JP2020518648A - アルファウイルス新生抗原ベクター - Google Patents
アルファウイルス新生抗原ベクター Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020518648A JP2020518648A JP2019561211A JP2019561211A JP2020518648A JP 2020518648 A JP2020518648 A JP 2020518648A JP 2019561211 A JP2019561211 A JP 2019561211A JP 2019561211 A JP2019561211 A JP 2019561211A JP 2020518648 A JP2020518648 A JP 2020518648A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- composition
- antigen
- nucleic acid
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 190
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 title claims abstract description 95
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 223
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 199
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 198
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 238
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 211
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 207
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 168
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 149
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 148
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 87
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 332
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 275
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 160
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 148
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 145
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 claims description 127
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 103
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 90
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 claims description 89
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 claims description 86
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 85
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 83
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 76
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 73
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 70
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 65
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 claims description 64
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 63
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 62
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 61
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 60
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 60
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 claims description 59
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 57
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 53
- 241001217856 Chimpanzee adenovirus Species 0.000 claims description 51
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 50
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 claims description 43
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 claims description 43
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 43
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 42
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 41
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 41
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 41
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 38
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 34
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 33
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 33
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 32
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 31
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 claims description 31
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 30
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 28
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 28
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 28
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 claims description 27
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 26
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 26
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 25
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 24
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 24
- 102100031726 Endoplasmic reticulum junction formation protein lunapark Human genes 0.000 claims description 23
- 101000941029 Homo sapiens Endoplasmic reticulum junction formation protein lunapark Proteins 0.000 claims description 23
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 claims description 23
- 101000991410 Homo sapiens Nucleolar and spindle-associated protein 1 Proteins 0.000 claims description 22
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 22
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 22
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims description 22
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 21
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 21
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 20
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 19
- NRLNQCOGCKAESA-KWXKLSQISA-N [(6z,9z,28z,31z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl] 4-(dimethylamino)butanoate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCCC(OC(=O)CCCN(C)C)CCCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC NRLNQCOGCKAESA-KWXKLSQISA-N 0.000 claims description 18
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 18
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 18
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 18
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 18
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 18
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 claims description 17
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 16
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 16
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 claims description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 13
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 13
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 13
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims description 12
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 claims description 12
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 12
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 claims description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 11
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 11
- 241000178568 Aura virus Species 0.000 claims description 10
- 241000608292 Mayaro virus Species 0.000 claims description 10
- 241000710942 Ross River virus Species 0.000 claims description 10
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 claims description 10
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 claims description 10
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 10
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 claims description 10
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 10
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 9
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims description 9
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 9
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 9
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 9
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 9
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 claims description 8
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 claims description 8
- 206010066919 Epidemic polyarthritis Diseases 0.000 claims description 8
- 241000231322 Fort Morgan virus Species 0.000 claims description 8
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 claims description 8
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 7
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 claims description 6
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000014944 Lysosome-Associated Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010064171 Lysosome-Associated Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 6
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 6
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 claims description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 6
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 6
- 230000032258 transport Effects 0.000 claims description 6
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 claims description 6
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 5
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 5
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 5
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 5
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 claims description 5
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 5
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 claims description 4
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 4
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 4
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 claims description 4
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 claims description 4
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 claims description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 4
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 4
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 3
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101800000515 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 claims description 3
- 101800000980 Protease nsP2 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims description 3
- 101800001758 RNA-directed RNA polymerase nsP4 Proteins 0.000 claims description 3
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 claims description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 3
- WTJKGGKOPKCXLL-VYOBOKEXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-VYOBOKEXSA-N 0.000 claims description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 claims description 2
- GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N Dimethyl dicarbonate Chemical compound COC(=O)OC(=O)OC GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 claims description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 claims description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 2
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 2
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 241001492404 Woodchuck hepatitis virus Species 0.000 claims description 2
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 claims description 2
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 claims description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 230000025308 nuclear transport Effects 0.000 claims description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 claims description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-N 2-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-7-methylpurin-9-ium-6-olate Chemical compound C12=NC(N)=NC([O-])=C2N(C)C=[N+]1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims 1
- 102100035233 Furin Human genes 0.000 claims 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 99
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 97
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 74
- 238000012549 training Methods 0.000 description 59
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 57
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 42
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 36
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 36
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 33
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 23
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 22
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 22
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 22
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 230000006870 function Effects 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 238000013461 design Methods 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 14
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 13
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 12
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 12
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 12
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 11
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 11
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 9
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 9
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 9
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 8
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 8
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 8
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 8
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 7
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-4-amino-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2-azaniumyl-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-carboxylatobutanoyl]amino]-6-azaniumy Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N 0.000 description 5
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 5
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 5
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 5
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 5
- 102100024263 CD160 antigen Human genes 0.000 description 4
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 4
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 4
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 4
- 108010050568 HLA-DM antigens Proteins 0.000 description 4
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 description 4
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 description 4
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 description 4
- 101000761938 Homo sapiens CD160 antigen Proteins 0.000 description 4
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 description 4
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 4
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 4
- 101800000324 Immunoglobulin A1 protease translocator Proteins 0.000 description 4
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 4
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 description 4
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 4
- 102100038929 V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1 Human genes 0.000 description 4
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 4
- 238000013135 deep learning Methods 0.000 description 4
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 4
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 4
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 4
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101150005585 E3 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150066038 E4 gene Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 3
- 102100028636 HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 4 chain Human genes 0.000 description 3
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 3
- 108010040960 HLA-DRB4 Chains Proteins 0.000 description 3
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 3
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 3
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 3
- 208000026651 T-cell prolymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 3
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 230000037437 driver mutation Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 3
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 3
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 3
- AWNBSWDIOCXWJW-WTOYTKOKSA-N (2r)-n-[(2s)-1-[[(2s)-1-(2-aminoethylamino)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-naphthalen-2-yl-1-oxopropan-2-yl]-n'-hydroxy-2-(2-methylpropyl)butanediamide Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(=O)NO)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCCN)=CC=C21 AWNBSWDIOCXWJW-WTOYTKOKSA-N 0.000 description 2
- DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N (2s,3s,4s,5r,6r)-6-[[(3s,4s,4ar,6ar,6bs,8r,8ar,12as,14ar,14br)-8a-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-[(3s,5s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@H]5CC(C)(C)CC[C@@]5([C@@H](C[C@@]4(C)[C@]3(C)CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)O)C(=O)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H]([C@@H]([C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@](O)(CO)CO3)O)[C@H](O)CO2)O)[C@H](C)O1)O)O)OC(=O)C[C@@H](O)C[C@H](OC(=O)C[C@@H](O)C[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](CO)O1)O)[C@@H](C)CC)C(O)=O)[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N 0.000 description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRQUFUKTQHISJB-YYADALCUSA-N 2-[(E)-N-[2-(4-chlorophenoxy)propoxy]-C-propylcarbonimidoyl]-3-hydroxy-5-(thian-3-yl)cyclohex-2-en-1-one Chemical compound CCC\C(=N/OCC(C)OC1=CC=C(Cl)C=C1)C1=C(O)CC(CC1=O)C1CCCSC1 KRQUFUKTQHISJB-YYADALCUSA-N 0.000 description 2
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 7-methylguanosine Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 0.000 description 2
- 108010024878 Adenovirus E1A Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100026882 Alpha-synuclein Human genes 0.000 description 2
- 241000272478 Aquila Species 0.000 description 2
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 description 2
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710185679 CD276 antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100021868 Calnexin Human genes 0.000 description 2
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 2
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 201000009182 Chikungunya Diseases 0.000 description 2
- 241001502567 Chikungunya virus Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 241000710945 Eastern equine encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 description 2
- 102100031351 Galectin-9 Human genes 0.000 description 2
- 101100229077 Gallus gallus GAL9 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100033079 HLA class II histocompatibility antigen, DM alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 102100031258 HLA class II histocompatibility antigen, DM beta chain Human genes 0.000 description 2
- 102100031547 HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 102100031546 HLA class II histocompatibility antigen, DO beta chain Human genes 0.000 description 2
- 102100029966 HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Human genes 0.000 description 2
- 102100031618 HLA class II histocompatibility antigen, DP beta 1 chain Human genes 0.000 description 2
- 102100036241 HLA class II histocompatibility antigen, DQ beta 1 chain Human genes 0.000 description 2
- 102100036117 HLA class II histocompatibility antigen, DQ beta 2 chain Human genes 0.000 description 2
- 102100040505 HLA class II histocompatibility antigen, DR alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 102100040482 HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 3 chain Human genes 0.000 description 2
- 102100040485 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain Human genes 0.000 description 2
- 102210042925 HLA-A*02:01 Human genes 0.000 description 2
- 108010093061 HLA-DPA1 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010045483 HLA-DPB1 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010086786 HLA-DQA1 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010081606 HLA-DQA2 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010065026 HLA-DQB1 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010067802 HLA-DR alpha-Chains Proteins 0.000 description 2
- 108010039343 HLA-DRB1 Chains Proteins 0.000 description 2
- 108010061311 HLA-DRB3 Chains Proteins 0.000 description 2
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 2
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 2
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 description 2
- 101000884279 Homo sapiens CD276 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000898052 Homo sapiens Calnexin Proteins 0.000 description 2
- 101000793651 Homo sapiens Calreticulin Proteins 0.000 description 2
- 101000866278 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Proteins 0.000 description 2
- 101000866281 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO beta chain Proteins 0.000 description 2
- 101000930799 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ beta 2 chain Proteins 0.000 description 2
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 description 2
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001117312 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000652359 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000649068 Homo sapiens Tapasin Proteins 0.000 description 2
- 101000955999 Homo sapiens V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000666896 Homo sapiens V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Proteins 0.000 description 2
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 2
- 102000002698 KIR Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010043610 KIR Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001372913 Maraba virus Species 0.000 description 2
- 108010061593 Member 14 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000011202 Member 2 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 2
- 108010023335 Member 2 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 2
- 101150039088 PDIA3 gene Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100037097 Protein disulfide-isomerase A3 Human genes 0.000 description 2
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 2
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 102100028082 Tapasin Human genes 0.000 description 2
- 102100028785 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Human genes 0.000 description 2
- 108010079206 V-Set Domain-Containing T-Cell Activation Inhibitor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100038282 V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Human genes 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 2
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 2
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 2
- IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N fluquinconazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1N1C(=O)C2=CC(F)=CC=C2N=C1N1C=NC=N1 IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 229940126546 immune checkpoint molecule Drugs 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 2
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 2
- 229950010550 resiquimod Drugs 0.000 description 2
- BXNMTOQRYBFHNZ-UHFFFAOYSA-N resiquimod Chemical compound C1=CC=CC2=C(N(C(COCC)=N3)CC(C)(C)O)C3=C(N)N=C21 BXNMTOQRYBFHNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- BNRNXUUZRGQAQC-UHFFFAOYSA-N sildenafil Chemical compound CCCC1=NN(C)C(C(N2)=O)=C1N=C2C(C(=CC=1)OCC)=CC=1S(=O)(=O)N1CCN(C)CC1 BNRNXUUZRGQAQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 2
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- ICLYJLBTOGPLMC-KVVVOXFISA-N (z)-octadec-9-enoate;tris(2-hydroxyethyl)azanium Chemical compound OCCN(CCO)CCO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ICLYJLBTOGPLMC-KVVVOXFISA-N 0.000 description 1
- MWRBNPKJOOWZPW-NYVOMTAGSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine zwitterion Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-NYVOMTAGSA-N 0.000 description 1
- IOJUJUOXKXMJNF-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxybenzoic acid [3-(nitrooxymethyl)phenyl] ester Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(=O)OC1=CC=CC(CO[N+]([O-])=O)=C1 IOJUJUOXKXMJNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002627 4-1BB Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 description 1
- XXJWYDDUDKYVKI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-fluoro-2-methyl-1H-indol-5-yl)oxy]-6-methoxy-7-[3-(1-pyrrolidinyl)propoxy]quinazoline Chemical compound COC1=CC2=C(OC=3C(=C4C=C(C)NC4=CC=3)F)N=CN=C2C=C1OCCCN1CCCC1 XXJWYDDUDKYVKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010087905 Adenovirus E1B Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102100035080 BDNF/NT-3 growth factors receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010009356 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p15 Proteins 0.000 description 1
- 102000009512 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p15 Human genes 0.000 description 1
- 108010009392 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p16 Proteins 0.000 description 1
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N DDT Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(C(Cl)(Cl)Cl)C1=CC=C(Cl)C=C1 YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101150082328 DRB5 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001061 Dunnett's test Methods 0.000 description 1
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241001125671 Eretmochelys imbricata Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 1
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100028640 HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 5 chain Human genes 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102210009883 HLA-B*07:02 Human genes 0.000 description 1
- 108010016996 HLA-DRB5 Chains Proteins 0.000 description 1
- 102100035108 High affinity nerve growth factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 101000596896 Homo sapiens BDNF/NT-3 growth factors receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000937544 Homo sapiens Beta-2-microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 101000596894 Homo sapiens High affinity nerve growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001043209 Homo sapiens Leukemia NUP98 fusion partner 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000686031 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Proteins 0.000 description 1
- 101000579425 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Proteins 0.000 description 1
- 101000800133 Homo sapiens Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 101150032643 IVa2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 239000002147 L01XE04 - Sunitinib Substances 0.000 description 1
- 239000003798 L01XE11 - Pazopanib Substances 0.000 description 1
- 101150075239 L1 gene Chemical group 0.000 description 1
- 101150027802 L2 gene Chemical group 0.000 description 1
- 101150084684 L3 gene Chemical group 0.000 description 1
- 101150007425 L4 gene Chemical group 0.000 description 1
- 108010013709 Leukocyte Common Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000017095 Leukocyte Common Antigens Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- GUVMFDICMFQHSZ-UHFFFAOYSA-N N-(1-aminoethenyl)-1-[4-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[hydroxy-[[3-[hydroxy-[[3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy]phosphinothioyl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy]phosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-[[[2-[[[2-[[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-2-[[[5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-2-[[hydroxy-[2-(hydroxymethyl)-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-3-yl]oxyphosphinothioyl]oxymethyl]oxolan-3-yl]oxy-hydroxyphosphinothioyl]oxymethyl]oxolan-3-yl]oxy-hydroxyphosphinothioyl]oxymethyl]-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-3-yl]oxy-hydroxyphosphinothioyl]oxymethyl]-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-3-yl]oxy-hydroxyphosphinothioyl]oxymethyl]oxolan-2-yl]-5-methylimidazole-4-carboxamide Chemical compound CC1=C(C(=O)NC(N)=C)N=CN1C1OC(COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CO)C(OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)O)C1 GUVMFDICMFQHSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010084333 N-palmitoyl-S-(2,3-bis(palmitoyloxy)propyl)cysteinyl-seryl-lysyl-lysyl-lysyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 102100029166 NT-3 growth factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 101100117569 Oryza sativa subsp. japonica DRB6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102100023347 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Human genes 0.000 description 1
- 102100028286 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Human genes 0.000 description 1
- 102000015097 RNA Splicing Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039259 RNA Splicing Factors Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-UHFFFAOYSA-N Taurocholic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)C1(C)C(O)C2 WBWWGRHZICKQGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 1
- SECKRCOLJRRGGV-UHFFFAOYSA-N Vardenafil Chemical compound CCCC1=NC(C)=C(C(N=2)=O)N1NC=2C(C(=CC=1)OCC)=CC=1S(=O)(=O)N1CCN(CC)CC1 SECKRCOLJRRGGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 108700015342 adenovirus terminal Proteins 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical class N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000014619 adult acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000947 anti-immunosuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 150000001767 cationic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229960002412 cediranib Drugs 0.000 description 1
- 229940047495 celebrex Drugs 0.000 description 1
- RZEKVGVHFLEQIL-UHFFFAOYSA-N celecoxib Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C1=CC(C(F)(F)F)=NN1C1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 RZEKVGVHFLEQIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229950009791 durvalumab Drugs 0.000 description 1
- 229940056913 eftilagimod alfa Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 229960002751 imiquimod Drugs 0.000 description 1
- DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N imiquimod Chemical compound C1=CC=CC2=C3N(CC(C)C)C=NC3=C(N)N=C21 DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000013546 insoluble monolayer Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 101150063421 l5 gene Chemical group 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007108 local immune response Effects 0.000 description 1
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 1
- 230000004777 loss-of-function mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000034778 micropinocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 1
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229960000639 pazopanib Drugs 0.000 description 1
- CUIHSIWYWATEQL-UHFFFAOYSA-N pazopanib Chemical compound C1=CC2=C(C)N(C)N=C2C=C1N(C)C(N=1)=CC=NC=1NC1=CC=C(C)C(S(N)(=O)=O)=C1 CUIHSIWYWATEQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 108010054442 polyalanine Proteins 0.000 description 1
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229960002816 potassium chloride Drugs 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012913 prioritisation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 108010038379 sargramostim Proteins 0.000 description 1
- 229960002530 sargramostim Drugs 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 229960003310 sildenafil Drugs 0.000 description 1
- 238000004557 single molecule detection Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 description 1
