KR101875055B1

KR101875055B1 - 융합 단백질 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101875055B1
Application number: KR1020160135596A
Authority: KR
Inventors: 홍민선; 전보영; 김명일
Original assignee: 연세대학교 원주산학협력단
Priority date: 2016-10-19
Filing date: 2016-10-19
Publication date: 2018-07-06
Also published as: KR20180042958A

Abstract

본 발명은 치쿤구니야 바이러스 항원 단백질 및 톨-유사수용체 5(Toll like receptor 5)자극 단백질인 플라젤린 융합 단백질에 관한 것으로, 본 발명에 따른 상기 융합 단백질은 치쿤구니야 바이러스 항원 단백질 단독으로 접종된 경우에 비하여, 백신을 통한 면역 유도 과정에서 현저한 시너지 효과를 발휘할 수 있다.

Description

융합 단백질 및 그의 용도{FUSION PROTEIN AND USE THEREOF}

본 발명은 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 항원 단백질 및 톨-유사수용체 5 (Toll-like receptor 5) 자극 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 그의 용도에 관한 것이다.

치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus)는 토가비리데과(family Togaviridae), 알파바이러스속(genus Alphavirus)에 속하는 직경 60 내지 70nm (+)ssRNA 바이러스로, 감염된 열대숲모기(Aedes aegypti)나 흰줄숲모기(Aedes albopictus, Tiger mosquito)를 매개로 하여 전파되는 급성열성질환인 치쿤구니야 열병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 상기 치쿤구니야 바이러스가 감염되는 경우 10~15%는 무증상을 보이지만, 나머지 감염자는 1 ~ 12일의 잠복기를 거쳐 갑작스러운 고열, 간헐적 오한, 두통, 구역질, 구토, 극심한 관절통, 점상출혈발진 및 구진발진 등의 증세를 보이며, 39~40℃에 이르는 고열은 수일 동안 지속되는 것으로 보고되어 있다. 특히, 관절통의 경우 감염자의 30~40%가 수년간 지속되는 만성질환으로 나타날 수 있을 뿐만 아니라, 신생아의 경우 뇌수막염으로까지 이어질 수 있는 질병원으로 알려져 있다.

상기 치쿤구니야 바이러스는 감염 후 면역력을 가지는 경우 재감염 확률이 매우 낮지만, 현재까지 치쿤구니야 바이러스에 대한 예방 백신 또는 치료제가 존재하지 않아 그 필요성이 절실한 실정이다.

한편, 편모(flagella)는 세균의 운동성을 결정하는 중요한 구성요소이며 크게 후크(hook), 기저체(basal body) 및 필라멘트(filament)로 구성되어 있다. 편모는 세균의 유영 혹은 유주운동(swarming motility), 세균의 주성(taxis)을 결정하고, 바이오 필름(biofilm)을 형성하여, 병원성 미생물의 부착능을 결정하는 기능이 있다고 알려져 있다. 편모의 필라멘트를 구성하는 구성 단위 단백질을 플라젤린(flagellin)이라 하며, 플라젤린이 규칙적으로 조합되어(assembling) 필라멘트를 형성한다. 편모를 갖는 그람 음성 및 그람 양성 세균의 플라젤린은 TLR5(toll like receptor 5)를 자극하여 NF-kB를 활성화 시킨다고 보고 되어 있다(Hayashi F, Smith KD, Ozinsky A, Hawn TR, Yi EC, Goodlett DR, Eng JK, Akira S, Underhill DM, Aderem A: Nature 410:1099-1103, 2001). 상기 TLR5는 패턴인식수용체(PRP: pattern recognition receptor)로 병원체와 관련된 분자구조를 인식하는 수용체에 해당하는 것으로 알려져 있으며, 선천성 면역반응(Innate immune response)을 유도하고 나아가 획득 면역 반응(adaptive immune reseponse)을 적극 지원 및 조절하는 것으로 알려져 있다.

