CN104220462A - 病毒样颗粒组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含多肽和至少一种抗原的颗粒，和包含它们的组合物。

Description

病毒样颗粒组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年2月16日申请的美国临时专利申请号61/599,746的权益，其全部内容都通过引用结合到本文中。
技术背景
本发明涉及包含多肽和至少一种抗原的颗粒，和包含它们的组合物。
背景
病毒样颗粒(VLP)是多蛋白结构，其模拟真实的天然病毒的组织和构造但缺少病毒基因组，可能产生更安全和更便宜的疫苗候选物。一部分预防性的基于VLP的疫苗目前在全球范围内已商业化：葛兰素史克公司的Engerix® (乙肝病毒)和Cervarix® (人乳头瘤病毒)，以及默克公司(Merck & Co., Inc.)的Recombivax HB® (乙肝病毒)和Gardasil® (人乳头瘤病毒)就是一些实例。其它基于VLP的疫苗候选物处于临床试验中或正在进行临床前评价，例如，流感病毒、细小病毒、Norwalk和各种嵌合VLP。许多其它的仍仅限于小规模基础研究，尽管它们在临床前试验中是成功的。关于大规模VLP生产，在工艺控制、监测和优化的背景下讨论。因此鉴定和讨论了主要的上下游技术挑战。对于治疗性或预防性的疫苗接种，伴随最新的临床试验结果和近来基于嵌合VLP技术的进展，暂时呈现出成功的基于VLP的疫苗的突起。(Expert Rev. Vaccines 9(10), 1149-1176, 2010)。
自从基孔肯雅病毒(CHIKV)于2004年自肯尼亚再度出现以来，这种甲病毒已经感染了非洲、欧洲和亚洲的几百万人。由于缺乏疫苗或抗病毒治疗，该疾病的严重性和该流行性病毒的传播带来了严重的公共健康威胁。据报道针对流行性基孔肯雅病毒的VLP疫苗保护非人类灵长类动物免于感染(Nat Med. 2010 March；16(3): 334-338)。美国专利公布号2012/0003266公开了包含一种或多种基孔肯雅病毒结构多肽的病毒样颗粒(VLP)，其可用于配制针对基孔肯雅的疫苗或抗原组合物，其诱导针对感染或其至少一种症状的免疫力。WO2012/106356公开了修饰的甲病毒或黄病毒病毒样颗粒(VLP)和用于增强修饰的VLP的生产的方法，用于预防或治疗甲病毒和黄病毒-介导的疾病。(这些引用的参考文献通过引用结合到本文中)。
发明概述
在第一方面，本发明提供能够自我装配的颗粒，其包含多肽和至少一种抗原，其中所述多肽包含至少一个第一附着位点和所述至少一种抗原包含至少一个第二附着位点，和其中所述多肽和所述抗原通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点而连接。
在第二方面，本发明提供核酸分子，其包含编码在本发明第一方面中提供的颗粒的核苷酸序列。
在第三方面，本发明提供组合物，其包含在本发明第一方面中提供的颗粒和/或在本发明第二方面中提供的核酸分子。
在第四方面，本发明提供产生抗体的方法，包括使在本发明第一方面中提供的颗粒和/或在本发明第二方面中提供的核酸分子与哺乳动物接触。
在第五方面，本发明提供免疫调节的方法，治疗自身免疫性疾病的方法，在哺乳动物中诱导和/或增强针对抗原的免疫应答的方法，和治疗癌症的方法，包括将在本发明第三方面中提供的组合物给予哺乳动物。
在第六方面，本发明提供被动免疫的方法，包括将在本发明第四方面中提供的抗体给予哺乳动物。
在第七方面，本发明提供在巨噬细胞上呈递抗原的方法，包括使在本发明第一方面中提供的颗粒和/或在本发明第二方面中提供的核酸分子与哺乳动物接触。
在第八方面，本发明提供用于产生在本发明第一方面中提供的颗粒的方法，包括：制备包含编码所述颗粒的核苷酸序列的基因；培养已用所述基因转染的细胞，以表达所述颗粒；和回收所述颗粒。
附图简述
图1显示待插入到委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)结构多肽中的TNFα序列的修饰。
图2显示蛋白质印迹结果，表明TNFα缀合的VLP已表达。
图3显示VLP_CHI 512载体。
图4显示VLP_CHI 532载体。
图5显示VLP_CHI 520载体。
图6显示VLP_VEEV VLP 518载体。
图7显示VLP_VEEV VLP 519载体。
图8显示VLP_VEEV VLP 538载体。
图9显示由TNFα衍生的肽-缀合的病毒样颗粒所诱导的抗TNFα抗体的检测。
图10显示由CD20衍生的肽-缀合的病毒样颗粒所诱导的抗人CD20抗体的检测。
图11显示由CD20衍生的肽-缀合的病毒样颗粒所诱导的抗小鼠CD20抗体的检测。
发明详述
(1) 包含多肽和至少一种抗原的颗粒
在第一方面，本发明提供能够自我装配的颗粒，其包含多肽和至少一种抗原，其中所述多肽包含至少一个第一附着位点和所述至少一种抗原包含至少一个第二附着位点，和其中所述多肽和所述抗原通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点而连接。
如本文所用，“能够自我装配的颗粒”是指由至少一种自发装配的组分构成的颗粒。所述组分可以是多肽或非肽化合物。在一个实施方案中，“能够自我装配的颗粒”可以是包含至少一种多肽或由其组成的颗粒。所述至少一种多肽由一种或多种类型的肽组成。在一个实施方案中，所述颗粒的直径为至少10nm，例如至少20nm，优选地至少50nm。在一个实施方案中，所述颗粒的分子量为100 kDa至100,000kDa，优选400kDa 至30,000kDa。
用于本发明的多肽并未被限定，只要它自发装配。所述多肽可以是病毒结构多肽。因此，本发明提供的颗粒可以是病毒样颗粒。
病毒结构多肽可以是天然存在的病毒多肽或其修饰的多肽。在一个实施方案中，所述修饰的多肽与包括衣壳和被膜蛋白在内的天然存在的病毒结构多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述修饰的多肽是突变体，其中至多10%的氨基酸被缺失、置换和/或添加到包括衣壳和被膜蛋白在内的天然存在的病毒结构多肽。
在一个实施方案中，用于本发明的病毒结构多肽包含衣壳和/或被膜蛋白或其片段或由其组成。例如，被膜蛋白包含选自E3、E2、6K和E1的至少一种。用于本发明的病毒结构多肽可衍生自甲病毒或黄病毒。因此，本发明提供的颗粒可以是衍生自甲病毒或黄病毒的病毒样颗粒。
甲病毒和黄病毒的实例包括但不限于奥拉病毒(Aura virus)、Babanki病毒、Barmah Forest病毒(BFV)、Bebaru病毒、Cabassou病毒、基孔肯雅病毒(CHIKV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、埃拉特病毒(Eilat virus)、沼泽地病毒(Everglades virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、盖塔病毒(Getah virus)、高地J病毒(Highlands J virus)、Kyzylagach病毒、马雅罗病毒(Mayaro virus)、Me Tri病毒、米德尔堡病毒(Middelburg virus)、Mosso das Pedras病毒、Mucambo病毒、恩杜姆病毒(Ndumu virus)、奥绒绒病毒(O'nyong-nyong virus)、Pixuna病毒、Rio Negro病毒、罗斯河病毒(Ross river virus, RRV)、鲑鱼胰腺病病毒(Salmon pancreas disease virus)、Semliki Forest病毒、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、南方象海豹病毒(Southern elephant seal virus)、Tonate病毒、Trocara病毒、Una病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)、Whataroa病毒、西尼罗病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒和黄热病病毒。
