JP2002510204A

JP2002510204A - バキュロウイルス発現系内で作製されるレトロウイルスベクター粒子

Info

Publication number: JP2002510204A
Application number: JP50185799A
Authority: JP
Inventors: キングスマン，アラン，ジョン; ジョーンズ，イアン，マーティン
Original assignee: オックスフォードバイオメディカ（ユーケー）リミテッド
Priority date: 1997-06-04
Filing date: 1998-06-04
Publication date: 2002-04-02
Also published as: EP0986649A1; CA2289491A1; NO995900L; NO995900D0; AU741764B2; NZ500936A; IL132359A0; WO1998055640A1; GB9711578D0; CN1259171A; KR20010013332A; AU7780098A

Abstract

(57)【要約】組成物が記載されている。この組成物は、少なくとも１つのバキュロウイルス成分と少なくとも１つのレトロウイルス成分とを含んでなり、該レトロウイルス成分はレトロウイルス粒子にパッケージングできる。

Description

【発明の詳細な説明】バキュロウイルス発現系内で作製されるレトロウイルスベクター粒子本発明は、組成物に関する。特に、本発明は、レトロウイルス粒子を作製するための新規な系に関する。さらに特には、本発明は、１つの目的のヌクレオチド配列(nucleotide sequen ce of interest)(以下、「NOI」と略す)、さらには複数のNOIを目的の部位へと輸送できるレトロウイルス粒子を発現することができる組成物に関する。さらに特には、本発明は、遺伝子治療に有用な組成物に関する。遺伝子治療は、次のうちの任意の１つ以上を含む：例えば１つ以上の標的部位（例えば、標的細胞）における、１つ以上のヌクレオチド配列の付加、置換、欠失、補足、操作、等。標的部位が標的細胞である場合には、該細胞は、組織または器官の一部とすることができる。遺伝子治療の一般的な技術は、Molecular Bi ology（Robert Meyers編，VCH出版，例えば556〜558頁）に見られる。さらなる例として、遺伝子治療はまた、次のうちの任意の１つ以上のための手段を提供する：ヌクレオチド配列（例えば、遺伝子）を適用して欠陥遺伝子を置換または補足できる；病原性遺伝子または病原性遺伝子産物を排除できる；例えばさらに好ましい表現型を創出するために新規な遺伝子を付加できる；癌または他の症状(例えば、免疫、心臓血管、神経学的、炎症性または感染性の障害)を治療するために細胞を分子レベルで操作できる(癌の治療については、Schmidt-Wol fおよびSchmidt-Wolf，1994，Annals of Hematology 69：273-279)；免疫応答を誘発するために抗原を操作および／または導入できる(例えば、遺伝子ワクチン接種)。近年、レトロウイルスが遺伝子治療での使用に提案されている。本質的に、レトロウイルスは、溶菌ウイルスとは異なる生活環を有するRNAウイルスである。この点に関して言えば、レトロウイルスが細胞に感染すると、そのゲノムはDNA の形態に変わる。つまり、レトロウイルスは、DNA中間体を経て複製する感染性のものである。レトロウイルス感染等についてのさらなる詳細については後記する。多くのレトロウイルスがあり、例としては、マウス白血病ウイルス(MLV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)、マウス乳腺癌ウイルス(MMTV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、藤波肉腫ウイルス(FuSV)、モロニーマウス白血病ウイルス(Mo-MLV)、FBRマウス骨肉腫ウイルス(FBR MSV)、モロニーマウス肉腫ウイルス(Mo-MSV)、エーベルソンマウス白血病ウイルス(A-MLV)、鳥類骨髄芽球症ウイルス-29(MC29)、および鳥類赤芽球症ウイルス（AEV）が挙げられる。レトロウイルスの詳細な一覧はCoffinら（"Retroviruses"，1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press編;JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus，pp758-763）に見ることができる。幾つかのレトロウイルスのゲノム構造についての詳細は当業界で見ることができる。例として、HIVについての詳細はNCBI Genbank（すなわち、ゲノム受け入れ番号AFO33819）から見ることができる。全てのレトロウイルスは、３つの主要なコードドメインであるgag、pol、env を含み、これらは本質的にビリオンタンパク質をコードする。それでもなお、レトロウイルスはおおまかに２つのカテゴリー、つまり「単純型(simple)」および「複雑型(complex)」、に分けられる。これらのカテゴリーは、それらのゲノムの構成によって区別される。単純型レトロウイルスは通常、このエレメント情報だけを担持する。これに対して、複雑型レトロウイルスはさらに、複数のスプライスされたメッセージから誘導される別の調節タンパク質もコードする。レトロウイルスは、さらに７つのグループに分けることができる。これらのグループのうち５つは発癌潜在性があるレトロウイルスに該当する。残りの２つのグループは、レンチウイルスとスプマウイルスである。これらのレトロウイルスの総説は、"Retroviruses"(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press編;JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus，pp 1-25)に示されている。ヒトＴ細胞白血病ウイルス−ウシ白血病ウイルスグループ（HTLV-BLV）を除く全ての腫瘍性メンバーは単純型レトロウイルスである。HTLV、BLVならびにレンチウイルスおよびスプマウイルスは複雑型である。最も良く研究されている腫瘍性レトロウイルスの幾つかは、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、マウス乳腺癌ウイルス（MMTV）およびマウス白血病ウイルス(MLV)、ならびにヒトＴ細胞白血病ウイルス(HTLV)である。レンチウイルスグループは、さらに「霊長類」および「非霊長類」に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス(HIV) 、つまりヒト自己免疫不全症候群（AIDS）の原因物質、およびサル免疫不全ウイルス（SIV）が挙げられる。非霊長類レンチウイルスグループとしては、始原型「スローウイルス」であるビスナ-マエディウイルス(VMV)、ならびに関連するヤギ関節炎-脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、そして、つい最近説明されたネコ免疫不全ウイルス(FIV)およびウシ免疫不全ウイルス（BIV）が挙げられる。レンチウイルス科と他のタイプのレトロウイルスとの違いは、レンチウイルスは分裂中の細胞および非分裂中の細胞の両方に対して感染能を有することである (Lewisら，1992 EMBO．J．11:3053-3058，LewisおよびEmerman 1994 J．Virol． 68:510-516)。これに対して、他のレトロウイルス（例えば、MLV）は、非分裂中の細胞（例えば、筋肉、脳、肺および肝臓組織を構成する細胞）に感染できない。感染プロセスの際、レトロウイルスは、まず最初に特定の細胞表面受容体に結合する。感受性宿主細胞に侵入すると、レトロウイルスのRNAゲノムはウイルスによってコードされる逆転写酵素によりDNAへとコピーされ、そのDNAは親ウイルスの内側に運ばれる。このDNAは、宿主細胞の核に輸送され、次いで、その核内で宿主ゲノムに組込まれる。この段階で、それは通常プロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは、細胞分裂の間、宿主の染色体内で安定であり、他の細胞タンパク質のように転写される。プロウイルスは、ウイルスをもっと作るために必要なタンパク質およびパッケージング機構をコードし、できたウイルスは時に「発芽」と呼ばれるプロセスによって細胞から出ることができる。既に示したように、各レトロウイルスゲノムは、gag、pol、およびenvと呼ばれる遺伝子を含み、これらの遺伝子はビリオンタンパク質および酵素をコードする。これらの遺伝子は、両端が長い末端反復配列(LTR)と呼ばれる領域に隣接している。LTRはプロウイルスの組込みおよび転写に関与する。これらはエンハンサー−プロモーター配列としても機能する。つまり、LTRはウイルス遺伝子の発現を調節できるのである。レトロウイルスRNAの包膜(encapsidation)は、ウイルスゲノムの5'末端に位置するpsi配列によって起こる。 LTR同士そのものは同一の配列であり、U3、RおよびU5と呼ばれる３つのエレメントに分けることができる。U3は、RNAの3'末端に特有の配列から誘導される。R はRNAの両末端で繰り返される配列から誘導され、U5はRNAの5'末端に特有の配列から誘導される。これら３つのエレメントのサイズは各種のレトロウイルス間ではかなり異なり得る。理解を容易にするために、LTR、gag、polおよびenvのエレメントとしての特徴を示すレトロウイルスゲノムの簡単な概略図（一定の縮尺で描かれてはいない）を以下に示す。ウイルスゲノムの場合、転写開始部位は（上図に示すように）左側LTRのU3とR の境界にあり、ポリ（Ａ）付加（終結）部位は（上図に示すように）右側LTRのR とU5の境界にある。U3はプロウイルスの転写調節エレメントの大部分を含み、転写調節エレメントには細胞の、ある場合にはウイルスの、転写アクチベータータンパク質に応答性であるプロモーターおよび複数のエンハンサー配列を含む。幾つかのレトロウイルスは、遺伝子発現の調節に関与するタンパク質をコードする次の遺伝子：tat、rev、taxおよびrex、のうちの任意の１つ以上を有する。上図に示すように、レトロウイルスRNAゲノムの基本的分子構造は、（5'）R-U 5-gag，pol，env-U3-R（3'）である。レトロウイルスベクターゲノムにおいては、gag、polおよびenvは存在していないか、または機能的ではない。RNAの両端にあるR領域は反復配列である。U5およびU3は、RNAゲノムのそれぞれ5'末端および 3'末端に特有（ユニーク）の配列を表わす。これらの３つ組の末端配列は、プロウイルスDNAにおいて長い末端反復配列（LTR）を形成しており、これが感染細胞のゲノムに組込まれるゲノムの形態である。野生型レトロウイルスのLTRは（5' ）U3-R-U5（3'）で構成され、したがって、U3およびU5の両方はプロウイルスの組み込みに重要な配列を含む。ゲノムにおいて適切に機能するのに必要な他の必須配列としては、第１鎖の逆転写のためのプライマー結合部位、第２鎖の逆転写に必要なプライマー結合部位、およびパッケージングシグナルが挙げられる。構造遺伝子gag、polおよびenv自体に関して、ほんの少し詳細に説明すれば、g agはウイルスの内部構造タンパク質をコードする。gagはタンパク質分解酵素によりプロセッシングされて成熟タンパク質MA(マトリックス)、CA(キャプシド)、 NC（ヌクレオキャプシド）になる。遺伝子polは、逆転写酵素（RT）(これはDNA ポリメラーゼおよびそれに伴うRNase Hの両活性を含む)およびインテグラーゼ（ IN）(ゲノムの複製を仲介する)をコードする。遺伝子envはビリオンの表面（SU ）糖タンノゝク質および膜貫通（TM）タンパク質をコードし、これらのタンパク質が細胞受容体タンパク質と特異的に相互作用する複合体を形成する。この相互作用により、最終的に、ウイルス膜と細胞膜との融合が起こる。レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質複合体は２つのポリペプチドを含む。すなわち、外側のグリコシル化親水性ポリペプチド（SU）と、膜貫通(membr ane-spanning)タンパク質（TM）である。これらは一緒になって、ビリオンの表面にオリゴマー性の「ノブ(こぶ；knob)」または「ノブ状のスパイク」を形成する。これら２つのポリペプチドはenv遺伝子によってコードされ、細胞表面へ輸送される間にタンパク質分解酵素によって切断されるポリタンパク質前駆体の形態で合成される。未切断のEnvタンパク質は受容体に結合できるが、該タンパク質の融合能を活性化するためにはこの切断事象そのものが必要であり、このタンパク質融合能の活性化はウイルスが宿主細胞に侵入するのに必要である。典型的には、SUおよびTMの両タンパク質とも複数の部位でグリコシル化される。しかし、幾つかのウイルス（例えばMLV）において、TMはグリコシル化されない。 SUおよびTMタンパク質は包膜ビリオン粒子のアセンブリそのものには必ずしも必要ではないが、侵入プロセスにおいて極めて重要な役割を担う。これについては、SUドメインは標的細胞上の受容体分子（特定の受容体分子の場合が多い）に結合する。この結合事象はTMタンパク質の膜融合誘導能を活性化し、その後でウイルスと細胞の膜が融合すると考えられる。幾つかのウイルス、特にMLVにおいて、切断事象（これによってTMの細胞質テイルの短い部分の除去が起こる）は、該タンパク質の十分な融合活性を発揮（uncover）させる上で重要な役割を担うと考えられる(Brodyら，1994 J．Virol．68:4620-4627，Reinら1994 J．Virol．68:1773- 1781)。この細胞質「テイル」は、ウイルス膜の内側に残るTMの膜貫通(membrane -spanning)セグメントからはずっと離れており、その長さは各種レトロウイルス間で相当ばらつきがある。このように、SU／受容体相互作用の特異性は、レトロウイルスの宿主範囲および組織指向性を決定し得る。いくつかの場合、この特異性は、組換えレトロウイルスベクターのトランスダクション能を制限することがある。この理由により、多くの遺伝子療法実験はMLVを用いてきた。4070Aと呼ばれるエンベロープタンパク質を有する特定のMLVは、両種指向性ウイルスとして知られており、これはヒト細胞にも感染できる。何故ならば、このエンベロープタンパク質がヒトとマウスとの間で保存されているリン酸輸送タンパク質に「ドッキング」するからである。この輸送体は遍在性であり、そのため、これらのウイルスは多くの細胞型に感染できる。しかし、幾つかの場合、特に安全性の観点から、限られた細胞を特異的に標的とすることが有益な場合がある。この目的のために、幾つかのグループが、特定のヒト細胞に特異的に感染させるために、その両種指向性類縁物とは異なって通常はマウス細胞だけに感染するマウス同種指向性レトロウイルスを作製した。