。このプロテアーゼは、479位のグリシンと480位のアルギニンとの間で翻訳開始因子eIF4Gを切断し、開始因子活性を有しない２つのペプチドフラグメントにする（Kirchweger et al.，1995，J．Viro l．68，5677-5684）。さらに、Ohlmann et al．（1995，Nucleic Acid Res．23, 334-340；1996，EMBO J．15，1371-1382）により、Ｌプロテアーゼを用いた網状赤血球溶解物の処理は、キャップ化された細胞RNAのインビトロ翻訳を阻害するが、カルジオウイルスIRESによって行われる内部からの翻訳開始は影響を受けないことが示されている。従って、IRESエレメントがREV-Aの５'リーダー内に存在する場合には、Ｌプロテアーゼの存在によって、その翻訳がその制御下にあるシストロンの発現は影響を受けないはずである。この場合、試験には、その初期濃度が50％のRRL Flexiシステム（Promega）、８μｇ/mlのRNA、１mCi/mlの[³⁵S] メチオニン（Amersham）、および従来の方法により精製された30ngの組換えＬプロテアーゼが使用される。反応混合物には、塩化カリウムを80m量の最終濃度で補充する。反応は、31℃で１時間続けられる。サンプルを、62.5mM Tris-HCl（pH 6.8）、２％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) 、10％グリセロール、５％β−メルカプトエタノールおよび0.02％ブロモフェノールブルーで熱変性する。標識タンパク質を、0.2％SDSの12％（重量／容量）ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分析する。neo遺伝子産物およびβ −ガラクトシダーゼは、それぞれ、約28kDaおよび約46kDaの分子量に対応して移動する。キャップ依存性および非依存性の翻訳効率を、スキャナー分析によって定量する（Phospho-Imageur Storm 840,version 4.00，Molecular Dynamics；Im age Quant^TMversion 1.1，Molecular Dynamics）。ジシストロニックベクターの場合、IRESによりその発現が媒介される第２シストロンの発現産物（β−ガラクトシダーゼ）の標識強度を、neo遺伝子の発現レベルで標準化した後に評価する。モノシストロニックベクターのpREV CB-95、pREV CG-53、pREV CG-54、pREV C G-55およびpREV CG-56から得られる非キャップ化RNAの翻訳は、キャップ化RNAと同じくらいの効率であることが観測される。しかし、予想されるように、REV-A 配列（１−578）がアンチセンス方向で存在するプラスミドpREV CG-53から生成するβ−ガラクトシダーゼの量は、REV-A配列をセンス方向で使用している構築物によって得られる量よりもはるかに少ない。ジシストロニックな様式で、REV- Aフラグメントをneo遺伝子とLacZ遺伝子との間で使用している場合、β−ガラクトシダーゼの発現は、機能的なIRESが存在するときだけに見られる（pREV CB-54 、pREV CB-55およびpREV CG-52）。一方、第１シストロン（neo）の発現は、（p REV CG-50を含む）すべての場合において効率的である。上記ベクターおよび参照となるEMCV IRESを含むプラスミドpEMCV-D260-837を用いて行われたインビトロ翻訳の比較試験により、REV-Aの１−578、265−578および452−578のフラグメントは、EMCV IRESによって行われる翻訳よりも効率的に第２シストロンの翻訳を開始し得ることが示される。さらに、Ｌプロテアーゼを用いた網状赤血球溶解物の処理によって、neo遺伝子のキャップ依存的な発現は阻害されるが、IRES依存的なβ−ガラクトシダーゼの発現は実質的に増加する。コントロールのpREV CG- 50については、neoの発現阻害が同様に観測されるが、β−ガラクトシダーゼの発現は、Ｌプロテアーゼによる処理の有無によらず、ほとんど検出できない。指標として、２つのレポーター遺伝子の発現に関するプロテアーゼの効果を以下に示す。