本文所用的术语“抗原”是指如果被MHC分子呈递，能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。术语“抗原”，如本文使用，也包括T细胞表位。在存在于除红细胞外的机体所有细胞上的MHC I类的情况下，或在存在于免疫细胞和尤其是抗原呈递细胞上的MHC II类的情况下，T细胞表位被T细胞受体识别。这样的识别事件导致T细胞活化和随后的效应器机制，例如T细胞的增殖、细胞因子的分泌、穿孔素的分泌等。抗原还能被免疫系统识别和/或能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B-和/或T-淋巴细胞的活化。然而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有或者连接于TH细胞表位，并且包含于佐剂中。一种抗原可能包含一种或多种表位(B和T表位)。上面提到的特异性反应指抗原优选地通常以高选择性方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的许多其它抗体或TCR反应。本文所用的抗原也可以是几种不同抗原的混合物。抗原，如本文所用，包括但不限于变应原、自体抗原、半抗原、癌抗原(即肿瘤抗原)和感染性疾病抗原以及有机小分子例如滥用的药物(例如烟碱)及其片段和衍生物。此外，用于本发明的抗原可以是肽、蛋白质、结构域、碳水化合物、生物碱、脂质或小分子例如甾体激素及其片段和衍生物、自身抗体和细胞因子本身。
细胞因子的实例包括但不限于：白介素(IL)，包括超过30个种类，例如IL-1α、IL-1β、IL-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11至-37；干扰素(IFN)，例如IFN-α、IFN-β和IFN-γ；肿瘤坏死因子(TNF)，例如TNF-α和TNF-β；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β；集落刺激因子(CSF)，例如粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)、红细胞生成素(EPO)、干细胞因子(SCF)和单核细胞趋化和活化因子(MCAF)；生长因子(GF)例如表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、角质细胞生长因子(KGF)、血小板生成素(TPO)、和骨形态发生蛋白(BMP)；和其它多肽因子，包括LIF、kit配体(KL)、MPO (髓过氧化物酶)和CRP (C-反应蛋白)；COX (环加氧酶)，例如COX-1、COX-2和COX-3；NOS (一氧化氮合酶)例如NOS-1、NOS-2和NOS-3；等等。
细胞因子还包括趋化因子，其是诱导趋化性的细胞因子。有两个主要类型的趋化因子，CXC和CC。CXC趋化因子，例如嗜中性粒细胞-活化蛋白-2 (NAP-2)和黑素瘤生长刺激活性蛋白(MGSA)，主要对于嗜中性粒细胞和T淋巴细胞是趋化性的，而CC趋化因子，例如RANTES、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)包括MIP-lα和MIP-lβ、角质细胞-衍生的趋化因子(KC)、单核细胞趋化蛋白(MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4和MCP-5)和嗜酸性粒细胞趋化因子(-1和-2)，对于其它细胞类型中的巨噬细胞、T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞和嗜碱性粒细胞是趋化性的。还存在趋化因子淋巴细胞趋化蛋白-1、淋巴细胞趋化蛋白-2 (两者都是C趋化因子)和fractalkine (一种CX3C趋化因子)，这些未落入主要趋化因子亚家族的任何一类中。
本文所用的术语“抗原决定簇”是指被B或T-淋巴细胞特异性识别的抗原部分。B-淋巴细胞经由抗体产生而响应外源抗原决定簇，而T淋巴细胞是细胞免疫的介质。因此，抗原决定簇或表位是由抗体识别的抗原部分，或者是在MHC的情况下由T细胞受体识别的抗原部分。抗原决定簇含有一个或多个表位。
本文所用的术语“抗体”是指能够结合表位或抗原决定簇的分子。该术语意指包括完整抗体及其抗原结合片段，包括单链抗体。这样的抗体包括人抗原结合抗体片段和包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、单链Fvs (scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs (sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是哺乳动物抗体，所述哺乳动物例如人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马等，或是其它合适的动物(例如鸡)。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并包括分离自人免疫球蛋白文库或一种或多种人免疫球蛋白的转基因动物(其不表达内源免疫球蛋白)的抗体，例如描述于美国专利号5,939,598，其公开内容通过引用全部结合到本文中。
抗原可以是并非源自病毒(例如基孔肯雅病毒、委内瑞拉马脑炎病毒)的一种物质(例如蛋白)。
在一个实施方案中，用于本发明的抗原是表1所列举的至少一个靶标或源自它们的多肽。
在一个实施方案中，用于本发明的抗原是选自CTLA-4、PD-1、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27和HVEM的至少一种蛋白或源自它们的多肽。CTLA-4、PD-1、TIM-3、BTLA、VISTA和LAG-3是T细胞刺激的抑制性受体，以及CD28、OX40、GITR、CD137、CD27和HVEM是T细胞刺激的活化受体(参见Mellman等人, Nature 480, 480-489 (2011))。
用于本发明的抗原可以是衍生自天然存在的蛋白的修饰的多肽。所述修饰的多肽可以是天然存在的蛋白的片段。在一个实施方案中，所述修饰的多肽与衍生自天然存在的蛋白的多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述衍生的修饰的多肽是突变体，其中基于衍生自天然存在的蛋白的多肽，至多10%的氨基酸被缺失、置换和/或添加。
在本发明提供的颗粒中，多肽和抗原可通过存在于所述多肽中的至少一个第一附着位点和存在于所述抗原中的至少一个第二附着位点而连接。
如本文所用，“第一附着位点”和“第二附着位点”各自是指超过一种物质彼此连接的位点。
在一个实施方案中，所述多肽和所述抗原直接融合。或者，可将一个或两个接头插入在所述抗原的N-末端残基和所述多肽之间和/或在所述抗原的C-末端残基和所述多肽之间。
所述抗原或所述多肽可以被截短和用短接头代替。在某些实施方案中，所述抗原或所述多肽包括一个或多个肽接头。典型地，接头由2-25个氨基酸组成。通常长度为2-15个氨基酸，尽管在某些情况下，可以是仅一个，例如单一的甘氨酸残基。
在一个实施方案中，其中编码多肽的多核苷酸与编码抗原的多核苷酸经基因融合的核酸分子，在宿主细胞中表达，使得第一附着位点和第二附着位点通过肽键连接。在这种情况下，所述多肽和所述抗原通过肽键连接。对于该实施方案，可自原始多肽或抗原，遗传修饰第一附着位点和/或第二附着位点。例如，自所述多肽修饰第一附着位点，使得通过包括SG、GS、SGG、GGS和SGSG在内的接头肽，将所述多肽与所述抗原缀合。
