KR101164602B1

KR101164602B1 - 배큘로바이러스?기반 백신

Info

Publication number: KR101164602B1
Application number: KR1020090002010A
Authority: KR
Inventors: 김영봉; 박누리; 이동희; 이정은; 이희정; 오유경
Original assignee: 주식회사 케이알바이오텍; 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2008-01-09
Filing date: 2009-01-09
Publication date: 2012-07-10
Also published as: JP2011509092A; CN101952436A; KR20090076852A; WO2009088256A2; CN101952436B; US20100285056A1; US9555091B2; WO2009088256A8; EP2241626A2; WO2009088256A3; KR20110052552A; WO2009088256A9; US20150030621A1; EP2241626B1; BRPI0906946A2; JP5309159B2; EP2241626A4

Abstract

본 발명은 (a) 바이러스의 외래 엔벨로프 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 엔벨로프-코딩 서열에 작동적으로 연결된 제1프로모터; (c) 항원 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (d) 상기 항원-코딩 서열에 작동적으로 연결된 제2프로모터를 포함하는 재조합 배큘로바이러스; 상기 재조합 배큘로바이러스를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 특정 항원(예컨대, HPV의 L1)에 대한 체액성 면역 유도능이 우수할 뿐만 아니라, 세포성 면역 유도능도 우수하여 향상된 백신 효능을 발휘할 수 있다.

HPV, AIV, 엔벨로프, 배큘로바이러스, 유전자 전달체

Description

배큘로바이러스?기반 백신{Baculovirus?Based Vaccines}

본 발명은 재조합(키메라) 배큘로바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

HPV(Human papillomavirus)가 발생의 주요 원인인 자궁경부암은 전세계 여성 암 중에서 12%를 차지하고 있으며, 전세계에서 2분에 1명씩 사망에 이를 만큼 발생 빈도와 사망률이 높은 질병이다(Vaccine 24:5235-5244(2006)). HPV는 현재까지 약 100여종이 분리 되었으며 이들 중 고위험(high risk)으로 구분되어 있는 HPV 타입 16과 HPV 타입 18은 70% 이상이 자궁경부암 조직에서 발견되고 있다(Vaccine 22:3004-3007(2004)).

자궁경부암을 조절하기 위해서 HPV 감염에 대한 효과적인 백신 개발이 이루어지고 있으며, 특히 자궁경부암 예방을 위한 예방백신 개발이 매우 중요하다 할 수 있다.

HPV L1 단백질은 바이러스 유사 입자(virus like particles: VLPs)로 자가조립 하 는 고유의 특징을 가지고 있어 바이러스 유전체는 가지지 않고 외부피막만을 형성한다. 이러한 VLP를 주사 할 경우 이에 대한 충분한 면역 반응이 일어나 높은 타이터의 중화 항체를 유도할 수 있다는 결과들이 보고되어 있다(Journal of Virology 81(24);13927-13931(2007), Virology 321:205-216(2004); Journal of Medical Virology 80:841846(2008)).

유전자의 효율적인 체내 전달을 위하여, 여러 가지 바이러스 벡터를 이용한 유전자전달 시스템이 개발되고 있다. 레트로바이러스 및 아데노바이러스 등을 이용한 바이러스 벡터가 유전자 치료의 목적으로 HPV16L1 유전자를 동물 숙주에 전달하기 위해 이용되고 있다 (Science 260(5110):926-932(1993)). 그러나, 이러한 바이러스의 사용은 복제 의존성 바이러스의 발생, 세포독성, 초기면역반응 및 원하지 않은 바이러스 유전자의 발현 등의 문제점을 가지고 있다.

한편, 배큘로바이러스 전달 벡터는 비교적 큰 크기의 외래유전자를 삽입할 수 있다는 점과 고등 진핵 세포인 곤충 세포를 이용하기 때문에 해독 후 변형 과정(post-translational processing)이 일어나, 원핵생물인 대장균에서 생성된 단백질과는 달리 발현된 재조합 단백질의 생물학적 및 면역학적 활성이 원래의 단백질과 같은 효과를 나타낸다는 중요한 장점을 지니고 있다. 이 외에도 배큘로바이러스는 동물세포 내에서는 복제가 불가능하고 세포독성을 일으키지 않기 때문에, 생물학적으로 안전한 바이러스로 알려져 있다(Virology 125:107-117(1983); Hum . Gene Ther . 7:1937-1945(1996); Proc . Natl . Acad . Sci . USA 96:127-132(1999); Trends Biotechnol . 20:173-180(2002)). 곤충 바이러스 그룹에 속하는 AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)는 다양한 종류의 동물세포에서 복제는 불가능하나 세포내로 들어갈 수 있어 유전자를 전달할 수 있다고 알려져 있다(Proc . Natl . Acad . Sci . USA 92:10099-10103(1995); Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:2348-2352(1996)). 이미 AcMNPV(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus) 유전체 내에 특정 유전자가 동물 프로모터에 의해 조절 될 경우 특정 유전자가 동물세포 내에서 높은 수준으로 발현 될 수 있다고 보고된 바 있다(Journal of Virology, 76(11):5729-5736(2002); Vaccine 26(20):2451-2456(2008)).

최근, 배큘로바이러스 표면에 다른 바이러스의 Env를 도입하여, 유전자 전달 효율을 높이기 위한 연구들이 시도되고 있다. 예를 들면 VSV(vesicular stomatitis virus) 엔벨로프 G 단백질을 배큘로바이러스 표면에 존재하도록 하거나(Journal of Virology, 78(16):8663-8672(2004); Journal of Urology 250(2): 276-283(2006); Biochemical and Biophysical Research Communications 289(2):444-450(2001); Journal of Virology 75(6):2544-2556(2001)), gp64 단백질을 바이러스 표면에 더 첨가하여 유전자 전달 효과를 높였다는 보고가 있었다(Human Gene Therapy, 14(1):67-77(2003)). 또한 배큘로바이러스 벡터로 백신화 하여 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 당단백질(hemagglutinin glycoprotein)에 대한 면역 반응을 유도한다는 보고가 있었다(Journal of Immunology, 171: 1133-1139(2003)).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시 되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 배큘로바이러스에 기반 한 다양한 병원체에 대하여 보다 향상된 면역반응을 유도할 수 있는 백신을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 항원 유전자와 바이러스의 외래 엔벨로프 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 조합(combination) 하여 발현 컨스트럭트 및 재조합 배큘로바이러스를 제조하고 이를 이용하여 면역화 하는 경우에는 면역반응이 크게 향상될 뿐만 아니라 안전하고 경제적인 백신을 제공할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 재조합 배큘로바이러스를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 백신 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 특정 항원에 대한 면역반응을 유도하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간 내인성 레트로바이러스(Human Endogenous Retrovirus: HERV)의 엔벨로프 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 HERV 엔벨로프 단백질-코딩 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 HERV 엔벨로프 단백질-코딩 핵산분자를 포함하는배큘로바이러스-기반 유전자 전달체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 바이러스의 외래 엔벨로프 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 엔벨로프-코딩 서열에 작동적으로 연결된 제1프로모터; (c) 항원 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (d) 상기 항원-코딩 서열에 작동적으로 연결된 제2프로모터를 포함하는 재조합 배큘로바이러스를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 백신 조성물을 객체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 생체 내에서 특정 항원에 대한 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 배큘로바이러스에 기반 한 다양한 병원체에 대하여 보다 향상된 면역반응을 유도할 수 있는 백신을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 항원 유전자와 바이러스의 외래 엔벨로프 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 조합(combination) 하여 발현 컨스트럭트 및 재조합 배큘로바이러스를 제조하고 이를 이용하여 면역화 하는 경우에는 면역반응이 크게 향상될 뿐만 아니라 안전하고 경제적인 백신을 제공할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 가장 큰 특징은 항원 유전자와 바이러스(가장 바람직하게는, 인간 내인성 레트로바이러스(HERV)) 외래 엔벨로프 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 조합을 이용하는 것이다.

본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 다양한 항원 유전자의 운반에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “항원 유전자” 또는 “항원 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열”은, 면역 시스템에 의해 인식될 수 있는 항원성 단백질(예컨대, 세포 또는 바이러스 표면 항원성 단백질)을 코딩하는 서열을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항원은 바이러스 병원체 항원, 박테리아 병원체 항원, 기생충(parasitic) 항원 또는 암 항원이며, 보다 바람직하게는 바이러스 병원체 항원 또는 암 항원이고, 가장 바람직하게는 바이러스 병원체 항원이다.

