CN110300597A

CN110300597A - 腺病毒多核苷酸和多肽

Info

Publication number: CN110300597A
Application number: CN201780074539.3A
Authority: CN
Inventors: V.安门多拉; S.卡彭; S.科洛卡; A.福戈里; R.梅罗内
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2016-12-09
Filing date: 2017-12-07
Publication date: 2019-10-01
Also published as: BE1025029B1; US11795478B2; JP2020511114A; EP3551224A1; KR20190092471A; EA201991116A1; US11414679B2; IL266942A; US20220275397A1; AU2017371944B2; BE1025029A1; AR110502A1; MX2019006725A; WO2018104911A1; CA3045973A1; US20190300905A1; GB201620968D0; AU2017371944A1; BR112019010906A2

Abstract

本发明涉及从新型黑猩猩腺病毒ChAd157衍生的分离的多核苷酸和多肽序列，以及包含所述多核苷酸和多肽序列的重组多核苷酸、载体、腺病毒、细胞和组合物。

Description

腺病毒多核苷酸和多肽

发明领域

发明背景

由于其在多种靶组织中实现高效基因转移的能力和大转基因容量，腺病毒已经被广泛地用于基因转移应用。常规地，将腺病毒的E1基因缺失并用转基因盒替换，从而产生复制缺陷型重组病毒，所述转基因盒由选择的启动子、目标基因的cDNA序列和聚腺苷酸信号组成。

重组腺病毒可用在基因治疗中，并用作疫苗。基于黑猩猩腺病毒的病毒载体代表了人衍生的腺病毒载体用于开发基因疫苗的用途的替代方案。如通过它们在人起源的细胞中的有效繁殖所证实的，从黑猩猩分离的腺病毒与从人类分离的腺病毒密切相关。但是，由于人和黑猩猩腺病毒是近亲，在两个病毒物种之间的血清学交叉反应性是可能的。

需要这样的载体：其将分子有效地递送至靶标并使群体中针对选定腺病毒血清型的预先存在的免疫的效应最小化。在人类中观察到的预先存在的免疫的一个方面是体液免疫，其可以导致对腺病毒蛋白特异性的抗体的产生和持续。由腺病毒引起的体液应答主要针对3种主要结构衣壳蛋白：纤突、五邻体和六邻体。

发明概述

提供了分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码选自以下的多肽：

(a)具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；和

(b)具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99.8%同一性的氨基酸序列。

还提供了重组多核苷酸，其包含选自以下的多核苷酸：

(a)多核苷酸，其编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；和

(b)多核苷酸，其编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99.8%同一性的氨基酸序列。

还提供了重组载体，其包含选自以下的多核苷酸：

还提供了重组腺病毒，其包含至少一种选自以下的多核苷酸或多肽：

(a)多核苷酸，其编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；

(b)多核苷酸，其编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99.8%同一性的氨基酸序列；

(c)具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；和

(d)具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99.8%同一性的氨基酸序列。

还提供了组合物，其包含以下中的至少一种：

(a)分离的多核苷酸，其编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；

(b)分离的多核苷酸，其编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99.8%同一性的氨基酸序列；

(c)分离的具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；

(d)分离的具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99.8%同一性的氨基酸序列；

(e)载体，其包含如上面(a)或(b)中所述的多核苷酸；和

(f)重组腺病毒，其包含如上面(a)或(b)中所述的多核苷酸，

和药学上可接受的赋形剂。

还提供了细胞，其包含以下中的至少一种：

(a)分离的多核苷酸，其编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，

(c)载体，其包含如上面(a)或(b)中所述的多核苷酸，和

(d)重组腺病毒，其包含如上面(a)或(b)中所述的多核苷酸。

还提供了选自以下的分离的腺病毒多肽：

(a)具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；和

附图描述

图1A-1D-来自所示猿猴腺病毒的纤突蛋白序列的比对。

图2 - 亚组C BAC穿梭物示意图

图3 - 亚组C质粒穿梭物示意图

图4 - pChAd157 ΔE1/TetO hCMV GAG载体示意图

图5 - pARS物种C Ad5orf6-2穿梭物示意图

图6 - 携带ChAd157 RG的质粒示意图

图7 - ChAd157/GAG、ChAd19/GAG和ChAd155/GAG的转基因表达

图8 - 用ChAd155/RG和ChAd157/RG感染的Hela细胞的裂解物的Western印迹分析

图9 - ChAd157/GAG、ChAd155/GAG和ChAd19 GAG在BALB/c小鼠中的免疫效力

图10 - ChAd157/RG和ChAd155/RG在BALB/c小鼠中的免疫效力

图11 - 用不同ChAd载体预免疫小鼠后的中和滴度

图12 - 各种预免疫方案后，用ChAd157/GAG向小鼠接种疫苗后的IFN-γ ELISpot。

序列的描述

SEQ ID NO:1 - ChAd157纤突的多肽序列

SEQ ID NO:2 - 编码ChAd157纤突的多核苷酸序列

SEQ ID NO:3 - ChAd157五邻体的多肽序列

SEQ ID NO:4 - 编码ChAd157五邻体的多核苷酸序列

SEQ ID NO:5 - ChAd157六邻体的多肽序列

SEQ ID NO:6 - 编码ChAd157六邻体的多核苷酸序列

SEQ ID NO:7 - ChAd155纤突的多肽序列

SEQ ID NO:8 - 编码ChAd155纤突的多核苷酸序列

SEQ ID NO:9 - ChAd155五邻体的多肽序列

SEQ ID NO:10 - 编码ChAd155五邻体的多核苷酸序列

SEQ ID NO:11 - ChAd155六邻体的多肽序列

SEQ ID NO:12 - 编码ChAd155六邻体的多核苷酸序列

SEQ ID NO:13 - 编码野生型ChAd155的多核苷酸序列

SEQ ID NO:14 - 亚组C BAC穿梭物(#1365)的多核苷酸序列

SEQ ID NO:15 - pChAd157∆E1 TetO hCMV RpsL-Kana#1551的多核苷酸序列

SEQ ID NO:16 - HIV Gag多核苷酸序列

SEQ ID NO:17 - pChAd157 ΔE1/TetO hCMV GAG#1557的多核苷酸序列

SEQ ID NO:18 - Ad5orf6引物1多核苷酸序列

SEQ ID NO:19 - Ad5orf6引物2多核苷酸序列

SEQ ID NO:20 - 纤突-E4聚A引物1多核苷酸序列

SEQ ID NO:21 - 纤突-E4聚A引物2多核苷酸序列

SEQ ID NO:22 - ChAd157 ΔE1E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana#1594的多核苷酸序列

SEQ ID NO:23 - 狂犬病糖蛋白多核苷酸序列

SEQ ID NO:24 - pChAd157 ΔE1E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RG#1559的多核苷酸序列

SEQ ID NO:25 - CMVfor引物多核苷酸序列

SEQ ID NO:26 - CMVrev引物多核苷酸序列

SEQ ID NO:27 - ChAd3的纤突蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:28 - PanAd3的纤突蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:29 - ChAd17的纤突蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:30 - ChAd19的纤突蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:31 - ChAd24的纤突蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:32 - ChAd11的纤突蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:33 - ChAd20的纤突蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:34 - ChAd31的纤突蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:35 - PanAd1的纤突蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:36 - PanAd2的纤突蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:37 - hCMV(tetO)的多核苷酸序列

SEQ ID NO:38 - 亚组C质粒穿梭物#1376的多核苷酸序列

SEQ ID NO:39 - BGH聚A的多核苷酸序列

SEQ ID NO:40 - pARS物种C Ad5orf6-2的多核苷酸序列

SEQ ID NO:41 - CMVFAM-TAMRA探针的多核苷酸序列

SEQ ID NO:42 - 编码增强的hCMV启动子的多核苷酸序列。

发明详述

本发明的载体、组合物和方法可具有一种或多种优于现有技术的以下改进特征，包括但不限于更高的生产力、提高的免疫原性、增加的转基因表达或独特的血清学交叉反应性概况。

本发明的载体、组合物和方法可以证明特征诸如生产力、免疫原性、转基因表达和/或血清学交叉反应性的组合，这意味着它们提供的是已知方法的有价值的替代方案。

腺病毒

腺病毒具有含二十面体衣壳的特征形态，所述二十面体衣壳包含三种主要蛋白：六邻体(II)、五邻体基质(III)和多节纤突(IV)、以及许多其他次要蛋白VI、VIII、IX、IIIa和IVa2。该病毒基因组是直链双链DNA。该病毒DNA与高碱性蛋白VII和小肽pX (以前称作mu)密切结合。另一种蛋白V与该DNA-蛋白复合物一起包装，并通过蛋白VI提供与衣壳的结构连接。该病毒也含有病毒编码的蛋白酶，所述蛋白酶是加工一些结构蛋白以产生成熟的传染性病毒所必需的。

腺病毒基因组被充分地表征。就类似地定位(例如每种病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4和L5基因的位置)的特定开放读码框而言，在腺病毒基因组的整体组构中存在普遍保守性。腺病毒基因组的每个末端包含被称作反向末端重复(ITR)的序列，其是病毒复制所必需的。该病毒也包含病毒编码的蛋白酶，其是产生传染性病毒粒子所需的一些结构蛋白的加工所必需的。基于在宿主细胞转导以后表达病毒基因的次序，描述了腺病毒基因组的结构。更具体地，根据在DNA复制开始之前或之后是否发生转录，将所述病毒基因称作早期(E)或晚期(L)基因。在转导的早期阶段，表达腺病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4基因以制备用于病毒复制的宿主细胞。在感染的晚期阶段，编码病毒颗粒的结构组分的晚期基因L1-L5的表达被活化。

腺病毒是物种特异性的，且已经从多个哺乳动物物种分离出不同的血清型(即，不会被抗体交叉中和的病毒类型)。例如，已经从人类分离超过50个血清型，它们基于序列同源性和基于它们的凝集红血细胞的能力而分成6个亚组(A-F；B细分成B1和B2) (Tatsis和Ertl Molecular Therapy (2004) 10:616-629)。已经从非人猿猴诸如黑猩猩、倭黑猩猩、恒河猴和大猩猩分离出众多腺病毒，且基于以六邻体或纤突序列为基础的系统发生关系，将它们归类进相同人类组中(Colloca等人 (2012) Science Translational Medicine 4:1-9; Roy等人 (2004) Virology 324: 361-372; Roy等人(2010) Journal of Gene Medicine 13:17-25)。

WO2005071093公开了黑猩猩腺病毒，其包括ChAd19。WO2016198621 (PCT/EP2016/063329)公开了黑猩猩腺病毒ChAd155，其出于定义ChAd155衍生的载体的目的通过引用并入本文。

包括纤突蛋白的腺病毒衣壳蛋白和编码这些蛋白的多核苷酸

如上所述，所述腺病毒衣壳包含三种主要蛋白：六邻体、五邻体和纤突。所述六邻体占衣壳的结构组分的大部分，所述衣壳由240个三聚的六邻体壳粒和12个五邻体基质组成。所述六邻体具有三个保守双桶(barrel)，而顶部具有三个塔(tower)，每个塔含有来自每个亚基的环，所述亚基形成衣壳的大部分。六邻体的基质在腺病毒血清型之间是高度保守的，而表面环是可变的(Tatsis和Ertl Molecular Therapy (2004) 10:616-629)。

五邻体是另一种腺病毒衣壳蛋白，其形成纤突所连接的五聚体基质。三聚的纤突蛋白从在衣壳的12个顶点中的每一个处的五邻体基质伸出且是有节的杆状结构。腺病毒衣壳的表面相对于大多数其他二十面体病毒的表面的显著差异是细长的纤突蛋白的存在。所述纤突蛋白的主要作用是通过它与细胞受体的相互作用而将病毒衣壳与细胞表面拴系。

许多腺病毒血清型的纤突蛋白共享共同的构造：N-端尾巴，由重复序列制成的中心轴，和C-端球形结结构域(或“头”)。所述中心轴结构域由可变数目的β-重复组成。所述β-重复连接以形成高度刚性且稳定的三个相互缠绕的螺旋链的长形结构。所述轴将N-端尾巴与球形结结构连接，所述球形结结构负责与靶细胞受体的相互作用。腺病毒结结构域的球形性质呈现大表面用于在侧面和在顶点结合所述受体。该构造的作用是使受体结合位点突出远离病毒衣壳，从而使该病毒脱离由相对扁平的衣壳表面呈现的空间约束。

尽管许多腺病毒血清型的纤突具有相同的整体构造，但它们具有影响它们的功能以及结构的可变氨基酸序列。例如，在纤突结的表面上的许多暴露区域呈现可容易地适应的受体结合位点。所述纤突结的球形形状允许受体结合在所述结的侧面处或所述纤突结的顶部上。这些结合位点通常位于表面暴露的环上，所述环连接在人腺病毒之间不太保守的β-链。这些环上的暴露侧链给予所述结多种表面特征，同时保留三级和四级结构。例如，在结表面处的静电势和电荷分布可以由于纤突结序列中的等电点的宽范围(从对于Ad 8、Ad19和Ad 37而言大约9至对于亚组B腺病毒而言大约5的pI)而变化。作为在结构上复杂的病毒配体，所述纤突蛋白允许来自病毒衣壳的呈许多取向和距离(轴)的多种结合表面(结)的呈现。

一些血清型之间最明显的变化之一是纤突长度。研究已经证实，纤突轴的长度强烈地影响所述结和所述病毒与它的靶受体的相互作用。此外，血清型之间的纤突蛋白还可以在它们的弯曲能力方面存在差异。尽管所述轴中的β-重复形成高度稳定的且规则的结构，但是电子显微术(EM)研究已经显示所述纤突中的不同铰链。来自几种腺病毒血清型纤突的蛋白序列的分析准确地定位在来自N-端尾巴的第三个β-重复处的所述轴的重复序列中的破坏，其与所述轴中的铰链之一强相关，如通过EM看到的。所述纤突中的铰链允许所述结采取相对于该病毒衣壳的多种取向，这可以防止受体接合的位阻，所述受体接合需要所述结上的受体结合位点的正确呈现。例如，亚组D Ad的刚性纤突因此需要柔性受体或为病毒连接预先设置的一个受体，因为它们本身不能弯曲(Nicklin等人Molecular Therapy2005 12:384-393)。

通过使用纤突假型化(pseudotyping)技术已经实现了对不同Ad血清型的特异性细胞受体的鉴别和它们如何促进组织嗜性的知识。尽管一些亚组的Ad使用CAR作为第一受体，越来越清楚的是，许多Ad使用替代性第一受体，从而导致非常不同的体外和体内嗜性。这些血清型的纤突表现出它们的一级结构和三级结构的明显差异，诸如纤突轴刚度，纤突轴长度，和CAR结合位点和/或推定的HSPG结合基序的缺乏，以及在纤突结内的净电荷的差异。因此，用替代性纤突轴和结将Ad 5颗粒假型化，提供除去重要细胞结合结构域的机会，且另外，可以允许与用Ad 5实现的结果相比，更有效的(和潜在地更细胞选择性的)向确定细胞类型的转基因递送。如果使用的纤突是来自在人类或实验模型中具有较低血清阳性率的Ad (有利于载体的成功施用的情形)，也可以减少纤突假型化的Ad颗粒的中和(Nicklin等人Molecular Therapy (2005) 12:384-393)。此外，全长纤突以及分离的纤突结区域能够(但是单独的六邻体或五邻体不能)诱导树突细胞成熟且与有效CD8+ T细胞应答的诱导有关(Molinier-Frenkel等人. J. Biol. Chem. (2003)278:37175-37182)。总之，腺病毒纤突在腺病毒载体的至少受体结合和免疫原性中起重要作用。