当所述多肽与所述抗原化学缀合时，第一附着位点和第二附着位点可通过化学交联接头(其是一种化合物)而连接。
交联接头的实例包括但不限于SMPH、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和其它交联接头，得自Pierce Chemical Company。
在一个实施方案中，本发明提供的颗粒包含与抗原连接的多肽，其中当在抗原或含有所述抗原的天然存在的蛋白或源自其的修饰的蛋白的晶体中测定距离时，所述抗原的N-末端残基和C-末端残基之间的空间距离为30Ǻ或更小。
用于本发明的抗原可以由本领域技术人员设计。例如，用于本发明的抗原可以是天然存在的蛋白或其片段。或者，本发明使用的抗原可以是自天然存在的蛋白或其片段修饰的蛋白。本领域技术人员可以设计抗原，使得当在抗原或含有所述抗原的天然存在的蛋白或源自其的修饰的蛋白的晶体中测定距离时，抗原的N-末端残基和C-末端残基之间的空间距离为30Ǻ或更小。例如，可以使用免费软件，包括PyMOL (例如PyMOL v0.99: http:/www.pymol.org)，设计用于本发明提供的颗粒的抗原。在一个实施方案中，抗原的N-末端残基和C-末端残基之间的空间距离为30Ǻ (埃)或更小、20Ǻ或更小、或10Ǻ或更小(例如5Ǻ至15Ǻ、5 Ǻ至12 Ǻ 、5 Ǻ至11 Ǻ 、5 Ǻ至10 Ǻ 、5 Ǻ至8 Ǻ 、8 Ǻ至15 Ǻ 、8 Ǻ至13 Ǻ 、8 Ǻ至12 Ǻ 、8 Ǻ至11 Ǻ 、9 Ǻ至12 Ǻ 、9 Ǻ至11 Ǻ 、9 Ǻ至10 Ǻ或10 Ǻ至11 Ǻ )。
基孔肯雅病毒样颗粒或委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒
在一个实施方案中，本发明提供基孔肯雅病毒样颗粒或委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒，其包含基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽和至少一种抗原，其中所述基孔肯雅病毒结构多肽或所述委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽包含至少一个第一附着位点和所述至少一种抗原包含至少一个第二附着位点，和其中所述基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽和所述至少一种抗原通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点而连接。
在一个实施方案中，当在抗原或含有所述抗原的天然存在的蛋白或源自其的修饰的蛋白的晶体中测定距离时，抗原的N-末端残基和C-末端残基之间的空间距离可以是30 Ǻ或更小； 25 Ǻ或更小； 20 Ǻ或更小； 15 Ǻ或更小； 14 Ǻ或更小； 13 Ǻ或更小； 12 Ǻ或更小； 11 Ǻ或更小； 10 Ǻ或更小； 9 Ǻ或更小；或8 Ǻ或更小(例如5 Ǻ至15 Ǻ 、5 Ǻ至12 Ǻ 、5 Ǻ至11 Ǻ 、5 Ǻ至10 Ǻ 、5 Ǻ至8 Ǻ 、8 Ǻ至15 Ǻ 、8 Ǻ至13 Ǻ 、8 Ǻ至12 Ǻ 、8 Ǻ至11 Ǻ 、9 Ǻ至12 Ǻ 、9 Ǻ至11 Ǻ 、9 Ǻ至11 Ǻ或10 Ǻ至11 Ǻ )。
在一个实施方案中，所述抗原通过化学交联方式或作为以遗传工程方式产生的融合蛋白而与基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽连接。
用于本发明的基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽可包含基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒被膜蛋白和/或衣壳。
基孔肯雅病毒的实例包括但不限于37997和LR2006 OPY-1毒株。
委内瑞拉马脑炎病毒的实例包括但不限于TC-83。
用于本发明的基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽可以是天然存在的病毒结构多肽或其修饰的多肽。所述修饰的多肽可以是天然存在的病毒结构多肽的片段。在一个实施方案中，所述修饰的多肽与天然存在的病毒衣壳和/或被膜蛋白具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述修饰的多肽是突变体，其中基于天然存在的病毒衣壳和/或被膜蛋白，至多10%的氨基酸被缺失、置换和/或添加。例如，可将K64A或K64N突变引入本发明所用的委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽的衣壳中。
基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒被膜蛋白可包含选自E3、E2、6K和El的至少一种。
基孔肯雅病毒结构多肽的实例包括但不限于基孔肯雅病毒株37997的E3-E2-6K-E1、基孔肯雅病毒株37997的衣壳-E3-E2-6K-E1、基孔肯雅病毒株LR2006 OPY-1的E3-E2-6K-E1和基孔肯雅病毒LR2006 OPY-1的衣壳-E3-E2-6K-E1。
委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽的实例包括但不限于委内瑞拉马脑炎病毒株TC-83的E3-E2-6K-E1和委内瑞拉马脑炎病毒株TC-83的衣壳-E3-E2-6K-E1。
示例性的基孔肯雅病毒结构多肽序列以Genbank登录号ABX40006.1提供，其描述如下(SEQ ID No.:1)：
另一示例性的基孔肯雅病毒结构多肽序列以Genbank登录号ABX40011.1提供，其描述如下(SEQ ID No.:2)：
示例性的委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽以Genbank登录号L01443.1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/L01443.1)提供，其描述如下(SEQ ID No.:3)：
在一个实施方案中，第一附着位点包含氨基，优选赖氨酸残基的氨基。在一个实施方案中，第二附着位点包含巯基，优选半胱氨酸的巯基。
在一个实施方案中，使用化学交联接头，实现通过第一附着位点或第二附着位点的超过两种物质(例如抗原和基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽)的缀合。交联接头的实例包括但不限于SMPH、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和其它交联接头，可得自Pierce Chemical Company。
依照本发明，可以提供基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒，其包括基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽和抗原，其中所述基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽和所述抗原表达为融合蛋白。
