KR20150123356A

KR20150123356A - 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물

Info

Publication number: KR20150123356A
Application number: KR1020140049126A
Authority: KR
Inventors: 하나영; 최명식; 김익상; 조남혁
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-04-24
Filing date: 2014-04-24
Publication date: 2015-11-04

Abstract

본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물을 개시한다. 구체적으로 본 발명은 활성성분으로서 자가수송단백질인 ScaA나 그 패신저 도메인 영역을 이용한 백신 조성물을 개시한다.

Description

오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물{Vaccine Composition for Orientia tsutsugamushi}

본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시 균(Orientia tsutsugamushi)에 대한 백신 조성물에 관한 것이다.

쯔쯔가무시병(scrub typhus)은 진드기 유충을 매개로 한 오리엔티아 쯔쯔가무시균(Orientia tsutsugamushi, 이하 "쯔쯔가무시균")의 인체감염으로 인하여 일어난다. 주로 러시아 연해주, 일본, 중국, 말레이시아, 태국, 베트남, 인도 등의 아시아-태평양 지역에서 발병하는 급성 열성 감염병의 한 종류이며 10억 명에 달하는 인구가 이 병에 잠재적으로 노출되어 있다.

매해 약 백만 명 정도의 환자가 발생하는 것으로 추정되고 있으며, 1-2주간의 잠복기를 거쳐 발열, 오한, 발진, 가피 생성, 근육통, 림프절 종대 등의 증상이 나타난다. 대부분 감기와 유사한 증상에서 끝나기도 하지만, 적절한 항생제 치료를 받지 않을 경우, 30% 이상의 사망률이 보고되었다. 초기 진단을 통해 독시사이클린, 클로람페니콜 등의 적절한 항생제 처리로 쉽게 치료될 수 있으나, 여러 종류의 혈청형들에 의한 재감염 위험이 높고, 항생제가 잘 듣지 않는 경우가 종종 보고되고 있다. 그리고 아직까지 상용화된 백신은 없다.

쯔쯔가무시균은 하나의 종으로 분류되고 있으나, 주요 막항원구조가 다른 혈청형이 다수 존재하며, 이러한 항원의 차이에 따라 현재까지는 20가지 이상의 쯔쯔가무시균 혈청형이 구별되고 있는데, 원형(prototype) 혈청형은 길리암(Gilliam), 카프(Karp) 및 카토(Kato)로 분류된다(Eisemann ans Osterman 1985, Am J Trop Med Hyg. Nov;34(6):1173-8; Akira Tamura and Akiyoshi Kawamura 1991, J.CLIN.MICROBIOL. Feb.1991, Vol.29,No.2; WOO-HYUN CHANG et al. 1993, J.CLIN.MICROBIOL. Mar.1993,p.598-605). 한국에서는 보령, 길리암 및 카프 혈청형 감염이 주로 발생하고 있으며, 이중 보령 혈청형 감염이 가장 빈번하다(Chang WH et al. 1995. J Korean Med Sci 10:227-38 ;227-38 ; Lee et al. 2010, J.Trop Med Hyg 83(4):930-5 Yang et al 2011, PLoS ONE 6(8):e22731).

사람에서의 쯔쯔가무시병에 대한 면역은 한 가지 혈청형에 특이적이기 때문에 병에 걸린 후 생기는 방어 면역 능력은 같은 혈청형에 대해서는 2-3년간 지속되나, 다른 혈청형에 대해서는 방어 능력을 보이지 않는다(No Cross-immunity). 예를 들면, 4개월 동안 관찰한 쯔쯔가무시병 환자 중에서 처음에 길리엄(Gilliam) 혈청형에 감염되고 2달 후에 카프(Karp) 혈청형에 재감염 된 예가 증명된 바 있다. 또한 최근에는 동남아시아, 인도 등지에서 항생제 저항균의 보고 되고 있으므로 다수의 혈청형 균주에 대해 근본적으로 예방을 할 수 있는 백신의 개발이 필요한 상황이다(Watt G,　Parola P.2003. Curr Opin Infect Dis. Oct;16(5):429-36 ; Strickman　D et al. 1995. Lancet.　1996 Jul 13;348(9020):86-9.).

기존의 쯔쯔가무시병 백신의 개발은 포르말린 처리나 감마선 조사를 통한 사백신(Killed-vaccine), 56KDa(56-kDa Type-Specific Antigen Gene, TSA56)단백 및 47KDa의 외막단백질을 이용한 재조합단백질 백신(Subunit vaccine) 등이 연구되어 왔으나, 이들 백신들은 주입한 혈청형 균주에 대해서만 방어면역을 보이거나 방어면역능의 지속기간이 짧아 실용화하지 못하였다(Buckland and Dudgeon, 1945; Lancet 2, 734~737; Kawamura et al., 1940. Trop.Dis.Bull. 37, 269~270; Seong et al., 1997. Infect.Immun. 65, 1541~1545; Yu et al., 2005. Am.J.Trop.Med.Hyg. 72, 458~46).

따라서 다양한 혈청형 균주들에 대해 공통적으로 방어 면역을 유도할 수 있는 항원물질이 필요한 상황이다. 최근 논문에서 쯔쯔가무시균의 Sca 단백질들은 자가수송단백으로 균의 외막에 발현하고 있는 것이 확인되었다. 이들 Sca 단백질은 ScaA, ScaB, ScaC, ScaD, ScaE의 5가지 아형으로 나누어지는데, 보령균주에서만 확인되는 ScaB을 제외한 나머지 단백들의 아미노산 서열은 혈청형간에 상동성이 비교적 높은 것으로 확인 되었다(ScaA: 65.8~81.8%, ScaC: 77.4~97.5%, ScaD:69.7~93.8%, ScaE: 62.8~85.3%) (Ha et al., 2011 Infect Immun 79:1718-27).

본 발명은 ScaA와 ScaC가 쯔쯔가무시병 환자에서 항체 반응을 유도하는 것을 확인하였으며, 이 중 ScaA가 백신으로서 기능할 수 있음을 확인함으로써 완성된 것이다.

본 발명의 목적은 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 쯔쯔가무시 균 보령(Boryoung) 혈청형의 유전체 DNA를 분리하여, 보령 혈청형의 유전 정보(GeneBank acession numberAM494475.1)를 기초로 하여 제작된 프라이머(아래의 [표 1] 참조)로 ScaA 및 ScaC 단백질의 패신저 도메인 영역의 일부를 증폭하고([도 1]의 ScaA 및 ScaC의 구조적 모식도, 그리고 [도 2] 및 [도 3]의 증폭된 염기서열(밑줄 부분임) 및 이에 상응하는 아미노산 서열(밑줄 부분임) 참조), 증폭된 DNA 단편들을 pET28a 백터에 삽입하여 대장균에 형질전환시켜 생산 분리한 다음에, 이들 단백질을 백신 항원으로 사용하여 면역 보강제 Alhydrogel®(Invivogen Inc. (San Diego, USA))와 함께 접종하고 1 주일 뒤 특이적 항체 생성을 확인한 결과 ScaA에 대해서 특이적인 IgM, IgG1, IgG2a 항체가 효과적으로 생성된 것을 확인할 수 있었다.

