TWI695844B

TWI695844B - 類似病毒粒子組成物

Info

Publication number: TWI695844B
Application number: TW102105497A
Authority: TW
Inventors: 上野隆司; 赤畑涉
Original assignee: Ｖｌｐ醫療股份有限公司
Priority date: 2012-02-16
Filing date: 2013-02-18
Publication date: 2020-06-11
Also published as: MX2014009916A; CA2863695C; TW201345926A; US11345726B2; JP6306518B2; EP2814847B1; AU2013221187A1; RU2705301C2; EP2814847A4; BR112014020052B1; WO2013122262A1; US20130251744A1; MX357202B; US20160090403A1; US9249191B2; AU2013221187B2; NZ717682A; CN113248626A; NZ628206A; EP2814847A1

Abstract

本發明提供包含多肽及至少一種抗原之粒子，及含其之組成物。

Description

類似病毒粒子組成物

[相關申請案交互參考]

本申請案請求2012年2月16日提出申請之美國專利臨時申請案第61/599,746號之效益(benefit)，該案全部內容併入本文以資參考。

本發明係有關包含多肽及至少一種抗原之粒子，及含其之組成物。

類似病毒粒子(VLPs)為模擬天然原態病毒組織及構形，但缺少病毒基因體之多蛋白質結構，具產生更為安全又便宜之疫苗候選者之潛力。目前世界各地有少數已商業化之預防性VLP系疫苗：葛蘭素史克藥廠(GlaxoSmithKline)之Engerix®(B型肝炎病毒)與Cervarix®(人類乳突狀瘤病毒)、及默克藥廠之Recombivax HB®(B型肝炎病毒)與Gardasil®(人類乳突狀瘤病毒)為若干實例。其他VLP系疫苗候選者則於臨床試驗中或正進行臨床前評估中，例如，流感病毒、小病毒、諾瓦克(Norwalk)及各種嵌合VLP。其他許多儘管臨床前試驗成功者，仍局限於小規模之基礎研究。大規模VLP生產之蘊含於程序控制、監控與最適化之內容中討論；相應地確認及討論主要上下游技術之挑戰性。伴隨臨床試驗之最新結果及以嵌合型VLP為基礎之醫療或預防性疫苗接種用技術之最近發展，簡要介紹成功之VLP系疫苗的大轟動(blockbuster)(Expert Rev.Vaccines 9(10),1149-1176,2010)。

自從基孔肯雅熱病毒(Chikungunya virus，CHIKV)2004年於肯亞再度出現以來，此α病毒已在非洲、歐洲及亞洲感染數百萬人。於缺乏疫苗或抗病毒療法下，此疾病之嚴重性及流行性病毒之蔓延造成嚴重之公共衛生威脅。據報導，流行性基孔肯雅熱病毒之VLP疫苗保護非人類靈長類動物對抗感染(Nat Med.2010 March；16(3)：334-338)。美國專利公開案第2012/0003266號揭示包含一種或多種基孔肯雅熱病毒結構多肽之類似病毒粒子(VLP)，其可用於調配針對感染或其至少一種症狀誘發免疫力之基孔肯雅熱疫苗或抗原組成物。國際專利公開案第WO2012/106356號揭示經修飾α病毒或黃病毒類似病毒粒子(VLPs)及用於提高經修飾VLPs產量之方法，以用於預防或治療α病毒及黃病毒媒介疾病。(彼等引用文獻均併入本文以資參考。)

於第一態樣中，本發明提供能自組裝之粒子，其包含多肽及至少一種抗原，其中該多肽包含至少一個第一連結位置，該至少一種抗原包含至少一個第二連結位置；其中該多肽與該抗原經由該至少一個第一及該至少一個第二連結位置連接。

於第二態樣中，本發明提供一種核酸分子，其包含編碼本發明第一態樣所提供粒子之核苷酸序列。

於第三態樣中，本發明提供一種組成物，其包含本發明第一態樣所提供之粒子及/或本發明第二態樣所提供之核酸分子。

於第四態樣中，本發明提供產生抗體之方法，該方法包括使本發明第一態樣所提供之粒子及/或本發明第二態樣所提供之核酸分子與哺乳動物接觸。

於第五態樣中，本發明提供免疫調節之方法、治療自體免疫疾病之方法、於哺乳動物中誘發及/或增強對抗抗原之免疫反應之方法、及治療癌症之方法，該等方法包括投予哺乳動物本發明第三態樣所提供之組成物。

於第六態樣中，本發明提供被動免疫之方法，該方法包括投予哺乳動物本發明第四態樣所提供之抗體。

於第七態樣中，本發明提供於巨噬細胞上呈現抗原之方法，該方法包括使本發明第一態樣所提供之粒子及/或本發明第二態樣所提供之核酸分子與哺乳動物接觸。

於第八態樣中，本發明提供用於產生本發明第一態樣所提供之粒子之方法，該方法包括製備包含編碼該粒子之核苷酸序列之基因；培養以該基因轉染之細胞以表現該粒子；及回收該粒子。

第1圖顯示待插入委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)結構多肽中之TNF-α序列之修飾。

第2圖顯示西方墨漬法之結果，指示經與TNF-α結合之VLP被表現。

第3圖顯示VLP_CHI 512載體。

第4圖顯示VLP_CHI 532載體。

第5圖顯示VLP_CHI 520載體。

第6圖顯示VLP_VEEV VLP 518載體。

第7圖顯示VLP_VEEV VLP 519載體。

第8圖顯示VLP_VEEV VLP 538載體。

第9圖顯示經與TNF-α衍生胜肽結合之類似病毒粒子誘發之抗TNF-α抗體之檢測。

第10圖顯示經與CD20衍生胜肽結合之類似病毒粒子誘發之抗人類CD20抗體之檢測。

第11圖顯示經與CD20衍生胜肽結合之類似病毒粒子誘發之抗小鼠CD20抗體之檢測。

(1)包含多肽及至少一種抗原之粒子

於第一態樣中，本發明提供一種能自組裝之粒子，其包含多肽及至少一種抗原，其中該多肽包含至少一個第一連結位置，該至少一種抗原包含至少一個第二連結位置，其中該多肽與該抗原經由該至少一個第一及該至少一個第二連結位置連接。

本文所用之「能自組裝之粒子」係指由至少一個自發性組裝之成分形成之粒子；該成分可為多肽或非肽化合物。於一具體實施例中，「能自組裝之粒子」可為包含或由至少一種多肽組成之粒子；該至少一種多肽係由一種或多種胜肽組成。於一具體實施例中，該粒子之直徑為至少10nm，例如，至少20nm，較佳為至少50nm。於一具體實施例中，該粒子之分子量為自100kDa至100,000kDa，較佳為自400kDa至30,000kDa。

用於本發明之多肽不受限制，只要其為自發性組裝即可。該多肽可為病毒結構多肽。因此，本發明所提供之粒子可為類似病毒粒子。

病毒結構多肽可為天然存在之病毒多肽或其經修飾多肽。於一具體實施例中，經修飾多肽與天然存在之病毒結構多肽(包括殼體及套膜蛋白)具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%之胺基酸序列一致性。於一具體實施例中，經修飾多肽為包括殼體及套膜蛋白之天然存在之病毒結構多肽中，最多10%胺基酸被刪除、取代及/或添加之突變體。