在一个实施方案中，所述抗原可以与基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽的任何位点融合。例如，所述抗原可以直接或间接连接到基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽(例如衣壳、E3、E2、6K或E1)的N-或C-末端，或所述抗原可以插入到基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒结构蛋白(例如衣壳、E3、E2、6K或E1)中。
在一个实施方案中，将至少一种抗原插入到基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒结构蛋白的E2中。例如，对于基孔肯雅病毒结构蛋白，将至少一种抗原插入到SEQ ID No.1或2的残基519和520之间(即SEQ ID No.1或2的519-位置的G和520-位置的Q之间)；SEQ ID No.1或2的残基530和531之间(即SEQ ID No.1或2的530-位置的G和531-位置的S之间)；SEQ ID No.1或2的残基531和532之间(即SEQ ID No.1或2的531-位置的S和532-位置的N之间)；SEQ ID No.1或2的残基529和530之间(即SEQ ID No.1或2的529-位置的G和530-位置的G之间)；或SEQ ID No.1或2的残基510和511之间(即SEQ ID No.1或2的510-位置的S和511-位置的G之间)；或SEQ ID No.1或2的残基511和512之间(即SEQ ID No.1或2的511-位置的G和512-位置的N之间)；或SEQ ID No.1或2的残基509和510之间(即SEQ ID No.1或2的509-位置的Q和510-位置的S之间)。
例如，对于委内瑞拉马脑炎病毒结构蛋白，将至少一种抗原插入SEQ ID No.3的残基517和518之间(即SEQ ID No.3的517-位置的G和518-位置的S之间)；SEQ ID No.3的残基518和519之间(即SEQ ID No.3的518-位置的S和519-位置的S之间)；SEQ ID No.3的残基519和520之间(即SEQ ID No.3的519-位置的S和520-位置的V之间)；SEQ ID No.3的残基515和516之间(即SEQ ID No.3的515-位置的L和516-位置的S之间)；SEQ ID No.3的残基516和517之间(即SEQ ID No.3的516-位置的S和517-位置的G之间)；SEQ ID No.3的残基536和537之间(即SEQ ID No.3的536-位置的C和537-位置的G之间)；SEQ ID No.3的残基537和538之间(即SEQ ID No.3的537-位置的G和538-位置的G之间)；SEQ ID No.3的残基538和539之间(即SEQ ID No.3的538-位置的G和539-位置的T之间)。
可使用本领域常规技术表达融合蛋白。各种表达系统可用于表达融合蛋白。例如，融合蛋白可以在293细胞、Sf9细胞或大肠杆菌中表达。
在一个实施方案中，抗原是并非衍生自基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒的一种物质(例如蛋白)。抗原可以是选自自身抗原和癌抗原的至少一种。例如，抗原是衍生自TNF-α、CD20或CTLA4的多肽。因此，用于本发明的所述多肽和所述抗原的组合的实例包括但不限于i) 衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)的多肽和衍生自TNF-α的多肽；
ii) 衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)的多肽和衍生自CD20的多肽；
iii) 衍生自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的多肽和衍生自TNF-α的多肽；或
iv) 衍生自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的多肽和衍生自CD20的多肽；
v) 衍生自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的多肽和衍生自CTLA4的多肽。
衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)或委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的多肽可以是天然存在的病毒多肽或其修饰的多肽。另外，衍生自TNF-α、CD20或CTLA4的多肽可以是天然存在的多肽或天然存在的多肽的修饰的多肽或天然存在的多肽或修饰的肽的片段。所述修饰的多肽可以是天然存在的病毒结构多肽的片段。
在一个实施方案中，衍生自TNF-α、CD20或CTLA4的修饰的多肽与天然存在的多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，衍生自TNF-α、CD20或CTLA4的修饰的肽是突变体，其中基于衍生自TNF-α、CD20或CTLA4的天然存在的多肽，至多10%的氨基酸被缺失、置换和/或添加。
当衍生自病毒的多肽与衍生自抗原的多肽缀合时，可以使用包括SG、GS、SGG、GGS SGSG和TRGGS在内的接头肽。衍生自病毒的多肽(以下称为“PFV”)与衍生自抗原的多肽(以下称为“PFA”)缀合的实例包括但不限于：PFV-SG-PFA-GS-PFV；PFV-SG-PFA-GGS-PFV；PFV-SSG-PFA-GS-PFV；PFV-SGG-PFA-GGS-PFV；PFV-SGSG-PFA-GS-PFV；和PFA-SGG-PFA-TRGGS-PFV。
在一个实施方案中，本发明提供病毒样颗粒，包含：
i) 衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)的多肽和衍生自TNF-α的多肽的融合蛋白，其由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成；
ii) 衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)的多肽和衍生自CD20的多肽的融合蛋白，其由SEQ ID No.5所示的氨基酸序列组成；
iii) 衍生自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的多肽和衍生自TNF-α的多肽的融合蛋白，其由SEQ ID No.6所示的氨基酸序列组成；或
iv) 衍生自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的多肽和衍生自CD20的多肽的融合蛋白，其由SEQ ID No.7所示的氨基酸序列组成；
v) 衍生自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的多肽和衍生自CTLA4的多肽的融合蛋白，其由SEQ ID No.8所示的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明提供包含融合蛋白的病毒样颗粒，所述融合蛋白是自具有SEQ ID No.4-8的任一个所示的氨基酸序列的融合蛋白修饰而来。所述修饰的融合蛋白与具有SEQ ID No.4-8的任一个所示的氨基酸序列的融合蛋白可具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%氨基酸序列同一性。而且，所述修饰的融合蛋白可以是突变体，其中基于具有SEQ ID No.4-8的任一个所示的氨基酸序列的融合蛋白，至多10%的氨基酸被缺失、置换和/或添加。
(2) 核苷酸、载体、宿主细胞
在第二方面，本发明提供包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码在本发明第一方面中提供的颗粒。