- 229960002668 sodium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000037436 splice-site mutation Effects 0.000 description 1
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960001796 sunitinib Drugs 0.000 description 1
- WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N sunitinib Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=C(C)NC(\C=C/2C3=CC(F)=CC=C3NC\2=O)=C1C WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 229960000835 tadalafil Drugs 0.000 description 1
- IEHKWSGCTWLXFU-IIBYNOLFSA-N tadalafil Chemical compound C1=C2OCOC2=CC([C@@H]2C3=C([C]4C=CC=CC4=N3)C[C@H]3N2C(=O)CN(C3=O)C)=C1 IEHKWSGCTWLXFU-IIBYNOLFSA-N 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-GIHLXUJPSA-N taurocholic acid Chemical compound C([C@@H]1C[C@H]2O)[C@@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@H](O)C1 WBWWGRHZICKQGZ-GIHLXUJPSA-N 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 229950007217 tremelimumab Drugs 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117013 triethanolamine oleate Drugs 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 108010064892 trkC Receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 229960002381 vardenafil Drugs 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
- 229940055760 yervoy Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00119—Melanoma antigens
- A61K39/001191—Melan-A/MART
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
- A61K39/001188—NY-ESO
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
- A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/605—MHC molecules or ligands thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/14011—Deltaretrovirus, e.g. bovine leukeamia virus
- C12N2740/14034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/14011—Filoviridae
- C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
- C12N2760/14134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
Abstract
Description
本出願は、EFS−Web経由で提出され、その全容を参照によって本明細書に援用する配列表を含む。20XX年XX月に作成された前記ASCIIコピーは、XXXXXUS_sequencelisting.txtと名前が付けられており、そのサイズはX,XXX,XXXバイトである。
(a)RNAアルファウイルス骨格であって、
(i)少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列と、
(ii)少なくとも1つのポリアデニル化(ポリ(A))配列と
を含む前記RNAアルファウイルス骨格;ならびに
(b)新生抗原カセットであって、
(i)対象内に存在する腫瘍に由来する、少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列であって、
(I)前記腫瘍に由来する、少なくとも1つの腫瘍特異的かつ対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列であって、
(A)コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有する、MHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
(B)任意で5’リンカー配列と、
(C)任意で3’リンカー配列と
を含む、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列と、
(ii)任意で、前記新生抗原コード核酸配列に機能的に連結された第2のプロモーターヌクレオチド配列と、
(iii)任意で、少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列と、
(iv)任意で、少なくとも1つのGPGPGリンカー配列(SEQ ID NO:56)と、
(v)任意で、前記アルファウイルスに対して天然のポリ(A)配列または外来性のポリ(A)配列である少なくとも1つの第2のポリ(A)配列と
を含む、前記新生抗原カセット。
(a)RNAアルファウイルス骨格であって、前記RNAアルファウイルス骨格がSEQ ID NO:6に記載の核酸配列を含み、前記RNAアルファウイルス骨格の配列が26Sプロモーターヌクレオチド配列及びポリ(A)配列を含み、前記26Sプロモーター配列が前記RNAアルファウイルス骨格に対して内在性のものであり、前記ポリ(A)配列が前記RNAアルファウイルス骨格に対して内在性のものである、前記RNAアルファウイルス骨格;ならびに
(b)前記26Sプロモーターヌクレオチド配列と前記ポリ(A)配列との間に組み込まれた新生抗原カセットであって、
(i)対象内に存在する腫瘍に由来する、少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列であって、
(I)互いに直鎖状に連結された、少なくとも10個の腫瘍特異的及び対象特異的MHCクラスI新生抗原コード核酸配列であって、それぞれが、
(A)コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応する核酸配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有し、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードする、MHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
(B)前記MHC Iエピトープの天然のN末端アミノ酸配列をコードし、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、5’リンカー配列と、
(C)前記MHC Iエピトープの天然のN末端酸配列をコードし、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、3’リンカー配列と、
を含む、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列
を含み、
ここで、前記新生抗原カセットが前記26Sプロモーターヌクレオチド配列と機能的に連結され、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸13〜25個の長さのポリペプチドをコードし、各MHCクラスI新生抗原コード核酸配列の各3’末端が、前記新生抗原カセット内の最後のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を除いて、それに続くMHCクラスI新生抗原コード核酸配列の5’末端に連結されている、
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列と、
(ii)少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列であって、
(I)PADRE MHCクラスII配列(SEQ ID NO:48)と、
(II)破傷風トキソイドMHCクラスII配列(SEQ ID NO:46)と、
(III)前記PADRE MHCクラスII配列と前記破傷風トキソイドMHCクラスII配列とを連結するGPGPGアミノ酸リンカー配列をコードする、第1の核酸配列と、
(IV)前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の5’末端と前記少なくとも20個の腫瘍特異的かつ対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列とを連結するGPGPGアミノ酸リンカー配列をコードする、第2の核酸配列と、
(V)任意で、前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の3’末端のGPGPGアミノ酸リンカー配列をコードする、第3の核酸配列と
を含む、前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列と
を含む、前記新生抗原カセット。
Pa−(L5b−Nc−L3d)X−(G5e−Uf)Y−G3g
を含む式で示され、式中、Pは、前記第2のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここで、a=0または1であり、Nは、前記MHCクラスIエピトープコード核酸配列のうちの1つを含み、ここで、c=1であり、L5は、前記5’リンカー配列を含み、ここで、b=0または1であり、L3は、前記3’リンカー配列を含み、ここで、d=0または1であり、G5は、GPGPGアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここで、e=0または1であり、G3は、GPGPGアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここで、g=0または1であり、Uは、前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列のうちの1つを含み、ここで、f=1であり、X=1〜400であり、ここで、各Xについて、対応するNcは、エピトープコード核酸配列であり、Y=0、1、または2であり、ここで、各Yについて、対応するUfは、抗原コード核酸配列である。いくつかの態様では、各Xについて、対応するNcは、異なるMHCクラスIエピトープコード核酸配列である。いくつかの態様では、各Yについて、対応するUfは、異なるMHCクラスII抗原コード核酸配列である。
式中、L1及びL2は、それぞれ独立して、−O(C=O)−、−(C=O)O−、−C(=O)−、−O−、−S(O)x−、−S−S−、−C(=O)S−、−SC(=O)−、−RaC(=O)−、−C(=O)Ra−、− RaC(=O)Ra−、−OC(=O)Ra−、−RaC(=O)O−、または直接的結合であり、G1は、Ci〜C2アルキレン、−(C=O)−、−O(C=O)−、−SC(=O)−、−RaC(=O)−、または直接的結合であり、−C(=O)−、−(C=O)O−、−C(=O)S−、−C(=O)Ra−、または直接的結合であり、Gは、Ci〜C6アルキレンであり、Raは、HまたはC1〜C12アルキルであり、R1a及びR1bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R1aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R1bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR1b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R2a及びR2bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R2aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R2bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR2b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R3a及びR3bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R3aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R3bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R4a及びR4bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R4aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R4bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR4b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R5及びR6は、それぞれ独立してHまたはメチルであり、R7は、C4〜C20アルキルであり、R8及びR9は、それぞれ独立してC1〜C12アルキルであるか、またはR8及びR9は、それらが結合する窒素原子と共に、5、6、または7員の複素環を形成し、a、b、c、及びdは、それぞれ独立して1〜24の整数であり、xは0、1、または2である。
式中、L1及びL2は、それぞれ独立して−O(C=O)−、−(C=O)O−、または炭素−炭素二重結合であり、R1a及びR1bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R1aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R1bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR1b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R2a及びR2bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R2aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R2bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR2b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R3a及びR3bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R3aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R3bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR3b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R4a及びR4bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R4aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R4bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR4b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R5及びR6は、それぞれ独立してHまたはメチルであり、R7は、各出現時に、独立してHまたはC1〜C12アルキルであり、R8及びR9は、それぞれ独立して、非置換のC1〜C12アルキルであるか、またはR8及びR9は、それらが結合する窒素原子と共に、1個の窒素原子を含む5、6、または7員の複素環を形成し、a及びdは、それぞれ独立して0〜24の整数であり、b及びcはそれぞれ独立して1〜24の整数であり、eは1または2であり、ただし、R1a、R2a、R3a、もしくはR4aのうちの少なくとも1つが、C1〜C12アルキルであるか、またはL1もしくはL2の少なくとも一方が、−O(C=O)−もしくは−(C=O)O−であり、R1a及びR1bは、aが6である場合にはイソプロピルでなく、aが8である場合にはn−ブチルでない。
式中、R10及びR11は、それぞれ独立して、10〜30個の炭素原子を含む、直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は任意で1つ以上のエステル結合によって中断され、zは、30〜60の範囲の平均値を有する。いくつかの態様では、R10及びR11は、それぞれ独立して、12〜16個の炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル鎖である。いくつかの態様では、平均zは、約45である。
ここから開始
I.定義
一般に、特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、当業者により理解される通常の意味を有するものとして解釈されるものとする。特定の用語を、さらなる明確性を与えるために下記に定義する。通常の意味と与えられる定義との間に矛盾が存在する場合、与えられる定義が用いられるものとする。
本明細書では、腫瘍細胞、または樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞を含む免疫細胞表面上に提示される可能性が高い、及び/または免疫原性を有する可能性が高い、対象の腫瘍由来の新生抗原を特定するための方法を開示する。例として、かかる1つの方法は、対象の腫瘍細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを得る工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータを用いて新生抗原のセットの各々のペプチド配列を表すデータが取得され、各新生抗原のペプチド配列が、ペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を含む、工程と、対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって、または腫瘍内に存在する細胞によって新生抗原の各々が提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を、1つ以上の提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されている、工程と、選択された新生抗原のセットを生成するために、前記新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と、を含む方法を開示する。
また、ある特定の変異(例えば、がん細胞中に存在する変異またはアレル)の特定のための方法も、本明細書に開示する。特に、これらの変異は、がんを有する対象のがん細胞のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはエクソーム中に存在し得るが、対象由来の正常組織には存在し得ない。
新生抗原は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、新生抗原は、ポリペプチド配列をコードするRNA配列であることができる。ワクチンにおいて有用な新生抗原は、したがって、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むことができる。
また、特異的な免疫応答、例えば、腫瘍特異的な免疫応答を生じることができる免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も、本明細書に開示する。ワクチン組成物は、典型的に、例えば、本明細書に記載した方法を用いて選択された多数の新生抗原を含む。ワクチン組成物はまた、ワクチンと呼ぶこともできる。
1つ以上の新生抗原の選択に用いられる方法、「カセット」のクローニング及び構築、ならびにウイルスベクターへのその挿入は本明細書に与えられる教示を考慮すれば当該技術分野の範囲内である。「新生抗原カセット」とは、選択された新生抗原または複数の新生抗原と、ネオアンチゲン(複数可)を転写し、転写産物を発現するために必要とされる他の調節エレメントとの組み合わせを意味する。新生抗原または複数の新生抗原は、転写を可能とするような形で調節要素と機能的に連結することができる。かかる要素としては、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞内で新生抗原(複数可)の発現を推進することができる従来の調節エレメントが挙げられる。したがって、新生抗原カセットは、新生抗原(複数可)に連結され、組換えベクターの選択されたウイルス配列内に他の任意選択的な調節エレメントとともに配置された選択されたプロモーターも含むことができる。
(Pa−(L5b−Nc−L3d)X)Z−(P2h−(G5e−Uf)Y)W−G3g
を用いて記述することができる。式中、P及びP2は、プロモーターヌクレオチド配列を含み、Nは、MHCクラスIエピトープコード核酸配列を含み、L5は、5’リンカー配列を含み、L3は、3’リンカー配列を含み、G5は、アミノ酸リンカーをコードする核酸配列を含み、G3は、アミノ酸リンカーをコードする少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、Uは、MHCクラスII抗原コード核酸配列を含み、ここで、各Xについて、対応するNcは、エピトープコード核酸配列であり、各Yについて、対応するUfは、抗原コード核酸配列である。組成物及び順序付けられた配列は、存在する要素の数を選択することによってさらに定義することができ、例えば、a=0または1である場合、b=0または1である場合、c=1である場合、d=0または1である場合、e=0または1である場合、f=1である場合、g=0または1である場合、h=0または1である場合、X=1〜400であり、Y=0、1、2、3、4または5であり、Z=1〜400であり、かつW=0、1、2、3、4または5である。
本明細書に記載されるベクター、例えば本明細書に記載されるC68ベクター、または本明細書に記載されるアルファウイルスベクターは少なくとも1つの新生抗原をコードする核酸を含むことができ、また、同じまたは別のベクターが、免疫チェックポイント分子に結合してその活性を遮断する少なくとも1つの免疫調節因子(例えばscFvなどの抗体)をコードする核酸を含むことができる。ベクターは、新生抗原と、チェックポイント阻害剤をコードする1つ以上の核酸分子とを含むことができる。
V.C.1.すべての腫瘍サブクローンをカバーするペプチドのセットの決定
すべてのまたは大部分の腫瘍サブクローンによって提示されるものを意味するトランカルペプチド(truncal peptide)が、ワクチン中への包含について優先される53。任意で、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドがない場合、または、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドの数が、追加的な非トランカルペプチドをワクチンに含めることができるほど少ない場合には、腫瘍サブクローンの数及び同一性を推定すること、及びワクチンによってカバーされる腫瘍サブクローンの数を最大化するようにペプチドを選ぶことによって、さらなるペプチドを優先順位付けすることができる54。
上記の新生抗原フィルターのすべてを適用した後、ワクチン技術が対応できるよりも多くの候補新生抗原が、依然としてワクチン包含に利用可能である可能性がある。追加的に、新生抗原解析の種々の態様についての不確定度が残っている可能性があり、候補ワクチン新生抗原の様々な性状の間にトレードオフが存在する可能性がある。したがって、選択プロセスの各段階でのあらかじめ決定されたフィルターの代わりに、少なくとも以下の軸を有する空間に候補新生抗原を置き、積分アプローチを用いて選択を最適化する、積分多次元モデルを考えることができる。
1. 自己免疫または寛容のリスク(生殖細胞系列のリスク)(より低い自己免疫のリスクが、典型的に好ましい)
2. シークエンシングアーチファクトの確率(より低いアーチファクトの確率が、典型的に好ましい)
3. 免疫原性の確率(より高い免疫原性の確率が、典型的に好ましい)
4. 提示の確率(より高い提示の確率が、典型的に好ましい)
5. 遺伝子発現(より高い発現が、典型的に好ましい)
6. HLA遺伝子のカバレッジ(新生抗原のセットの提示に関与する、より多い数のHLA分子は、腫瘍が、HLA分子の下方制御または変異を介して免疫攻撃を回避するであろう確率を低くする可能性がある)
7.HLAクラスのカバレッジ(HLA−I及びHLA−IIの両方をカバーすることで、治療応答の確率が高まり、腫瘍の免疫回避の確率が低くなる可能性がある)
V.D.1.アルファウイルスの生物学
アルファウイルスは、トガウイルス科のメンバーであり、一本鎖プラス鎖RNAウイルスである。アルファウイルスは、自己複製型RNAまたはsrRNAと呼ぶこともできる。メンバーは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモルガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株TC−83などの新世界型に分類される(Strauss Microbrial Review 1994)。天然のアルファウイルスゲノムは、通常、長さ約12kbであり、その最初の2/3は、ウイルスゲノムを自己複製するためのRNA複製複合体を形成する非構造タンパク質(nsP)をコードする遺伝子を含んでおり、最後の1/3は、ビリオンを産生するための構造タンパク質をコードするサブゲノム発現カセットを含んでいる(Frolov RNA 2001)。
アルファウイルスは、発現ベクター系として使用するために従来、遺伝子操作がなされている(Pushko 1997,Rheme 2004)。アルファウイルスは、異種抗原の発現が望ましい場合があるワクチン設定においていくつかの長所を有する。アルファウイルスは、宿主のサイトゾル中で自己複製するその能力のため、細胞内の発現カセットの高いコピー数を一般的に得ることができることから、高いレベルの異種抗原の産生を実現することができる。さらに、ベクターは一般的に一過性であるため、バイオセーフティーが高く、ベクターに対する免疫寛容の誘導は低い。また、一般公衆は、一般的にヒトアデノウイルスのような他の標準的ウイルスベクターと比較してアルファウイルスに対する既存の免疫を有していない。アルファウイルスに基づくベクターはまた、感染細胞に対する細胞毒性反応を一般的に生じる。細胞毒性は、発現された異種抗原に対して免疫応答を適性に誘発するためにワクチン設定においてある程度の重要性を有しうる。しかしながら、所望の細胞毒性の程度はバランスの問題であり、そのため、VEEのTC−83株をはじめとするいくつかの弱毒化されたアルファウイルスが開発されている。したがって、本明細書に記載される新生抗原発現ベクターの一例では、高いレベルの新生抗原発現を可能とし、新生抗原に対する強い免疫応答を誘発し、ベクター自体に対する免疫応答は誘発せず、安全に使用することができるアルファウイルス骨格を用いることができる。さらに、新生抗原発現カセットは、ベクターが、VEEまたはその弱毒化誘導株TC−83に由来する配列を含む(ただしこれらに限定されない)どのアルファウイルス配列を用いるかを最適化することを通じて異なるレベルの免疫応答を誘発するように設計することができる。
アルファウイルス送達ベクターは、一般的に、プラス鎖のRNAポリヌクレオチドである。RNA生成のための当該技術分野では周知の従来の方法として、インビトロ翻訳IVTがある。この方法では、所望のベクターのDNA鋳型が、クローニング、制限消化、ライゲーション、遺伝子合成、及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの標準的な分子生物学的方法を含む当該技術分野では周知の方法によって最初に生成される。このDNA鋳型は、RNAに転写されることが望ましい配列の5’末端にRNAポリメラーゼのプロモーターを有している。プロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、T3、T7、またはSP6などのバクテリオファージポリメラーゼのプロモーターが挙げられる。次に、DNA鋳型は、適当なRNAポリメラーゼ酵素、バッファー剤、及びヌクレオチド(NTP)とインキュベートされる。得られたRNAポリヌクレオチドは、7−メチルグアノシンまたは関連する構造などの5’キャップ構造の付加、及び任意でポリアデニル化(ポリA)テールを有するように3’末端を改変することを含む(ただしこれらに限定されない)方法によって、任意でさらに改変することができる。次に、RNAをフェノールクロロホルム抽出などの当該技術分野では周知の方法を用いて精製することができる。
ワクチンベクターの設計において考慮すべき重要な側面の1つとして、ベクター自体に対する免疫がある(Riley 2017)。これは、例えば特定のヒトアデノウイルス系などのベクター自体に対する既存の免疫の形である場合もあり、またはワクチンの投与後に生じるベクターに対する免疫の形である場合もある。後者は、例えば別々のプライミング及びブースター投与のように同じワクチンの複数回の投与が行われる場合、または異なる新生抗原カセットを送達するために同じワクチンベクターシステムが用いられるような場合に重要な考慮事項となる。
V.E.1.チンパンジーアデノウイルスによるウイルス送達
チンパンジー由来のアデノウイルスヌクレオチド配列、各種の新規ベクター、及びチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を与えることによって1種類以上の新生抗原を送達する(例えば新生抗原カセットにより)ためのワクチン組成物を調製することができる。チンパンジーC68アデノウイルス(本明細書ではChAdV68とも呼ぶ)のヌクレオチド配列を、新生抗原を送達するためのワクチン組成物中に使用することができる(SEQ ID NO:1を参照)。C68アデノウイルス由来ベクターの使用については米国特許第6,083,716号にさらに詳細に記載されており、当該特許の全容をあらゆる目的で参照によって本明細書に援用する。
本明細書に記載される遺伝子のいずれかにおいて欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルス(Ad)を作製するため、欠失させた遺伝子領域の機能(ウイルスの複製及び感染性に不可欠である場合)をヘルパーウイルスまたは細胞株(すなわち、相補性またはパッケージング細胞株)によって組換えウイルスに供給することができる。例えば、複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを作製するには、ヒトまたはチンパンジーアデノウイルスのE1遺伝子産物を発現する細胞株を使用することができ、そのような細胞株にはHEK293またはその変異体が含まれうる。チンパンジーE1遺伝子を発現する細胞株の作製のプロトコール(米国特許第6,083,716号の実施例3及び4)にしたがって任意の選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を作製することができる。
本明細書に開示される組成物は、少なくとも1種類の新生抗原を細胞に送達するウイルスベクターを含むことができる。かかるベクターは、C68のようなチンパンジーアデノウイルスDNA配列と、カセットを直接発現するための調節配列に機能的に連結された新生抗原カセットとを含む。C68ベクターは、感染した哺乳動物細胞内でカセットを発現することが可能である。C68ベクターは1つ以上のウイルス遺伝子に機能的欠失を有することができる。新生抗原カセットは、プロモーターなどの1つ以上の調節配列の制御下にある少なくとも1つの新生抗原を含む。任意選択的なヘルパーウイルス及び/またはパッケージング細胞株によって、チンパンジーウイルスベクターに、欠失させたアデノウイルス遺伝子の任意の必要な産物を供給することができる。
本発明において有用なチンパンジーアデノウイルスC68ベクターには、組換え欠損アデノウイルス、すなわち、E1aまたはE1b遺伝子に機能的欠失を有し、任意で例えば温度感受性変異または他の遺伝子における欠失などの他の変異を有するチンパンジーアデノウイルス配列が含まれる。これらのチンパンジー配列は、他のアデノウイルス及び/またはアデノ随伴ウイルス配列からハイブリッドベクターを形成するうえでも有用であると予想される。ヒトアデノウイルスから調製された同種アデノウイルスベクターについては、刊行文献に記載されている[例えば、上記に引用のKozarsky I及びII、ならびに同文献に引用された参照文献、米国特許第5,240,846号を参照]。
最小チンパンジーAd C68ウイルスとしては、複製及びビリオンのカプシド形成に必要なアデノウイルスのシスエレメントのみを含むウイルス粒子がある。すなわち、このベクターは、アデノウイルスのシス作用性の5’及び3’の末端逆位繰り返し配列(ITR)(複製起点として機能する)と、天然の5’パッケージング/エンハンサードメイン(直鎖状のAdのゲノム及びE1プロモーターのエンハンサーエレメントをパッケージングするために必要な配列を含む)とを含む。例えば、国際出願第WO96/13597号において「最小」ヒトAdベクターの調製について述べられ、本明細書に参照によって援用する方法を参照されたい。
組換え複製不全アデノウイルスは、最小チンパンジーアデノウイルス配列以上のものを含んでもよい。これらの他のAdベクターは、ウイルスの遺伝子領域の異なる部分の欠失、ならびに、必要に応じたヘルパーウイルス及び/またはパッケージング細胞株の使用によって形成される感染性ウイルス粒子によって特徴づけることができる。
新生抗原カセットを送達するために用いられるウイルスベクターのチンパンジーアデノウイルス遺伝子の含量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非複製ウイルスフラグメントを用いて、カセットを含む感染性の組換えウイルス粒子を生成するのに充分なチンパンジーアデノウイルス遺伝子配列を与えることができる。
アデノウイルス、新生抗原カセット、及び他のベクター因子の選択されたDNA配列の様々な中間プラスミド及びシャトルベクターへのアセンブリ、ならびに組換えウイルス粒子を作製するためのプラスミド及びシャトルベクターの使用は、従来の手法を用いてすべて実現することができる。かかる手法としては、従来のcDNAのクローニング法、インビトロ組換え法(例えば、ギブソンアセンブリ)、アデノウイルスゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を与える任意の適当な方法が挙げられる。標準的なトランスフェクション及び同時トランスフェクションの手法、例えば、CaPO4沈殿法またはリポフェクタミンなどのリポソーム媒介トランスフェクション法が用いられる。用いられる他の従来の方法としては、ウイルスゲノムの相同組み換え、アガーオーバーレイ中でのウイルスのプラーク形成、シグナル発生測定の方法などが挙げられる。
したがって、新生抗原カセットを含む得られた組換えチンパンジーC68アデノウイルス(上記に述べたように、アデノウイルスベクターとヘルパーウイルスとの協同、またはアデノウイルスベクターとパッケージング細胞株との協同により作製される)は、新生抗原(複数可)をインビボまたはエクスビボで対象に送達することができる効率的な遺伝子導入担体を与えるものである。
本明細書に開示する方法を用いて特定された複数の新生抗原などの1つ以上の新生抗原を対象に投与することにより、対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導し、腫瘍に対するワクチン接種を行い、対象のがんの症状を治療及び/または緩和する方法も提供される。
ワクチン接種プロトコールを用いて対象に1つ以上の新生抗原を投与することができる。プライミングワクチン及びブースターワクチンを用いて対象への投与を行うことができる。プライミングワクチンは、C68(例えば、SEQ ID NO:1または2に示される配列)またはsrRNA(例えば、SEQ ID NO:3または4に示される配列)に基づいたものとすることができ、ブースターワクチンは、C68(例えば、SEQ ID NO:1または2に示される配列)またはsrRNA(例えば、SEQ ID NO:3または4に示される配列)に基づいたものとすることができる。各ベクターは、通常、新生抗原を含むカセットを含んでいる。カセットは、各抗原を通常取り囲む天然の配列、またはAAYなどの他の非天然のスペーサー配列などのスペーサーによって分離された約20個の新生抗原を含むことができる。カセットは、破傷風トキソイド抗原などのMHCII抗原、及びユニバーサルなクラスII抗原とみなされるPADRE抗原を含んでもよい。カセットは、ユビキチンターゲティング配列などのターゲティング配列を含んでもよい。さらに、各ワクチン用量は、チェックポイント阻害剤(CPI)と組み合わせて(例えば、同時、その前、またはその後で)対象に投与することができる。CPIは、抗体またはその抗原結合部分など、CTLA4、PD1、及び/またはPDL1を阻害するものを含むことができる。かかる抗体としては、トレメリムマブまたはデュルバルマブを挙げることができる。
VIII.A.新生抗原候補の特定
腫瘍及び正常のエクソーム及びトランスクリプトームのNGS解析のための研究法を、新生抗原の特定のスペースに記載し、適用している6,14,15。下記の例は、臨床設定における新生抗原の特定について、より大きな感度及び特異性のためのある特定の最適化を考慮している。これらの最適化は、実験室プロセスに関連するもの及びNGSデータ解析に関連するものの、2つの区域にグループ化することができる。
本明細書に提示したプロセスの改善は、標的とされるがんパネルにおける信頼できるがんドライバー遺伝子の評価について開発された概念16を、新生抗原の特定のために必要な全エクソーム設定及び全トランスクリプトーム設定に拡大することによって、低い腫瘍含量及び少ない体積の臨床標本からの高精度の新生抗原の発見における難題に対処する。具体的には、これらの改善は、以下を含む:
1.低い腫瘍含量またはサブクローン状態のいずれかにより、低い変異体アレル頻度で存在する変異を検出するための、腫瘍エクソームにわたる深い(500xよりも大きい)固有の平均カバレッジのターゲティング。
2.可能性のある新生抗原の見逃しが最も少ないように、100x未満でカバーされる塩基が5%未満である、例として、
a. 個々のプローブQCを有するDNAベースの捕捉プローブの使用17
b.十分にカバーされていない領域についての追加的なベイトの包含
3.可能性のある新生抗原が体細胞性/生殖細胞系列ステータスについて分類されていないままである(したがってTSNAとして使用可能ではない)ことが最も少ないように、20x未満でカバーされる塩基が5%未満である、正常エクソームにわたる均一カバレッジのターゲティング。
4.必要とされるシークエンシングの総量を最小化するために、配列捕捉プローブは、非コードRNAは新生抗原を生じることができないことから、遺伝子のコード領域のみについて設計される。追加的な最適化は、以下を含む:
a.GCリッチであり、標準的なエクソームシークエンシングでは十分に捕捉されないHLA遺伝子についての補充的プローブ18。
b.不十分な発現、プロテアソームによる最適に満たない消化、または異例の配列特性などの要因により、候補新生抗原を少ししかまたは全く生成しないと予測される遺伝子の排除。
5.変異検出、遺伝子及びスプライス変異体(「アイソフォーム」)発現の定量、ならびに融合物検出を可能にするために、腫瘍RNAが同様に、高深度(100Mリードよりも大きい)でシークエンシングされる。FFPE試料由来のRNAは、DNAにおいてエクソームを捕捉するために使用されるのと同じまたは類似したプローブで、プローブベース濃縮19を用いて抽出される。
解析法の改善は、一般的な研究変異コーリングアプローチの最適に満たない感度及び特異性に対処し、具体的には、臨床設定における新生抗原の特定のために関連するカスタマイズ化を考慮する。これらは、以下を含む:
1.アラインメントのための、HG38参照ヒトゲノムまたはより後のバージョンの使用(それが、以前のゲノムリリースとは対照的に、集団多型をより良好に反映する複数のMHC領域アセンブリーを含有するため)。
2.様々なプログラム5からの結果をマージすることによる、単一変異コーラー20の限界の克服。
a.単一ヌクレオチド変異及び挿入欠失は、以下を含む一連のツールで、腫瘍DNA、腫瘍RNA、及び正常DNAから検出される:Strelka21及びMutect22などの、腫瘍及び正常DNAの比較に基づくプログラム;ならびに、低純度の試料において特に有利である23、UNCeqRなどの、腫瘍DNA、腫瘍RNA、及び正常DNAを組み入れるプログラム。
b.挿入欠失は、Strelka及びABRA24などの、局所リアセンブリーを行うプログラムで決定される。
c.構造的再編成は、Pindel25またはBreakseq26などの専用のツールを用いて決定される。
3.試料スワップを検出して阻止するために、同じ患者についての試料由来の変異コールが、選ばれた数の多型部位で比較される。
4.例として、以下による、人工的コールの広範囲のフィルタリングが行われる:
a.潜在的に、低いカバレッジの例においては緩やかな検出パラメータで、及び挿入欠失の例においては許容的な近接基準での、正常DNAにおいて見出される変異の除去。
b.低いマッピング品質または低い塩基品質による変異の除去27。
c.たとえ対応する正常において観察されないとしても、再出現するシークエンシングアーチファクトから生じる変異の除去27。例は、主として1本の鎖上に検出される変異を含む。
d.無関連の対照のセットにおいて検出される変異の除去27。
5.seq2HLA28、ATHLATES29、またはOptitypeのうちの1つを使用する、かつまた、エクソーム及びRNAシークエンシングデータを組み合わせる28、正常エクソームからの正確なHLAコーリング。追加的な潜在的最適化は、ロングリードDNAシークエンシングなどの、HLAタイピングのための専用アッセイの採用30、または、RNA断片を連結して連続性を保持するための方法の適応31を含む。
6.腫瘍特異的スプライス変異体から生じた新生ORFの堅牢な検出は、CLASS32、Bayesembler33、StringTie34、またはそのリファレンスガイドモードにおける類似したプログラム(すなわち、各実験からそれらの全体の転写産物を再作製するように試みるよりもむしろ、公知の転写産物構造を用いる)を用いて、RNA−seqデータから転写産物をアセンブルすることによって、行われる。Cufflinks35が、この目的で一般的に使用されるが、それは頻繁に、信じ難いほど多数のスプライス変異体を産生し、それらの多くは、完全長遺伝子よりもはるかに短く、単純な陽性対照をリカバーすることができない場合がある。コード配列及び潜在的なナンセンス変異依存分解機構は、変異体配列を再導入した、SpliceR36及びMAMBA37などのツールで決定される。遺伝子発現は、Cufflinks35またはExpress(Roberts and Pachter,2013)などのツールで決定される。野生型及び変異体特異的な発現カウント及び/または相対レベルは、ASE38またはHTSeq39などの、これらの目的で開発されたツールで決定される。潜在的なフィルタリング段階は、以下を含む:
a.不十分に発現されていると考えられる候補新生ORFの除去。
b.ナンセンス変異依存分解機構(NMD)を引き起こすと予測される候補新生ORFの除去。
7.腫瘍特異的と直接検証することができない、RNAにおいてのみ観察される候補新生抗原(例えば、新生ORF)は、例として以下を考慮することにより、追加的なパラメータにしたがって、腫瘍特異的である可能性が高いとして分類される:
a.腫瘍DNAのみのシス作用性フレームシフトまたはスプライス部位変異の支持の存在。
b.スプライシング因子における腫瘍DNAのみのトランス作用性変異の確証の存在。例として、R625変異体SF3B1での3つの独立して公開された実験において、最も差次的にスプライシングを呈する遺伝子は、1つの実験がブドウ膜黒色腫患者を検討し40、第2の実験がブドウ膜黒色腫細胞株を検討し41、及び第3の実験が乳がん患者を検討した42にもかかわらず、一致していた。
c.新規のスプライシングアイソフォームについては、RNASeqデータにおける「新規の」スプライス−ジャンクションリードの確証の存在。
d.新規の再編成については、正常DNAには存在しない腫瘍DNAにおけるエクソン近傍リードの確証の存在。
e.GTEx43などの遺伝子発現大要からの欠如(すなわち、生殖細胞系列起源の可能性をより低くする)。
8.アラインメント及びアノテーションベースのエラー及びアーチファクトを直接避けるために、アセンブルされたDNAの腫瘍及び正常リード(またはそのようなリード由来のkマー)を比較することによる、参照ゲノムアラインメントベースの解析の補完(例えば、生殖細胞系列変異またはリピートコンテクスト挿入欠失の近くに生じる体細胞性変異について)。
HLAペプチド分子の単離は、組織試料の溶解及び可溶化後に、古典的な免疫沈降(IP)法を用いて行った(55〜58)。清澄化した溶解物を、HLA特異的IPに使用した。
免疫沈降は、ビーズに共有結合されていない抗体を用いて行うこともできる。一般的に、これは、抗体をカラムに保持するためにProteinA及び/またはProteinGでコーティングしたセファロースまたは磁気ビーズを使用して行われる。MHC/ペプチド複合体を選択的に濃縮するために使用することができるいくつかの抗体を下記に示す。
ペプチドYVYVADVAAKを用いて、何が検出の限界かを、LCカラム上にロードした様々な量のペプチドを用いて決定した。試験したペプチドの量は、1pmol、100fmol、10fmol、1fmol、及び100amolであった。(表1)結果を図1Fに示す。これらの結果は、検出の最低限界(LoD)がアトモルの範囲(10−18)にあること、ダイナミックレンジが5桁に及ぶこと、及び、シグナル対ノイズが、低いフェムトモル範囲(10−15)でシークエンシングに十分であるように見えることを示す。
IX.A.システムの概要
図2Aは、1つの実施形態にしたがう、患者におけるペプチド提示の尤度を特定するための環境100の概要である。環境100は、それ自体が提示情報記憶装置165を含む提示特定システム160を導入するコンテクストを提供する。
図2は、1つの実施形態にしたがう、提示情報を取得する方法を説明する。提示情報165は、2つの一般的部類の情報:アレル相互作用情報及びアレル非相互作用情報を含む。アレル相互作用情報は、MHCアレルのタイプに依存する、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。アレル非相互作用情報は、MHCアレルのタイプに非依存的な、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。
アレル相互作用情報は、主として、ヒト、マウスなど由来の1つ以上の特定されたMHC分子によって提示されていることが公知である、特定されたペプチド配列を含む。注目すべきことに、これは、腫瘍試料から取得されたデータを含んでもよく、または含まなくてもよい。提示されたペプチド配列は、単一のMHCアレルを発現する細胞から特定されてもよい。この例において、提示されたペプチド配列は、概して、あらかじめ決定されたMHCアレルを発現するように操作されてその後合成タンパク質に曝露された単一アレル細胞株から収集される。MHCアレル上に提示されたペプチドは、酸溶出などの技法によって単離され、質量分析により特定される。図2Bは、あらかじめ決定されたMHCアレルHLA−A*01:01上に提示された例示的なペプチドYEMFNDKSが単離され、質量分析により特定される、この例を示す。図2Dは、この別の例を示し、あらかじめ決定されたMHCアレルHLA−DRB1*12:01上に提示された例示的ペプチド
が単離され、質量分析によって特定されている。これらの状況においては、ペプチドが、単一のあらかじめ決定されたMHCタンパク質を発現するように操作された細胞を通して特定されるため、提示されたペプチドとそれが結合したMHCタンパク質との間の直接の関連が、決定的に既知である。
が、特定されたMHCアレルHLA−A*01:01、HLA−A*02:01、HLA−B*07:02、HLA−B*08:01、HLA−C*01:03、及びHLA−C*01:04上に提示されており、単離され、質量分析により特定される、この例を示す。別の例において、図2Cは、6種類の例示的なペプチド
が、特定されたクラスI MHCアレルHLA−A*01:01、HLA−A*02:01、HLA−B*07:02、HLA−B*08:01、及びクラスII MHCアレルHLA−DRB1*10:01、HLA−DRB1:11:01上に提示され、単離され、質量分析によって特定される場合を示している。単一アレル細胞株とは対照的に、これらの例においては、結合したペプチドが、特定される前のMHC分子から単離されるため、提示されたペプチドとそれが結合したMHCタンパク質との間の直接の関連は、未知である可能性がある。
とクラスIIアレルHLA−DRB1:11:01との間の結合親和性予測値を含み得る。
アレル非相互作用情報は、その由来源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するC末端配列を含むことができる。MHC−Iでは、C末端フランキング配列は、ペプチドのプロテアソームプロセシングに影響を及ぼし得る。しかし、C末端フランキング配列は、ペプチドが小胞体に輸送され、細胞の表面上のMHCアレルと遭遇する前に、プロテアソームによってペプチドから切断される。その結果、MHC分子は、C末端フランキング配列についてのいかなる情報も受け取らず、したがって、C末端フランキング配列の効果は、MHCアレルタイプに応じて変動することができない。例えば、図2Cに示した例に戻ると、提示情報165は、ペプチドの由来源タンパク質から特定された、提示されたペプチド
のC末端フランキング配列FOEIFNDKSLDKFJIを含み得る。
i.EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異。
ii.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOB、HLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)におけるもの。その提示が、腫瘍において機能喪失変異の影響下にある抗原提示マシナリーの構成要素に依拠するペプチドは、提示の確率が低減している。
i.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOB、HLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)におけるもの。
図3は、1つの実施形態による、提示特定システム160のコンピュータ論理構成要素を説明する、ハイレベルブロック図である。この例示的実施形態において、提示特定システム160は、データ管理モジュール312、コード化モジュール314、訓練モジュール316、及び予測モジュール320を含む。提示特定システム160はまた、訓練データ記憶装置170及び提示モデル記憶装置175から構成される。モデル管理システム160のいくつかの実施形態は、本明細書に記載したものとは異なるモジュールを有する。同様に、機能は、本明細書に記載したものは異なる様式で、モジュールの間に分配され得る。
データ管理モジュール312は、提示情報165から訓練データ170のセットを生成する。各々の訓練データのセットは、多数のデータ例を含有し、各データ例iは、少なくとも、提示されるかまたは提示されないペプチド配列piと、ペプチド配列piと結合した1つ以上の関連するMHCアレルaiと、提示特定システム160が、独立変数の新たな値を予測することに関心があるという情報を表す従属変数yiとを含む、独立変数ziのセットを含有する。
からのペプチド提示情報を示す。訓練データ170A中の4番目のデータ例は、アレルHLA−B*07:02、HLA−C*01:03、HLA−A*01:01を含む複数アレル細胞株、及びペプチド配列QIEJOEIJEからのペプチド情報を示す。最初のデータ例は、ペプチド配列QCEIOWAREが、アレルHLA−C*01:03によって提示されなかったことを示す。前の2つの段落において議論したように、ペプチド配列は、データ管理モジュール312によってランダムに生成されてもよく、または提示されるペプチドの由来源タンパク質から特定されてもよい。訓練データ170Aはまた、ペプチド配列−アレルペアについて、1000nMの結合親和性予測値及び1時間の半減期の安定性予測値も含む。訓練データ170Aはまた、ペプチド
のC末端フランキング配列、及び102TPMのmRNA定量測定値などの、アレル非相互作用変数も含む。4番目のデータ例は、ペプチド配列QIEJOEIJE が、アレルHLA−B*07:02、HLA−C*01:03、またはHLA−A*01:01のうちの1つによって提示されたことを示す。訓練データ170Aはまた、アレルの各々についての結合親和性予測値及び安定性予測値、ならびに、ペプチドのC末端フランキング配列及びペプチドについてのmRNA定量測定値も含む。
を含む、単一アレル細胞株からのペプチド提示情報を示す。1番目のデータ例は、ペプチド配列
がアレルHLA−DRB3:01:01によって提示されなかったことを示す。
コード化モジュール314は、訓練データ170に含有される情報を、1つ以上の提示モデルを生成するために使用することができる数値的表示へとコード化する。一実現形態では、コード化モジュール314は、配列(例えば、ペプチド配列またはC末端隣接配列)を、あらかじめ決定された20文字のアミノ酸アルファベットについて、ワン・ホットでコード化する。具体的には、ki個のアミノ酸を有するペプチド配列piは、20・ki要素の行ベクトルとして表され、ペプチド配列のj番目の位置のアミノ酸のアルファベットに対応するpi 20・(j−1)+1,pi 20・(j−1)+2,...,pi 20・jの中の単一要素は、1の値を有する。その以外の、残りの要素は、0の値を有する。例として、所定のアルファベット{A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y}について、データ例iの3個のアミノ酸のペプチド配列EAFは、60個の要素の行ベクトル
によって表され得る。C末端隣接配列ci、ならびに、MHCアレルについてのタンパク質配列dh、及び提示情報における他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。
によって表され得る。C末端隣接配列ciまたは他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。したがって、ペプチド配列piまたはciにおける各々の独立変数または列は、配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在を表す。
と同等の行ベクトルとして表し得、bh iは、ペプチドpi及び関連するMHCアレルhについての結合親和性予測値であり、同様に、sh iは、安定性についてのものである。あるいは、アレル相互作用変数の1つ以上の組み合わせは、個々に(例えば、個々のベクトルまたは行列として)保存されてもよい。
(ただし、
はインジケータ関数であり、Lkはペプチドpkの長さを意味する)として表す。ベクトルTkは、アレル相互作用変数xh iに含まれうる。別の例では、クラスIIMHC分子によって提示されるペプチドについて、コード化モジュール314は、ペプチド長をベクトル
(ただし、
は、インジケータ関数であり、Lkは、ペプチドpkの長さを示す)として表す。ベクトルTkを、アレル相互作用変数xh iに含めることができる。
訓練モジュール316は、ペプチド配列に関連するMHCアレルによってペプチド配列が提示されるかどうかの尤度を生成する、1つ以上の提示モデルを構築する。具体的には、ペプチド配列pk及びペプチド配列pkに関連するMHCアレルakのセットを与えられ、各提示モデルは、ペプチド配列pkが、関連するMHCアレルakのうちの1つ以上によって提示されるであろう尤度を示す、推定値ukを生成する。
訓練モジュール316は、165に保存された提示情報から生成された、記憶装置170に保存された訓練データセットに基づいて、1つ以上の提示モデルを構築する。概して、提示モデルの具体的なタイプに関わらず、提示モデルのすべては、損失関数が最小化されるように、訓練データ170における独立変数と従属変数との間の依存性を捕捉する。具体的には、損失関数
は、訓練データ170における1つ以上のデータ例Sについての従属変数yi∈Sの値と、提示モデルによって生成されたデータ例Sについての推定された尤度ui∈Sとの間の矛盾を表す。本明細書の残りの部分を通じて言及される1つの特定の実現形態において、損失関数
は、以下のような等式(1a)によって与えられる負のlog尤度関数である。
しかし、実際には、別の損失関数が使用されてもよい。例えば、質量分析イオン電流について予測がなされる場合、損失関数は、以下のような等式1bによって与えられる平均二乗損失である。
を最小化するパラメトリックタイプの提示モデルの種々のパラメータは、例えば、バッチ勾配アルゴリズム、確率的勾配アルゴリズムなどの、勾配ベースの数値的最適化アルゴリズムを通して決定される。あるいは、提示モデルは、モデル構造が、訓練データ170から決定され、固定されたパラメータのセットに厳密には基づかない、ノンパラメトリックモデルであり得る。
訓練モジュール316は、アレルごとベースでペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール316は、単一のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170におけるデータ例Sに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
によって、特定のアレルhについてのペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、ただし、ペプチド配列xh kは、ペプチドpk及び対応するMHCアレルhについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味し、f(・)は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して変換関数と呼ばれる。さらに、gh(・)は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して依存性関数と呼ばれ、MHCアレルhについて決定されたパラメータθhのセットに基づいて、アレル相互作用変数xh kについての依存性スコアを生成する。各MHCアレルhについてのパラメータθhのセットの値は、θhに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ここでiは、単一のMHCアレルhを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
によって与えられるexpit関数である。
別の例として、f(・)はまた、ドメインzの値が0以上である場合、
によって与えられる双曲線正接関数であることもできる。あるいは、予測が、範囲[0,1]の外側の値を有する質量分析イオン電流についてなされる場合、f(・)は、例えば、恒等関数、指数関数、log関数などの任意の関数であることができる。
によって与えられるアフィン関数である。
によって与えられるネットワーク関数である。ノードは、パラメータθhのセットにおける関連するパラメータを各々有する接続を通して、他のノードに接続され得る。1つの特定のノードでの値は、特定のノードに関連する活性化関数によってマッピングされた関連するパラメータによって重み付けられた、特定のノードに接続されたノードの値の和として表され得る。アフィン関数と対照的に、ネットワークモデルは、提示モデルが非線形性、及び異なる長さのアミノ酸配列を有するプロセスデータを組み入れることができるため、有利である。具体的には、非線形モデリングを通して、ネットワークモデルは、ペプチド配列中の異なる位置のアミノ酸間の相互作用、及びこの相互作用がペプチド提示にいかに影響を及ぼすかを捕捉することができる。
として表すことができ、式中、g’h(xh k;θ’h)は、パラメータθ’hのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、MHCアレルhについての提示のベースライン確率を表す、MHCアレルのアレル相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるバイアスパラメータθh 0を伴う。
によって生成することができ、式中、x3kは、MHCアレルh=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ3は、損失関数最小化を通してMHCアレルh=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、x3 kは、MHCアレルh=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ3は、MHCアレルh=3に関連するネットワークモデルNN3(・)について決定されたパラメータのセットである。
一実現形態では、訓練モジュール316は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
によって、ペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、式中、wkは、ペプチドpkについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味し、gw(・)は、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータθwのセットに基づく、アレル非相互作用変数wkについての関数である。具体的には、各MHCアレルhについてのパラメータθhのセット及びアレル非相互作用変数についてのパラメータθwのセットの値を、θh及びθwに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
によって与えられ得る。
アレル相互作用変数についての依存性関数gh(・)と同様に、アレル非相互作用変数についての依存性関数gw(・)は、アフィン関数、または別々のネットワークモデルがアレル非相互作用変数wkに関連しているネットワーク関数であり得る。
によって与えられるネットワーク関数であってもよい。このネットワーク関数は、異なるアレル完全非相互作用変数を入力としてそれぞれ取る1つ以上のネットワークモデルも含み得る。
によって与えられ得、式中、g’w(wk;θ’w)は、アレル非相互作用パラメータθ’wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、mkは、ペプチドpkについてのmRNA定量測定値であり、h(・)は、定量測定値を変換する関数であり、かつθw mは、mRNA定量測定値についての依存性スコアを生成するようにmRNA定量測定値と組み合わされる、アレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるパラメータである。本明細書の残りの部分を通じて言及される1つの特定の実施形態において、h(・)はlog関数であるが、実際には、h(・)は、様々な異なる関数のうちのいずれか1つであり得る。
によって与えられ、式中、g’w(wk;θ’w)は、アレル非相互作用パラメータθ’wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、okは、ペプチドpkについてヒトプロテオームにおけるタンパク質及びアイソフォームを表す上記の指標ベクトルであり、かつθw oは、指標ベクトルと組み合わされるアレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおける、パラメータのセットである。1つのバリエーションにおいて、ok及びパラメータθw oのセットの次元が有意に高い場合、
(
は、L1ノルム、L2ノルム、組み合わせなどを表す)などのパラメータ正則化項を、パラメータの値を決定する時に損失関数に加えることができる。ハイパーパラメータλの最適値を、適切な方法を通して決定することができる。
ただし、g’w(wk;θ’w)は、アレル非相互作用パラメータθ’wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、
は、ペプチドpkがアレル非相互作用変数に関して上記に述べたソース遺伝子lに由来するものである場合に1に等しいインジケータ関数であり、θw lはソース遺伝子lの「抗原性」を示すパラメータである。1つのバリエーションにおいて、Lが充分に大きく、したがって、パラメータの数θw l=1, 2,...,Lが充分に大きい場合、
のようなパラメータ正則化項(ただし、
は、L1ノルム、L2ノルム、組み合わせなど)をパラメータの値を決定する際に損失関数に加えることができる。ハイパーパラメータλの最適値は適当な方法によって決定することができる。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
訓練モジュール316はまた、2つ以上のMHCアレルが存在する複数アレル設定においてペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール316は、単一のMHCアレルを発現する細胞、複数のMHCアレルを発現する細胞、またはそれらの組み合わせから生成された訓練データ170におけるデータ例Sに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
一実現形態では、訓練モジュール316は、複数のMHCアレルHのセットに関連したペプチドpkの推定提示尤度ukを、等式(2)〜(11)と共に上記で説明したような、単一アレルを発現する細胞に基づいて決定されたセットHにおけるMHCアレルhの各々について決定された提示尤度uk h∈Hの関数としてモデル化する。具体的には、提示尤度ukは、uk h∈Hの任意の関数であることができる。一実現形態では、等式(12)に示すように、関数は最大値関数であり、提示尤度ukは、セットHにおける各MHCアレルhについての提示尤度の最大値として決定することができる。
一実現形態では、訓練モジュール316は、ペプチドpkの推定提示尤度ukを、
によってモデル化し、式中、要素ah kは、ペプチド配列pkに関連する複数のMHCアレルHについて1であり、xh kは、ペプチドpk及び対応するMHCアレルについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味する。各MHCアレルhについてのパラメータθhのセットの値は、θhに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。依存性関数ghは、セクションX.B.1.において上記で導入された依存性関数ghのいずれかの形態であり得る。
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、MHCアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、MHCアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
一実現形態では、訓練モジュール316は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
によって、ペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、式中、wkは、ペプチドpkについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味する。具体的には、各MHCアレルhについてのパラメータθhのセット及びアレル非相互作用変数についてのパラメータθwのセットの値を、θh及びθwに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。依存性関数gwは、セクションX.B.3.において上記で導入された依存性関数gwのいずれかの形態であり得る。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって与えられ得る。
別の実現形態において、訓練モジュール316は、ペプチドpkの推定提示尤度ukを、