图1中提供的比对阐明了C组猿猴腺病毒的纤突蛋白之间的差异。一个突出特征是，这些腺病毒的纤突序列可以宽泛地分组成具有短纤突(诸如ChAd157)或长纤突(诸如ChAd155)。该长度差别是由于与长纤突相比在短纤突中大约位置321处的36个氨基酸缺失。另外，存在许多氨基酸取代，它们在短纤突亚组相对于长纤突亚组之间不同，但是在每个亚组内是一致的。尽管尚未阐明这些差异的确切功能，鉴于纤突的功能和免疫原性，它们可能是显著的。已经证实，病毒嗜性的决定簇之一是纤突轴的长度。已经证实，具有较短轴的Ad5载体具有与CAR受体的较低结合效率和较低感染性(Ambriović-Ristov A.等人.:Virology.(2003) 312(2):425-33)：已经推测，该损害是较短纤突的刚度增加的结果，从而导致与细胞受体的更低效率的连接(Wu, E等人.: J Virol. (2003) 77(13): 7225-7235)。

在本发明的一个方面，提供了分离的黑猩猩腺病毒ChAd157的纤突多肽和分离的编码黑猩猩腺病毒ChAd157的纤突多肽的多核苷酸。

预期纤突蛋白促成低血清阳性率，且因此可以与来自ChAd157的六邻体和五邻体多肽独立地或(与六邻体和五邻体中的一者或两者)组合地用于抑制腺病毒对既存中和抗体的亲和力，例如以制备具有降低的血清阳性率的重组腺病毒。这样的重组腺病毒可以是具有衣壳蛋白的嵌合腺病毒，所述衣壳蛋白来自至少具有来自ChAd157的纤突蛋白的不同血清型。

ChAd157纤突多肽序列提供在SEQ ID NO:1中。

ChAd157五邻体多肽序列提供在SEQ ID NO:3中。

ChAd157六邻体多肽序列提供在SEQ ID NO:5中。

包含ChAd157纤突的多肽序列或其功能衍生物的多肽、重组腺病毒、组合物或细胞

合适地，本发明的分离的多肽、重组腺病毒、组合物或细胞包含具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。

本发明的多肽、重组腺病毒、组合物或细胞可以包含这样的多肽：其为具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99.8%同一性的氨基酸序列。

或者，所述功能衍生物与SEQ ID NO:1相比具有不多于一个添加、缺失或取代，诸如与SEQ ID NO:1相比具有一个取代。

合适地，根据本发明的多肽、重组腺病毒、组合物或细胞还包含：

(a)具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；或

(b)具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少60%同一性的氨基酸序列，

和/或

(a)具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或

(b)具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少60%同一性的氨基酸序列。

合适地，具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70%同一性、诸如至少80%、特别是至少90%、例如至少95%或至少98%同一性的氨基酸序列。

合适地，具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70%同一性、诸如至少80%、特别是至少90%、例如至少95%或至少98%同一性的氨基酸序列。

具体而言，根据本发明的多肽、重组腺病毒、组合物或细胞还包含：

(a)具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；

和/或

(b)具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。

包含编码ChAd157纤突或其功能衍生物的多核苷酸的分离的多核苷酸、载体、重组腺病毒、组合物或细胞

合适地，本发明的分离的多核苷酸、载体、重组腺病毒、组合物或细胞包含编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。合适地，所述多核苷酸具有根据SEQ IDNO:2的序列。

当本发明的分离的多核苷酸、载体、重组腺病毒、组合物或细胞包含编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物的多核苷酸(其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99.8%同一性的氨基酸序列)时，合适地，所述多核苷酸具有根据SEQ ID NO:2的序列，其中已添加、缺失或改变一个密码子以编码不同的氨基酸。

合适地，本发明的多核苷酸、载体、重组腺病毒、组合物或细胞还包含编码以下的多核苷酸：

(a)具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；或

和/或

(a)具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或

具体而言，本发明的多核苷酸、载体、重组腺病毒、组合物或细胞还包含编码以下的多核苷酸：

(a)具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；

和/或

(b)具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。

本发明的多核苷酸、载体、重组腺病毒、组合物或细胞可进一步包含：

(a)根据SEQ ID NO:4的多核苷酸；

和/或

(b)根据SEQ ID NO:6的多核苷酸。

ChAd157主链

本发明提供了黑猩猩腺病毒ChAd157的分离的多核苷酸序列，包括野生型未修饰的ChAd157的分离的多核苷酸序列和ChAd157的经修饰的主链构建体。这些经修饰的主链构建体包括本文例举的那些，诸如pChAd157∆E1 TetO hCMV RpsL-Kana#1551 (SEQ ID NO:15)和ChAd157 ΔE1E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana#1594 (SEQ ID NO:22)。ChAd157主链可以用于构建重组复制型或复制缺陷型的腺病毒例如用于递送转基因。

下面提供了pChAd157 ΔE1/TetO hCMV GAG (SEQ ID NO:17)序列的注解。

注释ChAd157DE1_TetOhCMV_GAG

IX 3187..3651

IVa2 互补物 (3710..5045,5325..5337)

Pol 互补物(4816..8397, 13762..13770)

VA RNAI 10230..10391

pTP 互补物(8196..10199,13762..13770)

48K 10652..11914

pIIIa 11938..13714

III 13807..15588

pVII 15603..16199

V 16275..17390

pX 17415..17660

pVI 17750..18508

六邻体 18623..21499

蛋白酶 21529..22158

DBP 互补物(22274..23926)

92K 23976..26447

22K 26164..26739

33K 接合(26164..26473,26679..27061)

E2e启动子互补物(27027..27274)

pVIII 27136..27819

E3 12K 27820..28137

E3 CR1-αp0 28635..28835

E3 gp18K 28838..29329

E3A 11K 30776..31072

E3 RIDα 31084..31356

E3 RIDβ 31359..31757

E3 15K 31750..32136

U外显子互补物(32167..32331)

纤突 32342..33973

E4 ORF6/7 互补物(34181..34456,35168..35341)

E4 ORF6 互补物(34457..35341)

E4 ORF4 互补物(35241..35606)

E4 ORF3 互补物(35622..35969)

E4 ORF2 互补物(35966..36358)

E4 ORF1 互补物(36411..36797)。

在一个实施方案中，提供了SEQ ID NO:15、22的序列的片段及其互补链，与其互补的cDNA和RNA。合适地，片段长度为至少15个核苷酸，更合适地长度为30个核苷酸，更合适地长度为60个核苷酸，更合适地长度为120个核苷酸，更合适地长度为240个、更合适地480个核苷酸并且涵盖功能片段，即生物学上感兴趣的片段。例如，功能片段可以表达期望的腺病毒产物或可用于生产重组病毒载体。这样的片段包括上面列出的基因序列。在某些实施方案中，提供了SEQ ID NO:15、22的分离的序列及其互补链，与其互补的cDNA和RNA。

提供了由腺病毒核酸编码的ChAd157腺病毒的基因产物，诸如蛋白、酶及其片段，及其上述片段，如本文所述。这样的蛋白包括由上文鉴定的开放阅读框编码的蛋白和由序列表中提供的多核苷酸编码的蛋白。

另外的ChAd157多核苷酸和多肽

在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包含编码本发明的纤突多肽；六邻体多肽和纤突多肽；五邻体多肽和纤突多肽；或六邻体多肽、五邻体多肽和纤突多肽的多核苷酸；且可以进一步包含另外的腺病毒多核苷酸，合适地ChAd157多核苷酸。因此，根据本发明的多核苷酸合适地包含以下中的一种或多种：

(a)腺病毒5'-反向末端重复(ITR)；

(b)腺病毒E1A区域或其选自E1A_280R和E1A_243R区域的片段；

(c)腺病毒E1B或IX区域或其选自E1B_19K、E1B_55K和IX区域的片段；

(d)腺病毒E2B区域或其选自E2B_pTP、E2B_聚合酶和E2B_IVa2区域的片段；

(e)腺病毒L1区域或其片段，所述片段编码选自L1_13.6K、L1_52K和L1_pIIIa蛋白的腺病毒蛋白；

(f)腺病毒L2区域或包含编码本发明的五邻体蛋白的多核苷酸的L2区域或其片段，所述片段编码选自L2_五邻体蛋白、L2_pVII蛋白、L2_V蛋白和L2_pX蛋白的腺病毒蛋白；

(g)腺病毒L3区域或包含编码本发明的六邻体蛋白的多核苷酸的L3区域或其片段，所述片段编码选自L3_pVI蛋白、L3_六邻体蛋白和L3_蛋白酶蛋白的腺病毒蛋白；

(h)腺病毒E2A区域；

(i)腺病毒L4区域或其片段，所述片段编码选自L4_100k蛋白、L4_33K蛋白、L4_22K蛋白和蛋白L4_VIII的腺病毒蛋白；

(j)腺病毒E3区域或其选自以下的片段：

E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8和E3 ORF9；

(k)腺病毒L5区域或包含编码本发明的L5_纤突纤突多肽的多核苷酸的L5区域

(l)腺病毒(诸如Ad5) E4区域或其选自E4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2和E4 ORF1的片段；特别是所述E4区域的ORF6；

(m)腺病毒3'-ITR；和/或

(n)腺病毒VAI或VAII RNA区域，优选地来自除了ChAd157以外的腺病毒、更优选地来自Ad5的腺病毒VAI或VAII RNA区域。

定义

本发明的多核苷酸或多肽合适地是分离的。“分离的”多核苷酸是从它的原始环境取出的多核苷酸。例如，如果它与天然系统中的一些或全部共存物质分离，那么天然存在的多核苷酸是分离的。例如，如果将它克隆进不是它的天然环境的部分的载体中或如果将它包含在cDNA内，则认为多核苷酸是分离的。

本发明的多核苷酸合适地是重组的。重组意味着，所述多核苷酸是克隆、限制或连接步骤或其他程序中的至少一个的产物，所述其他程序产生不同于在自然界中发现的多核苷酸的多核苷酸。重组腺病毒是包含重组多核苷酸的腺病毒。重组载体是包含重组多核苷酸的载体。‘重组病毒’包括原始重组病毒的后代。‘重组载体’包括原始重组载体的复制品。‘重组多核苷酸’包括原始重组多核苷酸的复制品。

本发明的多肽序列合适地含有相对于天然序列的至少一个改变。本发明的多核苷酸序列合适地含有相对于天然序列的至少一个改变。例如，通过基因工程技术引入质粒或载体中的源自不同种(且经常不同属、亚科或科)的多核苷酸是异源多核苷酸。从它的天然编码序列取出并可操作地连接到没有天然地发现与其连接的编码序列的启动子是异源启动子。已经克隆进病毒的基因组或病毒载体中的特定重组位点(其中所述病毒的基因组不天然地含有它)是异源重组位点。异源核酸序列也包括在腺病毒基因组中天然地存在、但是位于腺病毒载体内的非天然位置处的序列。

通常，“异源”是指源自与进行对比的其他实体在遗传型上不同的实体。异源核酸序列是指并非分离自、源自或基于腺病毒载体的天然存在的核酸序列的任何核酸序列。异源蛋白序列是指不从腺病毒载体的天然存在的蛋白序列分离、衍生或基于其的任何蛋白序列。“天然存在的”是指在自然界中发现的且不是合成地制备或修饰的序列。当一个序列分离自一个来源、但是经过合适地修饰(例如，通过缺失、取代(突变)、插入或其他修饰)从而不破坏来源基因的正常功能时，所述序列“源自”所述来源。

多肽的“功能衍生物”合适地是指多肽的经修饰形式，例如其中所述多肽的一个或多个氨基酸可以被缺失、插入、修饰和/或取代。例如，在以下情况下，认为未修饰的腺病毒衣壳蛋白的衍生物是有功能的：

(a) 与包含未修饰的衣壳蛋白的腺病毒相比，在其衣壳内包含衍生衣壳蛋白的腺病毒保持基本上相同或更低的血清阳性率，和/或

(b) 与包含未修饰的衣壳蛋白的腺病毒相比，在其衣壳内包含衍生衣壳蛋白的腺病毒保持基本上相同或更高的宿主细胞感染性，和/或

(c) 与包含未修饰的衣壳蛋白的腺病毒相比，在其衣壳内包含衍生衣壳蛋白的腺病毒保持基本上相同或更高的免疫原性，和/或

(d) 与包含未修饰的衣壳蛋白的腺病毒相比，在其衣壳内包含衍生衣壳蛋白的腺病毒保持基本上相同或更高的转基因生产力水平。

使用在下面实施例部分中描述的方法可以合适地测量上面的性质(a) -(d)。

合适地，所述多肽、载体或重组腺病毒在人群体中具有低血清阳性率。“低血清阳性率”可以是指具有与人腺病毒5 (Ad5)相比降低的预先存在的中和抗体水平。类似地或可选地，“低血清阳性率”可以是指小于约20%血清阳性率、小于约15%血清阳性率、小于约10%血清阳性率、小于约5%血清阳性率、小于约4%血清阳性率、小于约3%血清阳性率、小于约2%血清阳性率、小于约1%血清阳性率或无可检测的血清阳性率。使用在Aste-Amézaga等人,Hum.Gene Ther.(2004) 15(3):293-304中描述的方法，可以将血清阳性率测量为具有临床上有关的中和滴度(定义为>200的50%中和滴度)的个体的百分比。

术语多肽、肽和蛋白在本文中可互换地使用。

术语“猿猴”通常意在包括非人灵长类动物，例如旧世界猴、新世界猴、猿类和长臂猿。具体地，猿猴可以是指非人猿类诸如黑猩猩(Pan troglodyte)、倭黑猩猩(Pan paniscus)和大猩猩(Gorilla属)。非猿猿猴可以包括恒河猴(Macaca mulatta)。

序列对比

为了对比两个密切相关的多核苷酸或多肽序列的目的，使用比对程序诸如BLAST®(可在blast.ncbi.nlm.nih.gov得到，最后一次登录在2015年3月09日)使用标准设置可以计算第一序列和第二序列之间的“%同一性”。%同一性是相同残基的数目除以参照序列中的残基的数目，再乘以100。在上面和在权利要求中提及的%同一性数字是通过该方法计算的百分比。%同一性的一个替代定义是相同残基的数目除以比对的残基的数目，再乘以100。替代方法包括使用缺口方法，其中在评分参数的缺口评分或缺口成本中考虑在比对中的缺口，例如在一个序列中相对于其他序列的缺失。关于更多信息, 参见可在ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/factsheets/HowTo_BLASTGuide.pdf得到的BLAST®事实表，最后一次登录在2015年3月09日。

保留多核苷酸或由其编码的多肽的功能性的序列可能是更密切相同的。如果多肽或多核苷酸序列在它们的整个长度上具有100%序列同一性，就说所述多肽或多核苷酸序列与其他多肽或多核苷酸序列是相同的或同一的。