エンベロープタンパク質の断片をエリトロポエチンセグメントで置き換えことにより組換えレトロウイルスを得たが、これは、表面にエリトロポエチン受容体を発現するヒト細胞（例えば、赤血球前駆体）に特異的に結合した(Mauli kおよびPatel 1997，“Molecular Biotechnology:Therapeutic Applications an d Strategies”1997，Wiley-Liss Inc．PP45)。 gag、polおよびenvに加えて、複雑型レトロウイルスは、アクセサリーまたは補助タンパク質をコードする「アクセサリー」遺伝子も含む。アクセサリーまたは補助タンパク質とは、通常の複製または構造遺伝子gag、polおよびenvによってコードされるタンパク質に加えてアクセサリー遺伝子によってコードされるタンパク質であると定義される。これらのアクセサリータンパク質は、tat、rev、 taxおよびrexによってコードされるタンパク質のように遺伝子発現の調節に関与するタンパク質とは異なる。アクセサリー遺伝子の例としては、vif、vpr、vpx 、vpuおよびnefのうちの１つ以上が挙げられる。これらのアクセサリー遺伝子は、例えば HIVにおいて見ることができる(例えば、”Retroviruses”Coffinら編，CSHL発行 1997の802頁および803頁を参照)。非必須アクセサリータンパク質は、特殊化した細胞型において機能でき、細胞タンパク質によってもたらされる機能と少なくとも部分的に同じ機能をもたらす。典型的には、アクサセリー遺伝子はpolとenv との間、LTRのU3領域を含むenv、またはenvとそれぞれのオーバーラップ部分のすぐ下流に位置する。複雑型レトロウイルスは、ウイルスがコードする転写アクチベーターならびに細胞性転写因子を用いる調節機構を進化させてきた。これらのトランス作用性ウイルスタンパク質は、LTRによって指令されるRNA転写のアクチベーターとして作用する。レンチウイルスの転写トランス型アクチベーターはウイルスtat遺伝子によってコードされる。tatは、TARと呼ばれる安定でステムループ形のRNA二次構造体に結合し、その１つの機能は、Tatを見かけ上最適に配置して転写をトランスで活性化することである。先に述べたように、レトロウイルスは、特に１つまたは複数のNOIを目的の１つ以上の部位へ移送（または移入：transfer）するための輸送系（または、輸送媒体または輸送ベクターとして発現されるもの）として提案されてきた。この移送は、in vitro、ex vivo、in vivoまたはこれらの組合せで起こり得る。この様式で用いられる場合、このレトロウイルスは典型的にはレトロウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターと呼ばれる。レトロウイルスベクターは、受容体の利用、逆転写およびRNAパッケージングを含むレトロウイルスの生活環の様々な局面を研究するためにも開発されている(Miller，1992 Curr Top Micro biol Immunol 158:1-24に概説されている)。遺伝子治療に用いるための典型的な組換えレトロウイルスベクターでは、gag 、polおよびenvタンパク質コード領域のうちの１つ以上の少なくとも一部がウイルスから除去し得る。これはレトロウイルスベクターを複製欠陥性にする。除去部分は、そのゲノムを宿主ゲノムに組込むことができるウイルスを得るために、 NOIで置き換えることができるが、この場合、その改変ウイルスゲノムは構造タンパク質が欠けているために、それ自身を増殖することはできない。宿主ゲノムに組込まれると、NOIの発現が起こり、例えば治療効果が生じる。したがって、目的の部位へのNOIの移送は、典型的には、NOIを組換えウイルスベクターに組込み；この改変ウイルスベクターをビリオンコート内にパッケージングし；そして目的とする部位（例えば、標的細胞または標的細胞集団）のトランスダクションを可能にする、ことによって達成される。続いて行われる例えばパッケージングまたはヘルパー細胞系と組換えベクターとの組合せを用いることによる目的の部位のトランスダクションのために、大量のレトロウイルスベクターを増殖および単離すること（例えば、好適な力価のレトロウイルスベクターを作製すること）が可能である。幾つかの例として、増殖および単離は、レトロウイルスgag、polおよびenv遺伝子を単離すること、ならびにそれらを別々に宿主細胞へ導入して、「パッケージング細胞系」を作製することが必要な場合がある。このパッケージング細胞系は、レトロウイルスDNAをパッケージングするのに必要なタンパク質を産生するが、psi領域が欠失しているために包膜はできない。しかし、NOIおよびpsi領域を担持する組換えベクターをそのパッケージング細胞系に導入すると、ヘルパータンパク質がpsi陽性組換えベクターをパッケージングして、組換えウイルスストックを得ることができる。これは、細胞を感染させてNOIを該細胞のゲノムに導入するのに用いることができる。ゲノムがウイルスタンパク質を作るのに必要な全ての遺伝子が欠如している組換えウイルスは、一回しか感染させることができず、増殖できない。したがって、NOIは、潜在的に有害なレトロウイルスを生じることなく宿主細胞ゲノムに導入される。利用可能なパッケージング系についてまとめたものは、"Retrovirus"（1997 Cold Spring Harbour Laboratory Pres s編;JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus，pp449）に示されている。しかし、この技術は、力価レベルが必ずしも十分なレベルではないという点で問題があるものであり得る。それでもなお、特に初期の設計を用いた場合に頻繁に起こっていたヘルパーウイルスの自然発生的生成の問題に対処するために、レトロウイルスパッケージング細胞系の設計が開発されている。組換えは相同性によって非常に促進されるので、ベクターとヘルパーのゲノムの相同性を低下させるかなくすことによってヘルパーウイルスの生成の問題は軽減する。ごく最近、gag、polおよびenvウイルスコード領域が、パッケージング細胞系に別々にトランスフェクトされる別々の発現プラスミドに担持されて、３つの組換え事象が野生型ウイルス生成に必要となるようにする、パッケージング細胞が開発された。この戦略は、３プラスミドトランスフェクション法と呼ばれることがある(Soneokaら，1995 Nucl．Acids Res．23:628-633)。ベクターが開発されている時にベクターの生成を測定するために、一過性トランスフェクションを用いることもできる。これに関して、一過性トランスフェクションは、安定なベクター作製細胞系の作製に長い時間がかからないようにし、ベクターまたはレトロウイルスパッケージング成分が細胞に対して毒性である場合に用いられる。レトロウイルスベクターの作製に典型的に用いられる成分としては、Gag／Polタンパク質をコードするプラスミド、Envタンパク質をコードするプラスミド、およびNOIを含むプラスミドが含まれる。ベクターの作製には、これらの成分の１つ以上を他の必要な成分を含む細胞に一過性でトランスフェクトすることが含まれる。ベクターが、有害な遺伝子、または細胞周期のインヒビターのような宿主細胞の複製を妨害する遺伝子、またはアポトーシスを引き起こす遺伝子をコードする場合には、安定なベクター作製細胞系を得ることは難しいかもしれないが、一過性のトランスフェクションを用いれば、細胞が死滅する前にベクターを得ることができる。また、一過性感染を用いて、安定なベクター作製細胞系で得られるレベルと同等のベクター力価レベルが得られる細胞系が開発されている(Pearら，1993，PNAS 90:8392-8396)。幾つかのHIVタンパク質の毒性（この毒性は安定なHIV系パッケージング細胞の作製を困難にすることがある）を考慮して、HIVベクターは通常、ベクターおよびヘルパーウイルスの一過性トランスフェクションによって得られる。何人かの研究者はHIVのEnvタンパク質を水疱性口内炎ウイルス（VSV）のEnvタンパク質と置換してみた。VSVのEnvタンパク質の挿入はベクター濃度を高めた。これは、一過性トランスフェクションによって５×10⁵（濃縮後には10⁸）の力価を有するHI V／VSV-Gベクターが作製されたことによる(Naldiniら，1996 Science 272:263-2 67)。このように、HIVベクターの一過性トランスフェクションは、高力価のベクターの作製に有用な戦略をもたらし得る(Yeeら，1994 PNAS．91:9564-9568)。しかし、この方法を用いた場合の欠点は、VSV-Gタンパク質が細胞に対して極めて毒性であることである。したがって、そして示されているように、レトロウイルスベクターは、生物医学的研究および遺伝子治療に広く用いられる。現行のレトロウイルスベクターの作製方法は、野生型レトロウイルスゲノムの２つの役割、すなわち、タンパク質をコードするという役割と新規なゲノムコピーの鋳型としての役割を切り離すことができる、という事実を用いるものである(例えば、Soneokaら，1995 Nucl．A cids Res．23．628およびそこでの引用文献)。新規なウイルス粒子のアセンブリならびに酵素および調節機能に必要なタンパク質は、非ゲノム配列（例えば、哺乳動物パッケージング細胞系のもの）によって作製できる(例えば、Miller 1990 Hum．Gene Therapy 1，5)。タンパク質コード化機能が欠如しているゲノム配列が提供され、そのため、得られるレトロウイルスベクター粒子は感染能はあるが、標的細胞内での複製能はない。このゲノム配列はまた、治療遺伝子の輸送および組込み用として設計することもできる(VileおよびRussel 1995 Brit．Med．Bu ll 51，12）。マウス白血病ウイルス（MLV）系ベクターの標準的作製方法には、例えば、MLVのgag-polおよびenv遺伝子（パッケージング成分）を発現する細胞系の使用が含まれる。これらは、トランスダクションにより、または適当なプラスミドを用いたトランスフェクションにより導入される適合性レトロウイルスベクターゲノムをパッケージングする。別の方法は、適切な細胞へのgag-pol、env およびベクターゲノムプラスミドの同時トランスフェクションを含む。これらの系の原理は十分に理解されてはいるが、実際面では、再構築されたウイルスアセンブリ系は、遺伝子治療で使用するために実際に必要とされる大量のベクター粒子を作製できない場合が多い。レトロウイルスベクター粒子は通常、粒子生産細胞の培養物から上清を除去することによって回収される。こうして得られる懸濁液は、物理的方法を用いてベクター粒子について濃縮することができるが、但しある限られた程度までしか濃縮できない。何故ならば、凝集や損傷といった問題が起こりやすいからである。したがって、ベクター粒子の懸濁液は10 0倍程度までしか濃縮できないかもしれない。本発明は、続いて医療において用いるのに有用となり得るウイルス粒子を調製するための改善された系を提供しようとするものである。特に、本発明は、続いて医療において使用するのに有用となり得る高力価のウイルス粒子を調製するための改善された系を提供しようとするものである。本発明の第１の態様によれば、少なくとも１つのバキュロウイルス成分と少なくとも１つのレトロウイルス成分とを含む組成物であって、該レトロウイルス成分はレトロウイルス粒子にパッケージングできる上記組成物が提供される。本発明の第２の態様によれば、少なくとも１つのレトロウイルス成分を含むバキュロウイルス発現系である組成物であって、該レトロウイルス成分がレトロウイルス粒子にパッケージングできる上記組成物が提供される。本発明の第３の形態によれば、本発明による組成物の発現によって得られるレトロウイルス粒子が提供される。本発明の第４の形態によれば、本発明による組成物を発現させることを含む、レトロウイルス粒子の調製方法が提供される。本発明の第５の形態によれば、本発明による組成物を含む昆虫細胞が提供される。本発明の第６の形態によれば、昆虫細胞内に本発明による組成物を含む、レトロウイルスベクター粒子作製系が提供される。本発明の第７の形態によれば、本発明によるレトロウイルスベクター粒子作製系によって作製されるレトロウイルスベクター粒子が提供される。本発明の第８の形態によれば、5'および3'末端を有するレトロウイルスベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、該レトロウイルスベクターゲノムはバキュロウイルス発現系内で発現しレトロウイルスベクター粒子にパッケージングできる上記発現ベクターが提供される。好ましくは、上記レトロウイルス成分は、レトロウイルスゲノムに相当する。好ましくは、上記組成物は、上記レトロウイルスベクターゲノムのRNA転写開始部位を含み、かつ、上記レトロウイルス成分をコードするヌクレオチド配列が、該RNA転写開始部位の上流に位置する上流プロモーター成分と該RNA転写開始部位の下流に位置する下流プロモーター成分とを含むプロモーターに作動可能なように連結している。好ましくは、上記下流プロモーター成分は上記レトロウイルスベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド配列の上流にある。１つの実施形態では、好ましくは、上記プロモーターはバキュロウイルスプロモーターである。好ましくは、上記プロモーターはポリヘドリンプロモーター、p10プロモーターおよび／またはpolhプロモーターである。１つの実施形態では、好ましくは、上記プロモーターは非バキュロウイルスプロモーターである。好ましくは、上記プロモーターはT7プロモーターまたはsp6サルモネラファージプロモーターである。好ましくは、上記組成物は、少なくとも１つのRNA切断成分を含む。好ましくは、上記RNA切断成分の少なくとも１つの操作により、どのようなバキュロウイルス成分も含まないレトロウイルスゲノムが生じる。好ましくは、上記RNA切断成分の少なくとも１つは、上記プロモーターと上記レトロウイルス成分をコードする配列との間に位置する。好ましくは、上記RNA切断成分の少なくとも１つは、引き続いて起こる上記レトロウイルスベクター成分の5'末端での切断のために、該ベクター成分をコードする配列に直に隣接して位置する。好ましくは、上記RNA切断成分の少なくとも１つは、上記レトロウイルス成分をコードする配列の下流に位置する。好ましくは、上記RNA切断成分は、引き続いて起こる上記レトロウイルス成分の3'末端での切断のために、該ベクター成分をコードする配列に直に隣接する切断部位を有する。好ましくは、上記RNA切断成分の少なくとも１つは、引き続いて起こるその切断のための、リボザイム切断部位である。好ましくは、各RNA切断成分は、引き続いて起こるその切断のための、リボザイム切断部位列である。上記リボザイム切断部位または各リボザイム切断部位は、上記組成物から別に誘導されるリボザイムによって切断され得る。しかし、好ましくは、リボザイム切断部位の任意の１つ以上は上記第２のウイルス成分から誘導されるリボザイムによって切断される。リボザイムは、通常は必然的に伴うタンパク質の関与を受けることなく細胞内の特定の化学反応を触媒するように機能できるRNA分子である。例えば、グループＩのリボザイムは、自己スプライシング型前駆体RNAからの自身の切り出しを仲介できるイントロンの形態をとる。