JP2003501066A - Sivベースのパッケージング欠損ベクター - Google Patents

Sivベースのパッケージング欠損ベクター

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Abstract

(57)【要約】 ウィルスRNAがSIVカプシド内にパッケージングされないように突然変異をパッケージングシグナル内に有するサル免疫不全ウィルス(SIV)ゲノムについて述べる。ウィルスベクターは、SIVパッケージングシグナルとベクター内で発現可能な異種遺伝子を含む。パッケージング欠陥性SIVゲノムおよびウィルスベクターは、宿主細胞内に同時形質移入され、異種遺伝子を発現可能なSIVウィルス粒子を生成する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 (発明の分野) 本発明はベクターおよび遺伝子伝達におけるその使用に関する。ベクターは、
それ自体のRNAをパッケージングできないように改変されたレトロウィルスに
基づき、たとえば体細胞遺伝子治療などの外来遺伝子を伝達するための感染因子
として使用できる。
【0002】 (発明の背景) レトロウィルスは複数の方法で分類される。その形態に基づいて、さまざまな
グループに分けられる。これらのグループは、A、B、CおよびD型ウィルスの
グループである。それらは3つの亜科、すなわちオンコウイルス、スプーマウィ
ルス、レンチウィルスの1つに属するように分類されることもある。
【0003】 SIVはC型ウィルスと呼ばれるレトロウィルスの科に属する。これらは細胞
膜におけるカプシド集合を特徴とし、たとえばヒト免疫不全ウィルス(HIV)
などのレンチウィルスグループのウィルスを含む。
【0004】 レトロウィルスは、感染した宿主細胞のゲノムに組込まれるDNAプロウィル
ス中間体を通じて複製するRNAウィルスである。ビリオン粒子は、プラス鎖の
ゲノムRNA分子のダイマーを含む。このゲノムRNAは、宿主RNAポリメラ
ーゼIIによってプロウィルスDNAから転写された全長種である。ウィルスの
gagおよびpol遺伝子をコード化するこれらの全長RNAの一部は、ビリオ
ン粒子の生成に必要な構造および酵素タンパク質を生成するために、宿主細胞リ
ボソームによって翻訳される。プロウィルスは、エンベロープタンパク質をコー
ド化する各種のより小型の単一または複数スプライスmRNAを生成し、さらに
複雑なレトロウィルスの場合は、制御タンパク質のグループを生成する。ゲノム
(およびサブゲノム)RNA分子は、5’mGキャップとポリアデニル化3’
尾部を持つという点で、細胞mRNAと構造的に類似している。
【0005】 ゲノムRNAのパッケージングを正しく行うためには、一連の問題に対処する
必要がある:全長RNAは、次世代のビリオンのための遺伝情報の全量を備えた
唯一のRNAであるため、スプライスウィルスメッセージよりも優先的にパッケ
ージングする必要がある。このウィルスは、大量および各種の物理的に類似した
宿主細胞に対して、特にゲノムRNAを選択する必要もある。なぜなら他の多く
のウィルスとは異なり、レトロウィルスは一般に宿主RNA合成を阻止しないた
めである。比率が集合部位への翻訳および輸送を防止されるか、翻訳直後にコー
ド化されたgag前駆体ポリタンパク質に関連付けられるように、パッケージさ
れるゲノムRNAを認識する機構があるはずである。最後に、3−4000個の
gag前駆体タンパク質、十分な数の逆転写酵素分子、プロテアーゼ、tRNA
プライマー、場合によっては制御タンパク質の複数の複写と関連付けて、正確な
数のゲノムをパッケージングしなければならない化学量論上の問題もある。
【0006】 それゆえゲノムのパッケージングは、RNA選択の特異性の問題と、RNA区
画化の考慮事項も伴う。
【0007】 ウィルスは、ウィルスゲノムmRNA内にcis作用要素、すなわち「パッケ
ージングシグナル」が存在するため、これらの問題を克服する。自然発生のウィ
ルス突然変異体および実験的に作成したウィルス突然変異体に関する研究により
、特異性配列がRNA認識およびカプシド化に不可欠であることが確認された。
Linialら、Cell 15:1371−1381(1978);Mann
ら、Cell 33:153−159(1983);Watanabeら、PN
AS USA 79:5986−5990(1979)およびWO−A−911
97798は、5’未翻訳リーダー配列の欠損がそれぞれ、ラウス肉腫ウィルス
(RSV)、モロニーネズミ白血病ウィルス(MoMLV)、膵臓壊死ウィルス
(SNV)およびHIVにおけるパッケージングの欠陥につながることを開示し
ている。
【0008】 欠損突然変異体は、複数のレトロウィルスでのRNAパッケージングに必要な
配列を定義している。これらの一部では、パッケージングに十分な程度の配列も
マッピングされている。パッケージングシグナルとRNA2次構造の記述におい
て、この配列が異種RNAに導入される場合、理論的に異種RNAはレトロウィ
ルス粒子によってカプシド化する必要があるという前提は明白である。パッケー
ジングの制約には、パッケージングシグナル(PSI)に隣接する配列が、PS
Iを崩壊させる代わりのの2次構造に好都合でないという、理論的な制約(この
ためにMannら、J. Virol. 54:401−407(1985)は
、ある情況証拠を与えている)が含まれる。さらに、パッケージジングされたR
NAの全長は、あるサイズのRNAをパッケージングするウィルスの容量によっ
て物理的に制限される。HIVにおいて、生成されたウィルスRNAの全長が元
のウィルスの全長を著しく超過した場合に複製欠陥につながる、異種遺伝子を含
むプロウィルス作成物がTerwillingerら、PNAS USA 86
:3857−3861(1989)によって示されている。複製欠陥は、RNA
パッケージングの減退効率と一致する。
【0009】 それにもかかわらず、天然の各種ウィルスとそのカプシド化配列の部位には著
しい多様性がある。RNA認識の機構はよく理解されていないため、実験データ
なしで、カプシド化配列の正確な部位と性質を予測することは理論的に不可能で
ある。
【0010】 レトロウィルス系の発展は、上述の研究の直接の発展である。これらの系では
、パッケージング欠陥「ヘルパー」ウィルスを用いて、高度に修飾されたRNA
ゲノム(ベクター)をカプシド化する粒子が生成される。Watanabeら、
Mol. Cell Biol. 3:2241−2249(1983)および
Eglitisら、BioTechniques 6:608−614(198
8)は、異種マーカー遺伝子とともに、最低限のウィルス長末端反復、パッケー
ジングシグナルおよびプライマー結合部位がビリオン粒子内にカプシド化され、
親ウィルスが向性である細胞に転移されたことを報告している。この手段により
、RNAのウィルス粒子へのカプシド化に必要な最低限の配列を定義することが
可能となっている。
【0011】 Adamら、J. Virol. 62:3802−3806(1988)は
、MoMLVの場合、パッケージングに十分な配列は、パッケージング欠陥を引
き起こすような欠損によって、最初に定義された5’リーダー領域を含むことを
開示している。gag配列がベクターのパッケージングを増強しても、追加の配
列は不要である。
【0012】 WO−A−9119798は、潜在的なパッケージングシグナルとして実質的
に5’リーダー配列のみを含むHIVベースのベクターの、HIVベースのパッ
ケージング系によるカプシド化が成功したと報告されたことを開示している。こ
の研究はまだ確認されていない。実際に、5’リーダー配列のみを含むHIV
RNAのカプシド化は失敗してきた。
【0013】 SIVでのパッケージングシグナルの適切な位置について、SIV RNAを
パッケージングする他のウィルスを用いた方法によって、従来、示唆(Rizv
i and Panganibanを参照)が行われてきたが、本研究はいくつ
かの理由により、根本的に欠陥がある。最初に、SIVゲノムの相当の伸展が含
まれており、そのためにパッケージングに十分な配列の定義が試みられなかった
。本研究より、異種遺伝子をパッケージングするSIV配列の使用方法に関して
最も不完全な示唆のみが存在する。加えて、使用した領域は、プライマー結合部
位、スプライスドナーおよび完全5’リーダー領域を含め、SIVに関する他の
重要なcis作用配列を多く含んでいた。パッケージング欠陥ウィルスを生成す
る目的で、SIVからこの領域全体を欠損させることは、この領域の他のセグメ
ントがウィルス転写、逆転写、スプライシングなどにとって重要であるため、全
く成功しないであろう。それゆえRizviとPanganibanが開示した
研究は、SIVパッケージングに必要な、または十分な配列を、ベクターとして
のSIVの発展に有用な程度まで定義していない。次に、特異性パッケージング
配列を決定するために第2のウィルスがパッケージングを使用する概念は、最近
欠陥があることが示された。Kayeら(1998)はたとえば、あるゲノムの
他のウィルスによるパッケージングによって、これらの配列がウィルスゲノムの
それ自体のタンパク質によるパッケージングに関連する配列であることが示唆さ
