JP2001502903A

JP2001502903A - レンチウィルスベクター

Info

Publication number: JP2001502903A
Application number: JP10519087A
Authority: JP
Inventors: キングスマン，アラン，ジョン; キングスマン，スーザン，マリー
Original assignee: オックスフォードバイオメディカ（ユーケイ）リミテッド
Priority date: 1996-10-17
Filing date: 1997-10-17
Publication date: 2001-03-06
Also published as: CA2268271A1; GB9621680D0; IL128564A0; NO991742D0; NZ334522A; WO1998017816A1; AU737801B2; ATE520783T1; GB2331522A; EP0939827B1; EP0939827A1; HUP0000442A2; HK1018481A1; NO991742L; AU4712397A; GB9903117D0; HUP0000442A3; BG103334A; CN1195864C; GB2331522B

Abstract

(57)【要約】非分裂性の哺乳動物標的細胞に感染して形質導入を生じさせることができるレトロウィルスベクター粒子であって、このベクター粒子は、HIVなどのレンチウィルスに基づくことができ、ＤＮＡプロウィルスの5'側LTR内に非レンチウィルス発現制御要素を提供するように構築されたＲＮＡゲノムを有している。

Description

【発明の詳細な説明】レンチウィルスベクター本発明は、レトロウィルスベクター粒子、およびレトロウィルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするＤＮＡ構築物に関する。特に、本発明は、遺伝物質を非分裂性細胞または低速分裂性細胞(slowly-dividing cell)に導入することのできるレトロウィルスベクターに関する。ここ最近の間、レンチウィルス(レトロウィルスの小さな亜科)に基づくレトロウィルスベクター系の開発に相当の関心が集まっている。この関心は、第一にHI V感受性細胞に抗HIV治療用遺伝子をターゲッティングするためにHIVに基づくベクターを用いるという意向、第二にレンチウィルスが非分裂性細胞に感染する能力があることから(LewisおよびEmerman 1993J.Virol．68，510)これらのウィルスに基づくベクター系が非分裂性細胞に形質導入できるという予測(例えば、Vil eおよびRussel 1995 Brit．Med．Bull．51，12)に由来する。HIVに基づくベクター系は作成されており(BuchschacherおよびPanganiban 1992 J.Virol．66，2731 )、CD4+細胞および既に記載されているように非分裂性細胞に形質導入するために使用されている(Naldiniら、1996，Science 272，263)。しかし、全般的に、遺伝子導入効率は、同等のマウスレトロウィルスベクター系ほど高くない。今日までに作られたHIVに基づくベクターは、形質導入された細胞中にHIV LTR を両末端に有する組込み型プロウィルスを生じさせる。これは、これらのベクターの使用を限定する。なぜなら、内部プロモーターを使用しない限り、あらゆる挿入遺伝子の発現シグナルとしてLTRを使用しなければならないからである。内部プロモーターの使用には重大な欠点がある(下記参照)。HIVおよび他のレンチウィルスのLTRは、遺伝子発現のためにウィルス特異的要件を有する。例えば、H IV LTRは、ウィルスTatタンパク質の不在下では活性でない(Cullen 1995 AIDS 9 ，S19)。従って、遺伝子発現のための要件を変えるようにLTRを改変することが望ましい。特に、一部の遺伝子治療への応用のために、組織特異的遺伝子発現シグナルが必要となったり、または外因性シグナルに応答するシグナルが必要となったりする。マウスレトロウィルスにおいては、これはよく、MLV LTRのU3領域にあるエンハンサー様要素を、所望のシグナルに応答するエンハンサーと置き換えることによって簡単に達成される。これは、HIVなどのウィルスでは不可能である。なぜなら、これらのウィルスのLTRのU3領域およびR領域内には、ISTおよびTARとして知られる配列が存在し、これらの配列は、遺伝子発現を阻害したりまた異種の(おそらく組織特異的な)制御配列がU3領域に挿入されていると、Tatタンパク質に応答したりしなかったりするからである。(Cullen，1995 AIDS 9，S19;Alonsoら、1994 J．Virol．68，6505;Ratnasabapathyら，1990 4，2061;Senguptaら、1990 PNAS 87，7492;Parkinら、1988 EMBO.J 7，2831)。たとえシグナルが応答性を有していたとしても、Tatを供給しなければならないことは、その系をさらに複雑にし、Tatが腫瘍タンパク質(oncoprotein)のいくつかの性質を有するために望ましくない(Vogelら，1988 Nature 335，606)。