表１：FMDV Lプロテアーゼの存在下および非存在下での遺伝子の発現比実施例２：REV-AのIRES配列を含むレトロウイルスベクター一連のレトロウイルスベクターを、IRES部位またはキャップシド粒子形成を増大させるエレメントとしてREV-A配列を使用することによって構築した。図３に、下記の実験において使用した、MoMLV型LTRを有するpREV HW系列のベクターおよびコントロールベクターを示す。LTRがSNV起源である点でのみ、pREV HWと異なる（pMCと命名された）ベクター、およびREV-A配列がLTRに対して逆方向（３' −＞５'）で位置する陰性コントロールもまた構築したが、これらは示されてはいない。すべての分子生物学工程のために、これらのベクターは、プラスミドpBR322に導入されている。１．レトロウイルスベクターの構築コントロールベクターpEMCV-CBTV（pBC101）は、MoMLVから誘導されるLTRおよびキャップシド粒子形成領域に加えて、キャップ依存的に翻訳される胎盤アルカリホスファターゼ（plap）をコードする遺伝子およびEMCV IRES部位に依存して翻訳されるneo遺伝子を含むジシストロニックベクターである（Torrent et al. ，1996，Human Gene Therapy 7，603-611）。 pREV HWベクターを、以下の様式で得た。 pREV HW-1：PCRによって得られ、NheIで消化したヌクレオチド265−578の領域を有するREV-Aフラグメントを、pMLV-CB71（Berlioz and Darlix，1995，J．Virol ．69，2214-2222）のplap遺伝子とneo遺伝子との間にクローン化する。 pREV HW-2：MoMLVの５’LTR配列およびVL30のキャップシド粒子形成配列を有するpVL CBT5（Torrent et al.，1996，Human Gene Therapy 7，603-611）のEcoRI フラグメントを、EcoRIで線状化したベクターpREV HW-1に挿入する。 pREV HW-3：MoMLVの５’LTR配列およびキャップシド粒子形成配列を有するpEMCV -CBTVのEcoRIフラグメントを、EcoRIで線状化したベクターpREV HW-1に挿入する。 pREV HW-4：PCRによって得られ、NheIで消化したヌクレオチド452−578の領域を有するREV-Aフラグメントを、pMLV-CB71のplap遺伝子とneo遺伝子との間にクローン化する。 pREV HW-5：MoMLVの５’LTR配列およびVL30のキャップシド粒子形成配列を有するpVL CBT5のEcoRIフラグメントを、EcoRIで線状化したベクターpREV HW-4に挿入する。 pREV HW-6：MoMLVの５’LTR配列およびキャップシド粒子形成配列を有するpEMCV -CBTVのEcoRIフラグメントを、EcoRIで線状化したベクターpREV HW-4に挿入する。 pMC系列のベクターを、以下の構築スキームに従って得る：SNV LTRを、PCRによって、プラスミドREV-A 2-20-6（O'Rear and Temin，1982，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 79,1230-1234；Darlix et al.，1992，J.Virol．66，7245-7252）から得る。neo遺伝子を、SalIおよびBamHIで消化することにより単離し、次いでベクターpUC19（Gibco BRL）の同じ部位に挿入する。SNV ５’LTR（ヌクレオチド１−861）を、HindIIIおよびSalIで消化し、これらの同じ酵素で前もって切断したpUC19-neoに挿入する。SmaIおよびEcoRIで消化したSNV ３’LTR（ヌクレオチド7230−8300）を上記ベクターにクローン化し、SNV ５’LTR-neo-SNV ３’LTR を含有するpCG-61を得る。平行して、pCG-62と命名したベクターを得る。これは、上記のベクターと、BglII−AvrII、クレノウおよび再連結による処理によって得られるenv配列（ヌクレオチド7230−7691）を欠失していることで異なる。Cla -12APクローン（DGoff）から単離されたplap遺伝子を、SalI部位について前もって欠失させた（EcoRI−SalI消化）ブルースクリプト（bluescript）プラスミドのEcoRI部位およびXbaI部位の間に導入し、その後KpnI−SalIフラグメントの形で再度単離して、それぞれ、pCG-63およびpCG-64を得る。