序列之间的“差异”是指与第一序列相比，在第二序列的位置中的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代。两个多肽序列可以含有1个、2个或更多个这样的氨基酸差异。在否则与第一序列相同(100%序列同一性)的第二序列中的插入、缺失或取代会导致降低的序列同一性百分比。例如，如果相同序列是9个氨基酸残基长，第二序列中的一个取代导致88.9%的序列同一性。如果相同序列是17个氨基酸残基长，第二序列中的两个取代导致88.2%的序列同一性。如果相同序列是7个氨基酸残基长，第二序列中的三个取代导致57.1%的序列同一性。如果第一和第二多肽序列是9个氨基酸残基长且具有6个相同残基，所述第一和第二多肽序列具有大于66%同一性(所述第一和第二多肽序列具有66.7%同一性)。如果第一和第二多肽序列是17个氨基酸残基长且具有16个相同残基，所述第一和第二多肽序列具有大于94%同一性(所述第一和第二多肽序列具有94.1%同一性)。如果第一和第二多肽序列是7个氨基酸残基长且具有3个相同残基，所述第一和第二多肽序列具有大于42%同一性(所述第一和第二多肽序列具有42.9%同一性)。

或者，为了将第一参照多肽序列与第二对比多肽序列进行对比的目的，可以确定为了产生第二序列向第一序列做出的添加、取代和/或缺失的数目。添加是将一个氨基酸残基添加到第一多肽的序列中(包括添加在第一多肽的任一个末端处)。取代是用一个不同的氨基酸残基取代第一多肽的序列中的一个氨基酸残基。缺失是从第一多肽的序列缺失一个氨基酸残基(包括在第一多肽的任一个末端处的缺失)。

为了将第一参照多核苷酸序列与第二对比多核苷酸序列进行对比的目的，可以确定为了产生第二序列向第一序列做出的添加、取代和/或缺失的数目。添加是将一个核苷酸残基添加到第一多核苷酸的序列中(包括添加在第一多核苷酸的任一个末端处)。取代是用一个不同的核苷酸残基取代第一多核苷酸的序列中的一个核苷酸残基。缺失是从第一多核苷酸的序列缺失一个核苷酸残基(包括在第一多核苷酸的任一个末端处的缺失)。

合适地，本发明的序列中的取代可以是保守取代。保守取代包含将一个氨基酸用另一个氨基酸取代，所述另一个氨基酸具有与被取代的氨基酸类似的化学性质(参见，例如，Stryer等人, Biochemistry, 第5版2002, 第44-49页)。优选地，保守取代是选自以下的取代：(i)用另一个不同的碱性氨基酸对碱性氨基酸的取代；(ii)用另一个不同的酸性氨基酸对酸性氨基酸的取代；(iii)用另一个不同的芳族氨基酸对芳族氨基酸的取代；(iv)用另一个不同的非极性脂族氨基酸对非极性脂族氨基酸的取代；和(v)用另一个不同的极性的不带电荷的氨基酸对极性的不带电荷的氨基酸的取代。碱性氨基酸优选地选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸优选地是天冬氨酸或谷氨酸。芳族氨基酸优选地选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。非极性脂族氨基酸优选地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸。极性的、不带电荷的氨基酸优选地选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。与保守的氨基酸取代不同，非保守的氨基酸取代是用没有落入上述保守取代(i)至(v)下面的任何氨基酸对一个氨基酸的交换。

载体和重组腺病毒

本发明的ChAd157序列可用作治疗剂和用于构建多种载体系统、重组腺病毒和宿主细胞。合适地，术语“载体”是指与野生型序列相比已经实质上改变(例如，已经缺失和/或灭活的基因或功能区域)和/或掺入了异源序列的核酸，即，得自不同来源(也称为“插入物”)且在引入细胞(例如，宿主细胞)中时复制和/或表达插入的多核苷酸序列的核酸。例如，所述插入物可以是本文描述的ChAd157序列的全部或部分。另外或可选地，ChAd157载体可以是包含病毒基因的一个或多个缺失或灭活的ChAd157腺病毒，诸如E1或本文描述的其他病毒基因或功能区域。这样的ChAd157(其可以包含或可以不包含异源序列)经常被称作“主链”，且可以原样使用或作为对载体的另外修饰的起始点使用。

载体可以是任意合适的核酸分子，包括裸露DNA、质粒、病毒、粘粒、噬菌体载体诸如λ载体、人工染色体诸如BAC (细菌人工染色体)或附加体。或者，载体可以是用于无细胞体外转录或表达的转录和/或表达单元，诸如T7-相容的系统。所述载体可以单独使用，或与其他腺病毒序列或片段联合使用，或与来自非腺病毒序列的元件联合使用。ChAd157序列也可用在反义递送载体、基因治疗载体或疫苗载体中。因此，还提供了含有ChAd157序列的基因递送载体和宿主细胞。

术语“复制型的”腺病毒是指在没有宿主细胞所包含的任何重组辅助蛋白存在下可以在所述宿主细胞中复制的腺病毒。合适地，“复制型的”腺病毒包含下述完整的或功能性的必需早期基因：E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4。从特定动物分离的野生型腺病毒将在该动物中是复制型的。

术语“复制缺陷型的”或“复制缺陷的”腺病毒是指不能复制的腺病毒，因为它已经被工程改造成至少包含功能缺失(或“功能缺失”突变)，即在不将基因完全除去的情况下损害该基因的功能的缺失或突变，例如人工终止密码子的引入，活性位点或相互作用结构域的缺失或突变，基因的调节序列的突变或缺失等，或编码病毒复制所必需的基因产物的基因的完全除去，诸如选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4 (诸如E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2和/或E4 ORF1)的腺病毒基因中的一个或多个。特别合适地E1和任选地E3和/或E4是缺失的。如果缺失的话，当确定相对于另一个序列的%同一性时，合适地将在比对中不考虑前述缺失的基因区域。

本发明提供了载体诸如重组腺病毒，其将蛋白(合适地异源蛋白)递送给细胞，用于治疗或疫苗目的。载体可以包括任何遗传元件，包括裸露DNA、噬菌体、转座子、粘粒、附加体、质粒或病毒。这样的载体含有本文中公开的ChAd157的DNA和微基因。“微基因”(或“表达盒”)是指选择的异源基因(转基因)和驱动宿主细胞中的基因产物的翻译、转录和/或表达所必需的其他调节元件的组合。

通常，设计ChAd157-衍生的腺病毒载体，使得所述微基因位于这样的核酸分子中：所述核酸分子在选择的腺病毒基因的天然区域中含有其他腺病毒序列。如果需要的话，可以将微基因插入现存的基因区域中以破坏该区域的功能。或者，可以将微基因插入部分地或完全地缺失的腺病毒基因的位点。例如，所述微基因可以位于使选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基因组区域的至少一个基因无功能的突变、插入或缺失的位点。术语“使……无功能”是指，将足够量的基因区域除去或以其他方式破坏，使得所述基因区域不再能够产生基因表达的功能产物。如果需要的话，可以将整个基因区域除去(和合适地用微基因替换)。

例如，对于可用于制备重组病毒的生产载体，所述载体可以含有微基因和腺病毒基因组的5' 末端或腺病毒基因组的3' 末端或腺病毒基因组的5' 和3' 末端二者。腺病毒基因组的5' 末端含有包装和复制所必需的5' 顺式元件；即，5' ITR序列(其作为复制起点起作用)和天然5' 包装增强子结构域(其含有包装直链Ad基因组和E1启动子的增强子元件所必需的序列)。腺病毒基因组的3'末端包括包装和衣壳化所必需的3' 顺式元件(包括ITR)。合适地，重组腺病毒含有5'和3'腺病毒顺式元件，且所述微基因(合适地含有转基因)位于5' 和3' 腺病毒序列之间。基于ChAd157的腺病毒载体还可以含有另外的腺病毒序列。

合适地，基于ChAd157的载体含有从本发明的腺病毒ChAd157基因组衍生的一个或多个腺病毒元件。在一个实施方案中，所述载体含有来自ChAd157的腺病毒ITR和来自相同腺病毒血清型的另外腺病毒序列。在另一个实施方案中，所述载体含有从不同于提供ITR的腺病毒血清型的腺病毒血清型衍生的腺病毒序列。

如本文所定义，假型腺病毒是指这样的腺病毒：其中腺病毒的衣壳蛋白来自不同于提供ITR的腺病毒的腺病毒。

此外，使用本领域技术人员已知的技术(例如，US 7,291,498)使用本文描述的腺病毒可以构建嵌合的或杂合的腺病毒。

存在于本发明的载体中的ITR和任何其他腺病毒序列可以得自许多来源。多种腺病毒毒株可得自美国典型培养物保藏中心, Manassas, Virginia，或通过请求从多种商业和机构来源得到。此外，许多这样的毒株的序列可得自多种数据库，包括例如，PubMed和GenBank。从其他黑猩猩或从人腺病毒制备的同源腺病毒载体描述在公开的文献(例如，US5,240,846)中。许多腺病毒类型的DNA序列可得自GenBank，包括Ad5型(GenBank登录号M73370)。所述腺病毒序列可以得自任何已知的腺病毒血清型，诸如血清型2、3、4、7、12和40，且进一步包括本发明鉴别的人类型中的任一种。类似地，已知会感染非人动物(例如，猿猴)的腺病毒也可以用在本发明的载体构建体中(例如，US 6,083,716)。在本文描述的载体的构建中采用的病毒序列、辅助病毒(如果需要的话)和重组病毒颗粒和其他载体组分和序列可以如下所述得到。

序列、载体和腺病毒生产

通过任意合适的方式，包括重组生产、化学合成或其他合成方式，可以生产本发明的序列。合适的生产技术是本领域技术人员众所周知的。或者，还可以通过众所周知的固相肽合成方法合成肽。

腺病毒质粒(或其他载体)可以用于生产腺病毒载体。在一个实施方案中，所述腺病毒载体是复制缺陷型的腺病毒颗粒。在一个实施方案中，通过E1A和/或E1B基因(特别是E1A和E1B)的缺失，使所述腺病毒颗粒为复制缺陷型。或者，通过另一种方式使所述腺病毒为复制缺陷型，任选地同时保留E1A和/或E1B基因。类似地，在一些实施方案中，通过E2B和/或DNA聚合酶基因的缺失，可以完成对载体的免疫应答的减小。腺病毒载体还可以含有对腺病毒基因组的其他突变，例如，在其他基因中的温度敏感的突变或缺失。在其他实施方案中，合乎需要的是，保留腺病毒载体中的完整E1A和/或E1B区域。这样的完整E1区域可以位于它在腺病毒基因组中的天然位置，或放在天然腺病毒基因组中的缺失位点(例如，在E3区域中)。

在用于将基因递送至哺乳动物(诸如人)细胞的腺病毒载体的构建中，可以在所述载体中采用多种经修饰的腺病毒核酸序列。例如，可以从形成重组病毒的部分的腺病毒序列中消除腺病毒延迟早期基因E3的全部或部分。认为E3的功能与重组病毒颗粒的功能和生产无关。也可以构建具有至少E4基因的ORF6区域的缺失的腺病毒载体，且更理想地因为该区域(整个E4区域)的功能的冗余。本发明的另一种载体含有延迟早期基因E2A中的缺失。也可以在腺病毒基因组的晚期基因L1至L5中的任一种中造成缺失。类似地，中间基因IX和IVa2中的缺失可以用于一些目的。可以在其他结构或非结构腺病毒基因中造成其他缺失。上面讨论的缺失可以单个地使用，即，用于如本文中所述的用途的腺病毒序列可以含有在仅单个区域中的缺失。或者，可以以任意组合使用有效地破坏它们的生物活性的整个基因或其部分的缺失。例如，在一种示例性的载体中，所述腺病毒序列可以具有E1基因和E4基因的缺失，或E1、E2A和E3基因的缺失，或E1和E3基因的缺失，或E1、E2A和E4基因的缺失，具有或没有E3的缺失，诸如此类。任意一个或多个E基因可以合适地用源自不同腺病毒毒株的E基因(或一个或多个E基因开放读码框)替代。特别合适地，将ChAd157 E1和E3基因缺失，并将ChAd157E4基因用E4Ad5orf6替代。如以上所讨论的，这样的缺失和/或取代可以与其他突变(诸如温度敏感的突变)联合使用以实现期望的结果。

在所缺失的腺病毒颗粒的病毒感染性和繁殖所需的腺病毒基因产物的存在下，可以培养缺乏一个或多个必需腺病毒序列(例如，E1A、E1B、E2A、E2B、E4 ORF6、L1、L2、L3、L4和L5)的腺病毒载体。这些辅助功能可以通过在一种或多种辅助构建体(例如，质粒或病毒)或包装宿主细胞存在下培养腺病毒载体来提供。

复制缺陷型的载体的互补

为了产生在上述的任何基因中缺失的重组腺病毒，被缺失的基因区域的功能(如果是该病毒的复制和感染性所必需的)必须由辅助病毒或细胞系(即，互补或包装细胞系)提供给重组病毒。

辅助病毒

取决于用于携带微基因的病毒载体的腺病毒基因内容物，辅助腺病毒或非复制病毒片段可以用于提供产生含有微基因的传染性重组病毒颗粒所必需的足够腺病毒基因序列。有用的辅助病毒含有不存在于腺病毒载体构建体中和/或不由在其中转染载体的包装细胞系表达的选定腺病毒基因序列。在一个实施方案中，所述辅助病毒是复制缺陷的，且合适地除了本文描述的一个或多个序列以外还含有腺病毒基因。这样的辅助病毒合适地与表达E1的(且任选地另外表达E3的)细胞系联合使用。

辅助病毒可以任选地含有报道基因。许多这样的报道基因是本领域已知的以及如本文所述。存在不同于腺病毒载体上的转基因的辅助病毒上的报道基因允许独立地监测腺病毒载体和辅助病毒。该报道物用于实现纯化后得到的重组病毒和辅助病毒之间的分离。

互补细胞系

在许多情况下，表达该病毒的复制和感染性所必需的一个或多个缺失基因(诸如人E1)的细胞系可以用于反式互补(transcomplement)黑猩猩腺病毒载体。这是特别有利的，因为，由于本发明的黑猩猩腺病毒序列和在目前可得到的包装细胞中发现的人腺病毒序列之间的多样性，当前的含有人E1的细胞的使用会阻止在复制和生产过程中生产复制型的腺病毒。

或者，如果需要的话，人们可以利用本文中提供的序列来产生包装细胞或细胞系，其至少在选定的亲本细胞系中用于表达的启动子的转录控制下表达来自ChAd157或来自另一腺病毒(诸如人腺病毒，例如，hAd5 E1，或另一ChAd E1)的E1基因。诱导型或组成型启动子可以用于此目的。这样的启动子的实例详细描述在该文件的别处。选择亲本细胞用于制备表达任何期望的ChAd157基因的新细胞系。非限制性地，这样的母代细胞系可以是HeLa[ATCC登记号CCL 2]、A549 [ATCC登记号CCL 185]、HEK 293、KB [CCL 17]、Detroit [例如，Detroit 510、CCL 72]和WI-38 [CCL 75]细胞，以及其他。这些细胞系都可得自美国典型培养物保藏中心, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209。