全体として上記考察は、LTR内の非レンチウィルス配列から有効な発現を得るためには、HIVおよび他のレンチウィルスベクターのR領域が除去されなければならないことを意味している。本発明者らは、既にPCT/GB96/01230において、レトロウィルスベクターゲノムのU3領域およびＲ領域の両方を置き換える方法を記載している。R領域を置き換えられるという所見は驚くべきものであった。なぜなら、それ以前は、R領域は、ＲＮＡウィルスゲノムを前組込み型(pre-integrated form)のプロウィルスＤＮＡに変換するために逆転写酵素を供給しているウィルスに特有のものであると考えられていたからである。PCT/GB 96/01230は、標的細胞における発現がHIV依存性である治療用遺伝子を送達するためのレトロウィルスベクターを特に記載している。非分裂性細胞または低速分裂性細胞への送達にはふれておらず、この発明をHIVまたはその他のレンチウィルスに基づくベクターに応用することにもふれていない。今回、PCT/GB 96/01230に記載の一般的なアプローチから、U3エンハンサーおよびR領域が選ばれた任意の配列で置換されているHIVに基づくベクターを製造する手段が提供されるが、ただし適切なポリアデニル化および転写終結領域がR領域に含まれている必要がある。本発明は１つの態様において、第１のレトロウィルスに基づくレトロウィルスベクター粒子であって、該レトロウィルスベクター粒子は非分裂性哺乳動物標的細胞に感染して形質導入を生じさせることができ、該レトロウィルスベクター粒子はＤＮＡプロウィルスの形態にある場合に標的細胞ゲノムに挿入され得るパッケージング可能なＲＮＡゲノムを含み、該ＲＮＡゲノムは：ａ）該第１のレトロウィルスのプロモーター機能に置き換わってプロウィルスの5'側ロングターミナルリピート(LTR)内に配置される非レンチウィルス発現制御要素；およびｂ）ａ）の非レンチウィルス発現制御要素の転写制御下におかれ、該LTR の間に配置される１つまたは複数の所定の遺伝子を該ＤＮＡプロウィルス内に提供する配列を含む、レトロウィルスベクター粒子を提供する。別の態様において、本発明は、プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に記載のレトロウィルスベクター粒子のパッケージング可能なＲＮＡゲノムをコードする、ＤＮＡ構築物を提供する。このＤＮＡ構築物において、１つまたは複数の所定の遺伝子が存在してもしなくてもよく、存在しない場合には構築物は１つまたは複数の所定の遺伝子を挿入しうる挿入部位(例えば、制限酵素部位)を有する。さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載のＤＮＡ構築物でトランスフェクトまたは形質導入された宿主細胞を含み、本明細書に記載のレトロウィルスベクター粒子を産生可能なレトロウィルスベクター粒子産生系を提供する。さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載のレトロウィルスベクター粒子の成分をコードする核酸配列のＤＲットを含む、レトロウィルスベクター粒子産生系を提供する。またさらに別の態様において、本発明は、遺伝子治療および遺伝子治療用薬剤の調製における本明細書に記載のレトロウィルスベクター粒子の使用；ならびに本明細書に記載のレトロウィルスベクター粒子を標的細胞に感染させて形質導入を生じさせることを含む、該標的細胞に対して遺伝子治療を行う方法を提供する。本発明はさらに、これらの使用および方法により得られる形質導入された標的細胞を提供する。従って、本発明は医療に使用される遺伝子送達系を提供する。本発明のベクター粒子が第１のレトロウィルスに「基づいている」とは、ベクター粒子がこのレトロウィルスに由来するという意味である。ベクター粒子のゲノムは、このレトロウィルス由来の成分をバックボーンとして含む。ベクター粒子は全体的に、逆転写系および組込み系をはじめとしてＲＮＡゲノムと適合する不可欠なベクター成分を含む。通常、これらには第１のレトロウィルス由来のgag タンパク質およびpolタンパク質が含まれる。第１のレトロウィルスは、好ましくは非分裂性細胞に感染し形質導入する能力を提供するレンチウィルスである。感染プロセスの間、レンチウィルスは、インテグラーゼ、コアタンパク質、およびプロウィルスＤＮＡを含む標的細胞の細胞質中で前組込み複合体(pre-integration complex)を形成する。この複合体は、タンパク質中のシグナル配列により、標的細胞の核膜を通過することができる。他のレトロウィルスは、このタンパク質を欠くか、タンパク質を有していても適切なシグナル配列を有していない。従って、原理的には、レンチウィルス以外のレトロウィルスに、非分裂性細胞への感染能を導入することができると予想される。レンチウィルスの例は、HIV、SIV、FIV、BLV、EIAV、CEV、およびビスナウィルスである。これらの中で、HIVおよびSIVは現時点で最も理解されている。しかし、遺伝子治療に使用するのに好ましいのは非免疫不全性のレンチウィルスである。