LacZ遺伝子を、SalIおよびBamHIの酵素によってpREV CB-95を部分消化することによって得る。pCG-61 およびpCG-62のSalI部位およびBamHI部位の間にそれを挿入することによって、それぞれ、pCG-65およびpCG-66を得る。最後に、LTR−遺伝子−LTR領域を、Hind III−EcoRI消化によってpCG-62、pCG-64およびpCG-66の各プラスミドから単離し、これらの同じ酵素を用いて切断したベクターpBR322内に挿入できるようにする。pMC1、pMC2およびpHC3を得る。２．感染性ウイルス粒子の生成ならびにウイルス力価測定とレポーター遺伝子pl apおよびneoの発現測定 ATCCから入手可能なエコトロピック（ecotropic）な相補株GP＋E-68（Markowi tz et al.，1988，J．Virol.，62，1120-1124）およびNIH3T3標的細胞（マウス繊維芽細胞）を、37℃で、５％CO₂の存在下、10％の新生児ウシ血清を補充したD MEM培地（ダルベッコ改変イーグル培地、Gibco BRL）中で培養する。GP＋E-68ヘルパー細胞およびNIH3T3標的細胞を、トランスフェクションおよび感染の前日に培養する。ウイルスの感染を、文献に記載されている従来のプロトコルに従って行う。 20μｇのベクターpREV HW-1〜pREV HW-6ならびに参照ベクターpEMCV-CBTVを、 Chen and Okyamaの方法（1987，Mol．Cell．Biol.，７，2745-2753；1988，Bio/ Teclmiques ６，632-637）に従って、平行して、GP＋E-68細胞（５×10⁵細胞／1 0cm培養皿）にトランスフェクションする。安定的および一過性のGP＋E-68培養上清の種々の希釈物を使用して、ウェルあたり２×10⁴細胞の割合で感染の前日に播種したNIH3T3標的細胞に感染させる。ウイルス上清を、あらかじめ（0.45μ ｍフィルターで）ろ過し、８μｇ/mlの最終濃度でポリブレンに曝した。37℃で一晩感染させ、翌日に、新鮮な培地で、細胞を洗浄し培養する。48時間後、plap アルカリホスファターゼを発現する細胞の数を測定するために、細胞を選抜培地（１mg/mlのG418）に入れるかまたは染色する。最初に、固定化を、２％ホルムアルデヒドおよび0.2％グルタルアルデヒドを含有する１×PBSで行う。２回の１ ×PBSでの洗浄を行い、続いて１×PBSで、65℃での30分間の培養を行った後に、細胞をAP緩衝液（１×PBS中に0.1M Tris-HCl（pH 9.5）、0.1M NaCl、50mM MgCl₂ ）で２回洗浄し、染色溶液（AP緩衝液中に、0.1mg/mlの5-ブロモ-4-クロロ-3- インドリルホスフェート（BCIP）、１mg/mlのニトロブルーテラゾリウム塩（NBT ）および１mMレバミゾール）中に５時間置く。この組織化学的な染色実験により、GP＋E-68ヘルパー細胞およびNIH3T3標的細胞におけるアルカリホスファターゼの発現が確認される。組換えウイルスの力価を、エコトロピックなGP＋E-68細胞のトランスフェクション後に測定する。２日間培養した後、ウイルス上清を集め、ウイルス力価の測定（一過性発現）のために使用する。次に、トランスフェクションされた細胞を、１ヶ月間、G418で選抜する。この選抜後、ウイルス力価を、集めた上清で測定する（安定発現）。ウイルス力価は、上清１mlあたりの感染性粒子の数に相当する。限界希釈法を使用して、NIH3T3標的細胞を、ウイルス上清の段階的な希釈物を用いて感染させ、２日間培養した後に、細胞を組織化学的に染色し、計数する。以下に示す結果が得られる（表２）：従来のキャップシド粒子形成領域を有しないベクターのpREV HW-1およびpREV HW-4は、MLVヘルパー株（GP＋E-86）へのトランスフェクション後、感染性ウイルス粒子を生成させることができない。しかし、pMC1ベクターは、SNV D17-C3A2 ヘルパー株（例えば、ATCC CRL8468）のトランスフェクション後、SNVウイルス粒子へのキャプシドによる粒子形成が可能であることが示されるはずである。このことは、ヌクレオチド265−578のREV-A配列が、これに関連して、キャプシド粒子形成領域として使用できることを示す。