본 발명자들은 나아가 ScaA 및 ScaC 단백질의 패신저 도메인 영역의 일부가 백신으로서 기능을 하는지 확인하기 위하여 대장균에서 생산 분리된 상기 ScaA 및 ScaC 단백질의 패신저 도메인 영역의 일부를 면역 보강제 Alhydrogel(Invivogen Inc. (San Diego, USA))와 함께 생쥐에 접종 후 1 주일 뒤 쯔쯔가무시 균주(보령 혈청형)를 PBS로 희식시켜 감염시키고 생존율을 계산하였는데, ScaC를 접종한 시험군의 경우 보령 균주 접종 12일 이내에 모두 사망하였으나, ScaA를 접종한 시험군의 경우 보령 균주 접종 13일째 1마리가 사망하고 나머지 4마리는 모두 생존함을 확인하였다(생존율 80%). 양성대조군으로 사용한 TSA56의 경우 모두 생존하였으며(생존율 100%), 음성대조군으로 사용한 PBS의 경우는 보령 균주 접종 11일 이내에 모두 사망하였다(생존율 0%). 또한 이러한 ScaA는 보령 혈청형뿐만 아니라 카토 및 카프 혈청형에 감염된 경우에도 백신 효과를 보였으며 기존 사용되던 TSA56과 혼합 사용할 경우 더 뛰어난 백신 효과를 보였다.

전술한 바의 실험 결과는 ScaA 단백질이 쯔쯔가무시 균에 대한 백신의 활성성분으로서 유용함을 보여주는 결과라 할 수 있다.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로서, 본 발명의 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물은 단리된 전장의 ScaA 단백질, 단리된 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역, 또는 단리된 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역의 실질적 일부를 활성성분으로 포함함을 특징으로 한다.

본 명세서에서, "백신"은 숙주인 사람에게서 해당 병원체에 대한 면역 반응을 유도함으로써 해당 병원체의 감염 또는 재감염의 예방, 해당 병원체에 의한 증상의 중증도 감소 또는 증상의 제거, 또는 해당 병원체나 그 병원체 의한 질환의 실질적 또는 완전한 제거를 포함하는 의미이다. 따라서 본 발명의 백신 조성물은 해당 병원체의 감염 전에 예방적으로 사람에게 투여되거나 해당 병원체의 감염 후에 치료적으로 사람에게 투여될 수 있다. 여기서 상기 "면역 반응"은 체액성 면역 반응, 세포성 면역 반응 또는 이들을 모두 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, "단리된"은 그 대상 물질이 원래의 유기체(즉 본 발명에서는 쯔쯔가무시 균)에서 분리되었거나 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 경우 형질전환된 유기체로부터 분리되었음을 의미한다.

또 본 명세서에서, "활성성분"은 단독으로 면역 반응을 유도하거나 또는 그 자체로는 면역 반응을 유도할 수 없는 담체와 함께 면역 반응을 유도할 수 있는 성분을 의미한다. 따라서 활성성분은 스스로가 반드시 면역원성(면역 반응을 유도할 수 있는 능력)일 필요는 없다. 본 발명에서 상기 활성성분은 필수적이지는 않지만 정제된 것이 바람직하다. 여기서 "정제된"은 그 대상 물질이 존재하는 원래의 유기체(즉 본 발명에서는 쯔쯔가무시 균)나 형질전환된 유기체의 세포 성분 또는 그 배상액 성분(즉 오염물)이 실질적으로 감소되었거나 제거된 상태를 의미한다. 오염물이 실질적으로 감소되었거나 제거된 상태는 순도가 50% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 99% 이상을 의미한다. 순도는 크로마토그래피, 겔 전기영동, 면역학적 분석 등 당업계에 공지된 방법을 통하여 평가될 수 있으며, 정제 방법도 당업계에 잘 공지되어 있다.

본 명세서에서, 상기 "ScaA"는 쯔쯔가무시균의 Sca 단백질 5가지 유형 중 하나인 ScaA를 가리킨다. Sca 단백질은 숙주세포의 피브로넥틴(fibronectin)과 상호작용하여 숙주세포에 침입에 관여하는 단백질로서 C-말단 부위에는 오토트랜스포터(autotransporter) 도메인을 지니고 N-말단 부위에 신호 서열(signal peptide)을 지니며 중간에는 외벽 밖으로 발현하는 부위인 패신저(passenger) 도메인을 지니는데, 쯔쯔가무시균의 Sca 단백질 5가지 유형 즉 ScaA, ScaB, ScaC, ScaD 및 ScaE로 나누어진다. 이들 Sca 단백질은 보령균주에서만 확인되는 ScaB을 제외한 나머지 단백들의 아미노산 서열은 혈청형간에 상동성이 비교적 높은 것으로 확인되었다(ScaA: 65.8~81.8%, ScaC: 77.4~97.5%, ScaD:69.7~93.8%, ScaE: 62.8~85.3%)(Ha et al., 2011 Infect Immun 79:1718-27). 본 명세서에서, 상기 "ScaA"는 바람직하게는 그 전장(full-length)의 서열이 GenBank accession no. CAM79168.1 또는 서열번호 1에서 확인되는 단백질을 말한다. 이 ScaA 단백질의 유전자 서열도 GenBank accession no. CAM79168.1 또는 서열번호 3에서 확인할 수 있다.

또 본 명세서에서, "단리된 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역의 실질적 일부"란 ScaA 단백질의 패신져 도메인 영역 중에서 80% 이상의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 말하며, 바람직하게는 GenBank accession no. CAM79168.1 또는 서열번호 1에서 26번째 아미노산에서부터 1186번째 아미노산까지의 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역 중에서 80% 이상의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 말한다. 아래의 실시예에서 본 발명자들은 총 1161 아미노산 서열로 이루어진 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역 중 30번째 아미노산 서열에서 1000번째 아미노산 서열까지 총 971개의 아미노산 서열로 이루어진 폴레펩티드를 제조하였을 때 이 폴리펩티드가 백신으로서 충분히 기능함을 확인한 바 있는데, 이 폴레펩티드는 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역 중에서 83.6%에 해당하는 연속된 아미노산 서열로 이루어진 것이다. 이러한 실험 결과는 80% 이상의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드도 백신으로서 충분히 기능할 수 있음을 시사하는 것이라 할 수 있다.

또 본 명세서에서, 상기 "쯔쯔가무시 균"은 오리엔티아 쯔쯔가무시를 의미하는 것으로 그 하위 분류인 길리엄(Gilliam) 혈청형, 카프(Karp) 혈청형, 카토(Kato) 혈청형 및 보령(Boryoung) 혈청형을 포함하는 의미이다.

본 발명에서 상기 ScaA 단백질이나 그 패신저 도메인 영역 등은 DNA 재조합 기술에 대해 당업계에 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 이러한 방법은 (i) 상기 분자를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하고 (ii) 이 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시키고 (iii) 형질전환된 숙주세포를 배양하고, 마지막으로 (iv) 그 배양물로부터 원하는 분자를 분리·정제하는 단계를 포함한다.

상기 분자를 암호화하는 유전자는 그 유전자 서열을 이용하여 쯔쯔가무시 균으로부터 얻을 수 있다. 예컨대 그 균의 게놈 DNA를 확보한 후 그 유전자 서열에 기초하여 제작된 프라이머로 증폭하여 얻을 수 있다.

상기 발현벡터는 플라스미드 또는 바이러스로부터 유래된 것일 수 있으며, 직접 제작하여 사용하거나 생명공학 회사 예컨대 노바겐(Novagen) 사, 다까라슈죠 사, 키아겐(Qiagen) 사, 스트라타진(Stratagene) 사, 프로메가(Promega) 사, 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnositics) 사, 인비트로겐(Invitrogen) 사, 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute) 사 등으로부터 상업적으로 입수하여 사용할 수 있다.