본 발명에서 이용될 수 있는 바이러스 병원체 항원의 예는 인플루엔자 바이러스와 같은 Orthomyxoviruses; RSV(respiratory syncytial virus), SIV(simian immunodeficiency virus) 및 HIV와 같은 레트로바이러스; EBV(Epstein-Barr Virus)와 같은 Herpesviruses; CMV(cytomegalovirus) 또는 HSV(herpes simplex virus); Lentiviruses; 광견병(rabies)와 같은 Rhabdoviruses; 폴리오바이러스와 같은 Picomoviruses; 백시니아와 같은 Poxviruses; Rotavirus; 및 Parvoviruses로부터 유래된 항원을 포함한다. 보다 구체적으로, 바이러스 병원체 항원의 예는 HPV 항원의 예는 HPV의 L1, L2, E6 또는 E7 단백질; HIV의 항원의 예는 nef, p24, gp120, gp41, tat, rev, pol, env 및 gp120의 T 세포와 B 세포 에피토프(Palker et al, J. Immunol ., 142:3612-3619(1989))을 포함한다. HBV의 표면 항원의 예는 Wu et al, Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 86:4726-4730(1989)에 개시되어 있다. 로타바이러스의 항원의 예는 VP4(Mackow et al, Proc . Natl. Acad . Sci ., USA, 87:518-522(1990)) 및 VP7(Green et al, J. Virol ., 62:1819-1823(1988)를 포함하며;, 인플루엔자 바이러스 항원은 헤마글루티딘(hemagglutinin: HA) 및 뉴클레오단백질을 포함하고; HSV 항원은 티미딘 키나아제를 포함하며(Whitley et al, In: New Generation Vaccines, pages 825-854); 조류 인플루엔자 바이러스 항원은 헤마글루티딘을 포함하고; 돼지 콜레라 바이러스 항원은 엔벤로프; 구제역 바이러스 항원은 엔벨로프; 그리고 뉴캐슬바이러스 항원은 HN(Hemagglutinin-neuraminidase), F (Fusion protein)을 포함한다.

본 발명에 이용될 수 있는 박테리아 병원체 항원의 예는 Mycobacterium spp., Helicobacter pylori, Salmonella spp., Shigella spp., E. coli , Rickettsia spp., Listeria spp., Legionella pneumoniae, Pseudomonas spp., Vibrio spp. 및 Borellia burgdorferi으로부터 유래된 항원을 포함한다. 구체적으로, 본 발명에 이용될 수 있는 박테리아 병원체 항원의 예는 Shigella sonnei의 form-1 항원(Formal et al, Infect . Immun ., 34:746-750(1981)); V. cholerae의 O-항원(Forrest et al, J. Infect . Dis . 159:145-146(1989); E. coli의 FA/I 섬모항원(fimbrial antigen)(Yamamoto et al, Infect . Immun ., 50:925-928(1985))과 열민감성 독소의 비독성 B-서브유니트(Klipstein et al, Infect. Immun ., 40:888-893 (1983)); Bordetella pertussis의 퍼택틴(pertactin)(Roberts et al, Vacc., 10:43-48(1992)); B. pertussis의 아데닐레이트 사이클라아제-헤모라이신(Guiso et al, Micro. Path ., 11:423431(1991)); 및 Clostridium tetani의 테타너스 독소의 단편 C(Fairweather et al, Infect . Immun ., 58:1323-1326(1990))을 포함한다.

본 발명에 이용될 수 있는 기생충 항원의 예는 Plasmodium spp., Trypanosome spp., Giardia spp., Boophilus spp., Babesia spp., Entamoeba spp., Eimeria spp., Laishmania spp., Schistosome spp., Brugia spp., Fascida spp., Dirofilaria spp., Wuchereria spp., 및 Onchocerea spp.으로부터 유래된 항원을 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명에 이용될 수 있는 기생충 항원의 예는 Plasmodium bergerii의 circumsporozoite 항원 및 P. falciparum의 circumsporozoite 항원과 같은 Plasmodium spp.의 circumsporozoite 항원(Sadoff et al, Sci ., 240:336-337 (1988)); Plasmodium spp.의 merozoite 표면 항원(Spetzler et al, Int . J. Pept . Prot . Res ., 43:351-358 (1994)); Entamoeba histolytica의 갈락토오스 특이 렉틴(Mann et al, Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 88:3248-3252 (1991)); Leishmania spp.의 gp63(Russell et al, J. Immunol ., 140:1274-1278 (1988)); Brugia malayi의 파라마이오신(Li et al, Mol . Biochem . Parasitol ., 49:315-323 (1991)); 및 Schistosoma mansoni의 트리오스-포스페이트 이소머라아제(Shoemaker et al, Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 89:1842-1846 (1992))를 포함한다.

본 발명에 이용될 수 있는 암 항원의 예는 전립선 특이 항원(Gattuso et al, Human Pathol ., 26:123-126 (1995)), TAG-72 및 CEA(carcinoembryonic antigen) (Guadagni et al, Int . J. Biol . Markers, 9:53-60 (1994)), MAGE-1 및 티로시나아제(Coulie et al, J. Immunothera ., 14:104-109 (1993)), p53(WO 94/02167), NY-ESO1(cancer- testis antigen), AFP(α-feto protein) 및 암 항원 125(CA-125), EPCA(Early Prostate Cancer Antigen)를 포함한다.

보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 항원은 바이러스 병원체 항원 또는 암 항원이고, 가장 바람직하게는 바이러스 병원체 항원이다.

본 발명에서 이용되는 항원 유전자가 바이러스 병원체 항원인 경우, 상기 항원은 바람직하게는 HPV(human papilloma virus) 항원, HBV(hepatitis B virus) 항원, HCV(hepatitis C virus) 항원, HIV(human immunodeficiency virus) 항원, 로타바이러스 항원, 인플루엔자 바이러스 항원, HSV(herpes simplex virus) 항원, 조류 인플루엔자 바이러스 항원, 돼지 콜레라 바이러스 항원, 구제역 바이러스 항원 또는 뉴캐슬바이러스 항원이다.

보다 바람직하게는, 상기 항원은 HPV 항원이며, 보다 더 바람직하게는 HPV의 L1, L2, E6 또는 E7 단백질이고, 가장 바람직하게는 HPV의 L1이다.

HPV L1은 체내 또는 체외에서 바이러스 유사 입자(virus like particles: VLPs)로 자가조립 하는 고유의 특징을 가지고 있다. L1 단백질은 HPV 단백질 중에서 가장 보존된 단백질이다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 L1 서열은 HPV 타입 1, 2, 3a, 4, 5, 6b, 7, 8, 9, 10 , 11a, 12, 13, 58, 16 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 HPV로부터 유래된 것이고, 보다 더 바람직하게는 HPV 타입 16 또는 18로부터 유래된 HPV로부터 유래된 것이다. L1 단 백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 예컨대, GenBank accession No. EU118173( J. Virol . 67(12):6929-6936(1993)), AY383628 및 AY383629(Virology 321(2): 205-216(2004))에 기재되어 있다.

본 발명에서 이용되는 바이러스의 외래 엔벨로프 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 배큘로바이러스를 제외한 다양한 바이러스로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 엔벨로프 단백질은 인간세포를 숙주 세포로 하는 바이러스로부터 유래된 것이며, 보다 바람직하게는 인간세포의 표면에 해당 수용체가 있는 바이러스로부터 유래된 것이고, 가장 바람직하게는 인간 세포의 수용체 매개 파고사이토시스를 유도할 수 있는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 바이러스의 엔벨로프 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 엔벨로프는 알파바이러스, 파라믹소바이러스, 랩도비리데, 믹소바이러스, 코로나바이러스, 레트로바이러스, 필로바이러스 또는 아레나바이러스로부터 유래된 것이고, 보다 더 바람직하게는 레트로바이러스로부터 유래된 것이며, 가장 바람직하게는 인간 내인성 레트로바이러스(Human Endogenous Retrovirus: HERV)로부터 유래된 것이다. HERV는 실제 인간에게 존재하는 내인성 바이러스로 대부분은 불활성화 된 상태로 사람의 지놈 상에 존재하고 있다 엔벨로프 단백질은 재조합 바이러스의 표면에 발현되며, 이는 인간 세포의 수용체와 상호작용 하여 파고사이토시스를 유도한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, HERV의 엔벨로프를 코딩하는 서열은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코팅하는 뉴클레오타이드 서열이고, 보다 바 람직하게는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열이다. 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열은 곤충세포에서 HERV 표면단백질(Env)가 잘 발현되도록 최적화 한 것이다.

본 발명의 키메라 바이러스는 배큘로바이러스에 기반한다.

배큘로바이러스는 막대 모양의 바이러스로서 인간 세포에서 곤충-특이 프로모터로부터 자신의 유전자를 발현하지 않는다. 이러한 이유 때문에, 배큘로바이러스는 바이러스 유전자 발현에 의한 면역반응을 유발하지 않기 때문에, 유전자 치료제의 기본 시스템으로서 주목을 받고 있다. 그러나, 포유동물 프로모터의 조절 하에 있으면 배큘로바이러스 벡터에 있는 외래 유전자의 발현이 높은 수준으로 일어난다. 배큘로바이러스에 의한 감염은 내인성 인간 바이러스의 복제를 촉발하지 않는 장정도 있다. 다른 유전자 치료제용 바이러스와 다르게, 배큘로바이러스는 혈청-부재 배지에서 잘 성장할 수 있어, 대량 생산에 적합한 이점이 있다.

재조합 배큘로바이러스의 구축 및 곤충세포의 배양은 Summers and Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. In Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; U.S. Pat. No. 4,745,051; 및 EP0340359에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, HERV Env 유전자 및 HPV L1 유전자를 포함하는 키메라 배큘로바 이러스는 HERV Env 유전자 및 HPV L1 유전자를 운반하는 전이벡터를 세포에 형질전환 시킨다. HERV Env 유전자 및 HPV L1 유전자를 포함하는 발현 컨스트럭트는 트랜스포존 서열, 예컨대 Tn7으로 플랭킹 된다. 이러한 전이벡터를 미니-attTn7 타겟 위치를 갖는 백미드(배큘로바이러스 셔틀벡터) 및 트랜스포자아제(transposase) 유전자를 갖는 헬퍼 플라스미드를 포함하는 세포, 예컨대 E. coli에 형질전환 시킨다. 전이벡터가 상기 E. coli 세포에 형질전환 되면, 트랜스포지션이 발생하여 재조합 백미드가 만들어진다. 이어, 재조합 백미드를 분리하고 이를 적합한 곤충세포에 형질전환시켜 키메라 배큘로바이러스를 생성시킨다. 본 발명에 적합한 곤충세포는 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어, Sf9(Spodoptera frugiperda), Spodoptera exiaua , Choristoneura fumiferana , Trichoplusia ni 및 Spodoptera littoralis 및 Drosophila 등이 곤충세포로 이용될 수 있다.