によってモデル化し、式中、要素ah kは、ペプチド配列pkに関連する複数のMHCアレルh∈Hについて1であり、u’k hは、MHCアレルhについての暗黙のアレルごと提示尤度であり、ベクトルvは、要素vhが、ah k・・・u’k hに対応するベクトルであり、s(・)は、vの要素をマッピングする関数であり、かつr(・)は、入力の値を所定の範囲中にクリップするクリッピング関数である。より詳細に下記に記載するように、s(・)は、総和関数または二次関数であってもよいが、他の実施形態において、s(・)は、最大値関数などの任意の関数であり得ることが認識される。暗黙のアレルごと尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
r(z)=min(max(z,0),1)
であってもよく、zと1の間の最小値が、提示尤度ukとして選ばれる。別の実現形態において、r(・)は、
r(z)=tanh(z)
として与えられる双曲線正接関数であり、ドメインzの値は、0以上である。
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、MHCアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、MHCアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
1つの実現形態では、MHCアレルhについての暗黙のアレルごと提示尤度を、
によって生成して、提示尤度が、
によって生成されるようにして、ペプチド提示に、アレル非相互作用変数の影響を組み入れる。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
一実現形態では、s(・)は、二次関数であり、ペプチドpkの推定提示尤度ukは、
によって与えられ、式中、要素u’k hは、MHCアレルhについての暗黙のアレルごと提示尤度である。暗黙のアレルごと尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。暗黙のアレルごと提示尤度は、上記の等式(18)、(20)、及び(22)において示すいずれかの形態であり得る。
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、HLAアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、HLAアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、HLAアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、HLAアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
予測モジュール320は、配列データを受け取って、提示モデルを用いて配列データ中の候補新生抗原を選択する。具体的には、配列データは、患者の腫瘍組織細胞から抽出されたDNA配列、RNA配列、及び/またはタンパク質配列であってよい。予測モジュール320は、配列データを、MHC−Iについては8〜15個のアミノ酸またはMHC−IIについては6〜30個のアミノ酸を有する複数のペプチド配列pkに処理する。例えば、予測モジュール320は、所定の配列「IEFROEIFJEF」を、9個のアミノ酸を有する3種類のペプチド配列「IEFROEIFJ」、「EFROEIFJE」、及び「FROEIFJEF」に処理することができる。一実施形態では、予測モジュール320は、患者の正常組織細胞から抽出された配列データをその患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較して1つ以上の変異を有する部分を特定することによって、変異したペプチド配列である候補新生抗原を特定することができる。
XI.B.1 概要
カセット設計モジュール324は、患者に注射するためのv種類の選択された候補ペプチドに基づいてワクチンカセット配列を生成する。具体的には、容量vのワクチンに含まれる選択されたペプチドのセットpk,k=1,2,…,vについて、カセット配列は、それぞれが対応するペプチドpkの配列を含む一連の治療エピトープ配列p’k,k=1,2,…,vの連結鎖によって与えられる。一実施形態では、カセット設計モジュール324は、各エピトープを互いに対して直接隣接するように連結することができる。例えば、あるワクチンカセットCは、
で表すことができる(式中、p’tiは、カセットのi番目のエピトープを示す)。したがって、tiは、カセットのi番目の位置の選択されたペプチドの添え字k=1,2,…,vに対応する。別の実施形態では、カセット設計モジュール324は、隣接するエピトープ間に1つ以上の任意選択的なリンカー配列を有するように各エピトープを連結することができる。例えば、あるワクチンカセットCは、
で表すことができる(式中、l(ti,tj)は、カセットのi番目のエピトープp’tiとj=i+1番目のエピトープp’j=i+1との間に配置されたリンカー配列を示す)。カセット設計モジュール324は、選択されたエピトープp’k,k=1,2,…,vのどれがカセットの異なる位置に配置されるか、及び、各エピトープ間に配置されるすべてのリンカー配列を決定する。カセット配列Cは、本明細書に記載される方法のいずれかに基づいたワクチンとしてロードすることができる。
により与えられる(ただし、h(・)は、各ジャンクションの距離関数をあるスコアにマッピングする特定の関数である)。本明細書の残りの部分を通じて言及される1つの特定の例では、関数h(・)は、カセットの距離関数にわたった総和である。
v×vの行列Dは、非対称距離行列であり、各要素D(k,m),k=1,2,…,v;m=1,2,…,vは、エピトープp’kからエピトープp’mまでのジャンクションの距離関数に対応している。Pの列k=2,…,vは元のエピトープの各ノードに対応し、列1及び行1は、他のすべてのノードからの距離が0である「ゴーストノード」に対応する。行列への「ゴーストノード」の追加は、ワクチンカセットが環状ではなく直鎖状であり、したがって最初のエピトープと最後のエピトープとの間にジャンクションがないという概念を記号化するものである。換言すれば、配列は環状ではなく、最初のエピトープは配列内の最後のエピトープの後に連結されると仮定されない。エピトープp’kがエピトープp’mのN末端に連結され、そうでない場合には0である、方向付けられた経路(すなわち、カセット内のエピトープ−エピトープジャンクション)が存在する場合にxkmがバイナリー変数を示すものとする。さらに、Eが、すべてvの治療ワクチンエピトープのセットを示し、S⊂Eがエピトープのサブセットを示すものとする。任意のかかるサブセットSにおいて、out(S)が、エピトープ−エピトープジャンクションxkm=1の数を示すものとする(ただし、kはS内のエピトープであり、mはE\S内のエピトープである)。既知の経路行列Pが与えられたものとして、カセット設計モジュール324は、以下の整数線形計画問題を解く経路行列Xを見つける。すなわち、
ただし、Pkmは、以下の制約条件の下で、経路行列Pの要素P(k,m)を示す。すなわち、
最初の2つの制約条件は、各エピトープがカセット内にちょうど1回現れることを保証するものである。最後の制約条件は、カセットが連結されていることを保証するものである。換言すれば、xで記号化されたカセットは連結された直鎖状タンパク質配列である。
v=20個の治療エピトープを含む2個のカセット配列を、1,000,000通りの順列のランダムサンプリングにより(カセット配列C1)、また、等式(27)において整数線形計画問題を解くことにより(カセット配列C2)生成した。距離関数、したがって提示スコアを、等式(14)で記述される提示モデルに基づいて求めた(式中、fは、シグモイド関数であり、xh iは、ペプチドpiの配列であり、gh(・)は、ニューラルネットワーク関数であり、wは、フランキング配列、ペプチドpiのlogTPM(transcripts per kilobase million)、ペプチドpiのタンパク質の抗原性、及びペプチドpiの由来源の試料IDを含み、フランキング配列のgw(・)及びlogTPMは、それぞれニューラルネットワーク関数である)。gh(・)のニューラルネットワーク関数のそれぞれは、単一隠れ層の多層パーセプトロン(MLP)の1つの出力ノードを含み、入力次元231(11残基×残基ごとに21文字(pad文字を含む))の幅256、隠れ層での正規化線形ユニット(ReLU)活性化、出力層での線形活性化、及び、訓練データセット内のHLAアレルごとに1個の出力ノードのものであった。フランキング配列のニューラルネットワーク関数は、単一隠れ層MLPで、入力次元210(N末端フランキング配列の5残基+C末端フランキング配列の5残基×残基ごとに21文字(pad文字を含む))、幅32、隠れ層でのReLU活性化、及び出力層での線形活性化のものであった。RNA logTPMのニューラルネットワーク関数は、単一隠れ層MLPで、入力次元1、幅16、隠れ層でのReLU活性化、及び出力層での線形活性化のものであった。HLA−A*02:04、HLA−A*02:07、HLA−B*40:01、HLA−B*40:02、HLA−C*16:02、及びHLA−C*16:04のHLAアレルについて提示モデルを構築した。2個のカセット配列の提示されるジャンクションエピトープの期待数を示す提示スコアを比較した。結果は、等式(27)を解くことによって生成されたカセット配列の提示スコアが、ランダムサンプリングによって生成されたカセット配列の提示スコアよりも約4倍の改善をともなったことを示した。
これは、提示されるジャンクションエピトープの期待数の提示スコアは6.1であった。1,000,000通りのランダム配列の提示スコアの中央値は、18.3であった。実験は、提示されるジャンクションエピトープの期待数が、ランダムにサンプリングされたカセット間でカセット配列を特定することによって大幅に低減されたことを示している。
これは提示スコア1.7であった。カセット配列C2の提示スコアは、カセット配列C1の提示スコアと比較して約4倍の改善を示し、ランダムに生成された1,000,000通りの候補カセットの提示スコアの中央値と比較して約11倍の改善を示した。カセットC1を生成するためのランタイムは、2.30GHzのIntel Xeon E5−2650 CPUのシングルスレッド上で20秒であった。カセットC2を生成するためのランタイムは、同じCPUのシングルスレッド上で1秒であった。したがって、この例では、等式(27)の整数線形計画問題を解くことによって特定されたカセット配列は、20倍低減された計算コストで約4倍良好な解を生成している。
この例では、腫瘍/正常エクソームのシークエンシング、腫瘍トランスクリプトームのシークエンシング、及び肺癌試料のHLAタイピングに基づいて選択されたv=20個の治療エピトープを含むカセット配列を、1,000,000通りの順列のランダムサンプリングにより、さらに等式(27)で整数線形計画問題を解くことによって生成した。距離関数、したがって提示スコアを、HLAペプチドの結合親和性の予測プログラムであるMHCflurryによって予測された、様々な閾値(例えば、50〜1000nM、またはこれよりも高いかもしくは低い値)を下回る親和性で患者のHLAに結合するジャンクションエピトープの数に基づいて求めた。この例では、治療エピトープとして選択される20個の非同義体細胞変異を、上記のセクションXI.Bの提示モデルにしたがって変異をランク付けすることによって腫瘍試料で特定された98個の体細胞変異間から選択した。しかしながら、他の実施形態では、治療エピトープは、安定性に基づくものなど、または提示スコア、親和性といった基準の組み合わせなどの他の基準に基づいて選択することもできる点は理解されよう。さらに、ワクチンに含めるための治療エピトープを優先順位付けするために用いられる基準は、カセット設計モジュール324で使用される距離関数D(k,m)を決定するために用いられる基準と同じである必要はない点は理解されよう。
上記の種々の提示モデルの妥当性を、提示モデルを訓練するために使用されなかった訓練データ170のサブセット、または、訓練データ170と類似した変数及びデータ構造を有する訓練データ170とは別々のデータセットであった、試験データTに対して試験した。
であり、これは、HLAアレル上に提示されると予測されたペプチド例の数に対する、関連するHLAアレル上に提示されると正確に予測されたペプチド例の数の比を示す。一実現形態では、試験データTにおけるペプチドpiは、対応する尤度推定値uiが、所定の閾値t以上である場合に、1つ以上の関連するHLAアレル上に提示されると予測された。提示モデルの性能を示す別の関連性のある測定基準は、
であり、これは、HLAアレル上に提示されることが公知であったペプチド例の数に対する、関連するHLAアレル上に提示されると正確に予測されたペプチド例の数の比を示す。提示モデルの性能を示す別の関連性のある測定基準は、受信者動作特性(ROC)の曲線下面積(AUC)である。ROCは、
によって与えられる、偽陽性率(FPR)に対するリコールをプロットする。
図13Aは、複数アレル質量分析データに基づいて、ペプチド提示予測について、本明細書において提示するような例示的な提示モデル、及び従来の技術水準モデルの性能結果を比較する。結果は、例示的な提示モデルが、親和性及び安定性の予測に基づく従来の技術水準モデルよりも有意に良好に、ペプチド提示の予測において機能したことを示した。
図13Bは、T細胞エピトープデータに基づいて、ペプチド提示予測について、本明細書において提示するような別の例示的な提示モデル、及び従来の技術水準モデルの性能結果を比較する。T細胞エピトープデータは、細胞表面上のMHCアレルによって提示されT細胞によって認識されたペプチド配列を含有する。結果は、例示的な提示モデルが、たとえ質量分析データに基づいて訓練されているとしても、親和性及び安定性の予測に基づく従来の技術水準モデルよりも有意に良好に、T細胞エピトープの予測において機能したことを示した。換言すると、図13Bの結果は、例示的な提示モデルが、質量分析試験データに基づくペプチド提示の予測において従来の技術水準モデルよりも良好に機能しただけではなく、T細胞によって実際に認識されたエピトープの予測においても、従来の技術水準モデルよりも有意に良好に機能したことを示した。これは、本明細書において提示するような様々な提示モデルが、免疫系において免疫原性応答を誘導する可能性が高い抗原の、改善された特定を提供できることのしるしである。
図13Cは、複数アレル質量分析データに基づいて、ペプチド提示予測について、例示的な和の関数モデル(等式(13))、例示的な関数の和モデル(等式(19))、及び例示的な二次モデル(等式(23))の性能結果を比較する。結果は、関数の和モデル及び二次モデルが、和の関数モデルよりも良好に機能したことを示した。これは、和の関数モデルが、実際にはペプチドの提示が有効に独立している場合、複数アレル設定におけるアレルが、ペプチド提示について互いに干渉し得ることを含意するためである。
図13Dは、複数アレル質量分析データについて、ペプチド提示予測に関して、単一アレル質量分析データを伴って及び伴わずに訓練される2つの例示的な提示モデルの性能結果を比較する。結果は、単一アレルデータを伴わずに訓練される例示的な提示モデルが、単一アレルデータを伴って訓練される例示的な提示モデルのものに匹敵する性能を達成することを示した。
図13Eは、図13Dに示す解析において提供されたアレルHLA−A*02:01及びHLA−B*07:02についての単一アレル質量分析データに基づく、図13Dに示す「A2/B7単一アレルデータを伴わない」及び「A2/B7単一アレルデータを伴う」例示的なモデルの性能を示す。結果は、たとえ例示的な提示モデルがこれらの2つのアレルについての単一アレル質量分析データを伴わずに訓練されるとしても、モデルが各MHCアレルについての結合モチーフを学習できることを示す。
図13Fは、図13Dに示す「A2/B7単一アレルデータを伴わない」例示的なモデルによって予測される、ノナマー間で2位及び9位に共通したアンカー残基を示す。ペプチドは、推定尤度が5%よりも上であった場合に、提示されることが予測された。結果は、MHCアレルHLA−A*02:01及びHLA−B*07:02上での提示について特定されたペプチドにおける最も一般的なアンカー残基が、これらのMHCアレルについて既知のアンカーモチーフと一致したことを示す。これは、例示的な提示モデルが、期待されたように、ペプチド配列のアミノ酸の特定の位置に基づいて、ペプチド結合を正確に学習したことを示す。
図13Gは、C末端隣接配列及びN末端隣接配列をアレル相互作用変数として組み入れた例示的な提示モデルと、C末端隣接配列及びN末端隣接配列をアレル非相互作用変数として組み入れた例示的な提示モデルとの間の性能結果を比較する。結果は、C末端隣接配列及びN末端隣接配列のアレル非相互作用変数としての組み入れが、モデル性能を有意に改善したことを示した。より具体的には、様々なMHCアレルにわたって共通である、ペプチド提示に適切な特性を特定し、これらのアレル非相互作用変数についての統計学的強度が、提示モデルの性能を改善するためにMHCアレルにわたって共有されるように、それらをモデル化することが、価値を有する。
図13(H)は、質量分析によって決定された、mRNA存在量と腫瘍細胞上に提示されたペプチドの頻度との間の依存性を示す。結果は、mRNA発現とペプチド提示との間に強い依存性があることを示す。
図13Iは、2つの例示的な提示モデルの性能を示し、そのうち1つは、質量分析腫瘍細胞データに基づいて訓練されており、もう1つは、mRNA定量データ及び質量分析腫瘍細胞データを組み入れている。図13Hから期待されるように、mRNA発現はペプチド提示の強い指標であるため、結果は、mRNA定量測定値を例示的な提示モデルに組み入れることによって、性能の有意な改善があることを示した。
図13Jは、図13Iに関して説明した「例示的なモデル、RNAあり」提示モデルによって生成された結果と、ペプチド提示を予測する時にペプチド長を計上しない従来の技術水準モデルによって予測された結果との間で、異なるペプチド長についてのペプチド提示の確率を比較する。結果は、図13Iからの「例示的なモデル、RNAあり」の例示的な提示モデルが、異なる長さのペプチドにわたって尤度の変動を捕捉したことを示した。
以下は、hによって意味されるMHCアレルHLA−C*16:04について、アレルごと提示モデル(等式(2))のバリエーションについて決定されたパラメータのセットを示し:
式中、relu(・)は、正規化線形ユニット(RELU:rectifiedlinearunit)関数であり、Wh 1、bh 1、Wh 2、及びbh 2は、モデルについて決定されたパラメータθのセットである。アレル相互作用変数xh kは、ペプチド配列からなる。Wh 1の次元は(231x256)であり、bh 1の次元は(1x256)であり、Wh 2の次元は(256x1)であり、かつbh 2はスカラーである。証明の目的で、bh 1、bh 2、Wh 1、及びWh 2の値は、その教示するところのすべてについて本明細書に援用する国際公開第WO2017106638号に詳細に記載されている。
MHCクラスII新生抗原を決定するための方法については、その教示するところのすべてを本明細書に援用する、国際出願第PCT/US2018/028438号により詳細に記載されている。
図13Nは、HLAクラスII分子を含む合計39種の試料の各試料について質量分析を用いてシークエンシングしたペプチドの量を示すヒストグラムである。さらに、複数の試料の各試料について、図13Nに示されるヒストグラムは、異なるq値の閾値で質量分析を用いてシークエンシングしたペプチドの量を示している。具体的には、複数の試料の各試料について、図13Nは、0.01未満のq値、0.05未満のq値、及び0.2未満のq値で質量分析を用いてシークエンシングしたペプチドの量を示している。
以下は、クラスII MHCアレルであるHLA−DRB1*12:01及びHLA−DRB1*10:01の暗黙のアレルごと提示尤度を生成する複数アレル提示モデル(式(16))のバリエーションについて求められるパラメータのセットを示す。
u=expit(relu(X・W1+b1)・W2+b2)
式中、relu(・)は、正規化線形ユニット(ReLU)関数、W1、b1、W2、及びb2は、モデルについて求められたパラメータθのセットである。アレル相互作用変数Xは、入力ペプチド当たり1行のワン・ホットコード化され、中間パッド化された(middle−padded)ペプチド配列からなる1×399行列に含まれる。W1の次元は(399×256)、b1の次元は(1×256)、W2の次元は(256×2)、b2の次元は(1×2)である。出力の第1の行は、アレルHLA−DRB1*12:01によるそのペプチド配列の暗黙のアレルごとの提示の確率を示し、出力の第2の行は、アレルHLA−DRB1*10:01によるそのペプチド配列の暗黙のアレルごとの提示の確率を示す。例示の目的で、W1、b1、W2、及びb2の値は、その教示するところのすべてについて本明細書に援用する、国際出願第PCT/US2018/028438号に詳細に記載されている。
図14は、図1及び図3に示した実体を実施するための例示的なコンピュータ1400を説明する。コンピュータ1400は、チップセット1404に連結された少なくとも1つのプロセッサ1402を含む。チップセット1404は、メモリコントローラハブ1420及び入力/出力(I/O)コントローラハブ1422を含む。メモリ1406及びグラフィックスアダプタ1412は、メモリコントローラハブ1420に連結されており、ディスプレイ1418は、グラフィックスアダプタ1412に連結されている。記憶デバイス1408、入力装置1414、及びネットワークアダプタ1416は、I/Oコントローラハブ1422に連結されている。コンピュータ1400の他の実施形態は、異なるアーキテクチャを有する。
以下は、本明細書を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明の範囲をいかなる意味においても限定しようとするものではない。用いられる数値(例えば、量、温度など)に関して精度を確実とするべく努力に努めてはいるが、ある程度の実験的誤差及び偏差は無論のこと許容されなければならない。
ワクチン接種によって、対応する細胞免疫応答(複数可)を刺激するクラスI MHCに制限された複数の腫瘍特異的新生抗原(TSNA)を送達することができる。1つの例では、複数のエピトープを単一の遺伝子産物をしてコードするようにワクチンカセットを操作しているが、ここで各エピトープはそれらの天然の包囲ペプチド配列内に埋め込まれるか、または非天然リンカー配列によって分離されている。抗原のプロセシング及び提示、ひいてはTSNA特異的CD8 T細胞応答の程度及び幅に潜在的に影響を及ぼしうるいくつかの設計パラメータが特定されている。本例では、いくつかのモデルカセットを設計及び構築して以下を評価した。すなわち、(1)1個の発現カセットに組み込まれた複数のエピトープに対する強いT細胞応答を生じることができるかどうか、(2)どのような条件が、すべてのエピトープの最適なプロセシング及び提示につながる、発現カセット内のTSNA間に配置される最適リンカーを作るか、(3)カセット内の各エピトープの相対位置がT細胞応答に影響するか、(4)カセット内のエピトープの数が個々のエピトープに対するT細胞応答の程度または質に影響するかどうか、(5)細胞ターゲティング配列の付加がT細胞応答を向上させるか。
XIV.B.1.方法及び材料
TCR及びカセット設計及びクローニング
選択されたTCRは、A*0201により提示される場合にペプチドNLVPMVATV(PDB番号5D2N)、CLGGLLTMV(PDB番号3REV)、GILGFVFTL(PDB番号1OGA)LLFGYPVYV(PDB番号1AO7)を認識する。2Aペプチド連結TCRサブユニット(βに続きα)、EMCV IRES、及び2A連結CD8サブユニット(βに続きα及びプロマイシン耐性遺伝子)を含むトランスファーベクターを構築した。オープンリーディングフレーム配列は、コドン最適化され、GeneArt社により合成されたものである。
ペプチドは、ProImmune社またはGenscript社より購入し、水/DMSO(2:8,v/v)に加えた10mM tris(2−カルボキシルエチル)ホスフィン(TCEP)で10mg/mLに希釈した。細胞培地及び補助添加物質は特に断らない限りはGibco社より入手した。熱不活化ウシ胎児血清(FBShi)はSeradigm社より入手した。QUANTI−Luc基質、ゼオシン、及びプロマイシンはInvivoGen社より入手した。Jurkat−Lucia NFAT細胞(InvivoGen社)を10% FBShi、ピルビン酸ナトリウム、及び100μg/mLのゼオシンを添加したRPMI1640中で維持した。形質導入した後、これらの細胞にさらに0.3μg/mLのプロマイシンを加えた。T2細胞(ATCC CRL−1992)をIscove培地(IMDM)+20%FBShi中で培養した。U−87 MG(ATCC HTB−14)細胞を、10%FBShiを添加したMEM Eagles培地中で維持した。
T2細胞はTCRによる抗原認識を調べる目的で日常的に使用されている。T2細胞は、抗原プロセシング用のペプチドトランスポーターを欠失しており(TAP欠損)、内在性のペプチドをMHC上に提示するために小胞体に取り込むことができない。しかしながら、T2細胞には外来性のペプチドを容易に取り込ませることができる。5種類のマーカーペプチド(NLVPMVATV、CLGGLLTMV、GLCTLVAML、LLFGYPVYV、GILGFVFTL)及び2種類の無関係のペプチド(WLSLLVPFV、FLLTRICT)をT2細胞に取り込ませた。簡単に述べると、T2細胞をカウントし、IMDM +1%FBShiで1×106細胞/mLに希釈した。各ペプチドは10μgペプチド/1×106細胞となるように加えた。次いで細胞を37℃で90分間インキュベートした。細胞をIMDM+20%FBShiで2回洗浄し、5×10E5細胞/mLに希釈し、100μLを96ウェルCostar組織培養プレートにプレーティングした。Jurkat−Lucia TCRクローンをカウントし、RPMI1640+10%FBShi中で5×10E5細胞/mLに希釈し、100μLをT2細胞に加えた。プレートを37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。次いでプレートを400gで3分間遠心し、20μLの上清を白色平底Greinerプレートに取った。指示にしたがってQUANTI−Luc基質を調製し、50μL/ウェルで加えた。ルシフェラーゼ発現をMolecular Devices SpectraMax iE3xで読み取った。
トランスジェニックHLA−A2.1(HLA−A2 Tg)マウスをTaconic Labs,Inc社より入手した。これらのマウスは、ヒトHLA−A2.1リーダードメイン、α1ドメイン、及びα2ドメインと、マウスH2−Kb α3ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインからなる導入遺伝子を有するものである(Vitiello et al.,1991)。これらの実験で使用したマウスは、C57Bl/6バックグラウンドの野生型BALB/cAnNTacの雌及びホモ接合型HLA−A2.1Tgの雌の第1世代子孫(F1)である。
HLA−A2 Tgマウスを、前脛骨筋の両側性の筋肉内注射により1×1010〜1×106 個のアデノウイルスベクターのウイルス粒子で免疫化した。免疫応答を免疫化の12日後に測定した。
免疫化したマウスの新しく収穫した脾臓及びリンパ節からリンパ球を単離した。GentleMACS組織解離装置を製造者の指示にしたがって使用して、10%ウシ胎児血清をペニシリン及びストレプトマイシンとともに含むRPMI(完全RPMI)中で組織を解離させた。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン(Janetzki et al.,2015)にしたがってELISPOT分析を行った。1×105個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入した。
新しく単離したリンパ球を2〜5×106細胞/mLの密度で10uMの示したペプチドと2時間インキュベートした。2時間後、ブレフェルジンAを5ug/mlの濃度にまで加え、細胞を刺激物質とさらに4時間インキュベートした。刺激後、生細胞を製造者のプロトコールにしたがって固定可能な生存率解析用色素eFluor780で標識し、抗CD8 APC(クローン53−6.7,BioLegend社)により1:400の希釈率で染色した。細胞内染色には抗IFNg PE(クローンXMG1.2,BioLegend社)を1:100で使用した。試料をAttune NxT Flow Cytometer(Thermo Scientific社)で収集した。FlowJoを使用してフローサイトメトリーデータをプロットし、分析を行った。抗原特異的応答の程度を評価するため、CD8+細胞のIFNg+の割合(%)及び全IFNg+細胞数/1×106個の生細胞の両方を、各ペプチド刺激物質に対して計算した。
新生抗原カセットの設計の評価の一例として、インビトロの細胞ベースのアッセイを開発し、モデルワクチンカセット内の選択されたヒトエピトープが抗原提示細胞によって発現、プロセシング、及び提示されるかどうかを評価した(図15)。認識後、特性がよく知られているペプチド−HLAの組み合わせに特異的な5種類のTCRのうちの1つを発現するように操作されたJurkat−LuciaレポーターT細胞が活性化され、活性化T細胞の核因子(NFAT)を核内に移行させると、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写が活性化される。個々のレポーターCD8 T細胞株の抗原刺激をバイオルミネッセンスによって定量した。
ルシフェラーゼの誘導によって測定されるペプチド特異的T細胞認識は、ワクチンカセット抗原の効果的なプロセシング及び提示を示す。
*エピトープ3のレポーターT細胞はまだ生成されていない。
インビトロT細胞活性化アッセイにおけるルシフェラーゼ誘導は、DPPベースのカセットと異なり、すべてのリンカーがカセット抗原の効率的な放出を促進したことを示した。T細胞エピトープのみ(リンカー無し)=9AA、片側に天然リンカー=17AA、両側に天然リンカー=25AA、非天然リンカー=AAY,RR,DPP
*エピトープ3のレポーターT細胞はまだ生成されていない。
インビトロT細胞活性化アッセイを用いることにより、4つのHLA−A*0201制限マーカーエピトープがモデルカセットから効率的に放出され、ターゲティング配列がT細胞の認識及び活性化を大幅に向上させないことが示された。
*エピトープ3のレポーターT細胞はまだ生成されていない。
新生抗原カセット設計の評価の別の例として、HLA−A*02:01に制限された形でCD8 T細胞を刺激することが知られている、特性がよく知られた5つのヒトクラスI MHCエピトープを含むようにワクチンカセットを設計した(図16A、17、19A)。それらのインビボ免疫原性の評価を行うため、これらのマーカーエピトープを含むワクチンカセットをアデノウイルスベクターに組み込み、HLA−A2トランスジェニックマウスに感染させるのに使用した(図18)。このマウスモデルは、ヒトHLA−A*0201及びマウスH2−Kbから一部が構成された導入遺伝子を保有しており、したがって、ヒトHLA−A2.1のリーダー、マウスα3に連結されたα1及びα2ドメイン、膜貫通及び細胞質H2−Kbドメインで構成されたキメラクラスI MHC分子をコードしている(Vitiello et al.,1991)。このキメラ分子は、HLA−A*02:01に制限された抗原提示を可能とする一方で、CD8共受容体とMHC上のα3ドメインとの種の一致した相互作用を維持する。
ELISPOTデータは、HLA−A2トランスジェニックマウスが1×e11個のアデノウイルス粒子による感染17日後にカセット内のすべてのクラスI MHC制限エピトープに対してT細胞応答を生じたことを示した。
ELISPOTデータは、HLA−A2トランスジェニックマウスが5e10アデノウイルス粒子による感染17日後に長いワクチンカセット及び短いワクチンカセットの両方で同等の大きさのT細胞応答を生じたことを示した。
* 技術的なエラーによりT細胞応答が見られなかったと疑われる。
要約すると、モデルカセット評価による知見(図16〜19、表2〜6)によって、モデルワクチンカセットでは、アデノウイルスベースのベクターとの関連で約20個のエピトープをコードする「数珠つなぎ」アプローチを用いた場合に強い免疫原性が得られることが実証された。エピトープは、両側にその天然の周辺ペプチド配列(例えば、両側に8個のアミノ酸残基)が隣接した最小のCD8 T細胞エピトープ(例えば、9個のアミノ酸残基)をそれぞれが埋め込んだ25マー配列を連結することによって最も効果的にアセンブルされる。本明細書において使用される場合、「天然」または「自然」のフランキング配列とは、その由来源タンパク質内のそのエピトープの天然に存在するという文脈で特定のエピトープのN末端及び/またはC末端側のフランキング配列のことを指す。例えば、HCMV pp65 MHC IのエピトープNLVPMVATVは、その5’末端側に天然の5’配列WQAGILARが、その3’末端側に天然の3’配列QGQNLKYQが隣接し、それによりHCMV pp65由来源タンパク質内にみられる
という25マーペプチドを生成する。天然または自然の配列は、天然のフランキング配列(複数可)が隣接したエピトープをコードするヌクレオチド配列のことを指す場合もある。各25マー配列は、それに続く25マー配列に直接連結される。最小のCD8 T細胞エピトープがアミノ酸9個よりも大きいかまたは小さい場合、フランキングペプチドの長さは、全体の長さが依然25マーのペプチド配列となるように調節することができる。例えば、アミノ酸10個のCD8 T細胞エピトープには、アミノ酸8個とアミノ酸7個の配列を隣接させることができる。このコンカテマーの後には、CD4 Tヘルパー細胞を刺激し、ワクチンカセット抗原の全体のインビボ免疫原性を改善するため(Alexander et al.,1994;Panina−Bordignon et al.,1989)に含ませた2個のユニバーサルクラスII MHCエピトープを繋げた。これらのクラスIIエピトープは、GPGPGアミノ酸リンカー(SEQ ID NO:56)によって最後のクラスIエピトープに連結した。2個のクラスIIエピトープは、GPGPGアミノ酸リンカーによって互いに対しても連結し、さらにC末端側にGPGPGアミノ酸リンカーを連結させた。エピトープの位置もその数もT細胞の認識または応答に大きく影響しないようであった。ターゲティング配列も、カセットに由来する抗原の免疫原性に大きく影響しないようであった。
XV.A.ChAd新生抗原カセット送達ベクターの構築
1つの例では、チンパンジーアデノウイルス(ChAd)を操作して新生抗原カセットの送達ベクターとした。さらなる例では、完全長ChAdV68ベクターを、AC_000011.1(米国特許第6083716号に記載の配列2)に基づいて合成し、E1(nt457〜3014)及びE3(nt27,816〜31,332)配列を欠失させた。CMVプロモーター/エンハンサーの制御下にあるレポーター遺伝子を欠失させたE1配列の代わりに挿入した。このクローンをHEK293細胞にトランスフェクトしたところ、感染性のウイルスは生成されなかった。野生型C68ウイルスの配列を確認するため、単離VR−594をATCCより入手して継代した後、個々に配列決定した(SEQ ID NO:10)。AC_000011.1配列を野生型ChAdV68ウイルスのATCC VR−594配列(SEQ ID NO:10)と比較したところ、6個のヌクレオチドの相違が特定された。1つの例では、改変ChAdV68ベクターを、AC_000011.1に基づいて作製し、対応するATCC VR−594ヌクレオチドを5つの位置で置換した(ChAdV68.5WTnt SEQ ID NO:1)。
XV.B.1.ChAdベクターの評価方法及び材料
リポフェクタミンを用いたHEK293A細胞のトランスフェクション
ChAdV68コンストラクト(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25マー、及びChAdV68.5WTnt.MAG25マー)のDNAを調製し、以下のプロトコールを用いてHEK293A細胞にトランスフェクトした。
ChAdV68コンストラクト(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25マー、ChAdV68.5WTnt.MAG25マー)のDNAを調製し、以下のプロトコールを用いてHEK293A細胞にトランスフェクトした。
8%CO2のインキュベーター内の293FreeStyle(商標)(ThermoFisher社)培地中で増殖させた293F細胞内でChAdV68ウイルス生成を行った。感染の当日、細胞を生存率98%で1mL当たり106細胞に希釈し、1LのShakeフラスコ(Corning社)中、1回の生成操作当たり400mLを使用した。1回の感染当たり目標MOIが3.3よりも高い4mLの三次ウイルスストックを使用した。トリパンブルーによって測定される生存率が70%を下回るまで48〜72時間にわたって細胞をインキュベートした。次いで感染細胞をベンチトップ遠心分離器で最大速度で遠心して収穫し、1×PBS中で洗浄し、再び遠心してから20mLの10mM Tris pH7.4に再懸濁した。細胞ペレットを、凍結解凍を3回行って溶解し、4,300×gで5分間遠心して清澄化した。
ウイルスDNAをCsCl遠心分離により精製した。2つの不連続な勾配の操作を行った。第1の遠心は、細胞成分からウイルスを精製するためのもので、第2の遠心は、細胞成分からの分離物をさらに精製し、感染性粒子から機能不全粒子を分離するためのものである。
1.1×1012個のウイルス粒子(VP)の消光係数はOD260nmの吸光度の値=1に相当することに基づき、OD260アッセイを用いてVP濃縮を行った。アデノウイルスの2つの希釈度(1:5と1:10)をウイルス溶解バッファー(0.1%SDS,10mM Tris pH7.4,1mM EDTA)中で作った。両方の希釈度でODを2重に測定し、OD260値×希釈係数×1.1×1012VPを掛けることによりVP濃度/mLを測定した。
C57BL/6J系の雌性マウス及びBalb/c系の雌性マウスに、1×108個のChAdV68.5WTnt.MAG25マーのウイルス粒子(VP)を、100uL体積中で両側性の筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールした。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解した。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行った。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入した。
1つの例において、ChAdV68.4WTnt.GFP(図21)及びChAdV68.5WTnt.GFP(図22)のDNAを、HEK293A細胞にトランスフェクトし、ウイルス複製(ウイルスプラーク)をトランスフェクションの7〜10日後に観察した。ChAdV68ウイルスプラークを光学(図21A及び22A)及び蛍光顕微鏡法(図21B〜C、及び図22B〜C)を使用して可視化した。GFPは、増殖性ChAdV68ウイルス送達粒子の生成を示す。
1つの例において、ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、及びChAdV68.5WTnt.MAG25マーウイルスをHEK293F細胞内で増殖させ、精製ウイルスストックをトランスフェクションの18日後に生成した(図23)。精製ChAdV68ウイルスストック中のウイルス粒子を定量し、同じプロトコールを使用して生成されたアデノウイルス5型(Ad5)及びChAdVY25(近縁のChAdV;Dicks,2012,PloS ONE7,e40385)ウイルスストックと比較した。ChAdV68ウイルス力価は、Ad5及びChAdVY25と同等であった(表7)。
マウス腫瘍抗原を発現するC68ベクターを、マウス免疫原性実験で評価して、C68ベクターがT細胞応答を誘発することを実証する。MHCクラスIエピトープSIINFEKLに対するT細胞応答C57BL/6J系雌性マウスで測定し、MHCクラスIエピトープAH1−A5(Slansky et al.,2000,Immunity13:529−538)に対するT細胞応答をBalb/c系マウスで測定した。図29に示されるように、ChAdV68.5WTnt.MAG25マーによるマウスの免疫後にコントロールに対して強いT細胞応答が測定された。脾細胞106個当たり、8957個及び4019個のスポット形成細胞(SFC)の平均の細胞性免疫応答が、ELISpotアッセイにおいて、C57BL/6J系またはBalb/c系マウスをそれぞれChAdV68.5WTnt.MAG25マーで免疫した場合に免疫の10日後に観察された。
XVI.A.アルファウイルス送達ベクター評価の材料及び方法
RNAを生成するためのインビトロ転写
インビトロ試験を行うため、プラスミドDNAをPmeIによる制限消化によって直鎖状とし、カラムを製造者の指示にしたがって洗浄し(GeneJet DNA cleanup kit,Thermo社)、テンプレートとして使用した。RiboMAX Large Scale RNA production System(Promega社)をm7Gキャップアナログ(Promega)とともに製造者の指示にしがって使用してインビトロ転写を行った。RNeasy kit(Qiagen社)を製造者の指示にしがって使用してmRNAを精製した。
HEK293A細胞を、96ウェルのウェル当たり6e4細胞で、24ウェルのウェル当たり2e5細胞で、トランスフェクションの約16時間前に播種した。細胞にMessengerMAXリポフェクタミン(Invitrogen社)を製造者のプロトコールにしたがって使用してmRNAをトランスフェクションした。96ウェルでは、ウェル当たり0.15uLのリポフェクタミン及び10 ng のmRNAを使用し、24ウェルでは、ウェル当たり0.75uLのリポフェクタミン及び150ngのmRNAを使用した。GFPを発現するmRNA(TriLink Biotechnologies社)をトランスフェクションのコントロールとして使用した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイを、白い壁の96ウェルプレートで、ONE−Gloルシフェラーゼアッセイ(Promega社)を製造者のプロトコールにしたがって使用して各条件を三重にして行った。発光度をSpectraMaxを使用して測定した。
トランスフェクトした細胞をトランスフェクションの2時間後に新鮮な培地で洗い、新鮮な培地に交換してトランスフェクトしなかったmRNAをすべて除去した。次いで細胞を異なる時点でRLT plus lysis buffer(Qiagen社)中に収穫し、いずれも製造者のプロトコールにしたがってQiaShredder(Qiagen社)を使用してホモジナイズし、RNeasy kit(Qiagen社)を使用して抽出した。Nanodrop(Thermo Scientific社)を使用して全RNAを定量した。製造者のプロトコールにしたがってqTower3 (Analytik Jena)でQuantitect Probe One−Step RT−PCR kit(Qiagen社)を使用し、反応当たり20ngの全RNAを使用してqRT−PCRを行った。各試料を各プローブについて三重に試験した。ActinまたはGusBを参照遺伝子として用いた。カスタムプライマー/プローブはIDT社により生成されたものである(表8)。
C57BL/6J系マウスの左下脇腹に105個のB16−OVA細胞/動物を注射した。腫瘍を免疫化の前、3日間にわたって増殖させた。
Balb/c系マウスの左下脇腹に106個/動物のCT26細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、7日間にわたって増殖させた。
srRNAワクチンについては、マウスに100uL体積中、10ugのRNAを、両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。Ad5ワクチンについては、マウスに5×1010個のウイルス粒子(VP)を、100uL体積中で両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。各動物に、抗CTLA−4(クローン9D9,BioXcell社)、抗PD−1(クローンRMP1−14,BioXcell社)、または抗IgG(クローンMPC−11,BioXcell社)を、用量250ugで、週2回、腹腔内注射により注射した。
各時点においてマウスに腹腔内注射により150mg/kgのルシフェリン基質を注射し、注射の10〜15分後にIVISインビボイメージングシステム(PerkinElmer社)を使用して生物発光を測定した。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールした。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解した。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行った。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入した。
XVI.B.1.アルファウイルスベクターのインビトロ評価
本明細書の一実現形態では、新生抗原発現システム用のRNAアルファウイルス骨格を、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)(Venezuelan Equine Encephalitis(VEE)(Kinney,1986,Virology 152:400−413)ベースの自己複製RNA(srRNA)ベクターから生成した。1つの例では、26Sサブゲノムプロモーターの3’側に位置するVEEの構造タンパク質をコードする配列を欠失させ(VEE配列の7544〜11,175を欠失させた。番号付けはKinney et al 1986に基づく。SEQ ID NO:6)、抗原配列(SEQ ID NO:14及びSEQ ID NO:4)またはルシフェラーゼレポーター(例えばVEE−ルシフェラーゼ、SEQ ID NO:15)に置き換えた(図24)。RNAをインビトロでsrRNA DNAベクターから転写させ、HEK293A細胞にトランスフェクトしてルシフェラーゼレポーターの発現を測定した。さらに、ルシフェラーゼをコードする(非複製)mRNAを比較のためにトランスフェクトした。VEE−ルシフェラーゼのsrRNAでは、2時間の測定値を23時間の測定値と比較した場合にsrRNAレポーターシグナルの約30,000倍の増大が観察された(表9)。これに対して、同じ時間でのmRNAレポーターのシグナルの増大は10倍未満であった(表9)。
96ウェル中、ウェル当たり10ngのVEE−ルシフェラーゼsrRNAまたは10ngの非複製ルシフェラーゼmRNA(TriLink L−6307)をHEK293A細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト後の異なる時点で発光を測定した。ルシフェラーゼ発現を相対発光単位(RLU)として報告する。各データポイントは、3つのトランスフェクトしたウェルの平均±SDである。
HEK293A細胞にVEE−ルシフェラーゼsrRNAをトランスフェクトし(24ウェルのウェル当たり150ng)、トランスフェクション後の異なる時間にqRT−PCRによりRNAレベルを定量した。各測定値はアクチン参照遺伝子に対して正規化し、2時間の時点に対する倍率変化を示す。
HEK293細胞にVEE−MAG25マーsrRNAをトランスフェクトし(24ウェルのウェル当たり150ng)、トランスフェクション後の異なる時間にqRT−PCRによりRNAレベルを定量した。各測定値はGusB参照遺伝子に対して正規化し、2時間の時点に対する倍率変化を示す。グラフ上の異なる線は、いずれもsrRNAのエピトープカセット領域を検出する2つの異なるqPCRプライマー/プローブのセットを表す。
別の例において、VEE−ルシフェラーゼレポーターの発現をインビボで評価した。マウスに、脂質ナノ粒子(MC3)に封入された10ugのVEE−ルシフェラーゼsrRNAを注射し、注射の24及び48時間後、ならびに7及び14日後に撮影して生物発光シグナルを測定した。ルシフェラーゼシグナルが注射の24時間後に検出され、時間とともに増大し、srRNA注射の7日後にピークとなった(図25)。
1つの実現形態において、VEE srRNAベクターがインビボで抗原特異的免疫応答を誘導するかを調べるため、2つの異なるMHCクラスIマウス腫瘍エピトープであるSIINFEKL及びAH1−A5(Slansky et al.,2000,Immunity 13:529−538)を発現するVEE srRNAベクターを作製した(VEE−UbAAY,SEQ ID NO:14)。SFL(SIINFEKL)エピトープは、B16−OVAメラノーマ細胞株によって発現され、AH1−A5(SPSYAYHQF;Slansky et al.,2000,Immunity)エピトープは、CT26結腸癌細胞株によって発現される関連エピトープを標的とするT細胞を誘導する(AH1/SPSYVYHQF;Huang et al.,1996,Proc Natl Acad Sci USA 93:9730−9735)。1つの例では、インビボ実験において、VEE−UbAAY srRNA が、T7ポリメラーゼ(TriLink Biotechnologies)を使用したインビトロ転写によって生成され、脂質ナノ粒子(MC3)に封入された。
*Vax群のマウス#6からの結果は、三重のウェル間のばらつきが大きいことから分析から除外した。
ChAdV68及び自己複製RNA(srRNA)を用いた異なる投与プロトコールを、マウスCT26腫瘍モデルで評価した。
腫瘍の注入
Balb/c系マウスにCT26細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の7日後にマウスを異なる実験アーム(各群当たりマウス28〜40匹)をランダムカセット配列し、処置を開始した。Balb/c系マウスの左下脇腹に106個/動物のCT26細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、7日間にわたって増殖させた。各実験アームは表15に詳細に記載したとおりである。
srRNAワクチンについては、マウスに100uL体積中、10ugのVEE−MAG25マーsrRNAを、両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。C68ワクチンについては、マウスに100uL体積中1×1011個のChAdV68.5WTnt.MAG25マーのウイルス粒子(VP)を、両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。各動物に、抗PD−1(クローンRMP1−14,BioXcell社)、または抗IgG(クローンMPC−11,BioXcell社)を、用量250ugで、週2回、腹腔内注射により注射した。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールした。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解した。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行った。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入した。
ChAdV68.5WTnt.MAG25マー/VEE−MAG25マーsrRNAの異種プライム/ブースト、またはVEE−MAG25マーsrRNAの同種プライム/ブーストワクチンの免疫原性及び有効性をCT26マウス腫瘍モデルで評価した。Balb/c系マウスにCT26細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の7日後にマウスを異なる実験アームをランダムカセット配列し、処置を開始した。各実験アームは表15に詳細に、また表16により一般的に記載したとおりである。
ChAdV68及び自己複製RNA(srRNA)を用いた異なる投与プロトコールを、非ヒト霊長類(NHP)で評価した。
プライミングワクチンを各NHPで筋肉内(IM)注射して実験を開始した(ワクチンプライム)。1回以上のブースターワクチン(ワクチンブースト)も各NHPに筋肉内注射した。下記表に概略を示し、下記に要約した各グループにしたがって、投与ごとに両側性注射で投与した。
Mamu A*01インドアカゲザルを、LNP−1またはLNP−2中で製剤化した1×1012個のウイルス粒子(注射1回当たり5×1011個のウイルス粒子)のChAdV68.5WTnt.MAG25マー、30ugのVEE−MAG25マーsrRNA、100ugのVEE−MAG25マーsrRNA、または300ugのVEE−MAG25マーsrRNAで両側性に免疫した。30ug、100ugまたは300ugのVEE−MAG25マー srRNAのワクチンブーストをプライムワクチン接種後の示した時間に筋肉内投与した。
PBMCを、プライムワクチン接種後の示した時間にLymphocyte Separation Medium(LSM,MP Biomedicals社)及びLeucoSep分離チューブ(Greiner Bio−One社)を使用して単離し、10%FBS及びペニシリン/ストレプトマイシンを含んだRPMIに再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。実験に用いたそれぞれのサルについて、ELISpotまたはフローサイトメトリー法を用いてT細胞応答を測定した。ワクチンにコードされた6種類の異なるアカゲザルMamu−A*01クラスIエピトープに対するT細胞応答を、ELISpot(ex vivo enzyme−linked immunospot)(エクスビボ酵素結合免疫スポット)分析を用いてIFN−γなどのサイトカインの誘導を測定することにより、PBMCから観測した。サルIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISpot分析を行った。200,000個のPBMCを、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次に、スポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入した。
この実験は、(a)同種のプライム/ブーストまたは異種のプライム/ブーストとしてのVEE−MAG25マー srRNAの30μg及び100μgの用量とChAdV68.5WTnt.MAG25マーとの組み合わせの免疫原性及び予備的安全性を評価し、(b)LNP2に対してLNP1を使用した脂質ナノ粒子中のVEE−MAG25マー srRNAの免疫応答を比較し、(c)VEE−MAG25マー srRNA及びChAdV68.5WTnt.MAG25マーによる免疫化に対するT細胞応答の速度論を評価するように設計した。
6種類の異なるMamu−A*01制限エピトープに対する末梢血単核細胞(PBMC)中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の1、2、3、4、5、6、8、9、及び10週後に測定した。表21に示すように、各動物に、4及び8週目に、LNP1またはLNP2のいずれかと製剤化した用量30μgまたは100μgのVEE−MAG25マー srRNAによるブースト免疫を行った。6種類のエピトープすべてに対する複合的な免疫応答を、それぞれの免疫モニタリング時点についてプロットした(図34A〜D及び表22〜25)。
この実験は、(a)同種のプライム/ブーストまたは異種のプライム/ブーストとしてのVEE−MAG25マー srRNAの300μgの用量とChAdV68.5WTnt.MAG25マーとの組み合わせの免疫原性を評価し、(b)用量300μgで、LNP2に対してLNP1を使用した脂質ナノ粒子中のVEE−MAG25マー srRNAの免疫応答を比較し、(c)VEE−MAG25マー srRNA及びChAdV68.5WTnt.MAG25マーによる免疫化に対するT細胞応答の速度論を評価するように設計した。
Mamu−A*01インドアカゲザルを、ChAdV68.5−WTnt.MAG25マーで免疫化した。6種類の異なるMamu−A*01制限エピトープに対する末梢血単核細胞(PBMC)中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23及び24週後に測定した(図35及び表27)。動物に、4、12、及び20週目にLNP2製剤を用いてVEE−MAG25マー srRNAによる免疫化を行った。最初のChAdV68.5WTnt.MAG25マーによる初期免疫化の4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24週後に、PBMC106個当たり1750、4225、1100、2529、3218、1915、1708、1561、5077、4543、4920、5820、3395、2728、1996、1465、4730、2984、2828、または3043SFC(6つのエピトープの合計)の複合的な抗原特異的免疫応答が観察された(図35)。VEE−MAG25マー srRNAによる2度目のブースト免疫化の1週後(13週目)に測定された免疫応答は、ブースト免疫化の直前(12週目)に測定された免疫応答よりも約3倍高かった。VEE−MAG25マー srRNAによる3度目のブースト免疫化の1週後(21週目)に測定された免疫応答は、2度目のブーストで観察された応答と同様、ブースト免疫化の直前(20週目)に測定された免疫応答よりも約3倍高かった。
本発明の一実現形態では、srRNAの用量範囲実験を、mamu A01インドアカゲザルで実施することによって、どのsrRNA用量をNHP免疫原性実験に進めるべきかを特定することができる。1つの例では、mamu A01インドアカゲザルに、複数のmamu A01制限エピトープを含むモデル抗原をコードしたsrRNAベクターを筋肉内注射により投与することができる。別の例では、抗CTLA−4モノクローナル抗体を、筋肉内ワクチン注射の部位の近位に皮下投与することで1つの動物群でワクチン流入領域のリンパ節をターゲティングすることができる。最初の免疫化後、2週間ごとにPBMCを採取して免疫モニタリングを行うことができる。各実験アームを下記に記載する(表30)。
本発明の一実施形態では、免疫原性を実証するためにmamu A01インドアカゲザルでワクチン実験を行うことができる。1つの例では、mamu A01インドアカゲザルに、複数のmamu A01制限エピトープを含むモデル抗原をコードしたChAdV及び/またはsrRNAベクターを筋肉内注射により投与することができる。別の例では、一部のグループに対して、抗CTLA−4モノクローナル抗体を、筋肉内ワクチン注射の部位の近位に皮下投与する。最初の免疫化後、2週間ごとにPBMCを採取して免疫モニタリングを行うことができる。各実験アームを下記に記載する(表31)。
T細胞は、患者の血液、リンパ節、または腫瘍から単離することができる。T細胞は、例えば、抗原−MHCテトラマー結合細胞を分取することにより、またはT細胞と抗原でパルスした抗原提示細胞とのインビトロ共培養物中で刺激した活性化された細胞を分取することにより、抗原特異的T細胞について濃縮することができる。抗原ロードテトラマー及び他のMHCベースの試薬をはじめとする、抗原特異的T細胞の同定のためのさまざまな試薬が当該技術分野で知られている。
1.本明細書では、新生抗原または複数の新生抗原を含むウイルスベクターを開示する。特定の実施形態では、例えば以下のような本明細書に開示される方法を用いて新生抗原が特定される。特定の実施形態では、新生抗原は、例えば以下のような本明細書に開示される少なくとも1つの特性または性質を有する。
前記対象の腫瘍細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられ、各新生抗原のペプチド配列が、前記ペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有する、工程と、
前記新生抗原のそれぞれが前記対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を1つ以上の提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、
選択された新生抗原のセットを生成するために、前記新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と、を含む方法を開示する。
MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
前記ペアの前記MHCアレルのうちの特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の尤度と、の間の依存性を表す。
前記1つ以上の提示モデルを、対応する新生抗原のペプチド配列に適用することによって、前記1つ以上のMHCアレルのそれぞれについて、前記対応する新生抗原のペプチド配列のアミノ酸の少なくとも位置に基づいて、前記MHCアレルが前記対応する新生抗原を提示するかどうかを示す依存性スコアを生成することを含む。
前記依存性スコアを変換することによって、各MHCアレルについて、前記対応するMHCアレルが前記対応する新生抗原を提示する尤度を示す対応するアレルごと尤度を生成することと、
前記アレルごと尤度を組み合わせて前記数値的尤度を生成することと、をさらに含む。
前記依存性スコアの組み合わせを変換して前記数値的尤度を生成することを含む。
前記アレル非相互作用特性に基づいて、対応する新生抗原のペプチド配列が提示されるかどうかを示す、前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアを生成するために、1つ以上の提示モデルのうちのアレル非相互作用モデルを前記アレル非相互作用特性に適用することを含む。
1つ以上のMHCアレルの各MHCアレルについての前記依存性スコアを、前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアと組み合わせることと、
前記対応するMHCアレルが前記対応する新生抗原を提示する尤度を示す、前記MHCアレルについての対応するアレルごと尤度を生成するために、各MHCアレルについての前記組み合わされた依存性スコアを変換することと、
前記アレルごと尤度を組み合わせて前記数値的尤度を生成することと、をさらに含む。
前記MHCアレルの各々についての依存性スコアと、前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアとの組み合わせを変換することにより、前記数値的尤度を生成することを含む。
前記試料中に存在する前記訓練ペプチドのセットのペプチド存在量;
前記試料中の前記訓練ペプチドのセットのペプチド長に関連するデータをさらに含む。
a.MHCアレルと新生抗原コード化ペプチドとが結合する予測親和性;
b.新生抗原コード化ペプチド−MHC複合体の予測安定性;
c.新生抗原コード化ペプチドの配列及び長さ;
d.質量分析プロテオミクスまたは他の手段によって評価される、特定のMHCアレルを発現する他の個体由来の細胞の類似した配列を有する新生抗原コード化ペプチドの提示の確率;
e.対象とされる対象の特定のMHCアレルの発現レベル(例えば、RNA−seqまたは質量分析によって測定される);
f.特定のMHCアレルを発現する他の別個の個体における、特定のMHCアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率;
g.他の別個の対象における、同じ分子のファミリー(例えば、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DQ、HLA−DR、HLA−DP)のMHCアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率。
a.その由来源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するC末端及びN末端配列;
b.任意で、腫瘍細胞内の対応するプロテアーゼの発現(RNA−seqまたは質量分析によって測定される)にしたがって重み付けされる、新生抗原コード化ペプチド内のプロテアーゼ切断モチーフの存在;
c.適切な細胞タイプにおいて測定される由来源タンパク質の代謝回転速度;
d.RNA−seqもしくはプロテオーム質量分析によって測定される、または、DNAもしくはRNA配列データにおいて検出される生殖細胞系列もしくは体細胞系列スプライシング変異のアノテーションから予測される、腫瘍細胞に最も高発現している特定のスプライス変異体(「アイソフォーム」)を任意で考慮した、由来源タンパク質の長さ;
e.腫瘍細胞におけるプロテアソーム、イムノプロテアソーム、胸腺プロテアソーム、または他のプロテアーゼの発現のレベル(RNA−seq、プロテオーム質量分析、または免疫組織化学によって測定することができる);
f.新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の発現(例えば、RNA−seqまたは質量分析によって測定される);
g.細胞周期の異なる段階における新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の典型的な組織特異的発現;
h.例えば、uniProtまたはPDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.doにみることができるような、由来源タンパク質及び/またはそのドメインの特性の包括的なカタログ;
i.ペプチドを含む由来源タンパク質のドメインの性質を説明する特性、例えば、二次構造または三次構造(例えば、βシートに対するαヘリックス);選択的スプライシング;
j.他の別個の対象における、対象とされる新生抗原コード化ペプチドの由来源タンパク質に由来するペプチドの提示の確率;
k.ペプチドが、技術的バイアスのために質量分析によって検出されないか、または過剰に表現される確率;
l.腫瘍細胞、間質、または腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の状態について情報を与える、RNASeqによって測定される、種々の遺伝子モジュール/経路の発現(ペプチドの由来源タンパク質を含む必要はない);
m.腫瘍細胞内の新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子のコピー数;
n.ペプチドがTAPに結合する確率、またはTAPに対するペプチドの測定または予測される結合親和性;
o.腫瘍細胞におけるTAPの発現レベル(RNA−seq、プロテオーム質量分析、免疫組織化学によって測定することができる);
p.以下を含むがただしこれらに限定されない、腫瘍変異の有無:
i.EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異、
ii.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOB、HLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)における変異;その提示が、腫瘍において機能喪失変異を生ずる抗原提示マシナリーの構成要素に依存するペプチドは、提示の確率が低い;
q.以下を含むがただしこれらに限定されない、機能的生殖細胞系列多型の有無:
i.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOB、HLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)における多型;
r.腫瘍タイプ(例えば、NSCLC、メラノーマ);
s.臨床的腫瘍サブタイプ(例えば、扁平上皮肺癌対非扁平上皮);
t.喫煙歴;
u.任意でドライバー変異によって層別化される、関連する腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドの由来源遺伝子の典型的な発現。
複数の試料に由来する主要組織適合性複合体(MHC)から溶出された複数の単離ペプチドに関連するデータを含む質量分析データを受け取る工程と、
前記試料中に存在する訓練ペプチド配列のセット及び各訓練ペプチド配列に関連する1つ以上のMHCを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程と、
前記訓練ペプチド配列を含む訓練データセットを用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、前記提示モデルが、腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される複数の数値的尤度を与える、工程と、を実行することを含む方法も開示される。
ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在と、
前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を有する前記ペプチド配列の、腫瘍細胞上のMHCアレルのうちの1つによる提示の尤度との間の依存性を表す。
前記試料中に存在する前記訓練ペプチドのセットのペプチド存在量;
前記試料中の前記訓練ペプチドのセットのペプチド長に関連するデータをさらに含む。
既知のタンパク質配列のセットを含むデータベースとのアラインメントにより訓練ペプチド配列のセットを比較することによって、前記訓練ペプチド配列に基づいて、前記訓練ペプチド配列よりも長くかつ前記訓練ペプチド配列を含む前記訓練タンパク質配列のセットを取得することを含む。
細胞株からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得するために、細胞株に対して質量分析を行うかまたは質量分析がこれまでに行われていることを含んでもよく、前記ヌクレオチドシークエンシングデータは、変異を含む少なくとも1つのタンパク質配列を含む。
ワン・ホット(one−hot)エンコーディングスキームを用いて前記訓練ペプチド配列をコードすることを含む。