발현벡터는 원하는 분자(ScaA 또는 그 패신저 도메인 등, 이하 "목적 단백질")를 암호화하는 유전자(이하 "목적 유전자")를 포함하고 그 목적 유전자의 발현을 유도하는 서열을 포함하여 구성된다. 여기서 목적 유전자의 발현을 유도하는 서열은 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열 등을 말한다. 여기서 프로모터는 목적 유전자의 전사를 유도할 수 있는 서열로서, 사이토메갈로 바이러스의 즉시 초기형 프로모터, SV40의 프로모터(SV 40 후기형 프로모터 및 SV 40 초기형 프로모터), HSV(herpes simplex virus)의 tk 프로모터, 아데노바이러스 2 주요 후기형 프로모터(Adeno 2 major late promoter PAdml), 아데노 바이러스 2 초기형 프로모터(PAdE2) 등이 예시될 수 있으며, 또한 여기서 폴리아데닐화 서열은 전사 종결 서열로서 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998(1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876(1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)) 등이 예시될 수 있다.

또한 상기 발현벡터는 선택적으로 리포터(예: 루시퍼라아제, β-글루쿠로니다아제) 유전자나 선택 표지 유전자로서 항생제(예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 등을 포함할 수 있으며, 또한 선택적으로 발현 효율을 향상시키기 위하여 인핸서 분자를 포함할 수 있다.

형질전환될 수 있는 숙주세포로는 세균 등의 원핵 세포(예를 들면 대장균, 고초균)나, 효모(예를 들면 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)), 곤충 세포(예를 들면 Sf 세포), 포유 동물 세포(예를 들면 COS, CHO, BHK) 등의 진핵 세포를 사용할 수 있다.

형질전환 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있으며, 그러한 방법으로서 예컨대 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)), 초산-리튬 DMSO법(Hill et al., Nucleic Acid Res., 19, 5791(1991)) 등을 들 수 있다.

형질전환된 숙주세포의 배양도 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

세포 배양에 사용되는 배지는 형질전환된 숙주세포가 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염 등을 포함한다면 천연 배지와 합성 배지 모두를 사용할 수 있다. 만일 숙주세포로서 동물세포를 사용할 경우, 예컨대 Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp.Med.147:923(1978)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)) 등을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 배지에 대해서 구체적인 것은 문헌 [R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York]를 참조할 수 있다.

목적 단백질의 분리·정제 방법도 당업계에 공지되어 있으며, 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 예컨대 한외 여과, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피(표지 펩티드가 결합된 경우), HPLC, 소수성 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피 등의 방법이나 이들을 조합하는 방법이 사용될 수 있다.

DNA 재조합 기술에 의한 본 발명의 목적 단백질의 생산에 대해서는 본 명세서의 기재 내용 이외에 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, US(1989)], 문헌[DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)], 문헌[Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)], 문헌[Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)], 문헌[Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)], 문헌[Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986))], 문헌[Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)], 문헌[B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)], 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Jon Willey & Sons, US(1993)], 문헌[F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)], 문헌[Sambrook, J. ＆ Russel, D., Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001년 1월 15일 발행의 제1권 7.42 내지 7.45, 제2권 8.9 내지 8.17] 등을 참조할 수 있다. 이들 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

한편 아래의 실시예는 ScaA 항원을 TSA56(56-kDa Type-Specific Antigen, 56kDa) 항원과 함께 사용할 경우 백신으로서의 효과가 더 뛰어남을 보여준다.

따라서 본 발명의 백신 조성물은 활성성분으로서 ScaA 이외에 TSA56을 추가로 포함할 수 있다. TSA56을 이용한 재조합 단백질 백신은 주입한 혈청형 균주에 대해서만 방어 면역을 보이거나 방어 면역능의 지속 기간이 짧은 문제점이 있다고 알려져 있다(Seong et al., 1997. Infect.Immun. 65, 1541-1545; Yu et al., 2005. Am.J.Trop.Med.Hyg. 72, 458-46).

본 명세서에서, 상기 "TSA56"은 숙주세포의 세포 외 기질 당단백질인 피브로넥틴과 상호작용하여 균의 숙주세포 감염을 돕는 기능을 가지는 쯔쯔가무시 균의 세포막 단백질을 말한다(Lee et al.,J Infect Dis. 2008;198: 250-257; Cho BA et al., Infect Immun. 2010 May;78(5):1915-23.). 바람직하게는 그 전장(full-length)의 서열이 GenBank accession no. CAM79668.1 또는 서열번호 2에서 확인되는 단백질을 말한다. 서열번호 2에 개시된 TSA56 단백질의 유전자 서열도 GenBank accession no CAM79668.1 또는 서열번호 4에서 확인할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물에 활성성분으로서 ScaA와 함께 포함될 수 있는 TSA56은 그 전장의 단백질뿐만 아니라 그것의 항원성 영역(antigenic domain)일 수 있으며 그 항원성 영역의 실질적 일부일 수 있다. 여기서 항원성 영역은 [도 1]의 모식도에 있어서 도메인 AD I에서부터 AD Ⅳ까지 연속적인 아미노산 서열로 이루어진 영역을 말하며, 서열번호 2에서는 19번째 아미노산에서 432번째 아미노산까지의 서열을 말한다. 이들 도메인은 항체 생성이 높은 도메인으로 알려져 있다(Infect Immun. 1999 67(11): 6194~6197).

또 상기에서 "항원성 영역의 실질적 일부"란 도메인 AD I에서부터 AD Ⅳ까지 연속적인 아미노산 서열로 이루어진 영역에서 80% 이상의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 말하며, 바람직하게는 서열번호 2에서 19번째 아미노산에서부터 432번째 아미노산까지의 TSA56 단백질의 항원성 영역 중에서 80% 이상의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 말한다. 아래의 실시예에서 서열번호 2의 총 414개의 아미노산으로 서열로 이루어진 TSA56 단백질의 항원성 영역 중 85번째 아미노산에서 420번째 아미노산까지의 총 336개의 아미노산으로 이루어진 폴레펩티드를 제조하고 그 폴리펩티드가 백신으로서 충분히 기능함을 확인한 바 있는데, 이 폴레펩티드는 TSA56 단백질의 항원성 영역 중에서 81.1%에 해당하는 연속된 아미노산 서열로 이루어진 것이다. 이러한 실험 결과는 80% 이상의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드도 백신으로서 충분히 기능할 수 있음을 시사하는 것이라 할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 임의의 적절한, 약학적으로 허용되는 제제로 제조될 수 있다. 예컨대 즉석 투여 용액 또는 현탁액 형태이거나, 투여 전 희석에 적절한 농축된 원액이거나, 또는 재구성 가능한 형태 예컨대 동결건조, 냉동-건조, 또는 냉동 제제 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제제화될 수 있다. 백신 조성물의 제제화를 위하여 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 담체는 대한민국 약전이나 제외국의 약전 특히 미국, 일본, 유럽의 약전에 열거·규정되어 있다.

이러한 담체는 통상 희석제, 부형제, 안정화제, 방부제 등을 포함할 것이다. 적절한 희석제로서는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유, 땅콩유와 같은 식물성유 등의 비수성 용매나 염수(바람직하게는 0.8%의 염수), 완충 매질을 포함한 물(바람직하게는 0.05M의 인산염 완충액) 등의 수성 용매 등을 들 수 있고, 적절한 부형제로서는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 나트륨 클로라이드, 무수 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 들 수 있으며, 적절한 안정화제로서는 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 덱스트란, 글루타메이트, 글루코스 등의 탄수화물이나 분유, 혈청 알부민, 카제인 등의 동물성, 식물성 또는 미생물성 단백질 등의 단백질을 들 수 있다. 적절한 방부제로서는 티메로살, 메르티올레이트, 젠타마이신, 네오마이신, 니스타틴, 암포테리신 B, 테트라사이클린, 페니실린, 스트렙토마이신, 폴리믹신 B 등을 들 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 항원 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 항원 보조제는 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 하나 이상의 물질로 이루어진 것일 수 있다. 보조제는 항원을 서서히 방출시키는 조직 저장소로서 및/또는 면역 반응을 비특이적으로 증강시키는 임파성 시스템 활성자로서 기능할 수 있다(Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, benjamin/Cummings: Menlo Park, California, p.384). 항원 보조제는 예컨대 완전 프로인트(Freund), 불완전 프로인트, 사포닌, 겔 성상의 알루미늄 보조제, 표면 활성 물질(예: 리소레시틴, 플루론 글리콜, 다중 음이온, 펩티드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼 등), 식물성 오일(면실유, 땅콩유, 옥수수유 등), 비타민 E 아세테이트 등일 수 있다.