현재 백신 보조제로 사용되고 있거나 사용이 고려되고 있는 것으로는 1) 수산화 알루미늄 젤 등과 같은 미네랄염(mineral salt), 2) 계면활성 물질, 3) 세균 유래 물질, 4) 사이토카인 혹은 호르몬, 6) 다가음이온(polyanion), 7) 폴리아크릴(polyacryl), 8) 담체(carrier), 9) 바이러스를 이용한 생 벡터(living vector), 및 10) 미네랄 오일(mineral oil)이나 리포좀(liposome)과 같은 운반제(vehicle) 등이 있다. 그러나 백신 보조제는 외독소에 해당하여 원치않는 면역 반응의 자극으로 부작용의 염려가 크기 때문에 독성을 없애거나 최소화 시키려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 점을 고려할 때, 상기 플라젤린이 백신 보조제 개발에 적합한 표적이 될 수 있어, 그 개발 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다.

본 발명의 일 목적은 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus)의 항원 단백질 및 톨-유사수용체 5(Toll like receptor 5) 자극 단백질이 융합된 융합 단백질 및 그를 발현하는 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus)용 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명자들은 연구 결과, 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus)의 항원 단백질 및 톨-유사수용체 5(Toll like receptor 5) 자극 단백질인 플라젤린(flagellin)을 융합 단백질로 제작하여 목적하는 개체에 접종하는 경우, 치쿤구니야 외피 단백질 단독으로 접종하는 경우에 비해, 플라젤린이 톨-유사수용체 5를 자극하여 면역 활성을 유도하여 백신보조제로서 작용하는 경우 치쿤구니야 외피 단백질에 대한 항체가 동량의 백신 투여 시 보다 높게 형성되었을 뿐만 아니라, 상기 외피 단백질에 백신보조제인 수화된 알루미늄 포타슘 설페이트(Alum)를 추가로 사용하는 경우에 비해 상기 융합 단백질에서 증폭된 항체를 형성하였고, 보다 소량의 단백질 항원을 이용하여 백신으로 사용 할 수 있음을 확인해 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 일 구현 예에서는 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 항원 단백질의 일측에 톨-유사수용체 5(Toll like receptor 5) 자극 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

단, 본 발명에 있어서 상기 “톨-유사수용체 5(Toll like receptor 5)”이란 대표적인 패턴인식수용체(Pattern Recognition Receptor)로서 병원체에 존재하여 병원체와 관련된 특이 분자구조를 인식하는 수용체 중 하나이며, 숙주세포의 세포 표면 혹은 세포질 내 분포하고 다양한 자극에 의해 선천성 면역 반응을 유도할 뿐만 아니라 획득 면역 반응을 조절하므로 백신 보조제로 사용될 수 있는 것을 의미한다. 바람직하게는, 상기 톨-유사수용체 5 자극 단백질은 플라젤린(flagellin)일 수 있으나, 패턴인식수용체에 결합하여 외부 항원으로 인식된 뒤, 면역 반응을 유도할 수 있는 것이라면 이에 제한되지 아니하고 포함될 수 있다.

본 발명에서 상기 플라젤린은 편모성 세균이 감염된 경우에 감염된 숙주 내에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 보다 구체적으로 인체의 세포막 표면에 존재하는 톨-유사수용체 5(TLR5; Toll like receptor 5)는 상기 플라젤린과 상호작용을 통하여 세포 내 신호 전달을 유발하고, 이를 통하여 전사인자인 NF-kB의 발현이 증가되어 선천성면역신호 활성화를 유도할 뿐만 아니라, 획득 면역 반응을 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 항원 단백질의 일측에 플라젤린(flagellin)이 결합된 융합 단백질은 치쿤구니야 바이러스 항원 단백질 단독으로 접종된 경우에 비하여, 백신을 통한 면역 유도 과정에서 현저한 시너지 효과를 발휘할 수 있다.