正常組織試料からエクソーム、トランスクリプトーム、及び全ゲノムの正常ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得することと、
前記正常ヌクレオチドシークエンシングデータを用いて、前記提示モデルの前記パラメータのセットを訓練することと、を含む。
前記パラメータのセットのロジスティック回帰を行うことを含む。
レフトパディング(left−padded)ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて前記訓練ペプチド配列をコードすることを含む。
ディープラーニングアルゴリズムを用いて前記パラメータのセットについて値を決定することを含む。
複数の新鮮なまたは凍結腫瘍試料に由来する主要組織適合性複合体(MHC)から溶出された複数の単離ペプチドに関連するデータを含む質量分析データを受け取る工程と、
前記腫瘍試料中に存在し、各訓練ペプチド配列に関連する1つ以上のMHCアレル上に提示される訓練ペプチド配列のセットを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程と、
前記訓練ペプチド配列に基づいて、訓練タンパク質配列のセットを取得する工程と、
前記訓練タンパク質配列及び前記訓練ペプチド配列を用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、前記提示モデルが、腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される複数の数値的尤度を与える、工程と、を含む方法が開示される。
MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
前記ペアの前記MHCアレルのうちの特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の尤度と、の間の依存性を表す。
アレル非相互作用情報は、その由来源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するC末端配列を含むことができる。MHC−Iでは、C末端フランキング配列は、ペプチドのプロテアソームプロセシングに影響を及ぼし得る。しかし、C末端フランキング配列は、ペプチドが小胞体に輸送され、細胞の表面上のMHCアレルと遭遇する前に、プロテアソームによってペプチドから切断される。その結果、MHC分子は、C末端フランキング配列についてのいかなる情報も受け取らず、したがって、C末端フランキング配列の効果は、MHCアレルタイプに応じて変動することができない。例えば、図2Cに示した例に戻ると、提示情報165は、ペプチドの由来源タンパク質から特定された、提示されたペプチドFJIEJFOESSのC末端フランキング配列FOEIFNDKSLDKFJIを含み得る。
本出願は、EFS−Web経由で提出され、その全容を参照によって本明細書に援用する配列表を含む。20XX年XX月に作成された前記ASCIIコピーは、XXXXXUS_sequencelisting.txtと名前が付けられており、そのサイズはX,XXX,XXXバイトである。
(a)RNAアルファウイルス骨格であって、
(i)少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列と、
(ii)少なくとも1つのポリアデニル化(ポリ(A))配列と
を含む前記RNAアルファウイルス骨格;ならびに
(b)新生抗原カセットであって、
(i)対象内に存在する腫瘍に由来する、少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列であって、
(I)前記腫瘍に由来する、少なくとも1つの腫瘍特異的かつ対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列であって、
(A)コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有する、MHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
(B)任意で5’リンカー配列と、
(C)任意で3’リンカー配列と
を含む、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列と、
(ii)任意で、前記新生抗原コード核酸配列に機能的に連結された第2のプロモーターヌクレオチド配列と、
(iii)任意で、少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列と、
(iv)任意で、少なくとも1つのGPGPGリンカー配列(SEQ ID NO:56)と、
(v)任意で、前記アルファウイルスに対して天然のポリ(A)配列または外来性のポリ(A)配列である少なくとも1つの第2のポリ(A)配列と
を含む、前記新生抗原カセット。
(a)RNAアルファウイルス骨格であって、前記RNAアルファウイルス骨格がSEQ ID NO:6に記載の核酸配列を含み、前記RNAアルファウイルス骨格の配列が26Sプロモーターヌクレオチド配列及びポリ(A)配列を含み、前記26Sプロモーター配列が前記RNAアルファウイルス骨格に対して内在性のものであり、前記ポリ(A)配列が前記RNAアルファウイルス骨格に対して内在性のものである、前記RNAアルファウイルス骨格;ならびに
(b)前記26Sプロモーターヌクレオチド配列と前記ポリ(A)配列との間に組み込まれた新生抗原カセットであって、
(i)対象内に存在する腫瘍に由来する、少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列であって、
(I)互いに直鎖状に連結された、少なくとも10個の腫瘍特異的及び対象特異的MHCクラスI新生抗原コード核酸配列であって、それぞれが、
(A)コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応する核酸配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有し、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードする、MHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
(B)前記MHC Iエピトープの天然のN末端アミノ酸配列をコードし、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、5’リンカー配列と、
(C)前記MHC Iエピトープの天然のN末端酸配列をコードし、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、3’リンカー配列と、
を含む、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列
を含み、
ここで、前記新生抗原カセットが前記26Sプロモーターヌクレオチド配列と機能的に連結され、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸13〜25個の長さのポリペプチドをコードし、各MHCクラスI新生抗原コード核酸配列の各3’末端が、前記新生抗原カセット内の最後のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を除いて、それに続くMHCクラスI新生抗原コード核酸配列の5’末端に連結されている、
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列と、
(ii)少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列であって、
(I)PADRE MHCクラスII配列(SEQ ID NO:48)と、
(II)破傷風トキソイドMHCクラスII配列(SEQ ID NO:46)と、
(III)前記PADRE MHCクラスII配列と前記破傷風トキソイドMHCクラスII配列とを連結するGPGPGアミノ酸リンカー配列(SEQ ID NO:56)をコードする、第1の核酸配列と、
(IV)前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の5’末端と前記少なくとも20個の腫瘍特異的かつ対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列とを連結するGPGPGアミノ酸リンカー配列(SEQ ID NO:56)をコードする、第2の核酸配列と、
(V)任意で、前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の3’末端のGPGPGアミノ酸リンカー配列(SEQ ID NO:56)をコードする、第3の核酸配列と
を含む、前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列と
を含む、前記新生抗原カセット。
Pa−(L5b−Nc−L3d)X−(G5e−Uf)Y−G3g
を含む式で示され、式中、Pは、前記第2のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここで、a=0または1であり、Nは、前記MHCクラスIエピトープコード核酸配列のうちの1つを含み、ここで、c=1であり、L5は、前記5’リンカー配列を含み、ここで、b=0または1であり、L3は、前記3’リンカー配列を含み、ここで、d=0または1であり、G5は、GPGPGアミノ酸リンカー(SEQ ID NO:56)をコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここで、e=0または1であり、G3は、GPGPGアミノ酸リンカー(SEQ ID NO:56)をコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここで、g=0または1であり、Uは、前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列のうちの1つを含み、ここで、f=1であり、X=1〜400であり、ここで、各Xについて、対応するNcは、エピトープコード核酸配列であり、Y=0、1、または2であり、ここで、各Yについて、対応するUfは、抗原コード核酸配列である。いくつかの態様では、各Xについて、対応するNcは、異なるMHCクラスIエピトープコード核酸配列である。いくつかの態様では、各Yについて、対応するUfは、異なるMHCクラスII抗原コード核酸配列である。
式中、L1及びL2は、それぞれ独立して、−O(C=O)−、−(C=O)O−、−C(=O)−、−O−、−S(O)x−、−S−S−、−C(=O)S−、−SC(=O)−、−RaC(=O)−、−C(=O)Ra−、− RaC(=O)Ra−、−OC(=O)Ra−、−RaC(=O)O−、または直接的結合であり、G1は、Ci〜C2アルキレン、−(C=O)−、−O(C=O)−、−SC(=O)−、−RaC(=O)−、または直接的結合であり、−C(=O)−、−(C=O)O−、−C(=O)S−、−C(=O)Ra−、または直接的結合であり、Gは、Ci〜C6アルキレンであり、Raは、HまたはC1〜C12アルキルであり、R1a及びR1bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R1aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R1bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR1b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R2a及びR2bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R2aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R2bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR2b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R3a及びR3bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R3aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R3bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R4a及びR4bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R4aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R4bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR4b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R5及びR6は、それぞれ独立してHまたはメチルであり、R7は、C4〜C20アルキルであり、R8及びR9は、それぞれ独立してC1〜C12アルキルであるか、またはR8及びR9は、それらが結合する窒素原子と共に、5、6、または7員の複素環を形成し、a、b、c、及びdは、それぞれ独立して1〜24の整数であり、xは0、1、または2である。
式中、L1及びL2は、それぞれ独立して−O(C=O)−、−(C=O)O−、または炭素−炭素二重結合であり、R1a及びR1bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R1aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R1bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR1b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R2a及びR2bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R2aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R2bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR2b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R3a及びR3bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R3aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R3bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR3b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R4a及びR4bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R4aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R4bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR4b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R5及びR6は、それぞれ独立してHまたはメチルであり、R7は、各出現時に、独立してHまたはC1〜C12アルキルであり、R8及びR9は、それぞれ独立して、非置換のC1〜C12アルキルであるか、またはR8及びR9は、それらが結合する窒素原子と共に、1個の窒素原子を含む5、6、または7員の複素環を形成し、a及びdは、それぞれ独立して0〜24の整数であり、b及びcはそれぞれ独立して1〜24の整数であり、eは1または2であり、ただし、R1a、R2a、R3a、もしくはR4aのうちの少なくとも1つが、C1〜C12アルキルであるか、またはL1もしくはL2の少なくとも一方が、−O(C=O)−もしくは−(C=O)O−であり、R1a及びR1bは、aが6である場合にはイソプロピルでなく、aが8である場合にはn−ブチルでない。
式中、R10及びR11は、それぞれ独立して、10〜30個の炭素原子を含む、直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は任意で1つ以上のエステル結合によって中断され、zは、30〜60の範囲の平均値を有する。いくつかの態様では、R10及びR11は、それぞれ独立して、12〜16個の炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル鎖である。いくつかの態様では、平均zは、約45である。
ここから開始
[本発明1001]
新生抗原発現系を含む、新生抗原発現系を送達するための組成物であって、
前記新生抗原発現系が、1つ以上のベクターを含み、
前記1つ以上のベクターが、以下を含む、前記組成物:
(a)RNAアルファウイルス骨格であって、
(i)少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列と、
(ii)少なくとも1つのポリアデニル化(ポリ(A))配列と
を含む前記RNAアルファウイルス骨格;ならびに
(b)新生抗原カセットであって、
(i)対象内に存在する腫瘍に由来する、少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列であって、
(I)前記腫瘍に由来する、少なくとも1つの腫瘍特異的かつ対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列であって、
(A)コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有する、MHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
(B)任意で5’リンカー配列と、
(C)任意で3’リンカー配列と
を含む、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列と、
(ii)任意で、前記新生抗原コード核酸配列に機能的に連結された第2のプロモーターヌクレオチド配列と、
(iii)任意で、少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列と、
(iv)任意で、GPGPGアミノ酸リンカー配列(SEQ ID NO:56)をコードする少なくとも1つの核酸配列と、
(v)任意で、前記アルファウイルスに対して天然のポリ(A)配列または外来性のポリ(A)配列である少なくとも1つの第2のポリ(A)配列と
を含む、前記新生抗原カセット。
[本発明1002]
新生抗原発現系を含む、新生抗原発現系を送達するための組成物であって、
前記新生抗原発現系が、1つ以上のベクターを含み、
前記1つ以上のベクターが、以下を含む、前記組成物:
(a)RNAアルファウイルス骨格であって、前記RNAアルファウイルス骨格がSEQ ID NO:6に記載の核酸配列を含み、前記RNAアルファウイルス骨格の配列が26Sプロモーターヌクレオチド配列及びポリ(A)配列を含み、前記26Sプロモーター配列が前記RNAアルファウイルス骨格に対して内在性のものであり、前記ポリ(A)配列が前記RNAアルファウイルス骨格に対して内在性のものである、前記RNAアルファウイルス骨格;ならびに
(b)前記26Sプロモーターヌクレオチド配列と前記ポリ(A)配列との間に組み込まれた新生抗原カセットであって、
(i)対象内に存在する腫瘍に由来する、少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列であって、
(I)互いに直鎖状に連結された、少なくとも10個の腫瘍特異的かつ対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列であって、それぞれが、
(A)コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有し、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードする、MHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
(B)前記MHC Iエピトープの天然のN末端アミノ酸配列をコードし、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、5’リンカー配列と、
(C)前記MHC Iエピトープの天然のN末端アミノ酸配列をコードし、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、3’リンカー配列と
を含む、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列
を含み、
ここで、前記新生抗原カセットが前記26Sプロモーターヌクレオチド配列と機能的に連結され、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸13〜25個の長さのポリペプチドをコードし、各MHCクラスI新生抗原コード核酸配列の各3’末端が、前記新生抗原カセット内の最後のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を除いて、それに続くMHCクラスI新生抗原コード核酸配列の5’末端に連結されている、
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列と、
(ii)少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列であって、
(I)PADRE MHCクラスII配列(SEQ ID NO:48)と、
(II)破傷風トキソイドMHCクラスII配列(SEQ ID NO:46)と、
(III)前記PADRE MHCクラスII配列と前記破傷風トキソイドMHCクラスII配列とを連結するGPGPGアミノ酸リンカー配列をコードする、第1の核酸配列と、
(IV)前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の5’末端と前記少なくとも20個の腫瘍特異的かつ対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列とを連結するGPGPGアミノ酸リンカー配列をコードする、第2の核酸配列と、
(V)任意で、前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の3’末端のGPGPGアミノ酸リンカー配列をコードする、第3の核酸配列と
を含む、前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列と
を含む、前記新生抗原カセット。
[本発明1003]
前記新生抗原カセットの各要素の順序付けられた配列が、5’から3’に向かって、
P a −(L5 b −N c −L3 d ) X −(G5 e −U f ) Y −G3 g
を含む式で示され、
式中、Pは、前記第2のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここで、a=0または1であり、
Nは、前記MHCクラスIエピトープコード核酸配列のうちの1つを含み、ここで、c=1であり、
L5は、前記5’リンカー配列を含み、ここで、b=0または1であり、
L3は、前記3’リンカー配列を含み、ここで、d=0または1であり、
G5は、GPGPGアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここで、e=0または1であり、
G3は、GPGPGアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここで、g=0または1であり、
Uは、前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列のうちの1つを含み、ここで、f=1であり、
X=1〜400であり、ここで、各Xについて、対応するN c は、エピトープコード核酸配列であり、
Y=0、1、または2であり、ここで、各Yについて、対応するU f は、抗原コード核酸配列である、
本発明1001の組成物。
[本発明1004]
各Xについて、対応するN c が、異なるMHCクラスIエピトープコード核酸配列である、本発明1003の組成物。
[本発明1005]
各Yについて、対応するU f が、異なるMHCクラスII抗原コード核酸配列である、本発明1003または1004の組成物。
[本発明1006]
a=0、b=1、d=1、e=1、g=1、h=1、X=20、Y=2であり、
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記RNAアルファウイルス骨格によって与えられる単一の26Sプロモーターヌクレオチド配列であり、
前記少なくとも1つのポリアデニル化ポリ(A)配列が、前記RNAアルファウイルス骨格によって与えられる少なくとも100個の連続したAヌクレオチドのポリ(A)配列であり、
各Nが、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードし、
L5が、前記MHC Iエピトープの天然のN末端アミノ酸配列をコードする天然の5’リンカー配列であり、前記5’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、
L3が、前記MHC Iエピトープの天然の末端核酸配列をコードする天然の3’リンカー配列であり、前記3’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、
Uが、PADREクラスII配列及び破傷風トキソイドMHCクラスII配列のそれぞれであり、
前記RNAアルファウイルス骨格が、SEQ ID NO:6に記載の配列であり、
前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸13個〜25個の長さのポリペプチドをコードする、
本発明1003〜1005のいずれかの組成物。
[本発明1007]
ナノ粒子状の送達ビヒクルをさらに含む、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1008]
前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが、脂質ナノ粒子(LNP)である、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
前記LNPが、イオン化可能なアミノ脂質を含む、本発明1008の組成物。
[本発明1010]
前記イオン化可能なアミノ脂質が、MC3様(ジリノレイルメチル−4−ジメチルアミノブチレート)分子を含む、本発明1009の組成物。
[本発明1011]
前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが新生抗原発現系を封入する、本発明1007〜1010のいずれかの組成物。
[本発明1012]
複数のLNPをさらに含み、前記LNPが、
新生抗原発現系と、
カチオン性脂質と、
非カチオン性脂質と、
LNPの凝集を阻害する複合脂質と
を含み、前記複数のLNPのうち、少なくとも約95%のLNPが、
(a)非ラメラ形態を有するか、または、
(b)高電子密度である、
本発明1008の組成物。
[本発明1013]
前記非カチオン性脂質が、
(1)リン脂質、及び
(2)コレステロールまたはコレステロール誘導体
の混合物である、本発明1012の組成物。
[本発明1014]
前記LNPの凝集を阻害する複合脂質が、ポリエチレングリコール(PEG)−脂質複合体である、本発明1012または1013の組成物。
[本発明1015]
前記PEG−脂質複合体が、PEG−ジアシルグリセロール(PEG−DAG)複合体、PEG−ジアルキルオキシプロピル(PEG−DAA)複合体、PEG−リン脂質複合体、PEG−セラミド(PEG−Cer)複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択される、本発明1014の組成物。
[本発明1016]
前記PEG−DAA複合体が、PEG−ジデシルオキシプロピル(C 10 )複合体、PEG−ジラウリルオキシプロピル(C 12 )複合体、PEG−ジミリスチルオキシプロピル(C 14 )複合体、PEG−ジパルミチルオキシプロピル(C 16 )複合体、PEG−ジステアリルオキシプロピル(C 18 )複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである、本発明1015の組成物。
[本発明1017]
前記LNPの非ラメラ形態が、逆六方晶(H II )または立方晶相構造を含む、本発明1012〜1016のいずれかの組成物。
[本発明1018]
前記カチオン性脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約10mol%〜約50mol%を構成する、本発明1012〜1017のいずれかの組成物。
[本発明1019]
前記カチオン性脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約20mol%〜約50mol%を構成する、本発明1012〜1017のいずれかの組成物。
[本発明1020]
前記カチオン性脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約20mol%〜約40mol%を構成する、本発明1012〜1017のいずれかの組成物。
[本発明1021]
前記非カチオン性脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約10mol%〜約60mol%を構成する、本発明1012〜1020のいずれかの組成物。
[本発明1022]
前記非カチオン性脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約20mol%〜約55mol%を構成する、本発明1012〜1020のいずれかの組成物。
[本発明1023]
前記非カチオン性脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約25mol%〜約50mol%を構成する、本発明1012〜1020のいずれかの組成物。
[本発明1024]
前記複合脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約0.5mol%〜約20mol%を構成する、本発明1012〜1023のいずれかの組成物。
[本発明1025]
前記複合脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約2mol%〜約20mol%を構成する、本発明1012〜1023のいずれかの組成物。
[本発明1026]
前記複合脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約1.5mol%〜約18mol%を構成する、本発明1012〜1023のいずれかの組成物。
[本発明1027]
前記LNPの95%超が非ラメラ形態を有する、本発明1012〜1026のいずれかの組成物。
[本発明1028]
前記LNPの95%超が高電子密度である、本発明1012〜1027のいずれかの組成物。
[本発明1029]
複数のLNPをさらに含み、前記LNPが、
前記LNP中に存在する全脂質の50mol%〜65mol%を構成するカチオン性脂質と、
前記LNP中に存在する全脂質の0.5mol%〜2mol%を構成する、LNPの凝集を阻害する複合脂質と、
(a)リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、前記リン脂質が前記LNP中に存在する全脂質の4mol%〜10mol%を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記LNP中に存在する全脂質の30mol%〜40mol%を構成する、前記混合物、
(b)リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、前記リン脂質が前記LNP中に存在する全脂質の3mol%〜15mol%を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記LNP中に存在する全脂質の30mol%〜40mol%を構成する、前記混合物、または、
(c)前記LNP中に存在する全脂質の49.5mol%以下であり、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含み、前記コレステロールまたはその誘導体が、前記LNP中に存在する全脂質の30mol%から40mol%を構成するもの
のいずれかを含む、非カチオン性脂質と
を含む、本発明1008〜1028のいずれかの組成物。
[本発明1030]
複数のLNPをさらに含み、前記LNPが、
前記LNP中に存在する全脂質の50mol%〜85mol%を構成するカチオン性脂質と、
前記LNP中に存在する全脂質の0.5mol%〜2mol%を構成する、LNPの凝集を阻害する複合脂質と、
前記LNP中に存在する全脂質の13mol%〜49.5mol%を構成する非カチオン性脂質と
を含む、本発明1008〜1028のいずれかの組成物。
[本発明1031]
前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、またはこれらの混合物を含む、本発明1029の組成物。
[本発明1032]
前記複合脂質が、ポリエチレングリコール(PEG)−脂質複合体を含む、本発明1029または1030の組成物。
[本発明1033]
前記PEG−脂質複合体が、PEG−ジアシルグリセロール(PEG−DAG)複合体、PEG−ジアルキルオキシプロピル(PEG−DAA)複合体、またはこれらの混合物を含む、本発明1032の組成物。
[本発明1034]
前記PEG−DAA複合体が、PEG−ジミリスチルオキシプロピル(PEG−DMA)複合体、PEG−ジステアリルオキシプロピル(PEG−DSA)複合体、またはこれらの混合物を含む、本発明1033の組成物。
[本発明1035]
前記複合体のPEG部分が、約2000ダルトンの平均分子量を有する、本発明1032〜1034のいずれかの組成物。
[本発明1036]
前記複合脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の1mol%〜2mol%を構成する、本発明1029〜1035のいずれかの組成物。
[本発明1037]
前記LNPが、式Iの構造を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む、本発明1008〜1036のいずれかの組成物:
式中、
L 1 及びL 2 は、それぞれ独立して、−O(C=O)−、−(C=O)O−、−C(=O)−、−O−、−S(O) x −、−S−S−、−C(=O)S−、−SC(=O)−、−R a C(=O)−、−C(=O)R a −、−R a C(=O)R a −、−OC(=O)R a −、−R a C(=O)O−、または直接的結合であり、
G 1 は、Ci〜C 2 アルキレン、−(C=O)−、−O(C=O)−、−SC(=O)−、−R a C(=O)−、または直接的結合であり、
−C(=O)−、−(C=O)O−、−C(=O)S−、−C(=O)R a −、または直接的結合であり、
Gは、Ci〜C 6 アルキレンであり、
R a は、HまたはC 1 〜C 12 アルキルであり、
R 1a 及びR 1b は、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであるか、または(b)R 1a は、HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであり、R 1b はそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR 1b 及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R 2a 及びR 2b は、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであるか、または(b)R 2a は、HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであり、R 2b はそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR 2b 及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R 3a 及びR 3b は、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであるか、または(b)R 3a は、HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであり、R 3b はそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R 4a 及びR 4b は、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであるか、または(b)R 4a は、HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであり、R 4b はそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR 4b 及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R 5 及びR 6 は、それぞれ独立してHまたはメチルであり、
R 7 は、C 4 〜C 20 アルキルであり、
R 8 及びR 9 は、それぞれ独立してC 1 〜C 12 アルキルであるか、またはR 8 及びR 9 は、それらが結合する窒素原子と共に、5、6、または7員の複素環を形成し、
a、b、c、及びdは、それぞれ独立して1〜24の整数であり、xは0、1、または2である。
[本発明1038]
前記LNPが、式IIの構造を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む、本発明1008〜1036のいずれかの組成物:
式中、
L 1 及びL 2 は、それぞれ独立して−O(C=O)−、−(C=O)O−、または炭素−炭素二重結合であり、
R 1a 及びR 1b は、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであるか、または(b)R 1a は、HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであり、R 1b はそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR 1b 及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R 2a 及びR 2b は、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであるか、または(b)R 2a は、HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであり、R 2b はそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR 2b 及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R 3a 及びR 3b は、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであるか、または(b)R 3a は、HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであり、R 3b はそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR 3b 及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R 4a 及びR 4b は、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであるか、または(b)R 4a は、HもしくはC 1 〜C 12 アルキルであり、R 4b はそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR 4b 及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R 5 及びR 6 は、それぞれ独立してメチルまたはシクロアルキルであり、
R 7 は、各出現時に、独立してHまたはC 1 〜C 12 アルキルであり、
R 8 及びR 9 は、それぞれ独立して、非置換のC 1 〜C 12 アルキルであるか、またはR 8 及びR 9 は、それらが結合する窒素原子と共に、1個の窒素原子を含む5、6、または7員の複素環を形成し、
a及びdは、それぞれ独立して0〜24の整数であり、b及びcはそれぞれ独立して1〜24の整数であり、eは1または2であり、
ただし、
R 1a 、R 2a 、R 3a 、もしくはR 4a のうちの少なくとも1つが、C 1 〜C 12 アルキルであるか、またはL 1 もしくはL 2 の少なくとも一方が、−O(C=O)−または−(C=O)O−であり、
R 1a 及びR 1b は、aが6である場合にはイソプロピルでなく、aが8である場合にはn−ブチルでない。
[本発明1039]
中性脂質、ステロイド、及びポリマーコンジュゲート脂質を含む1つ以上の賦形剤をさらに含む、本発明1037または1039の組成物。
[本発明1040]
前記中性脂質が、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DSPC)、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DPPC)、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DMPC)、1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(POPC)、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DOPC)、及び 1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE)のうちの少なくとも1つを含む、本発明1039の組成物。
[本発明1041]
前記中性脂質がDSPCである、本発明1040の組成物。
[本発明1042]
前記化合物と前記中性脂質とのモル比が、約2:1〜約8:1の範囲である、本発明1039〜1041のいずれかの組成物。
[本発明1043]
前記ステロイドがコレステロールである、本発明1039〜1042のいずれかの組成物。
[本発明1044]
前記化合物と前記コレステロールとのモル比が、約2:1〜1:1の範囲である、本発明1043の組成物。
[本発明1045]
前記ポリマーコンジュゲート脂質がPEG化脂質である、本発明1039〜1044のいずれかの組成物。
[本発明1046]
前記化合物と前記PEG化脂質とのモル比が、約100:1〜約25:1の範囲である、本発明1045の組成物。
[本発明1047]
前記PEG化脂質が、PEG−DAG、PEGポリエチレン(PEG−PE)、PEG−スクシノイル−ジアシルグリセロール(PEG−S−DAG)、PEG−cer、またはPEGジアルキオキシプロピルカルバメートである、本発明1045または1046の組成物。
[本発明1048]
前記PEG化脂質が、下記構造IIIを有する、本発明1045または1046の組成物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、もしくは立体異性体:
式中、
R 10 及びR 11 は、それぞれ独立して、10〜30個の炭素原子を含む、直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は任意で1つ以上のエステル結合によって中断され、
zは、30〜60の範囲の平均値を有する。
[本発明1049]
R 10 及びR 11 が、それぞれ独立して、12〜16個の炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル鎖である、本発明1048の組成物。
[本発明1050]
前記平均zが、約45である、本発明1048または1049の組成物。
[本発明1051]
前記LNPが、ポリアニオン性の核酸と混合される際に非二重層構造に自己組織化する、本発明1008〜1050のいずれかの組成物。
[本発明1052]
前記非二重層構造が、60nm〜120nmの直径を有する、本発明1051の組成物。
[本発明1053]
前記非二重層構造が、約70nm、約80nm、約90nm、または約100nmの直径を有する、本発明1051の組成物。
[本発明1054]
前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが、約100nmの直径を有する、本発明1007〜1053のいずれかの組成物。
[本発明1055]
前記新生抗原カセットが、前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列と前記少なくとも1つのポリ(A)配列との間に組み込まれている、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1054のいずれかの組成物。
[本発明1056]
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記新生抗原コード核酸配列と機能的に連結されている、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1055のいずれかの組成物。
[本発明1057]
前記1つ以上のベクターが、1つ以上の+鎖RNAベクターを含む、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1056のいずれかの組成物。
[本発明1058]
前記1つ以上の+鎖RNAベクターが、5’7−メチルグアノシン(m7g)キャップを含む、本発明1057の組成物。
[本発明1059]
前記1つ以上の+鎖RNAベクターが、インビトロ転写によって生成される、本発明1057または1058の組成物。
[本発明1060]
前記1つ以上のベクターが、哺乳動物細胞内で自己複製する、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1059のいずれかの組成物。
[本発明1061]
前記RNAアルファウイルス骨格が、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1060のいずれかの組成物。
[本発明1062]
前記RNAアルファウイルス骨格が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1060のいずれかの組成物。
[本発明1063]
前記RNAアルファウイルス骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、26Sプロモーター配列、ポリ(A)配列、非構造タンパク質1(nsP1)遺伝子、nsP2遺伝子、nsP3遺伝子、及びnsP4遺伝子を含む、本発明1061または1062の組成物。
[本発明1064]
前記RNAアルファウイルス骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、26Sプロモーター配列、及びポリ(A)配列を含む、本発明1061または1062の組成物。
[本発明1065]
前記非構造タンパク質媒介増幅のための配列が、アルファウイルス5’ UTR、51ntのCSE、24ntのCSE、26Sサブゲノミックプロモーター配列、19ntのCSE、アルファウイルス3’ UTR、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1063または1064の組成物。
[本発明1066]
前記RNAアルファウイルス骨格が構造ビリオンタンパク質カプシドE2及びE1をコードしていない、本発明1063〜1065のいずれかの組成物。
[本発明1067]
前記新生抗原カセットが、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内の構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入されている、本発明1066の組成物。
[本発明1068]
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:5に記載の配列を含む、本発明1061または1062の組成物。
[本発明1069]
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、塩基対7544と11175との間の欠失をさらに含むSEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:5の配列を含む、本発明1061または1062のの組成物。
[本発明1070]
前記RNAアルファウイルス骨格が、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:7に記載の配列を含む、本発明1069の組成物。
[本発明1071]
前記新生抗原カセットが、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:5の配列に記載される塩基対7544と11175との間の前記欠失を置換するように7544位に挿入されている、本発明1069または1070の組成物。
[本発明1072]
前記新生抗原カセットの挿入が、nsP1〜4遺伝子及び少なくとも1つの抗原コード核酸配列を含むポリシストロニックRNAの転写をもたらし、前記nsP1〜4遺伝子及び前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が別々のオープンリーディングフレーム内にある、本発明1067〜1071のいずれかの組成物。
[本発明1073]
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記RNAアルファウイルス骨格によってコードされた天然の26Sプロモーターヌクレオチド配列である、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1072のいずれかの組成物。
[本発明1074]
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、外来性のRNAプロモーターである、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1072のいずれかの組成物。
[本発明1075]
前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が、26Sプロモーターヌクレオチド配列である、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1074のいずれかの組成物。
[本発明1076]
前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が複数の26Sプロモーターヌクレオチド配列を含み、各26Sプロモーターヌクレオチド配列が、前記別々のオープンリーディングフレームのうちの1つ以上の転写をもたらす、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1074のいずれかの組成物。
[本発明1077]
前記1つ以上のベクターが、それぞれ少なくとも300ntのサイズである、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1078]
前記1つ以上のベクターが、それぞれ少なくとも1kbのサイズである、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1079]
前記1つ以上のベクターが、それぞれ2kbのサイズである、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1080]
前記1つ以上のベクターが、それぞれ5kb未満のサイズである、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1081]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、腫瘍細胞上のMHCクラスIによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1082]
各抗原コード核酸配列が互いに直接連結されている、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1081のいずれかの組成物。
[本発明1083]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、リンカーをコードする核酸配列によって異なる抗原コード核酸配列と連結されている、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1082のいずれかの組成物。
[本発明1084]
前記リンカーが、2個のMHCクラスI配列または1個のMHCクラスI配列を1個のMHCクラスII配列と連結する、本発明1083の組成物。
[本発明1085]
前記リンカーが、
(1)少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したグリシン残基、
(2)少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したアラニン残基、
(3)2個のアルギニン残基(RR)、
(4)アラニン、アラニン、チロシン(AAY)、
(5)哺乳動物プロテアソームによって効率的にプロセシングされる、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さのコンセンサス配列、及び
(6)元のタンパク質と同種のタンパク質に由来する抗原に隣接し、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、または2〜20個の長さの1つ以上の天然配列
からなる群から選択される、本発明1084の組成物。
[本発明1086]
前記リンカーが、2個のMHCクラスII配列または1個のMHCクラスII配列を1個のMHCクラスI配列と連結する、本発明1083の組成物。
[本発明1087]
前記リンカーが、配列GPGPGを含む、本発明1086の組成物。
[本発明1088]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つの配列が、
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセシング及び提示、ならびに/または免疫原性を高める、分離したまたは連続的な配列
に機能的または直接的に連結されている、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1087のいずれかの組成物。
[本発明1089]
前記分離したまたは連続的な配列が、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変されたユビキチン配列(例えば、76位にGlyからAlaへの置換を含むユビキチン配列)、免疫グロブリンシグナル配列(例えばIgK)、主要組織適合性クラスI配列、リソソーム関連膜タンパク質(LAMP)−1、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスII配列のうちの少なくとも1つを含み、任意でプロテアソームターゲティング性を高めるように改変された前記ユビキチン配列がA76である、本発明1088の組成物。
[本発明1090]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレルに対する増大した結合親和性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1091]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列の少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレルに対する増大した結合安定性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1092]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレル上への増大した提示の尤度を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1093]
前記少なくとも1つの変化が、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、またはプロテアソームにより生成されたスプライスされた抗原を含む、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1094]
前記腫瘍が、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、T細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1095]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列が、少なくとも2〜10個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の核酸配列を含む、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1094のいずれかの組成物。
[本発明1096]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列が、少なくとも11〜20個、15〜20個、11〜100個、11〜200個、11〜300個、11〜400個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、または最大で400個の核酸配列を含む、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1094のいずれかの組成物。
[本発明1097]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列が少なくとも2〜400個の核酸配列を含み、前記新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも2個が、腫瘍細胞表面上のMHCクラスIによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1094のいずれかの組成物。
[本発明1098]
前記新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも2つが、腫瘍細胞表面上のMHCクラスIによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、本発明1002または1006の組成物。
[本発明1099]
対象に投与されて翻訳された場合、前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列によってコードされた新生抗原のうちの少なくとも1つが抗原提示細胞上に提示され、腫瘍細胞表面上の新生抗原の少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらす、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1100]
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列が、対象に投与されて翻訳された場合、MHCクラスIまたはクラスII新生抗原のうちの少なくとも1つが抗原提示細胞上に提示され、腫瘍細胞表面上の新生抗原の少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらし、任意で、前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列のそれぞれの発現が、前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列によって誘導される、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1101]
各MHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、アミノ酸8〜35個の長さ、任意で、アミノ酸9〜17個、9〜25個、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35個のポリペプチド配列をコードする、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1100のいずれかの組成物。
[本発明1102]
前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在する、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1101のいずれかの組成物。
[本発明1103]
前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在し、かつ、前記コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を含む少なくとも1つのMHCクラスII新生抗原コード核酸配列を含む、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1101のいずれかの組成物。
[本発明1104]
前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が、アミノ酸12〜20個、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、または20〜40個の長さである、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1103のいずれかの組成物。
[本発明1105]
前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在し、かつ、少なくとも1つのユニバーサルMHCクラスII抗原コード核酸配列を含み、任意で、前記少なくとも1つのユニバーサル配列が、破傷風トキソイド及びPADREの少なくとも一方を含む、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1104のいずれかの組成物。
[本発明1106]
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が誘導性である、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1105のいずれかの組成物。
[本発明1107]
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が非誘導性である、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1105のいずれかの組成物。
[本発明1108]
前記少なくとも1つのポリ(A)配列が、前記アルファウイルスに天然に存在するポリ(A)配列を含む、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1107のいずれかの組成物。
[本発明1109]
前記少なくとも1つのポリ(A)配列が、前記アルファウイルスに対して外来性のポリ(A)配列を含む、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1107のいずれかの組成物。
[本発明1110]
前記少なくとも1つのポリ(A)配列が、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つと機能的に連結されている、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1109のいずれかの組成物。
[本発明1111]
前記少なくとも1つのポリ(A)配列が、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、または少なくとも90個の連続したAヌクレオチドである、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1110のいずれかの組成物。
[本発明1112]
前記少なくとも1つのポリ(A)配列が、少なくとも100個の連続したAヌクレオチドである、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1110のいずれかの組成物。
[本発明1113]
前記新生抗原カセットが、
イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子(WPRE)配列、内部リボソーム進入配列(IRES)配列、2A自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結された、mRNAの核輸送、安定性、もしくは翻訳効率を向上させることが知られている5’もしくは3’末端非コード領域内の配列
のうちの少なくとも1つをさらに含む、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1114]
前記新生抗原カセットが、緑色蛍光タンパク質(GFP)、GFP変異体、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ変異体、または検出可能なペプチドもしくはエピトープを含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1115]
前記検出可能なペプチドまたはエピトープが、HAタグ、Flagタグ、Hisタグ、またはV5タグからなる群から選択される、本発明1114の組成物。
[本発明1116]
前記1つ以上のベクターが、少なくとも1つの免疫調節物質をコードする1つ以上の核酸配列をさらに含む、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1117]
前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、本発明1116の組成物。
[本発明1118]
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、一本鎖Fv(scFv)、単一特異的もしくは互いに連結された多重特異性の単一ドメイン抗体(sdAb)(例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン)、または完全長の一本鎖抗体(例えば、フレキシブルリンカーによって重鎖と軽鎖が連結された完全長IgG)である、本発明1117の組成物。
[本発明1119]
前記抗体の重鎖配列と軽鎖配列が、2Aなどの自己切断配列もしくはIRESによって分けられた連続的配列であるか、または前記抗体の重鎖配列と軽鎖配列が、連続したグリシン残基などのフレキシブルリンカーによって連結されている、本発明1117または1118の組成物。
[本発明1120]
前記免疫調節物質がサイトカインである、本発明1116の組成物。
[本発明1121]
前記サイトカインが、IL−2、IL−7、IL−12、IL−15、もしくはIL−21、またはそれぞれのその変異体のうちの1つである、本発明1120の組成物。
[本発明1122]
前記少なくとも1つのMHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、
(a)腫瘍から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、工程と、
(b)新生抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のMHCアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、
(c)新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択することにより、前記少なくとも1つのMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成する工程と
を行うことによって選択される、本発明1001、1003〜1005、または1007〜1121のいずれかの組成物。
[本発明1123]
前記MHCクラスIエピトープコード核酸配列のそれぞれが、
(a)腫瘍から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、工程と、
(b)新生抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のMHCアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、