なぜなら、免疫不全性ウィルスは、安全性の問題および不利益を必然的に伴うからである。通常、非レンチウィルス発現制御要素は、構成的に作用するプロモーター(この用語には公知のプロモーターが一部または全体として含まれる)であるか、もしくは特定の条件下(例えば、調節タンパク質の存在下)でのみ誘導可能な調節プロモーターであり得る。これは、１つまたは複数の所定の遺伝子の発現を( 例えば、特定の細胞型もしくは特定の外因性シグナルが存在する細胞に)限定することを可能にする。例えば、メタロチオネインプロモーターの成分を用いて、遺伝子の重金属誘導が行える。ステロイドホルモンによる発現制御も、別の有用なアプローチであり得る。脳特異的、幹細胞特異的、または腫瘍特異的遺伝子発現シグナルも代替的に用いることができる。非レンチウィルスプロモーターは、レンチウィルス5'側LTRのレンチウィルスタンパク質依存性プロモーター機能に置き換わる。HIVの場合、これは、5'側LTR がそれ以上HIV Tatタンパク質に応答しないということを意味する。Tatは、RのT AR領域に作用する。従って、本発明のHIVに基づくベクターにおいては、TAR構造体による翻訳の低減を避けるために、機能性TAR配列は存在しない。HIV U3領域に含まれるエンハンサー配列も除かれることが好ましい。従って、所望のベクターLTRを得る簡単な方法は、レンチウィルスR領域およびできるだけU3領域を置き換えるが、組込みに必要なU3領域の短い配列などの不可欠なレンチウィルス配列は残すようにすることである。明らかなように、ベクターとして機能するためには、本発明のレトロウィルスベクター粒子は、逆転写系(適合性のある逆転写酵素およびプライマー結合部位) ならびに組込み系(適合性のあるインテグラーゼおよび組込み部位)を有して、プロウィルスへの変換および二本鎖ＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組込みを可能とする必要がある。さらに、ベクターゲノムは、パッケージングシグナルを含む必要がある。これらの系およびシグナルは、以下の実施例により詳細に記載されており、一般的にはベクターの基礎となる第１のレトロウィルスにより提供される。また、本発明のベクターは特定の第１のレトロウィルスに基づいているが、遺伝的に改変されたまたはその他のやり方(例えば、パッケージング細胞系の特定な選択)で改変されたレトロウィルスであり得ることも明らかだろう。例えば、第１のレトロウィルスゲノムのパッケージングされ、逆転写され、組み込まれる能力に必要でない部分を除外することができる。また、例えば、異なるenv遺伝子を用いてベクター系を改変することで、ベクター-宿主域および感染または形質導入する細胞型を変えることができる。上記ベクターの基礎となるレトロウィルスの更に別の要素を含むと有利な場合がある。HIVの場合、機能性revおよびRRE配列を含むことで、ベクターゲノムのR REを含むＲＮＡ転写産物を標的細胞の核から細胞質へ効率的に輸送することが可能になる。プロウィルス5'側LTR内にあるプロモーターの制御下にある１つまたは複数の所定の遺伝子は、所望の効果に応じて選択される。遺伝子治療の目的のためには、治療または予防しようとする症状に対して活性な遺伝子産物をコードする少なくとも１つの治療用遺伝子がいる。あるいは、もしくはそれに加えて、検出可能な産物をコードすることによってマーカーとして作用する所定の遺伝子があってもよい。治療用遺伝子は、例えばアンチセンスＲＮＡ、リボザイム、標的タンパク質のトランス優性(transdominant)ネガティブ変異体、毒素、条件毒素(condit ional toxin)、抗体またはヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する抗原、一本鎖抗体、もしくはがん抑制タンパク質をコードし得る。ＤＮＡプロウィルスのLTRの間にある１つまたは複数の所定の遺伝子は、5'側L TR内のプロモーターの転写制御下にあるが、ベクター由来の別のプロモーターのいずれとも作動可能に連結していない。従って、１つまたは複数の所定の遺伝子の発現は単一転写単位内にある。しかし、以下に記載するように、ベクターゲノム中には別の転写単位が存在し得る。これらの転写単位は、１つまたは複数の所定の遺伝子を含む転写単位を妨害してはならない。２つ以上の遺伝子が存在し、5'側LTRプロモーターの転写制御下にある場合、内部リボザイムエントリー部位(IRES)(例えば、ピコルナウィルスＲＮＡ由来のもの)が存在して、両方の遺伝子が単一の転写産物から別々に翻訳されるようにしてもよい。IRES配列を含むレトロウィルスは他の研究者によって構築されている。また、別の１つまたは複数の遺伝子が、別のプロモーターの制御下におかれて存在してもよい。このような遺伝子は、例えば、選択マーカー、もしくは、上記一覧した治療物質を含みうる更なる治療物質をコードし得る。この遺伝子の発現は構成的で有り得る。これは、選択マーカーの場合、うまくトランスフェクトされたパッケージング細胞、またはレトロウィルスベクター粒子の特に高い力価を示すパッケージング細胞を選択するのに有用であり得る。