在一个实施方案中，本发明提供包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒，如上所述。
编码基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒的核苷酸序列的实例包括但不限于：编码基孔肯雅病毒株37997的E3-E2-6K-E1的核苷酸序列，编码基孔肯雅病毒株37997的衣壳-E3-E2-6K-E1的核苷酸序列，编码基孔肯雅病毒株LR2006 OPY-1的E3-E2-6K-E1的核苷酸序列，编码基孔肯雅病毒LR2006 OPY-1的衣壳-E3-E2-6K-E1的核苷酸序列，编码委内瑞拉马脑炎病毒株TC-83的E3-E2-6K-E1的核苷酸序列和编码委内瑞拉马脑炎病毒TC-83的衣壳-E3-E2-6K-E1的核苷酸序列。
对于基孔肯雅病毒，编码E3-E2-6K-E1的示例性的核苷酸序列描述如下(SEQ ID No.:9)：
。
对于基孔肯雅病毒，编码E3-E2-6K-E1的另一示例性的核苷酸序列描述如下(SEQ ID No.:10)：
。
对于基孔肯雅病毒，编码衣壳-E3-E2-6K-E1的示例性的核苷酸序列描述如下(SEQ ID No.:11)：
对于基孔肯雅病毒，编码衣壳-E3-E2-6K-E1的另一示例性的核苷酸序列描述如下(SEQ ID No.:12)：
在一个实施方案中，本发明提供包含如上所述的核酸分子的载体，其中所述载体任选包含与所述核酸分子操作性连接的表达控制序列。
表达控制序列的实例包括但不限于：启动子例如CMV启动子、噬菌体λ PL启动子、大肠杆菌lac、phoA和tac启动子、SV40早期和晚期启动子、和逆转录病毒LTR的启动子。
根据WO/2012/006180，本领域技术人员可以制备表达载体，所述参考文献的全部公开内容都通过引用结合到本文中。
可用于表达衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)的多肽和抗原多肽的融合蛋白的载体的实例包括示于以下的载体：VLP_CHI 512载体(SEQ ID No.:23)，其含有CHIKV VLP多核苷酸(SEQ ID No. 28；SEQ ID No.:29所示的相应氨基酸序列)；和VLP_CHI 532载体(SEQ ID No.: 24)，其含有CHIKV VLP多核苷酸(SEQ ID No. 30；SEQ ID No.:31所示的相应氨基酸序列)。
根据US2012/0003266，本领域技术人员可以制备表达载体，所述参考文献的全部公开内容都通过引用结合到本文中。
可用于表达衍生自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的多肽和抗原多肽的融合蛋白的载体实例包括示于以下的载体：VLP_VEEV VLP 518载体(SEQ ID No.:25)，其含有VEEV VLP多核苷酸(SEQ ID No. 32；SEQ ID No.:33所示的相应氨基酸序列)；VLP_VEEV VLP 519载体(SEQ ID No.26)，其含有VEEV VLP多核苷酸(SEQ ID No. 34；SEQ ID No.:35所示的相应氨基酸序列)；和VLP_VEEV VLP 538载体(SEQ ID No.: 27)，其含有VEEV VLP多核苷酸(SEQ ID No. 36；SEQ ID No.:37所示的相应氨基酸序列)。
在一个实施方案中，本发明提供：
i) 核酸分子，所述核酸分子编码衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)的多肽和衍生自TNF-α的多肽的融合蛋白，其由SEQ ID No.13所示的核苷酸序列组成；
ii) 核酸分子，所述核酸分子编码衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)的多肽和衍生自CD20的多肽的融合蛋白，其由SEQ ID No.14所示的核苷酸序列组成；
iii) 核酸分子，所述核酸分子编码衍生自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的多肽和衍生自TNF-α的多肽的融合蛋白，其由SEQ ID No.15所示的核苷酸序列组成；
iv) 核酸分子，所述核酸分子编码衍生自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的多肽和衍生自CD20的多肽的融合蛋白，其由SEQ ID No.16所示的核苷酸序列组成；或
v) 核酸分子，所述核酸分子编码衍生自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的多肽和衍生自CTLA4的多肽的融合蛋白，其由SEQ ID No.17所示的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明提供核酸分子，其是自具有SEQ ID No.13-17的任一个所示的核苷酸序列的核酸分子修饰而来。所述修饰的核酸分子与具有SEQ ID No.13-17的任一个所示的核苷酸序列的核酸分子可具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%核苷酸序列同一性。而且，所述修饰的核酸分子可以是突变体，其中基于具有SEQ ID No.13-17的任一个所示的核苷酸序列的核酸分子，至多10%的氨基酸被缺失、置换和/或添加。
(3) 组合物
在第三方面，本发明提供组合物，包含在本发明第一方面中提供的颗粒和/或在本发明第二方面中提供的核酸分子。
在一个实施方案中，本发明提供组合物，包含如上所述的基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒或如上所述的核酸分子。
所述组合物可以进一步包含药学上可接受的载体和/或佐剂。佐剂的实例包括但不限于Ribi溶液(Sigma佐剂系统, Sigma-Aldrich)。
本发明的药物组合物可含有单一活性成分或两种或更多种活性成分的组合，只要它们不违背本发明的目标。例如，包括趋化因子在内的细胞因子、细胞因子的抗体例如抗TNF抗体(例如英夫利昔单抗、阿达木单抗)、抗VEGF抗体(例如贝伐单抗和雷珠单抗)、细胞因子受体拮抗剂例如抗HER2抗体(例如曲妥单抗)、抗EGF受体抗体(例如西妥昔单抗)、抗VEGF适体(例如哌加他尼)和免疫调节剂例如环孢菌素、他克莫司、乌苯美司，可以用于联合治疗。
在多种活性成分的组合中，鉴于它们的治疗效果和安全性，可适当增加或减少它们各自的含量。
本文所用的术语“组合”是指将两种或更多种活性成分以单一实体或剂量的形式同时给予患者，或将两者作为单独的实体同时或序贯地没有具体时间限制地给予患者，其中这样的给予在机体内提供了治疗有效水平的两种组分，优选在同一时间。
在一个实施方案中，所述组合物是疫苗组合物，包括DNA疫苗。在一个实施方案中，本发明提供的DNA疫苗包含含有CpG的寡核苷酸。
(4) 产生抗体的方法，免疫调节的方法，治疗自身免疫性疾病的方法，在哺乳动物中诱导和 / 或增强针对抗原的免疫应答的方法，治疗癌症的方法，被动免疫的方法，在巨噬细胞上呈递抗原的方法，和产生颗粒的方法
在第四方面，本发明提供产生抗体的方法，包括使在本发明第一方面中提供的颗粒和/或在本发明第二方面中提供的核酸分子与哺乳动物接触。
可使用常规技术，使在本发明第四方面产生的抗体人源化。因此，在一个实施方案中，在本发明第四方面中提供的方法进一步包括使非人类哺乳动物产生的抗体人源化的步骤。
可将在本发明第一方面中提供的颗粒和/或在本发明第二方面中提供的核酸分子直接给予患者，给予受累器官或全身，或离体施加到衍生自所述患者或人细胞系的细胞并且随后再给予所述患者，或在体外用于从衍生自所述患者的免疫细胞例如B细胞和T细胞中选择亚群体，然后再将其重新给予所述患者。
