JP2011509092A - バキュロウイルスを利用したワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
(i)本発明のワクチンは、抗原遺伝子とウイルスの外来エンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列を含む組換えバキュロウイルスを含む。
<細胞準備>
昆虫細胞であるSf9(ATCC CRL-1711)は、27℃, 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco BRL)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco BRL)が入っているTC-100培地(Welgene)で培養した。293TT細胞(Schiller Lab, 米国NCI)は、10% FBS及びハイグロマイシンB(400 μg/ml)(Invitrogen Corp.)で補充されたDMEM(Dulbecco's modified minimal essential medium)で培養した。ヒト肝癌細胞株であるHuh7(JCRB0403)は、5% CO2と37℃温度下で10% FBS(Gibco BRL)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco BRL)が入っているDMEM培地で培養した。HeLa細胞(ATCC)は、10% FBS, 100Uペニシリン/ml及び100μgストレプトマイシン/mlが入っているDMEM培地で培養した。
HERV(human endogenous retrovirus)は、実際人間に存在する内因性ウイルスであって、大部分は、不活性化された状態で人間のゲノム上に存在している。HERVの表面蛋白質を獲得するために、HERV表面蛋白質をコーディングする遺伝子を直接合成し、合成時、遺伝子の塩基配列を昆虫細胞における発現に適合するように最適化した(GeneScript)。自己合成されたHERV表面蛋白質をコーディングする遺伝子をpUC57ベクター(GeneScript)のEcoRV位置に挿入し、pUC57-HERVenvを製作した。
転移ベクター(transfer vector)のクローニング過程を含む組換えバキュロウイルスの製造は、製造社(Invitrogen)のプロトコールによって、Bac-to-BacTM バキュロウイルス発現システムを利用して行った。組換えウイルスシステムを利用して動物細胞においてHPV 16L1蛋白質を発現させるために、AcMNPV(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus)転移ベクターに人間延長因子1αプロモーター(hEF1α)とHPV 16L1遺伝子を挿入させた。まず、hEF1αプロモーターの後ろにHPV 16L1遺伝子とhEF1aポリAシグナルが連結された遺伝子部分を、プラスミドDNAのp16L1L2(Schiller Lab, 米国NCI; Christopher B. Buck et al., J. Virol. 82(11):51905197(2008))を鋳型としてPCR増幅させた。使用されたプライマーの配列は、次のようである:センスプライマー5-GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCA-3;アンチセンスプライマー5 -TTAATTAACCCACGTTTCAACATG-3'。
クローニングした組換え転移ベクターをそれぞれDH10Bac(Invitrogen)に形質転換させて、組換えバクミド(bacmid, baculovirus shuttle vector)を生産した。組換えされたバクミドの区別は、M13プライマー(Invitrogen)を利用し、PCRを通じて確認した。確認された3種類のバクミドは、組換えバキュロウイルスを製作するために、リポフェクチン(Invitrogen)を利用してSf9細胞に形質感染させた。四日後、感染された細胞で生成されたウイルスは、収集し、新しいSf9細胞に反復的に感染させて、高い力価のウイルスを生産した。そして、選抜された組換えウイルスをそれぞれAcHERVenv-hEF1α16L1及びAc-hEF1α16L1と命名した(参照:図1c)。最終的に準備された組換えバキュロウイルスの力価は、Sf9細胞でプラーク確認法を通じて確認した。一方、HPV 18L1遺伝子を運搬する組換えバキュロウイルス(AcHERVenv-hEF1α18L1)は、利用されるHPV 18L1遺伝子(GenBank accession No.AY383629)を除いては、上述のHPV 16L1に対する組換えバキュロウイルス(AcHERVenv-hEF1α16L1)と同一な方法で製造した。
Huh7細胞を24-ウェルプレートに1x105 細胞/ウェルに分株して、37℃で培養した。培養12時間後、PBSで洗浄し、100 MOIでAc-hEF1α16L1及びAcHERVenv-hEF1α16L1ウイルスを感染させた。37℃で10時間培養した後、10% FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンが含有された新しいDMEM培地に入れ換えて、48時間培養した。それぞれのウイルスで発現されるHPV 16L1の発現程度は、以下の実験を通じて調べた。