这样的表达E1的细胞系可用于生成重组腺病毒E1缺失的载体。另外或可选地，使用与在重组病毒载体的生成中所用的程序基本上相同的程序，可以构造表达一种或多种腺病毒基因产物(例如，E1A、E1B、E2A、E3和/或E4)的细胞系。这样的细胞系可以用于反式互补(transcomplement)编码那些产物的必需基因缺失的腺病毒载体，或提供辅助依赖性病毒(例如，腺伴随病毒)的包装所必需的辅助功能。宿主细胞的制备涉及技术诸如选择的DNA序列的组装。

在另一个替代方案中，必需的腺病毒基因产物由腺病毒载体和/或辅助病毒以反式提供。在这样的一个实例中，合适的宿主细胞可以选自任何生物学生物体，包括原核(例如，细菌)细胞和真核细胞，包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。

宿主细胞可以选自任何哺乳动物物种，包括但不限于，细胞诸如A549、WEHI、3T3、10ΊΊ/2、HEK 293细胞或Per.C6 (它们二者表达功能性的腺病毒E1)[Fallaux, FJ等人,(1998), Hum Gene Ther, 9:1909-1917]、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、HepG2和源自哺乳动物(包括人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠)的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。

一种特别合适的互补细胞系是Procell 92细胞系。Procell 92细胞系是基于表达腺病毒E1基因(在人磷酸甘油酸激酶-1 (PGK)启动子的控制下用Tet阻遏物转染)和G418-抗性基因的HEK 293细胞(Vitelli等人. PLOS One (2013) 8(e55435):1-9)。Procell92.S适合于在混悬条件中生长，且可用于生产表达毒性蛋白的腺病毒载体(www.okairos.com/e/inners.phpm=00084, 最后一次登录在2015年4月13日)。

病毒颗粒的组装和细胞系的转染

通常，当通过转染递送包含微基因的载体时，以约5 μg至约100 μg DNA且优选约10至约50 μg DNA的量将载体递送给约1 x 10⁴个细胞至约1 x 10¹³个细胞且优选约10⁵个细胞。但是，考虑到诸如选择的载体、递送方法和选择的宿主细胞等因素，可以调整载体DNA与宿主细胞的相对量。

通过本领域已知的任意方式，包括转染和感染，可以实现载体在宿主细胞中的引入。一个或多个腺病毒基因可以稳定地整合进宿主细胞的基因组中，作为附加体稳定地表达，或短暂地表达。所述基因产物可以都短暂地表达、在附加体上或稳定地整合，或者一些基因产物可以稳定地表达，而其他基因产物短暂地表达。

使用技术人员已知的技术，也可以完成载体向宿主细胞中的引入。合适地，使用标准的转染技术，例如，CaPC转染或电穿孔。

腺病毒的选定DNA序列(以及转基因和其他载体元件)向不同中间质粒中的组装和所述质粒和载体用于生产重组病毒颗粒的应用都使用常规技术实现。这样的技术包括cDNA的常规克隆技术，腺病毒基因组的重叠寡核苷酸序列的应用，聚合酶链式反应，和提供期望的核苷酸序列的任何合适方法。采用标准的转染和共转染技术，例如，CaPC沉淀技术。采用的其他常规方法包括病毒基因组的同源重组、琼脂覆层中的病毒的噬斑、测量信号产生的方法等。

例如，在构建和组装期望的含有微基因的病毒载体以后，将载体在有辅助病毒存在下在体外转染进包装细胞系中。在辅助物和载体序列之间发生同源重组，这允许所述载体中的腺病毒-转基因序列复制和包装进病毒粒子衣壳中，从而产生重组病毒载体颗粒。得到的重组腺病毒可用于将选择的转基因转移至选择的细胞。在使用在包装细胞系中生长的重组病毒的体内实验中，本发明的E1缺失的重组腺病毒载体在将转基因转移至非猿猴哺乳动物(优选人)细胞中表现出效用。

转基因

所述转基因是编码目标蛋白的核酸序列，其与侧接所述转基因的载体序列异源。核酸编码序列以允许宿主细胞中的转基因转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接到调节组分。

转基因序列的组成将取决于得到的载体的预期用途。例如，所述转基因可以是治疗性转基因或免疫原性转基因。或者，转基因序列可以包括报告序列，其在表达时产生可检测信号。这样的报告序列包括但不限于，编码以下的DNA序列：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、萤光素酶、膜结合蛋白(包括例如，CD2、CD4、CD8、流感血凝素蛋白和本领域众所周知的其他蛋白(存在针对它们的高亲和力抗体或可以通过常规方式生产它们))和包含合适地与抗原标签结构域(尤其来自血凝素或Myc)融合的膜结合蛋白的融合蛋白。这些编码序列当与驱动它们的表达的调节元件结合时会提供可通过常规方式检测的信号，包括酶测定、放射摄影测定、比色测量测定、荧光测定或其他光谱测定、荧光活化细胞分选测定和免疫学测定，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学。

在一个实施方案中，所述转基因是编码在生物学和医学中有用的产物(诸如治疗性转基因或免疫原性转基因诸如蛋白、RNA、酶或催化RNA)的非标记物序列。合乎需要的RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化RNA和反义RNA。一种有用的RNA序列的一个实例是消灭治疗的动物中的靶向核酸序列的表达的序列。

所述转基因可以用于治疗，例如遗传缺陷，作为癌症治疗剂或疫苗，用于诱导免疫应答，和/或用于预防性疫苗目的。如本文中使用的免疫应答的诱导是指蛋白诱导针对所述蛋白的T细胞和/或体液免疫应答的能力。

术语预防意指预先提供药物，这可以在暴露于病原体之前(暴露前预防)或在发展疾病症状之前(暴露后预防)。术语治疗和疗法在本文中可互换使用，并且意指在疾病期间施用药物。

术语疾病意指主体中的结构或功能的障碍，尤其是产生特定症状或影响特定部位并且不仅仅是身体伤害的直接结果的障碍。

调节元件

除了转基因以外，所述载体还包括以特定方式与所述转基因可操作地连接的常规控制元件，所述方式允许所述转基因在用质粒载体转染或用通过本发明生产的病毒感染的细胞中的转录、翻译和/或表达。本文中使用的“可操作地连接的”序列包括与目标基因邻接的表达控制序列和以反式或在一定距离处起作用以控制目标基因的表达控制序列。

表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号诸如剪接和聚腺苷酸化(聚腺苷酸)信号，包括兔β-珠蛋白聚腺苷酸；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和当期望时，增强编码的产物的分泌的序列。在其他序列中，可以使用嵌合的内含子。

在一些实施方案中，可以将土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE) (Zuffrey等人(1999) J Virol; 73(4):2886-9)可操作地连接至转基因。在SEQ ID NO:26中提供了一种示例性的WPRE。

“启动子”是允许RNA聚合酶的结合并指导基因的转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5'非编码区，在所述基因的转录起始位点的近侧。在转录的起始中起作用的启动子内的序列元件经常特征在于共有核苷酸序列。启动子的实例包括但不限于来自细菌、酵母、植物、病毒和哺乳动物(包括人类)的启动子。大量表达控制序列(包括内部的、天然的、组成性的、可诱导的和/或组织特异性的启动子)是本领域已知的且可以利用。

组成型启动子的实例包括但不限于，TBG启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒LTR启动子(任选地与增强子一起)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地与CMV增强子一起，参见，例如，Boshart等人, Cell, 41:521-530 (1985))、CASI启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1a启动子(Invitrogen)。

在一些实施方案中，所述启动子是CASI启动子(参见，例如，WO2012/115980)。所述CASI启动子是含有CMV增强子的部分、鸡β-肌动蛋白启动子的部分和UBC增强子的部分的合成启动子。在一些实施方案中，所述CASI启动子可以包括与SEQ ID NO:12具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或更多序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述启动子包含SEQ ID NO:12的核酸序列或由其组成。

诱导型启动子允许基因表达的调节，且可以通过外源地提供的化合物、环境因素诸如温度或特定生理学状态(例如，急性期)的存在、细胞的特定分化状态或仅在复制中的细胞中被调节。诱导型启动子和可诱导的系统可得自多种商业来源，包括但不限于，Invitrogen、Clontech和Ariad。许多其他系统已经被描述，且可以由本领域技术人员容易地选择。例如，诱导型启动子包括锌-可诱导的绵羊金属硫蛋白(MT)启动子和地塞米松(Dex)-可诱导的小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子。其他可诱导的系统包括T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996))，四环素可抑制的系统(Gossen等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:5547-5551 (1992))，四环素-可诱导的系统(Gossen等人, Science, 378:1766-1769(1995)，也参见Harvey等人, Curr. Opin. Chem. Biol, 2:512-518 (1998))。其他系统包括FK506二聚体、VP16或p65(使用甘珀二醇(castradiol)、联苯酚米勒甾酮(diphenolmurislerone))、RU486-可诱导的系统(Wang等人, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)和Wang等人, Gene Ther., 4:432-441 (1997))和雷帕霉素-可诱导的系统(Magari等人, J.Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997))。一些诱导型启动子的有效性随时间增加。在这样的情况下，可以通过插入多个串联阻遏物(例如，通过IRES与TetR连接的TetR)增强这样的系统的有效性。

在一些实施方案中，所述启动子是增强的hCMV启动子，诸如SEQ ID NO:42中提供的。

在另一个实施方案中，将使用转基因的天然启动子。当期望转基因的表达应当模仿天然表达时，所述天然启动子可以是优选的。当转基因的表达必须在时间上或在发育上调节或以组织特异性的方式调节或响应于特定转录刺激而调节时，可以使用所述天然启动子。在另一个实施方案中，其他天然表达控制元件(诸如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列)也可以用于模仿天然表达。

可以将转基因可操作地连接至组织特异性的启动子。例如，如果在骨骼肌中的表达是期望的，那么应当使用在肌肉中有活性的启动子。这些包括来自编码骨骼β-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、肌养蛋白、肌肉肌酸激酶的基因的启动子，以及具有高于天然存在的启动子的活性的合成肌肉启动子(参见Li等人, Nat. Biotech., 17:241-245 (1999))。组织特异性的启动子的实例已知针对肝的(白蛋白, Miyatake等人, J. Virol, 71:5124-32(1997)；乙型肝炎病毒核心启动子, Sandig等人, Gene Ther., 3:1002-9 (1996)；甲胎蛋白(AFP), Arbuthnot等人, Hum.Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)), 骨骨钙素(Stein等人, Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997))；骨唾液蛋白(Chen等人, J.BoneMiner.Res., 11:654-64 (1996))、淋巴细胞(CD2, Hansal等人, J. Immunol, 161:1063-8 (1998)；免疫球蛋白重链；T细胞受体链)，针对神经元的诸如神经元特异性的烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen等人, Cell. Mol. Neurobiol, 13:503-15 (1993))、神经丝轻链基因(Piccioli等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991))和神经元特异性的vgf基因(Piccioli等人, Neuron, 15:373-84 (1995))，以及其他。

任选地，携带编码治疗上有用的或免疫原性的产物的转基因的载体还可以包括选择标记物或报道基因，它们可以包括编码遗传霉素、潮霉素或嘌呤霉素抗性的序列，以及其他。这样的选择报告物或标记物基因(优选地位于要包装进病毒颗粒中的病毒基因组外面)可以用于发出质粒在细菌细胞中的存在的信号，诸如氨苄青霉素抗性。所述载体的其他组分可以包括复制起点。

使用本文中提供的技术和序列，结合本领域技术人员已知的技术，生成这些载体。这样的技术包括cDNA的常规克隆技术(诸如在教科书中描述的那些)、腺病毒基因组的重叠寡核苷酸序列的应用、聚合酶链式反应、和提供期望的核苷酸序列的任何合适方法。

治疗和预防

重组的基于ChAd157的载体可用于在体外、离体和在体内向人或非猿猴哺乳动物的基因转移。

本文描述的重组腺病毒载体可以用作表达载体用于生产由异源转基因在体外编码的产物。例如，可以将含有转基因的重组的复制缺陷型的腺病毒转染进如上所述的互补细胞系中。

ChAd157-衍生的重组腺病毒载体提供了一种有效的基因转移媒介物，其可以在体内或离体将选定的转基因递送至选定的宿主细胞，即使在生物体具有针对一种或多种腺病毒血清型的中和抗体的情况下。在一个实施方案中，将所述载体和所述细胞离体混合；使用常规方法培养受感染的细胞；和将转导的细胞重新输入患者中。这些技术特别适合为了治疗目的和为了免疫(包括诱导保护性免疫)的基因递送。

免疫原性的转基因

还可以将重组ChAd157载体在免疫原性组合物中施用。如本文中所述的免疫原性组合物是包含一种或多种重组ChAd157载体的组合物，所述重组ChAd157载体能够在递送给哺乳动物(合适地人)以后诱导针对由所述载体递送的转基因产物的免疫应答，例如体液(例如，抗体)和/或细胞介导的(例如，细胞毒性的T细胞)应答。重组腺病毒可以包含(合适地在它的基因缺失中的任一个中)编码期望的免疫原的基因，且因此可以用在疫苗中。重组腺病毒可以用作针对任何病原体(已经为其鉴别出对于免疫应答的诱导而言关键性的抗原且能够限制病原体的传播且可得到其cDNA)的预防性或治疗性疫苗。

术语免疫原意指能够引发免疫应答的多肽。合适地，所述免疫原是包含至少一个B或T细胞表位的抗原。引发的免疫应答可以是抗原特异性B细胞应答，其产生中和抗体。引发的免疫应答可以是抗原特异性T细胞应答，其可以是全身性应答和/或局部应答。抗原特异性T细胞应答可以包含CD4+ T细胞应答，诸如涉及表达多种细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL2)的CD4+ T细胞的应答。可选地或额外地，所述抗原特异性T细胞应答包含CD8+ T细胞应答，诸如涉及表达多种细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL2)的CD8+ T细胞的应答。

因此，术语免疫意指施用免疫原(或适合于上下文的编码所述免疫原的多核苷酸)，以引发免疫应答。

可以将这样的疫苗或其他免疫原性组合物配制在合适的递送媒介物中。通常，免疫原性组合物的剂量是在下面在‘递送方法和剂量’下定义的范围内。可以监测选择的基因的免疫水平以确定对加强的需要(如果有的话)。在评估血清中的抗体滴度以后，任选的加强免疫接种可以是期望的。

任选地，可以将本发明的疫苗或免疫原性组合物配制成含有其他组分，包括例如，佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。在下面在‘佐剂’下提供了合适的佐剂的实例。这样的佐剂可以与编码抗原的引发DNA疫苗一起施用，以与用单独编码抗原的DNA疫苗引发后产生的免疫应答相比增强抗原特异性的免疫应答。或者，这样的佐剂可以与多肽抗原一起施用，所述多肽抗原在涉及本发明的ChAd157载体的施用方案中施用(如在下面在‘施用方案’下所述)。

以免疫原性的量(也就是说，在施用途径中有效地转染期望的靶细胞并提供选择的基因的足够表达水平以诱导免疫应答的重组腺病毒的量)施用重组腺病毒。在提供保护性免疫的情况下，认为重组腺病毒是可用于预防感染和/或复发性疾病的疫苗组合物。