REV-A配列（265〜578または452〜57 8）および従来のキャプシド粒子形成領域の両方を含むレトロウイルスベクターは、ウイルス粒子を大きな力価で生成する（pREV HW-2、3、5および6）。しかし、 MLVのキャプシド粒子形成領域との連携は、特に好都合であることが見出されている。なぜなら、それによって、この同じキャプシド粒子形成領域およびEMCV I RESを併せ持つ参照ベクターpEMCV-CBTVよりも、２倍（pREV HW-6）〜５倍（pREV HW-3）も大きなウイルス力価が得られるからである。さらに、使用したREV-Aセグメントの大きさのみが異なる同一ベクター（pREV HW-2およびpREV HW-5または pREV HW-3およびpREV HW-6）を用いて得られるデータの比較によって、ヌクレオチド265−578の範囲の配列は、ウイルスRNAのキャプシド粒子形成、従ってウイルス力価を増強するだけでなく、キャプシド粒子形成領域と協同し得ることが示唆される。キャプシド粒子形成と好ましく反応するエレメントは、REV-Aゲノムのヌクレオチド452〜265の間に存在するようである。３．電子顕微鏡法による組換えウイルスの分析対応するベクターによるGP+E-86株のトランスフェクション後に産生される組換えビリオンpREV HWの形態を電子顕微鏡法により分析する。同条件下でpEMCV-C BTVから得られるウイルスおよびFMLV-29株（Friendネズミ白血病ウイルス株29）によるNIH3T3細胞の感染後に得れらる野生型レトロウイルスをコントロールとして使用する。顕微鏡検査の結果は、RNA含量が組換えウイルスの形態に影響しないことを示す。４．plapおよびneoシストロンの発現に対するラパマイシンの効果 GP+E-86細胞を、20μｇのpREV HWまたはpEMCV-CBTV系列のベクターで安定にトランスフェクションし、選択条件（G418）で15日間培養する。70〜80％の集密度で、それらを、20ng/mlの最終濃度でラパマイシンに暴露する。これはキャップ依存性の翻訳に対して阻害効果を有し、細胞株により15〜40％変化する（Beretta et al.，1996，EMBO J．15，658-664）が、キャップ非依存性の翻訳には影響しない。細胞抽出物は、20時間のインキュベーション後に従来通り調製する。簡単に説明すると、細胞を２回１×PBSで洗浄し、10cmディッシュに対して１mlのTEN （40mM Tris-HCl pH 7.5、１mM EDTA、50mM NaCl）中に置き、次いで、掻き取ることによって回収し、低速で遠心分離する。ペレットを100μｌの0.25M Tris-HC l、pH８中に取り、３サイクルの凍結融解を用いて細胞溶解に供する。14,000ｇで10分間の遠心分離後、上清を回収し、酵素試験を行うまで-70℃で保存し得る。Micro BCA試験（Pierce）により最終タンパク質濃度を測定する。細胞抽出物のplapの酵素活性は、分光学的に上昇する（アルカリホスファターゼキット、BI ORAD）。仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ（Boehringer Mannheim）からなる標準と比較してplap単位を測定する。ネオマイシンに対する［γ−³²Ｐ］で標識したリン酸の転移により、neo活性を測定する（Ramesh and Osbome，1991，Anal ．Biochem．193，316-318）。ラパマイシンの非存在および存在下で測定したpla pおよびneo遺伝子の発現の結果を図４および表３に示す。表３：非処理細胞に対する％で示したplapおよびneoシストロンの発現に対するラパマイシンの効果。ベクターpREV HW-1およびpREV HW-4では、ラパマイシンが存在すればキャップ依存性の翻訳が減少し、IRESに依存性の翻訳は増加する。この刺激は、ラパマイシン存在下の翻訳機構に対するより低い競合により表現され得る。２つのIRESエレメントが存在する場合、ラパマイシンの添加は２つの遺伝子の発現の増加を伴う。しかし、発現量のデータは、IRESの相対活性が異なることを示し、このことは、リポソームに対してそれらの間に競合があることを示唆する。要約すると、すべてのデータは、REV-AウイルスのRNA、おそらくキャプシド粒子形成により明確に増加するエレメントの5'リーダーにおける効果的なIRES部位が存在することを示す。