遺伝子導入されたHuh7細胞からRNeasy miniキット(Qiagen, Valencia, CA)を利用して総RNAを精製し、ジオキシリボヌクレアーゼI(DNaseI, Promega, Madison, WI)を処理してDNAを除去した。精製されたRNAは、M-MuLV逆転写酵素(Bioneer, USA)を利用して、cDNAを合成した。2.5μlのcDNAを7.5μlの重合酵素連鎖反応の反応混合物(PCR reaction mixture)に添加し、Thermal Cycler PCR(GeneAmp PCR system 9700, Perkin-Elmer Cetus, USA)を利用してPCRを行った。PCR条件は、94℃で3分間ホットスタートを1回行った後、94℃で30秒間変性反応させた後、62℃で20秒間アニリング反応、及び72℃で20秒間延長反応の30サイクルである。反応に利用されたプライマーは、センスプライマー5-CAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGG-3、アンチセンスプライマー5 -GGCTGCAGGCCGAAGTTCCAGTCCTCCA-3であり、約275 bpの増幅産物を期待することができる。試料間のRT-PCR効率を補正するために、ハウスキーピング遺伝子である18S rRNA (ribosomal RNA)遺伝子を利用した。PCR産物を、1.5%アガロースゲルで確認した。
感染された細胞内における HPV 16L1 mRNA発現水準を定量するために、以前報告(Dhar et al., 2001)された通りに実時間PCRによる定量分析(Q-PCR)を行った。総HPV 16L1 mRNA発現水準は、実時間PCR(Roter Gene 3000, Corbett Research, Australia)機器を利用し、4回反復実験を行って確認した。PCR反応混合液には、5μlのDyNAmoTM HS SYBRTM Green qPCRキット反応液と、5μlのサンプル溶液(プライマーと鋳型)が添加されている。プライマーは、16L1センスプライマー5’-CAGCGAGACCACCTACAAGA-3とアンチセンスプライマー5-GCTGTTCATGCTGTGGATGT-3で構成されて、約138 bpの増幅産物を期待することができる。初期DNA変性過程を95℃で5分間、94℃で変性反応10秒間、62℃でアニリング20秒間、そして72℃で20秒間延長反応を45サイクル行って、PCR増幅産物を得た。PCRを終了した後、標的分子のコピー数とメルティングカーブ分析(melting curve analysis)をして、ソフトウェアRoter-Gene ver. 6.0(Roter Gene 3000, Corbett Research, Australia)プログラムを利用した。
Huh7細胞をガラススライドに分株して、Ac-hEF1α16L1とAcHERVenv -hEF1α16L1ウイルスをそれぞれ100 MOIで形質感染させた。感染されてから48時間になった細胞を4%ホルムアルデヒドで4℃で12時間固定し、PBS(Phosphate Buffered Saline)で洗浄した後、0.5% Triton X-100が入っているPBSを入れて37℃で10分間培養した。その後、PBSで洗浄した後、5%正常ヤギ血清が入っているPBSで37℃で30分間ブロッキングした。この後、HPV 16L1単一クローン抗体(Camvir-1)と共に、一日間4℃環境で反応させた。反応させた細胞をPBSで30分間洗浄後、マウスIgG-ホースラディッシュペルオキシダーゼ抗体を使用して1時間反応させた後、PBSで洗浄し、共焦点レーザー走査顕微鏡(confocal laser scanning microscope, FV-1000 spectral, Olympus, Japan)機器を利用して、HPV 16L1蛋白質の存在有無を確認した。
ガーダシルTM(MERCK & CO, USA, MSD, Korea)は、HPV Quadrivalent(タイプ6, 11, 16及び18)ワクチンであって、本実験では、免疫反応陽性対照群として利用した。
雌性の4週齢BALB/cマウスをオリエント-バイオ(大韓民国)から購入し、フィルターチップ条件下で、水と飼料に自由に接近できるようにしながら飼育した。
組換えバキュロウイルスを滅菌PBSに総容量100μlに希釈した後、107 PFU(plaque forming unit)の量でマウスの下端脚筋肉に注射し、免疫化させた。24匹のBALB/cマウスを八つの群に分けた(表1)。選択されたプライムブーストレジームによってそれぞれの群のマウスに注射した。免疫化は、2週間隔で3回ずつ行って、それぞれの免疫化後、1週目に血液及び膣洗浄液(vaginal washes)を収集した。分析前に、抗-血清を熱変性させた。