预期本文描述的重组载体将非常有效的诱导细胞裂解性T细胞和针对由所述载体编码的插入的异种抗原蛋白的抗体。

由本发明载体表达的免疫原可用于针对其他病原体免疫人或非人动物，或者来自癌细胞或肿瘤细胞，所述其他病原体包括，例如，感染人和非人脊椎动物的细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生物。例如，免疫原可以选自多种病毒科。病毒科(针对它的免疫应答将是期望的)的实例包括狂犬病毒属诸如狂犬病毒、呼吸道病毒诸如呼吸道合胞体病毒(RSV)和其他副粘病毒诸如人变性肺病毒、hMPV和副流感病毒(PIV)。

可用作免疫原以免疫人或非人动物的合适的狂犬病抗原可选自狂犬病病毒糖蛋白(G)、RNA聚合酶(L)、基质蛋白(M)、核蛋白(N)和磷蛋白(P)。术语“G蛋白”或“糖蛋白”或“G蛋白多肽”或“糖蛋白多肽”是指具有狂犬病糖蛋白多肽的氨基酸序列的全部或部分的多肽或蛋白。术语“L蛋白”或“RNA聚合酶蛋白”或“L蛋白多肽”或“RNA聚合酶蛋白多肽”是指具有狂犬病RNA聚合酶蛋白多肽的氨基酸序列的全部或部分的多肽或蛋白。术语“M蛋白”或“基质蛋白”或“M蛋白多肽”或“基质蛋白多肽”是指具有狂犬病基质蛋白多肽的氨基酸序列的全部或部分的多肽或蛋白。术语“N蛋白”或“核蛋白”或“N蛋白多肽”或“核蛋白多肽”是指具有狂犬病核蛋白多肽的氨基酸序列的全部或部分的多肽或蛋白。术语“P蛋白”或“磷蛋白”或“P蛋白多肽”或“磷蛋白多肽”是指具有狂犬病磷蛋白多肽的氨基酸序列的全部或部分的多肽或蛋白。

可用作免疫原以免疫人或非人动物的RSV的合适的抗原可以选自融合蛋白(F)、附着蛋白(G)、基质蛋白(M2)和核蛋白(N)。术语“F蛋白”或“融合蛋白”或“F蛋白多肽”或“融合蛋白多肽”是指具有RSV融合蛋白多肽的氨基酸序列的全部或部分的多肽或蛋白。类似地，术语“G蛋白”或“G蛋白多肽”是指具有RSV附着蛋白多肽的氨基酸序列的全部或部分的多肽或蛋白。术语“M蛋白”或“基质蛋白”或“M蛋白多肽”是指具有RSV基质蛋白的氨基酸序列的全部或部分的多肽或蛋白，且可以包括M2-1 (其可以在本文中书写为M2.1)和M2-2基因产物中的任一种或两种。同样地，术语“N蛋白”或“核衣壳蛋白”或“N蛋白多肽”是指具有RSV核蛋白的氨基酸序列的全部或部分的多肽或蛋白。

主要基于G糖蛋白的抗原性的差异，已经描述了两组人RSV毒株，即A和B组。迄今为止已经分离了众多RSV毒株，其中任一种在本文中公开的免疫原性组合的抗原的背景下是合适的。由GenBank和/或EMBL登录号指示的示例性毒株可以参见美国公开的申请号2010/0203071 (WO2008114149)，其通过引用并入本文，用于公开适合用在本发明中的RSV F和G蛋白的核酸和多肽序列的目的。在一个实施方案中，所述RSV F蛋白可以是RSV F蛋白(FΔTM)的胞外结构域。

示例性的M和N蛋白核酸和蛋白序列可以参见，例如，美国公开的申请号2014/0141042 (WO2012/089833)，其并入本文中，用于公开适合用在本发明中的RSV M和N蛋白的核酸和多肽序列的目的。

合适地，为了用在本发明中，核酸编码RSV F抗原和RSV M和N抗原。更具体地，所述核酸编码RSV FΔTM抗原和RSV M2-1和N抗原，其中在RSV FΔTM抗原和RSV M2-1之间包括自切割位点，且在RSV M2-1和N抗原之间包括柔性接头。在一个实施方案中，合适的核酸编码由SEQ ID NO:37表示的多肽。

在一个实施方案中，所述免疫原可以来自逆转录病毒，例如慢病毒诸如人免疫缺陷病毒(HIV)。在这样的一个实施方案中，免疫原可以源自HIV-1或HIV-2。

HIV基因组编码许多不同的蛋白，其中每一种当由本发明的载体表达时可以以其整体或作为片段是免疫原性的。包膜蛋白包括例如gp120、gp41和Env前体gp160。HIV的非包膜蛋白包括例如内部结构蛋白诸如gag和pol基因的产物和其他非结构蛋白诸如Rev、Nef、Vif和Tat。在一个实施方案中，本发明的载体编码一种或多种包含HIV Gag的多肽。

Gag基因被翻译为前体多蛋白，其被蛋白酶切割以产生包括基质蛋白(p17)、衣壳(p24)、核衣壳(p9)、p6和两种间隔肽p2和p1(它们都是Gag的片段的实例)的产物。

Gag基因产生55-千道尔顿(kD) Gag前体蛋白(也称为p55)，其从未剪接的病毒mRNA表达。在翻译过程中，p55的N末端被十八烷基化，从而引发它与细胞膜的细胞质方面的结合。膜结合的Gag多蛋白与其他病毒蛋白和细胞蛋白一起募集病毒基因组RNA的两个拷贝，这会引发病毒颗粒从被感染的细胞的表面芽殖。芽殖以后，在病毒成熟为四种较小蛋白(命名为MA (基质[p17])、CA (衣壳[p24])、NC (核衣壳[p9])和p6，它们都是Gag的片段的实例)的过程中，p55被病毒编码的蛋白酶(pol基因的产物)切割。在一个实施方案中，本发明的载体包含SEQ ID NO:16的Gag多肽。

佐剂

本文中使用的“佐剂”是指增强对免疫原的免疫应答的组合物。这样的佐剂的实例包括但不限于：无机佐剂(例如无机金属盐诸如磷酸铝或氢氧化铝)、有机佐剂(例如皂苷，诸如QS21或角鲨烯)、基于油的佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、细胞因子(例如IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和INF-γ)、微粒佐剂(例如免疫刺激性复合物(ISCOMS)、脂质体或可生物降解的微球)、病毒体、细菌佐剂(例如单磷酰脂质A，诸如3-脱-O-酰化单磷酰脂质A (3D-MPL)或胞壁酰基肽)、合成的佐剂(例如非离子的嵌段共聚物、胞壁酰基肽类似物或合成的脂质A)、合成的多核苷酸佐剂(例如聚精氨酸或聚赖氨酸)和含有未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性寡核苷酸。

一种合适的佐剂是单磷酰脂质A (MPL)，尤其是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A (3D-MPL)。在化学上，它经常作为具有4、5或6个酰化链的3-脱-O-酰化的单磷酰脂质A的混合物供应。它可以通过在GB 2122204B中教导的方法纯化和制备，该参考文献也公开了二磷酰基脂质A及其3-O-去酰化变体的制备。已经描述了其他纯化的和合成的脂多糖(美国专利号6,005,099和EP 0 729 473 B1; Hilgers等人, 1986, Int.Arch.Allergy.Immunol., 79(4):392-6; Hilgers等人, 1987, Immunology, 60(1):141-6；和EP 0 549 074 B1l)。

皂苷也是合适的佐剂(参见Lacaille-Dubois, M和Wagner H, A review of thebiological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine第2卷第363-386页(1996))。例如，皂苷Quil A (源自南美洲皂树Molina的树皮)及其级分描述在美国专利号5,057,540和Kensil, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12:1-55；和EP 0 362 279 B1中。Quil A的纯化级分也被称作免疫刺激剂，诸如QS21和QS17；它们的生产方法公开在美国专利号5,057,540和EP 0 362 279 B1中。在这些参考文献中也描述了QS7 (Quil-A的非溶血级分)。QS21的应用进一步描述在Kensil等人(1991,J.Immunology, 146: 431-437)中。QS21和聚山梨酯或环糊精的组合也是已知的(WO 99/10008)。包含QuilA的级分(诸如QS21和QS7)的微粒佐剂系统描述在WO 96/33739和WO 96/11711中。

另一种佐剂是含有未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性的寡核苷酸(Krieg, Nature 374:546 (1995))。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序的缩写。当通过全身和粘膜途径施用时，CpG被称作佐剂(WO 96/02555, EP 468520, Davis等人, J.Immunol, 1998, 160:870-876; McCluskie和Davis, J.Immunol., 1998, 161:4463-6)。当配制在疫苗中时，CpG可以与游离抗原一起在游离溶液中施用(WO 96/02555)，或共价地缀合至抗原上(WO 98/16247)，或与载体诸如氢氧化铝一起配制(Brazolot-Millan等人, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998, 95:15553-8)。

佐剂诸如上述的那些可以与载体诸如脂质体、水包油乳剂和/或金属盐(包括铝盐诸如氢氧化铝)一起配制。例如，可以将3D-MPL与氢氧化铝(EP 0 689 454)或水包油乳剂(WO 95/17210)一起配制；可以将QS21与含有胆固醇的脂质体(WO 96/33739)、水包油乳剂(WO 95/17210)或明矾(WO 98/15287)一起配制；可以将CpG与明矾一起(Brazolot-Millan,出处同上)或与其他阳离子载体一起配制。

可以在本发明中利用佐剂的组合，尤其是单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合(参见，例如，WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO99/11241)，更特别是在WO 94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或其中将QS21在含有胆固醇的脂质体(DQ)中淬灭的组合物(如在WO 96/33739中公开的)。或者，CpG +皂苷(诸如QS21)的组合是适合用在本发明中的佐剂。涉及在水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚的有效佐剂制剂描述在WO 95/17210中，且是用于用在本发明中的另一种制剂。可以将皂苷佐剂配制在脂质体中，并与免疫刺激性的寡核苷酸组合。因此，合适的佐剂系统包括，例如，单磷酰脂质A(优选3D-MPL)与铝盐一起的组合(例如如在WO00/23105中所述)。另一种示例性的佐剂包含QS21和/或MPL和/或CpG。可以将QS21在含有胆固醇的脂质体中淬灭，如在WO96/33739中公开的。

其他合适的佐剂包括烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯(AGP)诸如在WO9850399或美国专利号6,303,347中公开的那些(也公开了AGP的制备方法)，或在美国专利号6,764,840中公开的AGP的药学上可接受的盐。一些AGP是TLR4激动剂，且一些是TLR4拮抗剂。认为两者作为佐剂都是有用的。

已经发现(WO 2007/062656，其公开为US 2011/0293704且通过引用并入，用于公开不变链序列的目的)，如果将它与腺病毒一起施用，不变链与用于疫苗接种的表达系统所包含的抗原的融合会增加针对所述抗原的免疫应答。因此，在本发明的一个实施方案中，所述免疫原性的转基因可以与重组ChAd157病毒载体中的不变链一起共表达。

在另一个实施方案中，本发明提供了通过将ChAd157衣壳递送给主体将ChAd157的衣壳(任选地使用完整或重组病毒颗粒或空衣壳)用于诱导免疫调节效应应答或增强或辅助对另一种活性剂的细胞毒性T细胞应答的用途。可以将ChAd157衣壳单独递送，或在组合方案中与活性剂一起递送以增强对所述活性剂的免疫应答。有利地，在不用腺病毒感染宿主的情况下，可以实现期望的效应。

施用方案

通常，ChAd157重组腺病毒载体将用于递送治疗性的或免疫原性的分子(诸如蛋白)。对于两种应用将容易理解，本发明的重组腺病毒载体特别适合用在涉及重组腺病毒载体的重复递送的方案中。这样的方案通常包括递送一系列病毒载体，其中病毒衣壳是可替换的。可以为每个后续施用改变病毒衣壳，或在特定血清型衣壳的预先选定的施用次数(例如1、2、3、4或更多次)以后改变病毒衣壳。因此，方案可能涉及用具有第一衣壳的重组腺病毒递送，用具有第二衣壳的重组腺病毒递送，和用具有第三衣壳的重组腺病毒递送。使用单独的、彼此组合的或与其他腺病毒组合的(它们优选地是免疫学上非交叉反应性的)本发明的腺病毒衣壳的多种其他方案将是本领域技术人员显而易见的。任选地，这样的方案可能包括将重组腺病毒与其他非人灵长类动物腺病毒、人腺病毒的衣壳或人工序列(诸如本文描述的那些)一起施用。

本发明的腺病毒载体特别适合用于这样的治疗方案：其中多种腺病毒介导的转基因递送是期望的，例如，在涉及相同转基因的重新递送的方案中或在涉及其他转基因的递送的组合方案中。这样的方案可能涉及施用ChAd157腺病毒载体，随后重新施用来自相同血清型腺病毒的载体。特别合乎需要的方案涉及施用ChAd157腺病毒载体，其中在第一次施用中递送的载体的腺病毒衣壳序列的来源不同于在一次或多次后续施用中利用的病毒载体的腺病毒衣壳序列的来源。例如，治疗方案涉及施用ChAd157载体和重复施用相同或不同血清型的一种或多种腺病毒载体。

在另一个实例中，治疗方案涉及施用腺病毒载体，随后重复施用ChAd157载体(其衣壳不同于首先递送的腺病毒载体中的衣壳的来源)，并任选地进一步施用另一种载体(其与先前施用步骤中的载体的腺病毒衣壳的来源相同，或优选地不同)。这些方案不限于使用ChAd157序列构建的腺病毒载体的递送。相反，这些方案可以容易地利用与ChAd157载体组合的其他腺病毒序列，包括但不限于，包括其他非人灵长类动物腺病毒序列或人腺病毒序列在内的其他腺病毒序列。

在另一个实例中，治疗方案可以涉及同时(诸如共同施用)或相继(诸如引发-加强)递送(i)一种或多种ChAd157腺病毒载体和(ii)另一种组分诸如非腺病毒载体、非病毒载体和/或多种其他治疗上有用的化合物或分子诸如抗原蛋白，任选地与佐剂同时施用。共同施用的实例包括同侧的共同施用和对侧的共同施用(在下面在‘递送方法和剂量’下进一步描述)。

用于与一种或多种ChAd157腺病毒载体同时或特别是相继递送(诸如引发-加强)的合适非腺病毒载体包括一种或多种痘病毒载体。合适地，所述痘病毒载体属于脊椎动物痘病毒亚科，更合适地属于所述亚科中选自正痘、副痘、亚塔痘、禽痘(合适地金丝雀痘(ALVAC)或鸡痘(FPV))和软疣痘的属。甚至更合适地，所述痘病毒载体属于正痘，且选自牛痘病毒、NYVAC (源自牛痘的哥本哈根毒株)、经修饰的牛痘Ankara (MVA)、牛痘病毒和猴痘病毒。最合适地，所述痘病毒载体是MVA。

“同时”施用合适地是指相同的进行中的免疫应答。优选地，同时施用两种组分(诸如同时施用DNA和蛋白)，但是，可以在几分钟内(例如，在同一次医学预约或医生就诊)、在几小时内施用一种组分。这样的施用也被称作共同施用。在一些实施方案中，共同施用可以是指腺病毒载体、佐剂和蛋白组分的施用。在其他实施方案中，共同施用是指一种腺病毒载体和另一种病毒载体(例如第二种腺病毒载体或痘病毒诸如MVA)的施用。在其他实施方案中，共同施用是指一种腺病毒载体和一种蛋白组分(其任选地佐剂化)的施用。