依照本发明，所述病毒样颗粒可以用于免疫治疗。
在第五方面，本发明提供免疫调节的方法、治疗自身免疫性疾病的方法、在哺乳动物中诱导和/或增强针对抗原的免疫应答的方法和治疗癌症的方法，包括将在本发明第三方面中提供的组合物给予哺乳动物。
在第六方面，本发明提供被动免疫的方法，包括将在本发明第四方面中提供的抗体给予哺乳动物。
在第七方面，本发明提供在巨噬细胞上呈递抗原的方法，包括使在本发明第一方面中提供的颗粒和/或在本发明第二方面中提供的核酸分子与哺乳动物接触。
在第八方面，本发明提供产生在本发明第一方面中提供的颗粒的方法，包括：制备包含编码所述颗粒的核苷酸序列的基因；培养已用所述基因转染的细胞，以表达所述颗粒；和回收所述颗粒。
在一个实施方案中，本发明提供产生抗体的方法，包括使如上所述的基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒和/或如上所述的核酸分子与哺乳动物接触。所产生的抗体可以是可与基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒中包含的抗原或所述核酸分子编码的抗原特异性结合的抗体。产生本发明提供的抗体的方法可以是可用于产生针对抗原(例如TNFα、CD20和CLTA4)的单克隆抗体或多克隆抗体的方法。
在一个实施方案中，通过产生本发明的抗体的方法所获得的抗体用于被动免疫。被动免疫的方法可包括将所获抗体给予哺乳动物。
依照本发明，本发明的组合物可用于免疫调节。尤其是，所述免疫调节用于治疗自身免疫性疾病、神经性疾病、炎性疾病例如炎性肺病包括急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病和哮喘、血管生成相关疾病包括肿瘤。
在一个优选的实施方案中，本发明提供的免疫调节是在哺乳动物中诱导和/或增强针对抗原的免疫应答。因此，在一个实施方案中，本发明提供在哺乳动物中诱导和/或增强针对抗原的免疫应答的方法，包括将有效量的上述组合物给予所述哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于人。
因为许多抗体可用于治疗疾病，所以本发明提供的方法和组合物可用于治疗疾病。例如，与表1中列举的靶标特异性结合的抗体或与表1中列举的靶标上的表位结合的抗体可用于治疗表1中列举的疾病。
在一个实施方案中，用于本发明的至少一种抗原是表1中列举的至少一种靶标。当用于本发明的至少一种抗原是表1中列举的至少一种靶标时，本发明提供的颗粒、分离的核酸、载体、组合物和方法可用于治疗表1中列举的疾病或病况(参见表1的“用途”)。
例如，当用于本发明的至少一种抗原是一种或多种癌抗原时，本发明提供的颗粒、分离的核酸、载体、组合物和方法可用于治疗癌症。
癌抗原的实例包括但不限于VEGF、表皮生长因子受体、CD33、CD20和ErbB2。当将包含两种或更多种癌抗原的本发明的组合物给予哺乳动物时，针对这两种或更多种癌抗原的抗体就可以攻击癌症。
例如，当用于本发明的至少一种抗原是淀粉样蛋白β时，本发明提供的分离的核酸、载体、组合物和方法可用于治疗阿尔茨海默病。
例如，当用于本发明的至少一种抗原是TNFα时，本发明提供的分离的核酸、载体、组合物和方法可用于治疗：炎症；自身免疫疾病，包括类风湿性关节炎；银屑病、克罗恩病；溃疡性结肠炎等。
例如，当用于本发明的至少一种抗原是CD20时，本发明提供的分离的核酸、载体、组合物和方法可用于治疗：自身免疫疾病，包括类风湿性关节炎和SLE；癌症，包括非霍奇金淋巴瘤等。
例如，当用于本发明的至少一种抗原是CTLA4时，本发明提供的分离的核酸、载体、组合物和方法可用于治疗癌症包括黑素瘤；和用于活化T细胞等。
考虑到感染基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎的患者的症状以及基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎的异常大的分子，该VLP可以有效地及高效地起作用以靶向巨噬细胞及其组成例如细胞因子和免疫调节性化合物。
在一方面，本发明提供在巨噬细胞上呈递抗原的方法，包括将如上所述的基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒和/或如上所述的核酸分子给予哺乳动物。本发明提供的基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒良好地靶向巨噬细胞。在一个实施方案中，本发明提供的基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒是至少一种抗原的一类递送系统(递送到巨噬细胞)，所述抗原包含在基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒中。
在一个实施方案中，本发明提供用于产生在本发明第一方面中提供的基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒的方法，包括：制备包含编码所述颗粒的核苷酸序列的基因；培养已用所述基因转染的细胞，以表达所述颗粒；和回收所述颗粒。在该实施方案中，可使用常规方法进行转染。用于转染的细胞可以是293细胞。VLP的回收可包括在用包含基因的质粒转染细胞后收集条件培养基，并且可进一步包括用超速离心从条件培养基中纯化VLP。在一个实施方案中，在本发明第八方面中提供的产生基孔肯雅或委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒的方法中可以包括进一步的步骤，其中设计编码抗原的多核苷酸，使得当在抗原或含有所述抗原的天然存在的蛋白或源自其的修饰的蛋白的晶体中测定距离时，抗原的N-末端残基和C-末端残基之间的空间距离为30Ǻ或更小(例如5 Ǻ至15 Ǻ、5 Ǻ至12 Ǻ、5 Ǻ至11 Ǻ、5 Ǻ至10 Ǻ、5 Ǻ至8 Ǻ、8 Ǻ至15 Ǻ、8 Ǻ至13 Ǻ、8 Ǻ至12 Ǻ、8 Ǻ至11 Ǻ、9 Ǻ至12 Ǻ、9 Ǻ至11 Ǻ、9 Ǻ至10 Ǻ、或10 Ǻ至11 Ǻ)。
免疫系统经发展而识别外源抗原，以杀伤病原体例如病毒或细菌。它也经发展而不能识别自身蛋白，以保护自身蛋白。这称为免疫耐受系统。因此通过传统免疫方法诱导针对自身抗原的抗体是困难的。为了克服免疫耐受性，我们开发出新的疫苗方法，使用含有自身抗原的自我装配亚基。自我装配亚基自发装配并形成稳定的有组织的单元，其将高度重复的抗原展示在表面。与单一抗原免疫原例如传统免疫方法相比，高度重复的抗原免疫原在B细胞中增强了信号途径并导致对抗体应答的刺激。将该机制用于疫苗开发，不仅增加针对靶免疫原的抗体应答，而且克服自身抗原耐受性。
参考以下实施例，将详细描述本发明，然而以下实施例无意限制本发明的范围。
实施例
(1) 制备基孔肯雅病毒样颗粒，其包含病毒结构多肽和人 TNF α片段
预计与基孔肯雅病毒结构多肽融合的TNFα多肽单体难以稳定表达，因为发现TNFα在天然条件下是三聚体。然而，使用融合蛋白，其中TNFα单体肽(TNFα单体肽的片段)通过接头在TNFα-衍生肽的N-和C-末端(用于将TNFα-衍生肽与基孔肯雅病毒结构多肽连接)与基孔肯雅病毒结构多肽融合，导致基孔肯雅病毒样颗粒的稳定表达，所述颗粒包含病毒结构多肽和TNFα单体-衍生肽。
