CN1195864C - 慢病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可以感染和转导不分裂的哺乳动物靶细胞的逆转录病毒载体颗粒，该载体颗粒可以基于HIV等慢病毒，其所含的RNA基因组经构建可以在DNA原病毒的5’LTR区提供非慢病毒表达调控元件。

Description

慢病毒载体
本发明涉及逆转录病毒载体颗粒和编码逆转录病毒载体RNA基因组的DNA构建体。本发明尤其涉及能够将遗传材料转移到不分裂或分裂缓慢的细胞中的逆转录病毒载体。
曾经有一段时间人们非常关注基于慢病毒(逆转录病毒的一个小亚群)的逆转录病毒载体系统的发展。这种兴趣首先始于一种想法，即使用基于HIV的载体对HIV易感细胞靶向抗-HIV治疗剂，随后预测到因为慢病毒能够感染不分裂细胞(Lewis和Emerman，1993病毒学杂志，68，510)，基于这些病毒的载体系统也应该能够转导不分裂细胞(例如，Vile和Russel，1995英国医学公报，51，12)。已经制备了基于HIV的载体系统(Buchschacher和Panganiban，1992病毒学杂志，66，2731)，并且它们已被用于转导CD4+细胞以及不分裂细胞(正如预测)(Naldini等，1996科学272，263)。然而，基因转移效能与鼠逆转录病毒载体系统相比通常并不高。
目前制备的基于HIV的载体在转导细胞中产生末端整合HIV LTR的原病毒。这限制了该载体的使用，因为LTR必须被用做插入基因的表达信号，否则必须使用内部启动子。使用内部启动子有明显的缺点(见后)。HIV和其他慢病毒LTR具有基因表达的病毒特异性要求。例如，在缺乏病毒Tat蛋白时，HIV LTR没有活性(Cullen，1995，爱滋病，9，S19)。因此有必要改变LTR以便适应基因表达的需要。尤其需要用于基因治疗的组织特异性基因表达信号或对外源信号发生反应的信号。对于鼠逆转录病毒通常可以通过在MLV LTR的U3区用对需要的信号发生反应的增强子代替类增强子元件简单地实现。对于HIV病毒这是不可行的，因为它们LTR的U3和R区是IST和TAR序列，当异源或组织特异性调控序列插入U3区时它们会抑制基因表达，并且有时对Tat蛋白敏感有时不敏感(Cullen，1995，爱滋病，9，S19；Alonso等，1994，病毒学杂志，68，6505；Ratnasabapathy等，1990，4，2061；Sengupta等，1990，PNAS 87，7492；Parkin等，1988 EMBO杂志，7，2831)。即使对信号感应也不期望提供Tat，因为这会进一步使该系统复杂化，并且Tat具有某些肿瘤蛋白的性质(Vogel等，1988，自然，335，606)。总之，这些考虑意味着如果想获得LTR中非慢病毒序列的有效表达必须除去HIV和其他慢病毒载体的R区。
我们已经在以前的专利PCT/GB96/01230中描述了替换逆转录病毒载体基因组的U3和R区的方法。惊奇地发现R区可以被替换，因为以前认为这是具有将RNA病毒基因组转化成原病毒DNA的预整合型的逆转录酶的病毒的专属性质。PCT/GB 96/01230特别描述了逆转录病毒载体用于传送靶细胞中HIV依赖性表达的治疗基因。没有提到传送是针对不分裂或分裂缓慢的细胞，也没有提到本发明基于HIV或其它慢病毒载体的用途。PCT/GB 96/01230描述的概括性研究提供了制备HIV载体的方法，其通过选择R区含有合适多聚腺苷区和转录终止区的序列替换U3增强子和R区实现。
本发明一方面提供基于第一逆转录病毒的逆转录病毒载体颗粒，所述逆转录病毒载体颗粒能够感染和转导不分裂哺乳动物靶细胞，所述逆转录病毒载体颗粒包括可包装的RNA基因组，当其处于DNA原病毒形式时能够被插入靶细胞基因组，所述RNA基因组包括DNA原病毒中提供的序列：