현재 인체에 적용 가능한 항원 보조제 중에서 가장 널리 사용되고 있는 것은 알루미늄 보조제이며, 이러한 알루미늄 보조제는 인산알루미늄(Aluminum phosphate), Potassium aluminum sulfate, 수산화 알루미늄(Aluminum hydroxide) 등 알루미늄 염(Aluminium salts)의 겔 성상으로 사용되고 있다. 이러한 알루미늄 보조제는 일반적으로 Th2-type의 면역반응을 이끌어내어 백신 효과를 증강시키는 것으로 알려져 있다(Sokolovska A et al., Vaccine. 2007 Jun 6;25(23):4575-85; O'Hagan DT AND Rappuoli R., Pharm Res. 2004 Sep;21(9):1519-30.) 본 발명의 실시예에서 사용한 Invivogen사의 Alhydrogel®은 수산화 알루미늄(Aluminium hydroxide)의 겔 형태 현탁액(colloidal)이다. 이러한 알루미늄 보조제는 그 제조 방법이 당업계에 공지되어 있어(R. Bomford. Immunological Adjuvants and Vaccines. NATO ASI Series 1989;179:35-41; Vogel FR AND Powell MF. Pharm Biotechnol. 1995;6:141-228.;Derek T. O'Hagan, Methods in Molecular Medicine. 2000; April 15; 42: 65-90) 직접 제조하여 사용하거나, 상업적으로 유통되는 제품을 구입하여 사용할 수도 있다. 상업적으로 유통되는 제품으로서는 아래의 실시예에서 사용된 Invivogen사의 Alhydrogel® 2% 제품을 비롯하여 Sigma사의 Aluminum hydroxide Gel 제품, BRENNTAG사의 Alhydrogel™ 제품 등을 들 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 임의적 단위 용량으로 제조될 수 있다. 단위 용량은 사람에 1회 이상 투여되기 위한 용도로 포장된 낱개의 제품에 포함된 활성성분과 약학적으로 허용되는 담체의 양을 말하는 것으로, 이러한 활성성분과 담체의 적절한 양은 본 발명의 백신 조성물이 1회 이상 접종될 때 백신으로서 기능할 수 있는 양으로 이러한 양은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 비임상적 및 임상적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 바람직하게는 비경구적으로 예컨대 직장, 경피, 정맥 내 주사, 동맥 내 주사, 근육 내 주사, 피 내 주사, 피하 주사, 복막 내 주사, 심실 내 주사 등을 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 조절 방출 시스템으로 투여될 수 있다. 예컨대 그러한 조절 방출 시스템으로서는 리포좀, 이식 삼투성 펌프, 경피 패치 등의 방식 등을 들 수 있다. 바람직하게는 리포좀 방식으로 활성성분을 전달하는 경우이다. 리포좀 방식에 의해 활성성분을 전달하는 것과 관련해서는 문헌[Langer, Science 249: 1527-1533 (1990)], 문헌[Treat at al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (des.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)] 등을 참조할 수 있다. 여타의 활성성분의 전달 방식과 관련해서는 문헌 [Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987)], 문헌[Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980)], 문헌[Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)], 문헌 [Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)], 문헌[Controlled Drug Bioavailability. Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)], 문헌[Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983)], 문헌[During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989)], 문헌[Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)] 등을 참조할 수 있다. 이들 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.

본 발명의 백신 조성물의 투여량은 의료인에 의해 나이, 체중, 성별, 증상, 합병증, 다른 질환의 이환 유무 등의 환자 특성을 고려하여 결정될 수 있다.

또한 투여의 시간적 간격과 횟수는 사용되는 제형이나 활성성분의 혈중 반감기 등을 고려하여 결정될 수 있다.

이처럼 투여량과 투여의 시간적 간격이나 횟수는 의료인의 판단에 따라 좌우되고 개인에 따라 결정되어야 하지만, 통상의 적절한 투여량은 1일 기준 개인 체중 1kg당 약 0.1 내지 10mg 범위 내에서 결정될 것이고 투여 간격은 3 내지 10일, 투여 횟수는 1 내지 5회 범위 내에서 결정될 것이다.

진술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 ScaA 단백질이나 그 패신저 도메인 영역을 이용한 쯔즈가무시 균에 대한 백신 조성물을 제공할 수 있다. 활성성분인 ScaA 단백질이나 그 패신저 도메인 영역은 보다 효과적인 면역 반응을 유도하기 위하여 필요에 따라 TSA56 등 다른 항원과 함께 사용될 수 있으며 항원 보조제를 추가로 사용할 수 있다.

도 1은 ScaA 및 TSA56 단백질의 구조적 모식도와 증폭된 염기서열에 상응하는 아미노산 위치를 도시한 것이다. 백신에 사용된 항원 영역을 밑줄로 표시하였다.
도 2 내지 도 4는 각각 백신 항원으로 사용된 ScaA, ScaC 및 TSA56의 핵산 및 아미노산 서열을 나열한 것이다. 백신에 사용된 항원 영역을 밑줄로 표시하였다.
도 5는 정제된 쯔쯔가무시균 항원들(TSA56, ScaA, ScaC)을 전기영동 한 후 Coomasie blue 염색과 쯔쯔가무시병 환자 혈청을 이용한 immunoblot을 통하여 그 반응성을 확인한 결과이다.
도 6은 항원 접종에 의하여 생성된 항원 특이적 항체반응을 나타내는 ELISA 결과이다.
도 7은 각기 다른 쯔쯔가무시병 항원(TSA56, ScaA, ScaC)을 면역한 생쥐에 보령 균주를 감염시키고 그 생존율을 관찰한 결과이다.
도 8은 ScaA 및 TSA56 항원과 Alhydrogel을 혼합하여 면역한 생쥐에 쯔쯔가무시균 보령, 카프, 카토 혈청형 균주를 감염시키고 그 생존율을 관찰한 결과이다.

본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 쯔쯔가무시균의 genomic DNA 정제 및 백신 후보 항원 항원 유전자들의 증폭과 클로닝

실험에 사용할 ScaA, ScaC 및 TSA56 항원 유전자는 오리엔티아 보령 혈청형(GenBank accession number AM494475.1)으로부터 획득하였다.

Sca 항원 및 TSA56 항원을 제조하기 위하여 먼저 보령 균주를 L929 세포(마우스 섬유아세포주; ATCC NTCT929)에 감염시켜 증식 배양하였으며, 감염 3-4일 후 간접면역형광기술을 수행하여 감염률을 확인하고 감염률이 90% 이상이 되면 세포를 600 x g로 20분 동안 원심분리하여 침전시키고 6.5ml의 Tris-sucrose(TS) 완충액(33mMTris-Cl[pH 7.4] and 0.25 M sucrose)에 현탁시켰다. 현탁된 세포를 Polytron homogenizer(Wheaton Inc. Millville, NJ)를 이용하여 균질화한 후 5분 동안 200 x g로 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 TS 완충액에 들어있는 40% Percoll (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)과 섞은 후 2500 x g에서 60분 동안 원심분리 하였다. 침전된 세균들을 모아 7700 x g로 30분 동안 원심분리하고, 얻어진 세균들에서 RBC Genomic DNA extraction kit(RBC Bioscience Co., Taipei City, Taiwan)를 이용하여 균의 유전체 DNA를 확보하였다.