본 발명의 재조합 배큘로바이러스에서 바이러스의 엔벨로프 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 HPV L1을 코팅하는 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 엔벨로프 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 HPV L1을 코팅하는 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 연결된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, 엔벨로프 단백질을 코딩하 는 뉴클레오타이드 서열 또는 HPV L1을 코팅하는 뉴클레오타이드 서열에 연결된 프로모터는 다양한 프로모터가 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 엔벨로프-코딩 서열에 작동적으로 연결된 제1프로모터는 곤충 세포에서 작동하는 프로모터이며, 보다 바람직하게는 배큘로바이러스 IE-1 프로모터, IE-2 프로모터, p35 프로모터, p10 프로모터, gp64 프로모터 또는 폴리헤드린 프로모터이고, 가장 바람직하게는 폴리헤드린 프로모터이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, HPV L1-코팅 서열에 작동적으로 연결된 제2프로모터는 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터이고, 보다 바람직하게는 제2프로모터는 U6 프로모터, H1 프로모터, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 벡시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, 인간 연장인자 1α(hEF1α) 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 AFP 프로모터 또는 알부민 프로모터이고, 가장 바람직하게는 인간 연장인자 1α(hEF1α) 프로모터이다.

바람직하게는, 본 발명에 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리 아네닐화 서열을 포함한다. 예를 들어, 인간 연장인자 1α(hEF1α) polyA, 소성장 호르몬 터미네 이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res . 17:6983-6998(1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol . Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res . 26:1870-1876(1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol . Cell . Biol . 5:2104-2113(1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol . Cell . Biol . 15:4783-4790(1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 바이러스에서 엔벨로프-코딩 서열 및 HPV L1-코딩 서열은 각각 제1프로모터-엔벨로프-코딩 서열-폴리 A 서열 및 제2프로모터-HPV L1-코딩 서열-폴리 A 서열의 형태의 발현 컨스트럭트로 포함될 수 있다. 또한, 제1프로모터-엔벨로프-코딩 서열-제2프로모터-HPV L1-코딩 서열-폴리 A 서열의 형태로 포함될 수도 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 바이러스는 발현 하고자 하는 목적 유전자를 추가적으로 포함한다. 본 발명의 재조합 바이러스에 의해 발현되는 목적 유전자는 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 목적 유전자는 예컨대, 암세포의 사멸을 유도하고 궁극적으로 종양을 퇴화시키는 암 치료 유전자로서, 종양 억제 유전자, 면역 조절 유전자 [예: 사이토카인 유전자, 케모카인 유전자 및 조자극 인자 (costimulatory factor: B7.1과 B7.2와 같은 T 세포 활성에 필요한 보조 분자)], 자살 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 친-세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자가 포함되며 이에 한정되는 것은 아니 다.

자살 유전자는 세포가 외부 인자에 의해 살상되기 쉽도록 유도하는 물질을 발현하거나 세포에 독성 조건을 유발하는 핵산 서열이다. 이러한 자살 유전자로 잘 알려진 것은 티미딘 키나제(TK) 유전자이다 (미국특허 제5,631,236호 및 제5,601,818호). TK 유전자 산물을 발현하는 세포는 간사이클로비르 (gancyclovir)의 투여에 의해 선택적인 사멸에 민감하다. 종양 억제 유전자는 종양의 형성을 억제하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 가리킨다. 종양 억제 유전자는 포유동물에서 자연발생 유전자이며, 이 유전자의 결실 또는 불활성화는 종양 발생에 필수 전제인 것으로 믿어지고 있다. 종양 억제 유전자의 예로는 APC, DPC4, NF-1, NF-2, MTS1, WT1, BRCA1, BRCA2, VHL, p53, Rb, MMAC-1, MMSC-2, 망막아세포종 유전자 (Lee et al. Nature, 329:642(1987)), 선종양 폴립증 장 단백질 (adenomatous polyposis coli protein; 미국특허 제 5,783,666 호), 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자 (Cheng et al. Proc . Nat . Acad . Sci ., 95:3042-3047(1998)), 결손된 결장 종양 (DCC) 유전자, MTS1, CDK4, VHL, p110Rb, p16 및 p21을 포함한 종양 억제 유전자의 INK4 계열의 일원 및 이의 치료학적으로 유효한 단편 (예, p56Rb, p94Rb 등)이 포함된다. 당업자는 상기 예시된 유전자 외에 기타 알려진 항종양 유전자 모두가 본 발명에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 명세서에서 용어 "세포독성 유전자 (cytotoxic gene)"는 세포내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포독성 유전자의 예에는 슈도모나스 외독소 (exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.

본 명세서에서 용어 "세포증식 억제 유전자 (cytostatic gene)"는 세포내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포증식 억제 유전자의 예에는 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 키나아제 억제인자를 코딩하는 유전자 (예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성 호메오박스 (growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자 (WO 97/16459 및 WO 96/30385) 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 각종 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는 많은 치료 유전자도 본 발명의 시스템에 의해 운반된다. 예를 들면, 사이토카인 (예, 인터페론-알파, -베타, -델타 및 -감마), 인터루킨 (예, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-19 및 IL-20) 및 콜로니 자극 인자 (예, GM-CSF 및 G-CSF)를 암호화하는 유전자, 케모카인 그룹 (단핵구 화학 주성단백질 1 (MCP-1), 단핵구 화학 주성 단백질 2 (MCP-2), 단핵구 화학 주성단백질 3 (MCP-3), 단핵구 화학 주성 단백질 4 (MCP-4), 대식구 염증성 단백질 1α(MIP-1α), 대식구 염증성 단백질 1β (MIP-1β), 대식구 염증성 단백질 1γ (MIP-1γ), 대식구 염증성 단백질 3α (MIP-3α), 대식구 염증성 단백질 3β(MIP-3β), 케모카인 (ELC), 대식구 염증성 단백질 4 (MIP-4), 대식구 염증성 단백질 5 (MIP-5), LD78β, RANTES, SIS-엡실론 (p500), 흉선 활성화-조절되는 케모카인 (TARC), 에오탁신, I-309, 인간 단백질 HCC-1/NCC- 2, 인간 단백질 HCC-3, 마우스 단백질 C10 등)이 포함된다. 또한, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA) 또는 우로키나제를 발현하는 유전자 및 지속적인 혈전 효과를 제공하여 콜레스테롤 과다혈증을 예방하는 LAL 생성 유전자가 포함된다. 또한, 낭성 섬유증, 아데노신 데아미나제 결핍증 및 AIDS와 같은 바이러스, 악성 및 염증 질환 및 상태를 치료하기 위한 많은 폴리뉴클레오타이드가 알려져 있다.

본 명세서에서 용어 "친-세포사멸 유전자 (pro-apoptotic gene)"는 발현되어 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 친-세포사멸 유전자의 예에는 p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, Fas 리간드, TNF-, TRAIL, p53 경로 유전자 및 카스파아제를 코딩하는 유전자가 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어 "항-신생혈관생성 유전자 (anti-angiogenic gene)"는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 항-신생혈관 생성 인자에는, 안지오스타틴, Tie 2 (PNAS, 1998, 95,8795-800)와 같은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다.

상술한 목적 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank 또는 EMBL과 같은 DNA 서열 데이터뱅크로부터 입수할 수 있다.

본 발명의 재조합 바이러스는 표면의 엔벨로프 단백질에 의해 인간 세포의 수용체 매개 파고사이토시스를 유도할 수 있으며, 발현되는 항원 단백질에 의해 주 입되는 생체 내에서 항원 단백질에 대한 면역반응을 유발한다. 더욱이, 본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 체액성 면역뿐만 아니라 세포성 면역 반응도 우수하게 유발한다. 결국, 본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 이러한 작용에 의해 다양한 질환에 대한 예방 효능을 잘 발휘할 수 있다. 하기의 실시예에서 입증한 바와 같이, 종래의 HPV 백신인 가다실(Gardasil)과 비교하여 본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 HPV에 대한 체액성 면역 유도능이 거의 동일할 뿐만 아니라, 가다실이 가지고 있지 않은 HPV에 대한 세포성 면역 유도능을 가지고 있어, 가다실보다 우수한 HPV 백신 효능을 발휘할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 (a) 상술한 재조합 배큘로바이러스의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명의 백신 조성물에 포함되는 재조합 배큘로바이러스는 다양한 항원에 대하여 면역 유도능을 나타낸다.본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 백신 조성물에서 재조합 배큘로바이러스는 HPV 항원 유전자를 포함하며 상기 백신 조성물은 HPV 백신 조성물인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.

본 발명의 HPV 백신 조성물은 HPV 감염에 의해 유발되는 다양한 질환, 바람직하게는 자궁경부암, 직장암, 외음부암, 음경암 또는 두경부암의 예방 또는 치료, 바람직하게는 예방에 이용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명은 자궁경부암의 예방 또는 치료, 바람직하게는 예방에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상기한 질환에 대한 예방 또는 치료, 바람직하게는 예방 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 백신에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 백신은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.