他のリボザイムは、ウイルスRNA分子の複製に必須の自己切断型RNA構造体から誘導される。タンパク質酵素と同様に、リボザイムは、基質ならびに補因子（例えば金属イオン）に対する特異的結合部位をもたらす二次および三次構造体へと折りたたまれ得る。そのような構造体の例としては、ハンマーヘッド型、ヘアピン型またはステムループ型、結び目様およびデルタ肝炎アンチゲノム型(hepatitis delta antigenomic）リボザイムが挙げられる。それぞれのリボザイムは、標的RNA内の認識部位を認識して結合するモチーフを有する。このモチーフは１つ以上の「結合アーム」の形態をとるが、通常は２つの結合アームの形態である。ハンマーヘッド型リボザイムの結合アームは、ヘリックスIIに隣接する隣接配列ヘリックスＩおよびヘリックスIIIである。これらは様々の長さ（通常はそれぞれ６から10ヌクレオチド）のものであり得るが、より短くても長くてもよい。この隣接配列の長さは切断速度に影響を及ぼし得る。例えば、隣接配列の全ヌクレオチド数を20から12へと減らすことにより、HIV 配列を切断するリボザイムのターンオーバー速度を10倍増大させることができることがわかっている(Goodchild．JVK．1991 Arch Biochem Biophys 284:386-391 )。ハンマーヘッド型リボザイム内のリボザイム・ヘリックスIIにおける触媒モチーフは、標的RNAを切断部位と呼ばれる部位で切断させる。リボザイムが任意の所与のRNAを切断するかどうかは、適当な切断部位を含む該リボザイムに対する認識部位の存在の有無によって決まる。各タイプのリボザイムはそれ自身の切断部位を認識する。ハンマーヘッド型リボザイムの切断部位は、すぐ上流にヌクレオチド塩基トリプレットGUX（但し、G はグアニンであり、Uはウラシルであり、Xは任意のヌクレオチド塩基である。）を有する。ヘアピン型リボザイムは、切断部位BCUGNYR（但し、Bはアデニン以外の任意のヌクレオチド塩基であり、Nは任意のヌクレオチドであり、Yはシトシンまたはチミンであり、Rはグアニンまたはアデニンである。）を有する。この切断部位において、ヘアピン型リボザイムによる切断はGとNの間で起こる。リボザイムに関するさらなる詳細は、「Molecular Biology and Biotechnolog y」（RA Meyers編，1995 VCH Publishers Inc p831-8320）および「Retroviruse s」（JM Coffinら編，1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press pp683）に見ることができる。本発明のこの実施形態の広い態様は、少なくとも、第１ウイルスから得ることができる第１ウイルス成分と、第２ウイルスから得ることができる第２ウイルス成分とを含む組成物であって、該第１ウイルスは該第２ウイルスとは異なり、該第２ウイルス成分は少なくとも２つの切断部位（これは同じであっても異なっていてもよい）に隣接し、該第２ウイルス成分の少なくとも一部はウイルス粒子にパッケージングでき、そして該ウイルス粒子はどのような第１ウイルス成分も実質的に含まない上記組成物に関する。ここにおいて、好ましくは、上記切断部位の少なくとも１つはリボザイム切断部位である。ここにおいて、好ましくは、上記切断部位の各々はリボザイム切断部位である。本発明のこの態様によれば、上記リボザイム切断部位は、上記組成物から別に誘導されるリボザイムによって切断され得る。しかし、好ましくは、上記リボザイム切断部位の任意の１つ以上は上記第２ウイルス成分から誘導されるリボザイムによって切断される。ここにおいて、好ましくは、上記第１ウイルスはバキュロウイルスである。ここにおいて、好ましくは、上記第２ウイルスはレトロウイルスである。好ましくは、上記下流プロモーター成分は上記レトロウイルス成分をコードする配列内に位置する。好ましくは、上記下流プロモーター成分は上記レトロウイルスベクターをコードする配列内に位置する。好ましくは、上記レトロウイルス成分は、レトロウイルスベクターゲノムをコードする配列の両端にレトロウイルスR領域を含み、そして上記下流プロモーター成分が5'側R領域内に位置し、かつそれに対応する配列を3'側R領域内に含む。１つの実施形態では、好ましくは、上記組成物は、下流方向に向って、上流バキュロウイルスプロモーター成分、下流バキュロウイルスプロモーター成分、リボザイム配列、レトロウイルス5'側R領域、レトロウイルスU5領域、そのレトロウイルスベクターによって輸送しようとする１つ以上の遺伝子を挿入するためのレトロウイルスベクター領域、レトロウイルスU3領域、レトロウイルス3'側R領域、および場合によって第２のリボザイム配列を含む。１つの実施形態では、好ましくは、上記組成物は、下流方向に向って、上流バキュロウイルスプロモーター成分、下流プロモーター成分を含むレトロウイルス 5'側R領域、レトロウイルスU5領域、そのレトロウイルスベクターによって輸送しようとする１つ以上の遺伝子を挿入するためのレトロウイルスベクター領域、レトロウイルスU3領域、レトロウイルス3'側R領域、および場合によってリボザイム配列を含む。好ましくは、上記組成物は、上記レトロウイルス成分を含むレトロウイルスベクター粒子を作製するための１つ以上のパッケージング成分をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、上記組成物はさらに、少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列 (NOI)を含む。好ましくは、上記NOIは医療において有用である。好ましくは、上記NOIは上記レトロウイルス成分の一部である。本発明に関連して本明細書中で用いられる「組成物」なる用語は、１つの存在物（entity）(例えば、組成物(a composition of matter))または１つ以上の存在物を含み得る。例えば、上記第１および第２の態様の組成物は、１つの存在物、例えば、少なくとも一部が本発明のレトロウイルス成分によって置換されている改変バキュロウイルスゲノムであり得る。「改変(modified)」なる用語は、野生型ゲノムを実際に改変すること、または野生型ゲノムから改変できたであろう存在物を最初から構築すること（例えば、改変ゲノムに相当する存在物が形成されるように、２つ以上の断片を連結することによる）を含む。さらなる例として、本発明のパッケージング成分は、すぐ上に記載した存在物とは異なる存在物に含まれていてもよい。さらなる例として、本発明の組成物は、レトロウイルス粒子プロデュサーおよび／またはベクターであり得る。この組成物は、上記バキュロウイルス成分を含む第１部分と上記レトロウイルス成分を含む第２部分とを含むキットであってもよい。場合により、このキットは、１つ以上の他の部分、例えば１つ以上の適切な制限酵素などを含んでいてもよい。「レトロウイルスベクターゲノム」なる用語は、感染能はあるが、それ自身では複製能がないレトロウイルス核酸を含む。つまり、それは複製欠陥性である。レトロウイルスベクターゲノムは、標的細胞に輸送するための非レトロウイルス起源のポリヌクレオチド配列を担持するか、または担持できる。レトロウイルスベクターゲノムはさらに非レトロウイルス配列を含むことができ、この非レトロウイルス配列としては、プロウイルスとして標的細胞に組込まれるとそのゲノムの発現に影響を及ぼす、U3領域内の非レトロウイルス調節配列が挙げられる。レトロウイルスベクターゲノムは、単一のレトロウイルスだけに由来するエレメントを含んでいる必要はない。例えば、WO96／37623では、２種の異なるレトロウイルスから誘導されるハイブリッドLTRを有するレトロウイルスベクターが記載されている。「レトロウイルスベクター粒子」なる用語は、好ましくは標的細胞に結合して侵入できる、パッケージングされたレトロウイルスベクターゲノムを意味する。この粒子の成分は、ベクターゲノムについて既に述べたように、野生型レトロウイルスについて改変されていてもよい。例えば、該粒子のタンパク質性コート内のエンベロープタンパク質は、そのターゲッティング特異性を変えるか、または幾つかの他の所望の機能を達成する目的で遺伝子改変されていてもよい。レトロウイルス成分がenvヌクレオチド配列を含む場合には、その配列の全部または一部は場合によって、別のenvヌクレオチド配列の全部または一部で置換することができる。このenv遺伝子の異種env遺伝子による置換は、例えば、「擬似タイピング(pseudotyping)」と呼ばれる技法または戦略の一例である。擬似タイピングは新規な現象ではなく、その例はWO-A-98/05759、WO-A-98/05754、WO-A -97/17457、WO-A-96/09400、WO-A-91/00047およびMebatsionら，1997，Cell 90 ，841-847に見ることができる。擬似タイピングは１つ以上の利点をもたらし得る。例えば、レンチウイルスベクターの場合、HIVをベースとする（HIV系）ベクターのenv遺伝子産物は、これらのベクターがCD4と呼ばれるタンパク質を発現する細胞にだけ感染するように制限する。しかし、これらのベクター内のenv遺伝子が他のRNAウイルス由来のen v配列で置換されると、それらはより広い感染スペクトルを持つことができる(Verma およびSomia，1997，Nature 389:239-242)。例として、研究者達は、VSV由来の糖タンパク質を用いてHIV系ベクターを擬似タイピングしている(VermaおよびSom ia，1997，前掲)。本発明によれば、本発明者らは、驚くべきことに、機能的レトロウイルスベクター粒子がバキュロウイルス発現系で作製でき、それらの粒子が１つ以上のNOI を標的細胞にうまく輸送できることを見出した。本発明のもう１つの重要な利点は、哺乳動物系において得られるものよりも高い力価のベクター粒子が作製できることである。これもまた意外な知見である。さらに、バキュロウイルス発現系が内因性の哺乳動物遺伝物質を含まず、そのために、得られるレトロウイルスベクター調製物中に哺乳動物性の混入物が存在する、という危険性を低減できる、というさらなる利点がある。これに関して、昆虫性の混入物は、哺乳動物系において生物学的に活性である可能性は非常に低く、そのため、哺乳動物性の混入物よりも問題が少ないと期待される。示されるように、本発明の組成物はバキュロウイルス成分を含む。簡単に言うと、バキュロウイルスは、主に昆虫で見出される別種のグループのウイルスであり、おそらくは既知の節足動物宿主を持たない(O'Reillyら，Bacul ovirus Expression Vectors，A Laboratory Manual，1994，Oxford University Press)。それらは、比較的大きな異種DNAの挿入物（例えば本発明によるNOI）を収容できる(O'Reillyら，Baculovirus Expression Vectors，A Laboratory Manu al，1994，Oxford University Press)。それらは、非常に強い異種遺伝子DNA（例えば本発明によるNOI）の発現能を有し、例えば、全細胞タンパク質の25から5 0％の発現レベルが報告されている。さらに詳細に言うと、バキュロウイルスは、棹形キャプシド内に大きな二本鎖環状DNAゲノムを有する。キャプシド内で、このDNAは凝縮されて、コアとして知られる核タンパク質構造体になる。このキャプシドとコアはひとまとめにしてヌクレオキャプシドと呼ばれる。バキュロウイルスDNAの長さは80から120キロ塩基対（ｋｐｓ）である。通常発現ベクターとして開発されているバキュロウイルスであるAutographa californi a多核多面体ウイルス(multi nuclear polyhedrosis virus)（AcMNPV）(Millerら，198 7，Genetic Engineering，第８巻，Setler、JKおよびHollaender A編，Plenum P ress，New York)およびカイコウイルスであるBombyx mori核多面体ウイルス（Bm NPV）(Maedaら，1985，Nature 315:592-594)は共に約130kpbである。ヌクレオキャプシドは感染細胞の核の中で作られ、続いて２段階プロセスの一方により包膜される(つまり、膜を得る)。ヌクレオキャプシドは感染細胞の細胞膜から発芽できるか、またはそれらが作られる核内でエンベロープを得ることができる。包膜ヌクレオキャプシドはウイルス粒子またはビリオンと呼ばれる。ウイルスのこの細胞膜発芽形態のものは発芽ウイルス（budded virus;BV）と呼ばれる。通常の感染の間に、このウイルスは、結晶性タンパク質マトリックスに埋め込まれた包膜ヌクレオキャプシドを含む核封入体(nuclear occlusion body)を作るが、この主成分はポリヘドリンと呼ばれるウイルスによってコードされるタンパク質である。ポリヘドリンは、バキュロウイルスゲノム内の単一遺伝子の産物であり、感染後期には、感染昆虫細胞によって作られる全タンパク質の50％以上まで産生される。ポヘドリン(polh)遺伝子の転写は、非常に活性なプロモーターによって駆動され、そのため、このプロモーターは外来遺伝子の発現を駆動するためのプロモーターとして理想的に好適化される。ポリヘドリン遺伝子を外来遺伝子で置換した場合、同様のレベルのタンパク質産生が起こり得る。したがって、発現ベクターの構築は、外来コード配列をポリヘドリン・プロモーターのすぐ下流に挿入することからなる。しかし、これは直接達成することはできない。何故ならば、大きなサイズ（約130kbp）のウイルスDNAが簡易なin vitro操作の妨げとなるからである(OldおよびPrimose，1989，“Principles of Genetic Manipul ation”，第４版，Blackwell Scientific Publications，pp290-291)。昆虫バキュロウイルス発現系は、一般に幾つかの真核生物タンパク質の生物学的活性に必要な適切な折りたたみ、ジスルフィド結合の形成、オリゴマー化および／または他の翻訳後修飾へと導き易い真核性の環境をもたらす。バキュロウイルス感染昆虫細胞内で起こると報告されている翻訳後修飾としては、シグナル切断、タンパク質分解酵素による切断、Ｎ-グリコシル化、Ｏ-グリコシル化、アシル化、アミド化、リン酸化、プレニル化(prenylation)およびカルボキシル化が挙げられる。そのような修飾の部位は通常、昆虫および哺乳動物細胞において産生されるタンパク質において同じ位置である(O'Reillyら，前掲)。バキュロウイルス発現ベクターの有利な特徴は、非常に強い異種遺伝子DNA（例えば、本発明によるNOI）の発現能である。バキュロウイルス発現ベクターを用いて報告されている最も高い発現レベルは、全細胞タンパク質の25％〜50％である。そのようなレベルは、polh遺伝子（ポリヘドリン）発現と同等であり、細胞10⁹個（例えば培養物１リットル）当たリタンパク質産物約１グラムに相当する。しかし、全ての異種タンパク質がポリヘドリンと同レベルで産生されるわけではなく、いくつかのケースでは全細胞タンパク質のほぼ25％(approaching 25%) のレベルが達成されている。これらのケースの大部分は、他のウイルス科の構造遺伝子の発現に関するものであり、その産物は極めて安定であった。