れない、非相反性パッケージング関係をHIV−1およびHIV−2が示すこと
を証明している。あるウィルスの他のウィルスによるパッケージングの不在も、
ウィルス自体のタンパク質でこれが生じた場合には、RNAに含まれる配列がパ
ッケージングに関連しないことを意味するものではない。
【0014】 (発明の開示) 本発明によると、プロウィルスはSIVタンパク質を生成可能であるが、RN
Aはビリオン内にパッケージングできないため、複製は不能である。このパッケ
ージ欠陥プロウィルスベクターを用いて、パッケージング欠陥細胞系を作成し、
ウィルスのパッケージング機構を調査し、このパッケージング機構に干渉する戦
略を開発するために用いることができる。このようなパッケージング陰性プロウ
ィルスによって生成されたビリオンは、ワクチンや、望ましい遺伝子を哺乳類細
胞に十分に導入するための系として使用できる。
【0015】 ある態様において、本発明は、パッケージングシグナル内に、ウィルスRNA
がSIVカプシド内でパッケージされない突然変異を有するサル免疫不全ウイル
ス(SIV)ゲノムを提供する。このましい態様において、ゲノムは突然変異を
有し、特に、プライマー結合部位と5’主要スプライスドナー部位の間の領域に
、好ましくはDIS構造内に欠損を有する。ある好ましい態様において、突然変
異は、 (a)配列番号1の配列、または (b)長さが5ヌクレオチド以上のそのフラグメント、または (c)そのどちらかの変形 の欠損を含む。
【0016】 本発明の別の態様において、SIVパッケージングシグナルとベクター内で発
現可能である異種遺伝子を含むSIVウィルスベクターが提供される。
【0017】 本発明は、異種遺伝子をコード化するSIVウィルスを生成するためのプロセ
スも提供し、該プロセスは、宿主細胞を本発明によるパッケージング欠陥SIV
ゲノムと、異種遺伝子を発現し、SIVカプシド内でベクターをパッケージング
するのに十分なSIVパッケージング配列を有する本発明によるウィルスベクタ
ーによって感染させることと;宿主細胞を培養することを含む。本発明によって
生成されたウィルスは、たとえば遺伝子治療、ワクチン接種の方法において、あ
るいは科学的調査において、異種遺伝子を宿主細胞に送達するのに使用できる。
【0018】 本発明の別の実施形態では、SIVパッケージング配列は、SIVまたはHI
V感染の治療または予防に使用される。
【0019】 (図面の簡単な説明) 図1aおよび図1bはパッケージング研究に使用されるSIVベースの作成物
および5’リーダーにおける欠損部位。
【0020】 図2はウィルスRNAをDNAと区別し、スプライスおよび非スプライスウィ
ルスRNAを識別するのに用いるリボプローブ。予想される保護フラグメントサ
イズを示す。
【0021】 図3(a−e)はSIVmacリーダーRNAの予想される2次構造を示すR
NA折畳み。a)野生種、b)Δ1突然変異あり、c)Δ2突然変異あり、d)
Δ3突然変異あり、e)Δ4突然変異あり。欠損の位置はa)に矢印とボールド
体で示す。影の部分は、プライマー結合部位、ダイマー化開始シグナルおよびg
ag開始コドンに相当する配列を示す。b)、c)、d)およびe)の太線は、
欠失した配列の位置を示す。
【0022】 (発明の説明) SIVは、ヒトへの使用が考えられる遺伝子ベクターとして使用および開発さ
れている他のレトロウィルスと比較して、レトロウィルスベクターとして潜在的
な利点がいくつかある。
【0023】 1.レンチウィルス科のウィルスであるため、遺伝子に侵入し、効率よく遺伝
子を統合する能力を有し、有糸分裂が行われない細胞内に到達する。したがって
マウスまたはトリレトロウィルスに基づくベクターとは異なり、SIVに基づく
ベクター系は、ヒト成人ではめったにあるいは絶対に分裂しないニューロン、心
筋および肝臓細胞などの重要な組織を標的にすることができる。
【0024】 2.ヒトの遺伝子伝達のためのレンチウィルスベクターとして開発されている
ヒト免疫不全ウィルスタイプ1およびタイプ2とは異なり、SIVはヒトにおい
て病原性であるという証拠はない。HIV−1またはHIV−2をベクターとし
て使用すると、製造中または継代中、あるいは感染患者において、ベクター配列
が十分な量の他のウィルス配列と再結合して、全長の感染性および病原性ヒト免
疫不全ウィルスを再生成する可能性が、わずかであるが、考えられる。
【0025】 3.SIVは8キロベースより大きいゲノムを有し、これはパッケージング機
能にははるかに冗長であるように思われるため、望ましい遺伝子配列によって置
換できる。遺伝子治療の候補である遺伝子をコード化するRNAのcDNA複製
の大半は、これらの寸法のウィルスゲノムに適合する。
【0026】 4.SIVの分子生物学とウィルス集合機能はよく理解されている。
【0027】 5.SIVは代わりのウィルスエンベロープによって、偽分類(pseudo
type)される。したがって、SIVエンベロープ自体を用いて、CD4抗体
を持つ細胞に遺伝子を送達する能力を有する。あるいは、望ましい細胞形状にそ
の向性を向けるために、ウィルスに新たなエンベロープを結合できる。
【0028】 6.内在性ヒトレトロウィルス配列内に明らかに検出可能な相同性はないため
、インビトロでの複製可能なウィルス生成につながる、治療用ベクターと内在性
配列間の組換えの可能性が最小限になる。
【0029】 7.SIVが、マウスレトロウィルスベクターによってカプシド化され、マウ
スレトロウィルスベクター系によって形質導入されるすべての細胞に伝達される
、VL30科などの異種性ウィルスRN配列をカプシド化する証拠がない。
【0030】 本発明は、SIVのウィルスRNAパッケージングに関与するcis作用シグ
ナルを局在化するための、5’主要リーダー領域のセグメントが欠損している野
生種ならびに突然変異SIVおよびそれから作成される欠陥ウィルス作成物(ベ
クター)の分子生物学ならびに複製の研究に基づいている。RNAをビリオン粒
子内にパッケージングするために必要で十分なシグナルが定義されている。RN
Aパッケージングに必要で十分なシグナルの局在化は以前に研究された他のウィ
ルスとは異なり、これらのシグナルの部位は、他のレトロウィルスへの直接の類
推とそのパッケージング機構によっては予想できなかったと思われる。作成され
たベクターはそれ自体複製欠陥性であるが、そのRNAは野生種ウィルスによっ
てtransにパッケージングして、SIV自体が感染によって向性であるため
、標的細胞に送達することができる。これらのベクターは標的細胞染色体に組込
まれ、それ自体は抗生物質耐性である標的細胞を生成する抗生物質耐性マーカー
の場合も、十分な標的細胞を発現する。
【0031】 特に、SIVパッケージング欠陥性ベクターの作成が可能であることが発見さ
れている。SIVのプライマー結合部位と5’主要スプライスドナーの間の領域
は、SIV RNAをビリオン内に十分にパッケージングするために必要な配列
を含むことがわかっている。加えて、5’主要スプライスドナーとgag開始コ
ドンの間の領域が、重要であるがSIV RNAをビリオン内にパッケージング
するためには必須ではない、第2のあまり重要でない領域を含むこともわかって
いる。パッケージング欠陥性SIVタンパク質を含むベクターを調製可能であり
、その場合ベクターは、望ましいSIV生成物を発現する、十分な数のSIVゲ
ノムによるヌクレオチドに一致するが、SIV RNA(パッケージング配列)
を十分にパッケージングする、プライマー結合部位と5’主要スプライスドナー
との間、またはスプライスドナーおよびgag開始コドンとの間の領域に相当す
る十分な数のヌクレオチドには一致しないヌクレオチド配列を含む。
【0032】 これらの配列は、SIVのゲノムに一致することが好ましい。一致するという
語は、保存的な追加、欠損および置換が許可されることを意味する。プライマー
結合部位(23bp)および5’主要スプライスドナーは、転写開始部位が1と
定義されるゲノムヌクレオチド配列において、それぞれ121−143および2
95−296と番号付けされる。
【0033】 特に、本明細書で使用されるように、SIVゲノムはSIVに由来するウィル
スRNAを指す。本発明のサル免疫不全ウィルス(SIV)は、任意のSIV菌
株またはその誘導体に由来してもよい。誘導体は、SIVゲノムに対する相同性
が好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、またさらに好ましくは
90または95%以上である。本発明のウィルスを得るために用いられる他の誘
導体としては、一部のSIV遺伝子に、Rudら、1994 J. Gen V
irol 75, 529−543に述べられているnef遺伝子における突然
変異などの突然変異をすでに有する菌株が含まれる。他の変異はまた下でより詳
細に述べるように示しうる。当業者は、公表されたSIV配列を参照したり、ま
たは、たとえば、変種SIVを設計され、本明細書で述べた配列に合わせること
によって、プライマー結合部位および5’主要スプライスドナー部位の位置をた
だちに確立することができる。
【0034】 本発明のある態様によって、SIVゲノムは、SIVエンベロープタンパク質
またはカプシド内にSIV RNAがパッケージングされないように、パッケー