代替的にもしくはそれに加えて、選択マーカーは、レトロウィルスベクターによりうまく感染されて自身のゲノムにプロウィルスを組み込んだ細胞を選択するのに有用であり得る。遺伝子治療を行う１つの方法は、患者から細胞を抽出し、抽出した細胞にレトロウィルスベクターを感染させ、その細胞を患者に再導入することである。選択マーカーは、患者に再導入する前に、感染もしくは形質導入された細胞を富化する手段、または感染もしくは形質導入された細胞のみを陽性選択する手段を得るために使用され得る。この方法により、治療の成功の機会を高めることができる。選択マーカーは、例えば、薬剤耐性遺伝子、代謝酵素遺伝子、または他の公知の選択マーカーでもよい。しかし、レトロウィルスベクターの多くの遺伝子治療の応用例では、マーカー遺伝子発現の選択は不可能または不必要であることが明らかだろう。実際、選択マーカーの発現は、in vitro研究にとっては便利である一方、in vivoにおいては外来マーカータンパク質に対する細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)の不適切な誘導のために有害となりうる。また、in vivoへの応用では、内部プロモーターを全く持たないベクターが好ましいと考えられる。内部プロモーターの存在は、例えば、パッケージング細胞系から得られる形質導入力価、および組み込まれたベクターの安定性に影響を及ぼし得る。従って、１つ以上の治療用遺伝子をコードするバイシストロン性(bi-cistronic)もしくはポリシストロン性(poly-cistronic) であり得る単一転写単位ベクターが、in vivoでの使用のために設計された好ましいベクターであり得る。本明細書において「遺伝子」という用語は、曖昧に用いられ、所望のポリペプチドをコードする任意の核酸を含むことが明らかだろう。通常、本発明のベクターにより送達される遺伝子はｃＤＮＡである。遺伝子治療の目的のためには、レトロウィルスベクターゲノムが不必要なポリペプチド(即ち、ベクター設計の際の目的となる効果を得るために必要でないポリペプチド)を全くコードしないことが望ましい。いかなる場合にも、レトロウィルスベクターは複製に欠陥のあるものである。従って、ベクターゲノムから、完全長gag-polもしくはenvコード領域、または好ましくはこの両方を排除することが必要である。これには、外来ウィルスタンパク質に対する望ましくない免疫応答を避け、組換えにより複製能のあるレトロウィルスが作られる可能性を低くするという二重の目的がある。また、本発明のレトロウィルスベクター粒子は、低速分裂性であり、MLVなどの非レンチウィルスでは効率的に感染および形質導入できない細胞に感染して形質導入することができる。低速分裂性細胞は、およそ３〜４日に一度分裂する。呻乳動物の非分裂性および低速分裂性細胞としては、脳細胞、幹細胞、末梢で分化したマクロファージ、肺上皮細胞、および他の種々の細胞型がある。また、ある種の腫瘍細胞も含まれる。腫瘍は急速に分裂する細胞を含むが、一部の腫瘍細胞(特に腫瘍の中心にある腫瘍細胞)はめったに分裂しない。本明細書に記載のベクターゲノムをコードするＤＮＡ構築物は、CMVプロモーターなどの高効率プロモーターに連結されることが好ましい。他の高効率プロモーターも公知である。これは、レトロウィルスベクター粒子を産生する宿主細胞中でのベクターＲＮＡの高レベル発現を生じさせる。本発明に用いる適切な宿主またはプロデューサー細胞は、当該技術分野において周知である。多くのレトロウィルスが既に複製欠損ゲノムとパッケージング成分に分割されている。分割されていないものについても、そうするためにこの技術が使用できる。プロデューサー細胞は、gag、pol、およびenvタンパク質などのベクターゲノムによってコードされていないウィルス成分をコードする。gal、pol、およびenv遺伝子を、プロデューサー細胞に導入し、細胞ゲノムに安定に組み込んで、パッケージング細胞系を得ることができる。その後、レトロウィルスベクターゲノムをトランスフェクションまたは形質導入によりパッケージング細胞系に導入し、レトロウィルスベクター粒子を作るのに必要なＤＮＡ配列の全てを有する安定な細胞系を作成する。別のアプローチでは、レトロウィルスベクター粒子を作るのに必要な異なるＤＮＡ配列(例えば、envコード配列、gag-polコード配列、および欠損レトロウィルスゲノム)を、一過性トリプルトランスフェクション(transient triple transfection)により細胞に同時導入する(LandauおよびLittman 1992 J．Virol．66，5110;Soneokaら 1995)。本発明による方法は、既に記載されたものに加えていくつかの利点を有する。まず、治療用転写単位の発現シグナルとして5'側LTRを利用することにより、このベクターゲノムを、形質導入細胞における生産および発現の両方のための単一転写単位ゲノムとすることが可能になる。これにより、両LTR間の内部プロモーターの必要性を回避する。レトロウィルスLTR転写単位内に追加のプロモーターを置くことによる予測不可能な結果については多く記載されている(Bowtellら， 1988 J．Virol．