KR20180015185A

KR20180015185A - 돼지 생식기 호흡기 증후군 및 돼지 써코바이러스 연관 질환에 대한 백신 조성물

Info

Publication number: KR20180015185A
Application number: KR1020177037805A
Authority: KR
Inventors: 유-신 치엔; 멩-주 차이; 파오-옌 라이; 웨이-아이 초우; 시우-캉 창
Original assignee: 레버 제네틱스 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2015-06-01
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2018-02-12
Also published as: CN107847575A; US20160346377A1; JP6676661B2; TWI621627B; EP3302543A4; CA2985381A1; EP3302543B1; AU2016271144A1; AU2016271144B2; CN107847575B; ES2790527T3; TW201706296A; DK3302543T3; EP3302543A1; JP2018516926A; US10010602B2; WO2016196383A1; CA2985381C; KR102041032B1

Abstract

항원 제시 세포(APC)-결합 도메인 또는 CD91 수용체-결합 도메인, 전좌 펩타이드, 융합 항원, 소포체 보유 서열, 및 임의로 핵 배출 신호를 포함하는 융합 단백질이 기재된다. 융합 항원은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) ORF7 항원, PRRSV ORF1b 항원, PRRSV ORF6 항원, 및 PRRSV ORF5 항원을 포함한다. 융합 단백질은 항원-특이적 세포-매개 및 체액성 반응을 유도하는데 유용하다.

Description

돼지 생식기 호흡기 증후군 및 돼지 써코바이러스 연관 질환에 대한 백신 조성물

본 발명은 일반적으로 백신, 더 구체적으로 아단위 백신에 관한 것이다.

면역 세포(예를 들면, T-세포, B-세포, 수지상 세포, 단핵구, 또는 대식세포)를 감염시키는 바이러스는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus: PRRSV), 돼지 써코바이러스 II형(porcine circovirus type II: PCV2), 및 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus: HIV)를 포함한다. 면역성이 있는 세포는 면역화 반응을 일으킬 수는 없지만 바이러스를 보유한다. 이들 바이러스에 의해 감염된 동물은 다른 병원체에 쉽게 감염될 수 있다. 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)는 축산업에서 매년 높은 손실을 야기한다. 돼지뿐만 아니라 오리도 PRRSV에 감염될 수 있다. 일반적으로, 바이러스에 감염된 동물은 유의미한 증상을 갖지 않지만 감염된 동물의 면역력은 감소한다. 이러한 바이러스는 대식세포(폐포 및 비장에서), 뇌 소교세포 및 단핵구를 감염시키고, 감염된 동물의 혈액 및 기관에 존재할 수 있다. 이는 체중 증가의 감소 및 이차 감염으로 인한 사망률의 증가를 야기한다.

미국 특허 제7,595,054호에는 아단위 백신으로서 사용된 융합 항원이 기재되고, 여기서 ORF1b의 영역 또는 ORF7의 영역으로부터 선택된 단일 항원 잔기는 세포독성 도메인 III이 결여된 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 A 폴리펩타이드, 즉 PE(ΔIII)와 소포체 보유 서열(endoplasmic reticulum retention sequence) 사이에 융합된다.

레버 제네틱스 코 엘티디(Reber Genetics Co. Ltd.)에 의해 "PRRSFREE™"으로 명명된 백신 조성물은 각각 D, M, R, 및 P로 지정된 4개의 별개의 PRRS 항원을 포함한다. 이들 4개의 PRRS 항원은 미국 특허 제7,595,054호에 기재된 디자인을 사용하여 4개의 별개의 벡터에 의해 각각 발현되고, 동물에서 세포-매개 및 체액성 면역 반응을 유도하는데 효과적인 것으로 확인되었다.