단, 본 발명에 있어서 상기 “융합 단백질”이란, 두 개 이상 단백질의 융합으로 생성된 단백질을 의미하며, 유전자 재조합 방법을 통해 생산할 수 있다. 상기 유전자 재조합 방법에 의해 생산된 재조합 유전자를 숙주세포에 형질전환(transformation)시키는 방법으로 융합 단백질의 발현을 유도할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상 상기 융합 단백질은 치쿤구니야 바이러스 항원 단백질 및 톨-유사수용체 5 자극 단백질, 특히 플라젤린이 유전자 재조합 방법에 의해 제조된 재조합 유전자를 숙주세포에서 발현시켜서 얻은 융합 단백질 일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 치쿤구니야 바이러스 항원 단백질은 치쿤구니야 바이러스 외피 항원 단백질 일 수 있다. 상기 치쿤구니야 바이러스 외피 항원 단백질은 핵산과 함께 바이러스의 입자를 구성하는 단백질로, 일반적으로 바이러스 항원으로서의 특이성을 나타낸다.

본 발명에서 상기 치쿤구니야 바이러스는 E1, E2, E3 및 6K 외피 항원 단백질을 갖고 있으며, 바람직하게는 본 발명의 목적상 상기 치쿤구니야 바이러스 외피 항원 단백질은 E2 외피 항원 단백질 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 E2 외피 항원 단백질은 서열번호 1로 표시되는 단백질 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 상기 플라젤린(flagellin)은 살모넬라 속 또는 바실러스 속 세균의 플라젤린(flagellin)일 수 있다. 바람직하게 상기 플라젤린은 바실러스 속 세균에서 유래된 플라젤린일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 상기 세균은 살모넬라 더블린(salmonella dublin) 또는 바실러스 시리우스(Bacillus cereus ) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 상기 “플라젤린(flagellin)”이란, 세균의 운동성을 제공하는 편모(flagella)를 구성하는 주요 단백질로, 편모성 세균에 가장 풍부하게 존재하는 단백질에 해당한다. 상기 플라젤린은 일반적으로 2~4의 도메인으로 구성되어 있을 수 있으며, 상기 도메인은 편모성 세균에 2개의 보존 도메인 D0 및 D1과, 길이 및 존재 유무가 다양한 다변화 도메인 D2 및 D3로 구성될 수 있다. 본 발명의 목적상 본 발명의 상기 플라젤린은 D0 및 D1 도메인 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 플라젤린 단백질은 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 상기 바실러스 유래 플라젤린은 D0 및 D1 도메인만으로 구성되어 있어, 톨-유사수용체 5의 활성화를 위한 필수 부위만이 존재한다는 장점이 존재한다. 이를 통하여, 플라젤린에 의한 선천성면역반응을 선택적으로 활성화시키고, 다른 도메인이 항원으로 작용하여 발생하는 원치 않는 면역 반응을 최소화 할 수 있다.

본 발명의 일 구체 예에서는 본 발명에 따른 상기 융합 단백질의 일측에 히스티딘-표지(Histidine-tag)가 결합되어 있을 수 있다. 히스티딘-표지가 결합되는 경우에는 형질전환에 의해 숙주세포에서 발현이 유도된 이후 숙주 세포에서 목적하는 단백질을 빠르게 정제할 수 있을 뿐만 아니라, 정제된 단백질의 순도를 높일 수 있다는 장점이 존재한다.

본 발명의 다른 구현 예에서는 본 발명에 따른 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

단, 본 발명에서 상기 “폴리뉴클레오티드”란, 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬 모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명에 따른 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy), 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 융합 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 상기 변형 유전자 역시 본 발명의 보호범위 내에 포함된다.

본 발명의 또 다른 구현 예에서는 본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 바람직하게는 발현 벡터는 서열번호 4번 또는 서열번호 5번 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 유전자 절편을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 상기 “발현 벡터”란, 숙주세포에 DNA를 도입하여 본 발명의 융합 단백질을 미생물에서 발현시키기 위한 수단으로서, 상기 발현 벡터의 제작 시에는 상기 융합 단백질을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자 (terminator), 인핸서 (inhancer) 등과 같은 발현 조절 서열 및 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.

이에 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터, 및 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 효모 (yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 pET49b 벡터일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현 예에서는 본 발명에 따른 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 치쿤구니야 바이러스용 백신을 제공한다.