쯔쯔가무시균 보령 혈청형의 정보(GeneBank acession numberAM494475.1)를 기초로 하여 ［표 1］과 같이 디자인된 프라이머와 상기에서 분리한 유전체 DNA을 이용하여 ScaA유전자를 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (Applied Biosystems,USA)을 이용하여 증폭하였다. 여기서 PCR의 수행 조건은 다음과 같다

ScaA: 95℃(5mins)에서 pre-heating후 95℃(30s)-58℃(30s)-68℃(4min40s)을 30cycle반복 진행 후 68℃(5mins)의 추가 반응하였다.

ScaC: 95℃(5mins)에서 pre-heating후 95℃(30s)-60℃(30s)-72℃(60s)을 30cycle반복 진행 후 72℃(5mins)의 추가 반응하였다.

TSA56: 95℃(5mins)에서 pre-heating후 95℃(30s)-50℃(30s)-68℃(90s)을 30cycle반복 진행 후 72℃(5mins)의 추가 반응하였다.

그리고 ScaA 및 ScaC 유전자의 증폭된 영역은 Sca단백질의 구조적 모식도를 도시한 [도 1]에서 청색 라인(염기 서열)과 적색 라인(아미노산 서열)으로 표시된 패신저(passenger)도메인 영역이며, 여기서 서열 위치 표기는 보령 혈청형을 기준으로 하였다.

그리고 [도 1]에서 TSA56 유전자의 증폭된 영역도 함께 표시하였으며, 마찬가지로 청색 라인은 염기 서열을 표기한 것이고 적색 라인은 아미노산 서열을 표기한 것이며 보령 혈청형을 기준으로 하였다.

참고로 [도 1]에서 SP는 signal peptide, TM은 transmembrane, AT는 autotransporter domain, AA는 아미노산을 가리킨다.

증폭된 DNA 단편들은 pET28a vector에 클로닝하고 염기서열 분석을 통해 유전자 삽입을 확인하였다([도 2] 내지 [도 4] 참조).

< 실시예 2> 백신 후보 항원 재조합 단백질의 제조 및 정제

상기에 얻은 유전체 DNA를 이용하여 상기 [표 1]의 프라이머로 증폭한 각 유전자를 pET28a vector에 삽입하고 이 백터를 Escherichia coli BL21(DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany)에 도입한 후 카나마이신(30㎍/ml)를 함유 한 LB broth에서 배양하였다. 0.1mM isopropyl β-D-thiogalactoside(IPTG; Duchefa, Zwijndrecht, Netherlands)를 16℃에서 18시간 동안 배양하여 단백질의 발현을 유도하였으며 이후 균을 10분 동안 1,000xg의 속도로 원심분리한 후 1mg/ml의 리소자임(lysozyme)을 포함하는 결합 완충액(300 mMNaCl, 50 mM sodium phosphate buffer, 10mM imidazole)에 현탁시켜 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 얼음 위에서 5분간 음파처리를 하였으며 이를 통해 얻어진 용해물을 1,600xg의 속도로 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 상층액을 수거하고 결합 완충액으로 미리 평형화시킨 Ni-nitrilotriacetic acid (NTA) His-결합 레진(Qiagen)에 적용한 후 용리 완충액 (300 mM NaCl, 50 mM sodium phosphate buffer, 250 mM imidazole)를 부어 단백질을 얻어냈다. 단백질의 정제 여부는 SDS-PAGE분석을 통해 확인하였다[도 3]. 자유 이미다졸을 제거하기 위하여 PBS용액(pH7.4)에 4℃/18시간 동안 투석(Dialysis)을 진행하였으며 정제된 단백질은 내독소(Endotoxin)을 제거하기 위해 Endotoxin removal resin(Pierce)을 사용하였으며, 이를 LAL(Limulus amebocyte lysate) assay kit(Lonza)을 이용하여 EU<0.05/dose 수준으로 제거되는 것을 확인한 후 면역 반응을 이용한 실험에 사용하였다.

순수 정제된 단백질들은 [도 5]에서와 같이 SDS PAGE와 Coomasie blue 염색, 쯔쯔가무시병 환자 혈청을 이용한 immunoblot으로 확인하였으며, 이 단백질 용액을 백신 항원으로 사용하였다.

< 실시예 3> 백신 후보 항원을 이용한 면역 활성화 실험

< 실시예 3-1> 실험 방법

마우스의 사용 및 관리

본 발명에서 사용된 마우스는 C57BL/6 strain이며 모든 실험에서 5주령의 암컷을 사용하였다.

본 동물실험은 서울대학교 동물실험위원회의 동물사용에 관한 규정에 따라 실시하였으며, 백신제제의 면역 및 균 감염실험은 Biosafety level 3 (BL3) 실험실 내에서 모두 진행하였다.

Sca 단백질 항원 백신 접종 및 혈액 내 항체 정량

Sca 등 단백질 항원 면역을 위해 정제된 재조합 Sca 등의 단백질 20㎍을 인산 완충액과 총량이 50㎕이 되게 섞어준 후, 2% Alhydrogel®(Invivogen. Vac-alu-50) 50㎕을 첨가하여 총량 혼합 비율(final volume ratio)이 1:1이 되게 하여 실온에서 15분간 반응시켜 주었다.

백신 제제는 1ml 용량의 인슐린 주사기를 이용하여 총량 100㎕을 마우스의 등(Dorsal part)의 피하(Subcutaneous)로 접종하였다. 각 시험군으로서 5 마리의 C57BL/6 strain 5주령의 암컷 마우스를 사용하였고, 시험군의 구성은 아래의 [표 2]와 같이 구성하였으며, 구체적으로 인산 완충액 단독(PBS), ScaA 재조합 단백질 단독, ScaC 재조합 단백질 단독, Alhydrogel과 ScaA 재조합단백질 혼합물, Alhydrogel과 ScaC 재조합단백질 혼합물, Alhydrogel과 56KDa 재조합단백질 혼합물, Alhydrogel과 동량의 ScaA, 56KDa(TSA56) 재조합단백질 혼합물을 접종한 마우스가 사용되었다(아래 [표 2] 참조).

각각의 시험군에서 생쥐 5마리씩 면역하였고, 2주 간격으로 총 3회 접종을 실시하였다. 매회 접종 1주일 후 안와 채혈을 통해 각 마우스에서 50 ㎕씩 채취하여 2500 x g로 5분간 원침하여 혈장을 분리하였다. 분리된 혈장을 Sca 등의 단백질에 대한 특이적인 항체 측정에 사용하였다. 또한 항원을 면역하지 않은 음성대조군에서 측정된 흡광도를 기준으로 항체 역가를 결정하였다.

Sca 등의 항원 특이 항체 정량을 위한 ELISA

ELISA 방법을 이용하여 면역 후 생성된 ScaA, ScaC 및 TSA56 항원에 대한 특이 항체 정량을 수행하였다.