62，2464；Correllら，1994 Blood 84，1812；EmermanおよびTe min，1984 Cell 39，459；Ghattasら，1991 Mol.Cell.Biol．11，5848；Hantzop oulosら，1989 PNA S86，3519；Hatzoglouら、1991 J．Biol.Chem 266，8416;Ha tzoglouら，1988 J.Biol.Chem 263，17798；Liら，1992 Hum.Gen.Ther．3，381 ；McLachlinら，1993 Virol.195，１；Overellら，1988 Mol.Cell Biol．8，180 3；Scharfmanら，1991 PNAS 88，4626；Vileら，1994 Gene Ther 1，307；Xuら，1989 Virol．171，331；Yeeら，1987 PNAS 84，5197)。関連する要因としては、２つのプロモーターの相対的な位置および方向、プロモーターおよび発現遺伝子の性質、ならびに採用しうる選択方法が含まれると思われる。内部プロモーターの存在は、パッケージング細胞系から達成される形質導入力価、および組み込まれたベクターの安定性の両方に影響を及ぼし得る。形質導入後の遺伝子発現の低下は、プロウィルス欠失、およびプロモーター機能停止(promoter shut down)の可逆的な後成機構(epigenetic mechanism)の両方に起因することがある。また、組織培養実験から得られるデータは、ベクターのin vivo性能には無関係であることが多い。これらの考察から、単一のLTRプロモーターを含む単純なレトロウィルスベクターが、遺伝子治療に有望なベクターであるらしいことが示唆される(Correllら1994 Blood 84，1812)。さらに、単一のプロモーターのみを用いるバイシストロン性ベクターの開発により(Adamら，1991 J.Virol 65，4985 )、２つ以上の治療用遺伝子をコードし、対応して効力がより高い単一転写単位ベクターを作成することも可能になろう。 U3領域およびＲ領域に存在するHIV発現シグナルを除去することの第二の利点は、これらのシグナルがこれらの活性に対していくつかの外部影響を受けやすいことである。HIVプロモーターが、種々の原因(例えば、UV、ストレス、他のウィルスなど)により活性化され得ることは知られている(Peterlin,1992 Human Retr oviruses ed．Cullen．IRL Press)。これは、ベクターゲノムの転写状態を制御しづらくする。これらの配列の除去により、治療用遺伝子に対するより強い制御が確実になる。添付の図面において：図１は、本発明のベクターの概略図を示す。図２は、本発明の一般的なHIVに基づくベクターゲノムを示す。図３は、実施例１に記載のHIVに基づくベクターゲノムを示す。図４は、図３のベクターについて3'側LTRの構造をより詳細に示す。図５は、パッケージング成分の模式図である。図６は、本発明のベクターの原理をさらに示す。本発明を図１に概略的に示す。このベクター系は、レンチウィルスLTR欠失(LL D)ベクターと称する。これは、ＤＮＡ分子であり、ここではプロデューサー細胞中のベクターＲＮＡの発現を駆動するためにCMVまたは他の高効率プロモーターが用いられている。この戦略は、HITベクター系と類似している(Soneokaら，1995 Nucl.Acids Res．23，628)。プロデューサー細胞は、適合性レンチウィルス構造タンパク質および酵素を産生するように遺伝子操作されている。従って、これは、いわゆるベクターパッケージング細胞として知られているものである。プロデューサーＤＮＡは、複製するまたは複製しない自律性プラスミドとして使用されるか、またはプロデューサー細胞ゲノムに組み込むことができる。これらの戦略は全て当該分野において公知である(Soneokaら ,1995 Nucl.Acid.Res．23，628；MillerおよびRossman 1989 BioTech．7，980； Miller 1990 Hum.Gene Ther.1，5)。ベクターゲノムのプロデューサーＤＮＡは、少なくとも以下の連続した成分を含み得る。すなわち、高効率プロモーター、別のレトロウィルスに由来するか完全に合成の非レンチウィルスＲ領域、レンチウィルス・インテグラーゼによる組込みに必要な配列および効率的な逆転写に必要な配列を含むレンチウィルスU5領域の全体または一部、プロデューサー細胞のパッケージング成分により認識されるパッケージングシグナル、治療用遺伝子またはリポーター遺伝子または選択マーカーを含む遺伝子および関連した発現シグナルを含み得る内部領域(さらに内部領域は効率的なＲＮＡスプライシングおよび輸送を確実にするための系の成分を含み得る)、レンチウィルス由来の第二鎖のプライマー部位、レンチウィルス・インテグラーゼによる効率的な組込みに必要なレンチウィルスU3領域由来の30〜100ヌクレオチドの短い配列、遺伝子発現の組織特異性または外因性シグナルによる遺伝子調節を与えて治療用遺伝子を適切に発現させ得るような異種プロモーター、末端R領域をもつベクターＲＮＡを作るのに必要な転写終結およびポリアデニル化シグナルと一緒に第１のR領域と同一のR領域を含み得る。