於一具體實施例中，用於本發明之病毒結構多肽係包含或由殼體及/或套膜蛋白或其片段組成。例如，套膜蛋白包含選自由E3、E2、6K與E1所組成之組群之至少一者。用於本發明之病毒結構多肽可衍生自α病毒或黃病毒。因此，本發明所提供之粒子可為衍生自α病毒或黃病毒之類似病毒粒子。α病毒及黃病毒之實例包括，但不限於，奧拉(Aura)病毒、巴班基(Babanki)病毒、巴馬(Barmah)森林病毒(BFV)、貝巴魯(Bebaru)病毒、犰狳(Cabassou)病毒、基孔肯雅熱病毒(CHIKV)、東部馬腦炎病毒(EEEV)、埃拉特(Eilat)病毒、艾弗格雷茲(Everglades)病毒、摩根堡(Fort Morgan)病毒、給塔(Getah)病毒、高地J病毒、克孜勒阿加什(Kyzylagach)病毒、馬雅羅(Mayaro)病毒、密摧(Me Tri)病毒、密德堡(Middelburg)病毒、莫索佩拉斯(Mosso das Pedras)病毒、米坎波(Mucambo)病毒、恩杜姆(Ndumu)病毒、歐尼恩(O'nyong-nyong)病毒、皮休那(Pixuna)病毒、里奧尼格羅(Rio Negro)病毒、羅絲河(Ross River)病毒(RRV)、鮭魚胰臟病病毒、塞姆利基森林(Semliki Forest)森林病毒、辛德畢斯(Sindbis)病毒、南象海豹病毒、托納特(Tonate)病毒、挫卡拉(Trocara)病毒、烏納(Una)病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、西部馬腦炎病毒(WEEV)、沃達羅河(Whataroa)病毒、西尼羅河病毒、登革熱病毒、蜱媒腦炎病毒與黃熱病病毒。

本文所用之「抗原」一詞係指能被抗體或T細胞受體(TCR)(若由MHC分子呈現)結合之分子。本文所用之「抗原」亦涵蓋T細胞抗原決定區。T細胞抗原決定區被第一類MHC(其係呈現於紅血球以外之所有人體細胞)及第二類MHC(其係呈現於免疫細胞(特別是抗原呈現細胞))情形中T細胞受體所辨識。此辨識結果導致T細胞之活化及隨後之效應機制(例如T細胞增殖、細胞介素分泌、穿孔蛋白分泌等)。此外，抗原能被免疫系統辨識，及/或能誘發體液性免疫反應及/或細胞性免疫反應，而導致B及/或T淋巴細胞之活化；然而，至少於特定情形下，可能需要該抗原含有或連接於TH細胞抗原決定區且給定於佐劑中。抗原可具有一個或多個抗原決定區(B及T抗原決定區)。上文提及之特定反應意在表明抗原通常係以高度選擇性方式，較佳為與其相應抗體或TCR反應，而不與可由其他抗原誘發之許多其他抗體或TCR反應。本文所用之抗原亦可為數個個別抗原之混合物。本文所用之抗原包括但不限於過敏原、自體抗原、不完全抗原、癌症抗原(即腫瘤抗原)與傳染病抗原，以及小有機分子(例如濫用藥物(如菸鹼))及其片段與衍生物。再者，用於本發明之抗原可為胜肽、蛋白質、功能區、碳水化合物、生物鹼、脂質或小分子(例如類固醇激素)及其片段與衍生物、自體抗體及細胞介素本身。

細胞介素之實例包括，但不限於，包含超過30個類型之介白素(IL)(例如IL-1α、IL-1β、IL-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11至-37)；干擾素(IFN)(例如IFN-α、IFN-β與IFN-γ)；腫瘤壞死因子(TNF)(例如TNF-α與TNF-β)；轉變生長因子(TGF)(例如TGF-α與TGF-β)；群落刺激因子(CSF)(例如顆粒細胞-群落刺激因子(G-CSF)、顆粒細胞-巨噬細胞-群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞-群落刺激因子(M-CSF)、紅血球生成素(EPO)、幹細胞因子(SCF)及單核細胞趨化與活化因子(MCAF))；生長因子(GF)(例如表皮生長因子(EGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、類胰島素生長因子(IGF)、神經生長因子(NGF)、大腦衍生神經滋養因子(BDNF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)、角質細胞生長因子(KGF)、血小板生成素(TPO)、與骨形成蛋白(BMP))；及其他多肽因子包括LIF、套組配體(kit ligand，KL)、MPO(髓過氧化酶)與CRP(C-反應蛋白)；COX(環氧合酶)(例如COX-1、COX-2與COX-3)；NOS(一氧化氮合成酶)(例如NOS-1、NOS-2與NOS-3)等。

細胞介素亦包括趨化素，其為誘發趨化性之細胞介素。趨化素有CXC與CC二種主要類型。CXC趨化素(例如嗜中性球活化蛋白-2(NAP-2)與黑色素瘤生長刺激活性蛋白(MGSA))主要係趨化嗜中性球與T淋巴細胞；而CC趨化素(例如RANTES、包括MIP-1α與MIP-1β之巨噬細胞炎性蛋白(MIP)、角質細胞衍生趨化素(KC)、單核細胞趨化蛋白(MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、與MCP-5)與人嗜酸粒細胞親合素(eotaxins)(-1與-2))則趨化其他類型細胞(如巨噬細胞、T淋巴細胞、嗜酸性白血球、嗜中性白血球、樹突細胞、與嗜鹼性白血球)。亦存在未隸屬於任一主要趨化素亞科之淋巴細胞趨化因子-1、淋巴細胞趨化因子-2(皆為C趨化素)、與神經趨化蛋白(fractalkine)(一種CX3C趨化素)等趨化素。

本文所用之「抗原決定位」一詞係意指被B或T淋巴細胞專一地辨識之抗原部分。B淋巴細胞經由產生抗體對外來抗原決定位作出反應，而T-淋巴細胞則為細胞性免疫之媒介者。因此，抗原決定位或抗原決定區係被抗體(或於MHC情形下，被T細胞受體)辨識之抗原之彼等部分。抗原決定位包含一個或多個抗原決定區。

本文所用之「抗體」一詞係指能結合抗原決定區或抗原決定位之分子；該詞意欲包含整個抗體及其抗原結合片段，包括單鏈抗體。此類抗體包括人類抗原結合抗體片段及包括，但不限於，Fab、Fab'與F(ab')2、Fd、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、雙硫鍵連接之Fvs(sdFv)及包含VL或VH功能區之片段。該等抗體可源自任何動物，包括鳥類與哺乳動物。較佳為，該等抗體係源自哺乳動物(例如人類、鼠類、兔、山羊、天竺鼠、駱駝、馬等)，或其他適當動物(例如雞)。本文所用之「人類」抗體包括具有人類免疫球蛋白胺基酸序列之抗體，及包括單離自人類免疫球蛋白庫或自轉殖一種或多種人類免疫球蛋白而不表現內源性免疫球蛋白之動物之抗體，例如，見述於美國專利案第5,939,598號者，該案之揭示內容全部併入本文以資參考。

抗原可為非衍生自病毒(例如，基孔肯雅熱病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒)之物質(例如，蛋白質)。

於一具體實施例中，用於本發明之抗原為如表1中列出之至少一標的或其中之多肽。

於一具體實施例中，用於本發明之抗原為選自由下列者所組成之群組：CTLA-4、PD-1、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27與HVEM之至少一種蛋白質或其中之多肽。CTLA-4、PD-1、TIM-3、BTLA、VISTA與LAG-3係T細胞刺激之抑制受體；CD28、OX40、GITR、CD137、CD27與HVEM則是T細胞刺激之活性受體[參見Mellman et al.,Nature 480,480-489(2011)]。