Immunoassay plates(96-well plates; Nunc, Rochester, NY)에 각 ScaA, ScaC 및 TSA56 항원을 0.05M bicarbonate buffer (pH 9.5)에 1㎍/㎖의 농도로 첨가한 뒤 100㎕/well로 분주하여 4℃에서 18시간 동안 코팅하였다. 이후 세척액(0.05% Phosphatate Buffered Sakine Tween-20, PBST)을 이용해 항원 용액을 제거하고 3% BSA(Bovine serum albumin)로 실온에서 2시간 동안 Blocking을 실시하였다. 준비된 생쥐의 혈장을 100배 희석하고 이를 1/2 씩 단계희석(serial dilution)하여 100㎕/well로 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켜 주었다. 각 well을 PBST로 3회 세척하고 생쥐의 IgM, IgG₁ 또는 IgG_2a을 인식 할 수 있는 Horseradish peroxidase(HRP)-conjugated Rat-IgM 또는 Horseradish peroxidase(HRP)-conjugated Rat-IgG 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시켜 준 뒤 다시 PBST로 3회 세척하였다. 발색약인 TMB 용액(KPL)사용하여 상온에서 10분간 반응시키고, 반응 정지액인 1N H₂SO₄를 50㎕씩 각 well에 첨가하였다. Microplate reader을 이용해 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

면역한 마우스의 쯔쯔가무시균 감염실험

쯔쯔가무시균의 Sca 재조합 단백질 백신 제제를 접종하였을 경우 보호면역 반응이 유발되는지 확인하기 위해 인산 완충액 단독, ScaA(20㎍) 재조합 단백질 단독, ScaC(20㎍) 재조합 단백질 단독, Alhydrogel과 ScaA(20㎍) 재조합 단백질 혼합물, Alhydrogel과 ScaC(20㎍) 재조합 단백질 혼합물, Alhydrogel과 TSA56(20㎍) 재조합단백질 혼합물의 실험군으로 나누어 1차 실험을 진행하였다.

2주일 간격으로 총 3회 면역을 실시하였으며, 동종 혈청형(Homologous serotype)에 대한 반응을 살펴보기 위해 일주일 뒤 마우스에 반 수치량(Lethal Dose 50)의 10배, 100 배의 쯔쯔가무시균 보령 균주를 PBS에 200㎕ 용량으로 희석시킨 후, 마우스의 복강내로 주입하였으며 생존율을 확인하였다.

1차 동물실험을 수행한 후 Sca 등의 재조합 단백질이 이종 혈청형(Heterologous serotype)에 대한 보호 면역 효과를 보이는지 확인하기 위한 2차 실험을 진행하였다. Alhydrogel 단독, Alhydrogel과 ScaA 재조합단백질 혼합물, Alhydrogel과 TSA56 재조합단백질 혼합물, Alhydrogel과 동량의 ScaA, TSA56 재조합단백질 혼합물 투여 실험군으로 나누어 실험을 수행하였다.

2주일 간격으로 총 3회의 면역을 실시하였으며, 일주일 뒤 마우스에 반 수치량(Lethal Dose 50)의 10배, 100 배의 쯔쯔가무시균 보령 균주 이외에 카프, 카토 균주를 PBS에 200㎕ 용량으로 희석시킨 후, 마우스의 복강내로 주입하였으며 생존율을 확인하였다.

<실시예 3-2> 실험결과

Sca 특이적 항체 생성 결과

상기 실험 방법에 제시된 대로, 항원특이적인 IgG₁과 IgG_2a항체의 isotype별로 측정을 실시하였다. IgG₁과 IgG_2a항체를 측정한 이유는 IgG₁와 IgG_2a 항체가 각각 TH₂ 및 TH₁ 반응의 활성을 반영하는 것으로 알려져 있기 때문이다. TH₁ 면역반응은 주로 세포 매개 면역반응을 촉진하고 TH₂ 면역반응은 주로 체액 면역 반응을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 쯔쯔가무시균에 대한 효과적인 면역반응은 TH₁ 반응인 것으로 알려져 있다.

[도 6]에 ScaA, ScaC, TSA56 단백질 항원을 접종한 후 생성된 각각의 항원에 대한 항체 역가를 측정 결과를 나타내었다. IgG₁과 IgG_2a항체 뿐 아니라 초기 면역 반응에 관여하는 IgM의 수치도 확인하였다.

[도 6]의 결과를 참조하여 보면, Alhydrogel과 ScaA 재조합 단백질 혼합물 및 Alhydrogel과 동량의 ScaA, TSA56 재조합단백질 혼합물을 면역한 마우스그룹에서 ScaA 특이적인 IgM, IgG1, IgG2a 항체가 모두 효과적으로 생성되었으며 이를 통해 강력한 체액성 면역 반응을 유발되었다는 것을 알 수 있다.

면역한 마우스의 쯔쯔가무시균 감염실험 결과

상기 실험 방법에 제시된 대로, 상기 [표 2]의 백신 후보 물질을 3회 접종 후 1주일 뒤 반수치량(Lethal Dose 50)의 10배, 100 배의 쯔쯔가무시균 보령, 카프, 카토 균주를 PBS에 200㎕ 용량으로 희석시킨 후, 마우스의 복강 내로 주입하고 마우스의 생존율(Survival rate)을 관찰한 결과를 [도 7] 및 [도 8]에 나타내었다.

[도 7]은 반수치량(Lethal Dose 50)의 10배, 100 배의 보령 혈청형 감염에 대한 생존율을 확인한 1차 실험 결과이며, [도 8]은 보령 혈청형, 카프 혈청형 및 카토 혈청형 감염에 대한 생존율을 추가적으로 확인한 2차 실험 결과이다.

[도 7]의 결과에서 나타나듯이, ScaC를 면역한 시험군(ScaC 및 Alum+ScaC)은 항원을 면역하지 않은 음성대조군(PBS)과 비슷하게 감염 12일과 13일 이내에 모두 사망하였으나, ScaA를 면역한 시험군에서는 항원보조제인 Alhydrogel과 혼합 투여할 경우(Alum+ScaA) 보령 혈청형의 주입량을 불문하고 1마리만 사망하고 나머지 생쥐들은 모두 생존하여 80%의 생존율을 보였다. 기존에 알려진 대로, 보령 균주에서 유래한 TSA56 단백질로 면역한 시험군(TSA56/Alum)은 모두 생존하였다. 따라서 ScaA는 ScaC에 비하여 더 효과적으로 방어 면역능을 유도할 수 있는 것으로 확인되었으며, 그 효능은 기존에 알려진 TSA56 단백질과 거의 유사한 것으로 확인되었다.