可以使用引发-加强方案。引发-加强是指两种单独的免疫应答：(i)首次引发免疫系统，随后(ii)在已经建立初次免疫应答以后若干周或若干月第二次或加强免疫系统。

这样的方案可能涉及施用重组ChAd157载体以引发针对传统抗原诸如蛋白(任选地与佐剂一起共同施用)或携带编码这样的抗原的序列的重组病毒(例如，WO 00/11140)的第二次加强施用的免疫系统。或者，免疫接种方案可以涉及施用重组ChAd157载体以加强对编码抗原的载体(病毒的或基于DNA的)的免疫应答。在另一个替代方案中，免疫接种方案涉及施用蛋白，随后用编码抗原的重组ChAd157载体加强。在一个实例中，引发-加强方案可以提供对所述抗原所来源的病毒、细菌或其他生物的保护性免疫应答。在另一个实施方案中，所述引发-加强方案会提供使用常规测定可以测量的治疗效果，所述常规测定用于检测正在施用的疗法所针对的病况的存在。

优选地，在给主体施用引发组合物以后约2至约27周施用加强组合物。使用有效量的含有或能够递送与引发疫苗所施用的抗原相同的抗原或不同的抗原的加强组合物完成所述加强组合物的施用。所述加强组合物可以由源自相同病毒来源或另一种来源的重组病毒载体组成。或者，所述加强组合物可以是含有与在引发疫苗中编码的抗原相同的抗原的组合物，但是以蛋白形式，所述组合物在宿主中诱导免疫应答。所述加强组合物的基本要求是，所述组合物的抗原是与所述引发组合物编码的抗原相同的抗原或交叉反应性抗原。

ChAd157的中和抗体和某些其他腺病毒载体(诸如ChAd155)之间的低交叉反应性在需要多次载体施用的背景下是有益的。多次施用可以用于分开递送不同的转基因(例如编码与不同医学适应症相关的免疫原)或递送相同或相似的转基因(例如在引发 - 加强方案中以增加对特定医学适应症的免疫应答)的目的。

因此，提供了编码转基因的本发明的重组腺病毒载体，其用于施用于先前已经暴露于重组腺病毒载体的主体，所述重组腺病毒载体不包含如本文所述的ChAd157纤突或其功能衍生物(例如，不包含如本文所述的ChAd157纤突、六邻体或五邻体，诸如包含ChAd155纤突、六邻体和/或五邻体的重组腺病毒载体，尤其是包含ChAd155纤突、六邻体和五邻体的重组腺病毒载体)。具体而言，提供了编码转基因的本发明的重组腺病毒载体，其用于施用于先前已经施用重组腺病毒载体的主体，所述重组腺病毒载体不包含如本文所述的ChAd157纤突或其功能衍生物(例如，不包含如本文所述的ChAd157纤突、六邻体或五邻体，诸如包含ChAd155纤突、六邻体和/或五邻体的重组腺病毒载体，尤其是包含ChAd155纤突、六邻体和五邻体的重组腺病毒载体)。合适地，不包含ChAd157纤突的重组腺病毒载体是与ChAd157具有低交叉反应性的载体。在一个实施方案中，不包含ChAd157纤突的重组腺病毒载体编码的转基因针对的一种或多种医学适应症与本发明转基因的重组腺病毒载体的不同。在另一个实施方案中，不包含ChAd157纤突的重组腺病毒载体编码的转基因针对的一种或多种医学适应症与本发明转基因的重组腺病毒载体的相同(例如，诸如相同的转基因)。

还提供了编码转基因的本发明的重组腺病毒载体，其用于施用于可以(即，意图或预期将)随后暴露于这样的重组腺病毒载体的主体，所述重组腺病毒载体不包含如本文所述的ChAd157纤突或其功能衍生物(例如，不包含如本文所述的ChAd157纤突、六邻体或五邻体，诸如包含ChAd155纤突、六邻体和/或五邻体的重组腺病毒载体，尤其是包含ChAd155纤突、六邻体和五邻体的重组腺病毒载体)。具体而言，提供了编码转基因的本发明的重组腺病毒载体，其用于施用于可以随后施用这样的重组腺病毒载体的主体，所述重组腺病毒载体不包含如本文所述的ChAd157纤突或其功能衍生物(例如，不包含如本文所述的ChAd157纤突、六邻体或五邻体，诸如包含ChAd155纤突、六邻体和/或五邻体的重组腺病毒载体，尤其是包含ChAd155纤突、六邻体和五邻体的重组腺病毒载体)。合适地，不包含ChAd157纤突的重组腺病毒载体是与ChAd157具有低交叉反应性的载体。在一个实施方案中，不包含ChAd157纤突的重组腺病毒载体编码的转基因针对的一种或多种医学适应症与本发明转基因的重组腺病毒载体的不同。在另一个实施方案中，不包含ChAd157纤突的重组腺病毒载体编码的转基因针对的一种或多种医学适应症与本发明转基因的重组腺病毒载体的相同(例如，诸如相同的转基因)。

因此，本发明提供了用于引发主体中的免疫应答的方法，所述方法包括：

(a)向所述主体施用编码第一转基因的本发明的重组腺病毒载体；和

(b)向所述主体施用不包含如本文所述的ChAd157纤突或其功能衍生物的重组腺病毒载体，所述载体编码第二转基因；

其中步骤(a)和(b)可以以任何顺序进行，并且第一和第二转基因可以是相同或不同的。

所述第一和第二转基因将通常编码免疫原，其可用于针对感染人和非人脊椎动物的病原体诸如细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生物或针对癌细胞或肿瘤细胞免疫人或非人动物。所述第一和第二转基因可以编码相同或不同的免疫原。当编码不同的免疫原时，这些可以针对相同或不同的病原体或癌细胞或肿瘤细胞。

因此，还提供了用于预防或治疗主体的方法，所述方法包括：

(a)向所述主体施用编码第一转基因的本发明的重组腺病毒载体，所述第一转基因编码免疫原，其可用于针对感染人和非人脊椎动物的病原体诸如细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生物或针对癌细胞或肿瘤细胞免疫人或非人动物；和

(b)向所述主体施用不包含如本文所述的ChAd157纤突或其功能衍生物的重组腺病毒载体，所述载体编码第二转基因，所述第二转基因编码免疫原，其可用于针对感染人和非人脊椎动物的不同病原体诸如细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生物或针对癌细胞或肿瘤细胞免疫人或非人动物；

其中步骤(a)和(b)可以任何顺序进行。

不包含如本文所述的ChAd157纤突或其功能衍生物的重组腺病毒载体合适地不包含ChAd157纤突、ChAd157六邻体或ChAd157纤突，诸如不包含ChAd157纤突、ChAd157六邻体或ChAd157纤突或与其具有至少98%同一性的其功能衍生物。

不包含如本文所述的ChAd157纤突或其功能衍生物的重组腺病毒载体可以是包含ChAd155纤突、六邻体和/或五邻体的重组腺病毒载体，尤其是包含ChAd155纤突、六邻体和五邻体的重组腺病毒载体。

如所提及，本发明的重组腺病毒载体可以与包含ChAd155纤突、六邻体和/或五邻体的重组腺病毒载体结合用于递送治疗性或免疫原性分子。包含ChAd155纤突、六邻体和/或五邻体的重组腺病毒载体将包含根据SEQ ID NO:7、9和11的纤突、五邻体和/或六邻体，特别是根据SEQ ID NO:7、9和11的纤突、五邻体和六邻体。

术语低交叉反应性意味着用第一载体免疫不会引发对第二载体的显著的中和抗体应答，即不显著影响第二载体的免疫效力。中和抗体应答可以用类似于本文实施例7的方法测定。理想地，用第一载体两次免疫引发中和滴度，其平均小于用第二载体免疫产生的水平的50%，诸如小于75%，合适地小于90%。

术语“主体”意指任何动物，合适地哺乳动物，且特别是人。

递送方法和剂量

可以如下制备用于施用的载体：悬浮或溶解于药学上或生理上可接受的载体诸如等渗盐水、等渗盐溶液或本领域技术人员将显而易见的其他制剂。适当的载体是本领域技术人员显而易见的，且主要取决于施用途径。使用可生物降解的生物相容的聚合物，或通过使用胶束、凝胶和脂质体的现场递送，可以在持续释放制剂中将本文描述的组合物施用给哺乳动物。

在一些实施方案中，通过肌肉内注射、阴道内施用、静脉内注射、腹膜内注射、皮下注射、表皮施用、真皮内施用、鼻施用、直肠施用或经口施用。舌下施用也可以是感兴趣的。

如果治疗方案涉及一种或多种ChAd157腺病毒载体和另一种组分(各自配制在不同的组合物中)的共同施用，则它们有利地在相同部位处或附近共位置地施用。例如，可以将所述组分施用(例如经由选自肌肉内、透皮、真皮内、皮下的施用途径)至相同侧或肢体(“同侧”施用)或相对侧或肢体(“对侧”施用)。

病毒载体的剂量主要取决于诸如以下因素：正在治疗的病况，患者的年龄、重量和健康，且因此可以在患者之间变化。例如，病毒载体的治疗上有效的成年人或兽医学剂量通常含有1x10⁵至1x10¹⁵个病毒颗粒，诸如1x10⁸至1x10¹² (例如，1x10⁸、2.5x10⁸、5x10⁸、1x10⁹、1.5x10⁹、2.5x10⁹、5x10⁹、1x10¹⁰、1.5x10¹⁰、2.5x10¹⁰、5x10¹⁰、1x10¹¹ 1.5x10¹¹、2.5x10¹¹、5x10¹¹、1x10¹²个颗粒)。或者，可以以通常为1x10⁵至1x10¹⁰个噬斑形成单位(PFU)的剂量施用病毒载体，诸如1x10⁵ PFU、2.5x10⁵PFU、5x10⁵ PFU、1x10⁶ PFU、2.5x10⁶PFU、5x10⁶ PFU、1x10⁷ PFU、2.5x10⁷PFU、5x10⁷ PFU、1x10⁸ PFU、2.5x10⁸PFU、5x10⁸ PFU、1x10⁹ PFU、2.5x10⁹PFU、5x10⁹ PFU或1x10¹⁰ PFU。剂量将随动物的大小和施用途径而变化。例如，对于单个部位，用于肌肉内注射的合适人或兽医学剂量(对于约80 kg动物)是在约1 x 10⁹至约5 x 10¹²个颗粒/mL的范围内。任选地，可以使用多个施用部位。在另一个实例中，对于口服制剂，合适的人或兽医学剂量可以是在约1 x 10¹¹至约1 x 10¹⁵个颗粒的范围内。

可以通过定量PCR分析(Q-PCR)，定量病毒载体，例如使用在CMV启动子区域上设计的引物和探针，使用含有载体基因组(其含有包括HCMV启动子的表达盒)的质粒DNA的系列稀释物作为标准曲线。通过平行线分析方法确定测试样品中的拷贝数。载体颗粒定量的替代方法可以是分析型HPLC或基于A₂₆₀ nm的分光光度测量方法。

核酸的免疫学有效量可以合适地是在1 ng至100 mg之间。例如，合适的量可以是1µg至100 mg。本领域技术人员可以容易地确定特定核酸(例如，载体)的适当量。核酸组分的示例性有效量可以是在1 ng至100µg之间，诸如在1 ng至1µg之间(例如，100 ng-1µg)之间，或在1µg至100µg之间，诸如10 ng、50 ng、100 ng、150 ng、200 ng、250 ng、500 ng、750 ng或1µg。核酸的有效量还可以包括1µg至500µg，诸如1µg至200µg之间，诸如10-100µg之间，例如1µg、2µg、5µg、10µg、20µg、50µg、75µg、100µg、150µg或200µg。或者，核酸的示例性有效量可以是在100µg至1 mg之间，诸如100µg至500µg之间，例如，100µg、150µg、200µg、250µg、300µg、400µg、500µg、600µg、700µg、800µg、900µg或1 mg。

通常，人剂量将是在0.1ml和2 ml之间的体积。因此，可以将本文描述的组合物配制在例如0.1、0.15、0.2、0.5、1.0、1.5或2.0 ml人剂量/单一或组合免疫原性组分的体积中。

本领域技术人员可以调节这些剂量，这取决于施用途径和采用重组载体的治疗或疫苗用途。可以监测转基因的表达水平，或对于佐剂而言，循环抗体的水平，以确定剂量施用的频率。

如果使用一个或多个引发和/或加强步骤，该步骤可以包括每小时、每天、每周或每月或每年施用的单剂量。作为一个实例，哺乳动物可以接受一个或两个含有在载体中的约10 μg至约50 μg质粒的剂量。期望地，基于哺乳动物的特性和病况而选择递送的量或部位。

可以监测由选定的转基因编码的蛋白的治疗水平或针对所述蛋白的免疫应答的水平，以确定对加强的需要(如果有的话)。在评估血清中的CD8+ T细胞应答或任选的抗体滴度以后，任选的加强免疫接种可能是期望的。任选地，可以在单次施用中或在不同组合方案中递送重组ChAd157载体，例如，与涉及其他活性成分的方案或疗程组合或在引发-加强方案中。

现在将借助于下述非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

实施例1： ChAd157的分离和载体构建

使用如Colloca等人.Sci Transl Med. 2012 Jan 4;4(115):115ra2和WO2010/086189(其用于描述腺病毒分离和表征技术的目的通过引用并入本文)描述的标准程序从圈养在不同欧洲设施中的健康幼小黑猩猩分离29种不同的野生型黑猩猩腺病毒。

随后合并29种野生型病毒；通过使用BAC穿梭物在大肠杆菌BJ5183细胞中的同源重组克隆该合并物的病毒基因组，以产生携带E1区域的缺失的载体的微型文库。将ΔE1载体的微型文库转染至Procell 92细胞系中；将拯救的载体连续传代16代感染。在第16代，从扩增的载体制备病毒DNA，并通过使用质粒穿梭物在大肠杆菌BJ5183细胞中同源重组来克隆。将流行的载体物种鉴定为ChAd157∆E1载体，且随后进行修饰以包括载体主链的以下额外修饰：

a) ΔE1病毒的E4区域(从bp 34413至bp 37127)的缺失；

b) 从人Ad5衍生的E4orf6的插入。

1.1: ΔE1微型文库生成

使用29种野生型病毒的合并物以获得合并的病毒基因组。通过用合并的病毒DNA和亚组C BAC 穿梭物 (#1365)(SEQ ID NO:14)共转化的大肠杆菌菌株BJ5183中的同源重组，将合并的病毒基因组克隆进BAC载体中。如在图2的示意图中所示，亚组C 穿梭物是专门用于属于物种C的ChAd的克隆的BAC载体，且因此含有pIX基因和从物种C ChAd病毒的右和左末端(包括右和左ITR)衍生的DNA片段。