본 발명의 백신의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 백신은 1 x 10³- 1 x 10¹⁵ pfu/㎖의 재조합 바이러스를 포함한다.

본 발명의 백신은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 바이러스의 외래 엔벨로프 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 엔벨로프-코딩 서열에 작동적으로 연결된 제1프로모터; (c) HPV(human papilloma virus)의 L1을 코팅하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (d) 상기 L1-코딩 서열에 작동적으로 연결된 제2프로모터를 포함하는 재조합 배큘로바이러스를 제공한다.

본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 상술한 백신에 포함되는 재조합 배큘로바이러스와 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 인간 내인성 레트로바이러스(Human Endogenous Retrovirus: HERV)의 엔벨로프 단백질을 코딩하며 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명자들은 배큘로바이러스에 기반 한 보다 향상된 유전자 전달 시스템을 구축하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 유전자를 운반하고자 하는 목적 세포에 존재하여 이 세포에 독성을 지니지 않는 내인성 레트로바이러스의 표면 단백질을 유전자 전달 시스템에 도입시키는 경우, 유전자 전달 시스템의 전달 시스템을 크게 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

개선된 유전자 전달 시스템을 개발하기 위하여, 본 발명자들은 우선 유전자 전달 시스템에 도입되는 HERV의 엔벨로프 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 변형시켜 배큘로바이러스의 숙주세포인 곤충세포에서의 발현을 최적화 시켰다.

본 발명에서 유전자 전달체에 도입되는 엔벨로프 유전자는 HERV로부터 유래된 것이다. HERV는 인체 지놈 내에 삽입되어 있으나, 전체적으로 완벽한 유전자를 갖고 있지 않아 발현이 되지 않는다. 본 발명은 HERV의 비 발현 유전자를 곤충세포에서 높은 효율로 발현되도록 천연(natural-occurring)의 HERV 엔벨로프 유전자를 변형시킨 것이다.

본 명세서에서 용어 핵산 분자는 바람직하게는 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 HERV 엔벨로프-코딩 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 85%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl. Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://wwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://wwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 HERV의 엔벨로프 단백질을 코딩하는 상기의 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터는 상기 HERV의 엔벨로프-코딩 서열을 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로 모터 또는 배큘로바이러스 유래된 프로모터(예컨대, 폴리헤드린 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 첨부한 도 6의 유전자 지도를 갖는다. 즉, 도 6의 벡터는 HERV의 엔벨로프 유전자의 발현은 폴리헤드린 프로모터에 의해 조절되며, 목적 유전자(가장 바람직하게는, HPV의 16L1 유전자)의 발현은 hEF1α 프로모터에 의해 조절되고, 종결신호로서 hEF1α 폴리 A 신호를 가지며, 발현 카세트 양쪽에 트랜스포존 7의 두 암이 위치해 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 HERV의 엔벨로프 단백질을 코딩하는 상기 핵산분자를 포함하는 배큘로바이러스-기반 유전자 전달체(gene carrier)를 제공한다.

본 발명의 유전자 전달체는 상술한 재조합 벡터를 곤충세포에 감염시켜 얻은 바이러스로부터 유래되기 때문에, 상기 재조합 벡터와 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

최근 유전자 전달 시스템으로는 바이러스를 이용한 방법이 주를 이루고 있다. 바이러스를 이용한 유전자 전달 시스템으로는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티 바이러스 및 벡시니아 등 많은 바이러스들이 사용된다. 대부분 이들 바이러스는 사람에 새로운 감염 또는 위험을 주는 바이러스로 인체 사용에 제한을 두고 있는 반면, 배큘로바이러스는 인체 감염능이 없이 제한된 곤충에서만이 복제가 가능하여 생물학적으로 안전한 바이러스로 알려져 있다. 바이러스를 매개로한 유전자 전달 시스템은 바이러스의 감염을 통하여 이루어지는데, 이 감염은 바이러스의 표면 단백질과 목적 세포 및 동물의 수용체와의 상호작용을 통하여 결정이 된다.

본 발명은 이러한 배큘로바이러스의 이점에 착안하여 배큘로바이러스 표면에 적용 하고자 하는 동물에 존재하는 내인성 바이러스의 표면 단백질을 재조합하여 삽입시킴으로써, 보다 향상된 유전자 전달 시스템을 제공한다. 내인성 바이러스는 사람을 비롯하여 돼지, 쥐, 고양이 및 개 등을 비롯한 모든 포유류를 비롯하여 넓게 분포 하고 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 유전자 전달체의 경우, 인간의 내인성 레트로바이러스의 엔벨로포 단백질이 표면에 결합되어 있기 때문에, 인간 세포 내로 원하는 유전자를 높은 효율로 그리고 안전하게 운반할 수 있다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달체는 다양한 질환 및 질병에 대한 유전자 치료제의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명의 백신은 항원 유전자와 바이러스의 외래 엔벨로프 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 배큘로바이러스를 포함한다.

(ⅱ) 본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 표면의 엔벨로프 단백질에 의해 인간 세포의 수용체 매개 파고사이토시스를 유도할 수 있으며, 발현되는 항원 단백질(예컨대, HPV L1)에 의해 주입되는 생체 내에서 면역반응을 유발한다.

(ⅲ) 더욱이, 본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 체액성 면역뿐만 아니라 세포성 면역 반응도 우수하게 유발한다.

(ⅳ) 결국, 본 발명의 재조합 바이러스는 이러한 작용에 의해 특정 항원에 의해 유발되는 다양한 질환(예컨대, 자궁경부암)에 대한 예방 효능을 잘 발휘할 수 있다.

(ⅴ) 종래의 HPV 백신인 가다실과 비교하여 본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 HPV에 대한 체액성 면역 유도능이 거의 동일할 뿐만 아니라, 가다실이 가지고 있지 않은 HPV에 대한 세포성 면역 유도능을 가지고 있어, 가다실보다 우수한 HPV 백신 효능을 발휘할 수 있다.

(ⅵ) 본 발명에 따르면 안전하고 경제적인 백신을 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

세포 준비

곤충세포인 Sf9(ATCC CRL-1711)은 27℃, 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco BRL)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco BRL)이 들어 있는 TC-100 배지(Welgene)에서 배양 하였다. 293TT 세포(Schiller Lab, 미국 NCI)는 10% FBS 및 하이그로마이신 B(400 ㎍/ml)(Invitrogen Corp.)로 보충된 DMEM(Dulbecco's modified minimal essential medium)에서 배양하였다. 인간 간암 세포주인 Huh7(JCRB0403)은 5% CO₂와 37℃ 온도 하에서 10% FBS (Gibco BRL)와 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco BRL) 이 들어 있는 DMEM 배지에서 배양 하였다. HeLa 세포(ATCC)는 10% FBS, 100 U 페니실린/ml 및 100 ㎍ 스트렙토마이신/ml이 들어 있는 DMEM 배지에서 배양 하였다.

HERV 표면 단백질을 암호화 하는 유전자 합성

HERV(human endogenous retrovirus)는 실제 사람에게 존재하는 내인성 바이러스로 대부분은 불활성화 된 상태로 사람의 지놈 상에 존재하고 있다. HERV의 표면 단백질을 획득하기 위하여, HERV 표면 단백질을 코딩하는 유전자를 직접 합성하였으며, 합성 시에 유전자의 염기서열을 곤충세포에서의 발현에 적합하도록 최적화 하였다(GeneScript). 자체 합성된 HERV 표면 단백질을 코딩하는 유전자를 pUC57 벡터(GeneScript)의 EcoRV 위치에 삽입하여 pUC57-HERVenv를 제작 하였다.

전이벡터의 클로닝

전이벡터(transfer vector)의 클로닝 과정을 포함하는 재조합 배큘로바이러스의 제조는 제조사(Invitrogen)의 프로토콜에 따라 Bac-to-Bac^TM 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 실시하였다. 재조합 배큘로바이러스 시스템을 이용하여 동물세포에서 HPV 16L1 단백질을 발현시키기 위하여, AcMNPV(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus) 전이벡터에 인간 연장인자 1α 프로모터(hEF1α)와 HPV 16L1 유전자를 삽입시켰다. 우선, hEF1α프로모터 뒤로 HPV 16L1 유전자와 hEF1a 폴리 A 시그널이 연결된 유전자 부분을 플라스미드 DNA인 p16L1L2(Schiller Lab, 미국 NCI; Christopher B. Buck et al., J. Virol . 82(11):51905197(2008))를 주형으로 하여 PCR 증폭 시켰다. 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다: 센스 프라이머 5-GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCA-3; 안티센스 프라이머 5 -TTAATTAACCCACGTTTCAACATG-3'.

PCR 증폭산물을 pGEM-Teasy 벡터(Promega)에 클로닝하고, pGEM-Teasy/hEF1α16L1에서 hEF1α16L1을 EcoRI으로 절단하고, pFastBac^TM1(Invitrogen) 전이벡터의 EcoRI 부위에 삽입 하여 pAc-hEF1α16L1 벡터를 제조하였다(참조: 도 1a). pUC57-HERVenv에서 SalI으로 절단하여 HERV 표면 단백질 유전자를 pFastBac^TM1에 삽입 시 키고, hEF1α16L1은 pGEM-Teasy/hEF1α16L1을 NotI으로 절단 한 후 pFastBac^TM1-HERVenv 전이벡터에 삽입하여, pAcHERVenv-hEF1α16L1 벡터를 제조하였다(참조: 도 1b). 클로닝한 전이벡터들의 ORF(open reading frame)를 확인하기 위하여 ABI 유전자 서열 분석기(ABI)를 이용하여 유전자 서열을 분석 하였다.