このプロデューサーＤＮＡは、レンチウィルスパッケージング系によりパッケージングされたＲＮＡ分子をもたらす。その結果生じたベクター粒子は、このＲＮＡを感受性細胞に送達し、ＲＮＡはレンチウィルス逆転写酵素によりＤＮＡに変換され、これはレンチウィルス・インテグラーゼにより細胞ゲノムに組み込まれる。結果得られたプロウィルスでは、プロデューサーＤＮＡのCMVプロモーター成分が、レンチウィルスU3 領域の末端からの短いレンチウィルス配列および組織特異的なまたは調節された遺伝子発現を与え得る異種プロモーターにより置き換えられている。レンチウィルスＲ領域が全体的に置き換えられているために、組込みベクターゲノム内に阻害性TAR配列は存在しない。実施例実施例１ MLV U3プロモーターおよびMLV R領域を有するHIVに基づくLLDベクター一般的なHIV LLDベクター系の構造を図２に示す。この実施例は図３および図４に示す。これは、以下のように構築している。HIV逆転写の最低要件は、ネガティブ鎖ＤＮＡ合成を開始するためのプライマー結合部位(PBS)、ポジティブＤＮＡ合成を開始するためのポリプリントラクト(polypurine tract:PPT)、ならびに第１の鋳型スイッチ(first template switch)を可能にする5'側および3'側の同一のR配列である。従って、HIV-1由来のPBSおよびPPTをベクターに組み込むこと、およびMLV由来のR配列を両方のLTRに組み込むことが必要となる。5'側のU5 領域内の二次構造は逆転写にとって重要となり得るため、5'側LTR内のU5領域はH IV-1由来である。3'側LTRにあるU5領域には、HIV-1由来のU5を使用して、正確な転写終結がR-U5境界で確実に生じるようにした。しかし、いずれの終結シグナルを使用してもよい。効率的な組込みのために、3'側LTRにおけるHIV-1U3の5'末端に30個のヌクレオチドを組み込んだ。 MLV U3要素は、逆転写後に5'側LTRに生じるようにするために、ウィルスＲＮＡの3'側LTR内になければならない。5'末端側の30bpを除いた全MLV U3でHIV-1 U 3を置き換えた。ベクターの3'側LTRは、いくつかの便利な制限部位を含むように設計し、MLV U3が他の異種プロモーターによって簡単に置き換えられるようにした(図４)。いずれの異種プロモーターも、両端にStuIおよびNarI部位を含むプライマーを使用してＰＣＲにより増幅され、MLV U3に置き換わるように用いられる。StuIだけでなくNheIおよびAflIIもプロモーターカセットの5'末端で用いることができる。NarI(GGCGCC)は、プロモーターとRとの接合部位に配置して、異種プロモーター由来の転写開始部位が保存されるようにする。XbaIとNarIとの間のMLV U3配列は、TATAボックス、GCボックス、およびCAATボックスなどの基本的なプロモーター要素を含む。従って、MLVエンハンサーは、StuI(またはNheIまたはAflII)−XbaIカセットとして他のあらゆるエンハンサーによって置き換えることができる。効率的なパッケージングのために、353ヌクレオチドのgagが十分であることが知られている(Srinivasakumarら，1996 CSH Retrovirus Meeting abstract)。35 3ヌクレオチドのgag配列は790〜1144の配列と対応し、この中で３つのATG(790、 834、894)を突然変異により除去した。さらに、ポリクローニング部位をgagの下流に位置する。 HIVゲノムにコードされるＲＮＡ種の効率的な輸送を得るためには、revおよび RREが必要となる。これらはLLDベクターに含まれ、HIV-1(HXB2)由来の配列5861 〜6403および7621〜9085に対応する。Tatコード配列はベクター中に存在しない。プロデューサーＤＮＡ構築の詳細Ａ．5'側構造体(全てのHIV-1組み合わせ物(coordinates)はLoa Alamos配列データベースから得たHXBに由来し、MoMLV配列はShinnickら1981 Nature 293，543のものである) ベクターの5'側半分は、ハイブリッド5'側LTR(CMVプロモーター-MLV R-HIV-1 U5)、HIV-1 PBS、およびHIV-1パッケージングシグナルを含む。これは、組換えＰＣＲにより構築される。ＰＣＲ用の鋳型の一方であるpHIVdge2はHIV-1プロウィルスＤＮＡであり、これはClaI部位(831)への挿入(filling-in)および再連結、NdeI(6403)とBglII(7621)との間の欠失による突然変異を有する。MLV RとHIV- 1 U5との間の接合は、２回の一次ＰＣＲ反応(プライマーNIT1およびNIT2；NIT3 およびNIT4を使用)、ならびに二次ＰＣＲ反応(プライマーNIT1およびNIT4を使用 )によって作られる。ＰＣＲ産物を、pBluescriptKS+(STRATAGEN)のKpnIおよびXh oI部位に挿入した(構築物A1)。gag領域内の３つのATGを変異させるために、プライマーは変異コドンを含む。 