最小のIRESエレメントは129ntの配列（452〜578位）内に含有される。実施例３：多分化能性ヒト神経外胚葉細胞の形質導入本研究は、中枢神経系の細胞モデル（ヒト遺伝子治療に対して可能性のある標的）を構成するヒト細胞株Devにおいて実施する。Dev細胞は、神経外胚葉起源（ PNET）のヒト初代腫瘍から誘導され、多分化能性幹細胞と同様の挙動を示す（De rrington et al.，1997，Oncogene、印刷中）。さらに、ニューロンまたはグリア細胞へのそれらの分化を誘導することが可能である（Derrington et al.，199 7、前掲；Dufay et al.，1994，Eur．J．Neurosci．6，1633-1640;Giraudon et al.，1993，Neurosci．52，1069-1079）。本研究では、ジシストロニックベクターpREV HW-3（REV-A IRES 265-578）をコントロールベクターpEMCV CBTV（EMCV IRES）と比較する。 Dev細胞に１／100希釈のウイルス上清を２日間感染させ、次いで固定し、上記のプロトコルに従って組織化学的に染色し、計数する。ウイルス力価は２つのベクターについて同様であり、３×10³TU/mlのオーダーである。形質導入単位（TU /ml）はコロニー数×感染レトロウイルスの希釈対細胞に対して配置された希釈ベクターの全容量（ml）の割合に対応する。２つのneoおよびplapシストロンの発現についても確認する。これを行うために、標的細胞に上記のように１／100希釈のウイルス上清を形質導入し、G418の存在下で３週間選択する。plapに対して特異的な抗体（DAKO）を用いるフローサイトメトリーにより蛍光強度を測定する。ポリクローナル抗体が適切であることが示されるべきである。結果は、形質導入され、G418に対して選択された細胞が plap酵素を産生することを示す。同時に、plap酵素の合成を、耐性コロニーの組織化学的染色により確認する。これらのデータは、ジシストロニックベクターpREV HW-3が中枢神経系から誘導されたヒト細胞を効率的に形質導入し、目的の遺伝子をそれらに移し、第２のシストロンの発現産物の産生を仲介するためのIRESREV-A部位の機能性を確認し得る。さらに、最適化の目的のために、様々な形質導入プロトコルについて研究した。変更内容は、血清の存在または非存在下、あるいは増殖因子（FGF-2）の存在または非存在下における細胞の培養条件、および結成の存在または非存在下におけるウイルスの産生である。ポリトロニックエンベロープGaLV（PG13細胞、ATCC CRL-10686に対する産生）を有するpEMCV CBTVおよびpREV HW-3ウイルスを用いて、以下の６つのプロトコルを比較した。プロトコル１：血清（10％）を伴う培地中での細胞培養、血清（10％）の存在下でのウイルス産生。プロトコル２：血清（10％）を伴う培地中での細胞培養、血清非存在下でのウイルス産生。プロトコル３：血清を伴わない培地中での細胞培養、血清（10％）の存在下でのウイルス産生。プロトコル４：血清を伴わない培地中での細胞培養、血清非存在下でのウイルス産生。プロトコル５：血清を伴わない培地中での細胞培養、血清（10％）の存在、FGF- 2の存在下でのウイルス産生。プロトコル６：血清を伴わない培地中での細胞培養、血清非存在、FGF-2の存在下でのウイルス産生。形質導入されたDev細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定する（図５）。血清非存在下でDev細胞の培養を行う場合、pREV HW-3によって形質導入される細胞の割合は30％を超える。そのような％は、従来のpEMCV CBTVウイルスでは到達されない。増殖因子を添加するのも有利である。使用したすべてのプロトコルのうち、プロトコル５は50％を超えるDev細胞を形質導入することが可能である。これらの結果は、REV-A IRESを保持する本発明のポリシストロニックベクターが、多分化能性神経外胚葉細胞を形質導入するのに機能的であることを示す。ヒト細胞株の効率的な形質導入のためのプロトコルの開発は、遺伝子導入ストラテジー開発の必須項目である。 plapおよびneoシストロンの発現を、ニュ一ロンおよびグリアへの分化後に評価する（Derrignton et al.