ジングシグナル内に突然変異を有する。このようなゲノムは、SIVカプシドを
生成可能であることが好ましい。本発明の別の態様において、SIVパッケージ
ングシグナルと異種遺伝子を含むベクターが提供される。以下のSIVゲノムか
ら削除されるパッケージング配列の参照も、SIVカプシドを用いたパッケージ
ングのために、ベクターに含まれるこれらの配列の記述に関係する。
【0035】 パッケージング欠陥性ゲノムは、プライマー結合部位のすぐ下流で、5’主要
スプライスドナーのすぐ上流にあるセグメント、および/またはスプライスドナ
ーのすぐ下流で、gag遺伝子のすぐ上流にあるセグメントに相当するSIVパ
ッケージング配列を含まないことが好ましい。通常、ベクターは、プライマー結
合部位の約20塩基からプライマー結合部位の約80塩基下流までの範囲のヌク
レオチドを含み、なおパッケージング欠陥性である、および/または主要スプラ
イスドナーの約20塩基下流から70塩基下流までである。
【0036】 ベクターから削除されるパッケージング配列は、プライマー結合部位と5’主
要スプライス部位との間の領域の一部を含むことが好ましい。ある実施形態にお
いて、この領域におけるベクターから削除されるパッケージング配列は、本明細
書で配列番号1として示した85塩基ヌクレオチド、すなわち
【0037】
【化1】 を含む。
【0038】 突然変異は、(a)配列番号1の配列、または(b)長さ5以上のヌクレオチ
ドのそのフラグメント、または(c)そのいずれかの変形を含むことがある。配
列番号1で同定された配列の変形は、変形SIVゲノムに由来する一致ゲノムで
あり、たとえば主要5’スプライスドナー部位、プライマー結合部位またはga
g開始コドンを同定することと、配列番号1に一致する変形SIVの配列を同定
するために、変形の配列を配列番号1に揃えることによって同定される。
【0039】 好ましい実施形態において、パッケージングシグナルは、主要スプライスドナ
ー部位に対するゲノム5’の領域の一部またはすべてを含む。たとえば、(5’
から)5’主要スプライスドナー部位の90、80、70、60または50ヌク
レオチド上流から始まり、(5’から)5’主要スプライスドナー部位の40、
30、20または10ヌクレオチド上流まで広がる領域である。突然変異は、た
とえばこの領域から5、10、15、20、30、40、50または60または
それ以上のヌクレオチドを修飾または削除するために、この領域内の欠損または
突然変異を含む。たとえばパッケージング欠損は、配列番号1のヌクレオチド5
3〜85を含むことがある。
【0040】 SIVゲノムのこの領域は、添付図でDISと呼ばれる構造折畳みであり、パ
リンドローム末端に結合される。この領域のパッケージング配列はそれゆえ、突
然変異によってパリンドローム末端の生成を阻害することによって、図3に示す
DIS構造を除去することが好ましい。
【0041】 別の実施形態において、gag開始コドンまで拡張する5’主要スプライスド
ナー部位の下流の配列などの他の配列は削除される。このような配列は、主要ス
プライスドナー上流の配列の突然変異に加えて、削除されることが好ましい。た
とえばウィルスゲノムは、配列番号2、すなわち
【0042】
【化2】 として示した50塩基配列においてさらに欠損または突然変異を有することが好
ましい。
【0043】 削除または突然変異させる必要のある塩基の数は大きく変わることがある。た
とえばSIVにおける所与の50または85塩基対の欠損は、パッケージング能
力を損なうのに十分である。しかし、この領域ではさらに小規模な欠損でも、パ
ッケージング効率が損なわれる可能性がある。実際に、この領域における約5、
10、15、20または30塩基という小規模な欠損、そして特に配列番号1の
ヌクレオチド53〜85の領域における欠損は、効率のよいパッケージング能力
を除去することがある。特定の欠損のサイズは、当業者により、本開示に基づい
て、ただちに決定できる。
【0044】 ベクターは、機能SIV遺伝子生成物を発現するSIVゲノムのヌクレオチド
に相当する十分な数のヌクレオチドを有するSIVヌクレオチドセグメントを含
む必要はあるが、上述したように、ウィルスRNAをビリオン内に十分にパッケ
ージング可能にするために、プライマー結合部位と5’主要スプライスドナーの
間、または5’主要スプライスドナーおよびgag遺伝子の間の領域に相当する
十分な数のヌクレオチドを含む必要はない。これらのベクターをSIVパッケー
ジング欠陥性細胞系の確立に使用する場合、このような細胞系が感染性SIVを
生成しないことが好ましい。このようなパッケージング欠陥性ベクターによって
形質転換された細胞系は、細胞がパッケージング欠陥性であるために感染性が低
くても、一部のRNAはビリオン内になおパッケージング可能である。したがっ
て、ウィルスRNAの一部がビリオン内にパッケージングされない場合、パッケ
ージングされるものが複製可能ウィルスとならないように、SIVヌクレオチド
配列がSIVゲノム全体に一致しないことが好ましい。
【0045】 選択された細胞系は、それぞれSIVゲノムの異なる部分を含む、ウィルスパ
ッケージングに必要な配列も含まない、2個以上の異なるベクターを用いて形質
転換されることが好ましい。次に、各ベクターによって細胞に同時形質移入する
ことによって、細胞はなお、SIV構造および酵素タンパク質すべてを発現し、
ウィリオンを生成することができる。ある好ましい実施形態において、それぞれ
のベクターはSIV LTR(長末端反復配列)に相当する配列を含まないが、
プロモータ領域および/または別のゲノムのポリアデニル化配列に相当する配列
を含む。特定のプロモータおよびポリアデニル化配列の選択は、特定のホスト細
胞に基づいてただちに決定できる。配列が一致しないLTRは、3’LTRであ
ることが好ましい。
【0046】 ある好ましい実施形態において、1つのベクターはenv上流のSIVタンパ
ク質の発現を可能にする配列を含み、第2のベクターは残りのタンパク質を発現
を可能にする。たとえば1つのベクターは、5’−most遺伝子生成物を発現
するenv遺伝子配列に対するgag開始コドン上流の十分な数のヌクレオチド
に相当するSIVヌクレオチドセグメントを含む。他のベクターは、gag遺伝
子配列下流の十分な数のヌクレオチドに相当し、機能env遺伝子配列を含むS
IVヌクレオチドセグメントを含む。このようなベクターは、SIVゲノムの報
告された遺伝子配列から化学的に合成可能であるか、多くの利用可能なSIVプ
ロウィルスから、本開示に基づいて当業者が、これらのウィルスの既知の制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を利用することによって誘導できる。
【0047】 各種のマーカー遺伝子を各ベクターに添加することが好ましい。次に、これら
の異なるベクターを用いて同時形質導入した予備選択細胞系を使用して、両方の
マーカーを含む細胞を探すことによって、両方のベクターによって同時形質移入
された細胞が発見される。このような細胞は、あらゆるSIVタンパク質を生成
することができる。ビリオンが生成されても、ウィルス配列全体に相当するRN
Aはこれらのビリオンにパッケージングされない。望ましい場合には、たとえば
gag/polベクター、プロテアーゼベクター、envベクターなどの3以上
のベクターを使用することができる。
【0048】 場合によっては、他のウィルスのエンベロープ糖タンパク質によってレトロウ
ィルスを偽分類することができる。結果として、異なるレトロウィルスのenv
遺伝子に相当する十分な数のヌクレオチドを含むベクターを調製することができ
る。このベクターの5’LTRは、envゲノムと同じゲノムのものであること
が好ましい。このようなベクターは、ビリオンを作成するために、SIV en
vパッケージング欠陥性ベクターの代わりに使用できる。このような変更により
、生じたベクター系はより幅広い宿主範囲で使用可能であるか、たとえば、細胞
範囲をCD4タンパク質を持つ細胞に限定するHIV env遺伝子ベクターを
用いて、より狭い宿主範囲に制限することができる。水疱性口炎ウイルスまたは
狂犬病ウイルスエンベロープタンパク質を用いて、多くの異なる種類の細胞型に
向性のベクターを作成する。
【0049】 実質的にどの細胞系でも使用できる。哺乳類細胞、たとえばCV−l Hel
a、Raji、SW480またはCHOなどを使用することが好ましい。
【0050】 ウィルス細胞生成物の生成を向上させるために、CV−1またはHeLa細胞
で遺伝子を優先的に発現するプロモータで5’LTRを置換することにより、5
’LTR以外のプロモータを使用できる。使用する特定のプロモータは、本開示
に基づいて、使用する細胞系によって当業者が容易に決定できる。
【0051】 ウィルス細胞生成物のレベルを向上させるために、SIV LTRおよび/ま
たはプロモータを向上させるベクターにエンハンサ配列を追加することもできる
。特定のエンハンサ配列は、宿主細胞系によって当業者がただちに決定できる。
【0052】 完全なSIVゲノムをともに含む一連のベクターを使用して、SIV RNA
を含まないことを除いて、SIVビリオンに一致するビリオンを生成する細胞系