Schiller(J. Virol. 78(2):751757(2004))が提案した方法によって、293TT細胞の共同形質転換を行い、PVs(pseudoviruses)を製造した。まず、形質転換16時間前に293TT細胞を25Tフラスコにシーディングして、L1/L2-プラスミド及びpfwBプラスミド(強化緑色蛍光蛋白質(GFP)を発現)の混合物としてLipofectin(Invitrogen)を利用して形質転換させた。使用されたプラスミドのヌクレオチドマップは、 http://ccr.cancer.gov/Staff/links.asp?profileid=5637で確認することができる。HPV16 PVsの製造のために、pfwB及びp16L1/L2それぞれ9ugで細胞を形質転換させた。また、HPV18 PVsの製造のために、pfwB及びp18L1/L2それぞれ9 ugで細胞を形質転換させた。4〜6時間後、形質転換細胞の培地を入れ換えた。形質転換48時間後、細胞を収集した。上澄み液を分画し、次の実験前まで-80℃で保管した。
免疫注射したマウスの希釈血清及びPVsの混合物を室温で1時間インキュベーションした。接種16時間前に1x104個シーディングされたHeLa細胞に混合物を接種し、二日間インキュベーション後、蛍光顕微鏡下でGFP発現を観察した。GFP発現水準を正常マウス血清で処理した試料の1/2まで減少させる血清の最大希釈度の逆数で中和タイターを示した。
PBS 100μl内の抗-マウスガンマインターフェロン(IFN-γ)捕獲抗体(BD Bioscience)200ngで96ウェルプレートを4℃で一晩中コーティングした。プレートを培地(RPMI 1640 with 10% FBS)100μlで2時間37℃でブロッキングし、脾臓細胞をウェル当たり1 X 106 細胞密度で二個ずつシーディングした。次いで、2x106 IFUでPVsを接種し、37℃で2時間インキュベーションした。PBS0.05% Tween 20で3回洗浄して細胞を除去した。次いで、PBS10% FBS 100μl内の滅菌-フィルタリングされたバイオチン化抗-マウスIFN-γ検出抗体20ngをそれぞれのウェルに添加し、プレートを室温で2時間放置した。PBS0.01% Tween 20でプレートを3回洗浄した後、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ1:1,000希釈液100μlを添加した。その後、プレートを室温で1時間インキュベーションし、PBS0.01% Tween 20で3回洗浄して、PBSで3回洗浄した。プレートにAEC基質試薬(BD Biosciences, CA, USA)100μlを添加して10分間反応した。プレートを蒸留水で洗浄し、反応を停止した。スポットをELISPOTリーダー(AID ElispotReader ver.4, Germany)で定量化した。培地だけがあって、脾臓細胞が処理されていないウェルを陰性対照群として利用した。バックグラウンドウェルのカウントを試料から減価した。
<HERV表面蛋白質の遺伝子合成>
転移ベクター製作に利用するHERV表面蛋白質(Env)遺伝子は、自体的に遺伝子合成を通じて製作されて、昆虫細胞内で効果的に発現できるように、昆虫遺伝子暗号に合わせて遺伝子を最適化した。このように合成されたHERV表面蛋白質のアミノ酸配列は、既存報告されたHERV表面蛋白質のアミノ酸配列をそのまま維持しながら、遺伝子配列の一部分のみを一部変更した。配列番号1の配列及び配列番号2の配列は、本実験に使用するために合成した1617 bpのHERV表面蛋白質の遺伝子配列とアミノ酸配列である。また、図4〜7を通じて、既存のHERV表面蛋白質の遺伝子配列と合成させた本発明の遺伝子配列を比較した。図4〜7から分かるように、約73.5%の遺伝子配列が相同性を有していることが分かる。
組換えバキュロウイルスを製造するために、pAc-hEF1α16L1及びpAcHERVenv-hEF1α16L1の二種の転移ベクターの製作を計画して、予想されるバキュロウイルスの形態を予想してみた(図3)。バキュロウイルス表面の蛋白質を追加するために、ポリヘドリンプロモーター(polyhedrin promoter)の後ろには、HERV表面蛋白質(Env)の遺伝子を挿入し、HPV 16L1遺伝子は、hEF1αにより発現が調節されるように構成した。HERVのEnvは、ヒト細胞の受容体媒介ファゴサイトーシスを誘導する。図1は、pAc-hEF1α16L1クローニング方法を示し、図2は、pAcHERVenv-hEF1α16L1クローニング方法を簡略に示したものである。同一な方法により、pAcHERVenv-hEF1α18L1クローニングを行った。
バキュロウイルス表面が変形されることによるHPV 16L1遺伝子の伝達効率を調べるために、Ac-hEF1α16L1及びAcHERVenv-hEF1α16L1ウイルスをHuh7細胞にそれぞれ100MOIで感染させた。HPV 16L1 mRNA発現水準を、まずRT-PCRで確認した。図8のように電気泳動を通じて、Ac-hEF1α16L1及びAcHERVenv-hEF1α16L1を感染させた細胞から約275 bpのHPV 16L1増幅産物を確認することができた。しかしながら、HPV 16L1遺伝子の増幅程度には差があった。バキュロウイルス表面にHERV表面蛋白質を有したAcHERVenv-hEF1α16L1の場合、表面を変形させなかったバキュロウイルスに比べ、HPV 16L1遺伝子増幅産物の量が高かった。