大部分の異種タンパク質は、細胞10⁹個当たり10mgから100mgの範囲のレベルで産生される。それでもなお、各種の真核性発現系を比較した場合、バキュロウイルス系は通常、全体的なタンパク質産生において他の発現系よりも優れている。したがって、１つの広い態様において、本発明は、大量のNOIまたはその発現産物を生産するための生産装置(production facility)（例えば、バット、さらには器官またはその細胞）であって、NOIを含むバキュロウイルス組成物を含む媒体を含む上記装置を提供する。好ましくは、そのバキュロウイルス組成物は、本発明の第１の態様による組成物である。超後期プロモーター(very late promoter)（例えば、polhおよびp10プロモーター）はウイルス複製のユニークな封入期の間に活性化され強力に転写されるものであるが、これらの使用は、バキュロウイルス系発現系に明らかな利点をもたらす。この封入期はBV形成を含む後期とは異なるので、異種遺伝子DNA（例えば、本発明によるNOI）の発現は、BV生成を最低限にしか妨害せず、ウイルスが異種遺伝子の欠失または不活性化へと突然変異することに対する淘汰圧は非常に低い。超後期発現は、細胞傷害性遺伝子産物のように必須の細胞機能に対して有害な影響を有する異種遺伝子DNA（例えば、本発明によるNOI）の発現に特に有利である。超後期のウイルス感染の間に遺伝子を発現させることのマイナス面は、細胞の翻訳後修飾能がその後期の間に低下するように見えることである。バキュロウイルスの棹形ヌクレオキャプシドは、大きなウイルスDNAゲノムを収容するように伸びることができ、バキュロウイルスベクターはさらに100kbpの DNAまたはそれ以上のものを収容できると思われる。バキュロウイルスベクター系を用いて同時に発現できるかもしれない遺伝子の数もまた多いと思われる。しかし、非常に大きな挿入物を作製するためには、挿入物を徐々に大きくしながら構築してゆくことを可能にする一連の移送プラスミド(transfer plasmid)を構築する必要が出てくるかもしれない。この制限は、ベクター系そのものではなくin vitroで大きなDNAが脆い場合には、さらに強くなるはずである。また、３つ以上の遺伝子を発現させようとする場合、さらなる移送プラスミドが必要となる。全ての特性決定されたバキュロウイルスの超後期遺伝子はスプライシングされないが、効率的に発現される。したがって、このバキュロウイルス系は、スプライシングされていないcDNA遺伝子を発現させるのに特に有用である。しかし、このバキュロウイルス発現系は、少なくともある種のスプライシングを行い、特定の遺伝子産物を多重遺伝子ファミリーから同定したり獲得することにおけるその有用性が注目されている。したがって、１つの広い態様において、本発明は、少なくとも１つのイントロンを含むNOIを発現するためのバキュロウイルス組成物の使用を提供する。好ましくは、このバキュロウイルス組成物は、本発明の第１の態様による組成物である。バキュロウイルスベクターは、ヘルパーウイルス非依存性であり、そのために使用が比較的簡易である。組換えバキュロウイルスの構築は、クローニングされた高発現性組換え真核細胞系の構築よりも相当早く簡易である。 AcMNPV系およびBmNPV系ベクターを用いるための基本的技術は簡易ではあるが、AcMNPV系の系は最も一般的な用途にとって多くの利点を有する。AcMNPVの複製をサポートする細胞系は、BmNPVの複製をサポートする細胞系よりも増殖特性および発現レベルにおいて優れる。さらに、AcMNPV系の系に利用可能な移送プラスミドおよび親ウイルスの範囲は、BmNPV系の系の場合よりもずっと広い。さらに、遺伝子改変したAcMNPV系ベクターは、昆虫細胞でしか複製しないので有利であり、大きなもの（15kbより大きな挿入物）を担持できる(BoyceおよびButcher，1 996，PNAS 93:2348-2352)。最も一般的にAcMNPV系ベクターと共に用いられる細胞系はSpodoptera frugipe rda（SF）細胞系である。この理由は、該細胞系が十分に試験されており、優れた増殖および取り扱い特性を有するからである。これらの細胞は幾つかのタンパク質を全細胞タンパク質のほぼ20％またはそれ以上のレベルで産生することが報告されており、どのような他の一般的に利用可能な細胞系もこれらより３倍以上高いタンパク質収量をもたらさないと思われる。特に、SF細胞系IPBL-SF-21 AE （Vaughnら，1977，In Vitro，13，213-217）のようなSf細胞系の使用が好ましい。誘導細胞系Sf9またはSf8も好ましいものであり得る。しかし、Tricoplusian i368（KurstackおよびMarmorosch，1976，Invertebrate Tissue Culture Applic ations in Medicine，Biology and Agriculture．Academic Press，New York，U SA）のような他の細胞系を用いることも可能である。これらの細胞系、ならびに本発明での使用に好適な他の昆虫細胞系（例えば、pBAC4x-1）は市販されている (例えば、Stratagene，La Jolla，CA，USAおよびNovagenから販売)。 AcMNPV系ベクターの宿主特異性は節足動物に限られると思われるが、組換えAc MNPVウイルスが様々な哺乳動物細胞系に感染できることが実証されている(Boyce およびButcher，1996，PNAS 93:2348-2352)。肝臓だけへの感染を可能にしないレトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターとは違って、遺伝子改変したAcMNPVバキュロウイルスは肝細胞に対して強い優先性を示すことが実証されている(Sandigら，1996，Human Gene Ther 7:1937-1945；Hofmannら，1995，PNA S 92:10099-10103)。 NOIは通常、対立遺伝子置換によってバキュロウイルスゲノムへ導入される。対立遺伝子置換の戦略において、外来遺伝子は、必要とされるウイルスプロモーターの下流となり、かつ該遺伝子および該プロモーターをウイルスゲノム内の特定の領域にターゲティングするウイルス配列によって両端が挟まれるようにして、移送プラスミドに挿入される。このプラスミドおよび親ウイルスDNAは宿主細胞に同時トランスフェクトされ、該細胞内の酵素がそれらのDNAを組み換える。これは主に、外来遺伝子に隣接するプラスミドDNAの領域と、それらに対応するウイルスゲノム内の相同性の領域との間での相同組換えを含む。バキュロウイルス発現系では「後期」および「初期」プロモーターが用いられる。 polhおよびp10プロモーターは、感染後期に発現される強力なプロモーターの例である。転写にとって重要であり得る多くのウイルス遺伝子産物は同定されてはいるものの(Hasnainら，1997，Gene 190:113-118)、これらのプロモーターからの転写の調節は、現在のところあまり十分には理解されていない。バキュロウイルス感染細胞内でゆっくりとプロセッシングされる非毒性のタンパク質については、感染プロセスの初期に遺伝子発現を駆動するプロモーターも検討されている。バキュロウイルス発現系はまた、遺伝子を非融合タンパク質として発現させることについて優れた実績があるが(例えば、遺伝子をそれらの天然の翻訳開始コドンおよびN-末端配列を用いて発現させる場合)、幾つかのタンパク質は融合体のようにより高いレベルで発現される。レトロウイルスのウイルス様粒子（VLP）を作製するために昆虫バキュロウイルス発現系が用いられていることが知られている(例えば、Gheysenら，1989，Ce ll 59，103；Morikawaら，1991，Virol．183，288；Griffithsら，1993，J．Vir ol．67，3191；Sommer feltら，1993，Virol．192，298を参照されたい)。そのような昆虫バキュロウイルス系は、Gagアセンブリ反応の解析に広く用いられており、行われた多くの観察は遺伝子治療用ベクターの作製に関するものである。プロテアーゼ遺伝子およびポリメラーゼ遺伝子の同時発現（gagl-pol構築物を用いる）によりウイルス粒子の成熟が起こって、最終ウイルス粒子内の全ての機能的GagおよびPol抗原をもたらす(Konvalinkaら，1995，Eur．J．Biochem．228，1 91；Wagnerら，1992，Arch．Virol．127，117)。また、VLP発現細胞の細胞表面に存在するエンベロープ抗原は、VLPに取り込まれる(Yamshchikovら，1995，Vir ol．214，50；Garnierら，1995，J．Virol．69，4060）。しかし、VLPがウイルスゲノムを含まないタンパク質性粒子であることに注目すべきである。これに関して、VLPは非感染性であり、複製に必要なウイルス（または他のDNA／RNA）を欠く。VLPは宿主細胞内で複製しない。ヒツジを用いた実験から、VLPがサブユニットワクチン（ウイルスタンパク質）または化学的不活性化により死滅するウイルスよりも免疫源性が高いことが示されている。さらに、それらは体液性で細胞媒介性で粘膜性の免疫性を誘発するのにはより有効である。VLPは作製および取り扱いも安全である。VLPの作製に用いられるバキュロウイルスベクターおよび宿主細胞は、哺乳動物供給源からは誘導されない。したがって、それらは哺乳動物由来の病原体を含むことはない(Roy，P，1996，Intervirology 39: 62-71)。OBM 10詳細本文(spec．text)２頁20〜30行目および３頁１〜10行目を参照されたい)。また、レトロウイルスVLPの形成に必要とされるものが単一gag遺伝子の発現だけであることが判明しており、生産されるレトロウイルスVLPの量は、そのgagによってコードされる前駆体タンパク質の発現レベルに正比例すると思われる。したがって、レトロウイルスVLPの発芽プロセスを制限する二次修飾はなく、VLPの収量は生産されるバキュロウイルスのレベルよりも高い。 WO95/22617では、レトロウイルスベクター作製のためにバキュロウイルス系を使用することが示唆されているが、重要なことに、これが達成されるであろう手法については何も示されていない。このように、レトロウイルスタンパク質に関する観察はあるにもかかわらず、そして数年にわたって文献のデータを利用することができたにもかかわらず、レトロウイルスベクターの作製のためにバキュロウイルス発現系は今日まで用いられていなかった。この１つの理由は、レトロウイルスのタンパク質成分は昆虫バキュロウイルス系でうまく作製されてはいたが、機能的レトロウイルスベクター粒子に対する要件に合致するとは予想されなかったことである。これらの要件としては、ベクターゲノムの正確なパッケージング、および得られたベクター粒子の標的細胞への感染とプロウイルスとして組込みの能力が挙げられる。特に考えられるのは、標的細胞内でRNAからプロウイルスDNAへの正確な逆転写を受けることができ、かつ標的細胞ゲノムにうまく組込まれることができるプロウイルスDN Aを作製できるベクターゲノムを必要とすることである。これは、RNAが逆転写に必要とされる適切な開始(priming)部位および他の認識部位を含んでいること(Lu ciwおよびLeung:The Retroviridae．J.A．Levy編，1992，Plenumに概説されている)、およびDNA産物が組込みを達成するのに必要な末端配列を有すること（Luci wおよびLeung．前掲；Cannonら，1996，J．Virol．70，8234に概説されている）を必要とする。さらに、組込まれたプロウイルスは、引き続いて起こる組込みに際して遺伝子発現に必要な調節エレメントを含んでいなければならない。本発明の結果は非常に驚くべきものである。何故ならば、バキュロウイルス発現系は、レトロウイルスベクターを作製するためのバキュロウイルスベクターの設計を困難なものにするある独特の特徴を持っていたからである。一部その効率のために必要とされるバキュロウイルスプロモーターのエレメントは、RNA転写開始部位の下流にある（PosseおよびHoward，1987，Nucl．Acids．Res．15，102 33；Rankinら，1988，Gene 70，39；Ooiら，1989，J．Mol．Biol．210，721）。これは、ベクター力価の増大をもたらすのに必要である効率的な転写のために、レトロウイルスベクターゲノムは必ずその5'末端にバキュロウイルス配列を有すること意味する。そのような非レトロウイルス配列の存在は基本的には望ましいことではなく、逆転写および組込みのための特定のレトロウイルス末端配列が必要になり、正常なレトロウイルスベクターゲノムの機能を妨害すると予想できる。示したように、本発明は、レトロウイルスベクターおよび／またはレトロウイルス粒子（これはベクターとして作用できるものであり得る）の作製に有用であるバキュロウイルス発現系を提供することによって、従来技術の問題を克服する。本発明によって、または本発明の組成物から作製されるレトロウイルス粒子（これはまた、「レトロウイルス粒子ベクター」であると表現してもよい）は、１つ以上のNOIをin viroおよびin vitroで細胞に輸送するのに、特に治療上活性な NOIを輸送するのに有用である。１つ以上の選択されたNOIは、標的細胞内での発現のためにベクターゲノムに取り込まれ得る。このNOIは１つ以上のそれ自身の発現調節配列を有していてもよいし、または、それらの発現はベクターのLTRによって調節されてもよい。NOIの適切な発現のために、プロモーターは、ある特定の条件下または特定の細胞型において優先的に活性になるLTRの内部に、または該LTR同士の間に含まれ得る。NOIはセンス配列であってもよいし、アンチセンス配列であってもよい。さらに、複数のNOIが存在する場合には、それらのNOIは、センス配列同士、アンチセンス配列同士、またはそれらの組合せとすることができる。好ましい態様において、本発明のレトロウイルスベクターゲノムは通常、5'および3'末端にあるLTR、１つ以上のNOI(治療上活性な遺伝子および／またはマーカー遺伝子を含む)、または１つ以上のNOIを挿入するための適切な挿入部位を含んでもよい。いくつかの場合、該ゲノムをプロデューサー細胞中のベクター粒子内にパッケージングするためのパッケージングシグナルが存在させることができる。ベクターRNAのDNAへの逆転写およびプロウイルスDNAの標的細胞ゲノムへの組込みを可能にするために適切なプライマー結合部位および組込み部位がさらに存在してもよい。好ましい実施形態では、レトロウイルスベクター粒子は逆転写系（適合する逆転写およびプライマー結合部位）および組込み系（適合するインテグラーゼおよび組込み部位）を有する。本発明によれば、ウイルスゲノムまたはレトロウイルスベクターのヌクレオチド配列を操作して、ウイルス遺伝子が１つ以上のNOIで置換または補足されるようにすることが可能である。このNOIは選択遺伝子、マーカー遺伝子および治療用遺伝子の任意の１つ以上とすることができる。多くの異なる選択マーカーがレトロウイルスベクターでうまく用いられている。