본 발명에서 상기 백신은 당업계에서 잘 알려진 통상적인 방법으로 제조될 수 있고, 당업계에서 백신 제조 시 사용할 수 있는 여러 첨가물을 임의로 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 백신은 다른 면역보조제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 예를 들어 Mg, Ca, Sr, Ba 및 Ra으로 구성된 군으로부터 선택되는 제2족 원소, Ti, Zr, Hf 및 Rf로 구성된 군으로부터 선택되는 제4족 원소 또는 알루미늄의 염 또는 그의 수화물을 포함할 수 있다. 상기 염은 바람직하게는 옥사이드, 퍼옥사이드, 하이드록사이드, 카보네이트, 포스페이트, 파이로포스페이트, 하이드로겐포스페이트, 다이하이드로겐포스페이트, 설페이트 또는 실리케이트와 함께 형성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 백신 조성물에서 추가적으로 이용될 수 있는 면역보조제는 마그네슘 하이드록사이드, 마그네슘 카보네이트 하이드독사이드 펜타하이드데이트, 티타듐 다이독사이드, 칼슘 카보네이트, 바륨 옥사이드, 바륨 하이이드록사이드, 바륨 퍼옥사이드, 바륨 설페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 파이로포스페이트, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 수화된 알루미늄 포타슘 설페이트(Alum)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 상기 백신은 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들면, 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 백신은, 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 백신의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 백신의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-1000 mg/kg(체중)일 수 있다.

본 발명의 일 구체 예에서는 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신은 정맥내주사, 동맥내주사, 근육내주사, 피하내주사, 결막내주사, 경피전달 또는 기도흡입으로 체내에 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 항원 단백질에 톨-유사수용체 5 자극 단백질인 플라젤린(flagellin)이 결합된 융합 단백질은 치쿤구니야 바이러스 항원 단백질 단독으로 접종된 경우에 비하여, 백신을 통한 면역 유도 시 현저한 시너지 효과를 발휘할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질의 발현을 위한 플라스미드 벡터 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질의 전기영동 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질이 수용상태에서 단량체로 존재하는 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사수용체 5(TLR5; Toll like receptor 5)의 자극을 통한 신호전달활성에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신화 유도 과정에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질 접종에 의한 IgG 생성에 대한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

[ 실시예 1] 치쿤구니야 - 플라젤린 융합 단백질 발현 플라스미드 제작

치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus)에 적합한 백신을 제작하기 위하여 치쿤구니야 바이러스의 외피 단백질 항원 E2의 일부분에 해당하는 아미노산과 플라젤린 단백질이 융합된 단백질을 제작하였다.

상기 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질을 제작하기 위하여, 세 단계의 PCR 반응을 실시하였다. 첫 번째 증폭 반응은 치쿤구니야 게노믹 DNA를 주형으로 하기 표 1의 1번 및 2번의 프라이머로 95℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 30초의 복제조건, 변성-어닐링-복제 사이클을 25회 반복에서 실시하여 1차 반응물을 얻었다. 두 번째 증폭 반응은 살모넬라 더블린(salmonella Dublin)의 게노믹 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하기 표 1의 3번 프라이머 및 상기 첫 번째 반응의 산물인 1차 반응물을 프라이머로 이용하여, 95℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 1분간 반응을 25회 반복 실시하여 2차 반응물을 얻었다. 세 번째 증폭 반응은 살모넬라 더블린(salmonella Dublin)의 게노믹 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하기 표 1의 4번 프라이머 및 상기 두 번째 반응의 산물인 2차 반응물을 프라이머로 이용하여 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 1분 30초간 확장하는 반응을 25회 반복 실시하여 최종적으로 치쿤구니야-플라젤린 단백질의 융합 유전자를 얻었다. 상기 치쿤구니야-플라젤린 단백질의 융합 유전자는 pET49b(Addgene) 벡터에 삽입하여 단백질 발현 플라스미드(plasmid)를 제작하였다. 상기 단백질 발현 플라스미드는 DNA 서열분석(sequencing, macrogen)을 통해 검증하였고, 상기 플라스미드의 모식도는 도 1과 같다.