a)定位在原病毒5’长末端重复序列(LTR)中的非慢病毒表达调控元件代替第一逆转录病毒启动于功能；
b)选择基因由a)中所述的非慢病毒表达调控元件转录调控，所述选择基因定位在LTR之间。
本发明另一方面，提供基于逆转录病毒的逆转录病毒载体颗粒，所述逆转录病毒载体颗粒能够感染和转导不分裂哺乳动物靶细胞，所述逆转录病毒载体颗粒包含可包装RNA基因组，当其处于DNA原病毒型时能够插入靶细胞基因组，所述RNA基因组包括一些序列，当所述序列被反转录为DNA原病毒时能提供：
a)非慢病毒R区；
b)代替逆转录病毒启动子功能、定位于原病毒5’长末端重复序列的非慢病毒表达调控元件；
c)受b)中所述非慢病毒表达调控元件转录控制的选择基因，选择基因定位在长末端重复序列中间，并且
其中RNA基因组包括整合进靶细胞基因组必需的慢病毒序列。
另一方面，本发明提供编码本文描述的逆转录病毒载体颗粒的可包装RNA基因组的DNA构建体，其有效地连接于启动子。DNA构建体中，可以存在选择基因，也可以不存在，这种情况下，该构建体具有插入位点例如限制性酶位点，选择基因可以插入该位点。
再一方面，本发明提供了逆转录病毒载体颗粒制备系统，包括用本文描述的DNA构建体转染或转导宿主细胞，所述系统能够制备如本文描述的逆转录病毒载体颗粒。
另一方面，本发明提供了逆转录病毒载体颗粒制备系统，包括编码如本文描述的逆转录病毒载体颗粒成分的一系列核酸序列。
另一方面，本发明提供了本文描述的逆转录病毒载体颗粒在基因治疗方面的应用和在制备用于基因治疗的药物中的应用；对靶细胞进行基因治疗的方法，该方法包括用本文描述的逆转录病毒载体感染和转导靶细胞。本发明还提供了从这些应用和方法得到的转导靶细胞。因此本发明提供了药物应用的基因传送系统。
“本发明的载体颗粒基于第一逆转录病毒”指该载体颗粒来源于逆转录病毒。该载体颗粒基因组包括逆转录病毒成分的骨架。该载体颗粒作为一个整体包含与RNA基因组相容的基本载体成分，即逆转录系统和整合系统。通常它们包括来源于第一逆转录病毒的gag和pol蛋白。
该第一逆转录病毒最好为具有感染和转导不分裂细胞能力的慢病毒。感染过程中，慢病毒在含整合酶、核蛋白和原病毒DNA的靶细胞的细胞质内形成预整合复合物。复合物能够以蛋白信号序列方式穿过靶细胞的核膜。其他逆转录病毒或者缺乏蛋白，或者有蛋白但没有合适的信号序列。因此期望赋予非慢病毒的逆转录病毒感染不分裂细胞的能力原则上是可能的。
慢病毒的例子有HIV、SIV、FIV、BLV、EIAV、CEV和维斯纳病毒。其中HIV和SIV是目前了解最清楚的。然而，基因治疗应用优选非免疫缺陷慢病毒，因为免疫缺陷病毒不可避免地引起安全性考虑和一些偏见。
非慢病毒表达调控元件通常为一种启动子，该术语包括已知启动子的部分或全部，其可以作为组成性功能运作，也可以是仅在某些条件下(例如，存在调控蛋白)可诱导的调节启动子。这使得选择基因限制性表达，例如表达于特别细胞种类或存在特别外源信号的细胞。例如，使用金属硫蛋白启动子可以实现基因的重金属诱导。类固醇激素的表达调控也许是另一种有用的研究方向。另外也可以使用脑特异性、干细胞特异性或肿瘤特异性基因表达信号。
非慢病毒启动子代替慢病毒5’LTR的慢病毒蛋白依赖的启动子功能。对于HIV，这意味着5’LTR不再对HIV Tat蛋白有反应。Tat作用在R的TAR区；因此在本发明的基于HIV的载体中，功能性TAR序列缺失以避免TAR结构导致的翻译的减少。最好还包括HIV U3区包含的增强子序列。因此获得需要的载体LTR的最简单的方式就是替换慢病毒R区以及尽可能替换U3区，但是其余的基本慢病毒序列例如U3区的短序列对于整合是必要的。