を作成することができる。これらのビリオンは、細胞からただちに得ることがで
きる。たとえば、細胞を培養して、上澄を収集する。望ましい用途に応じて、ビ
リオンを含む上澄を使用するか、これらのビリオンを、勾配遠心分離、濾過など
の標準手法によって上澄から分離することができる。
【0053】 希釈したビリオンは、ワクチンの調製に非常に有用である。ビリオンを使用し
て、SIVビリオンに返納する抗体を生成したり、これらのビリオンは、これら
のビリオンの内部にウィルスRNAを含まないことを除いて、実際のSIVビリ
オンと同一であるため、作成されたワクチンは特に有用である。SIV gag
/polおよびプロテアーゼ遺伝子によって同時形質移入された細胞系から生成
され、別のウィルスによるenv遺伝子を含む偽分類ビリオンは、この他のウィ
ルスに対するワクチンを作成するのに有用である。たとえば細胞内のHIV e
nvベクターは、HIVに対する抗体反応を誘発するHIV envを含むが、
他のHIVタンパク質やHIV RNAがないために病原性は持たないウィルス
粒子を生成する。
【0054】 これらのビリオンを用いて、ビリオンに対する抗体を生成することもでき、こ
の抗体は次に、たとえばビリオンに対するスクリーニング、ビリオンに対する標
的系の開発などの様々な目的に使用できる。さらに、これらのSIVパッケージ
ング欠損細胞系は、たとえば以下で述べるように、異種遺伝子などの望ましい遺
伝子の哺乳類細胞への導入手段としてきわめて有用である。
【0055】 本発明のこの態様において、異種遺伝子を発現可能であり、さらにSIVのパ
ッケージング配列を含むベクターが提供される。パッケージング配列は、パッケ
ージング欠陥性SIVゲノムを生成するように突然変異された上述のパッケージ
ング配列に一致することが好ましい。パッケージングシグナルの実質的部分が含
まれることが好ましい。好ましい態様において、パッケージング配列は、主要5
’スプライスドナーの上流領域を含む。特にパッケージング配列は、パリンドロ
ーム末端の生成が可能となるように選択され、図3に示す構造DISを有する。
たとえば、配列番号1のパッケージング配列か、そのフラグメント、またはその
変形、および特に配列番号1のヌクレオチド53〜85を含む配列が提供される
。その変形は、削除されるゲノムの領域を決定する場合、上述したように同定さ
れる。SIVパッケージング欠陥性ゲノムを生成するための突然変異または欠損
に関して上述した配列すべては、ベクターがSIVカプシドまたはタンパク質エ
ンベロープによってパッケージングできるようにベクターに組込むのに好ましい
配列である。パッケージング配列は好ましくは、主要5’スプライスドナー上流
の10、20、30、40、50、60、70、80、100、120、150
、200またはそれ以上のヌクレオチドを含み、配列番号1の配列の一部または
すべて、あるいは変形SIVゲノムの相当する配列を含むことが好ましい。たと
えば配列番号2の配列などの、5’スプライスドナー部位の下流領域からgag
開始コドンまでの10、20、50、70または100またはそれ以上のポリヌ
クレオチドなどの、追加の配列も提供されることが好ましい。
【0056】 これらのビリオンは、望ましい遺伝子配列をパッケージングし、SIVによっ
て感染可能な標的細胞にその配列を送達する、非常に効率的な方法として使用で
きる。これは、SIVのパッケージングヌクレオチド(SIVパッケージング領
域)、既定の遺伝子に相当する十分な数のヌクレオチドを有するヌクレオチドセ
グメントを含むベクターを調製することと、パッケージング配列および既定の遺
伝子、パッケージング、逆転写、ベクターの標的細胞内への組込およびベクター
による遺伝子発現のためのLTR内および付近の十分な数の配列に相当する配列
をフランキングすることによって行える。
【0057】 パッケージング領域は少なくとも、プライマー結合部位と主要5’スプライス
ドナーの間の領域はもちろんのこと、5’主要スプライスドナーおよびgag遺
伝子の間の領域に一致することが好ましい。そのようなベクターのパッケージン
グに関して下に示した実験データについて、パッケージング効率を向上させるた
めに、ベクターがSIVのgag遺伝子配列の最初の500bpも有してもよい
。たとえば、標的細胞内でパッケージング、逆転写、組込および発現される十分
な数のSIV配列には、LTRのU3、RおよびU5配列、パッケージング配列
およびLTRをフランキングする一部の配列(逆転写に必要)が含まれる。プラ
イマー結合部位と5’主要スプライスドナーの間に記述されたパッケージング配
列と、主要スプライスドナーとgag遺伝子の間のパッケージング配列はそのよ
うなベクターをパッケージングするには十分であるが、gag遺伝子コード化配
列の最初の500ヌクレオチドを含むことがパッケージングをさらに向上させる
ように思われるため有利である。gag開始コドンの突然変異は、パッケージン
グに必要なcis作用gagヌクレオチド配列をなお保持しながら、この点から
開始する翻訳を避けるために受入れることができる。たとえば、gagATGは
特定部位の突然変異誘発によってATCに変化することがある。
【0058】 このベクターを用いてSIVパッケージング欠陥性細胞の1つに形質移入する
場合、ビリオンにパッケージングされるのは、このベクターによるヌクレオチド
配列である。これらのSIVパッケージ化遺伝子は次に、SIVによって感染可
能な細胞を標的とする。このような形質転換の方法は、現在の方法よりもはるか
に有効であると考えられる。さらに、遺伝子を適切に選択すれば、SIV感染の
方法を監視することができる。
【0059】 たとえば、ベクターは、発現、逆転写および組込されるSIVの5’および3
’LTRの両方に相当する十分な数のヌクレオチド、すなわちパッケージングさ
れるSIVパッケージング配列に相当する十分な数のヌクレオチドを含むことが
可能である。ベクターは、機能遺伝子(たとえば遺伝子セグメント)を生成する
ために転写することが望ましい遺伝子の十分な数のヌクレオチドも含む。この遺
伝子は以下で述べる、望ましいどの遺伝子でもよい。
【0060】 本発明の別の態様において、野生種SIVのパッケージングを阻害するために
、またはHIVカプシドにおけるHIVのパッケージングを阻害するために、パ
ッケージング配列はそれ自体に、あるいはアンチセンス分子として提供される。
それゆえパッケージング配列を、HIV−1またはHIV−2感染、好ましくは
HIV−1感染などのSIVまたはHIV感染の予防または治療に使用してもよ
い。特に、上の欠損または異種遺伝子の発現のためのベクター内への包含のいず
れかに関して述べたパッケージング配列などの、パッケージング配列は、単独で
も、あるいは以下でさらに詳細に述べるアンチセンス分子の生成にも使用できる
。パッケージング配列は、たとえば非SIVまたはHIV配列にフランキングし
て適切な送達ビヒクル内で提供してもよい。そのようなパッケージング配列を用
いて、SIVまたはHIVカプシドタンパク質に結合させたり、そのような結合
部位を飽和させたり、野生種ウィルスゲノムを有するそのような部位を得るため
に競合し、そのためにカプシド内のそのようなゲノムのパッケージングを防止す
ることができる。それゆえ、パッケージング配列はそれ自体で治療に有用なこと
がある。アンチセンス分子を用いて、野生種ウィルスゲノムパッケージング配列
に結合させ、ひいてはその認識とウィルスカプシドとの結合を防止することがで
きる。このようなパッケージングヌクレオチドは以下に述べるように作成するか
、裸のポリヌクレオチドとして投与するか、当業界で周知の形質移入促進剤を用
いて作成し、適切な技法によって送達してもよい。
【0061】 パッケージング配列は、パッケージング欠陥性SIVゲノムを生成するように
突然変異された上述のパッケージング配列に一致することが好ましい。好ましい
態様において、パッケージング配列は主要5’スプライスドナーの上流の領域を
含む。パッケージング配列は特に、図3に示す構造DISを有するパリンドロー
ム末端を形成するように選択される。たとえば、配列番号1のパッケージング配
列、またはそのフラグメントあるいはその変形、特に配列番号1のヌクレオチド
53−58を含む領域が提供される。その変形は、削除されるゲノムの領域を決
定する際に、上述したように同定される。SIVパッケージング欠陥性ゲノムを
生成するための突然変異または欠損について上述した配列すべては、ベクターが
SIVカプシドまたはタンパク質エンベロープにパッケージングされるように、
ベクター内に組込むことが好ましい配列である。パッケージング配列は好ましく
は、主要5’スプライスドナー上流の10、20、30、40、50、60、7
0、80、100、120、150、200またはそれ以上のヌクレオチドの領
域を含むか、配列番号1の配列の一部またはすべて、あるいは変形SIVゲノム
による相当する配列を含むことが好ましい。5’スプライスドナー部位の下流領
域からgag開始コドンまでの10、20、50、70または100またはそれ
以上のポリヌクレオチド、たとえば配列番号2の配列などの、追加のSIV配列
も提供することが好ましい。あるいは、またはさらに、パッケージング配列を送
達するために、他のフランキング配列を提供してもよい。本明細書で述べるパッ