(c)前記少なくとも20個のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成するために、新生抗原のセットのサブセットを、数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と
を行うことによって選択される、本発明1002または1006の組成物。
[本発明1124]
前記選択された新生抗原のセットの数が、2〜20である、本発明1122の組成物。
[本発明1125]
前記提示モデルが、
(a)前記MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
(b)前記ペアの前記MHCアレルのうちの前記特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の尤度と
の間の依存性を表す、本発明1122〜1124のいずれかの組成物。
[本発明1126]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原を選択することを含む、本発明1122〜1125のいずれかの組成物。
[本発明1127]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて前記対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含む、本発明1122〜1126のいずれかの組成物。
[本発明1128]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)によってナイーブT細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含み、任意で、前記APCが樹状細胞(DC)である、本発明1122〜1127のいずれかの組成物。
[本発明1129]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している新生抗原を選択することを含む、本発明1122〜1128のいずれかの組成物。
[本発明1130]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて前記対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原を選択することを含む、本発明1122〜1129のいずれかの組成物。
[本発明1131]
エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータが、腫瘍組織でシークエンシングを行うことによって取得される、本発明1122〜1130のいずれかの組成物。
[本発明1132]
前記シークエンシングが、次世代シークエンシング(NGS)または任意の大規模並列処理シークエンシングアプローチである、本発明1131の組成物。
[本発明1133]
前記新生抗原カセットが、前記新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列を含む、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1134]
少なくとも1つの、または各ジャンクショナルエピトープ配列が、MHCに対して500nMよりも高い親和性を有する、本発明1133の組成物。
[本発明1135]
各ジャンクショナルエピトープ配列が非自己である、本発明1133または1134の組成物。
[本発明1136]
前記新生抗原カセットが、翻訳後の野生型核酸配列を含む非治療的MHCクラスIまたはクラスIIエピトープ核酸配列をコードしておらず、前記非治療的エピトープが前記対象のMHCアレル上に提示されると予測される、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明1137]
前記非治療的な予測されたMHCクラスIまたはクラスIIエピトープ配列が、前記新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列である、本発明1136の組成物。
[本発明1138]
前記予測が、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づいたものである、本発明1133〜1137のいずれかの組成物。
[本発明1139]
前記新生抗原カセット内における少なくとも1つの抗原コード核酸配列の順序が、
(a)前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の異なる順序に対応した候補新生抗原カセット配列のセットを生成する工程、
(b)前記各候補新生抗原カセット配列について、前記候補新生抗原カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定する工程、及び
(c)所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、新生抗原ワクチン用の新生抗原カセット配列として選択する工程
を含む一連の工程によって決定される、本発明1133〜1138のいずれかの組成物。
[本発明1140]
先行本発明のいずれかの組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[本発明1141]
アジュバントをさらに含む、本発明1140の組成物。
[本発明1142]
免疫調節物質をさらに含む、本発明1140または1141の医薬組成物。
[本発明1143]
前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、本発明1142の医薬組成物。
[本発明1144]
先行の組成物の発明のいずれかの新生抗原カセットと、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:5の配列から得られる1つ以上の要素とを含む、単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットであって、任意で、前記1つ以上の要素が、非構造タンパク質媒介増幅に必要な配列、26Sプロモーターヌクレオチド配列、ポリ(A)配列、及びSEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:5に記載の配列のnsP1〜4遺伝子からなる群から選択され、任意で、前記ヌクレオチド配列がcDNAである、前記単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセット。
[本発明1145]
前記配列または単離ヌクレオチド配列のセットが、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:7に記載の配列の7544位に挿入された先行の組成物の発明のいずれかの新生抗原カセットを含む、本発明1144の単離ヌクレオチド配列。
[本発明1146]
SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:5の配列から得られた前記1つ以上の要素の5’側に位置するT7またはSP6 RNAポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列と、
任意で、前記ポリ(A)配列の3’側に位置する1つ以上の制限部位と
をさらに含む、本発明1144または1145の単離ヌクレオチド配列。
[本発明1147]
先行の組成物の発明のいずれかの新生抗原カセットが、SEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:9の7563位に挿入されている、本発明1144の単離ヌクレオチド配列。
[本発明1148]
本発明1144〜1147のいずれかのヌクレオチド配列を含む、ベクターまたはベクターのセット。
[本発明1149]
本発明1144〜1148のいずれかのヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットを含む単離細胞であって、任意で、前記細胞が、BHK−21、CHO、HEK293もしくはその変異体、911、HeLa、A549、LP−293、PER.C6、またはAE1−2a細胞である、前記単離細胞。
[本発明1150]
先行の組成物の発明のいずれかの組成物と、使用説明書とを含む、キット。
[本発明1151]
がんを有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、先行の組成物の発明のいずれかの組成物、または本発明1140〜1143のいずれかの医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
[本発明1152]
腫瘍に由来する少なくとも1つのMHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の腫瘍に由来する、本発明1151の方法。
[本発明1153]
少なくとも1つのMHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の腫瘍に由来しない、本発明1151の方法。
[本発明1154]
対象に免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に、先行の組成物の発明のいずれかの組成物、または本発明1140〜1143のいずれかの医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
[本発明1155]
前記組成物が、筋肉内(IM)、皮内(ID)、皮下(SC)、または静脈内(IV)投与される、本発明1151〜1154のいずれかの方法。
[本発明1156]
前記組成物が筋肉内投与される、本発明1151〜1154のいずれかの方法。
[本発明1157]
1つ以上の免疫調節物質の投与をさらに含み、任意で、前記免疫調節物質が前記組成物または医薬組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与される、本発明1151〜1156のいずれかの方法。
[本発明1158]
前記1つ以上の免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、本発明1157の方法。
[本発明1159]
前記免疫調節物質が、静脈内(IV)、筋肉内(IM)、皮内(ID)、または皮下(SC)投与される、本発明1157または1158の方法。
[本発明1160]
前記皮下投与が、前記組成物または医薬組成物の投与部位の近くに、または1つ以上のベクターもしくは組成物の流入領域リンパ節に近接して行われる、本発明1159の方法。
[本発明1161]
前記対象に第2のワクチン組成物を投与することをさらに含む、本発明1151〜1160のいずれかの方法。
[本発明1162]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1151〜1160のいずれかの組成物または医薬組成物の投与の前に投与される、本発明1161の方法。
[本発明1163]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1151〜1160のいずれかの組成物または医薬組成物の投与の後に投与される、本発明1161の方法。
[本発明1164]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1151〜1160のいずれかの組成物または医薬組成物と同じである、本発明1162または1163の方法。
[本発明1165]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1151〜1160のいずれかの組成物または医薬組成物と異なる、本発明1162または1163の方法。
[本発明1166]
前記第2のワクチン組成物が、少なくとも1つの抗原コード核酸配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターを含む、本発明1165の方法。
[本発明1167]
前記チンパンジーアデノウイルスベクターによってコードされる前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、先行の組成物の発明のいずれかの少なくとも1つの抗原コード核酸配列と同じである、本発明1166の方法。
[本発明1168]
先行の組成物の発明のいずれかの1つ以上のベクターを製造する方法であって、
(a)前記RNAアルファウイルス骨格及び前記新生抗原カセットを含む直線化DNA配列を得ることと、
(b)前記直線化DNA配列を、前記直線化DNA配列をRNAに転写するために必要なすべての構成要素を含んだインビトロ転写反応に加えることにより、前記直線化DNA配列をインビトロ転写することであって、任意で、得られたRNAに前記m7gキャップをインビトロで加えることをさらに含む、前記インビトロ転写することと、
(c)前記インビトロ転写反応から前記1つ以上のベクターを単離することと
を含む、前記方法。
[本発明1169]
前記直線化DNA配列が、DNAプラスミド配列を直線化することにより、またはPCRを用いた増幅により生成される、本発明1168の製造する方法。
[本発明1170]
前記DNAプラスミド配列が、細菌組換えまたは全ゲノムDNA合成または細菌細胞内での合成DNAの増幅を伴う全ゲノムDNA合成のうちの1つを用いて生成される、本発明1169の製造方法。
[本発明1171]
前記1つ以上のベクターを前記インビトロ転写反応から単離することが、フェノールクロロホルム抽出、シリカカラムを用いた精製、または同様のRNA精製法のうちの1つ以上を含む、本発明1168の製造する方法。
[本発明1172]
前記新生抗原発現系を送達するための先行の組成物の発明のいずれかの組成物を製造する方法であって、
(a)ナノ粒子状の送達ビヒクルの成分を提供することと、
(b)前記新生抗原発現系を提供することと、
(c)前記ナノ粒子状の送達ビヒクル及び前記新生抗原発現系が前記新生抗原発現系を送達するための前記組成物を生成するのに充分な条件を提供することと
を含む、前記方法。
[本発明1173]
前記条件がマイクロ流体混合によって提供される、本発明1172の製造する方法。
I.定義
一般に、特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、当業者により理解される通常の意味を有するものとして解釈されるものとする。特定の用語を、さらなる明確性を与えるために下記に定義する。通常の意味と与えられる定義との間に矛盾が存在する場合、与えられる定義が用いられるものとする。
本明細書では、腫瘍細胞、または樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞を含む免疫細胞表面上に提示される可能性が高い、及び/または免疫原性を有する可能性が高い、対象の腫瘍由来の新生抗原を特定するための方法を開示する。例として、かかる1つの方法は、対象の腫瘍細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを得る工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータを用いて新生抗原のセットの各々のペプチド配列を表すデータが取得され、各新生抗原のペプチド配列が、ペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を含む、工程と、対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって、または腫瘍内に存在する細胞によって新生抗原の各々が提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を、1つ以上の提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されている、工程と、選択された新生抗原のセットを生成するために、前記新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と、を含む方法を開示する。
また、ある特定の変異(例えば、がん細胞中に存在する変異またはアレル)の特定のための方法も、本明細書に開示する。特に、これらの変異は、がんを有する対象のがん細胞のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはエクソーム中に存在し得るが、対象由来の正常組織には存在し得ない。
新生抗原は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、新生抗原は、ポリペプチド配列をコードするRNA配列であることができる。ワクチンにおいて有用な新生抗原は、したがって、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むことができる。
また、特異的な免疫応答、例えば、腫瘍特異的な免疫応答を生じることができる免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も、本明細書に開示する。ワクチン組成物は、典型的に、例えば、本明細書に記載した方法を用いて選択された多数の新生抗原を含む。ワクチン組成物はまた、ワクチンと呼ぶこともできる。
1つ以上の新生抗原の選択に用いられる方法、「カセット」のクローニング及び構築、ならびにウイルスベクターへのその挿入は本明細書に与えられる教示を考慮すれば当該技術分野の範囲内である。「新生抗原カセット」とは、選択された新生抗原または複数の新生抗原と、ネオアンチゲン(複数可)を転写し、転写産物を発現するために必要とされる他の調節エレメントとの組み合わせを意味する。新生抗原または複数の新生抗原は、転写を可能とするような形で調節要素と機能的に連結することができる。かかる要素としては、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞内で新生抗原(複数可)の発現を推進することができる従来の調節エレメントが挙げられる。したがって、新生抗原カセットは、新生抗原(複数可)に連結され、組換えベクターの選択されたウイルス配列内に他の任意選択的な調節エレメントとともに配置された選択されたプロモーターも含むことができる。
(Pa−(L5b−Nc−L3d)X)Z−(P2h−(G5e−Uf)Y)W−G3g
を用いて記述することができる。式中、P及びP2は、プロモーターヌクレオチド配列を含み、Nは、MHCクラスIエピトープコード核酸配列を含み、L5は、5’リンカー配列を含み、L3は、3’リンカー配列を含み、G5は、アミノ酸リンカーをコードする核酸配列を含み、G3は、アミノ酸リンカーをコードする少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、Uは、MHCクラスII抗原コード核酸配列を含み、ここで、各Xについて、対応するNcは、エピトープコード核酸配列であり、各Yについて、対応するUfは、抗原コード核酸配列である。組成物及び順序付けられた配列は、存在する要素の数を選択することによってさらに定義することができ、例えば、a=0または1である場合、b=0または1である場合、c=1である場合、d=0または1である場合、e=0または1である場合、f=1である場合、g=0または1である場合、h=0または1である場合、X=1〜400であり、Y=0、1、2、3、4または5であり、Z=1〜400であり、かつW=0、1、2、3、4または5である。
本明細書に記載されるベクター、例えば本明細書に記載されるC68ベクター、または本明細書に記載されるアルファウイルスベクターは少なくとも1つの新生抗原をコードする核酸を含むことができ、また、同じまたは別のベクターが、免疫チェックポイント分子に結合してその活性を遮断する少なくとも1つの免疫調節因子(例えばscFvなどの抗体)をコードする核酸を含むことができる。ベクターは、新生抗原と、チェックポイント阻害剤をコードする1つ以上の核酸分子とを含むことができる。
V.C.1.すべての腫瘍サブクローンをカバーするペプチドのセットの決定
すべてのまたは大部分の腫瘍サブクローンによって提示されるものを意味するトランカルペプチド(truncal peptide)が、ワクチン中への包含について優先される53。任意で、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドがない場合、または、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドの数が、追加的な非トランカルペプチドをワクチンに含めることができるほど少ない場合には、腫瘍サブクローンの数及び同一性を推定すること、及びワクチンによってカバーされる腫瘍サブクローンの数を最大化するようにペプチドを選ぶことによって、さらなるペプチドを優先順位付けすることができる54。
上記の新生抗原フィルターのすべてを適用した後、ワクチン技術が対応できるよりも多くの候補新生抗原が、依然としてワクチン包含に利用可能である可能性がある。追加的に、新生抗原解析の種々の態様についての不確定度が残っている可能性があり、候補ワクチン新生抗原の様々な性状の間にトレードオフが存在する可能性がある。したがって、選択プロセスの各段階でのあらかじめ決定されたフィルターの代わりに、少なくとも以下の軸を有する空間に候補新生抗原を置き、積分アプローチを用いて選択を最適化する、積分多次元モデルを考えることができる。
1. 自己免疫または寛容のリスク(生殖細胞系列のリスク)(より低い自己免疫のリスクが、典型的に好ましい)
2. シークエンシングアーチファクトの確率(より低いアーチファクトの確率が、典型的に好ましい)
3. 免疫原性の確率(より高い免疫原性の確率が、典型的に好ましい)
4. 提示の確率(より高い提示の確率が、典型的に好ましい)
5. 遺伝子発現(より高い発現が、典型的に好ましい)
6. HLA遺伝子のカバレッジ(新生抗原のセットの提示に関与する、より多い数のHLA分子は、腫瘍が、HLA分子の下方制御または変異を介して免疫攻撃を回避するであろう確率を低くする可能性がある)
7.HLAクラスのカバレッジ(HLA−I及びHLA−IIの両方をカバーすることで、治療応答の確率が高まり、腫瘍の免疫回避の確率が低くなる可能性がある)
V.D.1.アルファウイルスの生物学
アルファウイルスは、トガウイルス科のメンバーであり、一本鎖プラス鎖RNAウイルスである。アルファウイルスは、自己複製型RNAまたはsrRNAと呼ぶこともできる。メンバーは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモルガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株TC−83などの新世界型に分類される(Strauss Microbrial Review 1994)。天然のアルファウイルスゲノムは、通常、長さ約12kbであり、その最初の2/3は、ウイルスゲノムを自己複製するためのRNA複製複合体を形成する非構造タンパク質(nsP)をコードする遺伝子を含んでおり、最後の1/3は、ビリオンを産生するための構造タンパク質をコードするサブゲノム発現カセットを含んでいる(Frolov RNA 2001)。
アルファウイルスは、発現ベクター系として使用するために従来、遺伝子操作がなされている(Pushko 1997,Rheme 2004)。アルファウイルスは、異種抗原の発現が望ましい場合があるワクチン設定においていくつかの長所を有する。アルファウイルスは、宿主のサイトゾル中で自己複製するその能力のため、細胞内の発現カセットの高いコピー数を一般的に得ることができることから、高いレベルの異種抗原の産生を実現することができる。さらに、ベクターは一般的に一過性であるため、バイオセーフティーが高く、ベクターに対する免疫寛容の誘導は低い。また、一般公衆は、一般的にヒトアデノウイルスのような他の標準的ウイルスベクターと比較してアルファウイルスに対する既存の免疫を有していない。アルファウイルスに基づくベクターはまた、感染細胞に対する細胞毒性反応を一般的に生じる。細胞毒性は、発現された異種抗原に対して免疫応答を適性に誘発するためにワクチン設定においてある程度の重要性を有しうる。しかしながら、所望の細胞毒性の程度はバランスの問題であり、そのため、VEEのTC−83株をはじめとするいくつかの弱毒化されたアルファウイルスが開発されている。したがって、本明細書に記載される新生抗原発現ベクターの一例では、高いレベルの新生抗原発現を可能とし、新生抗原に対する強い免疫応答を誘発し、ベクター自体に対する免疫応答は誘発せず、安全に使用することができるアルファウイルス骨格を用いることができる。さらに、新生抗原発現カセットは、ベクターが、VEEまたはその弱毒化誘導株TC−83に由来する配列を含む(ただしこれらに限定されない)どのアルファウイルス配列を用いるかを最適化することを通じて異なるレベルの免疫応答を誘発するように設計することができる。
アルファウイルス送達ベクターは、一般的に、プラス鎖のRNAポリヌクレオチドである。RNA生成のための当該技術分野では周知の従来の方法として、インビトロ翻訳IVTがある。この方法では、所望のベクターのDNA鋳型が、クローニング、制限消化、ライゲーション、遺伝子合成、及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの標準的な分子生物学的方法を含む当該技術分野では周知の方法によって最初に生成される。このDNA鋳型は、RNAに転写されることが望ましい配列の5’末端にRNAポリメラーゼのプロモーターを有している。プロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、T3、T7、またはSP6などのバクテリオファージポリメラーゼのプロモーターが挙げられる。次に、DNA鋳型は、適当なRNAポリメラーゼ酵素、バッファー剤、及びヌクレオチド(NTP)とインキュベートされる。得られたRNAポリヌクレオチドは、7−メチルグアノシンまたは関連する構造などの5’キャップ構造の付加、及び任意でポリアデニル化(ポリA)テールを有するように3’末端を改変することを含む(ただしこれらに限定されない)方法によって、任意でさらに改変することができる。次に、RNAをフェノールクロロホルム抽出などの当該技術分野では周知の方法を用いて精製することができる。
ワクチンベクターの設計において考慮すべき重要な側面の1つとして、ベクター自体に対する免疫がある(Riley 2017)。これは、例えば特定のヒトアデノウイルス系などのベクター自体に対する既存の免疫の形である場合もあり、またはワクチンの投与後に生じるベクターに対する免疫の形である場合もある。後者は、例えば別々のプライミング及びブースター投与のように同じワクチンの複数回の投与が行われる場合、または異なる新生抗原カセットを送達するために同じワクチンベクターシステムが用いられるような場合に重要な考慮事項となる。
V.E.1.チンパンジーアデノウイルスによるウイルス送達
チンパンジー由来のアデノウイルスヌクレオチド配列、各種の新規ベクター、及びチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を与えることによって1種類以上の新生抗原を送達する(例えば新生抗原カセットにより)ためのワクチン組成物を調製することができる。チンパンジーC68アデノウイルス(本明細書ではChAdV68とも呼ぶ)のヌクレオチド配列を、新生抗原を送達するためのワクチン組成物中に使用することができる(SEQ ID NO:1を参照)。C68アデノウイルス由来ベクターの使用については米国特許第6,083,716号にさらに詳細に記載されており、当該特許の全容をあらゆる目的で参照によって本明細書に援用する。
本明細書に記載される遺伝子のいずれかにおいて欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルス(Ad)を作製するため、欠失させた遺伝子領域の機能(ウイルスの複製及び感染性に不可欠である場合)をヘルパーウイルスまたは細胞株(すなわち、相補性またはパッケージング細胞株)によって組換えウイルスに供給することができる。例えば、複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを作製するには、ヒトまたはチンパンジーアデノウイルスのE1遺伝子産物を発現する細胞株を使用することができ、そのような細胞株にはHEK293またはその変異体が含まれうる。チンパンジーE1遺伝子を発現する細胞株の作製のプロトコール(米国特許第6,083,716号の実施例3及び4)にしたがって任意の選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を作製することができる。
本明細書に開示される組成物は、少なくとも1種類の新生抗原を細胞に送達するウイルスベクターを含むことができる。かかるベクターは、C68のようなチンパンジーアデノウイルスDNA配列と、カセットを直接発現するための調節配列に機能的に連結された新生抗原カセットとを含む。C68ベクターは、感染した哺乳動物細胞内でカセットを発現することが可能である。C68ベクターは1つ以上のウイルス遺伝子に機能的欠失を有することができる。新生抗原カセットは、プロモーターなどの1つ以上の調節配列の制御下にある少なくとも1つの新生抗原を含む。任意選択的なヘルパーウイルス及び/またはパッケージング細胞株によって、チンパンジーウイルスベクターに、欠失させたアデノウイルス遺伝子の任意の必要な産物を供給することができる。
本発明において有用なチンパンジーアデノウイルスC68ベクターには、組換え欠損アデノウイルス、すなわち、E1aまたはE1b遺伝子に機能的欠失を有し、任意で例えば温度感受性変異または他の遺伝子における欠失などの他の変異を有するチンパンジーアデノウイルス配列が含まれる。これらのチンパンジー配列は、他のアデノウイルス及び/またはアデノ随伴ウイルス配列からハイブリッドベクターを形成するうえでも有用であると予想される。ヒトアデノウイルスから調製された同種アデノウイルスベクターについては、刊行文献に記載されている[例えば、上記に引用のKozarsky I及びII、ならびに同文献に引用された参照文献、米国特許第5,240,846号を参照]。
最小チンパンジーAd C68ウイルスとしては、複製及びビリオンのカプシド形成に必要なアデノウイルスのシスエレメントのみを含むウイルス粒子がある。すなわち、このベクターは、アデノウイルスのシス作用性の5’及び3’の末端逆位繰り返し配列(ITR)(複製起点として機能する)と、天然の5’パッケージング/エンハンサードメイン(直鎖状のAdのゲノム及びE1プロモーターのエンハンサーエレメントをパッケージングするために必要な配列を含む)とを含む。例えば、国際出願第WO96/13597号において「最小」ヒトAdベクターの調製について述べられ、本明細書に参照によって援用する方法を参照されたい。
組換え複製不全アデノウイルスは、最小チンパンジーアデノウイルス配列以上のものを含んでもよい。これらの他のAdベクターは、ウイルスの遺伝子領域の異なる部分の欠失、ならびに、必要に応じたヘルパーウイルス及び/またはパッケージング細胞株の使用によって形成される感染性ウイルス粒子によって特徴づけることができる。
新生抗原カセットを送達するために用いられるウイルスベクターのチンパンジーアデノウイルス遺伝子の含量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非複製ウイルスフラグメントを用いて、カセットを含む感染性の組換えウイルス粒子を生成するのに充分なチンパンジーアデノウイルス遺伝子配列を与えることができる。
アデノウイルス、新生抗原カセット、及び他のベクター因子の選択されたDNA配列の様々な中間プラスミド及びシャトルベクターへのアセンブリ、ならびに組換えウイルス粒子を作製するためのプラスミド及びシャトルベクターの使用は、従来の手法を用いてすべて実現することができる。かかる手法としては、従来のcDNAのクローニング法、インビトロ組換え法(例えば、ギブソンアセンブリ)、アデノウイルスゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を与える任意の適当な方法が挙げられる。標準的なトランスフェクション及び同時トランスフェクションの手法、例えば、CaPO4沈殿法またはリポフェクタミンなどのリポソーム媒介トランスフェクション法が用いられる。用いられる他の従来の方法としては、ウイルスゲノムの相同組み換え、アガーオーバーレイ中でのウイルスのプラーク形成、シグナル発生測定の方法などが挙げられる。
したがって、新生抗原カセットを含む得られた組換えチンパンジーC68アデノウイルス(上記に述べたように、アデノウイルスベクターとヘルパーウイルスとの協同、またはアデノウイルスベクターとパッケージング細胞株との協同により作製される)は、新生抗原(複数可)をインビボまたはエクスビボで対象に送達することができる効率的な遺伝子導入担体を与えるものである。
本明細書に開示する方法を用いて特定された複数の新生抗原などの1つ以上の新生抗原を対象に投与することにより、対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導し、腫瘍に対するワクチン接種を行い、対象のがんの症状を治療及び/または緩和する方法も提供される。
ワクチン接種プロトコールを用いて対象に1つ以上の新生抗原を投与することができる。プライミングワクチン及びブースターワクチンを用いて対象への投与を行うことができる。プライミングワクチンは、C68(例えば、SEQ ID NO:1または2に示される配列)またはsrRNA(例えば、SEQ ID NO:3または4に示される配列)に基づいたものとすることができ、ブースターワクチンは、C68(例えば、SEQ ID NO:1または2に示される配列)またはsrRNA(例えば、SEQ ID NO:3または4に示される配列)に基づいたものとすることができる。各ベクターは、通常、新生抗原を含むカセットを含んでいる。カセットは、各抗原を通常取り囲む天然の配列、またはAAYなどの他の非天然のスペーサー配列などのスペーサーによって分離された約20個の新生抗原を含むことができる。カセットは、破傷風トキソイド抗原などのMHCII抗原、及びユニバーサルなクラスII抗原とみなされるPADRE抗原を含んでもよい。カセットは、ユビキチンターゲティング配列などのターゲティング配列を含んでもよい。さらに、各ワクチン用量は、チェックポイント阻害剤(CPI)と組み合わせて(例えば、同時、その前、またはその後で)対象に投与することができる。CPIは、抗体またはその抗原結合部分など、CTLA4、PD1、及び/またはPDL1を阻害するものを含むことができる。かかる抗体としては、トレメリムマブまたはデュルバルマブを挙げることができる。
VIII.A.新生抗原候補の特定
腫瘍及び正常のエクソーム及びトランスクリプトームのNGS解析のための研究法を、新生抗原の特定のスペースに記載し、適用している6,14,15。下記の例は、臨床設定における新生抗原の特定について、より大きな感度及び特異性のためのある特定の最適化を考慮している。これらの最適化は、実験室プロセスに関連するもの及びNGSデータ解析に関連するものの、2つの区域にグループ化することができる。
本明細書に提示したプロセスの改善は、標的とされるがんパネルにおける信頼できるがんドライバー遺伝子の評価について開発された概念16を、新生抗原の特定のために必要な全エクソーム設定及び全トランスクリプトーム設定に拡大することによって、低い腫瘍含量及び少ない体積の臨床標本からの高精度の新生抗原の発見における難題に対処する。具体的には、これらの改善は、以下を含む:
1.低い腫瘍含量またはサブクローン状態のいずれかにより、低い変異体アレル頻度で存在する変異を検出するための、腫瘍エクソームにわたる深い(500xよりも大きい)固有の平均カバレッジのターゲティング。
2.可能性のある新生抗原の見逃しが最も少ないように、100x未満でカバーされる塩基が5%未満である、例として、
a. 個々のプローブQCを有するDNAベースの捕捉プローブの使用17
b.十分にカバーされていない領域についての追加的なベイトの包含
3.可能性のある新生抗原が体細胞性/生殖細胞系列ステータスについて分類されていないままである(したがってTSNAとして使用可能ではない)ことが最も少ないように、20x未満でカバーされる塩基が5%未満である、正常エクソームにわたる均一カバレッジのターゲティング。
4.必要とされるシークエンシングの総量を最小化するために、配列捕捉プローブは、非コードRNAは新生抗原を生じることができないことから、遺伝子のコード領域のみについて設計される。追加的な最適化は、以下を含む:
a.GCリッチであり、標準的なエクソームシークエンシングでは十分に捕捉されないHLA遺伝子についての補充的プローブ18。
b.不十分な発現、プロテアソームによる最適に満たない消化、または異例の配列特性などの要因により、候補新生抗原を少ししかまたは全く生成しないと予測される遺伝子の排除。
5.変異検出、遺伝子及びスプライス変異体(「アイソフォーム」)発現の定量、ならびに融合物検出を可能にするために、腫瘍RNAが同様に、高深度(100Mリードよりも大きい)でシークエンシングされる。FFPE試料由来のRNAは、DNAにおいてエクソームを捕捉するために使用されるのと同じまたは類似したプローブで、プローブベース濃縮19を用いて抽出される。
解析法の改善は、一般的な研究変異コーリングアプローチの最適に満たない感度及び特異性に対処し、具体的には、臨床設定における新生抗原の特定のために関連するカスタマイズ化を考慮する。これらは、以下を含む:
1.アラインメントのための、HG38参照ヒトゲノムまたはより後のバージョンの使用(それが、以前のゲノムリリースとは対照的に、集団多型をより良好に反映する複数のMHC領域アセンブリーを含有するため)。
2.様々なプログラム5からの結果をマージすることによる、単一変異コーラー20の限界の克服。
a.単一ヌクレオチド変異及び挿入欠失は、以下を含む一連のツールで、腫瘍DNA、腫瘍RNA、及び正常DNAから検出される:Strelka21及びMutect22などの、腫瘍及び正常DNAの比較に基づくプログラム;ならびに、低純度の試料において特に有利である23、UNCeqRなどの、腫瘍DNA、腫瘍RNA、及び正常DNAを組み入れるプログラム。
b.挿入欠失は、Strelka及びABRA24などの、局所リアセンブリーを行うプログラムで決定される。
c.構造的再編成は、Pindel25またはBreakseq26などの専用のツールを用いて決定される。
3.試料スワップを検出して阻止するために、同じ患者についての試料由来の変異コールが、選ばれた数の多型部位で比較される。
4.例として、以下による、人工的コールの広範囲のフィルタリングが行われる:
a.潜在的に、低いカバレッジの例においては緩やかな検出パラメータで、及び挿入欠失の例においては許容的な近接基準での、正常DNAにおいて見出される変異の除去。
b.低いマッピング品質または低い塩基品質による変異の除去27。
c.たとえ対応する正常において観察されないとしても、再出現するシークエンシングアーチファクトから生じる変異の除去27。例は、主として1本の鎖上に検出される変異を含む。
d.無関連の対照のセットにおいて検出される変異の除去27。
5.seq2HLA28、ATHLATES29、またはOptitypeのうちの1つを使用する、かつまた、エクソーム及びRNAシークエンシングデータを組み合わせる28、正常エクソームからの正確なHLAコーリング。追加的な潜在的最適化は、ロングリードDNAシークエンシングなどの、HLAタイピングのための専用アッセイの採用30、または、RNA断片を連結して連続性を保持するための方法の適応31を含む。
6.腫瘍特異的スプライス変異体から生じた新生ORFの堅牢な検出は、CLASS32、Bayesembler33、StringTie34、またはそのリファレンスガイドモードにおける類似したプログラム(すなわち、各実験からそれらの全体の転写産物を再作製するように試みるよりもむしろ、公知の転写産物構造を用いる)を用いて、RNA−seqデータから転写産物をアセンブルすることによって、行われる。Cufflinks35が、この目的で一般的に使用されるが、それは頻繁に、信じ難いほど多数のスプライス変異体を産生し、それらの多くは、完全長遺伝子よりもはるかに短く、単純な陽性対照をリカバーすることができない場合がある。コード配列及び潜在的なナンセンス変異依存分解機構は、変異体配列を再導入した、SpliceR36及びMAMBA37などのツールで決定される。遺伝子発現は、Cufflinks35またはExpress(Roberts and Pachter,2013)などのツールで決定される。野生型及び変異体特異的な発現カウント及び/または相対レベルは、ASE38またはHTSeq39などの、これらの目的で開発されたツールで決定される。潜在的なフィルタリング段階は、以下を含む:
a.不十分に発現されていると考えられる候補新生ORFの除去。
b.ナンセンス変異依存分解機構(NMD)を引き起こすと予測される候補新生ORFの除去。
7.腫瘍特異的と直接検証することができない、RNAにおいてのみ観察される候補新生抗原(例えば、新生ORF)は、例として以下を考慮することにより、追加的なパラメータにしたがって、腫瘍特異的である可能性が高いとして分類される:
a.腫瘍DNAのみのシス作用性フレームシフトまたはスプライス部位変異の支持の存在。
b.スプライシング因子における腫瘍DNAのみのトランス作用性変異の確証の存在。例として、R625変異体SF3B1での3つの独立して公開された実験において、最も差次的にスプライシングを呈する遺伝子は、1つの実験がブドウ膜黒色腫患者を検討し40、第2の実験がブドウ膜黒色腫細胞株を検討し41、及び第3の実験が乳がん患者を検討した42にもかかわらず、一致していた。
c.新規のスプライシングアイソフォームについては、RNASeqデータにおける「新規の」スプライス−ジャンクションリードの確証の存在。
d.新規の再編成については、正常DNAには存在しない腫瘍DNAにおけるエクソン近傍リードの確証の存在。
e.GTEx43などの遺伝子発現大要からの欠如(すなわち、生殖細胞系列起源の可能性をより低くする)。
8.アラインメント及びアノテーションベースのエラー及びアーチファクトを直接避けるために、アセンブルされたDNAの腫瘍及び正常リード(またはそのようなリード由来のkマー)を比較することによる、参照ゲノムアラインメントベースの解析の補完(例えば、生殖細胞系列変異またはリピートコンテクスト挿入欠失の近くに生じる体細胞性変異について)。
HLAペプチド分子の単離は、組織試料の溶解及び可溶化後に、古典的な免疫沈降(IP)法を用いて行った(55〜58)。清澄化した溶解物を、HLA特異的IPに使用した。
免疫沈降は、ビーズに共有結合されていない抗体を用いて行うこともできる。一般的に、これは、抗体をカラムに保持するためにProteinA及び/またはProteinGでコーティングしたセファロースまたは磁気ビーズを使用して行われる。MHC/ペプチド複合体を選択的に濃縮するために使用することができるいくつかの抗体を下記に示す。
ペプチドYVYVADVAAK(SEQ ID NO:59)を用いて、何が検出の限界かを、LCカラム上にロードした様々な量のペプチドを用いて決定した。試験したペプチドの量は、1pmol、100fmol、10fmol、1fmol、及び100amolであった。(表1)結果を図1Fに示す。これらの結果は、検出の最低限界(LoD)がアトモルの範囲(10−18)にあること、ダイナミックレンジが5桁に及ぶこと、及び、シグナル対ノイズが、低いフェムトモル範囲(10−15)でシークエンシングに十分であるように見えることを示す。
IX.A.システムの概要
図2Aは、1つの実施形態にしたがう、患者におけるペプチド提示の尤度を特定するための環境100の概要である。環境100は、それ自体が提示情報記憶装置165を含む提示特定システム160を導入するコンテクストを提供する。
図2は、1つの実施形態にしたがう、提示情報を取得する方法を説明する。提示情報165は、2つの一般的部類の情報:アレル相互作用情報及びアレル非相互作用情報を含む。アレル相互作用情報は、MHCアレルのタイプに依存する、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。アレル非相互作用情報は、MHCアレルのタイプに非依存的な、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。
アレル相互作用情報は、主として、ヒト、マウスなど由来の1つ以上の特定されたMHC分子によって提示されていることが公知である、特定されたペプチド配列を含む。注目すべきことに、これは、腫瘍試料から取得されたデータを含んでもよく、または含まなくてもよい。提示されたペプチド配列は、単一のMHCアレルを発現する細胞から特定されてもよい。この例において、提示されたペプチド配列は、概して、あらかじめ決定されたMHCアレルを発現するように操作されてその後合成タンパク質に曝露された単一アレル細胞株から収集される。MHCアレル上に提示されたペプチドは、酸溶出などの技法によって単離され、質量分析により特定される。図2Bは、あらかじめ決定されたMHCアレルHLA−A*01:01上に提示された例示的なペプチドYEMFNDKS(SEQ ID NO:60)が単離され、質量分析により特定される、この例を示す。図2Dは、この別の例を示し、あらかじめ決定されたMHCアレルHLA−DRB1*12:01上に提示された例示的ペプチド
が単離され、質量分析によって特定されている。これらの状況においては、ペプチドが、単一のあらかじめ決定されたMHCタンパク質を発現するように操作された細胞を通して特定されるため、提示されたペプチドとそれが結合したMHCタンパク質との間の直接の関連が、決定的に既知である。
が、特定されたMHCアレルHLA−A*01:01、HLA−A*02:01、HLA−B*07:02、HLA−B*08:01、HLA−C*01:03、及びHLA−C*01:04上に提示されており、単離され、質量分析により特定される、この例を示す。別の例において、図2Cは、6種類の例示的なペプチド
が、特定されたクラスI MHCアレルHLA−A*01:01、HLA−A*02:01、HLA−B*07:02、HLA−B*08:01、及びクラスII MHCアレルHLA−DRB1*10:01、HLA−DRB1:11:01上に提示され、単離され、質量分析によって特定される場合を示している。単一アレル細胞株とは対照的に、これらの例においては、結合したペプチドが、特定される前のMHC分子から単離されるため、提示されたペプチドとそれが結合したMHCタンパク質との間の直接の関連は、未知である可能性がある。
とクラスIIアレルHLA−DRB1:11:01との間の結合親和性予測値を含み得る。
アレル非相互作用情報は、その由来源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するC末端配列を含むことができる。MHC−Iでは、C末端フランキング配列は、ペプチドのプロテアソームプロセシングに影響を及ぼし得る。しかし、C末端フランキング配列は、ペプチドが小胞体に輸送され、細胞の表面上のMHCアレルと遭遇する前に、プロテアソームによってペプチドから切断される。その結果、MHC分子は、C末端フランキング配列についてのいかなる情報も受け取らず、したがって、C末端フランキング配列の効果は、MHCアレルタイプに応じて変動することができない。例えば、図2Cに示した例に戻ると、提示情報165は、ペプチドの由来源タンパク質から特定された、提示されたペプチドFJIEJFOESS(SEQ ID NO: 64)のC末端フランキング配列FOEIFNDKSLDKFJI(SEQ ID NO:69)を含み得る。
i.EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異。
ii.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOB、HLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)におけるもの。その提示が、腫瘍において機能喪失変異の影響下にある抗原提示マシナリーの構成要素に依拠するペプチドは、提示の確率が低減している。
i.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOB、HLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)におけるもの。
図3は、1つの実施形態による、提示特定システム160のコンピュータ論理構成要素を説明する、ハイレベルブロック図である。この例示的実施形態において、提示特定システム160は、データ管理モジュール312、コード化モジュール314、訓練モジュール316、及び予測モジュール320を含む。提示特定システム160はまた、訓練データ記憶装置170及び提示モデル記憶装置175から構成される。モデル管理システム160のいくつかの実施形態は、本明細書に記載したものとは異なるモジュールを有する。同様に、機能は、本明細書に記載したものは異なる様式で、モジュールの間に分配され得る。
データ管理モジュール312は、提示情報165から訓練データ170のセットを生成する。各々の訓練データのセットは、多数のデータ例を含有し、各データ例iは、少なくとも、提示されるかまたは提示されないペプチド配列piと、ペプチド配列piと結合した1つ以上の関連するMHCアレルaiと、提示特定システム160が、独立変数の新たな値を予測することに関心があるという情報を表す従属変数yiとを含む、独立変数ziのセットを含有する。
からのペプチド提示情報を示す。訓練データ170A中の4番目のデータ例は、アレルHLA−B*07:02、HLA−C*01:03、HLA−A*01:01を含む複数アレル細胞株、及びペプチド配列QIEJOEIJE(SEQ ID NO:73)からのペプチド情報を示す。最初のデータ例は、ペプチド配列QCEIOWARE(SEQ ID NO:70)が、アレルHLA−C*01:03によって提示されなかったことを示す。前の2つの段落において議論したように、ペプチド配列は、データ管理モジュール312によってランダムに生成されてもよく、または提示されるペプチドの由来源タンパク質から特定されてもよい。訓練データ170Aはまた、ペプチド配列−アレルペアについて、1000nMの結合親和性予測値及び1時間の半減期の安定性予測値も含む。訓練データ170Aはまた、ペプチド
のC末端フランキング配列、及び102TPMのmRNA定量測定値などの、アレル非相互作用変数も含む。4番目のデータ例は、ペプチド配列QIEJOEIJE(SEQ ID NO:73)が、アレルHLA−B*07:02、HLA−C*01:03、またはHLA−A*01:01のうちの1つによって提示されたことを示す。訓練データ170Aはまた、アレルの各々についての結合親和性予測値及び安定性予測値、ならびに、ペプチドのC末端フランキング配列及びペプチドについてのmRNA定量測定値も含む。
を含む、単一アレル細胞株からのペプチド提示情報を示す。1番目のデータ例は、ペプチド配列
がアレルHLA−DRB3:01:01によって提示されなかったことを示す。
コード化モジュール314は、訓練データ170に含有される情報を、1つ以上の提示モデルを生成するために使用することができる数値的表示へとコード化する。一実現形態では、コード化モジュール314は、配列(例えば、ペプチド配列またはC末端隣接配列)を、あらかじめ決定された20文字のアミノ酸アルファベットについて、ワン・ホットでコード化する。具体的には、ki個のアミノ酸を有するペプチド配列piは、20・ki要素の行ベクトルとして表され、ペプチド配列のj番目の位置のアミノ酸のアルファベットに対応するpi 20・(j−1)+1,pi 20・(j−1)+2,...,pi 20・jの中の単一要素は、1の値を有する。その以外の、残りの要素は、0の値を有する。例として、所定のアルファベット{A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y}について、データ例iの3個のアミノ酸のペプチド配列EAFは、60個の要素の行ベクトル
によって表され得る。C末端隣接配列ci、ならびに、MHCアレルについてのタンパク質配列dh、及び提示情報における他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。
によって表され得る。C末端隣接配列ciまたは他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。したがって、ペプチド配列piまたはciにおける各々の独立変数または列は、配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在を表す。
と同等の行ベクトルとして表し得、bh iは、ペプチドpi及び関連するMHCアレルhについての結合親和性予測値であり、同様に、sh iは、安定性についてのものである。あるいは、アレル相互作用変数の1つ以上の組み合わせは、個々に(例えば、個々のベクトルまたは行列として)保存されてもよい。
(ただし、
はインジケータ関数であり、Lkはペプチドpkの長さを意味する)として表す。ベクトルTkは、アレル相互作用変数xh iに含まれうる。別の例では、クラスIIMHC分子によって提示されるペプチドについて、コード化モジュール314は、ペプチド長をベクトル
(ただし、
は、インジケータ関数であり、Lkは、ペプチドpkの長さを示す)として表す。ベクトルTkを、アレル相互作用変数xh iに含めることができる。
訓練モジュール316は、ペプチド配列に関連するMHCアレルによってペプチド配列が提示されるかどうかの尤度を生成する、1つ以上の提示モデルを構築する。具体的には、ペプチド配列pk及びペプチド配列pkに関連するMHCアレルakのセットを与えられ、各提示モデルは、ペプチド配列pkが、関連するMHCアレルakのうちの1つ以上によって提示されるであろう尤度を示す、推定値ukを生成する。
訓練モジュール316は、165に保存された提示情報から生成された、記憶装置170に保存された訓練データセットに基づいて、1つ以上の提示モデルを構築する。概して、提示モデルの具体的なタイプに関わらず、提示モデルのすべては、損失関数が最小化されるように、訓練データ170における独立変数と従属変数との間の依存性を捕捉する。具体的には、損失関数
は、訓練データ170における1つ以上のデータ例Sについての従属変数yi∈Sの値と、提示モデルによって生成されたデータ例Sについての推定された尤度ui∈Sとの間の矛盾を表す。本明細書の残りの部分を通じて言及される1つの特定の実現形態において、損失関数
は、以下のような等式(1a)によって与えられる負のlog尤度関数である。
しかし、実際には、別の損失関数が使用されてもよい。例えば、質量分析イオン電流について予測がなされる場合、損失関数は、以下のような等式1bによって与えられる平均二乗損失である。
を最小化するパラメトリックタイプの提示モデルの種々のパラメータは、例えば、バッチ勾配アルゴリズム、確率的勾配アルゴリズムなどの、勾配ベースの数値的最適化アルゴリズムを通して決定される。あるいは、提示モデルは、モデル構造が、訓練データ170から決定され、固定されたパラメータのセットに厳密には基づかない、ノンパラメトリックモデルであり得る。
訓練モジュール316は、アレルごとベースでペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール316は、単一のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170におけるデータ例Sに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
によって、特定のアレルhについてのペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、ただし、ペプチド配列xh kは、ペプチドpk及び対応するMHCアレルhについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味し、f(・)は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して変換関数と呼ばれる。さらに、gh(・)は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して依存性関数と呼ばれ、MHCアレルhについて決定されたパラメータθhのセットに基づいて、アレル相互作用変数xh kについての依存性スコアを生成する。各MHCアレルhについてのパラメータθhのセットの値は、θhに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ここでiは、単一のMHCアレルhを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
によって与えられるexpit関数である。
別の例として、f(・)はまた、ドメインzの値が0以上である場合、
によって与えられる双曲線正接関数であることもできる。あるいは、予測が、範囲[0,1]の外側の値を有する質量分析イオン電流についてなされる場合、f(・)は、例えば、恒等関数、指数関数、log関数などの任意の関数であることができる。
によって与えられるアフィン関数である。
によって与えられるネットワーク関数である。ノードは、パラメータθhのセットにおける関連するパラメータを各々有する接続を通して、他のノードに接続され得る。1つの特定のノードでの値は、特定のノードに関連する活性化関数によってマッピングされた関連するパラメータによって重み付けられた、特定のノードに接続されたノードの値の和として表され得る。アフィン関数と対照的に、ネットワークモデルは、提示モデルが非線形性、及び異なる長さのアミノ酸配列を有するプロセスデータを組み入れることができるため、有利である。具体的には、非線形モデリングを通して、ネットワークモデルは、ペプチド配列中の異なる位置のアミノ酸間の相互作用、及びこの相互作用がペプチド提示にいかに影響を及ぼすかを捕捉することができる。
として表すことができ、式中、g’h(xh k;θ’h)は、パラメータθ’hのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、MHCアレルhについての提示のベースライン確率を表す、MHCアレルのアレル相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるバイアスパラメータθh 0を伴う。
によって生成することができ、式中、x3kは、MHCアレルh=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ3は、損失関数最小化を通してMHCアレルh=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、x3 kは、MHCアレルh=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ3は、MHCアレルh=3に関連するネットワークモデルNN3(・)について決定されたパラメータのセットである。
一実現形態では、訓練モジュール316は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
によって、ペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、式中、wkは、ペプチドpkについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味し、gw(・)は、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータθwのセットに基づく、アレル非相互作用変数wkについての関数である。具体的には、各MHCアレルhについてのパラメータθhのセット及びアレル非相互作用変数についてのパラメータθwのセットの値を、θh及びθwに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
によって与えられ得る。
アレル相互作用変数についての依存性関数gh(・)と同様に、アレル非相互作用変数についての依存性関数gw(・)は、アフィン関数、または別々のネットワークモデルがアレル非相互作用変数wkに関連しているネットワーク関数であり得る。
によって与えられるネットワーク関数であってもよい。このネットワーク関数は、異なるアレル完全非相互作用変数を入力としてそれぞれ取る1つ以上のネットワークモデルも含み得る。
によって与えられ得、式中、g’w(wk;θ’w)は、アレル非相互作用パラメータθ’wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、mkは、ペプチドpkについてのmRNA定量測定値であり、h(・)は、定量測定値を変換する関数であり、かつθw mは、mRNA定量測定値についての依存性スコアを生成するようにmRNA定量測定値と組み合わされる、アレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるパラメータである。本明細書の残りの部分を通じて言及される1つの特定の実施形態において、h(・)はlog関数であるが、実際には、h(・)は、様々な異なる関数のうちのいずれか1つであり得る。
によって与えられ、式中、g’w(wk;θ’w)は、アレル非相互作用パラメータθ’wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、okは、ペプチドpkについてヒトプロテオームにおけるタンパク質及びアイソフォームを表す上記の指標ベクトルであり、かつθw oは、指標ベクトルと組み合わされるアレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおける、パラメータのセットである。1つのバリエーションにおいて、ok及びパラメータθw oのセットの次元が有意に高い場合、
(
は、L1ノルム、L2ノルム、組み合わせなどを表す)などのパラメータ正則化項を、パラメータの値を決定する時に損失関数に加えることができる。ハイパーパラメータλの最適値を、適切な方法を通して決定することができる。
ただし、g’w(wk;θ’w)は、アレル非相互作用パラメータθ’wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、
は、ペプチドpkがアレル非相互作用変数に関して上記に述べたソース遺伝子lに由来するものである場合に1に等しいインジケータ関数であり、θw lはソース遺伝子lの「抗原性」を示すパラメータである。1つのバリエーションにおいて、Lが充分に大きく、したがって、パラメータの数θw l=1, 2,...,Lが充分に大きい場合、
のようなパラメータ正則化項(ただし、
は、L1ノルム、L2ノルム、組み合わせなど)をパラメータの値を決定する際に損失関数に加えることができる。ハイパーパラメータλの最適値は適当な方法によって決定することができる。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
訓練モジュール316はまた、2つ以上のMHCアレルが存在する複数アレル設定においてペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール316は、単一のMHCアレルを発現する細胞、複数のMHCアレルを発現する細胞、またはそれらの組み合わせから生成された訓練データ170におけるデータ例Sに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
一実現形態では、訓練モジュール316は、複数のMHCアレルHのセットに関連したペプチドpkの推定提示尤度ukを、等式(2)〜(11)と共に上記で説明したような、単一アレルを発現する細胞に基づいて決定されたセットHにおけるMHCアレルhの各々について決定された提示尤度uk h∈Hの関数としてモデル化する。具体的には、提示尤度ukは、uk h∈Hの任意の関数であることができる。一実現形態では、等式(12)に示すように、関数は最大値関数であり、提示尤度ukは、セットHにおける各MHCアレルhについての提示尤度の最大値として決定することができる。
一実現形態では、訓練モジュール316は、ペプチドpkの推定提示尤度ukを、
によってモデル化し、式中、要素ah kは、ペプチド配列pkに関連する複数のMHCアレルHについて1であり、xh kは、ペプチドpk及び対応するMHCアレルについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味する。各MHCアレルhについてのパラメータθhのセットの値は、θhに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。依存性関数ghは、セクションX.B.1.において上記で導入された依存性関数ghのいずれかの形態であり得る。
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、MHCアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、MHCアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
一実現形態では、訓練モジュール316は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
によって、ペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、式中、wkは、ペプチドpkについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味する。具体的には、各MHCアレルhについてのパラメータθhのセット及びアレル非相互作用変数についてのパラメータθwのセットの値を、θh及びθwに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。依存性関数gwは、セクションX.B.3.において上記で導入された依存性関数gwのいずれかの形態であり得る。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって与えられ得る。
別の実現形態において、訓練モジュール316は、ペプチドpkの推定提示尤度ukを、
によってモデル化し、式中、要素ah kは、ペプチド配列pkに関連する複数のMHCアレルh∈Hについて1であり、u’k hは、MHCアレルhについての暗黙のアレルごと提示尤度であり、ベクトルvは、要素vhが、ah k・・・u’k hに対応するベクトルであり、s(・)は、vの要素をマッピングする関数であり、かつr(・)は、入力の値を所定の範囲中にクリップするクリッピング関数である。より詳細に下記に記載するように、s(・)は、総和関数または二次関数であってもよいが、他の実施形態において、s(・)は、最大値関数などの任意の関数であり得ることが認識される。暗黙のアレルごと尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
r(z)=min(max(z,0),1)
であってもよく、zと1の間の最小値が、提示尤度ukとして選ばれる。別の実現形態において、r(・)は、
r(z)=tanh(z)
として与えられる双曲線正接関数であり、ドメインzの値は、0以上である。
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、MHCアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、MHCアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
1つの実現形態では、MHCアレルhについての暗黙のアレルごと提示尤度を、
によって生成して、提示尤度が、
によって生成されるようにして、ペプチド提示に、アレル非相互作用変数の影響を組み入れる。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
一実現形態では、s(・)は、二次関数であり、ペプチドpkの推定提示尤度ukは、
によって与えられ、式中、要素u’k hは、MHCアレルhについての暗黙のアレルごと提示尤度である。暗黙のアレルごと尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。暗黙のアレルごと提示尤度は、上記の等式(18)、(20)、及び(22)において示すいずれかの形態であり得る。
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、HLAアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、HLAアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、HLAアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、HLAアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
予測モジュール320は、配列データを受け取って、提示モデルを用いて配列データ中の候補新生抗原を選択する。具体的には、配列データは、患者の腫瘍組織細胞から抽出されたDNA配列、RNA配列、及び/またはタンパク質配列であってよい。予測モジュール320は、配列データを、MHC−Iについては8〜15個のアミノ酸またはMHC−IIについては6〜30個のアミノ酸を有する複数のペプチド配列pkに処理する。例えば、予測モジュール320は、所定の配列「IEFROEIFJEF(SEQ ID NO:76)」を、9個のアミノ酸を有する3種類のペプチド配列「IEFROEIFJ(SEQ ID NO:77)」、「EFROEIFJE(SEQ ID NO:78)」、及び「FROEIFJEF(SEQ ID NO:79)」に処理することができる。一実施形態では、予測モジュール320は、患者の正常組織細胞から抽出された配列データをその患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較して1つ以上の変異を有する部分を特定することによって、変異したペプチド配列である候補新生抗原を特定することができる。