就象即将说明的，为了行使载体功能，本发明的逆转录载体颗粒必须有逆转录系统(相容的逆转录酶和引物结合位点)和整合系统(相容的整合酶和整合位点)，其能够促使转化成原病毒以及双链DNA整合到宿主细胞基因组。另外，该载体基因组必须包含包装信号。这些系统和信号在下面的实施例中将更详细地描述，它们基本上由该载体来源的第一逆转录病毒提供。同时还将表明虽然本发明的载体基于特别的第一逆转录病毒，它也可以是本发明逆转录病毒的遗传工程或其他(例如，包装细胞系统的特异性选择)的改变型。例如，部分第一逆转录病毒基因组由于非包装、进行逆转录和整合能力所必需而被排除。载体系统也可以改变，例如使用不同的env基因改变载体宿主区和感染或转导的细胞。
进一步包括改造成载体的逆转录病毒的成分也许更有利。对于HIV可以包括功能rev和RRE序列，实现含载体基因组RNA转录物的RRE有效地从靶细胞的细胞核运输到细胞质中。
在原病毒5’LTR中启动子控制下的选择基因可以通过要获得的效应来选择。用于基因治疗目的，该选择基因至少应该有一种编码具有抗需要治疗或防止症状活性的基因产物的治疗基因。换一种方式或附加一种方式，选择基因可以是编码可检测产物的标识物。治疗基因可以编码例如反义RNA、核酶、靶蛋白的反式显性负突变体、毒素、条件毒素、诱导抗体或辅助T细胞或细胞毒T细胞的抗原、信号链抗体或肿瘤抑制蛋白。
DNA原病毒中LTR之间的选择基因在5’LTR启动子的转录调控下，而不是有效地连接于任何其它该载体的启动子。因此，选择基因的表达是单一转录单位。然而，就象下面将详细描述的，可以在载体基因组中附加转录单位。其不应该干扰含选择基因的转录单位。
当存在两个或更多基因并且这些基因在5’LTR启动子的转录调控下时，可以有内部核糖体进入位点(IRES)，例如来源于微小RNA病毒RNA的IRES，使得每个基因可以被单独地从单一转录单位翻译。插入IRES序列的逆转录病毒已经由其他人构建。
也可以存在另一种由单独启动子调节的基因。所述基因可以编码例如选择性标识物，或上面列出的治疗药物中的一种。该基因的表达可以是组成型的；当该基因为选择性标识物时，这对于成功地选择转染的包装细胞、或能够生产特别高滴度逆转录病毒载体颗粒的包装细胞是有用的。换一种方式或附加一种方式，选择性标识物也许对于选择逆转录病毒载体成功感染的细胞以及具有原病毒整合到其自身基因组的细胞有用。
基因治疗的一种方式是提取病人细胞，用逆转录病毒载体感染提取的细胞，将该细胞导入所述病人。选择性标识物可以用于在将细胞重新导入病人前富集感染细胞或转导细胞，或者对已经被感染或转导的细胞提供阳性选择条件。该程序可以增加治疗成功的机会。选择性标识物可以是：例如药物抗性基因、代谢酶基因、或任何本领域已知的选择性标识物。
然而，显然对于逆转录病毒载体的一些基因治疗应用，标识物基因表达的选择也许不可能或不必要。事实上，选择性标识物基因的表达虽然在体外研究很方便，但在体内却是有害的，这是因为不适当地导入了针对外源标识物蛋白的细胞毒T淋巴细胞(CTL)。在体内应用中，可能优选没有任何内部启动子的载体。内部启动子的存在会影响例如从包装细胞系获得的转导滴度以及整合载体的稳定性。因此，包含编码一种、两种或多种治疗基因的双-顺反子或多-顺反子的单一转录单位载体也许是设计为体内使用的优选载体。
显然，术语“基因”本文含义较广泛，包括任何编码所需多肽的核酸。通常，本发明载体传送的基因是cDNA。
为基因治疗目的，期望逆转录病毒载体基因组不编码任何不必要的多肽，即对于获得载体被设计应发挥作用不必要的多肽。任何情况下，逆转录病毒载体是复制缺陷的。因此，需要从载体基因组中排除全长gag-pol或env编码区，或者优选二者都排除。这有双重目的：避免不想要的抗外源病毒蛋白免疫反应；减小重组产生的复制活性逆转录病毒的可能性。