ケージング配列に相補性のアンチセンス分子を提供してもよい。
【0062】 突然変異の方法 本発明は、上述のパッケージング配列内の突然変異によってパッケージング欠
陥性とされた、すなわちSIVカプシド内にもはやパッケージングされないSI
Vゲノムに関する。そのようなSIVゲノムも、他のSIV遺伝子内に他の突然
変異を含んでいていもよい。そのようなSIVゲノムは、SIVカプシドを発現
および集合する能力を保持することが好ましい。
【0063】 本発明はさらに、SIVパッケージング配列によってSIVゲノム内にパッケ
ージングされる異種遺伝子を発現するためのベクターに関する。そのようなベク
ターは、SIVパッケージング配列が含まれている限り、ウィルスの提案された
処方または使用に適合する適切な任意のベクターを含んでいてもよい。そのよう
なベクターはSIVゲノムに由来するが、たとえばSIVゲノム複製欠陥性にす
るために、1以上のSIV遺伝子の突然変異を含むことが望ましい。
【0064】 当業界で周知の複数の技法によって、不可欠な遺伝子を機能的に不活性にする
ことができる。たとえば、欠損、置換または挿入、好ましくは欠損によって機能
的に不活性にすることができる。欠損は、遺伝子の一部または遺伝子全体を除去
する。たとえば、1個のみのヌクレオチドの欠損を行うと、読取枠の移動が起き
る。しかし、好ましくはさらに大規模な、たとえば25%以上、さらに好ましく
は50%以上(あるいは、絶対的な用語では、10以上のヌクレオチド、さらに
好ましくは100以上のヌクレオチド、最も好ましくは1000以上のヌクレオ
チド)のコード化および非コード化配列の欠損が行われる。遺伝子全体とフラン
キング配列の一部を除去することが特に好ましい。挿入された配列は、以下で述
べる異種遺伝子を含むことがある。
【0065】 SIV内の突然変異は、当業者に周知の相同組換え方法によって行われる。た
とえば、SIVゲノムRNAは、相同SIV配列によってフランキングされた突
然変異配列を含むベクター、好ましくはプラスミドベクターによってともに形質
移入される。突然変異配列は、欠損、挿入または置換を含んでいてもよく、それ
らはすべてルーチン的技法によって構成される。挿入は、たとえばβ−ガラクト
シダーゼ活性によって組換えウィルスをスクリーニングするための、たとえばl
acZなどの、選択可能なマーカー遺伝子を含んでいてもよい。
【0066】 異種遺伝子およびプロモータ 本発明のベクターまたはウィルスは、異種遺伝子を含むように、すなわちSI
Vゲノム内に2種類以上の遺伝子が存在するように修飾してもよい。特に本発明
は、SIVカプシド内にベクターをパッケージングするのに十分なSIV由来配
列を含むウィルスベクターを提供する。そうでない場合、ベクターは、1以上の
SIV遺伝子に突然変異または欠損を含むSIVゲノムに由来するか、SIVパ
ッケージ配列を含むよう修飾された発現ベクターに由来する。「異種遺伝子」と
いう語は、SIVゲノムに存在する遺伝子以外の、任意の遺伝子を含む。異種遺
伝子は、野生種遺伝子の任意の対立変形であるか、突然変異遺伝子でもよい。「
遺伝子」という語は、少なくとも転写可能な核酸配列を範囲とする。それゆえ、
mRNA、tRNAおよびrNAをコード化する配列は、本定義に含まれる。配
列はプロモータに関して、センスまたはアンチセンス方向である。アンチセンス
作成物を用いて、周知の技法により細胞中での遺伝子の発現を阻害することがで
きる。mRNAをコード化する配列は、随意に転写された5’および/または3
’の一部または全部を含むことができるが、天然の、あるいはそうでなければ、
翻訳コード化配列と関連付けられた未翻訳フランキング配列は含まない。さらに
随意に、ととえば転写停止シグナル、ポリアデニル化部位および下流エンハンサ
要素などの、通常、転写配列に関連する、関連付けられた転写制御配列を含むこ
ともある。
【0067】 異種遺伝子は、たとえばSIVゲノム内に、SIV菌株のたとえば、SIV配
列によってフランキングされた異種遺伝子を有するプラスミドベクターとの相同
組換えによって挿入されることがある。異種遺伝子は、当業界で周知のクローニ
ング技術を用いて、SIV配列を含む適切なプラスミド内に導入される。異種遺
伝子は、SIVゲノムまたはベクターのどの位置に挿入してもよい。異種遺伝子
は不可欠なSIV遺伝子に挿入されることが好ましい。ベクターはSIVゲノム
に由来するが、異種遺伝子のパッケージングおよび発現に備えるために、1、2
または複数のSIV遺伝子の欠損、SIVゲノムの最小限の配列までを含むこと
が好ましい。
【0068】 異種遺伝子の転写配列は、哺乳類細胞での異種遺伝子の発現を可能にする制御
配列に操作可能に結合されることが好ましい。「操作可能に結合された」という
語は、述べられた構成要素が目的とする方法で機能することが可能な関係にある
近位を指す。コード化配列に「操作可能に結合された」制御配列は、コード化配
列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように連結される。
【0069】 制御配列は、異種遺伝子の発現を可能とするプロモータと転写終了シグナルを
含む。プロモータは、哺乳類、好ましくはヒトの細胞で機能するプロモータから
選択される。プロモータは、真核遺伝子のプロモータ配列より由来する。たとえ
ば、異種遺伝子の発現が起きる細胞のゲノムに由来するプロモータでもよい。真
核プロモータに関して、遍在的な方法で機能する(β−アクチン、チューブリン
などのプロモータ)、あるいは組織固有的な方法で機能する(ピルビン酸キナー
ゼの遺伝子のプロモータなど)プロモータでもよい。特異的な刺激に反応するプ
ロモータ、たとえばステロイドホルモン受容体を結合するプロモータでもよい。
たとえば、モロニーマウス白血病ウィルス長末端反復(MMLV LTR)プロ
モータまたはSIV遺伝子のプロモータなどの、ウィルスプロモータも使用でき
る。
【0070】 SIV LTRプロモータおよびLTRプロモータ領域の要素を含むプロモー
タは特に好ましい。発現カセットはさらに、その順番で、逆または順方向で第1
のプロモータおよび第1の異種遺伝子に操作可能に結合され、前記の第2のプロ
モータおよび第2の異種遺伝子が第1のプロモータおよび第1の異種遺伝子と同
一または異なる、第2のプロモータおよび第2の異種遺伝子を含むこともある。
それゆえ、プロモータ/異種遺伝子作成物の対によって、同一または異なるプロ
モータによって駆動される、同一または異なる異種遺伝子対の発現が可能となる
。加えて、第1の異種遺伝子の生成物は、適切な生理学的条件下で、第2の異種
遺伝子の発現を調整することがある(あるいはその逆)。
【0071】 発現カセットは、当業者に既知のルーチン的なクローニング技法を用いて作成
できる(たとえば、Sambrookら、1989, Molecular C
loning−a laboratory manual; Cold Spr
ing Harbor Press)。
【0072】 細胞の寿命の間に異種遺伝子の発現レベルが調整できるため、プロモータが誘
導性であることも有利である。誘導性とは、プロモータを用いて得られた発現レ
ベルが調整可能なことを意味する。たとえば、2以上の異種遺伝子がベクターま
たはSIVゲノムに挿入される好ましい実施形態において、1つのプロモータは
第2のタンパク質の発現に反応性であり、調整される異種遺伝子の発現を駆動す
るプロモータを含む。第2のプロモータは、第2のタンパク質の発現を駆動する
強力なプロモータ(たとえばCMV IEプロモータ)を含む。
【0073】 加えて、これらのプロモータのいずれも、たとえばエンハンサ配列などの、調
整配列をさらに添加することによって修飾できる。たとえばMMLV LTR/
SIV融合プロモータなどの、上述の2以上の異なるプロモータによる配列要素
を含むキメラプロモータを用いることもできる。
【0074】 異種遺伝子はたとえば、分裂促進因子、(α、βまたはγ−インターフェロン
、IL−1、IL−2を含むインターロイキン、腫瘍壊死因子、またはインシュ
リン状成長因子IまたはIIなどの)サイトカイン、(MAPキナーゼなどの)
タンパク質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、および上記のいずれかの細胞
受容体などの、細胞分割の調整に関与するタンパク質をコード化できる。異種遺
伝子も、細胞代謝経路に関与する酵素、たとえばアミノ酸生合成または分解に関
与する酵素(チロシンヒドロキシラーゼなど)、または、たとえばタンパク質キ
ナーゼ、ホスファターゼなどの、そのような経路の調整に関与するタンパク質を
コード化する。異種遺伝子は、その調整に関与する転写因子またはタンパク質、
膜タンパク質(ロドプシンなど)、構造タンパク質(ジストロフィンなど)また
はhsp27、hsp65、hsp70、hsp90などの熱ショックタンパク
質をコード化することもある。
【0075】 異種遺伝子は、治療用途の、またはその機能あるいは機能の欠如が疾病プロセ
スにおいて重要であるポリペプチドをコード化することが好ましい。たとえば、
チロシンヒドロキシラーゼは、パーキンソン病の治療に使用可能であり、ロドプ
シンは眼障害の治療に使用可能であり、ジストロフィンは筋ジストロフィーの治