XI.B.1 概要
カセット設計モジュール324は、患者に注射するためのv種類の選択された候補ペプチドに基づいてワクチンカセット配列を生成する。具体的には、容量vのワクチンに含まれる選択されたペプチドのセットpk,k=1,2,…,vについて、カセット配列は、それぞれが対応するペプチドpkの配列を含む一連の治療エピトープ配列p’k,k=1,2,…,vの連結鎖によって与えられる。一実施形態では、カセット設計モジュール324は、各エピトープを互いに対して直接隣接するように連結することができる。例えば、あるワクチンカセットCは、
で表すことができる(式中、p’tiは、カセットのi番目のエピトープを示す)。したがって、tiは、カセットのi番目の位置の選択されたペプチドの添え字k=1,2,…,vに対応する。別の実施形態では、カセット設計モジュール324は、隣接するエピトープ間に1つ以上の任意選択的なリンカー配列を有するように各エピトープを連結することができる。例えば、あるワクチンカセットCは、
で表すことができる(式中、l(ti,tj)は、カセットのi番目のエピトープp’tiとj=i+1番目のエピトープp’j=i+1との間に配置されたリンカー配列を示す)。カセット設計モジュール324は、選択されたエピトープp’k,k=1,2,…,vのどれがカセットの異なる位置に配置されるか、及び、各エピトープ間に配置されるすべてのリンカー配列を決定する。カセット配列Cは、本明細書に記載される方法のいずれかに基づいたワクチンとしてロードすることができる。
により与えられる(ただし、h(・)は、各ジャンクションの距離関数をあるスコアにマッピングする特定の関数である)。本明細書の残りの部分を通じて言及される1つの特定の例では、関数h(・)は、カセットの距離関数にわたった総和である。
v×vの行列Dは、非対称距離行列であり、各要素D(k,m),k=1,2,…,v;m=1,2,…,vは、エピトープp’kからエピトープp’mまでのジャンクションの距離関数に対応している。Pの列k=2,…,vは元のエピトープの各ノードに対応し、列1及び行1は、他のすべてのノードからの距離が0である「ゴーストノード」に対応する。行列への「ゴーストノード」の追加は、ワクチンカセットが環状ではなく直鎖状であり、したがって最初のエピトープと最後のエピトープとの間にジャンクションがないという概念を記号化するものである。換言すれば、配列は環状ではなく、最初のエピトープは配列内の最後のエピトープの後に連結されると仮定されない。エピトープp’kがエピトープp’mのN末端に連結され、そうでない場合には0である、方向付けられた経路(すなわち、カセット内のエピトープ−エピトープジャンクション)が存在する場合にxkmがバイナリー変数を示すものとする。さらに、Eが、すべてvの治療ワクチンエピトープのセットを示し、S⊂Eがエピトープのサブセットを示すものとする。任意のかかるサブセットSにおいて、out(S)が、エピトープ−エピトープジャンクションxkm=1の数を示すものとする(ただし、kはS内のエピトープであり、mはE\S内のエピトープである)。既知の経路行列Pが与えられたものとして、カセット設計モジュール324は、以下の整数線形計画問題を解く経路行列Xを見つける。すなわち、
ただし、Pkmは、以下の制約条件の下で、経路行列Pの要素P(k,m)を示す。すなわち、
最初の2つの制約条件は、各エピトープがカセット内にちょうど1回現れることを保証するものである。最後の制約条件は、カセットが連結されていることを保証するものである。換言すれば、xで記号化されたカセットは連結された直鎖状タンパク質配列である。
v=20個の治療エピトープを含む2個のカセット配列を、1,000,000通りの順列のランダムサンプリングにより(カセット配列C1)、また、等式(27)において整数線形計画問題を解くことにより(カセット配列C2)生成した。距離関数、したがって提示スコアを、等式(14)で記述される提示モデルに基づいて求めた(式中、fは、シグモイド関数であり、xh iは、ペプチドpiの配列であり、gh(・)は、ニューラルネットワーク関数であり、wは、フランキング配列、ペプチドpiのlogTPM(transcripts per kilobase million)、ペプチドpiのタンパク質の抗原性、及びペプチドpiの由来源の試料IDを含み、フランキング配列のgw(・)及びlogTPMは、それぞれニューラルネットワーク関数である)。gh(・)のニューラルネットワーク関数のそれぞれは、単一隠れ層の多層パーセプトロン(MLP)の1つの出力ノードを含み、入力次元231(11残基×残基ごとに21文字(pad文字を含む))の幅256、隠れ層での正規化線形ユニット(ReLU)活性化、出力層での線形活性化、及び、訓練データセット内のHLAアレルごとに1個の出力ノードのものであった。フランキング配列のニューラルネットワーク関数は、単一隠れ層MLPで、入力次元210(N末端フランキング配列の5残基+C末端フランキング配列の5残基×残基ごとに21文字(pad文字を含む))、幅32、隠れ層でのReLU活性化、及び出力層での線形活性化のものであった。RNA logTPMのニューラルネットワーク関数は、単一隠れ層MLPで、入力次元1、幅16、隠れ層でのReLU活性化、及び出力層での線形活性化のものであった。HLA−A*02:04、HLA−A*02:07、HLA−B*40:01、HLA−B*40:02、HLA−C*16:02、及びHLA−C*16:04のHLAアレルについて提示モデルを構築した。2個のカセット配列の提示されるジャンクションエピトープの期待数を示す提示スコアを比較した。結果は、等式(27)を解くことによって生成されたカセット配列の提示スコアが、ランダムサンプリングによって生成されたカセット配列の提示スコアよりも約4倍の改善をともなったことを示した。
これは、提示されるジャンクションエピトープの期待数の提示スコアは6.1であった。1,000,000通りのランダム配列の提示スコアの中央値は、18.3であった。実験は、提示されるジャンクションエピトープの期待数が、ランダムにサンプリングされたカセット間でカセット配列を特定することによって大幅に低減されたことを示している。
これは提示スコア1.7であった。カセット配列C2の提示スコアは、カセット配列C1の提示スコアと比較して約4倍の改善を示し、ランダムに生成された1,000,000通りの候補カセットの提示スコアの中央値と比較して約11倍の改善を示した。カセットC1を生成するためのランタイムは、2.30GHzのIntel Xeon E5−2650 CPUのシングルスレッド上で20秒であった。カセットC2を生成するためのランタイムは、同じCPUのシングルスレッド上で1秒であった。したがって、この例では、等式(27)の整数線形計画問題を解くことによって特定されたカセット配列は、20倍低減された計算コストで約4倍良好な解を生成している。
この例では、腫瘍/正常エクソームのシークエンシング、腫瘍トランスクリプトームのシークエンシング、及び肺癌試料のHLAタイピングに基づいて選択されたv=20個の治療エピトープを含むカセット配列を、1,000,000通りの順列のランダムサンプリングにより、さらに等式(27)で整数線形計画問題を解くことによって生成した。距離関数、したがって提示スコアを、HLAペプチドの結合親和性の予測プログラムであるMHCflurryによって予測された、様々な閾値(例えば、50〜1000nM、またはこれよりも高いかもしくは低い値)を下回る親和性で患者のHLAに結合するジャンクションエピトープの数に基づいて求めた。この例では、治療エピトープとして選択される20個の非同義体細胞変異を、上記のセクションXI.Bの提示モデルにしたがって変異をランク付けすることによって腫瘍試料で特定された98個の体細胞変異間から選択した。しかしながら、他の実施形態では、治療エピトープは、安定性に基づくものなど、または提示スコア、親和性といった基準の組み合わせなどの他の基準に基づいて選択することもできる点は理解されよう。さらに、ワクチンに含めるための治療エピトープを優先順位付けするために用いられる基準は、カセット設計モジュール324で使用される距離関数D(k,m)を決定するために用いられる基準と同じである必要はない点は理解されよう。
上記の種々の提示モデルの妥当性を、提示モデルを訓練するために使用されなかった訓練データ170のサブセット、または、訓練データ170と類似した変数及びデータ構造を有する訓練データ170とは別々のデータセットであった、試験データTに対して試験した。
であり、これは、HLAアレル上に提示されると予測されたペプチド例の数に対する、関連するHLAアレル上に提示されると正確に予測されたペプチド例の数の比を示す。一実現形態では、試験データTにおけるペプチドpiは、対応する尤度推定値uiが、所定の閾値t以上である場合に、1つ以上の関連するHLAアレル上に提示されると予測された。提示モデルの性能を示す別の関連性のある測定基準は、
であり、これは、HLAアレル上に提示されることが公知であったペプチド例の数に対する、関連するHLAアレル上に提示されると正確に予測されたペプチド例の数の比を示す。提示モデルの性能を示す別の関連性のある測定基準は、受信者動作特性(ROC)の曲線下面積(AUC)である。ROCは、
によって与えられる、偽陽性率(FPR)に対するリコールをプロットする。
図13Aは、複数アレル質量分析データに基づいて、ペプチド提示予測について、本明細書において提示するような例示的な提示モデル、及び従来の技術水準モデルの性能結果を比較する。結果は、例示的な提示モデルが、親和性及び安定性の予測に基づく従来の技術水準モデルよりも有意に良好に、ペプチド提示の予測において機能したことを示した。
図13Bは、T細胞エピトープデータに基づいて、ペプチド提示予測について、本明細書において提示するような別の例示的な提示モデル、及び従来の技術水準モデルの性能結果を比較する。T細胞エピトープデータは、細胞表面上のMHCアレルによって提示されT細胞によって認識されたペプチド配列を含有する。結果は、例示的な提示モデルが、たとえ質量分析データに基づいて訓練されているとしても、親和性及び安定性の予測に基づく従来の技術水準モデルよりも有意に良好に、T細胞エピトープの予測において機能したことを示した。換言すると、図13Bの結果は、例示的な提示モデルが、質量分析試験データに基づくペプチド提示の予測において従来の技術水準モデルよりも良好に機能しただけではなく、T細胞によって実際に認識されたエピトープの予測においても、従来の技術水準モデルよりも有意に良好に機能したことを示した。これは、本明細書において提示するような様々な提示モデルが、免疫系において免疫原性応答を誘導する可能性が高い抗原の、改善された特定を提供できることのしるしである。
図13Cは、複数アレル質量分析データに基づいて、ペプチド提示予測について、例示的な和の関数モデル(等式(13))、例示的な関数の和モデル(等式(19))、及び例示的な二次モデル(等式(23))の性能結果を比較する。結果は、関数の和モデル及び二次モデルが、和の関数モデルよりも良好に機能したことを示した。これは、和の関数モデルが、実際にはペプチドの提示が有効に独立している場合、複数アレル設定におけるアレルが、ペプチド提示について互いに干渉し得ることを含意するためである。
図13Dは、複数アレル質量分析データについて、ペプチド提示予測に関して、単一アレル質量分析データを伴って及び伴わずに訓練される2つの例示的な提示モデルの性能結果を比較する。結果は、単一アレルデータを伴わずに訓練される例示的な提示モデルが、単一アレルデータを伴って訓練される例示的な提示モデルのものに匹敵する性能を達成することを示した。
図13Eは、図13Dに示す解析において提供されたアレルHLA−A*02:01及びHLA−B*07:02についての単一アレル質量分析データに基づく、図13Dに示す「A2/B7単一アレルデータを伴わない」及び「A2/B7単一アレルデータを伴う」例示的なモデルの性能を示す。結果は、たとえ例示的な提示モデルがこれらの2つのアレルについての単一アレル質量分析データを伴わずに訓練されるとしても、モデルが各MHCアレルについての結合モチーフを学習できることを示す。
図13Fは、図13Dに示す「A2/B7単一アレルデータを伴わない」例示的なモデルによって予測される、ノナマー間で2位及び9位に共通したアンカー残基を示す。ペプチドは、推定尤度が5%よりも上であった場合に、提示されることが予測された。結果は、MHCアレルHLA−A*02:01及びHLA−B*07:02上での提示について特定されたペプチドにおける最も一般的なアンカー残基が、これらのMHCアレルについて既知のアンカーモチーフと一致したことを示す。これは、例示的な提示モデルが、期待されたように、ペプチド配列のアミノ酸の特定の位置に基づいて、ペプチド結合を正確に学習したことを示す。
図13Gは、C末端隣接配列及びN末端隣接配列をアレル相互作用変数として組み入れた例示的な提示モデルと、C末端隣接配列及びN末端隣接配列をアレル非相互作用変数として組み入れた例示的な提示モデルとの間の性能結果を比較する。結果は、C末端隣接配列及びN末端隣接配列のアレル非相互作用変数としての組み入れが、モデル性能を有意に改善したことを示した。より具体的には、様々なMHCアレルにわたって共通である、ペプチド提示に適切な特性を特定し、これらのアレル非相互作用変数についての統計学的強度が、提示モデルの性能を改善するためにMHCアレルにわたって共有されるように、それらをモデル化することが、価値を有する。
図13(H)は、質量分析によって決定された、mRNA存在量と腫瘍細胞上に提示されたペプチドの頻度との間の依存性を示す。結果は、mRNA発現とペプチド提示との間に強い依存性があることを示す。
図13Iは、2つの例示的な提示モデルの性能を示し、そのうち1つは、質量分析腫瘍細胞データに基づいて訓練されており、もう1つは、mRNA定量データ及び質量分析腫瘍細胞データを組み入れている。図13Hから期待されるように、mRNA発現はペプチド提示の強い指標であるため、結果は、mRNA定量測定値を例示的な提示モデルに組み入れることによって、性能の有意な改善があることを示した。
図13Jは、図13Iに関して説明した「例示的なモデル、RNAあり」提示モデルによって生成された結果と、ペプチド提示を予測する時にペプチド長を計上しない従来の技術水準モデルによって予測された結果との間で、異なるペプチド長についてのペプチド提示の確率を比較する。結果は、図13Iからの「例示的なモデル、RNAあり」の例示的な提示モデルが、異なる長さのペプチドにわたって尤度の変動を捕捉したことを示した。
以下は、hによって意味されるMHCアレルHLA−C*16:04について、アレルごと提示モデル(等式(2))のバリエーションについて決定されたパラメータのセットを示し:
式中、relu(・)は、正規化線形ユニット(RELU:rectifiedlinearunit)関数であり、Wh 1、bh 1、Wh 2、及びbh 2は、モデルについて決定されたパラメータθのセットである。アレル相互作用変数xh kは、ペプチド配列からなる。Wh 1の次元は(231x256)であり、bh 1の次元は(1x256)であり、Wh 2の次元は(256x1)であり、かつbh 2はスカラーである。証明の目的で、bh 1、bh 2、Wh 1、及びWh 2の値は、その教示するところのすべてについて本明細書に援用する国際公開第WO2017106638号に詳細に記載されている。
MHCクラスII新生抗原を決定するための方法については、その教示するところのすべてを本明細書に援用する、国際出願第PCT/US2018/028438号により詳細に記載されている。
図13Nは、HLAクラスII分子を含む合計39種の試料の各試料について質量分析を用いてシークエンシングしたペプチドの量を示すヒストグラムである。さらに、複数の試料の各試料について、図13Nに示されるヒストグラムは、異なるq値の閾値で質量分析を用いてシークエンシングしたペプチドの量を示している。具体的には、複数の試料の各試料について、図13Nは、0.01未満のq値、0.05未満のq値、及び0.2未満のq値で質量分析を用いてシークエンシングしたペプチドの量を示している。
以下は、クラスII MHCアレルであるHLA−DRB1*12:01及びHLA−DRB1*10:01の暗黙のアレルごと提示尤度を生成する複数アレル提示モデル(式(16))のバリエーションについて求められるパラメータのセットを示す。
u=expit(relu(X・W1+b1)・W2+b2)
式中、relu(・)は、正規化線形ユニット(ReLU)関数、W1、b1、W2、及びb2は、モデルについて求められたパラメータθのセットである。アレル相互作用変数Xは、入力ペプチド当たり1行のワン・ホットコード化され、中間パッド化された(middle−padded)ペプチド配列からなる1×399行列に含まれる。W1の次元は(399×256)、b1の次元は(1×256)、W2の次元は(256×2)、b2の次元は(1×2)である。出力の第1の行は、アレルHLA−DRB1*12:01によるそのペプチド配列の暗黙のアレルごとの提示の確率を示し、出力の第2の行は、アレルHLA−DRB1*10:01によるそのペプチド配列の暗黙のアレルごとの提示の確率を示す。例示の目的で、W1、b1、W2、及びb2の値は、その教示するところのすべてについて本明細書に援用する、国際出願第PCT/US2018/028438号に詳細に記載されている。
図14は、図1及び図3に示した実体を実施するための例示的なコンピュータ1400を説明する。コンピュータ1400は、チップセット1404に連結された少なくとも1つのプロセッサ1402を含む。チップセット1404は、メモリコントローラハブ1420及び入力/出力(I/O)コントローラハブ1422を含む。メモリ1406及びグラフィックスアダプタ1412は、メモリコントローラハブ1420に連結されており、ディスプレイ1418は、グラフィックスアダプタ1412に連結されている。記憶デバイス1408、入力装置1414、及びネットワークアダプタ1416は、I/Oコントローラハブ1422に連結されている。コンピュータ1400の他の実施形態は、異なるアーキテクチャを有する。
以下は、本明細書を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明の範囲をいかなる意味においても限定しようとするものではない。用いられる数値(例えば、量、温度など)に関して精度を確実とするべく努力に努めてはいるが、ある程度の実験的誤差及び偏差は無論のこと許容されなければならない。
ワクチン接種によって、対応する細胞免疫応答(複数可)を刺激するクラスI MHCに制限された複数の腫瘍特異的新生抗原(TSNA)を送達することができる。1つの例では、複数のエピトープを単一の遺伝子産物をしてコードするようにワクチンカセットを操作しているが、ここで各エピトープはそれらの天然の包囲ペプチド配列内に埋め込まれるか、または非天然リンカー配列によって分離されている。抗原のプロセシング及び提示、ひいてはTSNA特異的CD8 T細胞応答の程度及び幅に潜在的に影響を及ぼしうるいくつかの設計パラメータが特定されている。本例では、いくつかのモデルカセットを設計及び構築して以下を評価した。すなわち、(1)1個の発現カセットに組み込まれた複数のエピトープに対する強いT細胞応答を生じることができるかどうか、(2)どのような条件が、すべてのエピトープの最適なプロセシング及び提示につながる、発現カセット内のTSNA間に配置される最適リンカーを作るか、(3)カセット内の各エピトープの相対位置がT細胞応答に影響するか、(4)カセット内のエピトープの数が個々のエピトープに対するT細胞応答の程度または質に影響するかどうか、(5)細胞ターゲティング配列の付加がT細胞応答を向上させるか。
XIV.B.1.方法及び材料
TCR及びカセット設計及びクローニング
選択されたTCRは、A*0201により提示される場合にペプチドNLVPMVATV(SEQ ID NO:132)(PDB番号5D2N)、CLGGLLTMV(SEQ ID NO:133)(PDB番号3REV)、GILGFVFTL(SEQ ID NO:134)(PDB番号1OGA)LLFGYPVYV(SEQ ID NO:135)(PDB番号1AO7)を認識する。2Aペプチド連結TCRサブユニット(βに続きα)、EMCV IRES、及び2A連結CD8サブユニット(βに続きα及びプロマイシン耐性遺伝子)を含むトランスファーベクターを構築した。オープンリーディングフレーム配列は、コドン最適化され、GeneArt社により合成されたものである。
ペプチドは、ProImmune社またはGenscript社より購入し、水/DMSO(2:8,v/v)に加えた10mM tris(2−カルボキシルエチル)ホスフィン(TCEP)で10mg/mLに希釈した。細胞培地及び補助添加物質は特に断らない限りはGibco社より入手した。熱不活化ウシ胎児血清(FBShi)はSeradigm社より入手した。QUANTI−Luc基質、ゼオシン、及びプロマイシンはInvivoGen社より入手した。Jurkat−Lucia NFAT細胞(InvivoGen社)を10% FBShi、ピルビン酸ナトリウム、及び100μg/mLのゼオシンを添加したRPMI1640中で維持した。形質導入した後、これらの細胞にさらに0.3μg/mLのプロマイシンを加えた。T2細胞(ATCC CRL−1992)をIscove培地(IMDM)+20%FBShi中で培養した。U−87 MG(ATCC HTB−14)細胞を、10%FBShiを添加したMEM Eagles培地中で維持した。
T2細胞はTCRによる抗原認識を調べる目的で日常的に使用されている。T2細胞は、抗原プロセシング用のペプチドトランスポーターを欠失しており(TAP欠損)、内在性のペプチドをMHC上に提示するために小胞体に取り込むことができない。しかしながら、T2細胞には外来性のペプチドを容易に取り込ませることができる。5種類のマーカーペプチド(NLVPMVATV(SEQ ID NO:132)、CLGGLLTMV(SEQ ID NO:133)、GLCTLVAML(SEQ ID NO:136)、LLFGYPVYV(SEQ ID NO:135)、GILGFVFTL(SEQ ID NO:134))及び2種類の無関係のペプチド(WLSLLVPFV(SEQ ID NO:137)、FLLTRICT(SEQ ID NO:138))をT2細胞に取り込ませた。簡単に述べると、T2細胞をカウントし、IMDM +1%FBShiで1×106細胞/mLに希釈した。各ペプチドは10μgペプチド/1×106細胞となるように加えた。次いで細胞を37℃で90分間インキュベートした。細胞をIMDM+20%FBShiで2回洗浄し、5×10E5細胞/mLに希釈し、100μLを96ウェルCostar組織培養プレートにプレーティングした。Jurkat−Lucia TCRクローンをカウントし、RPMI1640+10%FBShi中で5×10E5細胞/mLに希釈し、100μLをT2細胞に加えた。プレートを37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。次いでプレートを400gで3分間遠心し、20μLの上清を白色平底Greinerプレートに取った。指示にしたがってQUANTI−Luc基質を調製し、50μL/ウェルで加えた。ルシフェラーゼ発現をMolecular Devices SpectraMax iE3xで読み取った。
トランスジェニックHLA−A2.1(HLA−A2 Tg)マウスをTaconic Labs,Inc社より入手した。これらのマウスは、ヒトHLA−A2.1リーダードメイン、α1ドメイン、及びα2ドメインと、マウスH2−Kb α3ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインからなる導入遺伝子を有するものである(Vitiello et al.,1991)。これらの実験で使用したマウスは、C57Bl/6バックグラウンドの野生型BALB/cAnNTacの雌及びホモ接合型HLA−A2.1Tgの雌の第1世代子孫(F1)である。
HLA−A2 Tgマウスを、前脛骨筋の両側性の筋肉内注射により1×1010〜1×106 個のアデノウイルスベクターのウイルス粒子で免疫化した。免疫応答を免疫化の12日後に測定した。
免疫化したマウスの新しく収穫した脾臓及びリンパ節からリンパ球を単離した。GentleMACS組織解離装置を製造者の指示にしたがって使用して、10%ウシ胎児血清をペニシリン及びストレプトマイシンとともに含むRPMI(完全RPMI)中で組織を解離させた。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン(Janetzki et al.,2015)にしたがってELISPOT分析を行った。1×105個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入した。
新しく単離したリンパ球を2〜5×106細胞/mLの密度で10uMの示したペプチドと2時間インキュベートした。2時間後、ブレフェルジンAを5ug/mlの濃度にまで加え、細胞を刺激物質とさらに4時間インキュベートした。刺激後、生細胞を製造者のプロトコールにしたがって固定可能な生存率解析用色素eFluor780で標識し、抗CD8 APC(クローン53−6.7,BioLegend社)により1:400の希釈率で染色した。細胞内染色には抗IFNg PE(クローンXMG1.2,BioLegend社)を1:100で使用した。試料をAttune NxT Flow Cytometer(Thermo Scientific社)で収集した。FlowJoを使用してフローサイトメトリーデータをプロットし、分析を行った。抗原特異的応答の程度を評価するため、CD8+細胞のIFNg+の割合(%)及び全IFNg+細胞数/1×106個の生細胞の両方を、各ペプチド刺激物質に対して計算した。
新生抗原カセットの設計の評価の一例として、インビトロの細胞ベースのアッセイを開発し、モデルワクチンカセット内の選択されたヒトエピトープが抗原提示細胞によって発現、プロセシング、及び提示されるかどうかを評価した(図15)。認識後、特性がよく知られているペプチド−HLAの組み合わせに特異的な5種類のTCRのうちの1つを発現するように操作されたJurkat−LuciaレポーターT細胞が活性化され、活性化T細胞の核因子(NFAT)を核内に移行させると、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写が活性化される。個々のレポーターCD8 T細胞株の抗原刺激をバイオルミネッセンスによって定量した。
ルシフェラーゼの誘導によって測定されるペプチド特異的T細胞認識は、ワクチンカセット抗原の効果的なプロセシング及び提示を示す。
*エピトープ3のレポーターT細胞はまだ生成されていない。
インビトロT細胞活性化アッセイにおけるルシフェラーゼ誘導は、DPPベースのカセットと異なり、すべてのリンカーがカセット抗原の効率的な放出を促進したことを示した。T細胞エピトープのみ(リンカー無し)=9AA、片側に天然リンカー=17AA、両側に天然リンカー=25AA、非天然リンカー=AAY,RR,DPP
*エピトープ3のレポーターT細胞はまだ生成されていない。
インビトロT細胞活性化アッセイを用いることにより、4つのHLA−A*0201制限マーカーエピトープがモデルカセットから効率的に放出され、ターゲティング配列がT細胞の認識及び活性化を大幅に向上させないことが示された。
*エピトープ3のレポーターT細胞はまだ生成されていない。
新生抗原カセット設計の評価の別の例として、HLA−A*02:01に制限された形でCD8 T細胞を刺激することが知られている、特性がよく知られた5つのヒトクラスI MHCエピトープを含むようにワクチンカセットを設計した(図16A、17、19A)。それらのインビボ免疫原性の評価を行うため、これらのマーカーエピトープを含むワクチンカセットをアデノウイルスベクターに組み込み、HLA−A2トランスジェニックマウスに感染させるのに使用した(図18)。このマウスモデルは、ヒトHLA−A*0201及びマウスH2−Kbから一部が構成された導入遺伝子を保有しており、したがって、ヒトHLA−A2.1のリーダー、マウスα3に連結されたα1及びα2ドメイン、膜貫通及び細胞質H2−Kbドメインで構成されたキメラクラスI MHC分子をコードしている(Vitiello et al.,1991)。このキメラ分子は、HLA−A*02:01に制限された抗原提示を可能とする一方で、CD8共受容体とMHC上のα3ドメインとの種の一致した相互作用を維持する。
ELISPOTデータは、HLA−A2トランスジェニックマウスが1×e11個のアデノウイルス粒子による感染17日後にカセット内のすべてのクラスI MHC制限エピトープに対してT細胞応答を生じたことを示した。
ELISPOTデータは、HLA−A2トランスジェニックマウスが5e10アデノウイルス粒子による感染17日後に長いワクチンカセット及び短いワクチンカセットの両方で同等の大きさのT細胞応答を生じたことを示した。
* 技術的なエラーによりT細胞応答が見られなかったと疑われる。
要約すると、モデルカセット評価による知見(図16〜19、表2〜6)によって、モデルワクチンカセットでは、アデノウイルスベースのベクターとの関連で約20個のエピトープをコードする「数珠つなぎ」アプローチを用いた場合に強い免疫原性が得られることが実証された。エピトープは、両側にその天然の周辺ペプチド配列(例えば、両側に8個のアミノ酸残基)が隣接した最小のCD8 T細胞エピトープ(例えば、9個のアミノ酸残基)をそれぞれが埋め込んだ25マー配列を連結することによって最も効果的にアセンブルされる。本明細書において使用される場合、「天然」または「自然」のフランキング配列とは、その由来源タンパク質内のそのエピトープの天然に存在するという文脈で特定のエピトープのN末端及び/またはC末端側のフランキング配列のことを指す。例えば、HCMV pp65 MHC IのエピトープNLVPMVATV(SEQ ID NO:132)は、その5’末端側に天然の5’配列WQAGILAR(SEQ ID NO:139)が、その3’末端側に天然の3’配列QGQNLKYQ(SEQ ID NO:140)が隣接し、それによりHCMV pp65由来源タンパク質内にみられる
という25マーペプチドを生成する。天然または自然の配列は、天然のフランキング配列(複数可)が隣接したエピトープをコードするヌクレオチド配列のことを指す場合もある。各25マー配列は、それに続く25マー配列に直接連結される。最小のCD8 T細胞エピトープがアミノ酸9個よりも大きいかまたは小さい場合、フランキングペプチドの長さは、全体の長さが依然25マーのペプチド配列となるように調節することができる。例えば、アミノ酸10個のCD8 T細胞エピトープには、アミノ酸8個とアミノ酸7個の配列を隣接させることができる。このコンカテマーの後には、CD4 Tヘルパー細胞を刺激し、ワクチンカセット抗原の全体のインビボ免疫原性を改善するため(Alexander et al.,1994;Panina−Bordignon et al.,1989)に含ませた2個のユニバーサルクラスII MHCエピトープを繋げた。これらのクラスIIエピトープは、GPGPGアミノ酸リンカー(SEQ ID NO:56)によって最後のクラスIエピトープに連結した。2個のクラスIIエピトープは、GPGPGアミノ酸リンカー(SEQ ID NO:56)によって互いに対しても連結し、さらにC末端側にGPGPGアミノ酸リンカー(SEQ ID NO:56)を連結させた。エピトープの位置もその数もT細胞の認識または応答に大きく影響しないようであった。ターゲティング配列も、カセットに由来する抗原の免疫原性に大きく影響しないようであった。
XV.A.ChAd新生抗原カセット送達ベクターの構築
1つの例では、チンパンジーアデノウイルス(ChAd)を操作して新生抗原カセットの送達ベクターとした。さらなる例では、完全長ChAdV68ベクターを、AC_000011.1(米国特許第6083716号に記載の配列2)に基づいて合成し、E1(nt457〜3014)及びE3(nt27,816〜31,332)配列を欠失させた。CMVプロモーター/エンハンサーの制御下にあるレポーター遺伝子を欠失させたE1配列の代わりに挿入した。このクローンをHEK293細胞にトランスフェクトしたところ、感染性のウイルスは生成されなかった。野生型C68ウイルスの配列を確認するため、単離VR−594をATCCより入手して継代した後、個々に配列決定した(SEQ ID NO:10)。AC_000011.1配列を野生型ChAdV68ウイルスのATCC VR−594配列(SEQ ID NO:10)と比較したところ、6個のヌクレオチドの相違が特定された。1つの例では、改変ChAdV68ベクターを、AC_000011.1に基づいて作製し、対応するATCC VR−594ヌクレオチドを5つの位置で置換した(ChAdV68.5WTnt SEQ ID NO:1)。
XV.B.1.ChAdベクターの評価方法及び材料
リポフェクタミンを用いたHEK293A細胞のトランスフェクション
ChAdV68コンストラクト(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25マー、及びChAdV68.5WTnt.MAG25マー)のDNAを調製し、以下のプロトコールを用いてHEK293A細胞にトランスフェクトした。
ChAdV68コンストラクト(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25マー、ChAdV68.5WTnt.MAG25マー)のDNAを調製し、以下のプロトコールを用いてHEK293A細胞にトランスフェクトした。
8%CO2のインキュベーター内の293FreeStyle(商標)(ThermoFisher社)培地中で増殖させた293F細胞内でChAdV68ウイルス生成を行った。感染の当日、細胞を生存率98%で1mL当たり106細胞に希釈し、1LのShakeフラスコ(Corning社)中、1回の生成操作当たり400mLを使用した。1回の感染当たり目標MOIが3.3よりも高い4mLの三次ウイルスストックを使用した。トリパンブルーによって測定される生存率が70%を下回るまで48〜72時間にわたって細胞をインキュベートした。次いで感染細胞をベンチトップ遠心分離器で最大速度で遠心して収穫し、1×PBS中で洗浄し、再び遠心してから20mLの10mM Tris pH7.4に再懸濁した。細胞ペレットを、凍結解凍を3回行って溶解し、4,300×gで5分間遠心して清澄化した。
ウイルスDNAをCsCl遠心分離により精製した。2つの不連続な勾配の操作を行った。第1の遠心は、細胞成分からウイルスを精製するためのもので、第2の遠心は、細胞成分からの分離物をさらに精製し、感染性粒子から機能不全粒子を分離するためのものである。
1.1×1012個のウイルス粒子(VP)の消光係数はOD260nmの吸光度の値=1に相当することに基づき、OD260アッセイを用いてVP濃縮を行った。アデノウイルスの2つの希釈度(1:5と1:10)をウイルス溶解バッファー(0.1%SDS,10mM Tris pH7.4,1mM EDTA)中で作った。両方の希釈度でODを2重に測定し、OD260値×希釈係数×1.1×1012VPを掛けることによりVP濃度/mLを測定した。
C57BL/6J系の雌性マウス及びBalb/c系の雌性マウスに、1×108個のChAdV68.5WTnt.MAG25マーのウイルス粒子(VP)を、100uL体積中で両側性の筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールした。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解した。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行った。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入した。
1つの例において、ChAdV68.4WTnt.GFP(図21)及びChAdV68.5WTnt.GFP(図22)のDNAを、HEK293A細胞にトランスフェクトし、ウイルス複製(ウイルスプラーク)をトランスフェクションの7〜10日後に観察した。ChAdV68ウイルスプラークを光学(図21A及び22A)及び蛍光顕微鏡法(図21B〜C、及び図22B〜C)を使用して可視化した。GFPは、増殖性ChAdV68ウイルス送達粒子の生成を示す。
1つの例において、ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、及びChAdV68.5WTnt.MAG25マーウイルスをHEK293F細胞内で増殖させ、精製ウイルスストックをトランスフェクションの18日後に生成した(図23)。精製ChAdV68ウイルスストック中のウイルス粒子を定量し、同じプロトコールを使用して生成されたアデノウイルス5型(Ad5)及びChAdVY25(近縁のChAdV;Dicks,2012,PloS ONE7,e40385)ウイルスストックと比較した。ChAdV68ウイルス力価は、Ad5及びChAdVY25と同等であった(表7)。
マウス腫瘍抗原を発現するC68ベクターを、マウス免疫原性実験で評価して、C68ベクターがT細胞応答を誘発することを実証する。MHCクラスIエピトープSIINFEKL(SEQ ID NO:57)に対するT細胞応答C57BL/6J系雌性マウスで測定し、MHCクラスIエピトープAH1−A5(Slansky et al.,2000,Immunity13:529−538)に対するT細胞応答をBalb/c系マウスで測定した。図29に示されるように、ChAdV68.5WTnt.MAG25マーによるマウスの免疫後にコントロールに対して強いT細胞応答が測定された。脾細胞106個当たり、8957個及び4019個のスポット形成細胞(SFC)の平均の細胞性免疫応答が、ELISpotアッセイにおいて、C57BL/6J系またはBalb/c系マウスをそれぞれChAdV68.5WTnt.MAG25マーで免疫した場合に免疫の10日後に観察された。
XVI.A.アルファウイルス送達ベクター評価の材料及び方法
RNAを生成するためのインビトロ転写
インビトロ試験を行うため、プラスミドDNAをPmeIによる制限消化によって直鎖状とし、カラムを製造者の指示にしたがって洗浄し(GeneJet DNA cleanup kit,Thermo社)、テンプレートとして使用した。RiboMAX Large Scale RNA production System(Promega社)をm7Gキャップアナログ(Promega)とともに製造者の指示にしがって使用してインビトロ転写を行った。RNeasy kit(Qiagen社)を製造者の指示にしがって使用してmRNAを精製した。
HEK293A細胞を、96ウェルのウェル当たり6e4細胞で、24ウェルのウェル当たり2e5細胞で、トランスフェクションの約16時間前に播種した。細胞にMessengerMAXリポフェクタミン(Invitrogen社)を製造者のプロトコールにしたがって使用してmRNAをトランスフェクションした。96ウェルでは、ウェル当たり0.15uLのリポフェクタミン及び10 ng のmRNAを使用し、24ウェルでは、ウェル当たり0.75uLのリポフェクタミン及び150ngのmRNAを使用した。GFPを発現するmRNA(TriLink Biotechnologies社)をトランスフェクションのコントロールとして使用した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイを、白い壁の96ウェルプレートで、ONE−Gloルシフェラーゼアッセイ(Promega社)を製造者のプロトコールにしたがって使用して各条件を三重にして行った。発光度をSpectraMaxを使用して測定した。
トランスフェクトした細胞をトランスフェクションの2時間後に新鮮な培地で洗い、新鮮な培地に交換してトランスフェクトしなかったmRNAをすべて除去した。次いで細胞を異なる時点でRLT plus lysis buffer(Qiagen社)中に収穫し、いずれも製造者のプロトコールにしたがってQiaShredder(Qiagen社)を使用してホモジナイズし、RNeasy kit(Qiagen社)を使用して抽出した。Nanodrop(Thermo Scientific社)を使用して全RNAを定量した。製造者のプロトコールにしたがってqTower3 (Analytik Jena)でQuantitect Probe One−Step RT−PCR kit(Qiagen社)を使用し、反応当たり20ngの全RNAを使用してqRT−PCRを行った。各試料を各プローブについて三重に試験した。ActinまたはGusBを参照遺伝子として用いた。カスタムプライマー/プローブはIDT社により生成されたものである(表8)。
C57BL/6J系マウスの左下脇腹に105個のB16−OVA細胞/動物を注射した。腫瘍を免疫化の前、3日間にわたって増殖させた。
Balb/c系マウスの左下脇腹に106個/動物のCT26細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、7日間にわたって増殖させた。
srRNAワクチンについては、マウスに100uL体積中、10ugのRNAを、両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。Ad5ワクチンについては、マウスに5×1010個のウイルス粒子(VP)を、100uL体積中で両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。各動物に、抗CTLA−4(クローン9D9,BioXcell社)、抗PD−1(クローンRMP1−14,BioXcell社)、または抗IgG(クローンMPC−11,BioXcell社)を、用量250ugで、週2回、腹腔内注射により注射した。
各時点においてマウスに腹腔内注射により150mg/kgのルシフェリン基質を注射し、注射の10〜15分後にIVISインビボイメージングシステム(PerkinElmer社)を使用して生物発光を測定した。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールした。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解した。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行った。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入した。
XVI.B.1.アルファウイルスベクターのインビトロ評価
本明細書の一実現形態では、新生抗原発現システム用のRNAアルファウイルス骨格を、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)(Venezuelan Equine Encephalitis(VEE)(Kinney,1986,Virology 152:400−413)ベースの自己複製RNA(srRNA)ベクターから生成した。1つの例では、26Sサブゲノムプロモーターの3’側に位置するVEEの構造タンパク質をコードする配列を欠失させ(VEE配列の7544〜11,175を欠失させた。番号付けはKinney et al 1986に基づく。SEQ ID NO:6)、抗原配列(SEQ ID NO:14及びSEQ ID NO:4)またはルシフェラーゼレポーター(例えばVEE−ルシフェラーゼ、SEQ ID NO:15)に置き換えた(図24)。RNAをインビトロでsrRNA DNAベクターから転写させ、HEK293A細胞にトランスフェクトしてルシフェラーゼレポーターの発現を測定した。さらに、ルシフェラーゼをコードする(非複製)mRNAを比較のためにトランスフェクトした。VEE−ルシフェラーゼのsrRNAでは、2時間の測定値を23時間の測定値と比較した場合にsrRNAレポーターシグナルの約30,000倍の増大が観察された(表9)。これに対して、同じ時間でのmRNAレポーターのシグナルの増大は10倍未満であった(表9)。
96ウェル中、ウェル当たり10ngのVEE−ルシフェラーゼsrRNAまたは10ngの非複製ルシフェラーゼmRNA(TriLink L−6307)をHEK293A細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト後の異なる時点で発光を測定した。ルシフェラーゼ発現を相対発光単位(RLU)として報告する。各データポイントは、3つのトランスフェクトしたウェルの平均±SDである。
HEK293A細胞にVEE−ルシフェラーゼsrRNAをトランスフェクトし(24ウェルのウェル当たり150ng)、トランスフェクション後の異なる時間にqRT−PCRによりRNAレベルを定量した。各測定値はアクチン参照遺伝子に対して正規化し、2時間の時点に対する倍率変化を示す。
HEK293細胞にVEE−MAG25マーsrRNAをトランスフェクトし(24ウェルのウェル当たり150ng)、トランスフェクション後の異なる時間にqRT−PCRによりRNAレベルを定量した。各測定値はGusB参照遺伝子に対して正規化し、2時間の時点に対する倍率変化を示す。グラフ上の異なる線は、いずれもsrRNAのエピトープカセット領域を検出する2つの異なるqPCRプライマー/プローブのセットを表す。
別の例において、VEE−ルシフェラーゼレポーターの発現をインビボで評価した。マウスに、脂質ナノ粒子(MC3)に封入された10ugのVEE−ルシフェラーゼsrRNAを注射し、注射の24及び48時間後、ならびに7及び14日後に撮影して生物発光シグナルを測定した。ルシフェラーゼシグナルが注射の24時間後に検出され、時間とともに増大し、srRNA注射の7日後にピークとなった(図25)。
1つの実現形態において、VEE srRNAベクターがインビボで抗原特異的免疫応答を誘導するかを調べるため、2つの異なるMHCクラスIマウス腫瘍エピトープであるSIINFEKL(SEQ ID NO:57)及びAH1−A5(Slansky et al.,2000,Immunity 13:529−538)を発現するVEE srRNAベクターを作製した(VEE−UbAAY,SEQ ID NO:14)。SFL(SIINFEKL(SEQ ID NO:57))エピトープは、B16−OVAメラノーマ細胞株によって発現され、AH1−A5(SPSYAYHQF(SEQ ID NO:58);Slansky et al.,2000,Immunity)エピトープは、CT26結腸癌細胞株によって発現される関連エピトープを標的とするT細胞を誘導する(AH1/SPSYVYHQF(SEQ ID NO:193);Huang et al.,1996,Proc Natl Acad Sci USA 93:9730−9735)。1つの例では、インビボ実験において、VEE−UbAAY srRNA が、T7ポリメラーゼ(TriLink Biotechnologies)を使用したインビトロ転写によって生成され、脂質ナノ粒子(MC3)に封入された。
*Vax群のマウス#6からの結果は、三重のウェル間のばらつきが大きいことから分析から除外した。
ChAdV68及び自己複製RNA(srRNA)を用いた異なる投与プロトコールを、マウスCT26腫瘍モデルで評価した。
腫瘍の注入
Balb/c系マウスにCT26細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の7日後にマウスを異なる実験アーム(各群当たりマウス28〜40匹)をランダムカセット配列し、処置を開始した。Balb/c系マウスの左下脇腹に106個/動物のCT26細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、7日間にわたって増殖させた。各実験アームは表15に詳細に記載したとおりである。
srRNAワクチンについては、マウスに100uL体積中、10ugのVEE−MAG25マーsrRNAを、両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。C68ワクチンについては、マウスに100uL体積中1×1011個のChAdV68.5WTnt.MAG25マーのウイルス粒子(VP)を、両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。各動物に、抗PD−1(クローンRMP1−14,BioXcell社)、または抗IgG(クローンMPC−11,BioXcell社)を、用量250ugで、週2回、腹腔内注射により注射した。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールした。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解した。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行った。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入した。
ChAdV68.5WTnt.MAG25マー/VEE−MAG25マーsrRNAの異種プライム/ブースト、またはVEE−MAG25マーsrRNAの同種プライム/ブーストワクチンの免疫原性及び有効性をCT26マウス腫瘍モデルで評価した。Balb/c系マウスにCT26細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の7日後にマウスを異なる実験アームをランダムカセット配列し、処置を開始した。各実験アームは表15に詳細に、また表16により一般的に記載したとおりである。
ChAdV68及び自己複製RNA(srRNA)を用いた異なる投与プロトコールを、非ヒト霊長類(NHP)で評価した。
プライミングワクチンを各NHPで筋肉内(IM)注射して実験を開始した(ワクチンプライム)。1回以上のブースターワクチン(ワクチンブースト)も各NHPに筋肉内注射した。下記表に概略を示し、下記に要約した各グループにしたがって、投与ごとに両側性注射で投与した。
Mamu A*01インドアカゲザルを、LNP−1またはLNP−2中で製剤化した1×1012個のウイルス粒子(注射1回当たり5×1011個のウイルス粒子)のChAdV68.5WTnt.MAG25マー、30ugのVEE−MAG25マーsrRNA、100ugのVEE−MAG25マーsrRNA、または300ugのVEE−MAG25マーsrRNAで両側性に免疫した。30ug、100ugまたは300ugのVEE−MAG25マー srRNAのワクチンブーストをプライムワクチン接種後の示した時間に筋肉内投与した。
PBMCを、プライムワクチン接種後の示した時間にLymphocyte Separation Medium(LSM,MP Biomedicals社)及びLeucoSep分離チューブ(Greiner Bio−One社)を使用して単離し、10%FBS及びペニシリン/ストレプトマイシンを含んだRPMIに再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。実験に用いたそれぞれのサルについて、ELISpotまたはフローサイトメトリー法を用いてT細胞応答を測定した。ワクチンにコードされた6種類の異なるアカゲザルMamu−A*01クラスIエピトープに対するT細胞応答を、ELISpot(ex vivo enzyme−linked immunospot)(エクスビボ酵素結合免疫スポット)分析を用いてIFN−γなどのサイトカインの誘導を測定することにより、PBMCから観測した。サルIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISpot分析を行った。200,000個のPBMCを、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次に、スポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入した。
この実験は、(a)同種のプライム/ブーストまたは異種のプライム/ブーストとしてのVEE−MAG25マー srRNAの30μg及び100μgの用量とChAdV68.5WTnt.MAG25マーとの組み合わせの免疫原性及び予備的安全性を評価し、(b)LNP2に対してLNP1を使用した脂質ナノ粒子中のVEE−MAG25マー srRNAの免疫応答を比較し、(c)VEE−MAG25マー srRNA及びChAdV68.5WTnt.MAG25マーによる免疫化に対するT細胞応答の速度論を評価するように設計した。
6種類の異なるMamu−A*01制限エピトープに対する末梢血単核細胞(PBMC)中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の1、2、3、4、5、6、8、9、及び10週後に測定した。表21に示すように、各動物に、4及び8週目に、LNP1またはLNP2のいずれかと製剤化した用量30μgまたは100μgのVEE−MAG25マー srRNAによるブースト免疫を行った。6種類のエピトープすべてに対する複合的な免疫応答を、それぞれの免疫モニタリング時点についてプロットした(図34A〜D及び表22〜25)。
この実験は、(a)同種のプライム/ブーストまたは異種のプライム/ブーストとしてのVEE−MAG25マー srRNAの300μgの用量とChAdV68.5WTnt.MAG25マーとの組み合わせの免疫原性を評価し、(b)用量300μgで、LNP2に対してLNP1を使用した脂質ナノ粒子中のVEE−MAG25マー srRNAの免疫応答を比較し、(c)VEE−MAG25マー srRNA及びChAdV68.5WTnt.MAG25マーによる免疫化に対するT細胞応答の速度論を評価するように設計した。
Mamu−A*01インドアカゲザルを、ChAdV68.5−WTnt.MAG25マーで免疫化した。6種類の異なるMamu−A*01制限エピトープに対する末梢血単核細胞(PBMC)中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23及び24週後に測定した(図35及び表27)。動物に、4、12、及び20週目にLNP2製剤を用いてVEE−MAG25マー srRNAによる免疫化を行った。最初のChAdV68.5WTnt.MAG25マーによる初期免疫化の4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24週後に、PBMC106個当たり1750、4225、1100、2529、3218、1915、1708、1561、5077、4543、4920、5820、3395、2728、1996、1465、4730、2984、2828、または3043SFC(6つのエピトープの合計)の複合的な抗原特異的免疫応答が観察された(図35)。VEE−MAG25マー srRNAによる2度目のブースト免疫化の1週後(13週目)に測定された免疫応答は、ブースト免疫化の直前(12週目)に測定された免疫応答よりも約3倍高かった。VEE−MAG25マー srRNAによる3度目のブースト免疫化の1週後(21週目)に測定された免疫応答は、2度目のブーストで観察された応答と同様、ブースト免疫化の直前(20週目)に測定された免疫応答よりも約3倍高かった。
本発明の一実現形態では、srRNAの用量範囲実験を、mamu A01インドアカゲザルで実施することによって、どのsrRNA用量をNHP免疫原性実験に進めるべきかを特定することができる。1つの例では、mamu A01インドアカゲザルに、複数のmamu A01制限エピトープを含むモデル抗原をコードしたsrRNAベクターを筋肉内注射により投与することができる。別の例では、抗CTLA−4モノクローナル抗体を、筋肉内ワクチン注射の部位の近位に皮下投与することで1つの動物群でワクチン流入領域のリンパ節をターゲティングすることができる。最初の免疫化後、2週間ごとにPBMCを採取して免疫モニタリングを行うことができる。各実験アームを下記に記載する(表30)。
本発明の一実施形態では、免疫原性を実証するためにmamu A01インドアカゲザルでワクチン実験を行うことができる。1つの例では、mamu A01インドアカゲザルに、複数のmamu A01制限エピトープを含むモデル抗原をコードしたChAdV及び/またはsrRNAベクターを筋肉内注射により投与することができる。別の例では、一部のグループに対して、抗CTLA−4モノクローナル抗体を、筋肉内ワクチン注射の部位の近位に皮下投与する。最初の免疫化後、2週間ごとにPBMCを採取して免疫モニタリングを行うことができる。各実験アームを下記に記載する(表31)。
T細胞は、患者の血液、リンパ節、または腫瘍から単離することができる。T細胞は、例えば、抗原−MHCテトラマー結合細胞を分取することにより、またはT細胞と抗原でパルスした抗原提示細胞とのインビトロ共培養物中で刺激した活性化された細胞を分取することにより、抗原特異的T細胞について濃縮することができる。抗原ロードテトラマー及び他のMHCベースの試薬をはじめとする、抗原特異的T細胞の同定のためのさまざまな試薬が当該技術分野で知られている。
1.本明細書では、新生抗原または複数の新生抗原を含むウイルスベクターを開示する。特定の実施形態では、例えば以下のような本明細書に開示される方法を用いて新生抗原が特定される。特定の実施形態では、新生抗原は、例えば以下のような本明細書に開示される少なくとも1つの特性または性質を有する。
前記対象の腫瘍細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられ、各新生抗原のペプチド配列が、前記ペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有する、工程と、
前記新生抗原のそれぞれが前記対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を1つ以上の提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、
選択された新生抗原のセットを生成するために、前記新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と、を含む方法を開示する。
MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
前記ペアの前記MHCアレルのうちの特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の尤度と、の間の依存性を表す。
前記1つ以上の提示モデルを、対応する新生抗原のペプチド配列に適用することによって、前記1つ以上のMHCアレルのそれぞれについて、前記対応する新生抗原のペプチド配列のアミノ酸の少なくとも位置に基づいて、前記MHCアレルが前記対応する新生抗原を提示するかどうかを示す依存性スコアを生成することを含む。
前記依存性スコアを変換することによって、各MHCアレルについて、前記対応するMHCアレルが前記対応する新生抗原を提示する尤度を示す対応するアレルごと尤度を生成することと、
前記アレルごと尤度を組み合わせて前記数値的尤度を生成することと、をさらに含む。
前記依存性スコアの組み合わせを変換して前記数値的尤度を生成することを含む。
前記アレル非相互作用特性に基づいて、対応する新生抗原のペプチド配列が提示されるかどうかを示す、前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアを生成するために、1つ以上の提示モデルのうちのアレル非相互作用モデルを前記アレル非相互作用特性に適用することを含む。
1つ以上のMHCアレルの各MHCアレルについての前記依存性スコアを、前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアと組み合わせることと、
前記対応するMHCアレルが前記対応する新生抗原を提示する尤度を示す、前記MHCアレルについての対応するアレルごと尤度を生成するために、各MHCアレルについての前記組み合わされた依存性スコアを変換することと、
前記アレルごと尤度を組み合わせて前記数値的尤度を生成することと、をさらに含む。
前記MHCアレルの各々についての依存性スコアと、前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアとの組み合わせを変換することにより、前記数値的尤度を生成することを含む。
前記試料中に存在する前記訓練ペプチドのセットのペプチド存在量;
前記試料中の前記訓練ペプチドのセットのペプチド長に関連するデータをさらに含む。
a.MHCアレルと新生抗原コード化ペプチドとが結合する予測親和性;
b.新生抗原コード化ペプチド−MHC複合体の予測安定性;
c.新生抗原コード化ペプチドの配列及び長さ;
d.質量分析プロテオミクスまたは他の手段によって評価される、特定のMHCアレルを発現する他の個体由来の細胞の類似した配列を有する新生抗原コード化ペプチドの提示の確率;
e.対象とされる対象の特定のMHCアレルの発現レベル(例えば、RNA−seqまたは質量分析によって測定される);
f.特定のMHCアレルを発現する他の別個の個体における、特定のMHCアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率;
g.他の別個の対象における、同じ分子のファミリー(例えば、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DQ、HLA−DR、HLA−DP)のMHCアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率。
a.その由来源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するC末端及びN末端配列;
b.任意で、腫瘍細胞内の対応するプロテアーゼの発現(RNA−seqまたは質量分析によって測定される)にしたがって重み付けされる、新生抗原コード化ペプチド内のプロテアーゼ切断モチーフの存在;
c.適切な細胞タイプにおいて測定される由来源タンパク質の代謝回転速度;
d.RNA−seqもしくはプロテオーム質量分析によって測定される、または、DNAもしくはRNA配列データにおいて検出される生殖細胞系列もしくは体細胞系列スプライシング変異のアノテーションから予測される、腫瘍細胞に最も高発現している特定のスプライス変異体(「アイソフォーム」)を任意で考慮した、由来源タンパク質の長さ;
e.腫瘍細胞におけるプロテアソーム、イムノプロテアソーム、胸腺プロテアソーム、または他のプロテアーゼの発現のレベル(RNA−seq、プロテオーム質量分析、または免疫組織化学によって測定することができる);
f.新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の発現(例えば、RNA−seqまたは質量分析によって測定される);
g.細胞周期の異なる段階における新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の典型的な組織特異的発現;
h.例えば、uniProtまたはPDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.doにみることができるような、由来源タンパク質及び/またはそのドメインの特性の包括的なカタログ;
i.ペプチドを含む由来源タンパク質のドメインの性質を説明する特性、例えば、二次構造または三次構造(例えば、βシートに対するαヘリックス);選択的スプライシング;
j.他の別個の対象における、対象とされる新生抗原コード化ペプチドの由来源タンパク質に由来するペプチドの提示の確率;
k.ペプチドが、技術的バイアスのために質量分析によって検出されないか、または過剰に表現される確率;
l.腫瘍細胞、間質、または腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の状態について情報を与える、RNASeqによって測定される、種々の遺伝子モジュール/経路の発現(ペプチドの由来源タンパク質を含む必要はない);
m.腫瘍細胞内の新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子のコピー数;
n.ペプチドがTAPに結合する確率、またはTAPに対するペプチドの測定または予測される結合親和性;
o.腫瘍細胞におけるTAPの発現レベル(RNA−seq、プロテオーム質量分析、免疫組織化学によって測定することができる);
p.以下を含むがただしこれらに限定されない、腫瘍変異の有無:
i.EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異、
ii.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOB、HLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)における変異;その提示が、腫瘍において機能喪失変異を生ずる抗原提示マシナリーの構成要素に依存するペプチドは、提示の確率が低い;
q.以下を含むがただしこれらに限定されない、機能的生殖細胞系列多型の有無:
i.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOB、HLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)における多型;
r.腫瘍タイプ(例えば、NSCLC、メラノーマ);
s.臨床的腫瘍サブタイプ(例えば、扁平上皮肺癌対非扁平上皮);
t.喫煙歴;
u.任意でドライバー変異によって層別化される、関連する腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドの由来源遺伝子の典型的な発現。
複数の試料に由来する主要組織適合性複合体(MHC)から溶出された複数の単離ペプチドに関連するデータを含む質量分析データを受け取る工程と、
前記試料中に存在する訓練ペプチド配列のセット及び各訓練ペプチド配列に関連する1つ以上のMHCを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程と、
前記訓練ペプチド配列を含む訓練データセットを用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、前記提示モデルが、腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される複数の数値的尤度を与える、工程と、を実行することを含む方法も開示される。
ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在と、
前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を有する前記ペプチド配列の、腫瘍細胞上のMHCアレルのうちの1つによる提示の尤度との間の依存性を表す。
前記試料中に存在する前記訓練ペプチドのセットのペプチド存在量;
前記試料中の前記訓練ペプチドのセットのペプチド長に関連するデータをさらに含む。
既知のタンパク質配列のセットを含むデータベースとのアラインメントにより訓練ペプチド配列のセットを比較することによって、前記訓練ペプチド配列に基づいて、前記訓練ペプチド配列よりも長くかつ前記訓練ペプチド配列を含む前記訓練タンパク質配列のセットを取得することを含む。
細胞株からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得するために、細胞株に対して質量分析を行うかまたは質量分析がこれまでに行われていることを含んでもよく、前記ヌクレオチドシークエンシングデータは、変異を含む少なくとも1つのタンパク質配列を含む。
ワン・ホット(one−hot)エンコーディングスキームを用いて前記訓練ペプチド配列をコードすることを含む。
正常組織試料からエクソーム、トランスクリプトーム、及び全ゲノムの正常ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得することと、
前記正常ヌクレオチドシークエンシングデータを用いて、前記提示モデルの前記パラメータのセットを訓練することと、を含む。
前記パラメータのセットのロジスティック回帰を行うことを含む。
レフトパディング(left−padded)ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて前記訓練ペプチド配列をコードすることを含む。
ディープラーニングアルゴリズムを用いて前記パラメータのセットについて値を決定することを含む。
複数の新鮮なまたは凍結腫瘍試料に由来する主要組織適合性複合体(MHC)から溶出された複数の単離ペプチドに関連するデータを含む質量分析データを受け取る工程と、
前記腫瘍試料中に存在し、各訓練ペプチド配列に関連する1つ以上のMHCアレル上に提示される訓練ペプチド配列のセットを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程と、
前記訓練ペプチド配列に基づいて、訓練タンパク質配列のセットを取得する工程と、
前記訓練タンパク質配列及び前記訓練ペプチド配列を用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、前記提示モデルが、腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される複数の数値的尤度を与える、工程と、を含む方法が開示される。
MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
前記ペアの前記MHCアレルのうちの特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の尤度と、の間の依存性を表す。
Claims (173)
- 新生抗原発現系を含む、新生抗原発現系を送達するための組成物であって、
前記新生抗原発現系が、1つ以上のベクターを含み、
前記1つ以上のベクターが、以下を含む、前記組成物:
(a)RNAアルファウイルス骨格であって、
(i)少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列と、
(ii)少なくとも1つのポリアデニル化(ポリ(A))配列と
を含む前記RNAアルファウイルス骨格;ならびに
(b)新生抗原カセットであって、
(i)対象内に存在する腫瘍に由来する、少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列であって、
(I)前記腫瘍に由来する、少なくとも1つの腫瘍特異的かつ対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列であって、