本发明的逆转录病毒载体颗粒也可以感染和转导分裂缓慢的细胞，以及非慢病毒例如MLV不能够有效感染和转导的细胞。分裂缓慢的细胞大约每三到四天分裂一次。哺乳动物不分裂细胞和分裂缓慢细胞包括脑细胞、干细胞、定期分化的巨噬细胞、肺上皮细胞和各种其它类型的细胞。还包括某种肿瘤细胞。虽然肿瘤包括快速分裂细胞，但是一些肿瘤细胞特别是肿瘤中心的细胞很少分裂。
本文所述的编码载体基因组的DNA构建体最好连接于高效启动子例如CMV启动子。其它高效启动子也已公开。这促使载体RNA在产生逆转录病毒载体颗粒的宿主细胞中高水平表达。
本发明使用的合适的宿主细胞或制备细胞是本领域熟知的。一些逆转录病毒已被分成复制缺陷基因组和包装成分。对于那些没有分开的逆转录病毒也提供了操作方法。制备细胞编码不被载体基因组编码的病毒成分，例如gag，pol和env蛋白。gag，pol和env基因可能被导入制备细胞并被稳定整合到细胞基因组形成包装细胞系。然后逆转录病毒载体基因组通过转染或转导导入包装细胞系以产生具有制备逆转录病毒载体颗粒所有需要的DNA序列的稳定细胞系。另一种方法是将制备逆转录病毒载体颗粒需要的不同DNA序列例如env编码序列、gag-pol编码序列和缺陷逆转录病毒基因组通过瞬时三重转染同步导入细胞(Landau和Littman，1992，病毒学杂志，66，5110；Sonelka等，1995)。
本发明方法除了已经描述过的还有几个优点。首先，使用5’LTR作为治疗性转录单位的表达信号可能使得该载体基因组作为一个转录单位基因组在转导细胞中制备和表达。这避免了LTR之间内部启动子的需求。很多文献报道了在逆转录病毒LTR转录单位放置其它启动子导致不可预测的结果(Bowtell等，1988，病毒学杂志，62，2464；Correll等，1994，血液，84，1812；Emerman和Temin，1984，细胞，39，459；Ghattas等，1991，细胞分子生物学，11，5848；Hantzopoulos等，1989，PNAS，86，3519；Hatzoglou等，1991，生物与化学杂志，266，8416；Hatzoglou等，1988，生物与化学杂志，263，17798；Li等，1992，人类基因治疗，3，381；McLachlin等，1993，病毒学，195，1；Overell等，1988，细胞分子生物学，8，1803；Scharfman等，1991，PNAS，88，4626；Vile等，1994，基因治疗，1，307；Xu等，1989，病毒学，171，331；Yee等，1987，PNAS，84，5197)。影响因素似乎包括两种启动子的相对位置和方向，启动子和表达基因的性质，以及可以采用的选择程序。内部启动子的存在既影响从包装细胞系获得的转导滴度又影响整合载体的稳定性。原病毒缺陷和启动子闭锁的可逆后生机制可以导致转导后基因表达能力的丢失。另外，组织培养研究数据通常并不涉及载体的体内操作。这些因素意味着包含单一LTR启动子的简单逆转录病毒载体可能更适于载体的基因治疗(Correll等，1994，血液，84，1812)。另外，随着应用一种启动子的双顺反子载体的发展(Adam等，1991病毒学杂志，65，4985)，还可能相对更高效地制备编码两种或多种治疗基因的单一转录单位载体。
除去U3和R区内HIV表达信号的第二个优点是这些信号的活性受到大量外部影响。已知HIV启动子可以被大量因素激活，例如UV、压力、其它病毒等(Peterlin 1992人类逆转录病毒，Cullen编，IRL出版社)，其使得载体基因组的转录状况难以控制。除去这些序列将确保较好地控制治疗基因。
附图简介
图1为本发明载体的大体示意图。
图2表明本发明的基于HIV的载体基因组基本成分。