AcHERVenv, AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1 107 PFUを筋肉内注射して、陽性対照群としてガーダシル投与群、陰性対照群としてAcHERVenv投与群とPBS投与群に分けて、各実験群の免疫反応を比較した。ELISA分析を行って、免疫化マウス血清からHPV16L1-特異IgG抗体またはHPV18L1-特異IgG抗体を測定した。免疫化する前、AcHERVenvのみを注射した群、そしてPBSのみを注射した群の血清では、予想の通り、著しく低い水準のIgG抗体が観察された。図12から分かるように、一回目の免疫化後は、ガーダシル投与群(Group1)のみがIgG抗体反応を示して、AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1投与群(Group 2)では、明確なIgG抗体反応を示さなかった。ガーダシルを二回免疫化して得た血清では、IgG抗体反応が、一回目の免疫化の時より約2.7倍(HPV16)または2倍(HPV18)増加して、ガーダシルを3回目免疫化した時は、二回目より1.3倍(HPV16)または1.3倍(HPV18)、一回目より約3.5倍(HPV16)または2.5倍(HPV18)増加した(Group 1)。AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1を二回免疫化して得た血清では、IgG抗体反応が、一回目の免疫化の時より3倍(HPV16)または2倍(HPV18)増加して、AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1を三回目免疫化した時は、二回目より1.1倍(HPV16)または1.1倍(HPV18)、一回目より約3.3倍(HPV16)または2.4倍(HPV18)増加した(Group 2)。したがって、AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1を注射したマウスの血清におけるIgG抗体反応は、ガーダシルを注射した場合とほぼ等しいことが分かる。また、最初の免疫化後、9週目と14週以後にも、IgG抗体反応が観察されたことから、免疫力が維持されることが分かった。
抗血清の中和活性は、HeLa細胞において、GFP発現プラスミドを感染性HPV16またはHPV18 PVsの感染を抑制する程度により決定した。中和抗体タイターは、血清を最大希釈して(5倍数血清希釈)、血清処理されなかった試料と比較し、GFP発現水準が50%または90%減少する時の逆数で表現した。各実験群の希釈された血清のHPV16またはHPV18 PVsに対する中和活性は、図14のようである。図14は、50%中和された時の中和タイターであり、一回目の免疫化後、二回目及び三回目の免疫化後の中和抗体タイターが全ての実験群で高く表れた。三回目の免疫化後、Group 1と2における中和抗体タイターは、156,250であり、ガーダシルを投与した群と本発明で開発したAcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1を投与した群におけるB細胞体液性免疫では、有意な差がなく高く表れることが分かった。また、中和活性50%を基準にGroup 3と4において、AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1でプライミングした後、ガーダシルでブースティングする場合の中和タイターが234,375から312,500として高く表れることを確認することができる。特に、AcHERVenv-hEF1α16L1でプライミングした後、ガーダシルで2回ブースティングする場合であるGroup4の中和タイターが、312,500と最も高く表れることを確認することができる。この結果として、AcHERVenv-hEF1α16L1のプライミングがガーダシルブースティング効果を向上できることを期待することができる。
免疫化マウスでT細胞免疫反応を確認するために、ELISPOT 分析を行った。AcHERVenv-hEFα16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1を3回免疫したGroup 2のマウス脾臓細胞1x106 個において約500個のスポットが生成されることを観察して、ガーダシル免疫したGroup 1または陰性対照群では、IFN-γの分泌によるスポットを観察することができなかった。ガーダシル、AcHERVenv-hEFα16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1、そしてPBSを注射したマウスの中で、AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1で免疫化したマウスで強いHPV16特異T細胞反応(IFN-γの分泌)が発生することを確認して、ガーダシルで免疫化した実験群は、全く細胞性免疫が起こらなかった(図15)。
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Claims (19)
- (a)ウイルスの外来エンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列と、(b)前記エンベロープコーディング配列に作動的に連結された第1プロモーターと、(c)抗原蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列と、(d)前記抗原コーディング配列に作動的に連結された第2プロモーターとを含む組換えバキュロウイルス。