これらは「Retroviruses」(199 7 Cold Spring Harbour Laboratory Press編;JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus ，pp444)に概説されており、それぞれG418およびハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌ネオマイシンおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；メトトレキセートに対する耐性を付与する突然変異マウス・ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子；マイコフェノール酸、キサンチンおよびアミノプテリンを含有する培地で細胞が増殖できるようにする細菌gpt遺伝子；ヒスチジンは含まないがヒスチジノールを含有する培地で細胞が増殖できるようにする細菌hisD 遺伝子；種々の薬剤に対する耐性を付与する多剤耐性遺伝子(mdr)；およびピューロマイシンまたはフレオマイシン(phleomycin)に対する耐性を付与する細菌遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。これらのマーカーは全て、優性種を選択可能であり、これらの遺伝子を発現する大部分の細胞の化学的選択を可能にする。本発明による組成物は、特に診断または治療用途のような医療の用途に有用となり得る。したがって、本発明によれば、NOIは治療用遺伝子とすることができる。この場合、この治療用遺伝子とは、その遺伝子自体が治療効果を誘発できるか、または治療効果を誘発できる産物をコードできる、という意味である。治療用NOIの非限定的例としては、腫瘍サプレッサータンパク質、サイトカイン、抗ウイルスタンパク質、免疫調節性分子、抗体、操作された免疫グロブリン様分子、融合タンパク質、ホルモン、膜タンパク質、血管作用性タンパク質もしくはペプチド、成長因子、リボザイム、アンチセンスRNA、酵素、プロドラッグ、例えば、プロドラッグ活性化酵素、細胞傷害剤、および酵素阻害剤をコードする遺伝子が挙げられる。プロドラッグの例としては、エトポシドホスフェート(アルカリホスファターゼと共に用いられる)；5-フルオロシトシン(シトシンデアミナーゼと共に用いられる)；ドキソルビン-N-p-ヒドロキシフェノキシアセトアミド(ペニシリン-V-アミダーゼと共に用いられる)；パラ-N-ビス（2-クロロエチル）アミノベンゾイルグルタメート(カルボキシペプチダーゼG2と共に用いられる)；セファロスポリンニトロジェンマスタードカルバメート(β-ラクタマーゼと共に用いられる)；SR4 233(p450レダクターゼと共に用いられる)；ガンシクロビル(HSVチミジンキナーゼと共に用いられる)；ニトロレダクターゼおよびシクロホスホアミドまたはイホスファミド(ifosfamide)を含むマスタードプロドラッグ（シトクロームp450と共に用いられる）が挙げられるが、これらに限定されない。治療され得る疾患としては、癌、心臓疾患、発作(stroke)、神経変性疾患、関節炎、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、免疫系の疾患、ウイルス感染症、腫瘍、血液凝固障害、および遺伝性疾患（例えば、慢性肉芽腫症、レッシュ-ナイハン症候群、パーキンソン病、肺気腫、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血、α-サラセミア、β-サラセミア、ゴシェ病）が挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターを用いる遺伝子治療の標的細胞としては、造血細胞( 例えば、単球、マクロファージ、リンパ球、顆粒球、またはそれらのいずれかの子孫細胞)；内皮細胞、腫瘍細胞、間質細胞、星状膠細胞もしくはグリア細胞、筋肉細胞、上皮細胞、ニューロン、繊維芽細胞、肝細胞、星状膠細胞および肺細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のレトロウイルスベクター内では、１つ以上のNOIをウイルスLTRの転写調節下にあるようにすることができる。あるいはまた、より高レベルの発現を達成するために、エンハンサー−プロモーターエレメントの組合せを存在させることができる。このエンハンサー−プロモーターエレメントは好ましくは、活性が強いものであるか、または標的細胞内で強く誘導され得るものである。活性が強いプロモーター−エンハンサーの組合せの一例は、ヒト・サイトメガロウイルス(HCMV)の主要中初期（major intermediate early；MIE）プロモーター−エンハンサーの組合せである。このプロモーター−エンハンサーの組合せは、それらの活性が組織的に、または時間的に限定されてもよい。好適な組織限定型プロモーター−エンハンサーの組合せの例は、腫瘍細胞内で高度に活性なもの、例えばMUCI遺伝子またはCEA遺伝子由来のプロモーター一エンハンサーの組合せである。低酸素または虚血調節可能発現もまた、ある環境下では特に有用となり得る。低酸素は、広範囲の各種細胞型の遺伝子発現の有力な調節因子（レギュレーター）であり、コグネートなDNA認識部位に結合する低酸素誘導性因子１型（HIF-1） (WangおよびSemenza，1993，PNAS（USA）90:430)や種々の遺伝子プロモーター上の低酸素応答性エレメント（HRE）のような低酸素誘導性の転写因子の活性の誘導によって作用する。マウス・ホスホグリセレートキナーゼ１型（PGK-1）遺伝子由来の多量体型のHREは、in vitroで低酸素に応答してヒト繊維肉腫細胞によって、またはin vivoで固形腫瘍内で、マーカー遺伝子および治療用遺伝子の両方の発現を調節するのに用いられている(Firthら，1994，PNAS 91(4):6496-650 0；Dachsら，1997，Nature Med．5:515)。あるいはまた、腫瘍の虚血領域ではグルコースの剥奪(deprivation)も見られるという事実を用いて、異種遺伝子DNA（例えば、本発明によるNOI）の発現を特に腫瘍において活性化することができる。grp78遺伝子プロモーターの末端切断した632塩基対の配列は、グルコース剥奪によって特異的に活性化されることが知られており、in vivoでマウス腫瘍においてレポーター遺伝子の高レベルの発現を駆動できることが示されている(Gazit ら，1995，Cancer Res．55:1660)。続いて遺伝子治療で用いるための本発明のレトロウイルスベクターゲノムは、好ましくは、ベクターとして効率的に機能するのに必要な最低限のレトロウイルス物質を含む。この目的は、NOIを取込むためのスペースができるようにするため、および安全性の理由からである。レトロウイルスベクターゲノムは、好ましくは、gag-polおよびenv遺伝子によってコードされる構造（またはパッケージング）成分の１つ以上をコードする機能的遺伝子が存在しないことによる複製欠陥性である。粒子作製に必要となる欠如している成分は、プロデューサー細胞内でトランスでもたらされる。ゲノム内にウイルス構造成分が存在しないことは、標的細胞内で発現されるウイルスタンパク質に対して起こる望ましくない免疫応答が低減または回避されることも意味している。さらに、in vivoでの使用が想定される場合、可能性のある感染性ウイルス粒子の再構築が回避されることが好ましい。したがって、どのような成功裏の組換えの機会も低減するために、ウイルス構造成分は、可能な限リゲノムから排除されることが好ましい。本発明のレトロウイルスベクター粒子は、典型的には、適切なプロデューサー細胞内で作製される。したがって、本発明はまた、本発明の組成物を含むプロデューサー細胞にも関する。プロデューサー細胞は、通常はそのゲノムに組込まれるウイルス構造遺伝子を含むパッケージング細胞であり得る。パッケージング細胞は次に、感染性で複製欠陥性のベクター粒子を得るために、ベクターゲノムをコードする核酸でトランスフェクトされる。あるいはまた、プロデューサー細胞は、ベクターゲノムおよび構造成分をコードする核酸配列、および／または１つ以上の発現ベクター（例えば、プラスミド、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター）上に存在する核酸配列で、または機能的DNAを標的細胞に輸送することが知られている任意の方法で同時トランスフェクトされてもよい。好適なプロデューサー細胞としては、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられるが、他の好適な細胞であってもよい。好ましくは、プロデューサー細胞は昆虫細胞である。本発明はまた、遺伝子治療によって個体を治療するための医薬組成物であって、本発明による組成物、または該組成物によって、もしくは該組成物から作製されるウイルス粒子を治療上有用な量で含む医薬組成物も提供する。この医薬組成物は、ヒトに用いるものであっても動物に用いるものであってもよい。典型的には、医師によって個々の患者にとって最も好適な実際の投与量が決定され、それはその特定の患者の年齢、体重および応答性に応じて様々である。上記組成物は、場合により、医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントを含んでもよい。医薬用の担体、賦形剤または希釈剤の選択は、目的とする投与経路および標準的な医療プラクティスに関して選択できる。この医薬組成物は（または、上記担体、賦形剤または希釈剤に加えて）任意の好適な結合剤、滑剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤、および標的部位へのウイルスの侵入を助け得る、または増大させ得る他の担体成分（例えば、脂質輸送系）を含んでもよい。適切なものとして、上記医薬組成物は次の任意の１つ以上によって投与できる：吸入；坐剤またはペッサリーの形態；局所用としてローション剤、液剤、クリーム剤、軟膏または粉剤の形態；皮膚パッチの使用；経口用としてデンプンまたは乳糖のような賦形剤を含む錠剤、もしくは該組成物を単独で、もしくは賦形剤と混合したカプセル剤もしくは小卵(ovules)の形態；または矯味矯臭剤または着色剤を含むエリキシル剤、液剤もしくは懸濁剤の形態。あるいは、上記医薬組成物は、非経口的に（例えば、空洞内、静脈内、筋肉内または皮下で）注射することができる。非経口投与の場合、上記組成物は、滅菌水溶液の形態で最もよく用いることができ、この場合、該溶液は他の物質、例えば血液と等張にするのに十分な塩類または単糖、を含んでいてもよい。頬内または舌下投与の場合、上記組成物は、慣用の方法で製剤化できる錠剤またはロゼンジ（舐剤）の形態で投与してもよい。本発明は、１つの態様において、5'および3'末端を有するレトロウイルスベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、該レトロウイルスベクターゲノムがバキュロウイルス発現系内で発現しレトロウイルスベクター粒子にパッケージングできる発現ベクターを提供する。したがって、上記5'および3'末端は逆転写および組込みにおいて機能する。 RNA転写開始部位の上流および下流に成分を有するバキユロウイルスプロモーターの問題を克服するための３つの戦略が本明細書で記載されている。これらの戦略を図１〜３に図解する。第１の戦略では(図１参照)、プロモーターの下流成分は、レトロウイルスベクターゲノムをコードする配列の上流末端にあるR領域（5'側R領域と呼ぶ）に組込まれる。このことによって、RNA転写開始部位がレトロウイルスベクターゲノムをコードする配列の直前に配置される。このプロモーターの下流成分に対応する成分もレトロウイルスベクターゲノムをコードする配列の下流末端にあるR領域（3'側 R領域と呼ぶ）に組込まれて、２つのR領域が同一、またはベクターRNAゲノムがD NAプロウイルスへと変換されるのに十分に類似したものになれば、このベクターゲノムは正しく機能する。第２の戦略では(図２参照)、RNA転写産物内で切断可能な配列が、ベクターのバキュロウイルスプロモーターとレトロウイルスベクターゲノムをコードする配列との間に含まれている。したがって、一次RNA転写産物が生成すると、バキュロウイルスプロモーターの下流成分は切り離すことができる。好ましくは、切断部位は、レトロウイルスベクターゲノムをコードする配列に直に隣接して存在して、適切なベクターゲノム末端が生じるようにする。リボザイムは、そのような機能を示し、かつDNA構築物へと処理(engineer)され得るRNA酵素である。好適なリボザイムの構造および機能は十分に研究されている（例えば、Cech，1992，Cu rr．Op．Struct．Biol．2，605）。例としては、ハンマーヘッド型、ヘアピン型およびデルタ肝炎アンチゲノム型リボザイムが挙げられる。リボザイム配列をRN A切断配列として含めて、切断部位がレトロウイルスベクターゲノムをコードする配列の末端に存在させることは、全ての転写産物について末端完全RNA(end-pe rfect RNA)を得るのに用いることができる。転写された各分子はこのリボザイム配列を含み、シスでの単一の切断事象だけが、各リボザイムが正確な鋳型を生じるのに必要である。第３の戦略では(図３参照)、非バキュロウイルスプロモーターが用いられる。好適なプロモーターの例としては、T7ファージプロモーターおよびsp6サルモネラファージプロモーターが挙げられる。T7プロモーターの場合、5'側R領域の末端G残基はT7プロモーターの転写開始部位に正しく配置させて、レトロウイルスベクターゲノムに真の5'末端残基を生じさせることができる。例えばT7ポリメラーゼを発現する組換えバキュロウイルスによって、T7ポリメラーゼの供給源を提供することが必要である(PolkinghornおよびRoy，1995，Nucl．Acids Res．23,1 88)。好ましくは、レトロウイルスベクターゲノムをコードする発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクター、すなわち、組換えバキュロウイルスゲノムをベースとするベクターである。ウイルスベクターは概して、非ウイルスベクターよりも取り扱いが容易である。例えば、細胞へのウイルスベクターの移送は、DNAプラスミドを用いた細胞のトランスフェクションよりもずっと容易に行われる。しかし、あるいはまた、発現ベクターは、非バキュロウイルス発現ベクターまたは非ウイルス発現ベクター（例えば、DNAプラスミド）であってもよい。上記の３種類の戦略のいずれかによる発現ベクターにおいて、レトロウイルスベクターをコードする配列の下流に位置するRNA切断配列を存在させて、RNA転写の正確な終結およびベクターゲノムのための正確な3'末端を確実にしてもよい。好ましくは、この切断配列は、レトロウイルスベクターゲノムの3'末端での切断のために、該ゲノムをコードする配列に直に隣接して切断部位を有する。本明細書中で既に述べたように、リボザイムが適切なRNA切断配列を提供できる。リボザイムは、リボザイム配列の5'または3'のいずれ一方に切断部位を有し得る。したがって、ベクターゲノムの各末端のためにリボザイムが存在する場合には、これらは通常異なるものである。