图3表明实施例1中描述的基于HIV的载体基因组。
图4更为详细地表明图3载体3’LTR的结构。
图5为包装成分的示意图。
图6进一步表明本发明载体的原理。
图1显示了本发明的轮廓。载体系统被设计为慢病毒LTR-缺陷(LLD)载体。它包括一种DNA分子，其中CMV或其它高效启动子被用于启动制备细胞中载体RNA的表达。该方法类似于HIT载体系统(Soneoka等，1995核酸研究，23，628)。该制备细胞将被工程化以制备相容的慢病毒结构蛋白和酶。因此它将成为所称的载体包装细胞。所述制备DNA既可以是可复制的自主质粒也可以是不可复制的自主质粒，或者它可以插入制备细胞基因组。所有这些方法本领域都已知(Soneoka等，1995核酸研究，23，628；Miller和Rossman 1989生物工程7，980；Miller 1990，人类基因治疗，1，5)。载体基因组的制备DNA应至少包含下列相关成分：高效启动子，或者来自其它逆转录病毒或者完全合成的非慢病毒R区，含通过慢病毒整合酶进行整合必须的序列和有效逆转录必需序列的慢病毒U5区的全部或部分，制备细胞的包装成分可以识别的包装信号，含治疗基因或报告基因或选择性标识物基因以及相关表达信号的内部区(内部区还可以包含保证RNA有效剪接和运输的系统成分)，来自慢病毒的第二条链引物位点，慢病毒整合酶有效整合所需的来自逆转录病毒U3区30-100个核苷酸的短序列，通过外源信号可以赋予基因表达或调节组织特异性使治疗基因可以适当地表达的异源启动子，与第一个R区相同的R区以及制备具有末端R区的载体RNA所需的转录末端和多聚腺苷信号。该制备DNA产生由慢病毒包装系统包装的RNA分子。产生的载体颗粒将运送所述RNA进入易感细胞，RNA将由慢病毒逆转录酶转变成为DNA，并且其还将被慢病毒整合酶整合到细胞基因组中。产生的原病毒的制备DNA的CMV启动子成分将被来自慢病毒U3区末端的短慢病毒序列和可以赋予组织特异性和调控基因表达的异源启动子代替。因为慢病毒R区已经被完全替换，因此在整合的载体基因组中无抑制性TAR序列。
                         实施例
实施例1
基于HIV的具有MLV U3启动子和MLV R区的LLD载体
图2显示了一般的HIV LLD载体系统的结构。图3和图4显示了本实施例。其如下述构建。HIV逆转录至少需要引物结合位点(PBS)以起始负链DNA合成，多聚嘌呤区(PPT)以起始正链DNA合成，以及同样的5’和3’R序列以使得第一模版转换。因此需要将来自HIV-1的PBS和PPT插入载体并且将来自MLV的R序列插入两个LTR中。因为5’U5区的二级结构对于逆转录很重要，所以5’LTR中的U5区来自HIV-1。对于3’LTR的U5区，来自HIV-1的U5用于确定R-U5边界发生的正确的转录终止。然而，可以使用任何末端信号。可以插入HIV-1 3’LTR U3区5’端的30个核苷实现有效整合。
为了逆转录后MLV U3元件在5’LTR出现，它必须在病毒RNA的3’LTR内。除了5’末端30个核苷全部MLV U3替换了HIV-1 U3。载体3’LTR设计为包含几种方便的限制性位点，以便MLV U3可以轻易地由其它异源启动子替换(图4)。异源启动子通过PCR使用在每个末端都包含Stul和Narl位点的启动子扩增，并且将用于替换MLV U3。不仅Stul而且Nhel和Aflll也可以被用在启动子盒的5’端。Narl(GGCGCC)定位在启动子和R区的连接处，以便保留来源于异源启动子的转录起始位点。Xbal和Narl之间的MLV U3序列包含基本启动子元件，例如TATA盒，GC盒，和CAAT盒。因此可以用任何其它增强子例如Stul(或Nhel或Aflll)-Xbal盒替换MLV增强子。