用於本發明之抗原可為衍生自天然存在蛋白質之經修飾多肽；該經修飾多肽可為天然存在蛋白質之片段。於一具體實施例中，該經修飾多肽與衍生自天然存在蛋白質之多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%之胺基酸序列一致性。於一具體實施例中，衍生之經修飾多肽為以衍生自天然存在蛋白質之多肽為基礎，最多10%胺基酸被刪除、取代及/或添加之突變體。

於本發明提供之粒子中，多肽與抗原可經由存在多肽中之至少一個第一連結位置與存在抗原中之至少一個第二連結位置連接。

本文所用之「第一連結位置」與「第二連結位置」各係指一種以上物質相互連接之位置。

於一具體實施例中，多肽與抗原係直接融合。或者，一個或二個連接子介入抗原N端殘基與多肽之間，及/或抗原C端殘基與多肽之間。

抗原或多肽可被截斷並以短連接子替換。於若干具體實施例中，抗原或多肽包含一個或多個胜肽連接子。典型地，連接子係由2至25個胺基酸組成；通常，其長度為2至15個胺基酸，惟於特定情況下，可僅為一個(例如單一甘胺酸殘基)。

於一具體實施例中，係於宿主細胞中表現核酸分子(其中編碼多肽之多核苷酸與編碼抗原之多核苷酸基因融合)，俾使第一連結位置與第二連結位置經由肽鍵連接。於此情形下，多肽與抗原係經由肽鍵連接。關於此具體實施例，第一連結位置及/或第二連結位置可從原始多肽或抗原進行基因修飾。例如，從多肽修飾第一連結位置，俾使多肽經由包括SG、GS、SGG、GGS與SGSG之連接子胜肽與抗原結合。

當多肽與抗原進行化學結合時，第一連結位置與第二連結位置可經由化學交聯劑(其為化合物)連接。

交聯劑之實例包括，但不限於，SMPH、磺基-MBS、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-SIAB、磺基-SMPB、磺基-SMCC、SVSB、SIA及可自皮爾斯化學公司(Pierce Chemical Company)購得之其他交聯劑。

於一具體實施例中，本發明所提供之粒子包含連接於抗原之多肽，其中抗原之N端殘基與C端殘基間之空間距離，於該距離以該抗原或含該抗原之天然存在蛋白質或其經修飾蛋白質之晶體測定時，為30

以下(本文中之「以上」或「以下」及包含本數)。

用於本發明之抗原可由熟習此項技藝人士設計。例如，用於本發明之抗原可為天然存在之蛋白質或其片段。或者，用於本發明之抗原可為以天然存在蛋白質之經修飾之蛋白質或其片段。熟習此項技藝人士可設計抗原，俾使抗原之N端殘基與C端殘基間之空間距離，於該距離以該抗原或含該抗原之天然存在蛋白質或其經修飾蛋白質之晶體測定時，為30

以下。舉例而言，用於本發明所提供粒子之抗原可使用包括PyMOL(例如，PyMOL v0.99：http：/www.pymol.org)之免費軟體設計。於一具體實施例中，抗原之N端殘基與C端殘基間之空間距離為30

(埃)以下、20

以下、或10

以下(例如，自5

至15

、自5

至12

、自5

至11

、自5

至10

、自5

至8

、自8

至15

、自8

至13

、自8

至12

、自8

至11

、自9

至12

、自9

至11

、自9

至10

或自10

至11

)。類似基孔肯雅熱病毒粒子或類似委內瑞拉馬腦炎病毒粒子

於一具體實施例中，本發明提供包含基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽及至少一種抗原之類似基孔肯雅熱病毒粒子或類似委內瑞拉馬腦炎病毒粒子，其中該基孔肯雅熱病毒結構多肽或該委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽包含至少一個第一連結位置，及該至少一種抗原包含至少一個第二連結位置，且其中該基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽與該至少一種抗原係經由該至少一個第一與該至少一個第二連結位置連接。

於一具體實施例中，抗原之N端殘基與C端殘基間之空間距離，於該距離以該抗原或含該抗原之天然存在蛋白質或其經修飾蛋白質之晶體測定時，為30

以下、25

以下、20

以下、15

以下、14

以下、13

以下、12

以下、11

以下、10

以下、9

以下、或8

以下(例如，自5

至15

、自5

至12

、自5

至11

、自5

至10

、自5

至8

、自8

至15

、自8

至13

、自8

至12

、自8

至11

、自9

至12

、自9

至11

、自9

至11

或自10

至11

)。

於一具體實施例中，該抗原係經由化學交聯連接於基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽，或為經由遺傳工程產生之融合蛋白質。

用於本發明之基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽可包含基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒套膜蛋白及/或殼體。

基孔肯雅熱病毒之實例包括，但不限於，37997與LR2006 OPY-1之病毒株。

委內瑞拉馬腦炎病毒之實例包括，但不限於，TC-83。

用於本發明之基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽可為天然存在之病毒結構多肽或其經修飾多肽。該經修飾多肽可為天然存在病毒結構多肽之片段。於一具體實施例中，經修飾多肽與天然存在之病毒殼體及/或套膜蛋白具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%之胺基酸序列一致性。於一具體實施例中，經修飾多肽為以天然存在之病毒殼體及/或套膜蛋白為基礎，最多10%胺基酸被刪除、取代及/或添加之突變體。舉例而言，K64A或K64N突變可引入用於本發明之委內瑞拉馬腦炎病毒殼體之結構多肽中。

基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒套膜蛋白可包含選自由E3、E2、6K與E1所組成之群組之至少一者。

基孔肯雅熱病毒結構多肽之實例包括，但不限於，基孔肯雅熱病毒株37997之E3-E2-6K-E1、基孔肯雅熱病毒株37997之殼體-E3-E2-6K-E1、基孔肯雅熱病毒株LR2006 OPY-1之E3-E2-6K-E1與基孔肯雅熱病毒株LR2006 OPY-1之殼體-E3-E2-6K-E1。

委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽之實例包括，但不限於，委內瑞拉馬腦炎病毒株TC-83之E3-E2-6K-E1與委內瑞拉馬腦炎病毒株TC-83之殼體-E3-E2-6K-E1。

一種例示性基孔肯雅熱病毒結構多肽序列係以基因庫登錄編號ABX40006.1所提供，其敘述於下(SEQ ID No.：1)：

其他例示性基孔肯雅熱病毒結構多肽序列係以基因庫登錄編號ABX40011.1所提供，其敘述於下(SEQ ID No.：2)：

一種例示性委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽序列係敘述於下(SEQ ID No.：3)：

於一具體實施例中，第一連結位置包含胺基，較佳為離胺酸殘基之胺基。於一具體實施例中，第二連結位置包含巰基，較佳為半胱胺酸之巰基。

於一具體實施例中，兩種以上物質(例如，抗原與基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽)經由第一連結位置或第二連結位置之結合係使用化學交聯劑達成。交聯劑之實例包括，但不限於，SMPH、磺基-MBS、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-SIAB、磺基-SMPB、磺基-SMCC、SVSB、SIA及可自皮爾斯化學公司購得之其他交聯劑。

根據本發明，可提供包含基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽與抗原之基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎類似病毒粒子，其中該基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽與該抗原係呈融合蛋白質表現。

於一具體實施例中，抗原可與基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽之任何位置融合。舉例而言，抗原可直接或間接連接於基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽(例如，殼體、E3、E2、6K或E1)之N或C端；或可插入基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質(例如，殼體、E3、E2、6K或E1)中。