例えば、ハンマーヘッド型リボザイムはそれ自身の右側で切断し、そのためベクターゲノムの5'末端に好適であり、ヘアピン型リボザイムは左側で切断し、ベクターゲノムの3'末端に好適である。本発明は、さらに別の態様において、昆虫細胞内に本明細書で記載する発現ベクターを含むレトロウイルスベクター粒子作製系、およびそのような系によって作製されるレトロウイルスベクター粒子を提供する。レトロウイルスベクター粒子の作製のためには、パッケージング成分を提供することが必要となる。これらは通常gag-polおよびenvであり、１つ以上の適切な発現ベクター上に提供され得る。この発現ベクターは、バキュロウイルス発現系でパッケージング成分を発現できることが必要である。したがって、パッケージング成分は、１つ以上のバキュロウイルスプロモーターの発現制御下にある。パッケージング成分を担持する発現ベクターは、好ましくはバキュロウイルス発現ベクターである。あるいはまた、それらは非バキュロウイルスまたは非ウイルス発現ベクター（例えばプラスミド）であってもよい。パッケージング成分の幾つかまたは全部は同じ発現ベクター上にレトロウイルスベクターゲノムとして提供され得る。本発明での使用に好適なバキュロウイルス系は容易に入手可能であり、当業界では周知である。バキュロウイルス発現ベクターは、O'Reillyら，1994（前掲）に詳細に記載されている。組換えバキュロウイルスベクターにおける使用のための１つの好適なバキュロウイルスは、十分に研究されているAutographa californica核多面体ウイルス（AcMNPV）である。市販の組換えバキュロウイルスベクター、例えばpBAC4x-1(Novagen)、を用いてもよい。pBAC4x-1は４つの挿入部位を含み、レトロウイルスベクターゲノムおよびパッケージング成分をコードする核酸配列を収容するように処理することができる。同様に、本発明での使用のための好適なバキュロウイルスプロモーターは当業界で周知である。通常用いられるバキュロウイルスプロモーターは、ポリヘドリンプロモーターおよびp10プロモーターである。ポリヘドリンプロモーターのDNA配列を図18に示す。本発明は、その配列の突然変異体、改変体、相同体および断片も包含する。本発明の好ましい酵素をコードするヌクレオチド配列に関連する「改変体(vari ant)」、「相同体」または「断片」なる用語は、結果として得られるヌクレオチド配列がプロモーターをコードする、またはコードできるようなものである限り、どのような該配列の、もしくは該配列への１個（またはそれ以上）の核酸の置換、改変、修飾、置換、欠失または付加も含み、好ましくは、少なくとも図18に示す配列と同じように生物学的に活性なものである。特に、「相同体」なる用語は、結果として得られるヌクレオチド配列がプロモーターをコードする、またはコードできるようなものである限り、構造および／または機能についての相同性を包含する。配列相同性については、好ましくは、配列番号１として示す配列に対して少なくとも75％、さらに好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％の相同性があることである。さらに好ましくは、図18に示す配列に対して少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも98％の相同性があることである。特に、本明細書中で用いられる「相同性」なる用語は「同一性」なる用語と同じであり得る。相対的な配列相同性（すなわち、配列同一性）は、２つ以上の配列間の相同性の割合（％）を計算できる市販のコンピュータープログラムによって決定できる。そのようなコンピュータープログラムの典型的な例はCLUSTALである。「改変体」、「相同体」または「断片」なる用語は、配列の対立遺伝子変異物と同義語である。「改変体」なる用語はまた、本明細書中で示すヌクレオチド配列にハイブリダイズできる配列と相補的な配列も包含する。好ましくは、「改変体」なる用語は、ストリンジェントな条件下［例えば、65℃および0.1×SSC(１×SSC＝0.15M NaCl、 0.015クエン酸三ナトリウム、pH7.0)］で本明細書中で示すヌクレオチド配列にハイブリダイズできる配列と相補的な配列を包含する。本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書中で示す相補的配列を含む）にハイブリダイズできるヌクレオチド配列も包含する。好ましい態様において、本発明は、ストリンジエントな条件下（例えば、65℃および0.1×SSC）で本明細書中に示すヌクレオチド配列（本明細書中で示す配列の相補的配列を含む）にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を包含する。本発明によれば、他のバキュロウイルスプロモーター、ならびにそれらのプロモーターの突然変異体、改変体、相同体または断片も用いることができる。本発明による発現ベクターと共に使用するための昆虫細胞系もまた容易に入手可能である。１つの例はsf8昆虫細胞系である。用いる昆虫細胞は、選択される特定の発現ベクターと適合することが必要である。昆虫細胞は、レトロウイルスベクターゲノムをコードする発現ベクターの複製をサポートし、かつレトロウイルスベクターゲノムの発現をサポートする必要がある。特定のグリコシル化欠陥性の細胞系は、哺乳動物系と昆虫系ではグリコシル化に違いがあるために、特に好適である。このグリコシル化の違いが問題になるとは考えられない。昆虫細胞において産生されるHIV gp120を用いた臨床試験のような臨床的使用の例から、二次修飾におけるどのような違いも重要ではないことが示されている。本発明で用いることができるレトロウイルスの種類は任意の特定のレトロウイルスに限定されない。マウスＣ型ウイルスMLVのようなオンコレトロウイルス、H IVのようなレンチウイルス、またはASLV、SNVおよびRSVのような他の周知のレトロウイルスが使用できるであろう。本発明は、レンチウイルスをベースとするレトロウイルスベクターに特に有用である。何故ならば、そのようなレトロウイルスベクターはこれまで高力価で作製することが非常に困難であったからである。レンチウイルスベクターの力価は通常、MLVのようなマウスベクターよりも２桁低い(例えば、Naldiniら，1996，Science 272,263)。さらに、バキュロウイルス発現系ではレトロウイルスRNAも効率的に作製できるので、レトロウイルスベクターゲノムからHIV RevおよびRREのようなレンチウイルスのエレメントを排除することが可能である(Gheysenら，1989，前掲)。レトロウイルスベクター内の不必要なレトロウイルスのエレメントをなくすことは、特にHIVまたは他のレンチウイルスを用いる場合に有利である。何故ならば、これらのエレメントには不都合な効果がある可能性があるからである。本発明を例を挙げて以下の図を参照しながら説明する。図１は、概略図である。図２は、概略図である。図３は、概略図である。図４は、概略図である。図５は、概略図である。図６は、概略図である。図７は、概略図である。図８は、概略図である。図９は、概略図である。図10は、概略図である。図11は、概略図である。図12は、概略図である。図13は、概略図である。図14は、概略図である。図15は、概略図である。図16は、概略図である。図17は、概略図である。図18は、概略図である。図19は、概略図である。図20は、概略図である。図21は、概略図である。図22は、概略図である。図23は、概略図である。図24は、概略図である。図25は、概略図である。図26は、概略図である。図27は、概略図である。図28は、概略図である。図29は、概略図である。図１、２、３および18は上記の記載において参照したものである。実施例１バキュロウイルス発現系におけるMLV gag-polおよびエンベロープ遺伝子の発現この戦略では、まず最初に、エンベロープ配列をpBAC4x-1（Novagen）に挿入し、続いてMLV gag-pol配列を挿入し、これをまずpBluescript（Stratagene）内で再構築する。 a）env発現（MLV同種指向性またはVSV G） MLV同種指向性エンベロープ配列のために、pHIT123(Soneokaら，前掲)からenv 配列全体を含むEcoRI断片を単離する。VSV-G配列のために、pHCMV-G(Yeeら，199 4，PNAS 91，9564)からもEcoRI断片を単離する。次に、これらの断片をpBAC4x-1 （Novagen）に挿入して(図４)、それぞれpBAC4-env-eおよびpBAC4-env-vを得る。どのようなウイルスエンベロープ遺伝子も、組換えDNAの分野で公知の技術を用いて同様の方法でこのベクターに挿入できる。エンベロープ遺伝子としては、どのようなレトロウイルス由来のものも、または擬似タイピングができる、もしくはレトロウイルスgag-pol遺伝子から作製される粒子に取り込まれることができるどのような他のウイルス由来のものも含まれ得る。 b）pBluescript内でのMLV gag-polの再構築（図５） pgagpolgpt（Markowitzら，1988，J．Virol．62，1120）から5'および3'断片をPCRにより作製する(プライマーの一覧を参照)。5'断片はXhoI部位まで増幅し、コード配列の開始部にKpnIおよびNotI部位を作って、940bpの断片を得る。3' 断片はgag-pol配列のSphI部位からpolコード配列の終点まで増幅し、700bpの断片を得る。この断片の両端にEcoRI部位を、そして3'末端だけにNotI部位を作って、gag-pol配列全体が再構築された場合に、NotIで消化することにより切り出されてpBAC4x-1（Novagen）のNotI部位に挿入できるようにする。 5'断片はpBluescriptのKpnI／XhoI部位に挿入し、3'断片はEcoRI部位に挿入する。次に、上記プラスミドからXhoI-SphI断片（30bp）を切り出し、pgagpolgptから得たXhoI-SphI断片（3580bp）で置換して、pBluescript内でgag-pol配列全体を再構築し、pBluescript-gagpolを得る。 c）pBAC4-gagpolenvを作製するためのpBAC4-envへのMLV gag-pol配列の挿入（図６） pBluescript-gagpolからgag-pol配列を含むNotI断片を単離し、pBAC4-env-eおよびpBAC4-env-vのNotI部位へ挿入して、それぞれMLVエンベロープバージョンおよびVSV-Gバージョンに対するpBAC4mgagpol-env-eおよびpBAC4mgagpol-env-vを作製する。これらのプラスミドを、O'Reillyら（前掲）に記載のような標準的な方法を用いてバキュロウイルス移送ベクターとして用いる。得られたウイルス調製物は、それぞれbBAC4mgagpol-env-eおよびbBAC4mgagpol-env-vと命名する。これらのウイルスを用いてsf8細胞のような昆虫細胞を感染させると、多数のVLPが産生される。実施例２ T7戦略を用いたMLV系ベクターゲノムの発現（図３および７）この実施例では、一過性発現系で用いられるプラスミドからベクターゲノムを発現させる。このゲノムは、gag-polおよびenv遺伝子と同じ組換えバキュロウイルスから発現させることができる。 pLZSN（Adamsら，1991，J．Virol．65，4985）由来のMLVゲノムをpEc-Hd（Pol kinghorn，1996，D.Phil．Thesis，University of Oxford）のEagI／SmaI部位に挿入する。このベクターに入れたゲノムは次の構造を有する。該ゲノムの5'および3'末端をPCRにより増幅して、T7プロモーター配列が5'側R 領域の直ぐ上流に位置するようにする。3'末端は3'側R配列の末端まで増幅して、デルタ肝炎アンチゲノム型リボザイムモチーフと正確に融合するように平滑末端にした産物を得る。この平滑末端にした産物を得るために、PCRにプルーフリーディング・ポリメラーゼを用いる。該ゲノムの5'末端はPCRによりパッケージングシグナルのEagI部位まで増幅する。pEc-HdのEagI部位への挿入のために、追加のEagI部位を超5'末端(very 5'en d)に作製する。該ゲノムの3'末端は3'側R配列のSmaI部位からR配列の超末端(ver y end)まで増幅する。まず、3'断片をpEc-HdのSmaI部位に挿入し(SmaI部位は超3'末端で再生しない) 、次に、5'断片をEagI部位に挿入する。上記からSmaI断片を切り出し、pLZSNからのSmaI断片（5850bp）で置換して、p Ec-Hd-LZSNを作製する。gag-polおよびenv配列を用いて標準的な手法により同じ発現カセットがバキュロウイルス移送ベクターにアセンブリできる。プラスミドpEc-Hd-LZSNを用いて、bBAC4mgagpol-env-eもしくはbBAC4mgagpol- env-vおよびBac-T7（T7ポリメラーゼを発現する）で同時感染させたsf21細胞をトランスフェクトできる。これらの細胞において、レトロウイルスベクターの成分の全部が発現され、そのため、機能的ベクターの作製を試験できる。lacZ遺伝子を標的細胞に移送する高力価の機能的ベクターが得られる。 MLV gag-pol、envおよびVSV-G構築のためのプライマー： MLV gag-pol配列の増幅用：5' 断片前進（35-mer NOTFOR）逆（22-mer XHOREV） 3' 断片前進（27-mer SPHFOR）逆（33-mer NOTREV）ゲノム（pLZSN）の増幅用：5' 断片前進（44-mer EAGFOR）逆（18-mer EAGREV） 3' 断片前進（20-mer SMAFOR）逆（22-mer SMAREV）実施例３バキュロウイルス発現系におけるHIV gag-polおよびVSV-Gの発現（図８） HIV gag-pol配列の供給源はプラスミドpRV664である。これはpWI3（Kimら，19 89，J．Virol．63，3708）由来のgagpol vif発現プラスミドである。pWI3のRRE （GenBank受け入れ番号：U26942）は、StyI／StyI断片（7720〜8050）を平滑末端にすることにより、SmaIで切断したpBluescript KS+（Stratagene）に挿入して、pBSRREを得る。pWI3のNarI／EcoRI断片（637〜5743）を、ClaIおよびEcoRI で切断しておいたpBSRREに挿入して、pBSGPRRE1を得る。XhoI／NotI断片（gagpo lおよびRREを含む）を発現プラスミドpCI-Neoに挿入して、pGR-RREIを得る。 pRV664からのHIV-1 gag-pol配列を含む5.6kbのXhoI-NotI断片を単離し、DNAポリメラーゼＩのKlenow断片で末端を平滑化する。次に、これをpBAC4-env-vのSma I部位に挿入して、pBAC4hgagpol-env-vを得る。これを、実施例１で記載したプラスミドと同様に用いる。実施例４ T7戦略を用いるHIV系ベクターゲノムの発現（図３および９〜12） pH4nZ由来のゲノムは、図９に示す構造を有する。これは次のようにして作製される。HIVdgeは、HIVgpt（Pageら，1990，J．