- 前記抗原は、ウイルス病原体抗原、バクテリア病原体抗原、寄生虫(parasitic)抗原または癌抗原であることを特徴とする、請求項1に記載の組換えバキュロウイルス。
- 前記抗原は、HPV(Human papillomavirus)抗原、HBV(hepatitis B virus)抗原、HCV(hepatitis C virus)抗原、HIV(human immunodeficiency virus)抗原、ロタウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、HSV(herpes simplex virus)抗原、鳥インフルエンザウイルス抗原、豚コレラウイルス抗原、口蹄疫ウイルス抗原及びニューカッスルウイルス抗原からなる群から選択されるウイルス病原体抗原であることを特徴とする、請求項2に記載の組換えバキュロウイルス。
- 前記抗原は、HPV抗原であることを特徴とする、請求項3に記載の組換えバキュロウイルス。
- 前記抗原は、HPVのL1、L2、E6またはE7蛋白質であることを特徴とする、請求項4に記載の組換えバキュロウイルス。
- 前記HPVの抗原蛋白質は、HPVタイプの1、2、3a、4、5、6b、7、8、9、10、11a、12、13、16及び18からなる群から選択されるHPV由来のものであることを特徴とする、請求項4に記載の組換えバキュロウイルス。
- 前記ウイルスのエンベロープは、アルファウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ミクソウイルス、コロナウイルス、レトロウイルス、フィロウイルスまたはアレナウイルス由来のものであることを特徴とする、請求項1に記載の組換えバキュロウイルス。
- 前記ウイルスのエンベロープは、レトロウイルス由来のものであることを特徴とする、請求項7に記載の組換えバキュロウイルス。
- 前記ウイルスのエンベロープは、ヒト内因性レトロウイルス(Human Endogenous Retrovirus: HERV)のエンベロープであることを特徴とする、請求項8に記載の組換えバキュロウイルス。
- 前記HERVのエンベロープをコーディングする配列は、配列番号2のアミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項9に記載の組換えバキュロウイルス。
- 前記第1プロモーターは、昆虫細胞で作動するプロモーターであることを特徴とする、請求項1に記載の組換えバキュロウイルス。
- 前記昆虫細胞で作動するプロモーターは、バキュロウイルスIE-1プロモーター、IE-2プロモーター、p35プロモーター、p10プロモーター、gp64プロモーターまたはポリヘドリンプロモーターであることを特徴とする、請求項11に記載の組換えバキュロウイルス。
- 前記第2プロモーターは、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーターまたは哺乳動物ウイルス由来のプロモーターであることを特徴とする、請求項1に記載の組換えバキュロウイルス。
- 前記第2プロモーターは、U6プロモーター、H1プロモーター、CMV(cytomegalo virus)プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス7.5Kプロモーター、SV40プロモーター、HSVのtkプロモーター、RSVプロモーター、ヒト延長因子1α(hEF1α)プロモーター、メタロチオニンプロモーター、β-アクチンプロモーター、ヒトIL-2遺伝子のプロモーター、ヒトIFN遺伝子のプロモーター、ヒトIL-4遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、ヒトGM-CSF遺伝子のプロモーター、TERTプロモーター、PSAプロモーター、PSMAプロモーター、CEAプロモーター、E2Fプロモーター、AFPプロモーターまたはアルブミンプロモーターであることを特徴とする、請求項13に記載の組換えバキュロウイルス。
- 請求項1乃至14のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスを有効成分として含むワクチン組成物。
- 前記組換えバキュロウイルスは、HPV(Human papillomavirus)抗原遺伝子を含み、前記ワクチン組成物は、HPVワクチン組成物であることを特徴とする、請求項15に記載のワクチン組成物。
- 請求項15に記載のワクチン組成物の薬剤学的有効量(pharmaceutically effective amount)を対象(subject)に投与する段階を含む、生体内で特定抗原に対する免疫反応を誘導する方法。
- 前記ワクチン組成物に含まれている組換えバキュロウイルスは、HPV(Human papillomavirus)抗原遺伝子を運搬し、前記方法は、HPV感染-誘発癌の予防または治療方法であることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- ヒト内因性レトロウイルス(Human Endogenous Retrovirus: HERV)のエンベロープ蛋白質をコーディングして、配列番号1のヌクレオチド配列を含む核酸分子。
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