於一具體實施例中，至少一種抗原插入基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質之E2中。舉例而言，就基孔肯雅熱病毒結構蛋白質而言，至少一種抗原插入SEQ ID Nos.1或2之殘基519與520間(即SEQ ID Nos.1或2之519-位置之G與520-位置之Q間)；插入SEQ ID Nos.1或2之殘基530與531間(即SEQ ID Nos.1或2之530-位置之G與531-位置之S間)；插入SEQ ID Nos.1或2之殘基531與532間(即SEQ ID Nos.1或2之531-位置之S與532-位置之N間)；插入SEQ ID Nos.1或2之殘基529與530間(即SEQ ID Nos.1或2之529-位置之G與530-位置之G間)；或插入SEQ ID Nos.1或2之殘基510與511間(即SEQ ID Nos.1或2之510-位置之S與511-位置之G間)；或插入SEQ ID Nos.1或2之殘基511與512間(即SEQ ID Nos.1或2之511-位置之G與512-位置之N間)；或插入SEQ ID Nos.1或2之殘基509與510間(即SEQ ID Nos.1或2之509-位置之Q與510-位置之S間)。

舉例而言，就委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質而言，至少一種抗原插入SEQ ID No.3之殘基517與518間(即SEQ ID No.3之517-位置之G與518-位置之S間)；插入SEQ ID No.3之殘基518與519間(即SEQ ID No.3之518-位置之S與519-位置之S間)；插入SEQ ID No.3之殘基519與520間(即SEQ ID No.3之519-位置之S與520-位置之V間)；插入SEQ ID No.3之殘基515與516間(即SEQ ID No.3之515-位置之L與516-位置之S間)；插入SEQ ID No.3之殘基516與517間(即SEQ ID No.3之516-位置之S與517-位置之G間)；插入SEQ ID No.3之殘基536與537間(即SEQ ID No.3之536-位置之C與537-位置之G間)；插入SEQ ID No.3之殘基537與538間(即SEQ ID No.3之537-位置之G與538-位置之G間)；插入SEQ ID No.3之殘基538與539間(即SEQ ID No.3之538-位置之G與539-位置之T間)。

融合蛋白質可使用此項技藝中習知之技術表現；多種表現系統可用於表現融合蛋白質；例如，融合蛋白質可於293細胞、Sf9細胞或大腸桿菌中表現。

於一具體實施例中，抗原為非衍生自基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之物質(例如，蛋白質)。抗原可為選自包括自體抗原與癌症抗原所組成之組群之至少一者。例如，抗原係衍生自TNF-α、CD20或CTLA4之多肽。因此，用於本發明之多肽與抗原組合之實例包括，但不限於，i)衍生自基孔肯雅熱病毒(CHIKV)之多肽及衍生自TNF-α之多肽；ii)衍生自基孔肯雅熱病毒(CHIKV)之多肽及衍生自CD20之多肽；iii)衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之多肽及衍生自TNF-α之多肽；或iv)衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之多肽及衍生自CD20之多肽；v)衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之多肽及衍生自CTLA4之多肽。

衍生自基孔肯雅熱病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之多肽可為天然存在之病毒多肽或其經修飾多肽。此外，衍生自TNF-α、CD20或CTLA4之多肽可為天然存在之多肽或天然存在多肽之經修飾多肽或天然存在多肽之片段或經修飾胜肽。經修飾多肽可為天然存在之病毒結構多肽之片段。

於一具體實施例中，衍生自TNF-α、CD20或CTLA4之經修飾多肽與天然存在之多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%之胺基酸序列一致性。於一具體實施例中，衍生自TNF-α、CD20或CTLA4之經修飾多肽為以衍生自TNF-α、CD20或CTLA4之天然存在多肽為基礎，最多10%胺基酸被刪除、取代及/或添加之突變體。

當衍生自病毒之多肽與衍生自抗原之多肽結合時，可使用包括SG、GS、SGG、GGS、SGSG與TRGGS之連接子胜肽。衍生自病毒之多肽(下文稱為「PFV」)與衍生自抗原之多肽(下文稱為「PFA」)結合之實例包括，但不限於：PFV-SG-PFA-GS-PFV、PFV-SG-PFA-GGS-PFV、PFV-SSG-PFA-GS-PFV、PFV-SGG-PFA-GGS-PFV、PFV-SGSG-PFA-GS-PFV、與PFA-SGG-PFA-TRGGS-PFV。

於一具體實施例中，本發明提供之類似病毒粒子包含：i)衍生自基孔肯雅熱病毒(CHIKV)多肽與衍生自TNF-α多肽之融合蛋白質，其由SEQ ID No.4所示胺基酸序列組成； ii)衍生自基孔肯雅熱病毒(CHIKV)多肽與衍生自CD20多肽之融合蛋白質，其由SEQ ID No.5所示胺基酸序列組成；iii)衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)多肽與衍生自TNF-α多肽之融合蛋白質，其由SEQ ID No.6所示胺基酸序列組成；或iv)衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)多肽與衍生自CD20多肽之融合蛋白質，其由SEQ ID No.7所示胺基酸序列組成；v)衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)多肽與衍生自CTLA4多肽之融合蛋白質，其由SEQ ID No.8所示胺基酸序列組成。

於一具體實施例中，本發明提供一種包含融合蛋白質之類似病毒粒子，該融合蛋白質係以具有SEQ ID Nos.4至8任一者所示胺基酸序列之融合蛋白質所修飾之。該經修飾之融合蛋白質與具有SEQ ID Nos.4至8任一者所示胺基酸序列之融合蛋白質，可具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%之胺基酸序列一致性。又，該經修飾之融合蛋白質可為以具有SEQ ID Nos.4至8任一者所示胺基酸序列之融合蛋白質為基礎，最多10%胺基酸被刪除、取代及/或添加之突變體。

(2)核苷酸、載體、宿主細胞

於第二態樣中，本發明提供一種核酸分子，其包含編碼如本發明第一態樣所提供之粒子之核苷酸序列。

於一具體實施例中，本發明提供一種核酸分子，其包含編碼如上述之類似基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒粒子之核苷酸序列。

編碼類似基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒粒子之核苷酸序列實例包括，但不限於，編碼基孔肯雅熱病毒株37997之E3-E2-6K-E1之核苷酸序列、編碼基孔肯雅熱病毒株37997之殼體-E3-E2-6K-E1之核苷酸序列、編碼基孔肯雅熱病毒株LR2006 OPY-1之E3-E2-6K-E1之核苷酸序列、編碼基孔肯雅熱病毒株LR2006 OPY-1之殼體-E3-E2-6K-E1之核苷酸序列、編碼委內瑞拉馬腦炎病毒株TC-83之E3-E2-6K-E1之核苷酸序列與編碼委內瑞拉馬腦炎病毒株TC-83之殼體-E3-E2-6K-E1之核苷酸序列。

下文敘述有關基孔肯雅熱病毒編碼E3-E2-6K-E1之核苷酸序列之實例(SEQ ID No.：9)：

下文敘述有關基孔肯雅熱病毒之編碼E3-E2-6K-E1之核苷酸序列之另一實例(SEQ ID No.：10)：

下文敘述有關基孔肯雅熱病毒之編碼殼體-E3-E2-6K-E1之核苷酸序列之實例(SEQ ID No.：11)：

下文敘述有關基孔肯雅熱病毒之編碼殼體-E3-E2-6K-E1之核苷酸序列之另一實例(SEQ ID No.：12)：

於一具體實施例中，本發明提供包含如上述之核酸分子之載體，其中該載體視需要包含可操作地連接於該核酸分子之表現控制序列。

表現控制序列之實例包括，但不限於，啟動子例如CMV啟動子、λ噬菌體PL啟動子、大腸桿菌lac、phoA與tac啟動子、SV40早期與晚期啟動子、及反轉錄病毒LTR之啟動子。