療に使用され、熱ショックタンパク質は虚血性ストレスに関連する心臓および脳
障害の治療に使用できる。治療用途のポリペプチドは、リシンなどの細胞障害性
ポリペプチド、または前駆体プロドラッグを、たとえばウィルス専用酵素プロド
ラッグ治療または遺伝子専用プロドラッグ治療法に使用される、細胞障害性化合
物に転換できる酵素を含むこともある。後者の場合、酵素が細胞表面に向かわせ
るための適切なシグナル配列、酵素が細胞表面に結合されたまま、細胞表面の外
側に露出するようにするシグナル配列を有するようにすることが望ましい。
【0076】 異種遺伝子は、ワクチンとして使用する抗原ポリペプチドもコード化する場合
がある。このような抗原ポリペプチドは、たとえば細菌またはウィルスなどの病
原性生物から、あるいは腫瘍から由来することが好ましい。
【0077】 異種遺伝子はまた、生成物が(たとえば転写調整因子などの)他の遺伝子の発
現を調整する、(たとえばβガラクトシダーゼまたは緑蛍光タンパク質をコード
化する)マーカー遺伝子または遺伝子を含むことがある。
【0078】 遺伝子治療および他の治療用途も、複数の遺伝子の投与を必要することもある
。複数遺伝子の発現は、各種の症状の治療には有利なこともある。
【0079】 宿主細胞 本発明の1つの態様において、宿主細胞は、異種遺伝子を発現するベクターを
含むSIVウィルスを生成するよう作成される。ウィルスは、SIVカプシドと
SIVパッケージングシグナルおよび異種遺伝子を有する本発明によるベクター
を生成可能な、本発明によるパッケージング欠陥性SIVゲノムによって、細胞
に同時形質移入することによって生成される。このようなウィルスは、哺乳類細
胞などの適切な細胞と両方のベクターの同時形質移入によって生成される。
【0080】 投与 したがって、本発明のウィルスは治療用遺伝子を治療の必要なヒトまたは動物
に送達するのに用いられる。
【0081】 投与遺伝子治療の1つの方法は、上述のように、治療用遺伝子を本発明のベク
ター内に挿入することを含む。次に、細胞にインビトロで、異種遺伝子およびS
IVパッケージング配列およびパッケージング欠陥性ゲノムを含むベクターを用
いて形質移入する。細胞を培養すると、SIVウィルスカプシドが生成され、S
IVパッケージング配列を通じて、そこに異種遺伝子ベクターがパッケージング
される。生じた組換えウィルスは、製薬的に許容可能な担体または希釈剤と組合
わされて、製薬組成物が生成される。適切な担体および希釈剤としては、たとえ
ばリン酸緩衝食塩水などの等張食塩水が挙げられる。異種遺伝子が抗原性ペプチ
ドまたはタンパク質をコード化するワクチン組成物は、生成される免疫反応を向
上させるためのアジュバントを用いて処方できる。組成物は、非経口、筋肉内、
静脈内、皮下、眼内または経皮投与用に処方できる。
【0082】 製薬組成物は、遺伝子治療用の治療用遺伝子を含むウィルスが細胞内の適切な
領域に組込まれるような方法で投与される。異種遺伝子組成物を含むSIVカプ
シドは、SIVが多くの異なる種類の非分割細胞に感染する能力によって、特に
有用である。加えて、SIVはヒトには非病原性であり、治療またはワクチン接
種には特に有用である。
【0083】 投与するウィルス量は、10〜1010pfu、好ましくは10〜10 pfu、さらに好ましくは10〜10pfuの範囲である。注射する場合、
製薬的に許容可能な担体または希釈剤中の通常1〜10μlのウィルスが投与さ
れる。
【0084】 熟練開業医は特定の患者および症状に対して最適な投与経路および用量をただ
ちに決定できるため、上述した投与経路および用量は単に指針としてものである
【0085】 アッセイ方法 本発明のウィルスは、科学的研究方法でも使用できる。それゆえ、本発明の別
の態様は、インビトロまたはインビボのどちらかの、哺乳類細胞の遺伝子機能を
アッセイする方法に関する。異種遺伝子の機能は、以下を含む方法によって決定
できる: (a) SIVカプシドおよびSIVパッケージングシグナルによってパッケ
ージングされた異種遺伝子を有するベクターを含むウィルス粒子を生成すること
; (b)生じたウィルスを哺乳類細胞系に導入すること; (c)前記哺乳類細胞系において前記異種遺伝子の発現の効果を決定すること
【0086】 たとえば、細胞系は細胞分裂時に感温性欠損がある。本発明による異種遺伝子
を含むSIV菌株は、欠損細胞系は欠損細胞系および制限温度で培養された細胞
系に導入されると、当業者は異種遺伝子が細胞分裂時の欠損を補完できるかどう
かを容易に判断する。同様に他の既知の技法を適用して、異種遺伝子の発現が哺
乳類細胞系の観察可能な突然変異表現型を補正できるかどうかを判断できる。
【0087】 この手順は、突然変異表現型の復元に関与するのが、遺伝子によってコード化
されるタンパク質のどの領域であるかを確認するために、異種遺伝子の系統的な
突然変異誘発を行うのにも使用できる。
【0088】 本方法は、いわゆる「遺伝子ノックアウト」を有する動物、たとえばマウスに
も使用できる。野生種異種遺伝子は、本発明の突然変異SIV菌株とを用いて動
物に導入され、動物に対する効果は、当業界で既知の各種の行動、組織化学およ
び生化学アッセイを用いて決定できる。あるいは、突然変異異種遺伝子は、野生
種または「遺伝子ノックアウト」動物に導入して、疾患関連病状が誘起されたか
どうかを判定することができる。アンチセンスヌクレオチドも、ノックアウト動
物における効果を引き起こすために、本発明のウィルス粒子を用いて導入できる
【0089】 あるいは、本発明の突然変異SIVウィルスを用いて、標的細胞中の調査中の
遺伝子を発現させ、次に、試験物質の標的遺伝子に対する効果を監視するために
、試験物質を用いてインキュベーションを行ってもよい。
【0090】 したがって、本発明の方法は特に、疾患に関与する遺伝子の機能研究に使用さ
れる。
【0091】 本発明は、例示に過ぎず、限定するものではない以下の実施例を参照して説明
する。
【0092】 実施例 要約すれば、感染性プロウィルスクローンは、Rudによる出版物を含む出版
物で述べられており、pBluescript KS−主鎖に完全なプロウィル
スクローンを含む。オリゴヌクレオチド部位の突然変異誘発を用いて、非コード
化領域内の一連のセグメントは現在、プライマー結合部位とgag開始コドンと
の間で削除されている。欠損ΔP1はヌクレオチド171−207を、ΔP2は
224−256を、ΔP3は304−354を、ΔP4は320−351を含む
。これらのヌクレオチドの番号付けはすべて、R領域の第1の塩基が+1と見な
されるウィルスのRNAを指す。プロウィルスクローンは、検出目的でエンベロ
ープ領域に置換されるレポーター遺伝子作成物を保持していた。この作成物はC
os−1細胞に形質移入され、ビリオン内の細胞中に存在するRNAは、高感度
の定量および定性RNase保護アッセイによって分析された。粒子生成の低下
は、すべての欠損によって見られた。最も重度の欠損を生じたのは、ΔP3およ
びΔP4であり、パッケージングを野生種の約20%低減した。欠損ΔP1およ
びΔP2は、パッケージングを野生種の約30%低減した。それゆえSIVリー
ダー領域は、プライマー結合部位とgag開始コドンの間のリーダーの長切片に
渡って幅広く分布するパッケージングシグナルを有すると思われる。主要パッケ
ージングシグナルは、主要5’スプライスドナーの上流に位置する。この点で、
以前に記録されたレンチウィルスパッケージングシグナルと異なる。HIV−1
において、パッケージング特異性全体は実質的に、スプライスドナーとgag開
始コドンの間に見られ、ここでの欠損は、90%を超えるパッケージングの低下
につながる(Leverら)。HIV−2では、主要なパッケージングシグナル
は、プライマー結合部位と主要5’スプライスドナーの間の、スプライスドナー
の上流にほぼ独占的に見られる(McCann and Lever)。それゆ
え、以前の実験からレンチウィルスのパッケージングシグナルの正確な部位とサ
イズを予測するのは不可能であることが確認される。本開示により、当業者はS
IVに基づく効果的なレトロウィルスベクター系を作成することができる。
【0093】 SIVをさらに詳細に研究するために、一連のSIVベースベクターが、減弱
表現型に関係するNef読取枠内に突然変異を含むSIVmac239のC8ク
ローンをベースとして作成された(Rudら 1994 J. Gen Vir
ol 75, 529−543)。エンベロープ読取枠内に欠損が作成され、こ
の中の、PflM1とPml1部位の間に、SV40早期プロモータから発言さ
れたホタルルシフェラーゼ遺伝子より成る発現カセットが挿入された(図1)。
この作成物pRSΔenvSLが逆転写酵素およびウィルス粒子を生成可能であ
り、RNAをカプシド化できることは、この作成物をSIVエンベロープ、両向
性ネズミ白血病ウィルスエンベロープまたはVSV−Gエンベロープタンパク質
のいずれかと同時形質移入させることによって確認された。これらの実験はすべ
て、標的細胞系でのルシフェラーゼ遺伝子の遺伝子転写と発現を引き起こした。
【0094】 プロウィルスの5’セグメントは、独立したプラスミドpBluescrip
t KSにクローニングされ、特定部位の突然変異誘起はKunkel法を用い
て行われた(Kunkelら、1987 Meth Enzymol, 154