(A)コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有する、MHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
(B)任意で5’リンカー配列と、
(C)任意で3’リンカー配列と
を含む、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列と、
(ii)任意で、前記新生抗原コード核酸配列に機能的に連結された第2のプロモーターヌクレオチド配列と、
(iii)任意で、少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列と、
(iv)任意で、GPGPGアミノ酸リンカー配列(SEQ ID NO:56)をコードする少なくとも1つの核酸配列と、
(v)任意で、前記アルファウイルスに対して天然のポリ(A)配列または外来性のポリ(A)配列である少なくとも1つの第2のポリ(A)配列と
を含む、前記新生抗原カセット。 - 新生抗原発現系を含む、新生抗原発現系を送達するための組成物であって、
前記新生抗原発現系が、1つ以上のベクターを含み、
前記1つ以上のベクターが、以下を含む、前記組成物:
(a)RNAアルファウイルス骨格であって、前記RNAアルファウイルス骨格がSEQ ID NO:6に記載の核酸配列を含み、前記RNAアルファウイルス骨格の配列が26Sプロモーターヌクレオチド配列及びポリ(A)配列を含み、前記26Sプロモーター配列が前記RNAアルファウイルス骨格に対して内在性のものであり、前記ポリ(A)配列が前記RNAアルファウイルス骨格に対して内在性のものである、前記RNAアルファウイルス骨格;ならびに
(b)前記26Sプロモーターヌクレオチド配列と前記ポリ(A)配列との間に組み込まれた新生抗原カセットであって、
(i)対象内に存在する腫瘍に由来する、少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列であって、
(I)互いに直鎖状に連結された、少なくとも10個の腫瘍特異的かつ対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列であって、それぞれが、
(A)コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有し、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードする、MHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
(B)前記MHC Iエピトープの天然のN末端アミノ酸配列をコードし、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、5’リンカー配列と、
(C)前記MHC Iエピトープの天然のN末端アミノ酸配列をコードし、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、3’リンカー配列と
を含む、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列
を含み、
ここで、前記新生抗原カセットが前記26Sプロモーターヌクレオチド配列と機能的に連結され、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸13〜25個の長さのポリペプチドをコードし、各MHCクラスI新生抗原コード核酸配列の各3’末端が、前記新生抗原カセット内の最後のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を除いて、それに続くMHCクラスI新生抗原コード核酸配列の5’末端に連結されている、
前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列と、
(ii)少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列であって、
(I)PADRE MHCクラスII配列(SEQ ID NO:48)と、
(II)破傷風トキソイドMHCクラスII配列(SEQ ID NO:46)と、
(III)前記PADRE MHCクラスII配列と前記破傷風トキソイドMHCクラスII配列とを連結するGPGPGアミノ酸リンカー配列をコードする、第1の核酸配列と、
(IV)前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の5’末端と前記少なくとも20個の腫瘍特異的かつ対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列とを連結するGPGPGアミノ酸リンカー配列をコードする、第2の核酸配列と、
(V)任意で、前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の3’末端のGPGPGアミノ酸リンカー配列をコードする、第3の核酸配列と
を含む、前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列と
を含む、前記新生抗原カセット。 - 前記新生抗原カセットの各要素の順序付けられた配列が、5’から3’に向かって、
Pa−(L5b−Nc−L3d)X−(G5e−Uf)Y−G3g
を含む式で示され、
式中、Pは、前記第2のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここで、a=0または1であり、
Nは、前記MHCクラスIエピトープコード核酸配列のうちの1つを含み、ここで、c=1であり、
L5は、前記5’リンカー配列を含み、ここで、b=0または1であり、
L3は、前記3’リンカー配列を含み、ここで、d=0または1であり、
G5は、GPGPGアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここで、e=0または1であり、
G3は、GPGPGアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここで、g=0または1であり、
Uは、前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列のうちの1つを含み、ここで、f=1であり、
X=1〜400であり、ここで、各Xについて、対応するNcは、エピトープコード核酸配列であり、
Y=0、1、または2であり、ここで、各Yについて、対応するUfは、抗原コード核酸配列である、
請求項1に記載の組成物。 - 各Xについて、対応するNcが、異なるMHCクラスIエピトープコード核酸配列である、請求項3に記載の組成物。
- 各Yについて、対応するUfが、異なるMHCクラスII抗原コード核酸配列である、請求項3または4に記載の組成物。
- a=0、b=1、d=1、e=1、g=1、h=1、X=20、Y=2であり、
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記RNAアルファウイルス骨格によって与えられる単一の26Sプロモーターヌクレオチド配列であり、
前記少なくとも1つのポリアデニル化ポリ(A)配列が、前記RNAアルファウイルス骨格によって与えられる少なくとも100個の連続したAヌクレオチドのポリ(A)配列であり、
各Nが、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードし、
L5が、前記MHC Iエピトープの天然のN末端アミノ酸配列をコードする天然の5’リンカー配列であり、前記5’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、
L3が、前記MHC Iエピトープの天然の末端核酸配列をコードする天然の3’リンカー配列であり、前記3’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、
Uが、PADREクラスII配列及び破傷風トキソイドMHCクラスII配列のそれぞれであり、
前記RNAアルファウイルス骨格が、SEQ ID NO:6に記載の配列であり、
前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸13個〜25個の長さのポリペプチドをコードする、
請求項3〜5のいずれか1項に記載の組成物。 - ナノ粒子状の送達ビヒクルをさらに含む、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが、脂質ナノ粒子(LNP)である、請求項7に記載の組成物。
- 前記LNPが、イオン化可能なアミノ脂質を含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記イオン化可能なアミノ脂質が、MC3様(ジリノレイルメチル−4−ジメチルアミノブチレート)分子を含む、請求項9に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが新生抗原発現系を封入する、請求項7〜10のいずれか1項に記載の組成物。
- 複数のLNPをさらに含み、前記LNPが、
新生抗原発現系と、
カチオン性脂質と、
非カチオン性脂質と、
LNPの凝集を阻害する複合脂質と
を含み、前記複数のLNPのうち、少なくとも約95%のLNPが、
(a)非ラメラ形態を有するか、または、
(b)高電子密度である、
請求項8に記載の組成物。 - 前記非カチオン性脂質が、
(1)リン脂質、及び
(2)コレステロールまたはコレステロール誘導体
の混合物である、請求項12に記載の組成物。 - 前記LNPの凝集を阻害する複合脂質が、ポリエチレングリコール(PEG)−脂質複合体である、請求項12または13に記載の組成物。
- 前記PEG−脂質複合体が、PEG−ジアシルグリセロール(PEG−DAG)複合体、PEG−ジアルキルオキシプロピル(PEG−DAA)複合体、PEG−リン脂質複合体、PEG−セラミド(PEG−Cer)複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項14に記載の組成物。
- 前記PEG−DAA複合体が、PEG−ジデシルオキシプロピル(C10)複合体、PEG−ジラウリルオキシプロピル(C12)複合体、PEG−ジミリスチルオキシプロピル(C14)複合体、PEG−ジパルミチルオキシプロピル(C16)複合体、PEG−ジステアリルオキシプロピル(C18)複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである、請求項15に記載の組成物。
- 前記LNPの非ラメラ形態が、逆六方晶(HII)または立方晶相構造を含む、請求項12〜16のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約10mol%〜約50mol%を構成する、請求項12〜17のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約20mol%〜約50mol%を構成する、請求項12〜17のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約20mol%〜約40mol%を構成する、請求項12〜17のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記非カチオン性脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約10mol%〜約60mol%を構成する、請求項12〜20のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記非カチオン性脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約20mol%〜約55mol%を構成する、請求項12〜20のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記非カチオン性脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約25mol%〜約50mol%を構成する、請求項12〜20のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記複合脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約0.5mol%〜約20mol%を構成する、請求項12〜23のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記複合脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約2mol%〜約20mol%を構成する、請求項12〜23のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記複合脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の約1.5mol%〜約18mol%を構成する、請求項12〜23のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記LNPの95%超が非ラメラ形態を有する、請求項12〜26のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記LNPの95%超が高電子密度である、請求項12〜27のいずれか1項に記載の組成物。
- 複数のLNPをさらに含み、前記LNPが、
前記LNP中に存在する全脂質の50mol%〜65mol%を構成するカチオン性脂質と、
前記LNP中に存在する全脂質の0.5mol%〜2mol%を構成する、LNPの凝集を阻害する複合脂質と、
(a)リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、前記リン脂質が前記LNP中に存在する全脂質の4mol%〜10mol%を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記LNP中に存在する全脂質の30mol%〜40mol%を構成する、前記混合物、
(b)リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、前記リン脂質が前記LNP中に存在する全脂質の3mol%〜15mol%を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記LNP中に存在する全脂質の30mol%〜40mol%を構成する、前記混合物、または、
(c)前記LNP中に存在する全脂質の49.5mol%以下であり、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含み、前記コレステロールまたはその誘導体が、前記LNP中に存在する全脂質の30mol%から40mol%を構成するもの
のいずれかを含む、非カチオン性脂質と
を含む、請求項8〜28のいずれか1項に記載の組成物。 - 複数のLNPをさらに含み、前記LNPが、
前記LNP中に存在する全脂質の50mol%〜85mol%を構成するカチオン性脂質と、
前記LNP中に存在する全脂質の0.5mol%〜2mol%を構成する、LNPの凝集を阻害する複合脂質と、
前記LNP中に存在する全脂質の13mol%〜49.5mol%を構成する非カチオン性脂質と
を含む、請求項8〜28のいずれか1項に記載の組成物。 - 前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、またはこれらの混合物を含む、請求項29に記載の組成物。
- 前記複合脂質が、ポリエチレングリコール(PEG)−脂質複合体を含む、請求項29または30に記載の組成物。
- 前記PEG−脂質複合体が、PEG−ジアシルグリセロール(PEG−DAG)複合体、PEG−ジアルキルオキシプロピル(PEG−DAA)複合体、またはこれらの混合物を含む、請求項32に記載の組成物。
- 前記PEG−DAA複合体が、PEG−ジミリスチルオキシプロピル(PEG−DMA)複合体、PEG−ジステアリルオキシプロピル(PEG−DSA)複合体、またはこれらの混合物を含む、請求項33に記載の組成物。
- 前記複合体のPEG部分が、約2000ダルトンの平均分子量を有する、請求項32〜34のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記複合脂質が、前記LNP中に存在する全脂質の1mol%〜2mol%を構成する、請求項29〜35のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記LNPが、式Iの構造を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む、請求項8〜36のいずれか1項に記載の組成物:
式中、
L1及びL2は、それぞれ独立して、−O(C=O)−、−(C=O)O−、−C(=O)−、−O−、−S(O)x−、−S−S−、−C(=O)S−、−SC(=O)−、−RaC(=O)−、−C(=O)Ra−、−RaC(=O)Ra−、−OC(=O)Ra−、−RaC(=O)O−、または直接的結合であり、
G1は、Ci〜C2アルキレン、−(C=O)−、−O(C=O)−、−SC(=O)−、−RaC(=O)−、または直接的結合であり、
−C(=O)−、−(C=O)O−、−C(=O)S−、−C(=O)Ra−、または直接的結合であり、
Gは、Ci〜C6アルキレンであり、
Raは、HまたはC1〜C12アルキルであり、
R1a及びR1bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R1aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R1bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR1b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R2a及びR2bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R2aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R2bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR2b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R3a及びR3bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R3aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R3bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R4a及びR4bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R4aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R4bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR4b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R5及びR6は、それぞれ独立してHまたはメチルであり、
R7は、C4〜C20アルキルであり、
R8及びR9は、それぞれ独立してC1〜C12アルキルであるか、またはR8及びR9は、それらが結合する窒素原子と共に、5、6、または7員の複素環を形成し、
a、b、c、及びdは、それぞれ独立して1〜24の整数であり、xは0、1、または2である。 - 前記LNPが、式IIの構造を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む、請求項8〜36のいずれか1項に記載の組成物:
式中、
L1及びL2は、それぞれ独立して−O(C=O)−、−(C=O)O−、または炭素−炭素二重結合であり、
R1a及びR1bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R1aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R1bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR1b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R2a及びR2bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R2aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R2bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR2b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R3a及びR3bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R3aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R3bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR3b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R4a及びR4bは、各出現時に、独立して、(a)HもしくはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R4aは、HもしくはC1〜C12アルキルであり、R4bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR4b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、
R5及びR6は、それぞれ独立してメチルまたはシクロアルキルであり、
R7は、各出現時に、独立してHまたはC1〜C12アルキルであり、
R8及びR9は、それぞれ独立して、非置換のC1〜C12アルキルであるか、またはR8及びR9は、それらが結合する窒素原子と共に、1個の窒素原子を含む5、6、または7員の複素環を形成し、
a及びdは、それぞれ独立して0〜24の整数であり、b及びcはそれぞれ独立して1〜24の整数であり、eは1または2であり、
ただし、
R1a、R2a、R3a、もしくはR4aのうちの少なくとも1つが、C1〜C12アルキルであるか、またはL1もしくはL2の少なくとも一方が、−O(C=O)−または−(C=O)O−であり、
R1a及びR1bは、aが6である場合にはイソプロピルでなく、aが8である場合にはn−ブチルでない。 - 中性脂質、ステロイド、及びポリマーコンジュゲート脂質を含む1つ以上の賦形剤をさらに含む、請求項37または39に記載の組成物。
- 前記中性脂質が、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DSPC)、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DPPC)、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DMPC)、1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(POPC)、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DOPC)、及び 1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE)のうちの少なくとも1つを含む、請求項39に記載の組成物。
- 前記中性脂質がDSPCである、請求項40に記載の組成物。
- 前記化合物と前記中性脂質とのモル比が、約2:1〜約8:1の範囲である、請求項39〜41のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ステロイドがコレステロールである、請求項39〜42のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記化合物と前記コレステロールとのモル比が、約2:1〜1:1の範囲である、請求項43に記載の組成物。
- 前記ポリマーコンジュゲート脂質がPEG化脂質である、請求項39〜44のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記化合物と前記PEG化脂質とのモル比が、約100:1〜約25:1の範囲である、請求項45に記載の組成物。
- 前記PEG化脂質が、PEG−DAG、PEGポリエチレン(PEG−PE)、PEG−スクシノイル−ジアシルグリセロール(PEG−S−DAG)、PEG−cer、またはPEGジアルキオキシプロピルカルバメートである、請求項45または46に記載の組成物。
- R10及びR11が、それぞれ独立して、12〜16個の炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル鎖である、請求項48に記載の組成物。
- 前記平均zが、約45である、請求項48または49に記載の組成物。
- 前記LNPが、ポリアニオン性の核酸と混合される際に非二重層構造に自己組織化する、請求項8〜50のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記非二重層構造が、60nm〜120nmの直径を有する、請求項51に記載の組成物。
- 前記非二重層構造が、約70nm、約80nm、約90nm、または約100nmの直径を有する、請求項51に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが、約100nmの直径を有する、請求項7〜53のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記新生抗原カセットが、前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列と前記少なくとも1つのポリ(A)配列との間に組み込まれている、請求項1、3〜5、または7〜54のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記新生抗原コード核酸配列と機能的に連結されている、請求項1、3〜5、または7〜55のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のベクターが、1つ以上の+鎖RNAベクターを含む、請求項1、3〜5、または7〜56のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上の+鎖RNAベクターが、5’7−メチルグアノシン(m7g)キャップを含む、請求項57に記載の組成物。
- 前記1つ以上の+鎖RNAベクターが、インビトロ転写によって生成される、請求項57または58に記載の組成物。
- 前記1つ以上のベクターが、哺乳動物細胞内で自己複製する、請求項1、3〜5、または7〜59のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記RNAアルファウイルス骨格が、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、請求項1、3〜5、または7〜60のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記RNAアルファウイルス骨格が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、請求項1、3〜5、または7〜60のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記RNAアルファウイルス骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、26Sプロモーター配列、ポリ(A)配列、非構造タンパク質1(nsP1)遺伝子、nsP2遺伝子、nsP3遺伝子、及びnsP4遺伝子を含む、請求項61または62に記載の組成物。
- 前記RNAアルファウイルス骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、26Sプロモーター配列、及びポリ(A)配列を含む、請求項61または62に記載の組成物。
- 前記非構造タンパク質媒介増幅のための配列が、アルファウイルス5’ UTR、51ntのCSE、24ntのCSE、26Sサブゲノミックプロモーター配列、19ntのCSE、アルファウイルス3’ UTR、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項63または64に記載の組成物。
- 前記RNAアルファウイルス骨格が構造ビリオンタンパク質カプシドE2及びE1をコードしていない、請求項63〜65のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記新生抗原カセットが、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内の構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入されている、請求項66に記載の組成物。
- 前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:5に記載の配列を含む、請求項61または62に記載の組成物。
- 前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、塩基対7544と11175との間の欠失をさらに含むSEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:5の配列を含む、請求項61または62に記載のの組成物。
- 前記RNAアルファウイルス骨格が、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:7に記載の配列を含む、請求項69に記載の組成物。
- 前記新生抗原カセットが、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:5の配列に記載される塩基対7544と11175との間の前記欠失を置換するように7544位に挿入されている、請求項69または70に記載の組成物。
- 前記新生抗原カセットの挿入が、nsP1〜4遺伝子及び少なくとも1つの抗原コード核酸配列を含むポリシストロニックRNAの転写をもたらし、前記nsP1〜4遺伝子及び前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が別々のオープンリーディングフレーム内にある、請求項67〜71のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記RNAアルファウイルス骨格によってコードされた天然の26Sプロモーターヌクレオチド配列である、請求項1、3〜5、または7〜72のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、外来性のRNAプロモーターである、請求項1、3〜5、または7〜72のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が、26Sプロモーターヌクレオチド配列である、請求項1、3〜5、または7〜74のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が複数の26Sプロモーターヌクレオチド配列を含み、各26Sプロモーターヌクレオチド配列が、前記別々のオープンリーディングフレームのうちの1つ以上の転写をもたらす、請求項1、3〜5、または7〜74のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のベクターが、それぞれ少なくとも300ntのサイズである、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のベクターが、それぞれ少なくとも1kbのサイズである、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のベクターが、それぞれ2kbのサイズである、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のベクターが、それぞれ5kb未満のサイズである、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、腫瘍細胞上のMHCクラスIによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 各抗原コード核酸配列が互いに直接連結されている、請求項1、3〜5、または7〜81のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、リンカーをコードする核酸配列によって異なる抗原コード核酸配列と連結されている、請求項1、3〜5、または7〜82のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記リンカーが、2個のMHCクラスI配列または1個のMHCクラスI配列を1個のMHCクラスII配列と連結する、請求項83に記載の組成物。
- 前記リンカーが、
(1)少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したグリシン残基、
(2)少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したアラニン残基、
(3)2個のアルギニン残基(RR)、
(4)アラニン、アラニン、チロシン(AAY)、
(5)哺乳動物プロテアソームによって効率的にプロセシングされる、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さのコンセンサス配列、及び
(6)元のタンパク質と同種のタンパク質に由来する抗原に隣接し、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、または2〜20個の長さの1つ以上の天然配列
からなる群から選択される、請求項84に記載の組成物。 - 前記リンカーが、2個のMHCクラスII配列または1個のMHCクラスII配列を1個のMHCクラスI配列と連結する、請求項83に記載の組成物。
- 前記リンカーが、配列GPGPGを含む、請求項86に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つの配列が、
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセシング及び提示、ならびに/または免疫原性を高める、分離したまたは連続的な配列
に機能的または直接的に連結されている、請求項1、3〜5、または7〜87のいずれか1項に記載の組成物。 - 前記分離したまたは連続的な配列が、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変されたユビキチン配列(例えば、76位にGlyからAlaへの置換を含むユビキチン配列)、免疫グロブリンシグナル配列(例えばIgK)、主要組織適合性クラスI配列、リソソーム関連膜タンパク質(LAMP)−1、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスII配列のうちの少なくとも1つを含み、任意でプロテアソームターゲティング性を高めるように改変された前記ユビキチン配列がA76である、請求項88に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレルに対する増大した結合親和性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列の少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレルに対する増大した結合安定性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレル上への増大した提示の尤度を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの変化が、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、またはプロテアソームにより生成されたスプライスされた抗原を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記腫瘍が、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、T細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列が、少なくとも2〜10個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の核酸配列を含む、請求項1、3〜5、または7〜94のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列が、少なくとも11〜20個、15〜20個、11〜100個、11〜200個、11〜300個、11〜400個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、または最大で400個の核酸配列を含む、請求項1、3〜5、または7〜94のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列が少なくとも2〜400個の核酸配列を含み、前記新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも2個が、腫瘍細胞表面上のMHCクラスIによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、請求項1、3〜5、または7〜94のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも2つが、腫瘍細胞表面上のMHCクラスIによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、請求項2または6に記載の組成物。
- 対象に投与されて翻訳された場合、前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列によってコードされた新生抗原のうちの少なくとも1つが抗原提示細胞上に提示され、腫瘍細胞表面上の新生抗原の少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらす、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列が、対象に投与されて翻訳された場合、MHCクラスIまたはクラスII新生抗原のうちの少なくとも1つが抗原提示細胞上に提示され、腫瘍細胞表面上の新生抗原の少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらし、任意で、前記少なくとも1つの新生抗原コード核酸配列のそれぞれの発現が、前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列によって誘導される、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 各MHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、アミノ酸8〜35個の長さ、任意で、アミノ酸9〜17個、9〜25個、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35個のポリペプチド配列をコードする、請求項1、3〜5、または7〜100のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在する、請求項1、3〜5、または7〜101のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在し、かつ、前記コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を含む少なくとも1つのMHCクラスII新生抗原コード核酸配列を含む、請求項1、3〜5、または7〜101のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が、アミノ酸12〜20個、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、または20〜40個の長さである、請求項1、3〜5、または7〜103のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在し、かつ、少なくとも1つのユニバーサルMHCクラスII抗原コード核酸配列を含み、任意で、前記少なくとも1つのユニバーサル配列が、破傷風トキソイド及びPADREの少なくとも一方を含む、請求項1、3〜5、または7〜104のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が誘導性である、請求項1、3〜5、または7〜105のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が非誘導性である、請求項1、3〜5、または7〜105のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのポリ(A)配列が、前記アルファウイルスに天然に存在するポリ(A)配列を含む、請求項1、3〜5、または7〜107のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのポリ(A)配列が、前記アルファウイルスに対して外来性のポリ(A)配列を含む、請求項1、3〜5、または7〜107のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのポリ(A)配列が、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つと機能的に連結されている、請求項1、3〜5、または7〜109のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのポリ(A)配列が、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、または少なくとも90個の連続したAヌクレオチドである、請求項1、3〜5、または7〜110のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのポリ(A)配列が、少なくとも100個の連続したAヌクレオチドである、請求項1、3〜5、または7〜110のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記新生抗原カセットが、
イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子(WPRE)配列、内部リボソーム進入配列(IRES)配列、2A自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結された、mRNAの核輸送、安定性、もしくは翻訳効率を向上させることが知られている5’もしくは3’末端非コード領域内の配列
のうちの少なくとも1つをさらに含む、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。 - 前記新生抗原カセットが、緑色蛍光タンパク質(GFP)、GFP変異体、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ変異体、または検出可能なペプチドもしくはエピトープを含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記検出可能なペプチドまたはエピトープが、HAタグ、Flagタグ、Hisタグ、またはV5タグからなる群から選択される、請求項114に記載の組成物。
- 前記1つ以上のベクターが、少なくとも1つの免疫調節物質をコードする1つ以上の核酸配列をさらに含む、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項116に記載の組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、一本鎖Fv(scFv)、単一特異的もしくは互いに連結された多重特異性の単一ドメイン抗体(sdAb)(例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン)、または完全長の一本鎖抗体(例えば、フレキシブルリンカーによって重鎖と軽鎖が連結された完全長IgG)である、請求項117に記載の組成物。
- 前記抗体の重鎖配列と軽鎖配列が、2Aなどの自己切断配列もしくはIRESによって分けられた連続的配列であるか、または前記抗体の重鎖配列と軽鎖配列が、連続したグリシン残基などのフレキシブルリンカーによって連結されている、請求項117または118に記載の組成物。
- 前記免疫調節物質がサイトカインである、請求項116に記載の組成物。
- 前記サイトカインが、IL−2、IL−7、IL−12、IL−15、もしくはIL−21、またはそれぞれのその変異体のうちの1つである、請求項120に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのMHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、
(a)腫瘍から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、工程と、
(b)新生抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のMHCアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、
(c)新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択することにより、前記少なくとも1つのMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成する工程と
を行うことによって選択される、請求項1、3〜5、または7〜121のいずれか1項に記載の組成物。 - 前記MHCクラスIエピトープコード核酸配列のそれぞれが、
(a)腫瘍から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、工程と、
(b)新生抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のMHCアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、
(c)前記少なくとも20個のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成するために、新生抗原のセットのサブセットを、数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と
を行うことによって選択される、請求項2または6に記載の組成物。 - 前記選択された新生抗原のセットの数が、2〜20である、請求項122に記載の組成物。
- 前記提示モデルが、
(a)前記MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
(b)前記ペアの前記MHCアレルのうちの前記特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の尤度と
の間の依存性を表す、請求項122〜124のいずれか1項に記載の組成物。 - 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原を選択することを含む、請求項122〜125のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて前記対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含む、請求項122〜126のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)によってナイーブT細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含み、任意で、前記APCが樹状細胞(DC)である、請求項122〜127のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している新生抗原を選択することを含む、請求項122〜128のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて前記対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原を選択することを含む、請求項122〜129のいずれか1項に記載の組成物。
- エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータが、腫瘍組織でシークエンシングを行うことによって取得される、請求項122〜130のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記シークエンシングが、次世代シークエンシング(NGS)または任意の大規模並列処理シークエンシングアプローチである、請求項131に記載の組成物。
- 前記新生抗原カセットが、前記新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 少なくとも1つの、または各ジャンクショナルエピトープ配列が、MHCに対して500nMよりも高い親和性を有する、請求項133に記載の組成物。
- 各ジャンクショナルエピトープ配列が非自己である、請求項133または134に記載の組成物。
- 前記新生抗原カセットが、翻訳後の野生型核酸配列を含む非治療的MHCクラスIまたはクラスIIエピトープ核酸配列をコードしておらず、前記非治療的エピトープが前記対象のMHCアレル上に提示されると予測される、先行請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記非治療的な予測されたMHCクラスIまたはクラスIIエピトープ配列が、前記新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列である、請求項136に記載の組成物。
- 前記予測が、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づいたものである、請求項133〜137のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記新生抗原カセット内における少なくとも1つの抗原コード核酸配列の順序が、
(a)前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の異なる順序に対応した候補新生抗原カセット配列のセットを生成する工程、
(b)前記各候補新生抗原カセット配列について、前記候補新生抗原カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定する工程、及び
(c)所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、新生抗原ワクチン用の新生抗原カセット配列として選択する工程
を含む一連の工程によって決定される、請求項133〜138のいずれか1項に記載の組成物。 - 先行請求項のいずれか1項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項140に記載の組成物。
- 免疫調節物質をさらに含む、請求項140または141に記載の医薬組成物。
- 前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項142に記載の医薬組成物。
- 先行の組成物の請求項のいずれか1項に記載の新生抗原カセットと、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:5の配列から得られる1つ以上の要素とを含む、単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットであって、任意で、前記1つ以上の要素が、非構造タンパク質媒介増幅に必要な配列、26Sプロモーターヌクレオチド配列、ポリ(A)配列、及びSEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:5に記載の配列のnsP1〜4遺伝子からなる群から選択され、任意で、前記ヌクレオチド配列がcDNAである、前記単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセット。
- 前記配列または単離ヌクレオチド配列のセットが、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:7に記載の配列の7544位に挿入された先行の組成物の請求項のいずれか1項に記載の新生抗原カセットを含む、請求項144に記載の単離ヌクレオチド配列。
- SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:5の配列から得られた前記1つ以上の要素の5’側に位置するT7またはSP6 RNAポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列と、
任意で、前記ポリ(A)配列の3’側に位置する1つ以上の制限部位と
をさらに含む、請求項144または145に記載の単離ヌクレオチド配列。 - 先行の組成物の請求項のいずれか1項に記載の新生抗原カセットが、SEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:9の7563位に挿入されている、請求項144に記載の単離ヌクレオチド配列。
- 請求項144〜147のいずれか1項に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクターまたはベクターのセット。
- 請求項144〜148のいずれか1項に記載のヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットを含む単離細胞であって、任意で、前記細胞が、BHK−21、CHO、HEK293もしくはその変異体、911、HeLa、A549、LP−293、PER.C6、またはAE1−2a細胞である、前記単離細胞。
- 先行の組成物の請求項のいずれか1項に記載の組成物と、使用説明書とを含む、キット。
- がんを有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、先行の組成物の請求項のいずれか1項に記載の組成物、または請求項140〜143のいずれか1項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
- 腫瘍に由来する少なくとも1つのMHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の腫瘍に由来する、請求項151に記載の方法。
- 少なくとも1つのMHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の腫瘍に由来しない、請求項151に記載の方法。
- 対象に免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に、先行の組成物の請求項のいずれか1項に記載の組成物、または請求項140〜143のいずれか1項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
- 前記組成物が、筋肉内(IM)、皮内(ID)、皮下(SC)、または静脈内(IV)投与される、請求項151〜154のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組成物が筋肉内投与される、請求項151〜154のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の免疫調節物質の投与をさらに含み、任意で、前記免疫調節物質が前記組成物または医薬組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与される、請求項151〜156のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つ以上の免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項157に記載の方法。
- 前記免疫調節物質が、静脈内(IV)、筋肉内(IM)、皮内(ID)、または皮下(SC)投与される、請求項157または158に記載の方法。
- 前記皮下投与が、前記組成物または医薬組成物の投与部位の近くに、または1つ以上のベクターもしくは組成物の流入領域リンパ節に近接して行われる、請求項159に記載の方法。
- 前記対象に第2のワクチン組成物を投与することをさらに含む、請求項151〜160のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2のワクチン組成物が、請求項151〜160のいずれか1項に記載の組成物または医薬組成物の投与の前に投与される、請求項161に記載の方法。
- 前記第2のワクチン組成物が、請求項151〜160のいずれか1項に記載の組成物または医薬組成物の投与の後に投与される、請求項161に記載の方法。
- 前記第2のワクチン組成物が、請求項151〜160のいずれか1項に記載の組成物または医薬組成物と同じである、請求項162または163に記載の方法。
- 前記第2のワクチン組成物が、請求項151〜160のいずれか1項に記載の組成物または医薬組成物と異なる、請求項162または163に記載の方法。
- 前記第2のワクチン組成物が、少なくとも1つの抗原コード核酸配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターを含む、請求項165に記載の方法。
- 前記チンパンジーアデノウイルスベクターによってコードされる前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、先行の組成物の請求項のいずれか1項に記載の少なくとも1つの抗原コード核酸配列と同じである、請求項166に記載の方法。
- 先行の組成物の請求項のいずれか1項に記載の1つ以上のベクターを製造する方法であって、
(a)前記RNAアルファウイルス骨格及び前記新生抗原カセットを含む直線化DNA配列を得ることと、
(b)前記直線化DNA配列を、前記直線化DNA配列をRNAに転写するために必要なすべての構成要素を含んだインビトロ転写反応に加えることにより、前記直線化DNA配列をインビトロ転写することであって、任意で、得られたRNAに前記m7gキャップをインビトロで加えることをさらに含む、前記インビトロ転写することと、
(c)前記インビトロ転写反応から前記1つ以上のベクターを単離することと
を含む、前記方法。 - 前記直線化DNA配列が、DNAプラスミド配列を直線化することにより、またはPCRを用いた増幅により生成される、請求項168に記載の製造する方法。
- 前記DNAプラスミド配列が、細菌組換えまたは全ゲノムDNA合成または細菌細胞内での合成DNAの増幅を伴う全ゲノムDNA合成のうちの1つを用いて生成される、請求項169に記載の製造方法。
- 前記1つ以上のベクターを前記インビトロ転写反応から単離することが、フェノールクロロホルム抽出、シリカカラムを用いた精製、または同様のRNA精製法のうちの1つ以上を含む、請求項168に記載の製造する方法。
- 前記新生抗原発現系を送達するための先行の組成物の請求項のいずれか1項に記載の組成物を製造する方法であって、
(a)ナノ粒子状の送達ビヒクルの成分を提供することと、
(b)前記新生抗原発現系を提供することと、
(c)前記ナノ粒子状の送達ビヒクル及び前記新生抗原発現系が前記新生抗原発現系を送達するための前記組成物を生成するのに充分な条件を提供することと
を含む、前記方法。 - 前記条件がマイクロ流体混合によって提供される、請求項172に記載の製造する方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2023108263A JP2023123766A (ja) | 2017-05-08 | 2023-06-30 | アルファウイルス新生抗原ベクター |
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762503283P | 2017-05-08 | 2017-05-08 | |
US62/503,283 | 2017-05-08 | ||
US201762523201P | 2017-06-21 | 2017-06-21 | |
US62/523,201 | 2017-06-21 | ||
US201762590163P | 2017-11-22 | 2017-11-22 | |
US62/590,163 | 2017-11-22 | ||
PCT/US2018/031696 WO2018208856A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-05-08 | Alphavirus neoantigen vectors |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023108263A Division JP2023123766A (ja) | 2017-05-08 | 2023-06-30 | アルファウイルス新生抗原ベクター |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020518648A true JP2020518648A (ja) | 2020-06-25 |
Family
ID=64105513
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019561211A Pending JP2020518648A (ja) | 2017-05-08 | 2018-05-08 | アルファウイルス新生抗原ベクター |
JP2023108263A Pending JP2023123766A (ja) | 2017-05-08 | 2023-06-30 | アルファウイルス新生抗原ベクター |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023108263A Pending JP2023123766A (ja) | 2017-05-08 | 2023-06-30 | アルファウイルス新生抗原ベクター |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US11504421B2 (ja) |
EP (1) | EP3634449A4 (ja) |
JP (2) | JP2020518648A (ja) |
KR (1) | KR20200003390A (ja) |
CN (1) | CN110612116A (ja) |
AU (2) | AU2018266705B2 (ja) |
BR (1) | BR112019023477A2 (ja) |
CA (1) | CA3062591A1 (ja) |
CO (1) | CO2019013609A2 (ja) |
MX (1) | MX2019013259A (ja) |
PE (1) | PE20191842A1 (ja) |
PH (1) | PH12019502518A1 (ja) |
SG (1) | SG11201910101SA (ja) |
TW (2) | TW202333779A (ja) |
WO (1) | WO2018208856A1 (ja) |
ZA (1) | ZA201907461B (ja) |
Families Citing this family (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3044840A1 (en) * | 2016-11-23 | 2018-05-31 | Gritstone Oncology, Inc. | Viral delivery of neoantigens |
JP7370861B2 (ja) | 2017-02-12 | 2023-10-30 | ビオンテック ユーエス インコーポレイテッド | Hlaに基づく方法および組成物ならびにそれらの使用 |
TW202333779A (zh) | 2017-05-08 | 2023-09-01 | 美商磨石生物公司 | 阿爾法病毒新抗原載體 |
GB201812474D0 (en) | 2018-07-31 | 2018-09-12 | Autolus Ltd | Nucleic acid construct |
CN109536464B (zh) * | 2018-12-10 | 2022-06-10 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种缺失衣壳蛋白基因的基孔肯雅病毒感染性克隆及构建方法和在制备减毒疫苗中的应用 |
MX2021006925A (es) * | 2018-12-14 | 2021-07-07 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Composiciones y metodos heterologos de vacunacion con refuerzo inductor. |
TW202043256A (zh) | 2019-01-10 | 2020-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 前列腺新抗原及其用途 |
BR122024002387A2 (pt) | 2019-05-30 | 2024-03-12 | Gritstone Bio, Inc. | Vetores de adenovírus, composição farmacêutica, sequência de nucleotídeo isolada, célula isolada, vetor, kit, usos de um vetor, método para fabricar o vetor, métodos para produzir um vírus e vetor viral |
JP2022536695A (ja) * | 2019-06-12 | 2022-08-18 | ビオンテック ユーエス インコーポレイテッド | 新抗原組成物およびその使用 |
EP3993829A4 (en) * | 2019-07-02 | 2024-01-03 | Gritstone bio, Inc. | HIV ANTIGENS AND MHC COMPLEXES |
CA3145791A1 (en) | 2019-07-16 | 2021-01-21 | Gilead Sciences, Inc. | Hiv vaccines and methods of making and using |
CN110515301B (zh) * | 2019-08-06 | 2021-06-08 | 大连理工大学 | 一种结合dmpc的改进的admm算法 |
KR20220044212A (ko) | 2019-08-09 | 2022-04-06 | 넛크래커 테라퓨틱스 인코포레이티드 | 미세유체 장치 및 이의 사용 방법 |
EP4125973A4 (en) * | 2019-11-04 | 2024-03-13 | Gritstone bio, Inc. | NEOANTIGEN VACCINE THERAPY |
PE20221182A1 (es) | 2019-11-18 | 2022-08-05 | Janssen Biotech Inc | Vacunas basadas en calr y jak2 mutantes y sus usos |
EP4117725A4 (en) | 2020-03-09 | 2024-05-29 | Arcturus Therapeutics, Inc. | CORONAVIRUS VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS |
CN115942942A (zh) * | 2020-04-03 | 2023-04-07 | 磨石生物公司 | 感染性疾病抗原和疫苗 |
WO2022032196A2 (en) * | 2020-08-06 | 2022-02-10 | Gritstone Bio, Inc. | Multiepitope vaccine cassettes |
CN114438128A (zh) * | 2020-10-30 | 2022-05-06 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种增强型溶瘤腺病毒及其应用 |
JP2023553343A (ja) | 2020-11-25 | 2023-12-21 | アカゲラ・メディスンズ,インコーポレイテッド | 核酸を送達するための脂質ナノ粒子および関連する使用方法 |
US20220194999A1 (en) * | 2020-12-23 | 2022-06-23 | Janssen Biotech, Inc. | Neoantigen Peptide Mimics |