，1997、前掲）。簡単に説明すると、Dev細胞は、血清およびFGF-2の存在下で分化した表現型を呈するが、血清の非存在下で培養を行う場合、表現型は多分化能性である。形質導入され、G418について選択され、分化したDev細胞に対する抗plap特異的抗体による免疫蛍光の結果は、ニューロンおよびグリア細胞におけるplapの発現を示す。これらのデータは、分化状態が REV-A IRESによって仲介される翻訳を阻害しないことを示唆する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/43 Ａ６１Ｐ 9/08 48/00 9/10 １０３Ａ６１Ｐ 7/04 21/00 9/00 31/00 9/08 31/04 9/10 １０３ 31/12 21/00 33/00 31/00 35/00 31/04 37/00 31/12 43/00 １１１ 33/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 35/00 1/19 37/00 1/21 43/00 １１１ 7/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 5/00 Ａ 1/19 Ａ６１Ｋ 37/465 1/21 37/02 5/10 37/26 7/00 37/66 Ｈ

Claims

【特許請求の範囲】１．ベクター内の内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）としてのおよび／またはレトロウイルスベクターのキャプシド粒子形成を可能または改善するための、Ｆｒｉｅｎｄ（ＦＭＬＶ）およびＭｏｌｏｎｅｙ（ＭｏＭＬＶ）ネズミ白血病ウイルスを除くＣ型レトロウイルスのゲノムＲＮＡの５’末端の全部または一部から誘導されるヌクレオチド配列の使用。２．請求項１に記載のＣ型レトロウイルスがＲＥＶ、ＭＳＶ、ＭＨＶ、ＭＥＶ、ＦＭＯＶ、ＡＭＬＶ、ＭＥＥＬＶ、ＳＦＦＶ、ＲＡＳＶ、ＦＬＶ、ＦＳＶ、ＥＦＬＶ、ＳＳＶ、ＧＡＬＶおよびＢＡＥＶウイルスから選択される、請求項１に記載の使用。３．請求項２に記載のヌクレオチド配列が細網内皮症ウイルスのゲノムＲＮＡの５’末端の全部または一部から誘導される、請求項２に記載の使用。４．請求項３に記載のヌクレオチド配列がトリ細網内皮症ウイルス、特にＡ型のゲノムＲＮＡの５’末端の全部または一部から誘導される、請求項３に記載の使用。５．請求項１〜４のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列が、配列番号１に記載の配列の全部または一部に実質的に相同または同一である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。６．請求項５に記載のヌクレオチド配列が、配列番号２の（ｉ）ヌクレオチド番号１で開始しヌクレオチド番号５７８で終了する、（ｉｉ）ヌクレオチド番号２６５で開始しヌクレオチド番号５７８で終了する、または（ｉｉｉ）ヌクレオチド番号４５２で開始しヌクレオチド番号５７８で終了する配列に実質的に相同または同一である、請求項５に記載の使用。７．請求項６に記載のヌクレオチド配列が、配列番号２に記載の（ｉ）ヌクレオチド番号１で開始しヌクレオチド番号５７８で終了する、（ｉｉ）ヌクレオチド番号２６５で開始しヌクレオチド番号５７８で終了する、または（ｉｉｉ）ヌクレオチド番号４５２で開始しヌクレオチド番号５７８で終了する配列に同一である、請求項６に記載の使用。８．請求項１〜７のいずれか１項に従って使用されるヌクレオチド配列を含む１つ以上の目的の遺伝子の発現用ベクター。９．ポックスウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルス群から選択されるウイルスから誘導されるプラスミドベクターまたはウイルスベクターであることを特徴とする、請求項８に記載のベクター。１０．レトロウイルスから誘導され、かつ機能的様式において関連する少なくとも以下のエレメント：レトロウイルス５’ＬＴＲおよびレトロウイルス３’ ＬＴＲ、１つ以上の目的の遺伝子、ならびにウイルス粒子内へのベクターのキャプシド粒子形成を可能または改善するための請求項１〜７のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列および／または前記ヌクレオチド配列の下流に位置する目的の遺伝子の発現を可能または促進するためのＩＲＥＳ部位としての前記ヌクレオチド、を含む請求項８または９に記載のベクター。