pRV109(Soneokaら，1995)から、ＰＣＲプライマーNIT5およびNIT6を用いたＰＣＲにより両端にKpnl部位を含むようにCMVプロモーター-MLV R断片を増幅し、構築物A1に挿入して構築物A2を作成した。Ｂ．3'側構造体ベクターゲノムの3'側半分は、HIV-1 revコード領域およびRRE、PPT、HIV-1 U 3の5'末端の36bp、ならびに5'末端側の30bpを除いた全MLV LTRを含む。配列(586 1-6000)は、pHIVdge2からＰＣＲで増幅し(NIT7およびNIT8を使用)、pSP64(PROME GA)のBamHIおよびSacI部位にサブクローニングした(構築物B1)。 pHIVdge2由来のSacI-SacI断片(6000〜6403および7621〜9572)を、上記構築物に挿入して、構築物B2を作成した。最後に、２回の一次ＰＣＲ(pHIVdge2を鋳型としてNIT9およびNIT10を使用；pLXSN(受託番号M28248;Millerら，1989)を鋳型としてNIT11およびNIT12を使用)ならびに１回の二次ＰＣＲ反応(NIT9およびNIT1 2を使用)によって、HIV-1-MLVハイブリッドLTRを作成する。このＰＣＲ産物を、構築物B2のXhoIおよびEcoRI 部位に挿入して構築物B3を作成する。Ｃ．完全ベクターベクターの半分である２つを、構築物B3のSpeI-SacII断片を構築物A2に挿入することによって組み合わせた。この結果生じた構築物のC1は、ポリクローニング部位(XhoI-SalI-ClaI-HindIII-EcoRV-EcoRI-PstI-SmaI-BamHI-SpeI(下線部位はベクターにおいてユニーク))を有する。このプラスミドをpLLD1と称し、このプラスミドが生成するレトロウィルスベクターがLLD1である。次いで、pSP72-1acZ(XhoI-BamHI)からβガラクトシダーゼ遺伝子を取り出し、構築物C1のSalIおよびBamHIに挿入して、LLD1-lacZを作った。これを、HIV gag およびpol成分を提供するプラスミド(pRV664、図５)、ならびにHIV由来のgp160 を発現するプラスミド(pRV438またはpSynp160mn、図５)、もしくはVSVGタンパク質を発現するプラスミド(pRV67、図５)のいずれかと共に用いて、293T細胞をトランスフェクトした。同じタンパク質をコードするいずれのプラスミドでも同等にうまく作用するであろう。作成されて生じたウィルスは、gp160を含むウィルスの場合にはlacZ遺伝子をCD4+Hela細胞に導入し、VSVGを有するウィルスの場合にはlacZ遺伝子をCD4-Hela細胞に導入した。さらに、VSVGを有するウィルスはla cZを分裂終了ニューロンに送達する。いずれの場合にも、Xga1染色によって測定したlacZ遺伝子の発現は高く、Tatに対して非依存性であった。実施例２他のLLDベクター実施例１に記載のものと同様の系を、他のレンチウィルスから作成することができる。これらの系では、遺伝子送達系として伴うと考えられる危険性のためにHIVの使用を避ける。例えば、FIV(Talbottら，1989 PNAS 86,5743)、EIAV (Payneら，1994 J.Gen.Virol.75，425)、ビスナウィルス(Sonigoら，1985 Cell 42，369;Queratら，1990 Virology 175，434)、BIV(Garveyら，1990 Virology 1 75，391)、およびSIV(Los Alamos配列データベース)由来の配列情報を用いて構築物を設計できる。図面の表記図２．実施例：HIVに基づくLLDベクター上付きのＨ＝HIV由来配列(いずれのレンチウィルス由来であってもよい) 上付きのＭ＝MLV由来配列 Ψ＝パッケージング部位(gag領域を含む) PBS＝第二鎖のプライマー部位内部＝遺伝子、選択マーカー、他のプロモーター、またはＲＮＡ操作系(HIV RREおよびRevコード配列など)を含む領域。図３．NITベクターゲノム（挿入部3789bp＋バックボーン2929bp＝6718bp） pRV109由来のHCMVプロモーター(-521〜-1) HXB2由来のHIV配列(552〜1144；5861〜6403；7621〜9085) 遺伝子型；gag-;pol-;env-;rev+;RRE;vif-;vpu-;vpr-;tat-;nef- 突然変異：・ATG(790、834、894)を除去するための３箇所の点変異(＠) ・２塩基挿入(831)によるフレームシフト変異(^*) ・NdeI(6403)とBglII(7621)との間の欠失(7621)(Δ) ポリクロ−ニング部位(Ｘ)；XhoI-SalI-ClaI-EcoRV-EcoRI-PstI-SmaI-B amHI-SpeI；下線部位はユニークである。ポリクローニング部位への最大挿入部位：5997bp バックボーン；pBluescriptKS+ 図５．パッケージング成分の模式図 pRV664は、HIV-1HXB2 gag pol(637-5748)をコードし、RRE(7720-8054) 含み、そのバックボーンはpCI-neo(PROMEGA)である。 PRV438は、pSA91中にHXB2(5955-8902)由来のrevおよびenvの両方を有し、CMCプロモーターを有する哺乳動物発現プラスミドである。pSYngp160mn(B．Se edから得た)は、哺乳動物細胞におけるコドンの使用が最適となるように改変されたHIV-1 MNエンベロープの発現プラスミドである。pRV67は、pSA91中のVSV G 発現プラスミドである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者キングスマン，スーザン，マリーイギリス国オーエックス５２エスエフオクソン，イスリップ，ミドルストリート，グレイストーンズ