하나의 양상에 있어서, 본 발명은, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 융합 단백질에 관한 것으로서, 상기 PRRSV 융합 단백질은,

(a) 융합 단백질의 N-말단에 위치한, 항원 제시 세포(APC)-결합 도메인 또는 CD91 수용체-결합 도메인;

(b) APC-결합 도메인 또는 CD91 수용체-결합 도메인의 C-말단에 위치한, 서열 번호 4, 2, 3, 또는 6과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 길이 34-112 아미노산 잔기의 전좌 펩타이드;

(c) (i) 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) ORF7 항원;

(ii) PRRSV ORF1b 항원;

(iii) PRRSV ORF6 항원; 및

(iv) PRRSV ORF5 항원

을 포함하는 융합 항원;

(d) 융합 단백질의 C-말단에 위치한 소포체 보유 서열; 및

(e) 임의로, 항원과 소포체 보유 서열 사이 또는 전좌 펩타이드와 항원 사이에 위치한, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 핵 배출 신호를 포함하되;

여기서 융합 항원은 전장 ORF7, ORF6, ORF5 및 ORF1b 단백질 서열을 포함하지 않는다.

본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, ORF7 또는 ORF1b 항원은 ORF6 항원에 대하여 N-말단에 위치하고, ORF5 항원은 ORF6 항원에 대하여 C-말단에 위치한다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, ORF6 항원은 ORF6과 ORF5 항원 사이에 브릿지 또는 링커가 없는 ORF5 항원에 대하여 N-말단에 위치한다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 융합 항원 ORF7 항원의 2개의 반복 배열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, ORF5 항원은 ORF6 항원에 대하여 C-말단에 위치한다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, ORF6 항원은 PRRSV ORF6의 N-말단 부분 아미노산 서열을 포함하고, ORF5 항원은 PRRSV ORF5의 N-말단 부분 아미노산 서열을 포함하고, 융합 항원은 ORF6 및 ORF5의 C-말단 부분 아미노산 서열을 포함하지 않는다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, ORF1b 항원은 ORF1b NSP 10의 C-말단 부분 아미노산 서열 및 ORF1b NSP 11의 N-말단 부분 아미노산 서열을 포함하고, 융합 항원에는 ORF1b의 N-말단 및 C-말단 부분 아미노산 서열이 없다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, APC-결합 도메인 또는 CD91 수용체-결합 도메인은 서열 번호 1, 8, 9, 10, 11, 또는 32와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 소포체 보유 서열은 아미노산 KDEL의 반복 배열 없이 아미노산 서열 KDEL(서열 번호 15)을 포함하고, 단 핵 배출 신호가 존재한다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, APC-결합 도메인 또는 CD91 수용체-결합 도메인은 서열 번호 1 또는 32와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 핵 배출 신호 및 ER 보유 서열은 서열 번호 12와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 융합 펩타이드를 형성한다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 소포체 보유 서열은 서열 번호 16, 17, 18, 또는 19의 아미노산 서열을 포함하고, 단 핵 배출 신호가 존재하지 않는다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, APC-결합 도메인 또는 CD91 수용체-결합 도메인은 서열 번호 8과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.

또 다른 양상에서, 본 발명은, 조성물로서,

(i) 본 발명의 PRRSV 융합 단백질; 및

(ii) 돼지 써코바이러스 2형(PCV2) 융합 단백질을 포함하되, 상기 PCV2 융합 단백질은,

(b) APC-결합 도메인 또는 CD91 수용체-결합 도메인의 C-말단에 위치한, 서열 번호 4, 2, 3, 또는 6과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 길이 34-112 아미노산 잔기의 전좌 펩타이드; 및

(c) PCV2 ORF2 항원;

(d) 융합 단백질의 C-말단에 위치한 소포체 보유 서열; 및

(e) 항원과 소포체 보유 서열 사이 또는 전좌 펩타이드와 항원 사이에 위치한, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 핵 배출 신호를 포함하며,

여기서 PCV2 ORF2 항원은 PCV2 ORF2 단백질의 C-말단 부분 아미노산 서열을 포함하고, PCV2 융합 단백질은 PCV2 ORF2 단백질의 N-말단 부분 아미노산 서열을 포함하지 않는, 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, APC-결합 도메인 또는 CD91 수용체-결합 도메인은 슈도모나스 외독소 A(PE) 결합 도메인 I의 아미노산 서열을 갖지 않는다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 전좌 펩타이드는 길이 34-46 아미노산 잔기를 갖는다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 전좌 펩타이드는 길이 34-61 아미노산 잔기를 갖는다.