已知gag的353个核苷酸对于有效包装已经足够(Srinivasakumar等，1996，CSH逆转录病毒会议摘要)。gag序列的353个核苷酸相当于从790-1144的序列，其中三个ATG(790、834、894)被突变除去。另外一个多克隆位点定位于gag的下游。
为了有效运输HIV基因组编码的RNA，需要rev和RRE。它们包括在LLD载体中，相当于HIV-1(HXB2)的序列5861-6403和7621-9085。载体中不含Tat编码序列。
制备DNA的构建：
A.5’结构(所有HIV-1等同物来源于Loa Alamos序列数据库的HXB， MoMLV序列来自Shinnick等(1981，自然，293，543))
载体的5’一半包含杂合5’LTR(CMV启动子-MLV R-HIV-1 U5)、HIV-1 PBS、和HIV-1包装信号。它用重组PCR构建。PCR的一条模板——pHIVdge2是一种HIV-1原病毒DNA，其中的突变由以下方法产生：在Clal位点(831)补平并重新连接，在Ndel(6403)和Bglll(7621)之间产生缺失。MLV R和HIV-1 U5之间的连接由两个初级PCR反应(使用引物NIT1和NIT2；NIT3和NIT4)和一个次级PCR反应(使用引物NIT1和NIT4)产生。PCR产物插入pBluesriptKS+(STRATAGEN)的Kpnl和Xhol位点(结构A1)。为了突变gag区的三个ATG，引物包含突变密码子。
NIT1：5’-ccgggtacccgtattcccaataaagcctcttgctgtttgca-3’(SEQ IDNO：1)
NIT2：5’-ctacgatctaattctcccccgcttaatactgacgctctcgcacctatctc-3’(SEQ ID NO：2)
NIT3：                                                   5’-
gcgggggagaattagatcgtagggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaat
ataaattaaaacatatagtttggg-3’(SEQ ID NO：3)
NIT4：5’-gaattctcgaggcgtgctgtgcttttttctatc-3’(SEQ ID NO：4)
CMV启动子-MLV R片段通过使用NIT5和NIT6 PCR引物从pRV109(Soneoka等，1995)用PCR扩增，以使其在两个末端均含有Kpnl位点，然后其被插入构建体A1以产生构建体A2。
NIT5：5’-gtaggtacccgttacataacttacggtaaatg-3’(SEQ ID NO：5)
NIT6：5’-agaggctttattgggaatacg-3’(SEQ ID NO：6)
B.3’结构
载体基因组的3’一半包括HIV-1 rev编码区和RRE、PPT、HIV-1 U35’末端的36bp、以及除掉5’末端30bp的全MLV LTR。该序列(5861-6000)从pHIVdge2(使用NIT7和NIT8)通过PCR扩增得到，进一步亚克隆到pSP64(PROMEGA)的BamHl和Sacl位点(构建体B1)。
NIT7：5’-cacggatccactagttggaagcatccaggaagtcagc-3’(SEQ ID NO：7)
NIT8：5’-ctctgactgttctgatgagc-3’(SEQ ID NO：8)
pHIVdge2的Sacl-Sacl片段(6000-6403和7621-9572)插入上述构建体以制备构建体B2。最后由两个初级PCR反应(使用NIT9和NIT10，用pHIVdge2作模板；使用NIT11和NIT12用pLXSN(入藏号：M28248；Miller等，1989)作模板)和一个次级PCR反应(使用NIT9和NIT12)产生HIV-1-MLV杂合LTR。该PCR产物插入构建体B2的Xhol和EcoR1位点以制备构建体B3。