번호	프라이머 서열
1	5'-TTGATGGGTTCAATGTTAATGGGCCAGCGGCCGCA CCCCCAGACACCCCAGATC-3'
2	5'-CTTGGCTGCGGCAGCGTCCCCGGG GACCGCGGCATGGCATTGA-3'
3	5'-CCTCGAGTTAACGCAGTAAAGAGAGGACGTTTTGC-3'
4	5'-GAAGGATCCG ATGGCACAAGTCATTAATACAAACAGCCT-3'

[ 실시예 2] 치쿤구니야 - 플라젤린 융합 단백질 생산

상기 실시예 1에서 제작한 치쿤구니야-플라젤린 융합 유전자 발현 플라스미드를 통해 융합 단백질을 생산하였다.

상기 융합 유전자 발현 플라스미드를 화학적으로 처리한 BL21 (DE3 E. coli) 대장균에 형질전환(transformation) 방법에 의해 삽입(insert)하고, 카나마이신(kanamycin) 항생제가 포함되어 있는 LB 아가(agar) (Becton, Dickinson and Company) 플레이트에 상기 형질전환된 대장균을 배양하였다. 상기 배양하는 과정을 통하여, 항생제 내성이 있는 플라스미드 벡터가 포함되어 있는 단일 대장균 콜로니를 1mM의 카나마이신이 있는 액체 배지(LPS)에 넣고, 37℃의 항온 진탕 배양기에서 배양하였다. 상기 배양액의 OD₆₀₀값이 ~0.7이 되면, 5-브로모-인돌-3-클로로-이소프로필울-β-D-갈락토피라노시드(IPTG) 1 mM을 첨가하여 18℃에서 16시간 동안 배양하여, 융합 단백질의 발현을 유도하였다. 상기 융합 단백질의 발현이 유도된 대장균은 3,000 rpm에서 20분 원심분리하여 수득하고, 상기 대장균 세포의 용해(cell lysis)는 소니케이터(sonicator)를 이용하였다. 상기 세포 용해 액은 원심분리를 통해 다른 세포 이물질을 제거한 뒤, Ni-NTA 한천 비드(Qiagen)와 4℃에서 2시간 결합 시켰다. 그 후, 10 mM 이미다졸/1X 포스페이트 버퍼드 살린(Phosphate-Buffered Saline) 버퍼로 비특이적인 결합을 한 다른 단백질들을 제거 하고, 50 mM 이미다졸/1X 포스페이트 버퍼드 살린을 이용하여 최종적으로 비특이적 결합의 단백질을 제거하였다 (도2, final wash, F.W.). 비드에 결합되어 있던 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질은 250 mM 이미다졸/1X 포스페이트 버퍼드 살린을 이용한 경쟁적인 저해 방법으로 Ni-NTA 한천 비드에서 용리시켜 수득하였다. 상기 수득된 융합 단백질(추출, elution, E1)은 SDS-PAGE를 통하여 사이즈 및 순도를 확인하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질이 약 37KDa에서 관찰되는 것으로 보아, 융합 단백질의 제작 및 발현이 제대로 된 것을 확인하였다.

[ 실시예 3] 치쿤구니야 - 플라젤린 융합 단백질 특성 확인

상기 실시예 2에서 생산된 융합 단백질이 단량체로 존재하는지에 대하여, 통상의 방법에 의해 겔 침투 크로마토그래피(gel filtration chromatography)를 수행한 뒤, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 바는 바와 같이, 상기 실시예 2에서 생산된 융합 단백질은 수용액 내에서 무작위적으로 중합되지 않고, 단량체를 형성하였다.

상기 결과를 통하여 본 발명에 따른 치쿤구니야 및 플라젤린 융합 단백질이 단량체로 존재하고, 그를 통하여 선청성면역 수용체인 TLR5를 자극할 수 있음을 알 수 있다(Smith KD, Andersen-Nissen E, Hayashi F, Strobe K, Bergman MA, Barrett SL, Cookson BT, Aderem A.Toll-like receptor 5 recognizes a conserved site on flagellin required for protofilament formation and bacterial motility. Nat Immunol. 2003 Dec;4(12):1247-5.).