Claims

【特許請求の範囲】１．第１のレトロウィルスに基づくレトロウィルスベクター粒子であって、該レトロウィルスベクター粒子は非分裂性の哺乳動物標的細胞に感染して形質導入を生じさせることができ、該レトロウィルスベクター粒子はＤＮＡプロウィルスの形態にある場合に標的細胞ゲノムに挿入され得るパッケージング可能なＲＮＡゲノムを含み、該ＲＮＡゲノムは該ＤＮＡプロウィルス内に：ａ）該第１のレトロウィルスのプロモーター機能に置き換わってプロウィルスの5'側ロングターミナルリピート(LTR)内に配置される非レンチウィルス発現制御要素；およびｂ）ａ）の非レンチウィルス発現制御要素の転写制御下におかれ、該LTRの間に配置される１つまたは複数の所定の遺伝子を提供する配列を含む、上記のレトロウィルスベクター粒子。２．前記第１のレトロウィルスがレンチウィルスであり、前記ＤＮＡプロウィルスに通常であれば5'側レンチウィルスタンパク質依存性プロモーター機能をもたらす１つまたは複数のレンチウィルス配列が存在していない、請求項１に記載のレトロウィルスベクター粒子。３．ベクターの基礎となる前記レンチウィルスがHIVであり、機能性TAR配列が存在していない、請求項１または２に記載のレトロウィルスベクター粒子。４．前記ベクターゲノムが機能性revおよびRRE配列をさらに含んで、該ゲノムのRRE含有ＲＮＡ転写産物を標的細胞の核から細胞質に輸送することを可能にする、請求項３に記載のレトロウィルスベクター粒子。５．レンチウィルスＲ領域が非レンチウィルスＲ領域に置き換えられる、請求項２〜４のいずれか１項に記載のレトロウィルスベクター粒子。６．前記非レンチウィルス発現制御要素が、非レンチウィルス調節因子により誘導可能な調節プロモーターである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のレトロウィルスベクター粒子。７．前記調節プロモーターが非ウィルス性調節因子により誘導可能である、請求項６に記載のレトロウィルスベクター粒子。８．前記発現制御要素がMLV LTRプロモーターを含む、請求項１に記載のレトロウィルスベクター粒子。９．前記非レンチウィルス発現制御要素が、レンチウィルス以外の、レトロウィルスのU3領域およびR領域、またはそれらの機能性部分を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のレトロウィルスベクター粒子。 10．前記ＲＮＡゲノムが、第１の非レンチウィルスR領域、組込みおよび逆転写のために十分なレンチウィルスU5領域部分、第一鎖の逆転写のためのプライマー結合部位、パッケージングシグナル、少なくとも１つの所定の遺伝子を含む内部領域、第二鎖の逆転写のためのプライマー結合部位、組込みに十分なレンチウィルスU3領域の短い配列、非レンチウィルスプロモーター、ならびに該第１のＲ領域と実質的に同一の第２のR領域を含む、請求項２〜９のいずれか１項に記載のレトロウィルスベクター粒子。 11．プロモーターと作動可能に連結された、請求項1〜10のいずれか１項に記載のレトロウィルスベクター粒子のパッケージング可能なＲＮＡゲノムをコードする、ＤＮＡ構築物。 12．前記プロモーターが高効率プロモーターである、請求項11に記載のＤＮＡ構築物。 13．前記所定の遺伝子が存在せず、前記構築物が１つまたは複数の所定の遺伝子を挿入しうる挿入部位を有する、請求項11または12に記載のＤＮＡ構築物。 14．請求項11〜13のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物でトランスフェクトまたは形質導入された宿主細胞を含み、請求項１〜10のいずれか１項に記載のレトロウィルスベクター粒子を産生可能な、レトロウィルスベクター粒子産生系。 15．請求項1〜10のいずれか１項に記載のレトロウィルスベクター粒子の成分をコードする核酸配列のセットを含む、レトロウィルスベクター粒子産生系。 16．遺伝子治療のために標的細胞に感染させて形質導入を生じさせるための、請求項1〜10のいずれか１項に記載のレトロウィルスベクター粒子の使用。 17．遺伝子治療に用いる薬剤の調製における、請求項１〜10のいずれか１項に記載のレトロウィルスベクター粒子の使用。 18．請求項１〜10のいずれか１項に記載のレトロウィルスベクター粒子を標的細胞に感染させて形質導入を生じさせることを含む、該標的細胞に対して遺伝子治療を行う方法。 19．請求項16〜18のいずれか１項に記載の使用または方法によって得られる標的細胞。