详细地讲，编码原始人TNFα的多核苷酸经修饰以制备编码修饰的TNFα-衍生肽的多核苷酸，其中作为原始TNFα-衍生肽的N-末端序列的RTPSD被SGG置换和将TRGGS连接到TNFα的C-末端(参见图1所示的SEQ ID No.18-20)。将所得多核苷酸插入到编码SEQ ID No.2的519-位置的G和520-位置的Q的密码子之间，以构建质粒(以下称为CHIKV-TNFa4)，用于表达基孔肯雅病毒样颗粒，其中将修饰的TNFα-衍生肽插入到基孔肯雅病毒结构多肽的E2 (C-E3-E2-6K-E1)。随后，用250μg CHIKV-TNFa4转染293F细胞(1.5x106细胞/ml)。培养4天后，收集上清液。将所得上清液覆盖到Opti Prep (Sigma D1556)上，然后进行超速离心(20000rpm, 120min)，使用SW28转子，以浓缩VLP (即病毒样颗粒)。将浓缩的VLP与Opti Prep混合形成密度梯度，然后进行超速离心(75000rpm, 4小时)，使用NVT100转子。超速离心后，收集纯化的VLP。包含与基孔肯雅病毒结构多肽缀合的TNFα的VLP的表达经蛋白质印迹得以证实，使用CHIVK特异性抗体(ATCC: VR-1241AF)和TNFα特异性抗体(Cell Signal: #6945)。
当在TNFα晶体中测定距离时，TNFα-衍生肽的N-末端残基和C-末端残基之间的空间距离为8.27Ǻ。
(2) 制备委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒，其包含病毒结构多肽和人 TNF α - 衍生肽 ( 称为 "VEEV-TNFa VLP")
按照上述(1)，制备与编码委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽的多核苷酸融合的编码修饰的TNFα-衍生肽的多核苷酸(参见SEQ ID No.15)，以构建表达载体，接着在293F细胞中转染。
通过密度梯度离心纯化VEEV-TNFa VLP。如泳道4所示，TNFα-衍生肽和VEEV表达经蛋白质印迹得以证实，分别使用TNFa单克隆抗体(上图)和VEEV多克隆抗体(下图) (参见图2)。
当在TNFα晶体中测定距离时，TNFα-衍生肽的N-末端残基和C-末端残基之间的空间距离为8.27Ǻ。
(3) 在免疫的小鼠中检测抗人 TNF α抗体
将小鼠分为3组(每组n=5)。将按照上述(1)制备的包含病毒结构多肽和人TNFα-衍生多肽的基孔肯雅病毒样颗粒(以下称为“CHIKV-TNFα”)、不包含人TNFα-衍生多肽的基孔肯雅病毒样颗粒(以下称为“CHIKV-VLP”)、按照上述(2)制备的包含病毒结构多肽和人TNFα-衍生多肽的委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒(以下称为“VEEV-TNFα”)、不包含人TNFα-衍生多肽的委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒(以下称为“VEEV-VLP”)或溶媒(即PBS)，经肌内给予各组小鼠。在实验开始时(以下称为“0周”)和第一次给予后3周(以下称为“3周”)给予小鼠，如下所述：组1：VEEV-TNFα (0周)、CHIKV-TNFα (3周)；组2：VEEV-VLP (0周)、CHIKV-VLP (3周)；和组3：PBS (0周)、PBS (3周)。
实验开始后6周，从每只小鼠获取血液样品并制备血清。使用在ELISA板上包被有TNFα蛋白的ELISA，检测所产生的抗人TNFα抗体。结果表明，包含病毒结构多肽和人TNFα-衍生多肽的病毒样颗粒在小鼠中诱导抗人TNFα抗体(参见图9)。
(4) 制备委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒，其包含病毒结构多肽和人 CD20 片段
按照上述(1)和(2)，通过密度梯度离心纯化VEEV-CD20 VLP，并且CD20和VEEV的片段表达经蛋白酶印迹得以证实。作为CD20片段的IYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ (SEQ ID No.: 21)，用作与委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽融合的抗原。
当在CD20晶体中测定距离时，CD20片段的N-末端残基和C-末端残基之间的空间距离为10.07Ǻ。
(5) 制备委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒，其包含病毒结构多肽和人 CTLA4 片段
根据全长CTLA4氨基酸序列而选择CTLA4片段：CKVELMYPPPYYLGIG (SEQ ID No.: 22)，使得当在CLTA4晶体中测定距离时，所述片段(其与委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽E2融合)的N-末端残基和C-末端残基之间的空间距离为大约5.6Ǻ。
将编码CTLA4片段的多核苷酸引入VLP_VEEV VLP 518载体，以构建质粒，用于表达与由SEQ ID No.:8的氨基酸序列组成的委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽融合的CTLA4片段。
(6) 制备委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒，其包含病毒结构多肽和全长人 CTLA4
将编码全长人CTLA4的多核苷酸引入VLP_VEEV VLP 518载体，以构建质粒，用于表达与委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽融合的CTLA4。
当在CLTA4晶体中测定距离时，全长人CTLA4的N-末端残基和C-末端残基之间的空间距离为大约39.6Ǻ。
在用所制备的质粒转染293细胞后，通过ELISA不能检测出与委内瑞拉马脑炎病毒结构多肽融合的CTLA4的表达。
(7) 制备基孔肯雅病毒样颗粒，其包含病毒结构多肽和人或小鼠 CD20 片段，和检测抗人或小鼠 CD20 抗体
使用VLP_CHI 532载体和人或小鼠TNFα抗体片段，制备包含病毒结构多肽和人或小鼠CD20片段的基孔肯雅病毒样颗粒。人和小鼠TNFα抗体片段描述如下：CD20人iyncepanpseknspstqycysiq (SEQ ID No.:21)；CD20小鼠ydcepsnsseknspstqycnsi (SEQ ID No.:41)。
接头(例如SGG、SG、GS或GGS)用于将如下所述的CD20片段插入SEQ ID No.2的519-位置的G和520-位置的Q之间：
CD20人：SGGiyncepanpseknspstqycysiqGS (SEQ ID No.:42)
CD20小鼠形式2：SGydcepsnsseknspstqycnsiGGS (SEQ ID No.:43)
CD20小鼠形式3：SGGydcepsnsseknspstqycnsiGS (SEQ ID No.:44)。
质粒：VLP_CHI VLP 532 CD20H、VLP_CHI VLP 532 CD20-2小鼠和VLP_CHI VLP 532 CD20-3小鼠用于表达基孔肯雅病毒样颗粒，其包含病毒结构多肽和人或小鼠CD20片段(SEQ ID No.: 45 (所表达的多肽的氨基酸序列示于SEQ ID No.: 46)、SEQ ID No.: 47 (所表达的多肽的氨基酸序列示于SEQ ID No.: 48)和SEQ ID No.: 49 (所表达的多肽的氨基酸序列示于SEQ ID No.: 50)。
按照(1)中所述方法纯化病毒样颗粒。用100μg纯化VLP；100μg人或小鼠CD20片段；或PBS (对照)，对小鼠免疫接种一次。免疫接种后10天，自小鼠中获得血液样品并制备血清。通过包被有人CD20片段的ELISA来检测经免疫诱导的抗人CD20抗体，并通过包被有小鼠CD20片段的ELISA来检测经免疫诱导的抗小鼠CD20抗体。结果表明，通过给予包含与病毒结构多肽融合的人或小鼠CD20片段的基孔肯雅病毒样颗粒，充分诱导出抗人CD20抗体和抗小鼠CD20抗体。而且，结果表明，通过给予包含与病毒结构多肽融合的自身抗原片段的基孔肯雅病毒样颗粒，可以充分诱导出自身抗原特异性抗体(参见图10和图11)。