, 367−82)。
【0095】 Δ1の場合、位置862−898(5’U3配列の開始からの番号付け、また
はR領域の最初の塩基が1と番号付けられた場合、171−207)は、次の突
然変異オリゴヌクレオチドを用いて削除された。
【0096】
【化3】
【0097】 Δ2の場合、位置915−947(または別の番号付けでは224−256)
は、次の突然変異オリゴヌクレオチドを用いて削除された。
【0098】
【化4】
【0099】 Δ3の場合、位置995−1045(または別の番号付けでは304−354
)は、次の突然変異オリゴヌクレオチドを用いて削除された。
【0100】
【化5】
【0101】 Δ4の場合、位置1011−1042(または320−351)は、次の突然
変異オリゴヌクレオチドを用いて削除された。
【0102】
【化6】
【0103】 削除された5’リーダー配列は、SIVgag/polリポーター作成物pR
SΔenvSL(図1)内にそれぞれ再度クローニングされて、4個の新たなプ
ラスミドΔ1−4ΔenvSLが生成した。
【0104】 リボプローブ生成のためのテンプレートとして用いられるプラスミドは、次の
ように作成された:スプライスRNAに対するゲノムの検出に用いるSIVKS
YGSは、プライマー
【0105】
【化7】
【0106】 および
【0107】
【化8】 を用いて、818〜1068の間のSIV配列を増幅することによって作成され
た。PCR生成物は次に、Bluescript SK+のBam H1および
Eco R1部位にクローニングされた(Stratagene)。DNAをR
NAから弁別するのに用いるSIVKSLTRは、プライマー
【0108】
【化9】
【0109】 および
【0110】
【化10】 を用いて、300〜750の間のSIV配列を増幅することによって作成された
(図2)。PCR生成物は次に、Bluescript SK+のBam H1
およびEco R1部位にクローニングされた(Stratagene)。
【0111】 野生種リーダー配列または欠損突然変異体のどちらかを含むpRSΔenvS
L(図1)は、10%ウシ胎仔血清、100μg/ml ストレプトマイシンお
よび100U/ml ペニシリンを補足したMEM中で保持されていた293T
細胞に形質移入された。過渡的形質移入は、修飾カルシウムリン酸技法を用いて
、10μgのプラスミドによって実施された。細胞と上澄は、形質移入の48時
間後に収集された。
【0112】 野生種および突然変異SIVベクターは、以前に述べられているように(Mc
Can and Lever 1997, J. Virol. 71, 41
33−4137)、ポリクローナル抗SIV抗血清を用いた免疫沈澱によって、
タンパク質生成について評価した。特に、プロウィルス作成物を用いて形質移入
された細胞の上澄からのウィルス核タンパク質の免疫沈澱を行った。野生種レー
ンは、過負荷を避けるために2倍少ないウィルスを含んでいた。
【0113】 野生種では、SIVの主要構造タンパク質を表すΔ1、Δ2およびΔ3 SI
V特異性バンドが検出できた。驚くべきことに、最小範囲の欠損Δ4は、形質移
入細胞においてウィルスタンパク質を示さなかった。
【0114】 SIV RNAのパッケージングは、以前述べられたRNase保護アッセイ
と、複製RNase保護アッセイによる平均値を用いたパッケージング効率を計
算するために以前の出版物で用いられた(Richardsonら、1993
J. Virol 67, 3997−4005)、スプライスRNAに対する
ゲノムRNAの比によって評価した。ビリオンレーンは、野生種Δ1、Δ2およ
びΔ3の場合は、逆転写酵素について正規化した。Δ4の場合、値は非常に低か
ったため、完全な上澄サンプルを試験した。リボプローブSIVKSLTDを用
いて、RNAからDNAが効率よく除去されたことが確認された(図2)。ビリ
オンおよび細胞RNAバンドはリボプローブSIVKSYGSを用いて分析した
。細胞によるSIV RNAのRNase保護は、細胞上澄からの作成物とビリ
オンによって形質移入した。LTR特異性プローブは、WTウィルスでは、39
5および232のバンドのみが検出されるという点で、RNAの信号特異性を示
している。450におけるDNA特異性バンドは見られない。結果は3回の反復
実験の代表である。隣接するΔ3レーン、偽レーンおよびプローブ+RNase
レーンにも見られる背景バンド以外に、Δ4ビリオンレーンによるシグナルが存
在していなかった。結果を表1にまとめる。
【0115】
【表1】
【0116】 細胞内で検出されるスプライスされたウィルスRNAの比率が高いことが興味
深い。これは、以前HIV−1またはHIV−2で見られたよりも大きい。野生
種RNAパッケージ自体は特異性のレベルが高く、少量だが検出可能な量のパッ
ケージングされたスプライスウィルスRNAが存在することがわかる。欠損Δ1
と、さらに詳細にはΔ2は、パッケ全長ゲノムRNAの量が低下させるが、形質
移入細胞の細胞質内で見られる全長RNAとスプライスRNAの相対比に対して
ほとんど影響を及ぼさない。我々が以前あるHIVリーダー領域欠損突然変異体
で注目したように、Δ1はタンパク質生成を向上させるように思われる。Δ2の
場合、ゲノムRNAはビリオンでは実質的に検出不可能である。この結果は、す
べての実験で再現可能であった。主要スプライスドナーに対する2つの欠損3’
のうち大きいほうであるΔ3欠損は全体として、細胞質内でのゲノムRNAおよ
びスプライスRNAのレベルが低い。しかし、野生種ウィルスに似た比率におい
て、ゲノムRNAが、スプライスRNAよりもはるかに高いレベルでカプシド化
されるという点で選択性がある。Δ4突然変異体によって形質移入された細胞の
細胞質中のゲノム非スプライスおよびスプライスRNAが適量出現したにもかか
わらず、反復実験において、形質移入細胞の上澄からの、パッケージングされた
RNAの出現と一致するシグナルを検出することができなかった。スプライスR
NAのほぼ正確なサイズのかすかなバンドが、ときどき見られた。しかし、この
同一のバンドは制御レーンで常時見られた。リーダー領域の反復配列決定とΔ4
のgag遺伝子全体によって、導入された欠損以外のその他の配列突然変異は明
らかにならなかった。
【0117】 リボヌクレアーゼ保護アッセイの複製による結果は、表1に示されており、欠
損Δ2が、重要なcis作用パッケージングシグナルの特徴的である領域の削除
に最も密接に相関していることを示している。細胞質におけるスプライスRNA
に対するゲノムRNAの比は、突然変異およびWTウィルスで見られる比に似て
いる。しかし、ビリオンではゲノムRNAは実質的に不在である。欠損Δ1およ
びΔ3によって、RNAカプシド化が可能となるが、Δ3の場合は、ビリオンで
検出可能なRNAの全体量がやや低下する。これらの結果は、主要スプライスド
ナー上流に存在するSIVの主要パッケージング信号とほぼ一致する。
【0118】 Δ4突然変異体の表現型は、この欠損がΔ欠損の範囲内に存在するため、やや
問題であり、どちらかというと、cis作用機能に対する影響が少ないと思われ
る。実際にこの突然変異体の注目すべき特徴は、細胞中にウィルスRNAが豊富
であるにもかかわらず、ウィルスタンパク質生成が明らかに行われなかったこと
である。Gagタンパク質の欠如を説明する、追加の配列はΔ4には見られなか
った。
【0119】 我々は、Δ4突然変異がリーダーRNAの第2構造に対して顕著な影響を有す
るかどうかに関して推測し、RNA折畳みプログラム(www.ibc.wus
tl.edu/〜zuker/rna/)を用いてこれを調査した。結果は図3
(a−e)に示す。図3は、パートaの無傷領域のRNA構造を示し、作成され
た4つの欠損突然変異体の境界が示されている:最も外側の5’末端では、ΔP
1と示されている2つの矢印の間に欠損がある;bでは、棒付の生じた構造が削
除配列の部位を示している。cでは、先端の一部の影付塩基(GGUACC)に
より、DISと呼ばれる構造が明らかに削除されているΔP2について同じこと
が当てはまる。顕著なパッケージング欠陥を生じたΔ2突然変異が、ダイマー化
およびカプシド化に関与するリーダーの一部に一致するパリンドローム末端を有
するRNA基部ループを削除していることが興味深い。これはΔ1、Δ3および
Δ4欠損において無傷のままである。これらの欠損は、パッケージングシグナル
が正確に同定されたことを示すパッケージング欠損を引き起こさなかった。しか
しΔ4欠損は、推定上のパッケージングシグナル/ダイマー開始シグナルループ
とウィルスgag開始コドンを含む基部ループとの間の構造化領域を著しく混乱
させる。Δ3突然変異もこの領域を混乱させるが、予測された第2構造の変化は
、基部ループが野生種に存在するΔ4によって引き起こされるほど著しくはなく
、Gag開始コドン上流の他の突然変異体は、非構造化RNAの領域によって置
換される。我々は、Δ4の劇的な効果は、第2構造の激しい混乱によって引き起
こされ、おそらくこの領域に依存する、パッケージング以外のcis作用機能に
影響を及ぼすことを示唆する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1a】 パッケージング研究に使用したSIVベースの構築物および5’リーダーにお