재조합 배큘로바이러스의 제작

클로닝한 재조합 전이벡터를 각각 DH10Bac(Invitrogen)에 형질전환 시켜 재조합 백미드(bacmid, baculovirus shuttle vector)를 생산하였다. 재조합 된 백미드의 구별은 M13 프라이머(Invitrogen)를 이용하여 PCR을 통해 확인하였다. 확인된 세 종류의 백미드는 재조합 배큘로바이러스를 제작하기 위하여 리포펙틴(Invitrogen)을 이용하여 Sf9 세포에 형질 감염 시켰다. 4일 후 감염된 세포에서 생성된 바이러스는 수집하여 새로운 Sf9 세포에 반복적으로 감염시켜 높은 역가의 바이러스를 생산하였다. 그리고 선발된 재조합 바이러스를 각각 AcHERVenv-hEF1α16L1 및 Ac-hEF1α16L1이라고 명명하였다(참조: 도 1c). 최종적으로 준비된 재조합 배큘로바이러스들의 역가는 Sf9 세포에서 플라크 확인 법을 통하여 확인 하였다.

한편, HPV 18L1 유전자를 운반하는 재조합 배큘로바이러스(AcHERVenv-hEF1α18L1)는 이용되는 HPV 18L1 유전자(GenBank accession No.AY383629)을 제외하고는 상술한 HPV 16L1에 대한 재조합 배큘로바이러스(AcHERVenv-hEF1α16L1)과 동일한 방법 으로 제조하였다.

재조합 배큘로바이러스를 이용한 Huh7 세포로의 유전자 도입

Huh7 세포를 24-웰 플레이트에 1 x 10⁵ 세포/웰로 분주하여 37℃에 배양하였다. 배양 12시간 후 PBS로 세척해 주고, 100 MOI로 Ac-hEF1α16L1 및 AcHERVenv-hEF1α16L1 바이러스를 감염 시켰다. 37℃에서 10시간 배양한 뒤 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 새로운 DMEM 배지로 교체하고 48시간 배양 하였다. 각각의 바이러스에서 발현되는 HPV 16L1의 발현 정도는 다음의 실험을 통해 알아보았다.

역전사중합효소연쇄반응 ( RT - PCR ) 분석

유전자 도입이 된 Huh7 세포로부터 RNeasy mini 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 총 RNA를 정제하고 디옥시리보뉴클레아제I(DNaseI, Promega, Madison, WI)을 처리하여 DNA를 제거 하였다. 정제된 RNA는 M-MuLV 역전사효소(Bioneer, USA)를 이용하여 cDNA를 합성 하였다. 2.5 ㎕ 의 cDNA를 7.5 ㎕의 중합효소연쇄반응의 반응혼합물(PCR reaction mixture)에 첨가하여 Thermal Cycler PCR(GeneAmp PCR system 9700, Perkin-Elmer Cetus, USA)을 이용하여 PCR을 하였다. PCR 조건은 94℃에서 3분으로 핫 스타트를 1 회 수행한 후, 94℃에서 30초간 변성반응을 시 킨 후, 62℃에서 20초간 어닐링 반응, 그리고 72℃에서 20초간 연장 반응 30 사이클이다. 반응에 이용된 프라이머는 센스 프라이머 5-CAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGG-3, 안티센스 프라이머 5 -GGCTGCAGGCCGAAGTTCCAGTCCTCCA-3이며, 약 275 bp의 증폭산물을 기대할 수 있다. 시료들 사이의 RT-PCR 효율을 보정하기 위해 하우스킵핑 유전자인 18S rRNA (ribosomal RNA) 유전자를 이용 하였다. PCR 산물들을 1.5% 아가로즈 겔에서 확인 하였다.

실시간 PCR 에 의한 정량분석 (Q- PCR ).

감염된 세포들 내에서의 HPV 16L1 mRNA 발현 수준을 정량하기 위하여 이전에 보고(Dhar et al ., 2001)된 대로 실시간 PCR에 의한 정량분석(Q-PCR)을 수행 하였다. 총 HPV 16L1 mRNA 발현 수준은 실시간 PCR(Roter Gene 3000, Corbett Research, Australia) 기기를 이용하여 4회 반복 실험을 하여 확인하였다. PCR 반응 혼합액에는 5 ㎕의 DyNAmoTM HS SYBR^TM Green qPCR 키트 반응 액과 5 ㎕의 샘플 용액(프라이머와 주형)이 첨가 되어 있다. 프라이머는 16L1 센스 프라이머 5’-CAGCGAGACCACCTACAAGA-3 와 안티센스 프라이머 5-GCTGTTCATGCTGTGGATGT-3 로 구성 되었으며 약 138 bp의 증폭산물을 기대할 수 있다. 초기 DNA 변성과정을 95℃에서 5분, 94℃에서 변성 반응 10초, 62℃에서 어닐링 20초, 그리고 72℃에서 20초간 연장 반응을 45 사이클 실시하여 PCR 증폭 산물을 얻었다. PCR을 마친 후 표 적 분자들의 카피수와 멜팅 커브 분석(melting curve analysis)을 하였고, 소프트웨어 Roter-Gene ver. 6.0(Roter Gene 3000, Corbett Research, Australia) 프로그램을 이용하였다.

면역세포화학법( Immunocytochemistry )

Huh7 세포를 유리 슬라이드에 분주하고 Ac-hEF1α16L1와 AcHERVenv -hEF1α16L1 바이러스를 각각 100 MOI로 형질감염 시켰다. 감염 된지 48 시간이 되는 세포들을 4% 포름알데하이드로 4℃에서 12시간 고정 시키고 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척한 후 0.5% Triton X-100이 든 PBS를 넣어 37℃에서 10분간 배양시켰다. 그 다음으로는 PBS 로 세척한 후 5% 정상 염소 혈청이 든 PBS로 37℃에서 30분간 블록킹 하였다. 이 후 HPV 16L1 단일클론 항체(Camvir-1)와 함께 하루 동안 4℃ 환경에서 반응시켰다. 반응시킨 세포를 PBS로 30분간 세척 후 마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다아제 항체를 사용하여 1시간 반응시킨 뒤 PBS로 세척 한 후 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscope, FV-1000 spectral, Olympus, Japan) 기기를 이용하여 HPV 16L1 단백질의 존재 여부를 확인 하였다.

가다실

가다실^TM(MERCK & CO, USA, MSD, Korea)은 HPV 쿼드리밸런트(Quadrivalent, 타입 6, 11, 16 및 18) 백신으로서, 본 실험에서는 면역반응 양성 대조군으로 이용하였다.

마우스

자성의 4주령 BALB/c 마우스를 오리엔트-바이오(대한민국)로부터 구입하고 필터 팁 조건 하에서 물과 사료에 자유롭게 접근할 수 있도록 하면서 사육 하였다.

마우스의 면역화

재조합 배큘로바이러스를 멸균 PBS에 총 부피 100 ㎕로 희석한 다음, 10⁷PFU(plaque forming unit)의 양으로 마우스의 하단 다리 근육에 주사하여 면역화 시켰다. 24 마리의 BALB/c 마우스를 8개의 군으로 나누었다(표 1). 선택된 프라임/부스트 레짐에 따라 각각의 군의 마우스에 주사하였다. 면역화는 2주 간격으로 3번씩 실시하였고, 각각의 면역화 후 1주째에 혈액 및 질 세척액(vaginal washes)을 수집하였다. 분석 전에, 항-혈청을 열 변성시켰다.

실험군	면역화(2주 간격)
실험군	1차	2차	3차
1군	가다실	가다실	가다실
2군	AcHERVenv-hEF1α16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1	AcHERVenv-hEF1α16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1	AcHERVenv-hEF1α16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1
3군	AcHERVenv-hEF1α16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1	AcHERVenv-hEF1α16L1또는 AcHERVenv-hEF1α18L1	가다실
4군	AcHERVenv-hEF1α16L1또는 AcHERVenv-hEF1α18L1	가다실	가다실
5군	AcHERV	가다실	가다실
6군	AcHERV	AcHERV	가다실
7군	AcHERV	AcHERV	AcHERV
8군	PBS	PBS	PBS

ELISA

HPV16 L1과 말토오스 결합 단백질(MBP)이 결합된 MBP-L1(바이오프로젠, 한국)을 1 ㎍/ml로 60 ㎕를 ELISA 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 4℃에서 14-16시간 동안 처리하였다. 0.1% Tween-20를 포함하는 PBS(블록킹 완충액) 내의 5% 스킴 밀크로 웰을 37℃에서 2시간 동안 블록킹하였다. 0.05% Tween-20 및 0.05% NP-40을 포함하는 PBS로 세척한 다음, 블록킹 완충액으로 1:100 희석된 혈청 시료를 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. IgG 검출을 위하여 항-마우스 IgG-HRP(SC-2030, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)를 블록킹 완충액로 1:2,000으로 희석하고, 웰에 첨가하였다. IgA 검출을 위하여 항-마우스 IgA-HRP(SC-3791, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)를 블록킹 완충액로 1:1,000으로 희석하고, 웰에 첨가하였다. 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 4.7) 내의 o-페닐렌디아민 기질을 웰에 첨가하고 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

슈도바이러스의 제조

Schiller (J. Virol . 78(2):751757(2004))가 제안한 방법에 따라 293TT 세포의 공동형질전환을 실시하여 PVs(pseudoviruses)를 제조하였다. 우선, 형질전환 16시간 전에 293TT 세포를 25 T 플라스크에 씨딩하고, L1/L2-플라스미드 및 pfwB 플라스미드(강화 녹색형광단백질(GFP)을 발현)의 혼합물로 Lipofectin(Invitrogen)을 이용하여 형질전환 시켰다. 사용된 플라스미드의 뉴클레오타이드 맵은 “http://ccr.cancer.gov/Staff/links.asp?profileid=5637”에서 확인할 수 있다. HPV16 PVs의 제조를 위하여, pfwB 및 p16L1/L2 각각 9 ug으로 세포를 형질전환 시켰다. 또한 HPV18 PVs의 제조를 위하여, pfwB 및 p18L1/L2 각각 9 ug으로 세포를 형질전환 시켰다. 4-6시간 후, 형질전환 세포의 배지를 교체 하였다. 형질전환 48시간 후 세포를 수집 하였다. 상등액을 분획하고 다음 실험 전까지 -80℃에서 보관 하였다.