또한 [도 8]을 참조할 때, 감염시킨 혈청형과 그 주입량을 불문하고 대체로 TSA56와 ScaA의 혼합 백신 제제, ScaA 백신 제제 및 TSA56 백신 제제 순으로 효과가 높음을 알 수 있다. 특히 TSA56와 ScaA의 혼합 백신 제제는 보령 혈청형 및 카프 혈청에 대해서 실험 기간인 30일까지 100% 생존율을 보였다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Vaccine Composition for Orientia tsutsugamushi <130> PP14-000-SNU-CHONAMHYUK <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1461 <212> PRT <213> Orientia tsutsugamushi <400> 1 Met Lys Asn Ser Arg Lys Ile Ser Leu Ile Phe Phe Thr Thr Leu Phe 1 5 10 15 Thr Ile Ser Asn Ile Thr Ile Ile Gln Thr Ala Asp Asn Asp Pro Ser 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Phe Thr Gly Ser Gly Ala Ser Gln 35 40 45 Ser Asn Asn Thr Thr Glu Ser Ser Asn Asp Asn Gln Gly Asp Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ala Thr Ser Asn Pro Ser Asn Pro Ser Asn Pro Ser Asn Pro 65 70 75 80 Ile Glu Gly Ala Ser Gly Thr Thr Pro Ala Thr Gly Ala Ser Asp Ala 85 90 95 Thr Gly Val Thr Glu Thr Thr Gly Gly Ser Ala Thr Gly Ser Glu Val 100 105 110 Thr Asp Gly Lys Lys Ser Lys Lys Ser Pro Phe Lys Lys Leu Lys Gly 115 120 125 Phe Gly Ser Thr Leu Ser Leu Ser Gly His Thr Lys Ser Glu Glu Pro 130 135 140 Ser Glu Gly Ala Thr Gly Gly Lys Glu Ser Ser Thr Ser Thr Leu Lys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Lys Gln Leu Gly Ser Thr Met Ser Leu Ser Ser Thr Thr 165 170 175 Pro Gly Glu Pro Lys Ala Pro Ile Val Leu Ser Asp Ser Thr Asn Lys 180 185 190 Gln Val Glu Val Lys Gln Asn Lys Gly Ser Gly Val Gln Lys Val Val 195 200 205 Val Lys Gln Pro Glu Val Gly Phe Glu Lys Met Asp Gly Lys Gly Asn 210 215 220 Ser Ile Glu Ile Ser Val Glu Glu Asn Ala Lys Val Thr Ile Lys Gly 225 230 235 240 Glu Asp Cys Tyr Arg Ile Lys Leu Ala Asn Leu Asn Leu Thr Asp Ser 245 250 255 Glu Leu Ile Val Asn Asn Thr Leu Tyr Ser Asn Ser Glu Leu Lys Thr 260 265 270 Thr Ser Pro Ile Thr Ser Ser Met Ser Met Pro Asn Leu Ser Asp Thr 275 280 285 Asp Val Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Arg Arg Ser Ser Ser Ile Ile 290 295 300 His Ser Ala Gly Gln Ser Pro Phe Asp Leu Ser Phe Phe Ser Ser Thr 305 310 315 320 Ala His Gly Gly Lys Thr Glu Ser Thr Asp Arg Ala Ser Phe Thr Gly 325 330 335 Ile Gly Ser Phe Val Val Gln Ser Pro Thr Ile Leu Ser Ser Asp Leu 340 345 350 Asn Ile Cys Gly Asn Ile Asn Val Thr Lys Pro Phe Gln Leu Leu Thr 355 360 365 Val Pro Pro Val Met Leu Lys 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Gln Gly Gln Gly Gln Gln Gln Gln Ala 340 345 350 Gln Ala Thr Ala Gln Glu Ala Val Ala Ala Ala Ala Val Arg Leu Leu 355 360 365 Asn Gly Ser Asp Gln Ile Ala Gln Leu Tyr Lys Asp Leu Val Lys Leu 370 375 380 Gln Arg His Ala Gly Ile Arg Lys Ala Met Glu Lys Leu Ala Ala Gln 385 390 395 400 Gln Glu Glu Asp Ala Lys Asn Gln Gly Lys Gly Asp Cys Lys Gln Gln 405 410 415 Gln Gly Ala Ser Glu Lys Ser Lys Glu Gly Lys Val Lys Glu Thr Glu 420 425 430 Phe Asp Leu Ser Met Val Val Gly Gln Val Lys Leu Tyr Ala Asp Leu 435 440 445 Val Thr Thr Glu Ser Phe Ser Ile Tyr Gly Gly Val Gly Ala Gly Leu 450 455 460 Ala Tyr Thr Tyr Gly Lys Ile Asp Asn Lys Asp Val Lys Gly Tyr Thr 465 470 475 480 Gly Met Val Ala Ser Gly Ala Leu Gly Val Ala Ile Asn Ala Ala Glu 485 490 495 Gly Val Cys Val Asp Leu Glu Ala Gly Tyr Met His Ser Phe Ser Lys 500 505 510 Val Glu Asp Lys Tyr Gln Val Asn Ala Phe Ile Ala Ser Ala Cys Val 515 520 525 Arg Tyr Asn Phe 530 <210> 3 <211> 4386 <212> DNA <213> Orientia tsutsugamushi <400> 3 atgaaaaact caagaaagat atcactaatt ttttttacaa ctttatttac tattagtaat 60 attacaatta tacaaacagc tgataatgat ccatcagctt catcaagtag cagcggaggt 120 tttactggta gtggggcatc gcagagcaat aacacaactg aaagtagtaa tgataatcag 180 ggagacacag gtagcggcgc aacaagtaat ccaagtaatc caagtaatcc aagtaatcca 240 attgaaggag ctagtggcac tactcctgca actggtgcca gcgatgcaac tggtgtcact 300 gaaacgactg gagggagtgc aactggcagc gaagtaactg atggcaaaaa atctaaaaaa 360 tcacctttta aaaaactaaa aggttttggt agcactttat cattaagtgg tcacactaag 420 tcagaagaac ctagtgaagg tgcaactgga ggaaaagaat ctagcacatc aactcttaaa 480 agactaagaa aacaacttgg tagtaccatg tcattaagca gtactactcc tggagagcct 540 aaagctccta ttgtactaag tgatagtact aataagcagg tagaggttaa gcaaaacaaa 600 ggatctggag tacagaaagt tgtagttaag cagcctgaag taggatttga aaaaatggat 660 ggtaaaggta acagtattga gattagtgtt gaagaaaatg ctaaagtaac tataaaaggt 720 gaggattgct ataggattaa attggcaaat ttaaacctca cagattctga gttaatagta 780 aataatacac tgtattcaaa tagtgaactt aaaactactt cacctattac atcaagtatg 840 tcaatgccta atctttctga tacagatgta agcagtagct ctacttcaag cagaagaagc 900 tcatcaatca ttcatagtgc aggacagtct ccatttgatc tttccttttt tagctctaca 960 gctcatggcg gaaaaactga atccacagat agagcaagtt ttactggtat tggatctttt 1020 gttgtgcaat cacctacaat attatctagt gatttaaata tttgtggaaa tattaatgtt 1080 actaaaccat ttcaattact tactgtccct ccagtgatgc tgaaaacgct tactgttgaa 1140 cgatccaaac ttgtacctca gaagtcagga gttttaaatc tgcaatcaga tcttacagct 1200 aatatagaag ttaaaggtgc tacggttgtt gctagtggta gtagtactaa aatttctttt 1260 aataaatttg gtacaccgaa taaccctatt cctgtgaaag tagatggtgt attaaaatta 1320 caagccgagc tgcaatctag tggtttaaaa acagtggata tgtatgctag cataacgcct 1380 aaaaaacaat cagcatcaga agtacatttt ttaaattctg ctagtagtac tagcctaaca 1440 acgtatcatg ttcatggctt tattggaaca cctgattttg tcacaggaaa aatattggtt 1500 gatggtgaaa cagtgctaaa tgttactgga aatttatata cacaaaaact aaagctaaat 1560 tcttcaaata aagtttctcg tggtgatagc gatacgcatg gatgtatagt attgaatggt 1620 gaaatgtata gcagatcagt agagccatct gtatctaact atggaaaatt aattatacat 1680 ggtaacccta gtactaagta tgatccagat cattataaaa gtatatttta tggagatatt 1740 ggaactggtc gaagtaagat acatagaatc gaatttgcag aacattcaaa taatccaaac 1800 ggaatacgtc cttatactaa ctggttcata agttatgata aaagtatgaa taaatctagt 1860 attttttgta gtgatattat ttttagtcat ccagaagata cgattaatgt ccttggcaat 1920 acagttatcg aaggtaacat aggaacaaaa ggtcatagtg gtgggaaaat tatagtacgt 1980 aataatggta cactaactca caatggtggt gatattggaa atactaaaat tagtaatcct 2040 aattcacttc aagcactttg tctttgtgaa aatgcatctt ttgtttctat gcctggtagt 2100 aatagtatac cttatacttg taatataaaa gaaataactg cagaccaaaa