物种C BAC穿梭物也含有插入在左末端和pIX基因之间的RpsL-Kana盒。另外，侧接ISceI限制位点的Amp-LacZ-SacB选择盒存在于pIX基因和病毒基因组的右末端之间。具体地，BAC穿梭物包含下述部件：左ITR：bp27-139，hCMV(tetO) RpsL-Kana盒：bp493-3396，pIX基因：bp3508-3972，ISceI限制位点：bp3990和7481，Amp-LacZ-SacB选择盒：bp4000-7471，右ITR：bp7805-7917。hCMV(tetO)在SEQ ID NO:37中提供。

将BJ5183细胞通过电穿孔用纯化的病毒DNA的合并物和用经ISceI限制性酶消化过的亚组C BAC穿梭载体共转化，并然后从凝胶纯化。发生在pIX基因和右ITR序列(存在于物种C BAC穿梭物线性化的DNA的末端处)之间的同源重组和存在于合并的病毒DNA中的同源序列导致不同的病毒基因组DNA插入到BAC穿梭载体中。与此同时，将病毒的E1区域缺失并用RpsL-Kana盒置换，从而产生BAC/微型文库ΔE1/TetO hCMV RpsL-Kana。

1.2: Procell 92细胞系中的∆E1微型文库扩增和ChAd157∆E1载体的克隆。

ΔE1微型文库用PmeI消化并用于转染Procell 92包装细胞系，以便大量拯救不同病毒的文库。转染后10天，收获细胞并将细胞裂解物进行三个循环的冷冻(-70℃)和解冻(+37℃)，通过以2000 rpm离心来澄清并用于感染新鲜细胞。进行16次病毒扩增的连续传代，以针对Procell92细胞中的繁殖效率来选择病毒物种。通过两次CsCl梯度离心来纯化第16代的病毒，并提取病毒DNA，并通过使用质粒穿梭物在大肠杆菌BJ5183细胞中同源重组来克隆。详细地，BJ5183细胞与纯化的病毒DNA和亚组C质粒穿梭物(SEQ ID NO:38)共转化。如图3的图表中所示，亚组C质粒穿梭物是专门用于克隆属于物种C的ChAd的质粒载体，且因此含有衍生自物种C ChAd病毒的右端和左端(包括右和左ITR)的DNA片段。

存在于线性化亚组C质粒穿梭物(用PshAI/NdeI/XbaI消化)和病毒基因组DNA末端的右和左ITR DNA序列之间的同源重组允许其插入质粒载体中。通过限制性分析扩增并分析30个不同的克隆，并鉴定9种不同物种。19/30个克隆显示相同的限制性模式，并代表优势物种；选择这些克隆之一并鉴定为pChAd157∆E1 TetO hCMV RpsL-Kana#1551 (SEQ IDNO:15)。

1.3: ChAd157 ΔE1/TetO hCMV GAG#1557的构建

通过利用HCMV启动子和BGH聚A序列(SEQ ID NO:39)之间存在的同源性，经由大肠杆菌中的同源重组，将GAG盒(GAG多核苷酸序列SEQ ID NO:16)克隆至线性化的前腺病毒(pre-adeno)受体载体中。

用SpeI和SphI切割质粒pARS CV32TetOhCMV GAG，以切除含有HCMV启动子与tetO、HIV-GAG和BGH聚A序列的2.44 Kb片段。

通过同源重组将HIV-GAG 2.44Kb片段克隆至携带在HCMV和BGHpA控制下的RpsL-Kana选择盒的pChAd157 ΔE1 /TetO hCMV RpsL-Kana (#1551)受体载体(SnabI消化的)中。所得构建体是pChAd157 ΔE1/TetO hCMV GAG#1557载体(SEQ ID NO:17)。

携带ChAd157 GAG的质粒的结构报道于图4中。

1.4: ChAd157 ΔE1E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana#1594的构建。

随后修饰ChAd157∆E1载体以在主链中进行以下修饰：

a) ΔE1病毒的E4区域(从bp 34413至bp 37127)的缺失；

b) 衍生自人Ad5的E4orf6的插入。

通过使用涉及在大肠杆菌中的几个克隆和同源重组步骤的策略，通过用Ad5E4orf6编码序列替换天然E4区域，将跨核苷酸34413-37127 (∆E1载体序列坐标)的E4区域的缺失引入载体主链中。将E4编码区完全缺失，同时保留E4天然启动子和聚腺苷酸化信号。为此目的，构建穿梭载体以通过如下详述的在大肠杆菌BJ5183中的同源重组替换ChAd157天然E4区域而允许Ad5orf6的插入。

- pARS物种C Ad5E4orf6-1的构建：

使用Ad5 DNA作为模板，用寡核苷酸：5'-ATACGGACTAGTGGAGAAGTACTCGCCTACATG-3'(SEQ ID NO:18)和5'-ATACGGAAGATCTAAGACTTCAGGAAATATGACTAC-3' (SEQ ID NO:19)，通过PCR得到含有Ad5orf6的DNA片段。将PCR片段用BglII和SpeI消化并克隆进用BglII和SpeI消化的pARS物种C RLD-EGFP穿梭物中，从而产生质粒pARS物种C Ad5orf6-1。

- pARS物种C Ad5E4orf6-2的构建：

通过PCR使用质粒pChAd157 ΔE1 /TetO hCMV RpsL-Kana (#1551)作为模板用以下寡核苷酸扩增含有纤突-E4聚A(ChAd157∆E1载体的bp 34269至bp 34412)的144 bp DNA片段： 5’- ATTCAGTGTACAGGCGCGCCAAAGCATGACACTGATGTTCATTTC-3’ (SEQ ID NO:20)和5’-ACTAGGACTAGTTATAAGCTAGAATGGGGCTTTGC-3’ (SEQ ID NO:21)。PCR片段用BsrGI和SpeI消化，并克隆至用BsrGI和SpeI消化的pARS亚组C Ad5orf6-1中，产生质粒pARS物种CAd5orf6-2 (SEQ ID NO:40)。

然后使用所得质粒pARS物种C Ad5orf6-2来用ChAd157主链内的Ad5orf6替换E4。为此，将质粒pChAd157∆E1 TetO hCMV RpsL-Kana#1551用PacI消化并与用BamHI/AscI消化的质粒pARS物种C Ad5orf6-2 共转化至BJ5183细胞中，以获得pChAd157 ΔE1E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana (#1594)前腺病毒质粒(SEQ ID NO:22)。

1.5: ChAd157 ΔE1E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RG#1559的构建。

通过利用HCMV启动子和BGH聚A序列之间存在的同源性，经由大肠杆菌中的同源重组，将将狂犬病病毒糖蛋白(RG)表达盒(狂犬病糖蛋白多核苷酸序列SEQ ID NO:23)克隆至线性化的前腺病毒受体载体中。

用SpeI和AsiSI切割质粒pvjTetOhCMV-bghpolyA_RG，以切除含有HCMV启动子与tetO、RG和BGH聚A序列的2.59 Kb片段。

通过同源重组将所得RG 2.59 Kb片段克隆至携带在HCMV和BGHpA控制下的RpsL-Kana选择盒的pChAd157 ΔE1E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana (#1594)受体载体中。受体preAd质粒用限制性内切核酸酶SnaBI线性化。所得构建体是pChAd157 ΔE1E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RG#1559载体(SEQ ID NO:24)。

携带ChAd157 RG的质粒的结构报道于图6中。

实施例2：载体生产

在Procell 92细胞系中，与ChAd19和ChAd155相比，评估ChAd157的生产力。

2.1: 包含HIV Gag转基因的载体的生产

拯救ChAd157/GAG、ChAd19/GAG、ChAd155/GAG(表达HIV Gag转基因的ChAd157、ChAd19和ChAd155载体)并在Procell 92中扩增；裂解物用于用每种载体感染以单层培养的1个T25烧瓶的Procell 92。使用300 vp/细胞的感染复数(MOI)并且在四环素存在的情况下进行感染，因为ChAd19/GAG缺乏通过在hCMV启动子中插入TetO操纵子介导的转录控制。当完全细胞病变效应明显时(ChAd157/GAG和ChAd155/GAG感染后48小时和ChAd19/GAG感染后5天)收获感染细胞；通过3个循环的冷冻/解冻(-70℃至37℃)从受感染细胞释放病毒，然后通过离心澄清裂解物。通过定量PCR分析用与CMV启动子区域互补的引物和探针定量澄清的裂解物。寡核苷酸序列如下： CMVfor 5’-CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3’ (SEQ ID NO:25)，CMVrev 5’-GACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3’ (SEQ ID NO:26)，CMVFAM-TAMRA探针5’-ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT-3’ (SEQ ID NO:41) (QPCRs在ABI Prism 7900序列检测仪– Applied Biosystem上运行)。

对澄清的裂解物测量的所得体积滴度(vp/ml)和以病毒颗粒数/细胞(vp/细胞)表示的比生产力在下表1中提供。

表1：GAG载体生产力

载体	容积生产力(vp/ml)	总vp	细胞比生产力(vp/细胞)
				ChAd157/GAG	4.61E+09	2.30E+10	7.68E+03
ChAd155/GAG	5.42E+09	2.71E+10	9.04E+03
				ChAd19/GAG	4.80E+08	2.40E+09	8.00E+02

2.2: 包含RG转基因的载体的生产

进行不同组的实验以评估在悬浮培养的Procell 92中RG疫苗载体的生产力。该实验通过以5x10⁵个细胞/ml的细胞密度感染Procell 92来平行比较ChAd157/RG和ChAd155/RG。使用300 vp/细胞的感染复数(MOI)。感染后4天收获感染的细胞；通过3个循环的冷冻/解冻从感染的细胞释放病毒，并通过离心澄清裂解物。然后如上所报道通过QPCR定量澄清的裂解物。

容积生产力和细胞比生产力在下表2中提供。

表2：RG载体生产力

载体	容积生产力(vp/ml)	总vp	细胞比生产力(vp/细胞)
				ChAd157/RG	9.39E+09	4.69E+11	1.88E+04
ChAd155/RG	1.41E+10	7.04E+11	2.81E+04

实施例3：转基因表达水平

3.1: HIV Gag转基因的表达水平

通过用包含HIV Gag转基因的ChAd19、ChAd155和ChAd157载体感染HeLa细胞，在平行实验中比较表达水平。

将HeLa细胞接种在35 mm培养皿中，并使用MOI = 250 vp/细胞用ChAd19/GAG、ChAd157/GAG和ChAd155/GAG纯化的病毒感染。感染后48小时收获感染的HeLa细胞的上清液，并通过使用商业ELISA试剂盒(HIV-1 p24 ELISA试剂盒，PerkinElmer Life Science)定量分泌的HIV GAG蛋白的产生。根据制造商的说明通过使用HIV-1 p24抗原标准曲线进行定量。

以pg/ml GAG蛋白表示的结果示于图7中。

3.2: RG转基因的表达水平

还进行western印迹分析以评估与ChAd155/RG载体相比的由ChAd157/RG载体提供的狂犬病糖蛋白表达。为此，将HeLa细胞接种在35mm培养皿中，并使用MOI = 250 vp/细胞用ChAd157/RG和ChAd155/RG纯化的病毒感染。感染后48小时收获细胞裂解物，并通过还原SDS-PAGE、随后进行Western印迹分析来评估转基因表达水平。

将等量的蛋白提取物上样至还原性SDS凝胶上；在电泳分离后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜，用兔多克隆抗GP (目录号RBVGP11-S αDiagnostic，1:1000稀释)进行探测。与一抗孵育后，洗涤膜，且然后与抗兔辣根过氧化物酶(HRP)缀合物二抗一起孵育。最后，使用增强化学发光(ECL)检测试剂(W3252282 PIERCE)通过化学发光将测定显色。Western印迹结果显示于图8中。

由箭头所示的约57 kD的条带由多克隆抗体抗GP揭示，其对应于狂犬病糖蛋白的预期重量。

结果表明ChAd157载体的表达水平与ChAd155提供的表达水平相当。

实施例4：通过小鼠免疫实验评估免疫效力

4.1: 包含HIV Gag转基因的载体的免疫原性

在BALB/c小鼠(每组6只)中与ChAd155/GAG和ChAd19/GAG平行评估免疫原性ChAd157/GAG载体。通过肌内注射10⁷个病毒颗粒来进行实验。免疫后3周通过使用定位在BALB/c小鼠中的GAG CD8+ T细胞表位的离体干扰素-γ (IFN-γ)酶联免疫斑点(ELISpot)测量T细胞应答。获得的结果报告于图9中，表示为每百万个脾细胞的IFNγ斑点形成细胞(SFC)。

每个点代表单个小鼠中的应答，并且线对应于每个剂量组的几何平均值。在x轴上显示CD8免疫显性肽阳性小鼠的频率。

4.2 包含RG转基因的载体的免疫原性

在BALB/c小鼠中评估ChAd157/RG和ChAd155/RG载体的免疫效力。两种载体均以10⁷和10⁶vp剂量肌内注射。接种疫苗后7周分离免疫小鼠的脾细胞，并通过IFNγ ELISpot使用来自RG的肽合并物作为抗原进行分析(图10)。

如所预期，与剂量减少一致，免疫应答的水平降低。此外，ChAd155RG载体比ChAd157 RG诱导更高的T细胞应答，尽管它们没有显著差异(图10)。

实施例5：感染性的评估

5.1 包含HIV Gag转基因的载体的感染性

在粘附的Procell 92细胞中，利用针对腺病毒六邻体蛋白的抗体以通过免疫细胞化学染色显现感染的细胞，评估纯化病毒的感染性。针对六邻体蛋白的抗体识别所有血清型的腺病毒。为此，将Procell92细胞以2x10⁵个活细胞/ml的细胞密度接种在24孔板中，并用ChAd157/GAG和ChAd155/GAG和ChAd19/GAG载体使用MOI = 1 vp/细胞、0.5 vp/细胞和0.25vp/细胞一式两份感染。感染后48小时，感染的细胞用冷甲醇固定，且然后用抗六邻体抗体标记。去除过量的抗体。然后将标记的细胞与缀合有辣根过氧化物酶的二抗一起孵育，并使用商业试剂盒VECTOR NOVARED底物试剂盒(SK-4800)进行检测。当辣根过氧化物酶标记物与DAB底物反应、产生深棕色产物时，完成检测。然后通过光学显微镜定量标记的深棕色细胞并计算感染滴度。结果显示于下表中。

病毒	Vp/ml	Ifu/ml	R(vp/ifu)
				ChAd155 GAG	1.32E+11	1.58E+09	84
ChAd157 GAG	1.17E+11	1.23E+09	95
				ChAd19 GAG	4.46E+10	3.86E+08	116

结果表明，ChAd155和ChAd157病毒的感染性是相当的且高于ChAd19。

5.2 包含RG转基因的载体的感染性

如上所报道，在贴壁Procell 92细胞中，通过六邻体免疫染色，评估ChAd157/RG和ChAd155/RG纯化病毒的感染性。结果显示于下表中。

病毒	Vp/ml	Ifu/ml	R(vp/ifu)
				ChAd155/RG	4.23E+11	4.06E+09	104
ChAd157/RG	1.97E+11	1.46E+09	133

结果表明，ChAd155和ChAd157病毒的感染性是相当的。

实施例6：ChAd155和ChAd157载体之间的交叉中和的评估

6.1如果ChAd155和ChAd157载体是不同的血清型，则进行体内测试

在BALB/c小鼠(每组6只)中评估ChAd155和ChAd157载体之间的交叉中和。小鼠在第0周和第3周用10⁹vp的表达RG的ChAd155或ChAd157预免疫两次，或者用盐水缓冲液模拟接种疫苗。三周后，然后用10⁹ vp编码HIV gag的ChAd157免疫所有小鼠一次。