추가의 또 다른 양상에서, 본 발명은 항원-특이적 세포-매개 및 체액성 반응을 유도하는 방법으로서, 본 발명의 융합 단백질의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하고, 이로써 항원-특이적 세포-매개 및 체액성 반응을 유도하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상에서 항원-특이적 세포-매개 및 체액성 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 융합 단백질의 치료적 유효량을 포함하는 조성물 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상에서 항원-특이적 세포-매개 및 체액성 반응을 유도하는데 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질의 치료적 유효량을 포함하는 조성물 또는 본 발명의 조성물에 관한 것이다.

대안적으로, 본 발명은 항원-특이적 세포-매개 및 체액성 반응을 유도하는 방법으로서, 본 발명의 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하고, 이로써 항원-특이적 세포-매개 및 체액성 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 융합 항원은 전장 ORF7, ORF6, ORF5 및 ORF1b 단백질 서열을 포함하지 않으면서 ORF7, ORF6, ORF5 및 ORF1b에 대한 중화 및 보호 에피토프를 포함한다.

ORF7 항원은 서열 번호 33, 22, 또는 23의 아미노산 서열을 포함한다.

ORF1b 항원은 ORF1b NSP 10의 C-말단 부분 및 ORF1b NSP 11의 N-말단 부분의 아미노산 서열을 포함하고, ORF1b의 N-말단 및 C-말단 부분이 없다. 즉, 융합 항원은 ORF1b NSP 10의 C-말단 부분 및 ORF1b NSP 11의 N-말단 부분의 아미노산 서열을 포함하고, ORF1b의 N-말단 및 C-말단 부분의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.

ORF6 항원은 PRRSV ORF6의 N-말단 부분 아미노산 서열을 포함하고, ORF5 항원은 PRRSV ORF5의 N-말단 부분 아미노산 서열을 포함하고, 융합 항원은 ORF6 및 ORF5의 C-말단 부분 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 다시 말해서, ORF6 항원은 PRRSV ORF6의 N-말단 부분 아미노산 서열로부터 선택되고, ORF5 항원은 PRRSV ORF5의 N-말단 부분 아미노산 서열로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, PRRSV ORF6의 N-말단 부분 아미노산 서열은 서열 번호 34이고, PRRSV ORF5의 N-말단 부분 아미노산 서열은 35이다.

추가의 본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, PRRSV ORF6의 N-말단 부분 아미노산 서열은 서열 번호 36이고, PRRSV ORF5의 N-말단 부분 아미노산 서열은 37이다. ORF1b 항원은 ORF1b NSP 10의 C-말단 부분 아미노산 서열 및 ORF1b NSP 11의 N-말단 부분 아미노산 서열을 포함하고, 융합 항원은 ORF1b의 N-말단 및 C-말단 부분 아미노산 서열이 없다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, ORF1b 항원은 길이 200 미만의 아미노산 잔기를 갖고, 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, ORF1b 항원은 PRRSV ORF1b의 아미노산 잔기 1046 내지 아미노산 잔기 1210의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 서열 번호 13의 C-말단 아미노산은 알라닌이다.

이들 및 다른 양상은 하기 도면과 함께 하기 바람직한 실시형태의 설명으로부터 명백해질 것이다. 첨부된 도면은 본 발명의 하나 이상의 실시형태를 예시하고, 기재된 설명과 함께, 본 발명의 원리에 대한 설명을 제공한다. 가능한 한, 도면 전체에서 실시형태의 동일하거나 유사한 원소를 지칭하는데 동일한 참조 숫자가 사용된다.