중화반응 분석

면역 주사한 마우스의 희석 혈청 및 PVs의 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 시켰다. 접종 16시간 전에 1 x 10⁴ 개로 씨딩된 HeLa 세포에 혼합물을 접종하여 2일간 인큐베이션 후, 형광현미경 하에서 GFP 발현을 관찰하였다. GFP 발현 수준을 정상 마우스 혈청으로 처리한 시료의 1/2까지 감소시키는 혈청의 최대 희석도의 역수로서 중화 타이터를 나타내었다.

IFN -γ효소-연결 면역스팟 분석( enzyme - linked immunospot : ELISPOT )

PBS 100 ㎕ 내의 항-마우스 감마 인터페론(IFN-γ) 포획 항체(BD Bioscience) 200 ng으로 96 웰 플레이트를 4℃에서 하룻밤 동안 코팅 하였다. 플레이트를 배지(RPMI 1640 with 10% FBS) 100 ㎕로 2시간 동안 37℃에서 블록킹 하고, 비장세포를 웰 당 1 X 10⁶ 세포 밀도로 두 개씩 씨딩 하였다. 이어, 2 x 10⁶IFU로 PVs를 접종 하고 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 하였다. PBS0.05% Tween 20로 3회 세척하여 세포를 제거하였다. 이어, PBS10% FBS 100 ㎕ 내의 멸균-필터링된 바이오틴화 항-마우스 IFN-γ 검출항체 20 ng을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 방치 하였다. PBS0.01% Tween 20으로 플레이트를 3회 세척한 다음, 스트렙타비딘-알칼린 포스파타아제 1:1,000 희석액 100 ㎕를 첨가하였다. 그런 다음, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하고 PBS0.01% Tween 20으로 3회 세척하고, PBS로 3회 세척하였다. 플레이트에 AEC 기질 시약(BD Biosciences, CA, USA) 100 ㎕를 첨가하고 10분 동안 반응시켰다. 플레이트를 증류수로 세척하여 반응을 정지시켰다. 스팟을 ELISPOT 리더(AID ElispotReader ver.4, Germany)로 정량화 하였다. 배지만 있고 비장세포가 처리되지 않은 웰을 음성 대조군으로 이용하였다. 백그라운드 웰의 카운트를 시료로부터 감가하였다.

실험 결과

HERV 표면 단백질의 유전자 합성.

전이 벡터 제작에 이용할 HERV 표면 단백질(Env) 유전자는 자체적으로 유전자 합성을 통해 제작 되었으며, 곤충 세포 내에서 효과적으로 발현 할 수 있도록 곤충 유전자 암호에 맞게 유전자를 최적화 시켰다. 이와 같이 합성된 HERV 표면 단백질의 아미노산 서열은 기존 보고된 HERV 표면 단백질의 아미노산 서열을 그대로 유지 하도록 하면서 유전자 서열 일부분만 일부 변경을 하였다. 서열목록 제1서열 및 제2서열은 본 실험에 사용하기 위하여 합성시킨 1617 bp의 HERV 표면 단백질의 유전자 서열과 아미노산 서열이다. 또한 도 2를 통하여 기존의 HERV 표면 단백질의 유전자 서열과 합성시킨 본 발명의 유전자 서열을 비교하였다. 도 2에서 볼 수 있듯이 약 73.5%의 유전자 서열이 상동성을 가졌음을 알 수 있다.

재조합 배큘로바이러스의 제작

재조합 배큘로바이러스를 제조하기 위하여, pAc-hEF1α16L1 및 pAcHERVenv-hEF1α16L1 두 가지의 전이 벡터의 제작을 계획 하였으며 예상되는 배큘로바이러스의 형태를 예상해 보았다(도 1c). 배큘로바이러스 표면의 단백질을 추가하기 위하여 폴리헤드린 프로모터(polyhedrin promoter) 뒤로는 HERV 표면 단백질(Env)의 유전자를 삽입 하였고, HPV 16L1 유전자는 hEF1α에 의해 발현을 조절 받도록 구성 하였다. HERV의 Env는 인간 세포의 수용체 매개 파고사이토시스를 유도한다. 도 1a는 pAc-hEF1α16L1 클로닝 방법을 나타낸 것이고, 도 1b는 pAcHERVenv-hEF1α16L1 클로닝 방법을 간략히 나타낸 것이다. 동일한 방법으로 pAcHERVenv-hEF1α18L1 클로닝을 하였다.

곤충 바이러스 프로모터의 조절을 받게 만든 HERV 표면 단백질의 경우에 곤충 세포에서는 매우 높은 발현 양을 나타내지만 동물 세포에서는 발현이 제대로 일어나지 못하는 특징을 가지게 된다. 이와 반대로 HPV 16L1 단백질의 경우에는 인간 프로모터인 인간 연장인자 1α 프로모터(hEF1α)를 갖기 때문에 동물세포에서는 효율적으로 발현이 활성화 되지만 곤충세포에서는 아예 발현을 못하거나 매우 미세한 발현만이 가능하다. 클로닝된 각각의 플라스미드를 이용하여 재조합 백미드를 만들어 Sf9 세포에 형질 감염시켜 높은 역가의 바이러스를 생산 하였다.

Huh7 로의 HPV 16 L1 유전자의 형질 도입 효율 측정

배큘로바이러스 표면이 변형됨에 따른 HPV 16L1 유전자의 전달 효율을 알아보기 위하여, Ac-hEF1α16L1 및 AcHERVenv-hEF1α16L1 바이러스를 Huh7 세포에 각각 100 MOI로 감염 시켰다. HPV 16L1 mRNA 발현 수준을 먼저 RT-PCR로 확인하였다. 도 3과 같이 전기영동을 통해Ac-hEF1α16L1 및 AcHERVenv-hEF1α16L1을 감염시킨 세포에서 약 275 bp의 HPV 16L1 증폭산물을 확인 할 수 있었다. 그러나 HPV 16L1 유전자의 증폭 정도는 차이가 있었다. 배큘로바이러스 표면에 HERV 표면 단백질을 가진 AcHERVenv-hEF1α16L1 경우 표면을 변형시키지 않은 배큘로바이러스에 비해 HPV 16L1 유전자 증폭 산물의 양이 높았다.

다음은 Ac-hEF1α16L1 및 AcHERVenv-hEF1α16L1 바이러스가 감염된 Huh7 세포에서의 HPV 16L1 발현을 현미경 상으로 확인하기 위하여 면역세포화학 분석을 수행 하였다. 감염 된지 48 시간이 되는 세포들을 가지고 HPV 16L1 단일클론 항체(Camvir-1)와 마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다아제 항체로 염색하여 공초점 레이저 주사 현미경을 통하여 HPV 16L1 단백질의 존재 여부를 확인 하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 바이러스를 감염시키지 않은 Huh7 세포와 비교 하였을 때 HERVenv-hEF1α16L1 및 Ac-hEF1α16L1 바이러스로 감염 시킨 세포에서 전반적으로 형광을 띄는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나, 두 가지 시료에서 HPV 16L1의 발현을 통한 형광 정도의 차이를 확실하게 구별을 할 수 없어서 다음과 같은 추가적인 실험을 하였다.

감염을 통한 HPV 16L1 유전자의 전달 효율을 확실하게 수치화하기 위하여 실시간 PCR에 의한 정량분석(Q-PCR)을 수행하였다. Q-PCR 분석의 정확성은 표준곡선를 지정해 줌으로써 확인 하였다. 실험은 4회 반복을 통해 이루어 졌으며 도 5와 같이, Roter-Gene ver. 6.0을 이용하여 Delta-Delta CT 법으로 상대 정량을 하였다. 하기 표 1에서 볼 수 있듯이, Ac-hEF1α16L1 바이러스를 감염시킨 세포의 카피수를 1로 보았을 때 AcHERVenv-hEF1α16L1 바이러스로 감염 시킨 세포에서의 유전자 카피수가 4.17 배 높은 것을 확인할 수 있었다.