Virol．64，5270）から、ClaI部位（829）を平滑末端化することによって得て、フレームシフト突然変異をつくる。次に、HIVdgeをBglIIおよびPstIで切断し(473〜1414)、pTIN406（Cannonら，前掲）に挿入する。pTIN406は、CMVのLTR構造、R（HIV）およびU5（MLV）を有する。これは、pBS5'と呼ばれるCMVならびにHIV由来のRおよびU5を含むハイブリッドLTRをつくる。RevおよびRREを含むプラスミドを提供するために、EcoRI／Xh oI断片（5743〜8897）をHIVdge1.2［NdeIからBglII（6403〜7621）の欠失を含む HIVdge誘導体］から切り出し、pBS5'に挿入して、pBS 5'Rを得る。3'側LTRの付与は、pBS3'のNotI／XhoI断片をpBS5'Rに挿入することにより行い、pH2を得る。 pBS3'は、pWI3のXhoI／HindIII断片、pTIN408（Cannonら，前掲）のHindIII／Kp nI断片、およびXhoI／KpnIで切断したpBluescript KS+のスリーウェイ連結法(th ree way ligation)によって作製する。pSPCMVから得たCMVプロモーター断片（SalI／XhoI）をpH2のユニークなXhoI部位に挿入して、pH2CMVを得る。pSPCM Vは、pLNCX（Genbank受け入れ番号：M28246）からのPstI／HindIII断片をpSP72 （Promega）に挿入することによって作製される。β-ガラクトシダーゼ遺伝子は pTIN414（Cannonら，前掲）から得、pSP72（XhoI／SphI）へと挿入して、pSPlac Zを得る。pSPlacZをXhoI／SalIで消化することにより、β-ガラクトシダーゼ・コード領域を得、これをpH2-CMVに挿入して、pH3Zを得る。pH4Zを構築して、tat 欠失ベクターを作製する。pH3内のEcoRI（5743）-SpeI断片を、以下のPCRプライマーを用いて増幅したEcoRI（5881）-SpeI PCR産物で置換することにより、tat コード領域の最初の50bpを取り除いて、pH4を得る。 pH4からのNsiI／SpeI断片をpH3Zに挿入して、pH4Zを得る。２つのPCR反応を行って、バキュロウイルス発現のためのゲノムの5'および3' 末端を増幅する。続いて、欠けている介在配列を挿入することによりゲノム全体を再構築する。一方のPCR反応は、ゲノムの3'配列を増幅するために行う。3'側U 3配列内のScaI部位をSmaI部位に変更して、R領域の超末端まで増幅する。この変更により、３塩基対突然変異が起こるが、組込みに影響を及ぼすことは決してない。プルーフリーディング・ポリメラーゼを用いて、平滑末端化した900bpの産物を得る。次に、この産物をpEc-HdのSmaI部位に挿入する(図10)。このことにより、R配列とpEc-Hdとの繋ぎ目にあるSmaI部位が破壊される。まず5'配列を、R配列の始点からパッケージングシグナル内に位置する第１のE coRI配列まで増幅する。これにより900bpの断片が得られる。この産物の両末端にEagI部位を配置し、XhoI部位を該断片の超5'末端に配置する。この産物をpBlu escript KS（Stratagene）のXhoI-EcoRI部位に挿入する(図11)。 EcoRI部位からSpeI部位（CMVプロモーター中）までの配列をpH4nZから単離し、上記プラスミドのEcoRI-SpeI部位に挿入する(図11)。次に、ゲノム配列を含むEagI-SpeI断片をpBluescript KSから単離し、pEc-Hd のEagI-SpeI部位に挿入する(図12)。最後に、pH4nZから単離したSpeI-ScaI断片（3.9kb）をpEc-HdのSpeI-SmaI部位に挿入することによりゲノム全体を再構築して(図12)、pEc-Hd-H4nZを得る。このプラスミドを、pBAC4hgagpol-env-v由来のバキュロウイルスベクターを用いる以外はpEc-Hd-LZSNの場合と同様にして用いて、HIV系バキュロウイルスベクターを高力価で得ることができる。実施例５バキュロウイルス系におけるEIAV gag-polおよびVSV-Gの発現（図13）出発分子はEIAVのプロウイルスクローンであるpSPEIAV19（AC:U01866）である。エンベロープコード領域は、pSPEIAV19をエンベロープ領域内でHindIII（5835 ／6571）で切断することにより破壊し、自己連結させて、pSPEIAV19dHを得る。これにより、エンベロープのないプロウイルスクローンが作製される。次に、pS PEIAV19dHをMluI（216／8124）で切断し、得られた断片を、MluI（216）で切断しておいたpCI-Neo（Promega）に挿入して、pONY3を得る。 EIAV gag-pol、tatおよびrevコード配列を含むpONY3から得たMluI断片を単離し、DNAポリメラーゼＩのKlenow断片で平滑末端にする。次に、これをpBAC4-VSV envのSmaI部位（平滑末端化されている）に挿入して、pBAC4egagpol-env-vを得る。このプラスミドを実施例１で記載したのと同様に用いて、高レベルのEIAVVL Pを生じる組換えレトロウイルスを得る。実施例６ T7戦略を用いたEIAV系ベクターゲノムの発現（図３および14〜17）プラスミドpONY2.1nlslacZのゲノムは図14に示す構造を有する。これは次のようにして構築される。EIAVクローンpSPEIAV19の5'側LTRをpfuポリメラーゼを用い、以下のプライマーを用いてPCR増幅する。増幅された断片を5'オーバーハング(overhang)フィルインにより平滑末端化し、BssHIIで切断し3'オーバーハング除去により平滑末端化してあるpBluescript II KS+に挿入する。この構築物をpONY1と呼び、pBlurscript II KS+のβ-ガラクトシダーゼについての向きは5'→3'である。pONY1を配列決定したところ、突然変異が全く起こっていないことが判明した。プラスミドpSPEIAV19dHをMluI（216 ／8124）で切断し、その断片をMluI(216)で切断しておいたpONY1に挿入して、pO NY2を得る。pBluescript II KS+のBssHII消化（619／792）を行って、多重クローニング部位を得る。これを5'オーバーハングフィルインにより平滑末端化し、 BglIIおよびNcoI（1901／4949）で切断しておいたpONY2に連結し、5'オーバーハングフィルインにより平滑末端化する。EIAV配列についての向きは3'→5'である。これをpONY2.1と呼ぶ。pLNCX（Genbank受け入れ番号：M28246）から得たPstI ／Hind III断片をpSP72（Promega）に挿入することにより、プラスミドpSPCMVを作製する。β-ガラクトシダーゼ遺伝子はpTIN414（Cannonら，前掲）から得て、 XhoIおよびSphIで切断しておいたpSP72に挿入して、pSPlacZを得る。β-ガラクトシダーゼ遺伝子までの5'末端をpAD.RSVBgal（Bloggsら，1992，J．Clin．Inve st．90，626）から得たSV40 T抗原核局在化シグナルで置換する。pAD.RSVBgalを XhoI／ClaIで切断し、その断片をXhoI／ClaIで切断しておいたpSPlacZに挿入して、pSPnlslacZを得る。pSPnlslacZ由来のlacZ遺伝子を駆動するCMVプロモーターを含むPstI断片を、pONY2.1のPstI部位にEIAVの5'→3'方向に挿入する。これをpONY2.1nlslacZと命名する。次に、pONY2.1nlslacZを鋳型として用いて２つのPCR反応を行って、バキュロウイルス発現カセットのためのゲノムの5'および3'末端を増幅する。続いて、欠けている介在配列を挿入することにより、ゲノム全体を再構築する。 3'PCR産物をプルーフリーディングポリメラーゼを用いてenv配列内のSmaI部位からR配列の超末端まで増幅して、平滑末端にした産物を得る。次に、この産物をpEc-HdのSmaI部位に挿入する。超3'末端はSmaI部位を喪失している(図15)。 CMVnlslacZ配列を含むSmaI断片をpONY2.1nlslacZから単離し、SmaI部位に挿入する(図16)。 5'PCR産物をMCS内のEagI部位まで増幅し、EagI部位を5'末端に付加する。次に、この産物をEagI部位に挿入し、pEc-Hd内のpONYゲノムを再構築して(図17)、pE c-Hd-ONY2.1nlslacZを得る。これを、pBAC4egagpol-env-vと共に用いて、実施例２および４に記載されているのと同様にして、高力価のEIAV系ベクターをつくることができる。実施例７ R領域置換戦略を用いたMLV系ベクターゲノムの発現(図１、18および19) ポリヘドリンプロモーターから発現されたLZSNレトロウイルスベクターゲノムを含むプラスミド（O'Reillyら，前掲）をpBHLZSNと呼ぶ(図19)。このプラスミドは次のようにして構築される。一連のPCR反応のための出発鋳型はpHIT111（So neokaら，1996，前掲）である。ポリヘドリンプロモーターを含む5'側LTRを反応 AにおいてPCRプライマーを用いて作製して、PCR:Aとして示すPCR産物を得る(図1 9)。第２の反応(B)は、PCR:Aとオーバーラップする断片を作製するものである。次に、反応Cによって結合断片を得、これをSalIおよびHindIIIで切断する。次に、得られた断片をpBluescript KS+に挿入して、プラスミドpBHRを得る(図18)。新たに構築されたR領域内でポリヘドリンプロモーターの適切な成分を用いて3' 側LTRを構築するために、PCR反応DおよびE（図19）を行う。次に、これらの反応の産物を用いて、結合PCR産物（PCR:F）を得る。これをXbaIおよびNotIで切断し、得られた断片をpBHRに挿入して、pBHU3HRを得る(図19)。次に、最後の工程で、pHIT111をSpeIおよびXbaIで切断し、得られた断片を同じ酵素で切断しておいたpBHU3HRに挿入することにより、pHIT111由来のLZSNの内部領域を挿入する(図1 9)。 pBHLZSNの構築のためのPCR反応で用いるプライマー C．プライマーpolyhA5およびployhB3をPCR産物AおよびBと共に用いて5'側LTRハイブリッド（ポリヘドリン.R）を得る。 F．プライマーpolyhD5およびployhE3をPCR産物DおよびEと共に用いて3'側LTRハイブリッド（U3.ポリヘドリン.R）を得る。実施例８ R領域置換戦略を用いたEIAV系ベクターゲノムの発現適切なR領域置換によりポリヘドリンプロモーターから発現されたpONY2.1nlsl acZレトロウイルスベクターゲノムを含むプラスミドをpB0NY2.1nlslacZと呼ぶ。このプラスミドは次のようにして構築される。一連のPCR反応のための出発鋳型はpONY2.1nlslacZ（実施例６、ならびに英国特許出願第 9727135.7号および英国特許出願第9711578.6を参照）である。ポリヘドリンプロモーターを含む5'側LTRを反応AEにおいてPCRプライマーを用いて作製して、PCR: AEとして示すPCR産物を得る。第２の反応(BE)により、PCR:AEとオーバーラップする断片を作製する。次に、反応CEによって結合断片を得、これをSalIおよびHi ndIIIで切断する。次に、得られた断片をpBluescript KS+に挿入して、プラスミドpBEHRを得る。新たに構築されたR領域内でポリヘドリンプロモーターの適切な成分を用いて3'側LTRを構築するために、PCR反応DEおよびEEを行う。次に、これらの反応の産物を用いて、結合PCR産物（PCR:FE）を得、これをXbaIおよびNotI で切断し、得られた断片をpBEHRに挿入して、pBEHU3HRを得る。次に、最後の工程で、pONY2.1nlslacZをNarIおよびNspVで切断し、得られた断片を同じ酵素で切断しておいたpBEHU3HRに挿入することにより、pONY2.1nlslacZの内部領域を挿入する(以下の注釈および図20を参照)。プラスミドpBONY2.1nlslacZをpBAC4egagpo l-env-vと共にもちいて、高力価のEIAV系ベクターを得ることができる。(図21も参照されたい)。 pONY2.1nlslacZの構築 A． 5'プライマー（polyhAE5）（下線部分＝SalI） 3'プライマー（polyhAE3）このPCRによりRの一部を含むポリヘドリンプロモーターが生じる。 B． 5'プライマー（polyhBE5） 3'プライマー（polyhBE3）（太字部分＝HindIII、下線部分＝NarI）このPCRによりRを含むポリヘドリンの一部が生じる。 C．プライマーpolyhAE5およびployhBE3をPCR産物AEおよびBEと共に用いて5'側LTR ハイブリッド（ポリヘドリン.R）を得る。 SalIおよびHindIIIで切断することによりpBluescript KS+ IIに挿入する。これをpBEHRと呼ぶ。 3'側LTR（U3.ポリヘドリン.R.U5） D． U3からRの内側、但しポリヘドリンプロモーターを含む 5'プライマー（polyhDE5）（下線部分＝XbaI、太字部分＝NspV） 3'プライマー（polyhDE3）このPCRによりポリヘドリンプロモーターの一部を含むU3が生じる。 E．ポリヘドリンプロモーターを含むRからU5 5'プライマー（polyhEE5） 3'ブライマー（polyhEE3）（下線部分＝NotI）このPCRによりRを含むポリヘドリンプロモーターの一部が生じる。 F．プライマーpolyhDE5およびpolyhEE3をPCR産物DEおよびEEと共に用いて3'側LTR ハイブリッド（U3.ポリヘドリン.R）を得る。 XbaIおよびNotIで切断することによりpBEHRに挿入する。これをpBEHRU3HRと呼ぶ。 G． pONY2.1nlslacZをNarIおよびNspVで切断して7.8kbの断片を得、NarIおよびNsp Vを介してpBEHRU3HRに挿入して、pBEHONYnlslacZを得る。実施例９ R領域置換戦略を用いたHIV系ベクターゲノムの発現ポリヘドリンプロモーターから発現されたpH4Zレトロウイルスベクターゲノムを含むプラスミドをpBH4Zと呼ぶ。このプラスミドは次のようにして構築される。一連のPCR反応のための出発鋳型はpH4Z（PCT/GB97/02857および英国特許出願第9711578.6を参照）である。ポリヘドリンプロモーターを含む5'側LTRを反応AH においてPCRプライマーを用いて作製して、PCR:AHとして示すPCR産物を得る。第２の反応(BH)により、PCR:AHとオーバーラップする断片を作製する。次に、反応 Cによって結合断片を得、これをSalIおよびHindIIIで切断する。次に、得られた断片をpBluescript KS+に挿入して、プラスミドpBHHRを得る。新たに構築された R領域内でポリヘドリンプロモーターの適切な成分を用いて3'側LTRを構築するために、PCR反応DHおよびEHを行う。次に、これらの反応の産物を用いて、結合PCR 産物（PCR:FH）を得、これをXbaIおよびNotIで切断し、得られた断片を pBHHRに挿入して、pBHHU3HRを得る。