组	n	在w0和w3预免疫2次	剂量 (vp)	在w6免疫	剂量 (vp)
						1	6	PBS	-	ChAd157-GAG	10<sup>9</sup>
2	6	ChAd155-RG	10<sup>9</sup>	ChAd157-GAG	10<sup>9</sup>
						3	6	ChAd157-RG	10<sup>9</sup>	ChAd157-GAG	10<sup>9</sup>

在第5周(第二次注射后2周)通过体外中和测定在血清中测量针对预免疫载体的中和滴度(图11)。最后，使用定位在BALB/c小鼠中的GAG CD8+ T细胞表位，在免疫后3周，通过IFN-γ ELISpot在脾细胞上测试针对gag的T细胞应答(图12)。用于预免疫的载体的剂量能够引发针对两种Ad载体的良好中和活性，尽管具有一些可变性。抗ChAd155中和抗体不与ChAd157交叉反应，且反之亦然(图11)。此外，ChAd157-Gag T细胞应答不受抗ChAd155预免疫的影响，证实未观察到交叉中和(图12)。

总之，这些数据表明ChAd155和ChAd157病毒是不同的腺病毒血清型。

Claims

1.分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码选自以下的多肽：

(a)具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，和

2.重组多核苷酸，其包含选自以下的多核苷酸：

(a)多核苷酸，其编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，和

3.重组载体，其包含选自以下的多核苷酸：

4.重组腺病毒，其包含至少一种选自以下的多核苷酸或多肽：

(a)多核苷酸，其编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，

(b)多核苷酸，其编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99.8%同一性的氨基酸序列，

(c)具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，和

5.组合物，其包含以下中的至少一种：

(c)具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，

(d)具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99.8%同一性的氨基酸序列，

(e)根据权利要求3所述的载体，和

(f)根据权利要求4所述的重组腺病毒，

以及药学上可接受的赋形剂。

6.细胞，其包含以下中的至少一种：

(c)具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，

(e)根据权利要求3所述的载体，和

(f)根据权利要求4所述的重组腺病毒。

7.分离的腺病毒多肽，其选自：

(a)具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，和

8.根据权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述多核苷酸编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99.8%同一性的氨基酸序列。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述多核苷酸编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。

10.根据权利要求9所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述多核苷酸具有根据SEQ ID NO:2的序列。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其进一步包含编码以下的多核苷酸：

(a)具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；或

或者

(a)具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或

12.根据权利要求11所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其进一步包含编码以下的多核苷酸：

(a)具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；或

(b)具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少98%同一性的氨基酸序列，

或者

(a)具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或

(b)具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少98%同一性的氨基酸序列。

13.根据权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其进一步包含编码以下的多核苷酸：

(a)具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；或

和

(a)具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或

14.根据权利要求13所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其进一步包含编码以下的多核苷酸：

(a)具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；或

和

(a)具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或

15.根据权利要求11-14中任一项所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述多核苷酸包含根据SEQ ID NO:4的序列。

16.根据权利要求11-15中任一项所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述多核苷酸包含根据SEQ ID NO:6的序列。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述多核苷酸包含以下中的至少一种：

(a) 腺病毒5'-末端，优选地腺病毒5'反向末端重复；

(b) 腺病毒ElA区域或其选自E1A_280R和E1A_243R区域的片段；

(c) 腺病毒ElB或IX区域或其选自E1B_19K、E1B_55K或IX区域的片段；

(d) 腺病毒E2b区域；或其选自E2B_pTP、E2B_聚合酶和E2B_IVa2区域的片段；

(e) 腺病毒L1区域或其片段，所述片段编码选自L1_13.6k蛋白、L1_52k和L1_IIIa蛋白的腺病毒蛋白；

(f) 腺病毒L2区域或其片段，所述片段编码选自根据权利要求3所述的L2_五邻体蛋白、L2_pVII、L2_V和L2_pX蛋白的腺病毒蛋白；

(g) 腺病毒L3区域或其片段，所述片段编码选自L3_pVI蛋白、根据权利要求2所述的L3_六邻体蛋白和L3_蛋白酶的腺病毒蛋白；

(h) 腺病毒E2A区域；

(i) 腺病毒L4区域或其片段，所述片段编码选自L4_100k蛋白、L4_33k蛋白和蛋白L4_VIII的腺病毒蛋白；

(j) 腺病毒E3区域或其选自E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8和E3 ORF9的片段；

(k) 腺病毒L5区域或其片段，所述片段编码根据权利要求1所述的L5_纤突纤突蛋白；

(1) 腺病毒E4区域或其选自E4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2和E4 ORF1的片段；

(m) 腺病毒3'-末端，优选地腺病毒3'反向末端重复；和/或

(n) 腺病毒VAI或VAII RNA区域，优选地来自除ChAd157以外的腺病毒、更优选地来自Ad5的腺病毒VAI或VAII RNA区域。

18.根据权利要求17所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述多核苷酸包含以下中的至少一种：

(a) 腺病毒5'-末端，优选地腺病毒5'反向末端重复；

(m) 腺病毒3'-末端，优选地腺病毒3'反向末端重复。

19.根据权利要求1-16中任一项所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述多核苷酸包含腺病毒VAI或VAII RNA区域。

20.根据权利要求19所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述VAI或VAII RNA区域来自除ChAd157以外的腺病毒。

21.根据权利要求20所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述VAI或VAII RNA区域来自Ad5。

22.根据权利要求1-16中任一项所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述多核苷酸包含在其整个长度上与基本上由SEQ ID NO:15或22组成的参照序列具有至少95%同一性的多核苷酸或由其组成。

23.根据权利要求22所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述多核苷酸包含在其整个长度上与所述参照序列具有至少99%同一性的多核苷酸或由其组成。

24.根据权利要求23所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述多核苷酸包含在其整个长度上与所述参照序列具有至少99.5%同一性的多核苷酸或由其组成。

25.根据权利要求22-24中任一项所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述多核苷酸包含在其整个长度上与所述参照序列相同的多核苷酸或由其组成。

26.根据权利要求25所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述参照序列是SEQ ID NO:15。

27.根据权利要求25所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述参照序列是SEQ ID NO:22。

28.根据权利要求1-16中任一项所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述多核苷酸包含使选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基因组区域的至少一个基因无功能的突变或缺失。

29.根据权利要求28所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述多核苷酸缺乏选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和/或E4的基因组区域的至少一个基因。

30.根据权利要求28或29所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述基因组区域是E1A和/或E1B。

31.根据权利要求1-16中任一项所述的多核苷酸、载体、腺病毒、组合物或细胞，其中所述多核苷酸包含E1基因组区域的缺失。

32.根据权利要求4和8-31中任一项所述的腺病毒，其中所述重组腺病毒是复制型的。

33.根据权利要求4和8-32中任一项所述的腺病毒，其中所述重组腺病毒是复制缺陷型的。

34.权利要求4和8-33中任一项的腺病毒，其中所述重组腺病毒包含编码蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至一个或多个指导所述蛋白在宿主细胞中表达的序列。

35.根据权利要求34所述的腺病毒，其中所述蛋白是抗原蛋白或其片段。

36.根据权利要求35所述的腺病毒，其中所述蛋白是异源蛋白或其片段。

37.权利要求36的腺病毒，其中所述蛋白衍生自病毒。

38.权利要求34-37中任一项的腺病毒，其中所述一个或多个指导所述产物在宿主细胞中表达的序列包括选自以下中的一种或多种的序列：转录起始、转录终止、启动子和增强子序列。

39.权利要求38的腺病毒，其中所述一个或多个指导所述产物在宿主细胞中表达的序列包括启动子序列。

40.权利要求39的腺病毒，其中所述启动子序列选自内部启动子、天然启动子、RSV LTR启动子、CMV启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、PGK启动子、EF1a启动子和CASI启动子。

41.权利要求39的腺病毒，其中所述启动子序列是增强的hCMV启动子，诸如SEQ ID NO:42中提供的。

42.根据权利要求4和8-41中任一项所述的腺病毒，其中所述腺病毒在人主体中具有小于10％的血清阳性率，并且优选在人主体中不具有血清阳性率。

43.根据权利要求4和8-42中任一项所述的腺病毒，其中所述腺病毒能够感染哺乳动物细胞。

44.根据权利要求5和8-43中任一项所述的组合物，其包含选自下列的佐剂：无机佐剂(例如无机金属盐，诸如磷酸铝或氢氧化铝)、有机佐剂(例如皂苷，诸如QS21或角鲨烯)、基于油的佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、细胞因子(例如IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和INF-γ)、微粒佐剂(例如免疫刺激性复合物(ISCOMS)、脂质体或可生物降解的微球)、病毒体、细菌佐剂(例如单磷酰脂质A，诸如3-脱-O-酰化单磷酰脂质A (3D-MPL)或胞壁酰基肽)、合成的佐剂(例如非离子的嵌段共聚物、胞壁酰基肽类似物或合成的脂质A)、合成的多核苷酸佐剂(例如聚精氨酸或聚赖氨酸)和含有未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性寡核苷酸。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述佐剂是3D-MPL和/或QS21。

46.根据权利要求6和8-31中任一项所述的细胞，其中所述细胞是表达至少一种选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3 E4、L1、L2、L3、L4和L5的腺病毒基因的宿主细胞。

47.根据权利要求45所述的细胞，其中所述宿主细胞是悬浮生长的。

48.根据权利要求1-47中任一项所述的多核苷酸、多肽、载体、腺病毒、组合物或细胞，其用作药物。

49.根据权利要求48所述的多核苷酸、多肽、载体、腺病毒、组合物或细胞，其用作疫苗。

50.根据权利要求1-47中任一项所述的多核苷酸、多肽、载体、腺病毒、组合物或细胞用于治疗或预防疾病的用途。

51.诱导主体中的免疫应答的方法，其包括将根据权利要求1-47中任一项所述的多核苷酸、多肽、载体、腺病毒、组合物或细胞施用于所述主体。

52.分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:2的序列或由SEQ ID NO:2的序列组成。

53.根据权利要求4和8-43中任一项所述的重组腺病毒载体，其编码转基因并用于施用于先前已暴露于不包含如本文所述的ChAd157纤突或其功能衍生物的重组腺病毒载体的主体。

54.根据权利要求53所述的重组腺病毒载体，其中所述主体先前已暴露于包含ChAd155纤突、六邻体和/或五邻体的重组腺病毒载体。

55.根据权利要求54所述的重组腺病毒载体，其中所述主体先前已暴露于包含ChAd155纤突、六邻体和五邻体的重组腺病毒载体。

56.根据权利要求54或55所述的重组腺病毒载体，其中包含ChAd155纤突、六邻体和/或五邻体的重组腺病毒载体编码的转基因针对的一种或多种医学适应症与编码转基因的根据权利要求4和8-43中任一项所述的重组腺病毒载体的不同。

57.根据权利要求54或55所述的重组腺病毒载体，其中包含ChAd155纤突、六邻体和/或五邻体的重组腺病毒载体编码的转基因针对的一种或多种医学适应症与编码转基因的根据权利要求4和8-43中任一项所述的重组腺病毒载体的相同。

58.根据权利要求54或55所述的重组腺病毒载体，其中包含ChAd155纤突、六邻体和/或五邻体的重组腺病毒载体编码与编码转基因的根据权利要求4和8-43中任一项所述的重组腺病毒载体相同的转基因。

59.根据权利要求53-58中任一项所述的重组腺病毒载体，其中所述转基因编码免疫原，所述免疫原可用于针对感染人和非人脊椎动物的病原体诸如细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生物或针对癌细胞或肿瘤细胞免疫人或非人动物。

60.根据权利要求4和8-43中任一项所述的重组腺病毒载体，其编码转基因并用于施用于可能随后暴露于不包含如本文所述的ChAd157纤突或其功能衍生物的重组腺病毒载体的主体。

61.根据权利要求60所述的重组腺病毒载体，其中所述主体可能随后暴露于包含ChAd155纤突、六邻体和/或五邻体的重组腺病毒载体。

62.根据权利要求61所述的重组腺病毒载体，其中所述主体可能随后暴露于包含ChAd155纤突、六邻体和五邻体的重组腺病毒载体。

63.根据权利要求61或62所述的重组腺病毒载体，其中包含ChAd155纤突、六邻体和/或五邻体的重组腺病毒载体编码的转基因针对的一种或多种医学适应症与编码转基因的根据权利要求4和8-43中任一项所述的重组腺病毒载体的不同。

64.根据权利要求61或62所述的重组腺病毒载体，其中包含ChAd155纤突、六邻体和/或五邻体的重组腺病毒载体编码的转基因针对的一种或多种医学适应症与编码转基因的根据权利要求4和8-43中任一项所述的重组腺病毒载体的相同。

65.根据权利要求61或62所述的重组腺病毒载体，其中包含ChAd155纤突、六邻体和/或五邻体的重组腺病毒载体编码与编码转基因的根据权利要求4和8-43中任一项所述的重组腺病毒载体相同的转基因。

66.根据权利要求60-65中任一项所述的重组腺病毒载体，其中所述转基因编码免疫原，所述免疫原可用于针对感染人和非人脊椎动物的病原体诸如细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生物或针对癌细胞或肿瘤细胞免疫人或非人动物。

67.用于引发主体中的免疫应答的方法，所述方法包括：

(a)向所述主体施用编码第一转基因的根据权利要求4和8-43中任一项所述的重组腺病毒载体；和

(b)向所述主体施用不包含ChAd157纤突的重组腺病毒载体，所述载体编码第二转基因；

其中步骤(a)和(b)可以以任何顺序进行，并且第一和第二转基因可以是相同的或不同的。

68.用于预防或治疗主体的方法，所述方法包括：

(a)向所述主体施用编码第一转基因的根据权利要求4和8-43中任一项所述的重组腺病毒载体，所述第一转基因编码免疫原，所述免疫原可用于针对感染人和非人脊椎动物的病原体诸如细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生物或针对癌细胞或肿瘤细胞免疫人或非人动物；和

(b)向所述主体施用不包含如本文所述的ChAd157纤突或其功能衍生物的重组腺病毒载体，所述载体编码第二转基因，所述第二转基因编码免疫原，所述免疫原可用于针对感染人和非人脊椎动物的不同病原体诸如细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生物或针对癌细胞或肿瘤细胞免疫人或非人动物；

其中步骤(a)和(b)可以任何顺序进行。

69.根据权利要求53-68中任一项所述的重组腺病毒载体或方法，其中不包含如本文所述的ChAd157纤突或其功能衍生物的重组腺病毒载体与根据权利要求4或8-43中任一项所述的重组腺病毒载体具有低交叉反应性。

70.根据权利要求69所述的重组腺病毒载体或方法，其中用第一载体免疫引发的中和滴度平均小于用第二载体免疫产生的水平的50%。

71.根据权利要求53-70中任一项所述的重组腺病毒载体或方法，其中不包含ChAd157纤突的重组腺病毒载体不包含ChAd157纤突、ChAd157六邻体或ChAd157纤突或与其具有至少98%同一性的其功能衍生物。