도 1A는 전장 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A(PE), 및 PE의 부분 절편을 나타낸 도식적 도면이다.
도 1B 내지 도 1C는 벡터 맵을 도시한다.
도 1D는 PRRSFREE로 명명된 백신 조성물의 제조에 사용되는 4개의 별개의 플라스미드를 보여주는 도식적 도면이다. 백신 조성물 PRRSFEE는 4개의 별개의, 개별적인 PE 융합 단백질을 포함한다. PRRSFREE 백신 조성물 중의 각각의 개별적인 PE 융합 단백질은 PE(ΔIII) 절편(PE₄₀₇), 단일 항원 모이어티(M, P, R, 또는 D로 지정됨), 및 내형질 보유 서열(K3)을 포함한다. 용어 "D" 또는 "DGD"는 PRRSV 핵단백질 ORF7로부터의 항원을 나타낸다. 용어 "R" 또는 "RSAB"는 그 사이에 브릿지/링커 서열이 없는 PRRSV ORF6/막 단백질과 ORF5/주요 엔벨로프 단백질의 융합 항원을 나타낸다. 용어 "M" 또는 "M12"는 PRRSV ORF1b로부터의 항원을 나타내고, PRRSV 비구조적 단백질 NSP 10과 NSP 11의 인공적인 융합 항원이다. 용어 "P" 또는 "PQAB"는 그 사이에 브릿지/링커 서열이 없는 PRRSV ORF6/막 단백질과 ORF5/ 주요 엔벨로프 단백질의 융합 항원을 나타낸다. 용어 "PE(ΔIII)"는 세포독성 도메인 III이 없는 PE 절편을 나타낸다. 용어 "PE₄₀₇"은 아미노산 1 내지 아미노산 407의 슈도모나스 외독소 A(PE) 폴리펩타이드를 나타낸다.
도 1E는 PE-DRMP-NESK 또는 PRRSFREE 4-in-1으로 지칭되는 PE 융합 단백질의 제조에 사용되는 플라스미드를 보여주는 도식적 도면이다. PE-DRMP-NESK 융합 단백질은 PE(ΔIII) 절편(PE₃₁₃), 4개의 항원 모이어티(DRMP로 지정됨)를 포함하는 단일 융합 폴리펩타이드, 핵 배출 신호(NES), 및 내형질 보유 서열(K)을 포함한다.
도 1F는 PE(ΔIII) 절편(PE₃₁₃), 단일 항원 모이어티(PCV2로 지정됨), 핵 배출 신호(NES), 및 내형질 보유 서열(K)을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 보여주는 도식적 도면이다.
도 2A는 PBS, 또는 백신 조성물 PRRSFREE 4-in-1 또는 PRRSFREE로 면역화된 마우스에서 항원-특이적 세포-매개 면역(CMI) 반응을 보여주는 그래프이다.
도 2B는 PBS 또는 PBS, 또는 백신 조성물 PRRSFREE 4-in-1 또는 PRRSFREE로 면역화된 마우스에서 항원 특이적 항체(IgG) 반응을 보여주는 그래프이다.
도 3A는 PBS 또는 상이한 PRRS/PCV2 콤보(combo) 백신으로 면역화된 마우스에 있어서 PRRSFREE 항원 특이적 CMI 반응을 보여주는 그래프이다.
도 3B는 PBS 또는 상이한 PRRS/PCV2 ORF2 콤보 백신으로 면역화된 마우스에 있어서 PCV2 ORF2 항원 특이적 CMI 반응을 보여주는 그래프이다.
도 4A는 PBS 또는 상이한 PRRS/PCV2 콤보 백신으로 면역화된 마우스에 있어서 PRRSFREE 항원 특이적 항체(IgG) 반응을 보여주는 그래프이다.
도 4B는 PBS 또는 상이한 PRRS/PCV2 콤보 백신으로 면역화된 마우스에 있어서 PCV2 ORF2 항원 특이적 항체(IgG) 반응을 보여주는 그래프이다.
도 5는 (1) 2개의 항원의 융합(PE₃₁₃-DR-NESK에서 항원 D와 R의 융합)을 포함하는 융합 단백질, 또는 (2) 2개의 별개의 융합 단백질의 조합으로서, 각각의 융합 단백질은 2개의 항원의 융합(PE₃₁₃-DR-NESK에서 D와 R의 융합, 또는 PE₃₁₃-MP-NESK에서 M과 P의 융합)을 포함하는 조합, 또는 (3) 4개의 항원의 융합(PE₃₁₃-DRMP-NESK에서 D, R, M, 및 P의 융합)을 포함하는 융합 단백질로 면역화된 마우스에서 PRRSFREE 항원 특이적 CMI 반응을 보여주는 그래프이다.
도 6은 PRRSV 감염에 대항하여 돼지를 면역화하는데 사용되는 다양한 융합 단백질을 보여주는 도식적 도면이다.
도 7은 각각의 PRRSV 항원에 의한 자극 후, 백신 접종된 돼지로부터의 PBMC에 의해 분비된 IFN-γ을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 그 안의 많은 변형 및 변이가 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이기 때문에 오직 예시를 의도하는 하기 실시예에서 더 특정하게 기재된다. 본 발명의 다양한 실시형태는 이제 상세하게 기재된다. 도면에 관하여, 유사한 숫자는 도면 전체에서 유사한 구성요소를 지시한다. 본원의 설명 및 하기 청구항 전체에서 사용되는 바와 같이, "한", "하나", 및 "그"의 의미는 내용이 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 또한, 본원의 설명 및 하기 청구항 전체에서 사용되는 바와 같이, 내용이 달리 명백하게 지시하지 않는 한, "에서"의 의미는 "에서" 및 "위에서"를 포함한다. 게다가, 제목 또는 소제목이 독자의 편의를 위하여 명세서에서 사용될 수 있고, 이는 본 발명의 범위에 영향을 미치지 않을 것이다. 추가로, 본 명세서에서 사용된 몇몇 용어는 하기에 더욱 구체적으로 정의된다.