바이러스명	GOI CT	GOI 카운트	Norm.CT	ΔCT	Δ-ΔCT	상대적 농도	보정
AcHERVenv-hEF1α16L1	22.89	2	19.45	3.44	-2.06	4.17	-
AcPERVenv-hEF1α16L1	25.85	2	18.24	7.61	2.11	0.23	-
AchEF1α16L1	23.93	2	18.44	5.5	0	1	Yes

마우스에서의 면역반응

AcHERVenv, AcHERVenv-hEF1α16L1, 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1 10⁷ PFU를 근육내 주사하였으며, 양성 대조군으로서 가다실 투여군, 음성 대조군으로서 AcHERVenv 투여군과 PBS 투여군을 나누어 각 실험군의 면역반응을 비교하였다. ELISA 분석을 수행하여 면역화 마우스 혈청으로부터 HPV16L1-특이 IgG 항체 또는 HPV18L1-특이 IgG 항체를 측정하였다. 면역화 하기 전, AcHERVenv만을 주사한 군, 그리고 PBS만을 주사한 군의 혈청에서는 예상한 대로, 현저히 낮은 수준의 IgG 항체가 관찰되었다. 도 7에서 보는 바와 같이, 첫 번째 면역화 후에는 가다실투여군(Group1) 만이 IgG 항체 반응을 보였고, AcHERVenv-hEF1α16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1 투여군(Group 2)에서는 명확한 IgG 항체 반응을 보이지 않았다. 가다실을 두 번 면역화 하여 얻은 혈청에서는 IgG 항체 반응이 첫 번째 면역화 때 보다 약 2.7배(HPV16) 또는 2배(HPV18) 증가하였으며, 가다실을 세 번째 면역화 하였을 때는 두 번째 보다 1.3배(HPV16) 또는 1.3배(HPV18), 첫 번째 보다 약 3.5배 (HPV16) 또는 2.5배(HPV18) 증가하였다(Group 1). AcHERVenv-hEF1α16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1을 두 번 면역화 하여 얻은 혈청에서는 IgG 항체 반응이 첫 번째 면역화 때 보다 3배(HPV16) 또는 2배(HPV18) 증가하였으며, AcHERVenv-hEF1α16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1을 세 번째 면역화 하였을 때는 두 번째 보다 1.1배(HPV16) 또는 1.1배(HPV18), 첫 번째 보다 약 3.3배(HPV16) 또는 2.4배(HPV18) 증가하였다(Group 2). 따라서 AcHERVenv-hEF1α16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1를 주사한 마우스의 혈청에서의 IgG 항체 반응은 가다실을 주사했을 경우와 비슷함을 알 수 있다. 또한 첫 면역화 후, 9주째와 14주 이후에도 IgG 항체 반응이 관찰된 것으로 보아 면역력이 유지됨을 알 수 있었다.

분비성 IgA 반응은 면역화 마우스의 질 세척액을 이용하여 ELISA를 수행하여 측정하였으며, 가다실을 주사한 실험군뿐만 아니라 AcHERVenv-hEF1α16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1을 주사한 군에서도 IgA 항체가 분비됨을 확인하였다(도 8). 첫번째 면역화에 이어 두 번째 세 번째 면역화 후 IgA 항체 분비가 증가함을 확인하였으며, 첫 면역화 후, 9주째와 14주 이후에도 IgA 항체 반응이 관찰된 것으로 보아 면역력이 지속됨을 알 수 있었다. 따라서 AcHERVenv-hEF1α16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1 면역화가 마우스에서 점막 면역 반응을 유도할 수 있음을 알 수 있다.

마우스 항혈청에 의한 HPV 타입 16, 18 및 BPV PVs 의 중화

항혈청의 중화 활성은 HeLa 세포에서 GFP 발현 플라스미드를 감염성 HPV16 또는 HPV18 PVs의 감염을 억제하는 정도에 의해 결정하였다. 중화항체 타이터는 혈청을 최대 희석하고 (5배수 혈청 희석), 혈청 처리되지 않는 시료와 비교하여 GFP 발현 수준이 50% 또는 90% 감소하는 때의 역수로 표현하였다. 각 실험군의 희석된 혈청의 HPV16 또는 HPV18 PVs에 대한 중화 활성은 도 9와 같다. 도 9는 50% 중화 되었을 때의 중화 타이터이며, 첫 번째 면역화 후 두 번째 및 세 번째 면역화 후의 중화항체 타이터가 모든 실험군에서 높게 나타났다. 세 번째 면역화 후, Group 1과 2에서의 중화항체 타이터는 156,250이었으며, 가다실을 투여한 군과 본 발명에서 개발한 AcHERVenv-hEF1α16L1또는 AcHERVenv-hEF1α18L1을 투여한 군에서의 B 세포 체액성 면역에서는 유의한 차이가 없이 높게 나타남을 알 수 있었다. 또한, 중화 활성 50%를 기준으로 Group 3과 4에서, AcHERVenv-hEF1α16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1 로 프라이밍 한 후, 가다실로 부스팅 하는 경우의 중화 타이터가 234,375에서 312,500으로 높게 나타남을 확인 할 수 있다. 특히, AcHERVenv-hEF1α16L1 로 프라이밍 한 후, 가다실로 2번 부스팅 하는 경우인 Group4 의 중화 타이터가 312,500으로 가장 높게 나타남을 확인 할 수 있다. 이 결과로써, AcHERVenv-hEF1α16L1의 프라이밍이 가다실의 부스팅 효과를 향상 시킬 수 있음을 기대할 수 있다.

세포성 면역 반응 분석

면역화 마우스에서 T 세포 면역 반응을 확인하기 위하여, ELISPOT 분석을 수행 하였다. AcHERVenv-hEFα16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1을 3번 면역한 Group 2의 마우스 비장세포 1 X 10⁶ 개에서 약 500개의 스팟이 생성됨을 관찰하였으며, 가다실 면역한 Group 1 또는 음성대조군에서는 IFN-γ의 분비로 인한 스팟을 관찰할 수 없었다. 가다실, AcHERVenv-hEFα16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1 그리고 PBS를 주사한 마우스 중에서, AcHERVenv-hEF1α16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1으로 면역화 한 마우스에서 강한 HPV16 특이 T 세포 반응(IFN-γ의 분비)이 발생함을 확인하였으며, 가다실로 면역화한 실험군은 전혀 세포성 면역을 일으키지 못하였다(도 10).

결론적으로, AcHERVenv-hEFα16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1 키메라 배큘로바이러스는 동물 생체 내 안전하게 DNA 백신을 효율 있게 전달해줌으로써 체액성 면역에서는 기존 백신 가다실과 거의 동일한 효과를 나타내며, AcHERVenv-hEFα16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1 키메라 배큘로바이러스와 가다실의 병용 백신 접종을 하는 경우에는 가다실 단독보다는 더 높은 중화 항체가를 보였다. 세포성 면역에서는 가다실은 단백질을 주입함으로 예상된 결과처럼 세포성 면역을 일으키지 못하나, AcHERVenv-hEFα16L1 AcHERVenv-hEF1α18L1 키메라 배큘로바이러스는 APC(antigen presentation cell) 내에서 DNA 백신으로 L1 유전자를 발현함으로써 매우 강한 세포성 면역능을 유도하였기에 백신 효능 면에서는 가다실보다 우수한 새로운 안전하고 경제적인 백신이라 할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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도 1a는 본 발명에서 이용된 전이 벡터 pAc-hEF1α16L1의 제작 과정을 대략적으로 나타낸 모식도이다. 도 1a에서, 검은 화살표는 폴리헤드린 프로모터, 백색 화살표는 hEF1α 프로모터, 그리고 작은 검은 사각형은 hEF1α 폴리 A 시그널을 나타낸다.

도 1b는 본 발명에서 이용된 전이 벡터 pAcHERVenv-hEF1α16L1의 제작 과정을 대략적으로 나타낸 모식도이다. 도 1b에서, 검은 화살표는 폴리헤드린 프로모터, 백색 화살표는 hEF1α 프로모터, 그리고 작은 검은 사각형은 hEF1α 폴리 A 시그널을 나타낸다.

도 1c는 제작된 pAc-hEF1α16L1 및 pAcHERVenv-hEF1α16L1을 포함하는 키메라 배큘로바이러스 전이 벡터 및 바이러스의 예상 모식도이다. 도 1c에서, 검은 화살표는 폴리헤드린 프로모터, 백색 화살표는 hEF1α 프로모터, 그리고 작은 검은 사각형은 hEF1α 폴리 A 시그널을 나타낸다.

도 2a-2d는 본 발명에서 합성한 HERV 표면 단백질의 유전자 서열과 기존의 HERV 표면 단백질의 유전자 서열의 상동성을 비교한 도면이다. NM 014590은 HERV 표면 단백질의 유전자의 GenBank 접근번호(accession no.)이다.

도 3은 Ac-hEF1α16L1 및 AcHERVenv-hEF1α16L1을 감염시킨 Huh7 세포에서 HPV 16L1 유전자의 발현 정도를 분석한 RT-PCR 결과 사진이다. "NTC"는 템플레이트를 넣지 않은 대조군을 나타낸다. AcHERVenv-hEF1α16L1은 돼지 내인성 레트로바이러스의 엔벨로프 단백질을 포함하는 것으로서, Huh7 인간세포에 거의 감염되지 않은 것을 확인할 수 있다.

도 4는 Ac-hEF1α16L1 및 AcHERVenv-hEF1α16L1을 감염시킨 Huh7 세포와 정상 Huh7세포에서의 HPV 16L1 발현을 면역세포화학법을 통하여 분석한 사진이다. AcHERVenv-hEF1α16L1은 돼지 내인성 레트로바이러스의 엔벨로프 단백질을 포함하는 것으로서, Huh7 인간세포에 거의 감염되지 않은 것을 확인할 수 있다.