表現載體可由熟習此項技藝人士根據WO/2012/006180(其全部內容併入本文以資參考)製備；可用於表現衍生自基孔肯雅熱病毒(CHIKV)多肽與抗原多肽之融合蛋白質之載體實例包括含有CHIKV VLP多核苷酸(SEQ ID No.28；其對應胺基酸序列由SEQ ID No.：29所示)之VLP_CHI 512載體(SEQ ID No.：23)；及含有CHIKV VLP多核苷酸(SEQ ID No.30；其對應胺基酸序列由SEQ ID No.：31所示)之VLP_CHI 532載體(SEQ ID No.：24)。

表現載體可由熟習此項技藝人士根據US2012/0003266(其全部內容併入本文以資參考)製備；可用於表現衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)多肽與抗原多肽之融合蛋白質之載體實例包括含有VEEV VLP多核苷酸(SEQ ID No.32；其對應胺基酸序列由SEQ ID No.：33所示)之VLP_VEEV VLP 518載體(SEQ ID No.：25)；含有VEEV VLP多核苷酸(SEQ ID No.34；其對應胺基酸序列由SEQ ID No.：35所示)之VLP_VEEV VLP 519載體(SEQ ID No.：26)；及含有VEEV VLP多核苷酸(SEQ ID No.36；其對應胺基酸序列由SEQ ID No.：37所示)之VLP_VEEV VLP 538載體(SEQ ID No.：27)。

於一具體實施例中，本發明提供i)由SEQ ID No.13所示核苷酸序列組成之核酸分子，其編碼衍生自基孔肯雅熱病毒(CHIKV)多肽與衍生自TNF-α多肽之融合蛋白質；ii)由SEQ ID No.14所示核苷酸序列組成之核酸分子，其編碼衍生自基孔肯雅熱病毒(CHIKV)多肽與衍生自CD20多肽之融合蛋白質；iii)由SEQ ID No.15所示核苷酸序列組成之核酸分子，其編碼衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)多肽與衍生自TNF-α多肽之融合蛋白質；iv)由SEQ ID No.16所示核苷酸序列組成之核酸分子，其編碼衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)多肽與衍生自CD20多肽之融合蛋白質；或v)由SEQ ID No.17所示核苷酸序列組成之核酸分子，其編碼衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)多肽與衍生自CTLA4多肽之融合蛋白質。

於一具體實施例中，本發明提供以具有SEQ ID Nos.13至17任一者所示核苷酸序列所修飾之核酸分子。該經修飾之核酸分子與具有SEQ ID Nos.13至17任一者所示核苷酸序列之核酸分子可具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%之核苷酸序列一致性。又，該經修飾之核酸分子可為以具有SEQ ID Nos.13至17任一者所示核苷酸序列之核酸分子為基礎，最多10%胺基酸被刪除、取代及/或添加之突變體。

(3)組成物

於一具體實施例中，本發明提供一種組成物，其包含如上述之類似基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒粒子或如上述之核酸分子。

該組成物可進一步包含醫藥上可接受之載劑及/或佐劑。佐劑之實例包括，但不限於，李畢溶液(Ribi solution)(Sigma Adjuvant system,Sigma-Aldrich)。

本發明之醫藥組成物可包含單一活性成分或二種或多種活性成分，只要彼等不違反本發明之目的即可。舉例而言，細胞介素包括趨化素、細胞介素之抗體如抗TNF抗體[例如，英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)]、抗VEGF抗體[例如，貝伐單抗(bevacizumab)與蘭尼單抗(ranibizumab)]、細胞介素受體拮抗劑(如抗HER2抗體[例如，曲妥珠單抗(Trastuzumab)]、抗EGF受體抗體[例如，西妥昔單抗(Cetuximab)]、抗VEGF適配體[例如，哌加他尼(Pegaptanib)]及免疫調節劑例如環孢靈(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)、烏苯美司(ubenimex)均可用於組合治療。

於多種活性成分組合中，其各自含量可慮及其醫療效果與安全性而適當增加或減少。

本文所用「組合物」一詞意指將二種或多種活性成分呈單一實體或劑量型式同時投予病患，或於無特定時間限制下，二者呈分開之實體同時或相繼投予病患；其中此類給藥較佳為同時於體內提供兩種成分之有效醫療量。

於一具體實施例中，該組成物為包含DNA疫苗之疫苗組成物。於一具體實施例中，本發明所提供之DNA疫苗包含含有寡核苷酸之CpG。

(4)產生抗體之方法、免疫調節之方法、治療自體免疫疾病之方法、於哺乳動物中誘發及/或增強對抗抗原之免疫反應之方法、治療癌症之方法、被動免疫之方法、於巨噬細胞上呈現抗原方法、及產生粒子之方法

本發明第四態樣中產生之抗體可使用習知技術予以人化。因此，於一具體實施例中，本發明第四態樣所提供之方法進一步包括使非人類哺乳動物產生之抗體人化之步驟。

本發明第一態樣所提供之粒子及/或本發明第二態樣所提供之核酸分子可直接投予病患、進入受影響器官或全身，或於體外施用於衍生自病患或人類細胞株之細胞，隨後將其投予病患；或活體外用於從衍生自病患之免疫細胞(例如B細胞與T細胞)挑選亞族群，然後將其再投予病患。

根據本發明，類似病毒粒子可應用於免疫療法。

於一具體實施例中，本發明提供產生抗體之方法，該方法包括使如上述之類似基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒粒子及/或如上述之核酸分子與哺乳動物接觸。產生之抗體可為能專一地結合至類似基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒粒子中所含之抗原或由該核酸分子編碼之抗原之抗體。本發明所提供之抗體生產方法可為產生對抗抗原(例如TNF-α、CD20與CLTA4)之單株或多株抗體之有用方法。

於一具體實施例中，根據本發明之生產抗體方法得到之抗體可用於被動免疫。被動免疫之方法包括將所得抗體投予哺乳動物。

根據本發明，本發明之組成物可用於免疫調節；特別是，該免疫調節係用於治療自體免疫疾病、神經性疾病、炎性疾病例如炎性肺疾(包括急性呼吸窘迫症候群、慢性阻塞性肺部疾病與氣喘)、血管生成關聯疾病(包括腫瘤)。

於一較佳具體實施例中，本發明所提供之免疫調節係於哺乳動物中誘發及/或增強對抗抗原之免疫反應。因此，於一具體實施例中，本發明提供於哺乳動物中誘發及/或增強對抗抗原之免疫反應之方法，該方法包括投予哺乳動物有效量之如上述之組成物。哺乳動物之實例包括，但不限於，人類。

由於許多抗體係用於治療疾病，因此本發明所提供之方法及組成物可用於疾病之治療。舉例而言，如表1中所列之專一地結合標的物之抗體，或如表1中所列之結合標靶上抗原決定區之抗體，係用於治療如表1中所列之疾病。

於一具體實施例中，用於本發明之至少一種抗原係如表1中所列之至少一種標的物。當用於本發明之至少一種抗原係如表1中所列之至少一種標的物時，則本發明所提供之粒子、單離核酸、載體、組成物及方法可用於治療如表1中所列之疾病或症狀(參見表1之「用途」)。