[ 실시예 4] 치쿤구니야 - 플라젤린 융합 단백질의 TLR5 자극 활성 확인

상기 실시예 2에서 생산된 융합 단백질의 TLR5 자극 활성 여부를 확인하기 위하여, TLR5에 의해 활성이 유도되는 NF-κB의 전사량을 측정하였다.

HEK293TLR5 세포를 96웰 플레이트에 분주하여 DMEM (High glucose with 4500 mg/L D-glucose L-glutamine WELGENE LM 001-07)의 배지를 이용하여 37℃, 5% 이산화탄소 조건의 항온 배양기 내에서 12시간 배양하였다. 배양을 통해 안정화된 상기 세포에 살모넬라 더블린(salmonella Dublin)의 플라젤린 단백질을 양성 대조군(1)으로 하고, 상기 실시예 2에서 생산된 융합 단백질(2)을 농도별로 처리하였다. 상기 융합 단백질이 처리된 세포에 알칼라인 포스파테이즈 기질 노란색(alkaline phosphatase substrate yellow(Sigma-Aldrich P7998))을 1/5로 희석하여 100㎕씩 넣고 30분간 상기 배양기 내에서 배양하여 반응시킨 뒤 405nm의 파장에서 그 값을 측정하여, 그 값을 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 2에서 생산된 융합 단백질(2)에 의하여 TLR5의 자극을 통한 세포 신호전달 체계의 활성이 대조군(1)과 같이 유발될 수 있음을 확인하였다.

상기 결과를 통하여, 본 발명에 따른 플라젤린 일부에 해당하는 도메인 역시 TLR5의 자극 활성을 효과적으로 유도할 수 있음을 알 수 있다.

[ 실시예 5] 치쿤구니야 - 플라젤린 융합 단백질을 이용한 백신 효과 검증

상기 실시예 2에서 제작한 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질의 백신 효과를 확인하기 위하여 도 5에 도시된 방법에 따라 면역한 후 ELISA 방법에 의해 검증하였다.

5-6 주령의 암컷 BALB/C 쥐에 대조군으로 업체에서 구입한 치쿤구니야 외피 단백질(ChiKE2⁴²⁶) 및 알루미늄포타슘 설페이트(Alum), 실험군으로 상기 실시예 2의 융합 단백질을 2주 간격으로 한 개체당 10㎍ 또는 20㎍ 피하 면역 주사 방법으로 접종하였다.

상기 접종에 의해 1차 내지 3차 면역을 유발하고 2주 후 상기 개체의 혈액에서 통상의 방법에 의해 혈청을 얻은 후, IgG의 생성 정도를 확인하기 위하여 ELISA를 수행하였다.

상기 ELISA는 코팅용액(Na2CO3 0.159g, NaHCO3 0.293g, 100ml 당, pH9.6)에 치쿤구니야 외피 단백질(ChiKE2⁴²⁶), Alum 및 상기 실시예 2의 융합 단백질 항원을 3.0ug/ml의 농도로 희석한 후 96웰 플레이트에 100㎕씩 각 well에 넣어 준 후, 4℃에서 하루동안 흡착과정을 거쳤다. 항원의 흡착이 완료된 상기 플레이트는 PBS를 이용하여 4회 세척 과정을 거친 뒤, 비특이적 결합을 배제하기 위하여 정상염소혈청이 5% 포함되어 있는 PBS를 각각의 플레이트에 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 대조군, Alum 및 실시예 2의 융합 단백질 접종을 통해 얻은 쥐의 혈청을 상온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤, PBS로 4회 세척 과정을 거친 후 발색을 위한 효소가 결합되어 있는 항-쥐 IgG1 과 상온에서 1시간 동안 반응 시킨 뒤에 암실에서 기질 완충용액(3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) 및 과산화수소수)을 첨가하여 발색 시키고, 2N 황산을 가하여 발색 반응을 중지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보는 바와 같이, 대조군에 해당하는 치쿤구니야 외피 단백질(ChiKE2⁴²⁶)은 Alum이 없는 경우에는 3회 면역 후 항체 반응이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, Alum이 추가된 경우에는 2회 면역 후 항체 반응이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 상기 실시예 2의 융합 단백질(SDFlic-ChiKE2⁵⁷)은 접종한 횟수에 따라 항체의 양이 현저하게 증가하였을 뿐만 아니라, 대조군인 치쿤구니야 외피 단백질 및 Alum이 함께 포함되어 있는 군(ChiKE2⁴²⁶ + Alum)에서 보다 4주차 이후부터 항체의 양이 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 통하여, 본 발명에 따른 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질을 백신으로 사용하는 경우, 치쿤구니야 외피 단백질 단독으로 사용하거나, 혹은 상기 외피 단백질에 Alum을 추가로 사용한 경우에 비하여도 면역 반응이 현저하게 높게 일어나는 것을 알 수 있다.