Claims (40)

1.能够自我装配的颗粒，其包含多肽和至少一种抗原，其中所述多肽包含至少一个第一附着位点和所述至少一种抗原包含至少一个第二附着位点，和其中所述多肽和所述抗原通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点而连接，和其中当在抗原或含有所述抗原的天然存在的蛋白或源自其的修饰的蛋白的晶体中测定距离时，所述抗原的N-末端残基和C-末端残基之间的空间距离为30 Ǻ或更小。
2.权利要求1的颗粒，其中所述颗粒是病毒样颗粒。
3.包含病毒结构多肽和至少一种抗原的颗粒，其中所述病毒结构多肽包含至少一个第一附着位点和所述至少一种抗原包含至少一个第二附着位点，和其中所述病毒结构多肽和所述抗原通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点而连接，和其中所述颗粒是病毒样颗粒。
4.权利要求2或3的颗粒，其中所述病毒样颗粒衍生自甲病毒或黄病毒。
5.权利要求4的颗粒，其中所述甲病毒或黄病毒选自奥拉病毒、Babanki病毒、Barmah Forest病毒(BFV)、Bebaru病毒、Cabassou病毒、基孔肯雅病毒(CHIKV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、埃拉特病毒、沼泽地病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、高地J病毒、Kyzylagach病毒、马雅罗病毒、Me Tri病毒、米德尔堡病毒、Mosso das Pedras病毒、Mucambo病毒、恩杜姆病毒、奥绒绒病毒、Pixuna病毒、Rio Negro病毒、罗斯河病毒(RRV)、鲑鱼胰腺病病毒、Semliki Forest病毒、辛德比斯病毒、南方象海豹病毒、Tonate病毒、Trocara病毒、Una病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)、Whataroa病毒、西尼罗病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒和黄热病病毒。
6.权利要求5的颗粒，其中所述甲病毒是基孔肯雅病毒(CHIKV)或委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)。
7.权利要求2-6中任一项的颗粒，其中所述多肽是包含被膜蛋白的病毒结构多肽。
8.权利要求2-7中任一项的颗粒，其中所述多肽是包含衣壳和/或被膜蛋白E3、E2、6K和E1的病毒结构多肽。
9.权利要求8的颗粒，其中将所述至少一种抗原插入到被膜蛋白的E2。
10.权利要求1-9中任一项的颗粒，其中所述抗原是选自自身抗原和癌抗原的至少一种。
11.权利要求1-10中任一项的颗粒，其中所述抗原是衍生自TNF-α、CD20或CTLA4的多肽。
12.权利要求1-11中任一项的颗粒，其中所述多肽是衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)或委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的多肽。
13.权利要求中1-12任一项的颗粒，其中所述多肽和所述至少一种抗原是
i) 衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)的多肽和TNF-α的多肽；
ii) 衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)的多肽和CD20的多肽；
iii) 衍生自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的多肽和TNF-α的多肽；或
iv) 衍生自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的多肽和CD20的多肽
v) 衍生自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的多肽和CTLA4的多肽。
14.权利要求1-13中任一项的颗粒，其中所述至少一种抗原和所述多肽表达为融合蛋白。
15.权利要求14的颗粒，其中所述多肽和所述至少一种抗原直接融合。
16.权利要求14的颗粒，其中所述至少一种抗原与所述多肽融合，其中一个或两个接头插入在所述抗原的N-末端残基和所述多肽之间和/或在所述抗原的C-末端残基和所述多肽之间。
17.权利要求15或16的颗粒，其中所述至少一种抗原插入在SEQ ID No.1或2的残基519和520之间、SEQ ID No.1或2的残基530和531之间、SEQ ID No.1或2的残基531和532之间或SEQ ID No.1或2的残基532和533之间。
18.权利要求14-17中任一项的颗粒，其中所述融合蛋白是由SEQ ID No. 4、5、6、7或8所示的氨基酸序列组成的蛋白。
19.权利要求14-17中任一项的颗粒，其中所述融合蛋白衍生自以下蛋白质：所述蛋白质由与SEQ ID No. 4、5、6、7或8所示的氨基酸序列具有90%或更高的序列同一性的氨基酸序列组成。
20.权利要求1-13中任一项的颗粒，其中所述至少一种抗原以化学交联方式与所述多肽连接。
21.分离的核酸分子，包含编码权利要求1-20中任一项的颗粒的核苷酸序列。
22.分离的核酸分子，由SEQ ID No. 13、14、15、16或17所示的核苷酸序列组成。
23.分离的核酸分子，由与SEQ ID No. 13、14、15、16或17所示的核苷酸序列具有90%或更高的序列同一性的核苷酸序列组成。
24.包含权利要求23的核酸分子的载体，其中所述载体任选包含与所述核酸分子操作性连接的表达控制序列。
25.组合物，包含权利要求1-20中任一项的颗粒和/或权利要求21-24中任一项的核酸分子。
26.药物组合物，包含：
(a) 权利要求1-20中任一项的颗粒和/或权利要求21-24中任一项的核酸分子；和
(b) 药学上可接受的载体。
27.疫苗组合物，包含权利要求1-20中任一项的颗粒。
28.DNA疫苗组合物，包含权利要求21-24中任一项的核酸分子。
29.产生抗体的方法，包括使权利要求1-20中任一项的颗粒和/或权利要求21-24中任一项的核酸分子与哺乳动物接触。
30.权利要求29的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
31.免疫调节的方法，包括将免疫有效量的权利要求25-28中任一项的组合物给予哺乳动物。
32.治疗自身免疫性疾病的方法，包括将免疫有效量的权利要求25-28中任一项的组合物给予哺乳动物。
33.在哺乳动物中诱导和/或增强针对抗原的免疫应答的方法，包括将有效量的权利要求25-28中任一项的组合物给予所述哺乳动物。
34.治疗癌症的方法，包括将有效量的权利要求25-28中任一项的组合物给予哺乳动物。
35.被动免疫的方法，包括将通过权利要求29或30的方法所获得的抗体给予哺乳动物。
36.权利要求35的方法，用于治疗癌症。
37.权利要求34-36中任一项的方法，其中所述至少一种抗原是癌抗原。
38.权利要求34-36中任一项的方法，其中所述至少一种抗原是一种或多种癌抗原。
39.在巨噬细胞上呈递抗原的方法，包括使权利要求1-20中任一项的颗粒和/或权利要求21-24中任一项的核酸分子与哺乳动物接触。
40.产生权利要求14-19中任一项的颗粒的方法，包括：制备包含编码所述颗粒的核苷酸序列的基因；培养已用所述基因转染的细胞，以表达所述颗粒；和回收所述颗粒。
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