舉例而言，當用於本發明之至少一種抗原係一種或多種癌症抗原時，本發明所提供之粒子、單離核酸、載體、組成物及方法可用於治療癌症。

癌症抗原之實例包括，但不限於，VEGF、表皮生長因子受體、CD33、CD20與ErbB2。將包含二種或多種癌症抗原之本發明組成物投予哺乳動物時，針對該二種或多種癌症抗原之抗體會攻擊該癌症。

舉例而言，當用於本發明之至少一種抗原係類澱粉蛋白β時，本發明所提供之單離核酸、載體、組成物及方法可用於治療阿茲海默症。

舉例而言，當用於本發明之至少一種抗原係TNF-α時，本發明所提供之單離核酸、載體、組成物及方法可用於治療炎症；自體免疫疾病(包括類風濕性關節炎)；牛皮癬、克隆氏症；潰瘍性結腸炎等。

舉例而言，當用於本發明之至少一種抗原係CD20時，本發明所提供之單離核酸、載體、組成物及方法可用於治療自體免疫疾病(包括類風濕性關節炎與SLE)；癌症(包括非霍奇金氏淋巴瘤等)。

舉例而言，當用於本發明之至少一種抗原係CTLA4時，本發明所提供之單離核酸、載體、組成物及方法可用於治療癌症(包括黑色素瘤)；及用於活化T細胞等。

給定被基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎連同基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎之異常巨大分子感染之病患症狀，此VLP可有效且高效地對準巨噬細胞及其組成物例如細胞介素與免疫調節化合物。

於一態樣中，本發明提供於巨噬細胞上呈現抗原之方法，該方法包括投予哺乳動物如上述之類似基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒粒子及/或如上述之核酸分子。本發明所提供之類似基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒粒子可良好地對準巨噬細胞。於一具體實施例中，本發明所提供之類似基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒粒子係為包含於類似基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒粒子中之至少一種抗原，其係針對巨噬細胞之一種傳送系統。

於一具體實施例中，本發明提供產生本發明第一態樣所提供之類似基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒粒子之方法，該方法包括製備包含編碼該粒子之核苷酸序列之基因、培養以該基因轉染之細胞以表現該粒子、及回收該粒子。於此具體實施例中，可使用習知方法進行轉染；用於轉染之細胞可為293細胞；回收VLP可包括以包含基因之質體轉染細胞後，收集條件培養液，及可進一步包括使用超速離心從條件培養液純化VLP。於一具體實施例中，進一步之步驟可包括在用於產生本發明第八態樣所提供類似基孔肯雅熱病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒粒子之方法，其中編碼抗原之多核苷酸係經設計，俾使該抗原之N端殘基與C端殘基間之空間距離，於該距離以該抗原或含該抗原之天然存在蛋白質或其經修飾蛋白質之晶體測定時，為30

以下(例如，自5

至15

、自5

至12

、自5

至11

、自5

至10

、自5

至8

、自8

至15

、自8

至13

、自8

至12

、自8

至11

、自9

至12

、自9

至11

、自9

至10

、或自10

至11

)。

免疫系統演變至辨識外來抗原以殺滅例如病毒或細菌之病原體；亦演變至不辨識自體蛋白質以保護自體蛋白質；此稱為免疫耐受系統。因此，以傳統免疫方法難以誘發對抗自體抗原之抗體。為了克服此免疫耐受性，發明人等使用含自體抗原之自組裝之次單元，開發新穎之疫苗方法。該自組裝次單元自發地組裝，且形成於表面呈現高度重複抗原之穩定有組織之單元。高度重複抗原之免疫原增強B細胞中之訊息路徑，導致抗體反應之刺激超過例如傳統免疫方法之單一抗原免疫原。應用此機制於疫苗之開發，不僅增強對抗標的免疫原之抗體反應，亦克服自體抗原之耐受性。

茲參照下述實施例詳細說明本發明，然而，不擬對本發明之範圍構成侷限。

實施例

(1)包含病毒結構多肽與人類TNF-α片段之類似基孔肯雅熱病毒粒子之製備

由於發現天然條件下之TNF-α為三聚體，預期將基孔肯雅熱病毒結構多肽與TNF-α多肽融合之單體難以被穩定地表現。然而，使用融合蛋白質(其中TNF-α單體胜肽(TNF-α單體胜肽之片段)經由TNF-α衍生胜肽之N端及C端之連接子與基孔肯雅熱病毒結構多肽融合)，使TNF-α衍生胜肽連接於基孔肯雅熱病毒結構多肽，將導致包含病毒結構多肽與TNF-α單體衍生胜肽之類似基孔肯雅熱病毒粒子之穩定表現。

詳言之，修飾編碼原始人類TNF-α之多核苷酸，以製備編碼經修飾之TNF-α衍生胜肽(其中原始TNF-α衍生胜肽N端序列之RTPSD以SGG置換，並使TRGGS連接於TNF-α之C端)之多核苷酸(參見第1圖所示之SEQ ID Nos.18至20)。將得到之多核苷酸插入編碼SEQ ID No.2之519-位置G與520-位置Q之密碼子間，以建構用於表現類似基孔肯雅熱病毒粒子之質體(下文稱為CHIKV-TNFa4)，其中該經修飾之TNF-α衍生胜肽係插入基孔肯雅熱病毒結構多肽(C-E3-E2-6K-E1)之E2中。接著，以250μg CHIKV-TNFa4轉染293F細胞(1.5x10⁶個細胞/ml)。培養4天後，收集上清液。將得到之上清液覆蓋於Opti Prep(Sigma D1556)上，隨後使用SW28轉子，超速離心(20000rpm，120分鐘)以濃縮VLP(即，類似病毒粒子)。使濃縮之VLP與Opti Prep混合以形成密度梯度，隨後使用NVT100轉子超速離心(75000rpm，4小時)。超速離心後，收集純化之VLP。使用CHIVK專一性抗體(ATCC：VR-1241AF)及TNF-α專一性抗體(Cell Signal：#6945)，以西方墨漬法確認包含與基孔肯雅熱病毒結構多肽結合的TNF-α之VLP之表現。

該TNF-α衍生胜肽之N端殘基與C端殘基間之空間距離，於該距離以TNF-α之晶體測定時，為8.27

。

(2)包含病毒結構多肽與人類TNF-α衍生胜肽之類似委內瑞拉馬腦炎病毒粒子(稱為「VEEV-TNFa VLPs」)之製備

根據上述(1)，製備與編碼委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽之多核苷酸融合之編碼經修飾TNF-α衍生胜肽之多核苷酸(參見SEQ ID No.15)，以建構表現載體，隨後轉染入293F細胞中。

利用密度梯度離心純化VEEV-TNFa VLPs。如第4道所示，分別使用TNFa單株抗體(上圖)與VEEV多株抗體(下圖)，以西方墨漬法確認TNF-α衍生胜肽與VEEV之表現(參見第2圖)。

。

(3)抗人類TNF-α抗體於免疫小鼠中之檢測

將小鼠分成3組(每組5隻)。肌內投予各組小鼠根據上述(1)製備之包含病毒結構多肽與人類TNF-α衍生多肽之類似基孔肯雅熱病毒粒子(以下稱為「CHIKV-TNF-α」)；不含人類TNF-α衍生多肽之類似基孔肯雅熱病毒粒子(以下稱為「CHIKV-VLP」)；根據上述(2)製備之包含病毒結構多肽與人類TNF-α衍生多肽之類似委內瑞拉馬腦炎病毒粒子(以下稱「VEEV-TNF-α」)；不包含人類TNF-α衍生多肽之類似委內瑞拉馬腦炎病毒粒子(以下稱「VEEV-VLP」)或載劑(即，PBS)。於實驗開始時(以下稱)及第一次投予之3週後(以下稱「3週」)，如下述進行小鼠之投藥：第1組：VEEV-TNF-α(0週)、CHIKV-TNF-α(3週)；第2組：VEEV-VLP(0週)、CHIKV-VLP(3週)；及第3組：PBS(0週)、PBS(3週)。