NIT9：5’-gagcagcatctcgagacctgg-3’(SEQ ID NO：9)
NIT10：5’-tggcgttacttaagctagcaggcctgtcttctttgggagtgttttagc-3’(SEQ ID NO：10)
NIT11：5’-cccaaagaagacaggcctgctagcttaagtaacgccatttttcc-3’(SEQID NO：11)
NIT12：5’-cctgaattccgcggaatgaaagacccccgctgacg-3’(SEQ ID NO：12)
C.完全载体
通过将构建体B3的Spel-Sacll片段插入构建体A2得以混合两个半载体。产生的构建体C1具有多克隆位点；Xhol- Sall- Clal-Hindlll- EcoRV- EcoRl- Pstl- Smal- BamHl- Spel(下划线位点在载体中是唯一的)。该质粒称为pLLD1和产生的逆转录病毒载体是LLD1。
来自pSP72-lacZ(Xhol-BamHl)的β-半乳糖苷酶基因插入构建体C1的Sall和BamHl位点以制备LLD1-lacZ。其被用于与提供HIV gag和pol成分(pRV664，图5)的质粒或者表达HIV gp 160的质粒(pRV438或pSynp160mn，图5)或者表达VAVG蛋白的质粒(pRV67，图5)一起转染293T细胞。任何编码同样蛋白的质粒是等效的。制备的病毒含gp160时将lacZ基因转导至CD4+Hela细胞，含VAVG时转导至CD4-Hela细胞。含VAVG蛋白的病毒还可以将lacZ运送给有丝分裂后期神经元。Xgal染色确定每种情况下lacZ基因均得以高效表达，而不取决于Tat。
实施例2
其它LLD载体
由其它慢病毒也可以制备类似于实施例1描述的系统。这些系统避免使用HIV，因为其作为基因传送系统同时存在风险。例如可以使用FIV(Talbott等，1989，PNAS 86，5743)、EIAV(Payne等，1994普通病毒学杂志75，425)、维斯纳病毒(Sonigo等1985细胞42，369；Querat等，1990病毒学175，434)、BIV(Garvey等1990病毒学175，391)和SIV(Los Alamos序列数据库)等序列信息设计构建体。
附图说明
图2.实例：基于HIV的LLD载体。
Superscript H＝来源于HIV的序列(可以来源于任何慢病毒)。
Superscript M＝来源于MIV的序列。
ψ＝包装位点(包括gag区)。
PBS＝第二条链起始位点。
INTERNAL＝包含基因、选择性标识物、其它启动子或RNA操作系统例如HIV RRE和Rev编码序列的区域。
图3.NIT载体基因组(插入的3789bp+骨架2929 bp＝6718bp)：
来自pRV109的HCMV启动子(-521到-1)。
来自HXB2的HIV序列(552到1144；5861到6401；7621到9085)。
基因型：gag-；pol-；env-；rev+；RRE；vif-；vpu-；vpr-；tat-；nef-。
突变：
■三个位置突变除去ATG(790，834，894)(@)
■两个碱基插入的框移突变(831)(*)
■Ndel(6403)和Bglll(7621)之间的缺失(Δ)
多克隆位点(X)：Xhol- Sall-Clal-EcoRV-EcoRl-Pstl-Smal-BamHl- Spel；下划线位点是唯一的。
插入多克隆位点的最大插入位点为：5997bp。