１１．前記ヌクレオチド配列がＩＲＥＳ部位として存在し、さらに、前記ヌクレオチド配列に相同であるキャプシド粒子形成領域を含む、請求項１０に記載のレトロウイルスベクター。１２．少なくとも（ａ）レトロウイルス５’ＬＲＴ、（ｂ）キャプシド粒子形成領域、（ｃ）場合によっては、前記レトロウイルス５’ＬＴＲの起源とは異なる起源の内部プロモーター領域が後に続く第１の目的の遺伝子、（ｄ）第２の目的の遺伝子（ｅ）ＩＲＥＳ部位（ｆ）第３の目的の遺伝子、および（ｇ）レトロウイルス３’ＬＴＲ、を含む請求項１０または１１に記載のレトロウイルスベクターであって、キャプシド粒子形成領域およびＩＲＥＳ部位のうちの少なくとも１つが請求項１〜７のいずれか１項に従って使用されるヌクレオチド配列からなるレトロウイルスベクター。１３．内部プロモーター領域、第２の目的の遺伝子、ＩＲＥＳ部位および第３の目的の遺伝子が、レトロウイルス５’および３’ＬＴＲに対して逆方向にある、請求項１２に記載のレトロウイルスベクター。１４．前記キャプシド粒子形成領域がネズミレトロウイルス、特にＭｏＭＬＶ、またはＶＬ３０型レトロトランスポゾンから誘導され、前記ＩＲＥＳ部位が請求項６に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１２または１３に記載のレトロウイルスベクター。１５．前記キャプシド粒子形成領域がＭｏＭＬＶから誘導され、前記ＩＲＥＳ部位がヌクレオチド番号２６５で開始しヌクレオチド番号５７８で終了するか、またはヌクレオチド番号４５２で開始しヌクレオチド番号５７８で終了する配列番号２に記載の配列に同一なヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載のレトロウイルスベクター。１６．ＲＥＶウイルス、特にＳＮＶ、任意の起源のレトロウイルス３’ＬＴＲ、１つ以上の目的の遺伝子、およびキャプシド粒子形成領域としてヌクレオチド番号１で開始しヌクレオチド番号５７８で終了するか、またはヌクレオチド番号２６５で開始しヌクレオチド番号５７８で終了する配列番号２に記載の配列に実質的に相同または同一なヌクレオチド配列から誘導されるレトロウイルス５’ ＬＴＲを含む、請求項１０に記載のレトロウイルスベクター。１７．第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＣＦＴＲタンパク質、ジストロフィン、インスリン、α−、β−またはγ−インターフェロン、インターロイキン（ＩＬ）、特にＩＬ−２から選択される発現産物をコードする目的の遺伝子および選択マーカーを含む、請求項８〜１６のいずれか１項に記載のベクター。１８．請求項８〜１７のいずれか１項に記載のウイルスベクターから作製されるウイルス粒子。１９．請求項８〜１７のいずれか１項に記載のベクターを含むか、または請求項１８に記載のウイルス粒子を感染させた細胞。２０．遺伝子治療によって治療可能な疾患の治療および／または予防用医薬組成物を製造するための請求項８〜１７のいずれか１項に記載のベクター、請求項１８に記載のウイルス粒子あるいは請求項１９に記載の細胞の使用。２１．組換え経路による１つ以上の目的のポリペプチドの製造のため、またはトランスジェニック動物の保護のための請求項８〜１７のいずれか１項に記載のベクター、請求項１８に記載のウイルス粒子あるいは請求項１９に記載の細胞の使用。２２．治療用または予防用薬剤として、請求項８〜１７のいずれか１項に記載のベクター、請求項１８に記載のウイルス粒子、請求項１９に記載の細胞、または請求項２１に記載の使用に従って得られる目的のポリペプチドを、薬学的に受容可能なビヒクルと組み合わせて含む医薬組成物。２３．１０４〜１０１４ｐｆｕ、好ましくは１０６〜１０１１ｐｆｕの請求項１８に記載のウイルス粒子を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の医薬組成物。２４．多分化能性細胞、特に中枢神経系の多分化能性細胞のトランスフェクションまたは感染のための請求項８〜１７のいずれか１項に記載のベクター、請求項１８に記載のウイルス粒子、あるいは請求項２２または２３に記載の医薬組成物の使用。