於實驗開始之6週後，從各小鼠取得血液樣品並製備血清。使用塗覆TNF-α蛋白質之ELISA盤，以ELISA檢測產生之抗人類TNF-α抗體。結果顯示，包含病毒結構多肽與人類TNF-α衍生多肽之類似病毒粒子於小鼠中誘發抗人類TNF-α抗體(參見第9圖)。

(4)包含病毒結構多肽與人類CD20片段之類似委內瑞拉馬腦炎病毒粒子之製備

根據上述(1)及(2)，利用密度梯度離心純化VEEV-CD20 VLPs，藉由西方墨漬法確認CD20片段與VEEV之表現。使用CD20片段，IYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ(SEQ ID No.：21)，作為與委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽融合之抗原。

該CD20片段之N端殘基與C端殘基間之空間距離，於該距離以CD20之晶體測定時，為10.07

。

(5)包含病毒結構多肽與人類CTLA4片段之類似委內瑞拉馬腦炎病毒粒子之製備

根據全長CTLA4胺基酸序列選擇CTLA4：CKVELMYPPPYYLGIG(SEQ ID No.：22)片段，俾使融合於委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽E2中之該片段之N端殘基與C端殘基間之空間距離，於該距離以CLTA4之晶體測定時，為約5.6

。

將編碼該CTLA4片段之多核苷酸引入VLP_VEEV VLP 518載體中，以建構用於表現與由SEQ ID No.：8胺基酸序列組成之委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽融合之該CTLA4片段之質體。

(6)包含病毒結構多肽與全長人類CTLA4之類似委內瑞拉馬腦炎病毒粒子之製備

將編碼全長人類CTLA4之多核苷酸引入VLP_VEEV VLP 518載體中，以建構用於表現與委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽融合之CTLA4之質體。

該全長人類CTLA4之N端殘基與C端殘基間之空間距離，於該距離以CLTA4之晶體測定時，為約39.6

。

以製備之質體轉染293細胞後，利用ELISA無法檢測出與委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽融合之CTLA4 之表現。

(7)包含病毒結構多肽與人類或小鼠CD20片段之類似基孔肯雅熱病毒粒子之製備及抗人類或小鼠CD20抗體之檢測

使用VLP_CHI 532載體與人類或小鼠TNF-α抗體之片段製備包含病毒結構多肽與人類或小鼠CD20片段之類似基孔肯雅熱病毒粒子。該人類與小鼠TNF-α抗體之片段如下述：人類CD20：iyncepanpseknspstqycysiq(SEQ ID No.：21)；小鼠CD20：ydcepsnsseknspstqycnsi(SEQ ID No.：41)。

如下述使用連接子(例如，SGG、SG、GS或GGS)將該CD20片段插入SEQ ID No.2之519-位置G與520-位置Q間：人類CD20：SGGiyncepanpseknspstqycysiqGS(SEQ ID No.：42)；小鼠CD20版本2：SGydcepsnsseknspstqycnsiGGS(SEQ ID No.：43)；小鼠CD20版本3：SGGydcepsnsseknspstqycnsiGS(SEQ ID No.：44)。

使用質體VLP_CHI VLP 532 CD20H、VLP_CHI VLP 532 CD20-2小鼠與VLP_CHI VLP 532 CD20-3小鼠，以表現包含病毒結構多肽與人類或小鼠CD20片段之類似基孔肯雅熱病毒粒子(SEQ ID No.：45(所表現多肽之胺基酸序列如SEQ ID No.：46所示)、SEQ ID No.：47(所表現多肽之胺基酸序列如SEQ ID No.：48所示)與SEQ ID No.：49(所表現多肽之胺基酸序列如SEQ ID No.：50所示)]。

根據如(1)中所述方法純化該等類似病毒粒子。以100μg純化之VLPs；100μg人類或小鼠CD20片段；或PBS(控制組)免疫處理小鼠一次。免疫後之10天，從小鼠取得血液樣品並製備血清。藉由塗覆人類CD20片段之ELISA，檢測免疫反應所誘發之抗人類CD20抗體；及藉由塗覆小鼠CD20片段之ELISA，檢測免疫反應所誘發之抗小鼠CD20抗體。結果顯示，經由投予包含與病毒結構多肽融合之人類或小鼠CD20片段之類似基孔肯雅熱病毒粒子，充分誘發抗人類CD20抗體與抗小鼠CD20抗體。結果亦顯示，經由投予包含與病毒結構多肽融合之自體抗原片段之類似基孔肯雅熱病毒粒子，充分誘發專一於自體抗原之抗體(參見第10圖與第11圖)。

<110> VLP醫療股份有限公司(VLP THERAPEUTICS,LLC)

<120> 類似病毒粒子組成物(VIRUS LIKE PARTICLE COMPOSITION)

<130> 671358

<150> US61/599,746

<151> 2012-02-16

<160> 50

<170> Patentln version 3.5

<210> 1

<211> 1248

<212> PRT

<213> 病毒

<400> 1

<210> 2

<211> 1248

<212> PRT

<213> 病毒

<400> 2

<210> 3

<211> 1255

<212> PRT

<213> 病毒

<400> 3

<210> 4

<211> 1405

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV+TNFalpha

<400> 4

<210> 5

<211> 1276

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV+CD20

<400> 5

<210> 6

<211> 1410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV+TNFalpha

<400> 6

<210> 7

<211> 1284

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV+CD20

<400> 7

<210> 8

<211> 1279

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV+CTLA4

<400> 8

<210> 9

<211> 2964

<212> DNA

<213> 病毒

<400> 9

<210> 10

<211> 2964

<212> DNA

<213> 病毒

<400> 10

<210> 11

<211> 3747

<212> DNA

<213> 病毒

<400> 11

<210> 12

<211> 3747

<212> DNA

<213> 病毒

<400> 12

<210> 13

<211> 4215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV+TNFalpha

<400> 13

<210> 14

<211> 3825

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV+CD20

<400> 14

<210> 15

<211> 4230

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV+TNFalpha

<400> 15

<210> 16

<211> 3852

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV+CD20

<400> 16

<210> 17

<211> 3837

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV+CTLA4

<400> 17

<210> 18

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNFalpha

<400> 18

<210> 19

<211> 155

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TNFalpha

<400> 19

<210> 20

<211> 465

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TNFalpha

<400> 20

<210> 21

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20

<400> 21

<210> 22

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CTLA4

<400> 22

<210> 23

<211> 8404

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_CHI512載體

<400> 23

<210> 24

<211> 8410

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_CHI 532載體

<400> 24

<210> 25

<211> 8431

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_VEEV VLP 518載體

<400> 25

<210> 26

<211> 8431

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_VEEV VLP 519載體

<400> 26

<210> 27

<211> 8431

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_VEEV VLP 538載體

<400> 27

<210> 28

<211> 3750

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_CHI 512載體-CHIKV VLP

<400> 28

<210> 29

<211> 1250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_CHI 512載體-CHIKV VLP