骨架：pBluescriptKS+。
图5.包装成分的示意图
pRV664编码HIV-1 HXB2 gagpol(637-5748)并包含RRE(7720-8054)，其骨架是pCl-neo(PROMEGA)。
pRV438具有来自pSA91中HXB2(5955-8902)的rev和env，该pSA9是具有CMC启动子的哺乳动物表达质粒。pSYngp 160mn(来自B.种子)是HIV-1 MN包膜的表达质粒，其经改变具有适用于哺乳动物细胞的优化密码子。pRV67是pSA91中的VSV G表达质粒。

Claims (18)

1.经修饰的逆转录病毒载体颗粒，所述逆转录病毒载体颗粒能够感染和转导不分裂哺乳动物靶细胞，所述逆转录病毒载体颗粒包含可包装RNA基因组，当其处于DNA原病毒型时能够插入靶细胞基因组，所述RNA基因组包括一些序列，当所述序列被反转录为DNA原病毒时能提供：
a)非慢病毒R区；
b)代替逆转录病毒启动子功能、定位于原病毒5’长末端重复序列的非慢病毒表达调控元件；
c)受b)中所述非慢病毒表达调控元件转录控制的选择基因，选择基因定位在长末端重复序列中间，并且
其中RNA基因组包括整合进靶细胞基因组必需的慢病毒序列。
2.权利要求1的经修饰的逆转录病毒载体颗粒，其中逆转录病毒是慢病毒，当其处于DNA原病毒型时通常发挥5’慢病毒-蛋白依赖性启动子功能的慢病毒序列缺失。
3.权利要求2的经修饰的逆转录病毒载体颗粒，其中的慢病毒是HIV，功能性TAR序列缺失。
4.权利要求3的经修饰的逆转录病毒载体颗粒，其中RNA基因组进一步包括功能性rev和RRE序列，功能性rev和RRE均能够将所述基因组中含RRE的RNA转录物从靶细胞的细胞核运输到细胞质中。
5.按照权利要求1的经修饰的逆转录病毒载体颗粒，其中非慢病毒表达调控元件是可以由非慢病毒调节因子诱导的调节启动子。
6.按照权利要求5的经修饰的逆转录病毒载体颗粒，其中调节启动子由非病毒调节因子诱导。
7.按照权利要求1的经修饰的逆转录病毒载体颗粒，其中表达调控元件包括MLV长末端重复序列启动子。
8.按照权利要求1的经修饰的逆转录病毒载体颗粒，其中非慢病毒表达调控元件包括非慢病毒U3和R区。
9.按照权利要求2-8之一的经修饰的逆转录病毒载体颗粒，其中RNA基因组包括第一非慢病毒R区、能够有效整合和逆转录的部分慢病毒U5区、第一条链逆转录的引物结合位点、包装信号、含至少一种选择基因的内部区、第二条链逆转录的引物结合位点、能够有效整合的慢病毒U3区的短序列、非慢病毒启动子和第二非慢病毒R区。
10.编码权利要求1-9之一的修饰的逆转录病毒载体颗粒的可包装RNA基因组的DNA构建体，其有效地连接于启动子。
11.按照权利要求10的DNA构建体，其中启动子是高效启动子。
12.按照权利要求10或11的DNA构建体，其中选择基因缺失，构建体具有选择基因可以插入的插入位点。
13.用权利要求10-12之一的DNA构建体转染或转导的宿主细胞，所述细胞能够制备权利要求1-9之一的逆转录病毒载体颗粒。
14.一系列编码权利要求1-9之一的逆转录病毒载体颗粒成分的核酸序列。
15.按照权利要求1-9之一的逆转录病毒载体颗粒用于基因治疗的体外的应用，以感染和转导靶细胞。
16.按照权利要求1-9之一的逆转录病毒载体颗粒在制备用于基因治疗的药物中的应用。
17.对靶细胞进行基因治疗的方法，该方法包括用权利要求1-9之一的逆转录病毒载体颗粒感染和转导体外的靶细胞。
18.一种靶细胞，其按照权利要求15-17之一的应用或方法得到，其中所述靶细胞被权利要求1-9之一的逆转录颗粒感染和转导。
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