cagttatatt 2160 gaattgaata gtaacgctga ttggaatgca aatataattc ctacaggccc tggtgcaaaa 2220 cttacaatga gtcaaggaag ctatagtggt aatattggaa ctaaggacaa gccaatgtta 2280 aatgttacat tgctaccaaa gtctaaaaga caatctttaa tagaagtaga tggatcagta 2340 catacgaagc aattttcgat tagcgacaag tcatctgcta gaggtgagat ggcgttactt 2400 ggagattata ctgttacagc tcaaactagc gatggatctg gtaacatcaa tgtaggtaat 2460 gcaagtatta accttggcat caatacacta gctctatttg gtgataatat tatcatattg 2520 ggacataagt caaacaaagg atctagtact aatcctaaaa aatttgataa gaagcctgtt 2580 actgtattta gtataggata tactactaac tcagatggga ctgttaaaac tcaaggtaag 2640 ttaaaattga gtaaacatta cgatccaagt aacaaaatcg tactaaatgt cgttcatcaa 2700 ggagattcaa gggatttaag taaacatggg cctcaaacta taatacaacc tgtagatatt 2760 gctgacactg gaaatttaga tgtaagtggc ttaatatatg tatgcgatgg caaatgcaag 2820 tggcagccag tacctggttc tgacggacaa ttagcatttg ctggattggt agataagaag 2880 aaaaaagata aaggagatga tggcgcttca agtagtagtg gtagtagtag tatagcacca 2940 tctgctagag ttagcccaga agtaagcgat ggtgaagaag gtggcaaaga cgaagatata 3000 caagcgtctg ctgcttctca tttacatagt aaggatagtg ctcatagcaa acagtcgcag 3060 gataaagatc atactgaaga tcctgaaaat cctgaagata ctactgaagc tgctattgaa 3120 gaacttgctc ggcgacttga cgatcctata ctgtcacgac gtgctgctga acaaccacag 3180 cctgatcctg ctgagcaggc gcaacctgtt gttgcacaac cacttgcggc tggtgctggt 3240 atgcaacgac agcaacaaca gcaacaacag caacaacagc aacaacagca acaacagcaa 3300 caacagcaac aacatattag cagcggtgtg caaccacaac aacatctttc atcaccttat 3360 agtgatgacc aagagcaaag tagtgagcaa gcggttgctc tacaaccaat attgcaaaga 3420 actgcttctg atgcaccttt gaaaggtgga gtaaatatta cagttgcagc tatatcttct 3480 atagttgaat ctagagcatc aaacaacaaa tctgtgtcag atatagtatc atctggatct 3540 aatatcaata aacaatcatg gaatatttgg gctgatggct ttttctcaaa tgttaatcaa 3600 caagaccata agcatattca aggatataaa acagatatta gcggtatttc tattggagca 3660 gataagcatt tgaaaaataa tgctattatc ggtgcagcta tttcatatgc aaagtttgat 3720 actaaacata cagatagcag aatagaaaaa ataaacagta acgtttactt attatcttta 3780 tatggtcaat attcgtttca aagtactaca tttattcgag gaatgataaa tgttgctaag 3840 ttcagtgatg atagtaaaaa tagttctcta acattatggc aagggcatag ttatcatggt 3900 agcctcaccg cagggcatta tttttatcca ttaaaaaata ataagaagct aagtttagta 3960 ccaactgttg gtattagaca ttcgtacttt aatacttctg gcaataaatc agtagataat 4020 tcatctaata aaactatagg tgacagaagt cataaagcat tagaaggaat aattggtatc 4080 tctttagagc agttagttgt aaataatgca aataataatc tcaatgtact ttctacagtc 4140 tatggatatg ttcatcataa cttatatgat tgtcaagatg gtgcacagct accaaacatt 4200 aactctacat ttaatccaga tgttataact tctcgtgaac agtgtttaca taaaacattc 4260 tatcaattag gtgttaaatt agctattaag cgtaatataa tggatatagg tattgcttgc 4320 gacgtttatt tggctgaaaa atatattagc catactggaa taatatatgc aaaggctagc 4380 ttttag 4386 <210> 4 <211> 1599 <212> DNA <213> Orientia tsutsugamushi <400> 4 atgaaaaaaa ttatgttaat tgctagtgca atgtctgcgt tgtcgttgcc gttttcagct 60 agtgcgatag aattggagga tgaagtagga ttagagtgtg gtccttatgc taaagttgga 120 gttgttggag gaatgattac tggtgcagaa tctactcgct tggattcaac tgattctgag 180 ggaaaaaaac atttgtcatt aacaactgga ctgccatttg gtggtacatt agctgcgggt 240 atgacaattg caccaggatt tagagcagag ctaggtgtta tgtaccttag aaatataagc 300 gctgaggttg aagtaggtaa aggcgaggta gattctaaag gtgagataaa ggcagattct 360 ggaggtggga cagatgctcc tatacgtaag ccgtttaaac ttacaccacc tcagcctact 420 atgatgccta taagtatagc tgatcgtgac tttgggattg atattcctaa catacctcag 480 gcgcaagcgc aagctgcaca gcctccgctt aatgatcaga agcgtgctgc agctaggatc 540 gcttggttaa agaattgtgc tggtattgac tatatggtga aggatcctaa taatcctggg 600 catatgatgg taaatccggt gttgttaaat attccacagg gcaaccctaa tcctgttgga 660 cagccaccgc agcgagcaaa tcagcctgca aattttgcga tacataacca tgagcaatgg 720 aggagtttgg tagttggtct tgctgcatta tcaaatgcta ataaacctag cgcttctcct 780 gtcaaagttt tgagtgacaa aattattcag atatatagtg atataaagcc atttgctgat 840 atagctggta ttaatgttcc tgatactggt ttgcctaata gtgcatctat cgaacagata 900 cagagtaaaa tccaagaatt aggtgataca ttggaagaac tcagagattc ttttgatggg 960 tatattaata atgcttttgt taatcagata cacttgaatt ttgtcatgcc gccgcaagca 1020 cagcaacagc aggggcaagg gcagcaacag caagctcaag ctacagcgca agaagcagta 1080 gcagcagcag ctgttaggct tttaaatggc agtgatcaga ttgcgcagtt atataaagat 1140 cttgttaaat tgcagcgtca tgcaggaatt aggaaagcca tggaaaaatt agctgcccaa 1200 caagaagaag atgcaaagaa tcaaggtaaa ggtgactgca agcagcaaca aggagcatct 1260 gaaaaatcta aagaaggaaa agtcaaagaa acagagtttg atctgagtat ggttgttggc 1320 caagttaaac tctatgctga cctagttaca actgaatcat tctcaatata cggtggtgtt 1380 ggtgcagggt tagcttatac ttatggaaaa atagataata aggatgttaa agggtataca 1440 ggcatggttg catcaggagc acttggtgta gcaattaatg ctgctgaggg tgtatgtgtg 1500 gacttagagg ctggttatat gcactcattc agtaaagtag aagataagta ccaagtaaac 1560 gcgtttattg caagtgcatg tgtgcgctat aacttctag 1599

Claims

단리된 전장의 ScaA 단백질, 단리된 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역, 또는 단리된 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역의 실질적 일부를 활성성분으로 포함하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단리된 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역의 실질적 일부는 서열번호 1에서 26번째 아미노산에서부터 1186번째 아미노산까지의 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역 중에서 80% 이상의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단리된 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역의 실질적 일부는 서열번호 1에서 30번째 아미노산 서열에서 1000번째 아미노산 서열까지 총 971개의 아미노산 서열로 이루어진 폴레펩티드인 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 오리엔티아 쯔쯔가무시 균은 카프 혈청형, 카토 혈청형, 길리엄 혈청형 및 보령 혈청형에서 선택된 혈청형인 것을 특징을 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 오리엔티아 쯔쯔가무시 균은 보령 혈청형, 카프 혈청형 및 카토 혈청형에서 선택된 혈청형인 것을 특징을 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
제6항에 있어서,
상기 약학적으로 허용되는 담체는 희석제, 부형제, 안정화제 및 방부제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 단리된 TSA56 단백질 또는 그것의 단리된 항원성 영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
제1항 내지 제8항에 있어서,
상기 조성물은 항원 보조제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
제9항에 있어서,
상기 항원 보조제는 겔 상의 알루미늄염인 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.