<400> 29

1250

<210> 30

<211> 3756

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_CHI 532載體-CHIKV VLP

<400> 30

<210> 31

<211> 1252

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_CHI 532載體-CHIKV VLP

<400> 31

<210> 32

<211> 3777

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_VEEV VLP 518載體-VEEV VLP

<400> 32

<210> 33

<211> 1259

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_VEEV VLP 518載體-VEEV VLP

<400> 33

<210> 34

<211> 3777

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_VEEV VLP 519載體-VEEV VLP

<400> 34

<210> 35

<211> 1259

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_VEEV VLP 519載體-VEEV VLP

<400> 35

<210> 36

<211> 3777

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_VEEV VLP 538載體-VEEV VLP

<400> 36

<210> 37

<211> 1259

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_VEEV VLP 538載體-VEEV VLP

<400> 37

<210> 38

<211> 8416

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_CHI 520載體

<400> 38

<210> 39

<211> 3762

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_CHI 520載體

<400> 39

<210> 40

<211> 1254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_CHI 520載體

<400> 40

<210> 41

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20

<400> 41

<210> 42

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20+連接子

<400> 42

<210> 43

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20+連接子

<400> 43

<210> 44

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD20+連接子

<400> 44

<210> 45

<211> 3828

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_CHI VLP 532 CD20H

<400> 45

<210> 46

<211> 1276

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_CHI VLP 532 CD20H

<400> 46

<210> 47

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_CHI VLP 532 CD20-2小鼠

<400> 47

<210> 48

<211> 1274

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_CHI VLP 532 CD20-2小鼠

<400> 48

<210> 49

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_CHI VLP 532 CD20-3小鼠

<400> 49

<210> 50

<211> 1274

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VLP_CHI VLP 532 CD20-3小鼠

<400> 50

本案圖式不足以代表本案之所有特徵，故本案無指定代表圖。

Claims

一種類似病毒粒子，其包含病毒結構多肽及至少一種外來抗原，其特徵為該病毒結構多肽為基孔肯雅熱病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的天然存在之病毒結構多肽或經修飾多肽，且該至少一種外來抗原係與基孔肯雅熱病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的套膜蛋白融合，其中該至少一種外來抗原非為自衍生該病毒結構多肽的病毒所衍生的蛋白質。
如申請專利範圍第1項所述之類似病毒粒子，其中該外來抗原之N端殘基與C端殘基間之空間距離為30Å或以下，其中該空間距離係以該抗原或含該抗原之天然存在之蛋白質或其經修飾蛋白質之晶體測定者。
如申請專利範圍第1項所述之類似病毒粒子，其中該多肽係包含殼體及套膜蛋白E3、E2、6K與E1之病毒結構多肽。
如申請專利範圍第3項所述之類似病毒粒子，其中該至少一種外來抗原係插入該套膜蛋白之E2中。
如申請專利範圍第4項所述之類似病毒粒子，其中該至少一種外來抗原及該多肽係表現為融合蛋白。
如申請專利範圍第5項所述之類似病毒粒子，其中該至少一種外來抗原與該多肽融合，其中，一個或二個連接子介入該外來抗原之N端殘基與該多肽之間，及/或該外來抗原之C端殘基與該多肽之間。
如申請專利範圍第1項所述之類似病毒粒子，其中該類似病毒粒子包含被插入套膜蛋白E2中以形成融合蛋白的至少一種外來抗原，其中該至少一種外來抗原係被插入基孔肯雅熱病毒(CHIKV)的套膜蛋白E2內之對應於SEQ ID Nos.1或2之殘基509至512、殘基519至520、或殘基529至533之位置的區域；或者是，該至少一種外來抗原係被插入委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的套膜蛋白E2內之對應於SEQ ID No.3之殘基515至520、殘基536至539之位置的區域。
如申請專利範圍第7項所述之類似病毒粒子，其中該至少一種外來抗原係被插入包括有SEQ ID Nos.1或2之胺基酸序列的基孔肯雅熱病毒(CHIKV)的套膜蛋白E2，且係被插入SEQ ID Nos.1或2之殘基519與520之間、SEQ ID Nos.1或2之殘基530與531之間、SEQ ID Nos.1或2之殘基531與532之間、或SEQ ID Nos.1或2之殘基532與533之間。
如申請專利範圍第7項所述之類似病毒粒子，其中該至少一種外來抗原係被插入包含有SEQ ID Nos.1或2之胺基酸序列之基孔肯雅熱病毒(CHIKV)的套膜蛋白E2中，且該至少一種外來抗原係被插入SEQ ID Nos.1或2之殘基519與520之間、SEQ ID Nos.1或2之殘基529與530之間、SEQ ID Nos.1或2之殘基530與531之間、SEQ ID Nos.1或2之殘基531與532之間、SEQ ID Nos.1或2之殘基532與533之間、SEQ ID Nos.1或2 之殘基509與510之間、SEQ ID Nos.1或2之殘基510與511之間、或SEQ ID Nos.1或2之殘基511與512之間。
如申請專利範圍第7項所述之類似病毒粒子，其中該至少一種外來抗原係被插入包含有SEQ ID No.3胺基酸序列之委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的套膜蛋白E2，且該至少一種外來抗原係被插入SEQ ID No.3之殘基515與516之間、SEQ ID No.3之殘基516與517之間、SEQ ID No.3之殘基517與518之間、SEQ ID No.3之殘基518與519之間、SEQ ID No.3之殘基519與520之間、SEQ ID No.3之殘基536與537之間、SEQ ID No.3之殘基537與538之間、或SEQ ID No.3之殘基538與539之間。
如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之類似病毒粒子，其特徵為該至少一種外來抗原係自體抗原或癌症抗原。
如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之類似病毒粒子，其中該至少一種外來抗原係TNF-α、CD20或CTLA4之多肽。
如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之類似病毒粒子，其中該類似病毒粒子係選自由下述者所組成群組者：i)一種類似基孔肯雅熱病毒(CHIKV)粒子，其中至少一種外來抗原係TNF-α； ii)一種類似基孔肯雅熱病毒(CHIKV)粒子，其中至少一種外來抗原係CD20；iii)一種類似委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)粒子，其中至少一種外來抗原係TNF-α；或iv)一種類似委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)粒子，其中至少一種外來抗原係CD20；以及v)一種類似委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)粒子，其中至少一種外來抗原係CTLA4。
如申請專利範圍第1、7至10項中任一項所述之類似病毒粒子，其中該融合蛋白係由SEQ ID Nos.4、5、6、7或8所示胺基酸序列組成之蛋白質。
如申請專利範圍第1、7至10項中任一項所述之類似病毒粒子，其中該融合蛋白係衍生自與SEQ ID Nos.4、5、6、7或8所示胺基酸序列具有90%以上序列一致性之胺基酸序列所組成之蛋白質。
一種組成物，其特徵為包含申請專利範圍第1至15項中任一項所述之類似病毒粒子。
一種醫藥組成物，其特徵為包含：a)申請專利範圍第1至15項中任一項所述之類似病毒粒子；及b)醫藥上可接受之載劑。
一種疫苗組成物，其特徵為包含申請專利範圍第1至15項中任一項所述之類似病毒粒子。
如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之類似病毒粒子，其係用於製造對抗該外來抗原的抗體。
如申請專利範圍第19項所述之類似病毒粒子，其中該抗體係單株抗體。
一種申請專利範圍第1至15項中任一項所述之類似病毒粒子之用途，該用途係用於製造使用於哺乳動物對象之免疫調節的藥物。
一種申請專利範圍第1至15項中任一項所述之類似病毒粒子之用途，該用途之特徵為用於製備使用於自體免疫疾病治療之藥物。
一種申請專利範圍第1至15項中任一項所述之類似病毒粒子之用途，該用途之特徵為用於製備使用於癌症治療之藥物。