도 5는 Ac-hEF1α16L1 및 AcHERVenv-hEF1α16L1을 감염시킨 Huh7 세포 내에서의 HPV 16L1 mRNA 발현수준을 정량하기 위하여 실시간 PCR에 의한 정량분석을 Delta-Delta CT 법으로 수행한 결과이다. AcHERVenv-hEF1α16L1은 돼지 내인성 레트로바이러스의 엔벨로프 단백질을 포함하는 것으로서, Huh7 인간세포에 거의 감염되지 않은 것을 확인할 수 있다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에서 구축한 벡터의 유전자 지도이다. Polh 프로모터, 폴리헤드린 프로모터; HERVenv, HERV의 엔벨로프 유전자; 그리고, Tn7R 및 Tn7L은 각각 트랜스포존 7의 오른쪽 암 및 왼쪽 암. AcHERVenv-hEF1α16L1의 경우, 목적 유전자의 위치에 HPV의 16L1 유전자가 위치한다.

도 7은 본 발명의 키메라 배큘로바이러스로 면역화한 혈청에서의 IgG 항체 반응을 나타내는 ELISA 분석 결과이다. 시료는 1:100으로 희석, 항-마우스 IgG는 1:2,000으로 희석하여 사용하였다. 각 그룹에서 왼쪽 막대부터 오른쪽으로 각각 1주, 3주, 5주, 9주 및 14주에 해당되는 것이다.

도 8은 본 발명의 키메라 배큘로바이러스로 면역화한 질 세척액에서의 IgA 항체 반응 측정 결과를 나타낸다. 시료는 1:50으로 희석, 항-마우스 IgA는 1:1,000으로 희석하여 사용하였다. y 축은 405 nm에서의 흡광도 값이다. 각 그룹에서 왼쪽 막대부터 오른쪽으로 각각 1주, 3주, 5주, 9주 및 14주에 해당되는 것이다.

도 9는 본 발명의 키메라 배큘로바이러스로 면역화된 마우스의 항혈청에 의한 HPV16 PVs(pseudoviruses)에 대한 중화 반응을 보여준다.

도 10은 세포성 면역반응을 측정하기 위한 ELISPOT 분석 결과이다. 비장세포에 대하여 ELISPOT 분석으로 IFN-γ을 발현하는 지 여부를 조사하였다. CD8⁺ T 세포를 HPV 16 PVs 또는 HPV18 PVs로 자극하였다. (A)는 가다실로 면역화 한 실험군, (B)는 AcHERVenv-hEF1α16L1 또는 AcHERVenv-hEF1α18L1으로 면역화 한 실험군, (C)는 대조군.

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70 75 80 cac gcc aat acc cac tat tgg acc gga aaa atg att aat cct tct tgc 288 His Ala Asn Thr His Tyr Trp Thr Gly Lys Met Ile Asn Pro Ser Cys 85 90 95 cct ggc ggc ctg ggc gtg acc gtg tgc tgg aca tac ttt aca cag acc 336 Pro Gly Gly Leu Gly Val Thr Val Cys Trp Thr Tyr Phe Thr Gln Thr 100 105 110 ggg atg agc gac ggc ggg ggc gtg cag gac cag gcc cgg gaa aag cac 384 Gly Met Ser Asp Gly Gly Gly Val Gln Asp Gln Ala Arg Glu Lys His 115 120 125 gtg aaa gaa gtg atc agc cag ctg aca agg gtg cac gga aca agc tcc 432 Val Lys Glu Val Ile Ser Gln Leu Thr Arg Val His Gly Thr Ser Ser 130 135 140 cct tat aag gga ctg gac ctg tct aag ctg cac gag aca ctg cgg aca 480 Pro Tyr Lys Gly Leu Asp Leu Ser Lys Leu His Glu Thr Leu Arg Thr 145 150 155 160 cac acc agg ctg gtg agc ctg ttc aac aca acc ctg aca ggc ctg cac 528 His Thr Arg Leu Val Ser Leu Phe Asn Thr Thr Leu Thr Gly Leu His 165 170 175 gaa gtg tcc gcc cag aat cct acc aat tgt tgg atc tgc ctg cca ctg 576 Glu Val Ser Ala Gln Asn Pro Thr Asn Cys Trp Ile Cys Leu 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Asn Asp Ile Lys Gly Thr Pro Pro Glu Glu Ile Ser Ala Ala Gln Pro 515 520 525 ctg ctg agg ccc aac tct gcc ggg agc agc tga 1617 Leu Leu Arg Pro Asn Ser Ala Gly Ser Ser 530 535 <210> 2 <211> 538 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Met Ala Leu Pro Tyr His Ile Phe Leu Phe Thr Val Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Phe Thr Leu Thr Ala Pro Pro Pro Cys Arg Cys Met Thr Ser Ser Ser 20 25 30 Pro Tyr Gln Glu Phe Leu Trp Arg Met Gln Arg Pro Gly Asn Ile Asp 35 40 45 Ala Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Ser Lys Gly Thr Pro Thr Phe Thr Ala 50 55 60 His Thr His Met Pro Arg Asn Cys Tyr His Ser Ala Thr Leu Cys Met 65 70 75 80 His Ala Asn Thr His Tyr Trp Thr Gly Lys Met Ile Asn Pro Ser Cys 85 90 95 Pro Gly Gly Leu Gly Val Thr Val Cys Trp Thr Tyr Phe Thr Gln Thr 100 105 110 Gly Met Ser Asp Gly Gly Gly Val Gln Asp Gln Ala Arg Glu Lys His 115 120 125 Val Lys Glu Val Ile Ser Gln Leu Thr Arg Val His Gly Thr Ser Ser 130 135 140 Pro Tyr Lys Gly Leu Asp Leu Ser Lys Leu His Glu Thr Leu Arg Thr 145 150 155 160 His Thr Arg Leu 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Ser Leu Ala Ala Val Val Leu Gln Asn Arg Arg 370 375 380 Ala Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Arg Gly Gly Thr Cys Leu Phe Leu 385 390 395 400 Gly Glu Glu Cys Cys Tyr Tyr Val Asn Gln Ser Gly Ile Val Thr Glu 405 410 415 Lys Val Lys Glu Ile Arg Asp Arg Ile Gln Arg Arg Ala Glu Glu Leu 420 425 430 Arg Asn Thr Gly Pro Trp Gly Leu Leu Ser Gln Trp Met Pro Trp Ile 435 440 445 Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ile Ile Leu Leu Leu Leu Phe 450 455 460 Gly Pro Cys Ile Phe Asn Leu Leu Val Asn Phe Val Ser Ser Arg Ile 465 470 475 480 Glu Ala Val Lys Leu Gln Met Glu Pro Lys Met Gln Ser Lys Thr Lys 485 490 495 Ile Tyr Arg Arg Pro Leu Asp Arg Pro Ala Ser Pro Arg Ser Asp Val 500 505 510 Asn Asp Ile Lys Gly Thr Pro Pro Glu Glu Ile Ser Ala Ala Gln Pro 515 520 525 Leu Leu Arg Pro Asn Ser Ala Gly Ser Ser 530 535

Claims

(a) 인간 내인성 레트로바이러스(Human Endogenous Retrovirus: HERV)의 외래 엔벨로프 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 엔벨로프-코딩 서열에 작동적으로 연결된 제1프로모터; (c) 항원 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (d) 상기 항원-코딩 서열에 작동적으로 연결된 제2프로모터를 포함하는 재조합 배큘로바이러스.
제 1 항에 있어서, 상기 항원은 바이러스 병원체 항원, 박테리아 병원체 항원, 기생충(parasitic) 항원 또는 암 항원인 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스.
제 2 항에 있어서, 상기 항원은 HPV(Human papillomavirus) 항원, HBV(hepatitis B virus) 항원, HCV(hepatitis C virus) 항원, HIV(human immunodeficiency virus) 항원, 로타바이러스 항원, 인플루엔자 바이러스 항원, HSV(herpes simplex virus) 항원, 조류 인플루엔자 바이러스 항원, 돼지 콜레라 바이러스 항원, 구제역 바이러스 항원 및 뉴캐슬바이러스 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스 병원체 항원인 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스.
제 3 항에 있어서, 상기 항원은 HPV 항원인 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스.
제 4 항에 있어서, 상기 항원은 HPV의 L1, L2, E6 또는 E7 단백질인 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스.
제 4 항에 있어서, 상기 HPV의 항원 단백질은 HPV 타입 1, 2, 3a, 4, 5, 6b, 7, 8, 9, 10 , 11a, 12, 13, 16 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 HPV로부터 유래된 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스.
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제 1 항에 있어서, 상기 HERV의 엔벨로프를 코딩하는 서열은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스.
제 1 항에 있어서, 상기 제1프로모터는 곤충 세포에서 작동하는 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스.
제 11 항에 있어서, 상기 곤충 세포에서 작동하는 프로모터는 배큘로바이러스 IE-1 프로모터, IE-2 프로모터, p35 프로모터, p10 프로모터, gp64 프로모터 또는 폴리헤드린 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스.
제 1 항에 있어서, 상기 제2프로모터는 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스.
제 13 항에 있어서, 상기 제2프로모터는 U6 프로모터, H1 프로모터, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 벡시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, 인간 연장인자 1α(hEF1α) 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 AFP 프로모터 또는 알부민 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스.
상기 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
제 15 항에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스는 HPV(Human papillomavirus) 항원 유전자를 포함하며 상기 백신 조성물은 HPV 백신 조성물인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
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