ける欠失部位。
【図1b】 パッケージング研究に使用されるSIVベースの構築物および5’リーダーに
おける欠失部位。
【図2】 ウィルスRNAをDNAと区別し、スプライスおよび非スプライスウィルスR
NAを識別するのに用いるリボプローブ。予想される保護フラグメントサイズを
示す。
【図3a】 SIVmacリーダーRNAの予想される2次構造を示すRNA折畳みであっ
て、aは野生種であり、影の部分は、プライマー結合部位、ダイマー化開始シグ
ナルおよびgag開始コドンに相当する配列を示し、欠失の位置は矢印とボール
ド体で示す。
【図3b】 SIVmacリーダーRNAの予想される2次構造を示すRNA折畳みであっ
て、bはΔ1突然変異であり、影の部分は、プライマー結合部位、ダイマー化開
始シグナルおよびgag開始コドンに相当する配列を示し、太線は、欠失した配
列の位置を示す。
【図3c】 SIVmacリーダーRNAの予想される2次構造を示すRNA折畳みであっ
て、cはΔ2突然変異であり、影の部分は、プライマー結合部位、ダイマー化開
始シグナルおよびgag開始コドンに相当する配列を示し、太線は、欠失した配
列の位置を示す。
【図3d】 SIVmacリーダーRNAの予想される2次構造を示すRNA折畳みであっ
て、dはΔ3突然変異であり、影の部分は、プライマー結合部位、ダイマー化開
始シグナルおよびgag開始コドンに相当する配列を示し、太線は、欠失した配
列の位置を示す。
【図3e】 SIVmacリーダーRNAの予想される2次構造を示すRNA折畳みであっ
て、eはΔ4突然変異であり、影の部分は、プライマー結合部位、ダイマー化開
始シグナルおよびgag開始コドンに相当する配列を示し、太線は、欠失した配
列の位置を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 31/18 C12N 7/00 C12N 7/00 C12R 1:93 //(C12N 7/00 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:93) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG ,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD, RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT, AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,C H,CN,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM, HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,K G,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT ,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW, MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,S D,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR ,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VN,YU, ZA,ZW (72)発明者 グレートレツクス,ジエイン イギリス国、ケンブリツジ・シー・ビイ・ 2・2・キユー・キユー、ヒルズ・ロー ド、アデンブルツクス・ホスピタル、ボツ クス・157、レベル・5、デパートメン ト・オブ・メデイスン (72)発明者 マツキヤン,エイモン イギリス国、バーミンガム・ビイ・15・ 2・テイ・エイ、エジバスタン、ザ・ユニ バーシテイ・オブ・バーミンガム、シー・ アール・シー・インステイテユート・フオ ー・キヤンサー・スタデイーズ (72)発明者 バラン,プレータ アメリカ合衆国、ペンシルバニア・19111、 フイラデルフイア、バーホーム・アベニユ ー・7701、ルーム・ダブリユ・470、フオ ツクス・チエイス・キヤンサー・センター (72)発明者 トーマス,ジヨーン イギリス国、ケンブリツジ・シー・ビイ・ 2・2・キユー・キユー、ヒルズ・ロー ド、アデンブルツクス・ホスピタル、ボツ クス・157、レベル・5、デパートメン ト・オブ・メデイスン Fターム(参考) 4B024 AA01 CA11 EA02 FA01 FA02 GA11 GA25 HA12 HA17 4B065 AA97X AA97Y AB01 BA16 BA24 BB40 CA44 4C084 AA13 NA14 ZB332 ZC552 ZC612 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB33 ZC55 ZC61 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA12 NA14 ZB33 ZC55 ZC61 【要約の続き】

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ウィルスRNAがSIVカプシド内にパッケージングされな
    いようなパッケージングシグナル内に突然変異を有するサル免疫不全ウィルス(
    SIV)ゲノム。
  2. 【請求項2】 ゲノムがプライマー結合部位と5’主要スプライスドナー部
    位の間の領域に欠失を有する、請求項1に記載のSIVゲノム。
  3. 【請求項3】 ゲノムが5’主要スプライスドナー部位とgag開始コドン
    の間の領域に突然変異を有する、請求項1または2に記載のSIVゲノム。
  4. 【請求項4】 ゲノムがDIS構造内に突然変異を有する、請求項1〜3の
    いずれか1つに記載のSIVゲノム。
  5. 【請求項5】 突然変異が (a)配列番号1の配列、または (b)長さが5ヌクレオチド以上のそのフラグメント、または (c)そのどちらかの変異体 の欠失を含む、請求項1〜4のいずれか1つに記載のSIVゲノム。
  6. 【請求項6】 欠損が配列番号1のヌクレオチド53〜85を含む、請求項
    5に記載のSIVゲノム。
  7. 【請求項7】 SIVパッケージングシグナルおよびベクターにおいて発現
    可能な異種遺伝子を含むウィルスベクター。
  8. 【請求項8】 プライマー結合部位と5’主要スプライスドナー部位との間
    の領域、および/または5’主要スプライスドナー部位とgag開始コドンの間
    の領域、またはそのどちらかのフラグメントを含む、請求項7に記載のベクター
  9. 【請求項9】 (a)配列番号1の配列、または (b)長さが10ヌクレオチド以上のそのフラグメント、または (c)そのどちらかの変異体 を含む、請求項8に記載のベクター。
  10. 【請求項10】 異種遺伝子が治療用タンパク質またはペプチド、抗原タン
    パク質またはペプチドをコード化する、請求項7〜9のいずれか1つに記載のベ
    クター。
  11. 【請求項11】 異種遺伝子をコード化するSIVウィルスを生成するプロ
    セスであって、宿主細胞を請求項1〜6のいずれか1つに記載のパッケージング
    欠損SIVゲノムおよび請求項7〜10のいずれか1つに記載のウィルスベクタ
    ーに感染させることと;該宿主細胞を培養することを含むプロセス。
  12. 【請求項12】 請求項11の方法によって生成されるウィルス。
  13. 【請求項13】 請求項12に記載のウィルスおよび製薬的に許容可能な担
    体を含む製薬組成物。
  14. 【請求項14】 SIVまたはHIV感染の治療または予防に使用するため
    の、SIVパッケージング配列またはそれのアンチセンス配列。
  15. 【請求項15】 プライマー結合部位と主要5’スプライスドナーの間の、
    SIVゲノムの領域に由来する5ヌクレオチド以上の配列を含む、請求項14に
    記載のSIVパッケージング配列。
  16. 【請求項16】 (a)配列番号1の配列、または (b)長さが5ヌクレオチド以上のそのフラグメント、または (c)そのどちらかの変異体 を含む、請求項14または15に記載のSIVパッケージング配列。
  17. 【請求項17】 治療用または抗原タンパク質またはペプチドを個体に送達
    する方法であって、請求項12に記載のウィルスまたは請求項13に記載の製薬
    組成物の有効量を個体に投与することを含む方法。
  18. 【請求項18】 請求項14、15または16のいずれか1つに記載のSI
    Vパッケージング配列の有効量を個体に投与することを含む、SIVまたはHI
    V感染の治療または予防の方法。
  19. 【請求項19】 SIVまたはHIV感染の治療または予防のための薬物の
    製造に使用するための、請求項14、15または16のいずれか1つに記載のS
    IVパッケージング配列。
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