次に、最後の工程により、pH4ZをNarIおよびSphIで切断し、得られた断片を同じ酵素で切断しておいたpBHHU3HRに挿入することにより、pH4Zの内部領域を挿入する(以下の注釈および図22を参照)。プラスミドpBH4ZをpBAC4hgagpol-env-vと共にもちいて、HIV系ベクターを高力価で得ることができる。(図23も参照されたい)。 pBH4Zの構築 A. 5'プライマー（polyhAH5）（下線部分＝SalI） 3'プライマー（polyhAH3）このPCRによりRの一部を含むポリヘドリンプロモーターが生じる。 B． 5'プライマー（polyhBH5） 3'プライマー（polyhBH3）（太字部分＝HindIII、下線部分＝NarI）このPCRによりRを含むポリヘドリンの一部が生じる。 C．プライマーpolyhAH5およびployhBH3をPCR産物AHおよびBHと共に用いて5'側 LTRハイブリッド（ポリヘドリン.R）を得る。 SalIおよびHindIIIで切断することによりpBluescript KS+ IIに挿入する。これをpBHHRと呼ぶ。 3'側LTR（U3.ポリヘドリン.R.U5） D． U3からRの内側、但しポリヘドリンプロモーターを含む 5'プライマー（polyhDH5）（下線部分＝XbaI、太字部分=SphI） 3'プライマー（polyhDH3）このPCRによりポリヘドリンプロモーターの一部を含むU3が生じる。 E．ポリヘドリンプロモーターを含むRからU5 5'プライマー（polyhEH5） 3'プライマー（polyhEH3）（下線部分＝NotI）このPCRによりRを含むポリヘドリンプロモーターの一部が生じる。 F．プライマーpolyhDH5およびpolyhEH3をPCR産物DHおよびEHと共に用いて3'側 LTRハイブリッド（U3.ポリヘドリン.R）を得る。 XbaIおよびNotIで切断することによりpBHHRに挿入する。これをpBHHRU3HRと呼ぶ。 G． pH4ZをNarIおよびSphIで切断して6.7kbの断片を得、NarIおよびNspVを介してp BHHRU3HRに挿入して、pBH4Zを得る。実施例10 ポリヘドリンプロモーターからの機能的MLV、EIAVおよびHIVベクターゲノムの発現：二重リボザイム切断法この戦略は、ハンマーヘッド型リボザイムをポリヘドリンプロモーター配列の下流に組み入れることにより達成されるものであり、このハンマーヘッド型リボザイムはそれらが連結する転写産物からそれら自身および5'側ポリヘドリン配列の両方が取り除かれるように設計されている。図24、図25および26はそれぞれ、これがMLV、EIAVおよびHIVベクターの場合にどのようにして達成されるのかを説明する概略図である。この戦略は、リボザイムヘリックス１配列がMLV、EIAVおよびHIVのそれぞれの相補的R配列に合致するように異なっていること以外は、３つの全ての例において同じである。示される位置でリボザイムによる切断が行われると、得られるRNA転写産物は５つの開始末端（prime end）に正確なR配列を含むようになる。これらの自己切断型ポリヘドリンプロモーターをベースとするレトロウイルスゲノム発現ベクターの各々を構築するためのクローニング戦略は、ここで順におおまかに説明する。これらの各々は、それらのコグネートgagpolおよびenv発現系と共に用いて、高力価のレトロウイルスベクター調製物を得ることができる。さらに、それらのゲノム発現カセットは標準的な手法によりバキュロウイルスベクターに挿入することができる。（i）MLV系ベクターの構築プライマーpolyhAM5およびpolyhAM3（図27および下記の注釈を参照）を用いて pEc-Hd-LZSNの5'側LTRをPCR増幅し、必要な変更（5’側R配列に直接接触させたポリヘドリンプロモーター／リボザイム配列の付加）をPCR断片に組み入れ、次にそれをEcoRI-SpeI消化によってpEc-Hd-LZSNにクローニングして、完成ベクターであるpBHz-Hδ-αRを得る。 pBHz-Hδ-αRの構築 5'プライマー（polyhAM5）（下線部分＝EcoRI部位） 3'プライマー（polyhAM3）（下線部分＝SpeI）このPCRはポリヘドリン、ハンマーヘッド型リボザイム、MSVのR領域、U5およびリーダーを生じる。この断片をpEc-Hd-LZSNのEcoRIおよびSpeI部位にクローニングして、pBHz-Hδ -αRLZSNを得ることができる。（ii）EIAV系ベクターの構築プライマーpolyhAEM5およびpolyhAEM3（図28および下記の注釈を参照）を用いてpEc-Hd-ONY2.1nlslacZの5'側LTRをPCR増幅し、必要な変更（5’側R配列に直接接触させたポリヘドリンプロモーター／リボザイム配列の付加）をPCR断片に組み入れ、次にそれをEagI消化によってpEc-Hd-ONY2.1nlslacZにクローニングして、完成ベクターであるpBEHz-Hδ-αRを得る。 pBEHz-Hδ-αRの構築 5,プライマー（polyhAEM5）（下線部分＝EagI部位） 3'プライマー（polyhAEM3）（下線部分＝EagI）このPCRはポリヘドリン、ハンマーヘッド型リボザイム、EIAVのR領域、U5およびリーダーを生じる。この断片をpEc-Hd-ONY2.1nlslacZのEagIおよびEagI部位に挿入して、pBEHz- Hδ-αRを得ることができる。（iii）HIV系ベクターの構築プライマーpolyhAHM5およびpolyhAHM3（図29および下記の注釈を参照）を用いてpEc-Hd-H4nZの5'側LTRをPCR増幅し、必要な変更（5'側R配列に直接接触させたポリヘドリンプロモーター／リボザイム配列の付加）をPCR断片に組み入れ、次にそれをEagI-NarI消化によってpEc-Hd-H4nZにクローニングして、完成ベクターであるpBHHz-Hδ-αRを得る。 pBHHz-Hδ-αRの構築 5'プライマー（polyhAHM5）ハンマーヘッド型Rz （下線部分＝EagI部位） 3'プライマー（polyhAHM3）（下線部分＝NarI）このPCRはポリヘドリン、ハンマーヘッド型リボザイム、HIVのR領域、U5およびリーダーを生じる。この断片はpEc-Hd-H4nZのEagIおよびNarI部位に挿入されて、pBHHz-Hδ-αRLZ SNを得ることができる。まとめしたがって、本発明は、レトロウイルスベクター粒子を作製するための新規な系を提供する。非常に好ましい実施形態では、この新規な系はレトロウイルスベクターゲノムをコードするバキュロウイルス発現ベクターを用いる。別の好ましい実施形態では、本発明は、レトロウイルスベクターゲノムをコードするバキュロウイルス発現ベクター、および本発明の該新規な系によって作製されるレトロウイルスベクター粒子を提供する。本明細書中で言及されている全ての刊行物は引用により本明細書に組み入れるものとする。当業者であれば、本発明の範囲および精神から逸脱することなしに、本発明の記載の方法および系の種々の変更および修正は明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明されているが、請求の範囲に記載されている発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解すべきである。実際に、分子生物学に習熟する者に自明の本発明を実施するための記載の態様の種々の変更は以下の請求の範囲の範疇内にあるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ジョーンズ，イアン，マーティンイギリス国オーエックス２８ディーワイオックスフォード，ブランドフォードアベニュー 24

Claims

【特許請求の範囲】 1．少なくとも１つのバキュロウイルス成分と少なくとも１つのレトロウイルス成分とを含む組成物であって、該レトロウイルス成分がレトロウイルス粒子にパッケージングできる前記組成物。 2．少なくとも１つのレトロウイルス成分を含むバキュロウイルス発現系である組成物であって、該レトロウイルス成分がレトロウイルス粒子にパッケージングできる前記組成物。 3．前記レトロウイルス成分がレトロウイルスゲノムに相当する、請求項１または２に記載の組成物。 4．レトロウイルスベクターゲノムのためのRNA転写開始部位を含んでおり、かつ、前記レトロウイルス成分をコードするヌクレオチド配列が、該RNA転写開始部位の上流に位置する上流プロモーター成分と該RNA転写開始部位の下流に位置する下流プロモーター成分とを含むプロモーターに作動可能なように連結している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。 5．前記下流プロモーター成分が前記レトロウイルスベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド配列の上流にある、請求項４に記載の組成物。 6．前記プロモーターがバキュロウイルスプロモーターである、請求項４または５に記載の組成物。 7．前記プロモーターがポリヘドリンプロモーターおよび／またはp10プロモーターおよび／またはpolhプロモーターである、請求項６に記載の組成物。 8．前記プロモーターが非バキュロウイルスプロモーターである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。 9．前記プロモーターがT7プロモーターまたはsp6サルモネラファージプロモーターである、請求項８に記載の組成物。 10．少なくとも１つのRNA切断成分を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。 11．前記RNA切断成分の少なくとも１つがどのようなバキュロウイルス成分も含まないレトロウイルスゲノムを生じる、請求項10に記載の組成物。 12．前記RNA切断成分の少なくとも１つが前記プロモーターと前記レトロウイルス成分をコードする配列との間に位置する、請求項４〜９のいずれか１項に従属する場合の請求項11に記載の組成物。 13．前記RNA切断成分の少なくとも１つが、引き続いて起こる前記レトロウイルスベクター成分の5'末端での切断のために、該ベクター成分をコードする配列に直に隣接して位置する、請求項12に記載の組成物。 14．前記RNA切断成分の少なくとも１つが前記レトロウイルス成分をコードする配列の下流に位置する、請求項４〜13のいずれか１項に記載の組成物。 15．前記RNA切断成分が、引き続いて起こる前記レトロウイルスベクター成分の3 '末端での切断のために、該ベクター成分をコードする配列に直に隣接する切断部位を有する、請求項14に記載の組成物。 16．前記RNA切断成分の少なくとも１つが、引き続いて起こるその切断のための、リボザイムによって認識される配列である、請求項４〜15のいずれか１項に記載の組成物。 17．各RNA切断成分が、引き続いて起こるその切断のための、リボザイムによって認識される配列である、請求項４〜15のいずれか１項に記載の組成物。 18．前記下流プロモーター成分が前記レトロウイルス成分をコードする配列内に位置する、請求項４〜17のいずれか１項に記載の組成物。 19．前記下流プロモーター成分が前記レトロウイルスベクターをコードする配列内に位置する、請求項18に記載の組成物。 20．前記レトロウイルス成分が、レトロウイルスベクターゲノムをコードする配列の両端にレトロウイルスR領域を含み、そして前記下流プロモーター成分が5'側R領域内に位置し、かつそれに対応する配列を3'側R領域内に含む、請求項19に記載の組成物。 21．下流方向に向って、上流バキュロウイルスプロモーター成分、下流バキュロウイルスプロモーター成分、リボザイム配列、レトロウイルス5'側R領域、レトロウイルスU5領域、そのレトロウイルスベクターによって輸送しようとする１つ以上の遺伝子を挿入するためのレトロウイルスベクター領域、レトロウイルスU3領域、レトロウイルス3'側R領域、および場合によって第２のリボザイム配列を含む、請求項１〜20のいずれか１項に記載の組成物。 22．下流方向に向って、上流バキュロウイルスプロモーター成分、下流プロモーター成分を含むレトロウイルス5'側R領域、レトロウイルスU5領域、そのレトロウイルスベクターによって輸送しようとする１つ以上の遺伝子を挿入するためのレトロウイルスベクター領域、レトロウイルスU3領域、レトロウイルス3'側R領域、および場合によってリボザイム配列を含む、請求項１〜20 のいずれか１項に記載の組成物。 23．前記レトロウイルス成分を含むレトロウイルスベクター粒子を作製するための１つ以上のパッケージング成分をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜22のいずれか１項に記載の組成物。 24．さらに少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列（NOI）を含む、請求項１〜23のいずれか１項に記載の組成物。 25．前記NOIが医療において有用である、請求項24に記載の組成物。 26．前記NOIが前記レトロウイルス成分の一部である、請求項24または25に記載の組成物。 27．請求項１〜26のいずれか１項に記載の組成物の発現によって得ることができるレトロウイルス粒子。 28．請求項１〜26のいずれか１項に記載の組成物を発現させることを含む、レトロウイルス粒子の調製方法。 29．請求項１〜26のいずれか１項に記載の組成物を含む昆虫細胞。 30．昆虫細胞内に請求項１〜26のいずれか１項に記載の組成物を含む、レトロウイルスベクター粒子作製系。 31．請求項30に記載のレトロウイルスベクター粒子作製系によって作製されるレトロウイルスベクター粒子。 32．5'および3'末端を有するレトロウイルスベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、該レトロウイルスベクターゲノムがバキュロウイルス発現系内で発現してレトロウイルスベクター粒子にパッケージングできる前記発現ベクター。 33．少なくとも、第１ウイルスから得ることができる第１ウイルス成分と、第２ウイルスから得ることができる第２ウイルス成分とを含む組成物であって、該第１ウイルスが該第２ウイルスとは異なり、該第２ウイルス成分が少なくとも２つの切断部位（これは同じであっても異なっていてもよい）に隣接しており；該第２ウイルス成分の少なくとも一部がウイルス粒子にパッケージングでき；そして、該ウイルス粒子がどのような第１ウイルス成分も実質的に含まない前記組成物。 34．前記切断部位の少なくとも１つがリボザイム切断部位である、請求項33に記載の組成物。 35．前記切断部位の各々がリボザイム切断部位である、請求項34に記載の組成物。 36．前記第１ウイルスがバキュロウイルスである、請求項33〜35のいずれか１項に記載の組成物。 37．前記第２ウイルスがレトロウイルスである、請求項33〜36のいずれか１項に記載の組成物。 38．少なくとも１つのイントロンを含むNOIを発現するためのバキュロウイルス組成物の使用。 39．大量のNOIまたはその発現産物を生産するための生産装置であって、該NOIを含むバキュロウイルス組成物を含む媒体を含んでなる前記生産装置。 40．実質的に添付の図面に関連して本明細書中に記載されている組成物。