CN112553232B (zh) * | 2020-12-29 | 2022-10-21 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 多功能自组装纳米颗粒的可控生物合成方法 |
JP2024503108A (ja) * | 2021-01-19 | 2024-01-24 | グリットストーン バイオ インコーポレイテッド | 改良型アルファウイルスベクター |
CA3211496A1 (en) | 2021-03-19 | 2022-09-22 | Tiba Biotech Llc | Artificial alphavirus-derived rna replicon expression systems |
WO2022229966A1 (en) | 2021-04-29 | 2022-11-03 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | T cell receptors directed against ras-derived recurrent neoantigens and methods of identifying same |
CN113517030B (zh) * | 2021-07-19 | 2022-09-20 | 中国人民解放军国防科技大学 | 基于病毒传播网络的基因序列表示学习方法 |
EP4373852A1 (en) * | 2021-07-22 | 2024-05-29 | The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Navy | Single domain antibodies that bind and neutralize venezuelan equine encephalitis virus |
WO2023172633A1 (en) * | 2022-03-08 | 2023-09-14 | Avalo, Inc. | System and method for genomic association |
WO2023183827A2 (en) * | 2022-03-21 | 2023-09-28 | Gritstone Bio, Inc. | Low-dose neoantigen vaccine therapy |
WO2024026274A2 (en) * | 2022-07-26 | 2024-02-01 | Yale University | Virus-like vesicles (vlvs) based vaccines and methods of preventing, ameliorating, and/or treating covid-19 and/or hepatocellular carcinoma (hcc) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100041737A1 (en) * | 2005-05-27 | 2010-02-18 | Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor | Gene Vector |
Family Cites Families (207)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4235871A (en) | 1978-02-24 | 1980-11-25 | Papahadjopoulos Demetrios P | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles |
US4722848A (en) | 1982-12-08 | 1988-02-02 | Health Research, Incorporated | Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus |
US4501728A (en) | 1983-01-06 | 1985-02-26 | Technology Unlimited, Inc. | Masking of liposomes from RES recognition |
GB8311018D0 (en) | 1983-04-22 | 1983-05-25 | Amersham Int Plc | Detecting mutations in dna |
US6090406A (en) | 1984-04-12 | 2000-07-18 | The Liposome Company, Inc. | Potentiation of immune responses with liposomal adjuvants |
US5019369A (en) | 1984-10-22 | 1991-05-28 | Vestar, Inc. | Method of targeting tumors in humans |
US4837028A (en) | 1986-12-24 | 1989-06-06 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5223427A (en) | 1987-03-31 | 1993-06-29 | The Scripps Research Institute | Hybridomas producing monoclonal antibodies reactive with human tissue-factor glycoprotein heavy chain |
US5217879A (en) | 1989-01-12 | 1993-06-08 | Washington University | Infectious Sindbis virus vectors |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
FR2650840B1 (fr) | 1989-08-11 | 1991-11-29 | Bertin & Cie | Procede rapide de detection et/ou d'identification d'une seule base sur une sequence d'acide nucleique, et ses applications |
CA2044593C (en) | 1989-11-03 | 2004-04-20 | Kenneth L. Brigham | Method of in vivo delivery of functioning foreign genes |
US5279833A (en) | 1990-04-04 | 1994-01-18 | Yale University | Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells |
US5204253A (en) | 1990-05-29 | 1993-04-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method and apparatus for introducing biological substances into living cells |
US6770283B1 (en) | 1990-12-13 | 2004-08-03 | Bioption Ab | DNA expression systems based on alphaviruses |
US6004744A (en) | 1991-03-05 | 1999-12-21 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer |
US6037135A (en) | 1992-08-07 | 2000-03-14 | Epimmune Inc. | Methods for making HLA binding peptides and their uses |
IL105914A0 (en) | 1992-06-04 | 1993-10-20 | Univ California | Methods and compositions for in vivo gene therapy |
US5662907A (en) | 1992-08-07 | 1997-09-02 | Cytel Corporation | Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in humans using synthetic peptide epitopes |
US9340577B2 (en) | 1992-08-07 | 2016-05-17 | Epimmune Inc. | HLA binding motifs and peptides and their uses |
US20050271676A1 (en) | 1993-03-05 | 2005-12-08 | Epimmune Inc. | Inducing cellular immune responses to human immunodeficiency virus-1 using peptide and nucleic acid compositions |
ATE415173T1 (de) | 1993-09-14 | 2008-12-15 | Pharmexa Inc | Pan dr-bindeproteinen zur erhöhung der immunantwort |
US6413935B1 (en) | 1993-09-14 | 2002-07-02 | Epimmune Inc. | Induction of immune response against desired determinants |
EP0716148B1 (en) | 1993-09-15 | 2004-01-02 | Chiron Corporation | Recombinant alphavirus vectors |
US6015686A (en) | 1993-09-15 | 2000-01-18 | Chiron Viagene, Inc. | Eukaryotic layered vector initiation systems |
CA2176215C (en) | 1993-11-09 | 2007-06-26 | James P. Trempe | Stable cell lines capable of expressing the adeno-associated virus replication gene |
US5505947A (en) | 1994-05-27 | 1996-04-09 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Attenuating mutations in Venezuelan Equine Encephalitis virus |
AU704391B2 (en) | 1994-10-28 | 1999-04-22 | Trustees Of The University Of Pennsylvania, The | Improved adenovirus and methods of use thereof |
FR2726285B1 (fr) | 1994-10-28 | 1996-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation |
US5552350A (en) | 1994-12-12 | 1996-09-03 | Ceramco Inc. | Low-fusing temperature porcelain |
US5792462A (en) | 1995-05-23 | 1998-08-11 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Alphavirus RNA replicon systems |
US5851796A (en) | 1995-06-07 | 1998-12-22 | Yale University | Autoregulatory tetracycline-regulated system for inducible gene expression in eucaryotes |
UY24367A1 (es) | 1995-11-23 | 2000-10-31 | Boehringer Ingelheim Int | Vacunas contra tumores y procedimiento para su produccion |
US5849589A (en) | 1996-03-11 | 1998-12-15 | Duke University | Culturing monocytes with IL-4, TNF-α and GM-CSF TO induce differentiation to dendric cells |
US6451592B1 (en) | 1996-04-05 | 2002-09-17 | Chiron Corporation | Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis |
EP0803573A1 (en) | 1996-04-25 | 1997-10-29 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) | Polycistronic expression construct with cytokines for multivalent vaccines |
US6514731B1 (en) | 1996-05-24 | 2003-02-04 | Chiron Corporation | Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens |
JP2001503735A (ja) | 1996-07-03 | 2001-03-21 | ユニバーシティ オブ ピッツバーグ | 親水性活性試薬のためのエマルジョン処方物 |
US6083716A (en) | 1996-09-06 | 2000-07-04 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Chimpanzee adenovirus vectors |
US7732129B1 (en) | 1998-12-01 | 2010-06-08 | Crucell Holland B.V. | Method for the production and purification of adenoviral vectors |
US5849561A (en) | 1997-05-22 | 1998-12-15 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for the production of non-group C adenoviral vectors |
EP1000628A1 (en) | 1998-09-28 | 2000-05-17 | Fondation Mondiale Recherche et Prevention SIDA | Use of antigenic complexes of HIV envelope and HLA class I antigens as HIV vaccine |
US20030072767A1 (en) | 1998-09-30 | 2003-04-17 | Alexander Gaiger | Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy |
US20080050393A1 (en) | 1998-12-03 | 2008-02-28 | Tang Y Tom | Novel nucleic acids and polypeptides |
CA2354374A1 (en) | 1998-12-07 | 2000-06-15 | U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases | Live attenuated venezuelan equine encephalitis vaccine |
EP1150708A2 (en) | 1999-02-11 | 2001-11-07 | Genzyme Corporation | Polynucleotide encoding multimers of antigenic peptides in order to enhance presentation of the antigenic peptide by mhc molecules |
US7262049B2 (en) | 1999-03-16 | 2007-08-28 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Pseudotyped lentiviral vectors and uses thereof |
ATE386127T1 (de) | 1999-04-08 | 2008-03-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Verbesserung der immunantwort als anwendung in impfstoff und gentherapie |
US8647864B2 (en) | 1999-04-14 | 2014-02-11 | Novartis Ag | Compositions and methods for generating an immune response utilizing alphavirus-based vector systems |
ATE463578T1 (de) | 1999-04-14 | 2010-04-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Zusammensetzungen und verfahren zur auslösung einer immunantwort auf basis alphavirus-vektoren- systeme |
US6365394B1 (en) | 1999-09-29 | 2002-04-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus |
AU2605501A (en) | 1999-12-21 | 2001-07-03 | Epimmune, Inc. | Inducing cellular immune responses to prostate cancer antigens using peptide andnucleic acid compositions |
US7462354B2 (en) | 1999-12-28 | 2008-12-09 | Pharmexa Inc. | Method and system for optimizing minigenes and peptides encoded thereby |
US20040248113A1 (en) | 1999-12-28 | 2004-12-09 | Alessandro Sette | Method and system for optimizing multi-epitope nucleic acid constructs and peptides encoded thereby |
WO2001055177A2 (en) | 2000-01-28 | 2001-08-02 | Statens Serum Institut | Methods to identify ctl epitopes of hiv |
EP2311950A1 (en) | 2000-01-28 | 2011-04-20 | The Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Novel MHC class II restricted T cell epitopes from the cancer antigen, NY ESO-1 |
US20010055596A1 (en) | 2000-03-24 | 2001-12-27 | Meagher Madeleine Joy | Compositions and methods for therapy and diagnosis of colon cancer |
US6436703B1 (en) | 2000-03-31 | 2002-08-20 | Hyseq, Inc. | Nucleic acids and polypeptides |
US20040115625A1 (en) | 2000-10-02 | 2004-06-17 | Reinhard Ebner | Cancer gene determination and therapeutic screening using signature gene sets |
US6783939B2 (en) | 2000-07-07 | 2004-08-31 | Alphavax, Inc. | Alphavirus vectors and virosomes with modified HIV genes for use in vaccines |
WO2002027007A2 (en) | 2000-09-25 | 2002-04-04 | Regents Of The University Of Michigan | Production of viral vectors |
US20020137081A1 (en) | 2001-01-08 | 2002-09-26 | Olga Bandman | Genes differentially expressed in vascular tissue activation |
AU2002242016A1 (en) | 2001-02-01 | 2002-08-12 | The Johns Hopkins University | Nucleic acid derived vaccine that encodes an antigen linked to a polypeptide that promotes antigen presentation |
AU2002303330B2 (en) | 2001-05-31 | 2008-07-24 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Chimeric alphavirus replicon particles |
US20030232324A1 (en) * | 2001-05-31 | 2003-12-18 | Chiron Corporation | Chimeric alphavirus replicon particles |
CA2450470C (en) | 2001-06-22 | 2012-08-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for rapid screening of bacterial transformants and novel simian adenovirus proteins |
CA2478508C (en) | 2002-04-25 | 2013-07-02 | Crucell Holland B.V. | Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof |
EP1497438B1 (en) | 2002-04-25 | 2009-10-28 | Crucell Holland B.V. | Means and methods for the production of adenovirus vectors |
AU2003289716A1 (en) | 2002-09-12 | 2004-04-30 | Incyte Corporation | Molecules for diagnostics and therapeutics |
CA2500687A1 (en) | 2002-10-02 | 2004-04-15 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
US7507803B2 (en) | 2002-10-03 | 2009-03-24 | Genimmune N.V. | Optimized multi-epitope constructs and uses thereof |
ES2618309T3 (es) | 2002-12-13 | 2017-06-21 | Alphavax, Inc. | Partículas de replicón de alfavirus multi-antigénico y métodos |
DK2290054T3 (en) | 2002-12-13 | 2017-07-03 | Alphavax Inc | Alpha virus particles and processes for their preparation |
GB2398300A (en) | 2003-02-17 | 2004-08-18 | Isis Innovation | Method and compositions for boosting immune response |
US7425328B2 (en) | 2003-04-22 | 2008-09-16 | Purdue Pharma L.P. | Tissue factor antibodies and uses thereof |
WO2005033265A2 (en) | 2003-04-25 | 2005-04-14 | Epimmune Inc. | Optimized multi-epitope constructs and uses thereof |
US7605235B2 (en) | 2003-05-30 | 2009-10-20 | Centocor, Inc. | Anti-tissue factor antibodies and compositions |
PT1629004E (pt) | 2003-06-05 | 2008-11-14 | Wyeth Corp | Composições imunogénicas compreendendo vectores do replicão do vírus da encefalite equina venezuelana e antigénios proteicos de paramixovírus |
US7291498B2 (en) | 2003-06-20 | 2007-11-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses |
DE10347710B4 (de) | 2003-10-14 | 2006-03-30 | Johannes-Gutenberg-Universität Mainz | Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung |
ATE449105T1 (de) | 2004-01-23 | 2009-12-15 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Impfstoffträger für schimpansen-adenovirus |
US8119336B2 (en) | 2004-03-03 | 2012-02-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of alphaviruses |
WO2006078279A2 (en) | 2004-04-28 | 2006-07-27 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Sequential delivery of immunogenic molecules via adenovirus and adeno-associated virus-mediated administrations |
WO2006033672A2 (en) | 2004-04-28 | 2006-03-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost |
JP4896021B2 (ja) | 2004-05-21 | 2012-03-14 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス, インコーポレイテッド | 呼吸器系病原体ワクチンのためのアルファウイルスベクター |
CA2567047C (en) | 2004-05-25 | 2015-06-30 | Zequn Tang | Alphavirus replicon packaging constructs |
US20060051405A1 (en) | 2004-07-19 | 2006-03-09 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions for the delivery of therapeutic agents and uses thereof |
ATE401392T1 (de) | 2004-10-04 | 2008-08-15 | Biovaxim Ltd | Subtypabgestimmte inaktivierte vollvirusvakzine zur behandlung von patienten mit hiv-infektion |
US20060198854A1 (en) | 2004-12-28 | 2006-09-07 | Peter Pushko | Vector platforms derived from the alphavirus vaccines |
US7220549B2 (en) | 2004-12-30 | 2007-05-22 | Helicos Biosciences Corporation | Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing |
FR2882557A1 (fr) | 2005-02-25 | 2006-09-01 | Centre Nat Rech Scient | Epitopes de vih et composition pharmaceutique les contenant |
US7283337B2 (en) | 2005-03-04 | 2007-10-16 | Headway Technologies, Inc. | Abutted exchange bias design for sensor stabilization |
RS63964B1 (sr) | 2005-08-23 | 2023-03-31 | Univ Pennsylvania | Rnk koja sadrži modifikovane nukleozide i postupci za njenu upotrebu |
US20110223197A1 (en) | 2005-10-18 | 2011-09-15 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | Mucosal and Systemic Immunization with Alphavirus Replicon Particles |
KR101499750B1 (ko) | 2006-02-27 | 2015-03-06 | 더 보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 가감염성 플라비바이러스 및 이들의 용도 |
EP2061508B1 (en) | 2006-09-12 | 2014-10-15 | Alphavax, Inc. | Alphavirus replicon particles matched to protein antigens as immunological adjuvants |
US9085638B2 (en) | 2007-03-07 | 2015-07-21 | The Johns Hopkins University | DNA vaccine enhancement with MHC class II activators |
GB0706914D0 (en) | 2007-04-10 | 2007-05-16 | Isis Innovation | Novel adenovirus vectors |
AU2008262490B2 (en) | 2007-05-22 | 2011-11-17 | Amgen Inc. | Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins |
WO2008145685A1 (en) | 2007-05-31 | 2008-12-04 | Genimmune N.V. | Hpv polyepitope constructs and uses thereof |
AU2008266807B2 (en) | 2007-06-21 | 2012-08-16 | Alphavax, Inc. | Promoterless cassettes for expression of alphavirus structural proteins |
US20100015179A1 (en) | 2007-08-16 | 2010-01-21 | Frolov Ilya V | Attenuation of encephalitogenic alphavirus and uses thereof |
WO2009034190A2 (en) | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Genimmune N.V. | Affinity tag |
GB0719526D0 (en) | 2007-10-05 | 2007-11-14 | Isis Innovation | Compositions and methods |
US20100285050A1 (en) | 2007-10-05 | 2010-11-11 | Isis Innovation Limited | Compositions and Methods |
WO2009079185A2 (en) | 2007-11-26 | 2009-06-25 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Methods of generating alphavirus particles |
US20110091496A1 (en) | 2008-01-19 | 2011-04-21 | Graham Barney S | Methods and compositions for the delivery of vaccines to disrupted epithelium |
US20090253184A1 (en) | 2008-01-23 | 2009-10-08 | Introgen Therapeutics, Inc. | Compositions and methods related to an adenoviral trans-complementing cell line |
KR101668849B1 (ko) | 2008-01-24 | 2016-10-24 | 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 모기에서 복제 불가능한 약독화된 재조합 알파바이러스 및 그의 용도 |
AU2009228183A1 (en) | 2008-03-28 | 2009-10-01 | Virxsys Corporation | Lentivirus-based immunogenic vectors |
CA2726914A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-10 | Okairos Ag | A vaccine for the prevention and therapy of hcv infections |
US8093021B2 (en) * | 2008-06-13 | 2012-01-10 | New York University | Defective sindbis viral vectors |
ES2544702T3 (es) | 2008-07-17 | 2015-09-02 | Medigen, Inc. | Vacunas en forma de ADNi y métodos para utilizarlas |
DK2172211T3 (en) * | 2008-10-01 | 2015-02-16 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Composition of tumor-associated peptides and related anti-cancer vaccine for the treatment of glioblastoma (GBM) and other cancers |
US10369204B2 (en) | 2008-10-02 | 2019-08-06 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
WO2010044515A1 (ko) | 2008-10-17 | 2010-04-22 | Lee Jeong-Min | 병뚜껑 |
EP2370455B1 (en) | 2008-11-26 | 2019-07-03 | Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Virus like particle compositions and methods of use |
US8680258B2 (en) | 2008-12-01 | 2014-03-25 | Alphavax, Inc. | Use of microRNAs to control virus helper nucleic acids |
DE102008061522A1 (de) | 2008-12-10 | 2010-06-17 | Biontech Ag | Verwendung von Flt3-Ligand zur Verstärkung von Immunreaktionen bei RNA-Immunisierung |
SG172935A1 (en) | 2009-02-02 | 2011-08-29 | Okairos Ag | Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof |
CN101579528B (zh) | 2009-06-24 | 2011-06-29 | 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 | 一种hiv复合多表位dna疫苗及其应用 |
GB0918154D0 (en) | 2009-10-16 | 2009-12-02 | Isis Innovation | Mycobacterial vaccines |
ES2647662T3 (es) | 2009-12-31 | 2017-12-26 | Medigen, Inc. | Vacunas de ADN infeccioso frente al virus chikungunya |
GB201006405D0 (en) | 2010-04-16 | 2010-06-02 | Isis Innovation | Poxvirus expression system |
KR102447139B1 (ko) | 2010-05-14 | 2022-09-23 | 더 제너럴 하스피톨 코포레이션 | 종양 특이적 신생항원을 확인하는 조성물 및 방법 |
EP4180057A1 (en) | 2010-07-06 | 2023-05-17 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules |
EP2591114B1 (en) | 2010-07-06 | 2016-06-08 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Immunisation of large mammals with low doses of rna |
ES2770335T3 (es) | 2010-07-06 | 2020-07-01 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Administración de ARN para desencadenar múltiples vías inmunológicas |
US9192661B2 (en) | 2010-07-06 | 2015-11-24 | Novartis Ag | Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles |
CN103327963A (zh) | 2010-07-06 | 2013-09-25 | 诺华股份有限公司 | 阳离子水包油乳液 |
US9770463B2 (en) | 2010-07-06 | 2017-09-26 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Delivery of RNA to different cell types |
BR112013000244A2 (pt) | 2010-07-06 | 2016-05-17 | Novartis Ag | lipossomas com lipídeos apresentando pka vantajoso para administração de rna |
ES2727583T3 (es) | 2010-08-31 | 2019-10-17 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Lípidos adecuados para la administración liposómica de ARN que codifica proteínas |
AU2011295935B2 (en) | 2010-08-31 | 2016-02-11 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding RNA |
PT2611467T (pt) | 2010-08-31 | 2022-08-01 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Lipossomas pequenos para entrega de arn que codifica um imunogénio |
KR20140024270A (ko) | 2010-12-30 | 2014-02-28 | 파운데이션 메디신 인코포레이티드 | 종양 샘플의 다유전자 분석의 최적화 |
US9487563B2 (en) | 2011-01-31 | 2016-11-08 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Virus-like particles and methods of use |
US8722044B2 (en) | 2011-03-15 | 2014-05-13 | Janssen Biotech, Inc. | Human tissue factor antibody and uses thereof |
ES2782119T3 (es) | 2011-05-13 | 2020-09-10 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Antígenos de F de prefusión del VRS |
US10738355B2 (en) | 2011-05-24 | 2020-08-11 | Tron-Translationale Onkologie An Der Universitätsmedizin Der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Ggmbh | Individualized vaccines for cancer |
GB201108879D0 (en) | 2011-05-25 | 2011-07-06 | Isis Innovation | Vector |
WO2012171541A1 (en) | 2011-06-15 | 2012-12-20 | Scil Proteins Gmbh | Human fusion proteins comprising interferons and hetero-dimeric modified ubiquitin proteins |
EP2729168A2 (en) | 2011-07-06 | 2014-05-14 | Novartis AG | Immunogenic compositions and uses thereof |
SG10201605537XA (en) | 2011-07-06 | 2016-09-29 | Novartis Ag | Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules |
JP2014522842A (ja) | 2011-07-06 | 2014-09-08 | ノバルティス アーゲー | 免疫原性組み合わせ組成物およびその使用 |
KR102067760B1 (ko) | 2011-08-16 | 2020-01-17 | 삼성전자주식회사 | 세포 내 전달용 단백질 복합체 및 그의 용도 |
LT2750707T (lt) | 2011-08-31 | 2019-01-10 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Pegilintos liposomos, skirtos imunogeną koduojančios rnr pristatymui |
CN104105504A (zh) | 2011-10-11 | 2014-10-15 | 诺华股份有限公司 | 重组多顺反子核酸分子 |
CN104220462A (zh) | 2012-02-16 | 2014-12-17 | Vlp治疗有限责任公司 | 病毒样颗粒组合物 |
US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
US20160289674A1 (en) | 2012-04-02 | 2016-10-06 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of membrane proteins |
MX358019B (es) | 2012-05-18 | 2018-08-02 | Univ Pennsylvania | Adenovirus de simio de la subfamilia e a1302, a1320, a1331 y a1337 y sus usos. |
ES2663688T3 (es) | 2012-07-04 | 2018-04-16 | Sirion Biotech Gmbh | Medios y métodos para aumentar la producción de adenovirus |
EP2869842A1 (en) | 2012-07-06 | 2015-05-13 | Novartis AG | Immunogenic compositions and uses thereof |
US8961995B2 (en) | 2012-09-20 | 2015-02-24 | Uab Research Foundation | Methods and compositions for alphavirus replicons |
GB201220119D0 (en) | 2012-11-08 | 2012-12-26 | Univ Cork | Vector |
US9402888B2 (en) | 2013-03-14 | 2016-08-02 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Methods and compositions for treating cancer |
CN105377292A (zh) | 2013-04-07 | 2016-03-02 | 博德研究所 | 用于个性化瘤形成疫苗的组合物和方法 |
SG11201509614SA (en) | 2013-06-03 | 2015-12-30 | Vlp Therapeutics Llc | Malaria vaccine |
CA2928908C (en) | 2013-11-01 | 2021-01-12 | Pfizer Inc. | Vectors for expression of prostate-associated antigens |
GB201319446D0 (en) | 2013-11-04 | 2013-12-18 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors |
CN106132432A (zh) | 2013-12-06 | 2016-11-16 | 博德研究所 | 用于瘤形成疫苗的配制品 |
NZ721908A (en) | 2013-12-20 | 2022-12-23 | Massachusetts Gen Hospital | Combination therapy with neoantigen vaccine |
US10561722B2 (en) | 2014-09-03 | 2020-02-18 | Bavarian Nordic A/S | Methods and compositions for enhancing immune responses |
JP6863893B2 (ja) | 2014-11-26 | 2021-04-21 | アメリカ合衆国 | 抗突然変異kras t細胞受容体 |
US10975442B2 (en) | 2014-12-19 | 2021-04-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Molecular biomarkers for cancer immunotherapy |
EP3757211A1 (en) | 2014-12-19 | 2020-12-30 | The Broad Institute, Inc. | Methods for profiling the t-cell-receptor repertoire |
SG11201706118XA (en) | 2015-01-29 | 2017-08-30 | Agency Science Tech & Res | Nanocapsules carrying chikungunya-associated peptides |
EP3253795B1 (en) | 2015-02-06 | 2019-04-17 | Navigo Proteins Gmbh | Novel binding proteins comprising a ubiquitin mutein and antibodies or antibody fragments |
WO2016154047A2 (en) | 2015-03-20 | 2016-09-29 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Monoclonal antigen-binding proteins to intracellular oncogene products |
WO2016154246A1 (en) | 2015-03-23 | 2016-09-29 | The Johns Hopkins University | Hla-restricted epitopes encoded by somatically mutated genes |
US10835585B2 (en) | 2015-05-20 | 2020-11-17 | The Broad Institute, Inc. | Shared neoantigens |
CN117025590A (zh) | 2015-09-21 | 2023-11-10 | 垂林克生物技术有限公司 | 用于合成5’-加帽rna的组合物和方法 |
KR20180083327A (ko) | 2015-10-12 | 2018-07-20 | 난토믹스, 엘엘씨 | 바이러스성 암 네오에피토프를 위한 조성물 및 방법 |
RU2729116C2 (ru) | 2015-12-16 | 2020-08-04 | Гритстоун Онколоджи, Инк. | Идентификация, производство и применение неоантигенов |
JP6930992B2 (ja) | 2016-02-29 | 2021-09-01 | ファウンデーション・メディシン・インコーポレイテッド | 腫瘍変異負荷を評価するための方法及びシステム |
WO2017151940A2 (en) | 2016-03-03 | 2017-09-08 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
EP3436048A4 (en) | 2016-03-31 | 2019-11-27 | Neon Therapeutics, Inc. | NEOANTIGENES AND METHODS OF USE |
US20190346442A1 (en) | 2016-04-18 | 2019-11-14 | The Broad Institute, Inc. | Improved hla epitope prediction |
WO2017192924A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Cell-based neoantigen vaccines and uses thereof |
WO2017208191A1 (en) | 2016-06-02 | 2017-12-07 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Zika viral antigen constructs |
KR20230030032A (ko) | 2016-06-20 | 2023-03-03 | 아이에스에이 파마슈티컬즈 비.브이. | 펩타이드 백신의 제형 |
CN107698593A (zh) | 2016-08-09 | 2018-02-16 | 南京天印健华医药科技有限公司 | 作为fgfr抑制剂的杂环化合物 |
WO2018039131A1 (en) | 2016-08-22 | 2018-03-01 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Anti-pd-1 antibodies, or fragments thereof, for treating hepatitis b |
CA3044840A1 (en) | 2016-11-23 | 2018-05-31 | Gritstone Oncology, Inc. | Viral delivery of neoantigens |
WO2018102585A1 (en) | 2016-11-30 | 2018-06-07 | Advaxis, Inc. | Personalized immunotherapy in combination with immunotherapy targeting recurrent cancer mutations |
GB201620968D0 (en) | 2016-12-09 | 2017-01-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Adenovirus polynucleotides and polypeptides |
GB201621732D0 (en) | 2016-12-20 | 2017-02-01 | Agricultural Research Council | A multi-epitope dna vaccine for heartwater |
WO2018119115A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Methods for ameliorating infusion reactions |
EP3606550A2 (en) | 2017-04-03 | 2020-02-12 | Neon Therapeutics, Inc. | Protein antigens and uses thereof |
TW202333779A (zh) | 2017-05-08 | 2023-09-01 | 美商磨石生物公司 | 阿爾法病毒新抗原載體 |
JP2020523010A (ja) | 2017-06-09 | 2020-08-06 | グリットストーン オンコロジー インコーポレイテッド | 新生抗原の特定、製造、及び使用 |
TW201919653A (zh) | 2017-06-16 | 2019-06-01 | 加拿大商艾爾布圖斯生技公司 | 用於治療b型肝炎之治療組合物及方法 |
CA3069469A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | Genentech, Inc. | Therapeutic and diagnostic methods for cancer |
WO2019067092A1 (en) | 2017-08-07 | 2019-04-04 | The Johns Hopkins University | METHODS AND SUBSTANCES FOR THE EVALUATION AND TREATMENT OF CANCER |
WO2019090156A1 (en) | 2017-11-03 | 2019-05-09 | Guardant Health, Inc. | Normalizing tumor mutation burden |
CN112020563A (zh) | 2018-03-06 | 2020-12-01 | 癌症研究技术有限公司 | 变体检测的改进 |
TW202000907A (zh) | 2018-05-23 | 2020-01-01 | 美商葛利史東腫瘤科技公司 | 共有抗原 |
US20210213122A1 (en) | 2018-05-23 | 2021-07-15 | Gritstone Oncology, Inc. | Immune checkpoint inhibitor co-expression vectors |
US20220125919A1 (en) | 2018-11-07 | 2022-04-28 | Gritstone Bio, Inc. | Alphavirus neoantigen vectors and interferon inhibitors |
BR122024002387A2 (pt) | 2019-05-30 | 2024-03-12 | Gritstone Bio, Inc. | Vetores de adenovírus, composição farmacêutica, sequência de nucleotídeo isolada, célula isolada, vetor, kit, usos de um vetor, método para fabricar o vetor, métodos para produzir um vírus e vetor viral |
EP3993829A4 (en) | 2019-07-02 | 2024-01-03 | Gritstone bio, Inc. | HIV ANTIGENS AND MHC COMPLEXES |
EP4125973A4 (en) | 2019-11-04 | 2024-03-13 | Gritstone bio, Inc. | NEOANTIGEN VACCINE THERAPY |
WO2021119545A1 (en) | 2019-12-11 | 2021-06-17 | Gritstone Bio, Inc. | Durable vaccination |
EP4087940A4 (en) | 2020-01-10 | 2024-04-10 | Gritstone bio, Inc. | CELLULAR DNA MONITORING |
KR20230014694A (ko) | 2020-04-21 | 2023-01-30 | 그릿스톤 바이오, 인코포레이티드 | 항원-코딩 카세트 |
WO2022032196A2 (en) | 2020-08-06 | 2022-02-10 | Gritstone Bio, Inc. | Multiepitope vaccine cassettes |
-
2018
- 2018-05-08 TW TW112116974A patent/TW202333779A/zh unknown
- 2018-05-08 JP JP2019561211A patent/JP2020518648A/ja active Pending
- 2018-05-08 AU AU2018266705A patent/AU2018266705B2/en active Active
- 2018-05-08 EP EP18798194.9A patent/EP3634449A4/en active Pending
- 2018-05-08 WO PCT/US2018/031696 patent/WO2018208856A1/en unknown
- 2018-05-08 CA CA3062591A patent/CA3062591A1/en active Pending
- 2018-05-08 TW TW107115639A patent/TW201907937A/zh unknown
- 2018-05-08 PE PE2019002380A patent/PE20191842A1/es unknown
- 2018-05-08 CN CN201880030476.6A patent/CN110612116A/zh active Pending
- 2018-05-08 BR BR112019023477-2A patent/BR112019023477A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2018-05-08 US US16/612,352 patent/US11504421B2/en active Active
- 2018-05-08 SG SG11201910101S patent/SG11201910101SA/en unknown
- 2018-05-08 MX MX2019013259A patent/MX2019013259A/es unknown
- 2018-05-08 KR KR1020197034437A patent/KR20200003390A/ko not_active Application Discontinuation
-
2019
- 2019-11-08 PH PH12019502518A patent/PH12019502518A1/en unknown
- 2019-11-11 ZA ZA2019/07461A patent/ZA201907461B/en unknown
- 2019-12-02 CO CONC2019/0013609A patent/CO2019013609A2/es unknown
-
2022
- 2022-03-11 US US17/693,029 patent/US11510973B2/en active Active
- 2022-10-11 US US18/045,812 patent/US20240024445A1/en active Pending
-
2023
- 2023-04-20 AU AU2023202423A patent/AU2023202423A1/en active Pending
- 2023-06-30 JP JP2023108263A patent/JP2023123766A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100041737A1 (en) * | 2005-05-27 | 2010-02-18 | Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor | Gene Vector |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
BIOTHERAPY, 1998, VOL.12 NO.5, P.785-787, JPN6022022594, ISSN: 0005003373 * |
CURR OPIN MOL THER., 2002, VOL.4 NO.1, P.28-34, JPN6022022593, ISSN: 0005003372 * |
VIROLOGY, 1997, VOL.239, P.389-401, JPN6022022591, ISSN: 0005003370 * |
VIROLOGY, 2008, VOL.370 NO.1, P.22-32, JPN6022022592, ISSN: 0005003371 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2019138741A3 (ja) | 2021-09-23 |
PE20191842A1 (es) | 2019-12-31 |
MX2019013259A (es) | 2020-01-13 |
US20200197500A1 (en) | 2020-06-25 |
CA3062591A1 (en) | 2018-11-15 |
CN110612116A (zh) | 2019-12-24 |
US20220226453A1 (en) | 2022-07-21 |
US11510973B2 (en) | 2022-11-29 |
US20240024445A1 (en) | 2024-01-25 |
EP3634449A4 (en) | 2021-03-17 |
SG11201910101SA (en) | 2019-11-28 |
EP3634449A1 (en) | 2020-04-15 |
ZA201907461B (en) | 2023-04-26 |
JP2023123766A (ja) | 2023-09-05 |
KR20200003390A (ko) | 2020-01-09 |
AU2018266705A1 (en) | 2020-01-02 |
AU2018266705B2 (en) | 2023-05-04 |
BR112019023477A2 (pt) | 2020-06-30 |
US11504421B2 (en) | 2022-11-22 |
AU2023202423A1 (en) | 2023-05-11 |
TW202333779A (zh) | 2023-09-01 |
CO2019013609A2 (es) | 2020-04-01 |
TW201907937A (zh) | 2019-03-01 |
RU2019138741A (ru) | 2021-06-09 |
WO2018208856A1 (en) | 2018-11-15 |
PH12019502518A1 (en) | 2020-07-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11510973B2 (en) | Alphavirus antigen vectors | |
US20240067985A1 (en) | Viral delivery of neoantigens | |
JP2021525076A (ja) | 共有抗原 | |
JP7457733B2 (ja) | 改変アデノウイルス | |
US20220125919A1 (en) | Alphavirus neoantigen vectors and interferon inhibitors | |
US20210213122A1 (en) | Immune checkpoint inhibitor co-expression vectors | |
US20220265812A1 (en) | Hiv antigens and mhc complexes | |
US20230020089A1 (en) | Shared neoantigen vaccines |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200303 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20200302 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210428 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20210707 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220606 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220905 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221205 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230302 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230630 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230810 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20230817 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20230915 |