상기 결과를 이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

<110> YOENSEI, YOENSEI <120> FUSION PROTEIN AND USE THEREOF <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 47 <212> DNA <213> Chikungunya virus <400> 1 dtdrtmssgn vktvnstvry kcncgdssgt ttdkvnnckv dqchaav 47 <210> 2 <211> 208 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 2 mrntnnsmrt ymrndkmnta mnrssgksns aaddaagaat rmrakggnvg arntdamsar 60 tgdaagssnr mrdataangt nnadtasdky vakddhagkt nngnsdttat gkdsdasgdt 120 mtkadtkstt gttnkdaaag ratattkdta kadratgsnr dhnnnvtsat nmaaaasdad 180 makmsmtkkn agsmsanqtp qmvskllq 208 <210> 3 <211> 200 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 3 mavntnsstn nnksssssar ssgrnsakdd aagaanrtsn kgtasrnand gsattgannn 60 nrvrsvatng tnsdsdksdr drvsntngvk vsdnmkvgan dgttdkdvks gdgnvngaaa 120 gdaaaakkst anasdsaskv davrssganr dsatngntvt nnsarsrdad yatvsnmska 180 agtsvaqanq vpqnvlsllr 200 <210> 4 <211> 294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 4 mrgshhhhhh gmasmtggmg rdydvrgsak dmavntnsst nnnksssssa rssgrnsakd 60 daagaanrts nkgtasrnan dgsattgann nnrvrsvatn gtnsdsdksd rdrvsntngv 120 kvsdnmkvga ndgttdkdvk sgdgnvngaa adtdrtmssg nvktvnstvr ykcncgdssg 180 tttdkvnnck vdchaavgda aaakkstana sdsalskvda vrsslgaiqn rfdsaitnlg 240 ntvtnlnsar sriedadyat evsnmskaqi lqqagtsvla qanqvpqnvl sllr 294 <210> 5 <211> 302 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 5 mrgshhhhhh gmasmtggmg rdydvrgsak dmrntnnsmr tymrndkmnt amnrssgksn 60 saaddaagaa trmrakggnv garntdamsa rtgdaagssn rmrdataang tnnadtasdk 120 yvakddhagk tnngnsdtta tgkdsdasgd tmtkadtkst tgttnkdaaa dtdrtmssgn 180 vktvnstvry kcncgdssgt ttdkvnnckv dchaavgrat attkdtakad ratgsqlnrl 240 dhnlnnvtsq atnmaaaasq iedadmakem semtkfkiln eagismlsqa nqtpqmvskl 300 lq 302

Claims

서열번호 1로 표시되는 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 외피 항원 단백질 및 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 바실러스 시리우스(Bacillus cereus) 또는 살모넬라 더블린(salmonella dublin)의 플라젤린(flagellin)을 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 치쿤구니야 바이러스용 백신.
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제 1항에 있어서,
상기 융합 단백질의 일측에 히스티딘-표지(Histidine-tag)가 결합되어 있는 것인, 치쿤구니야 바이러스용 백신.
제 1항에 있어서,
상기 백신은 정맥 내 주사, 동맥 내 주사, 근육 내 주사, 피하 내 주사, 결막 내 주사, 경피 전달 또는 기도흡입으로 체내 투여되는 것을 특징으로 하는, 치쿤구니야 바이러스용 백신.
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