정의

본 명세서에서 사용되는 용어는 일반적으로 본 발명의 내용에서 당해 분야에서 이들의 일반적인 의미를 갖는다. 본 발명을 설명하는데 사용되는 특정한 용어는 하기 또는 명세서의 다른 곳에서 논의되어 본 발명의 설명에 관하여 전문가에게 추가의 지침을 제공한다. 편의를 위하여, 특정한 용어는, 예를 들면, 이탤릭체 및/또는 인용 부호를 사용하여 강조될 수 있다. 강조의 사용은 용어의 범위 및 의미에 영향을 미치지 않고; 용어의 범위 및 의미는 강조가 되는지 여부와 관계없이 동일한 내용에서 동일하다. 동일한 것이 하나 이상의 방식으로 불릴 수 있다는 것이 인식될 것이다. 그 결과, 대안적인 언어 및 동의어가 본 명세서에 논의된 임의의 하나 이상의 용어에 있어서 사용될 수 있거나, 용어가 본 명세서에서 설명되거나 논의되는지 여부와 관계없이 특정한 뜻을 갖는다. 특정한 용어에 대한 동의어가 제공된다. 하나 이상의 동의어에 대한 설명은 다른 동의어의 사용을 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의되는 임의의 용어의 예를 포함하는 본 명세서의 어느 곳에서의 예의 사용은 오직 예시적인 것이고, 본 발명의 범위 및 의미 또는 임의의 예시화된 용어를 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다. 이와 같이, 본 발명은 본 명세서에 제공된 다양한 실시형태를 제한하지 않는다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 숙련가에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충하는 경우, 정의를 포함하는 본 문서가 지배할 것이다.

용어 "항원 제시 세포(APC) 또는 보조 세포"는 이들의 표면 위에 주요 조직적합 복합체(MHC)와 복합된 외래 항원을 나타내는 세포를 의미한다. T-세포는 이들의 T-세포 수용체(TCR)을 사용하여 이들 복합체를 인식할 수 있다. 이들 세포는 항원을 생성하고 이들을 T-세포에 제시한다. 전문적인 항원 제시 세포의 주요 유형은 수지상 세포(DC), CD4+로도 불리며 따라서 HIV에 의한 감염에 취약한 대식세포; 단핵구, 및 특정한 B-세포이다.

용어 "항원 제시 세포(APC)-결합 도메인"은 항원 제시 세포(APC)에 결합할 수 있는 도메인(이는 폴리펩타이드임)을 의미한다. APC-결합 도메인은 서열 번호 1 및 8-11로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. APC-결합 도메인은 APC 위의 수용체를 인식하고 이에 결합하는 리간드이다.

분화 클러스터 91(CD91)은 세포의 막에서 수용체를 형성하는 단백질이고, 수용체-매개된 세포내섭취와 연관된다.

용어 "PE_t"는 길이 34 내지 112 아미노산 잔기의 전좌 펩타이드(또는 전좌 도메인)를 의미한다. PE_t는 서열 번호 2 내지 4 및 6과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, PE_t의 아미노산 서열은 PE의 a.a. 280 - a.a. 313(서열 번호 4), a.a. 268 - a.a. 313(서열 번호 3), a.a. 253 - a.a. 313(서열 번호 2), 또는 a.a. 253 - a.a. 364(서열 번호 6)의 절편일 수 있다. 즉, PE_t의 아미노산 서열은 a.a. 280 - a.a. 313(서열 번호 4) 필수 서열(즉, 필수 절편)을 포함하는 한, PE 도메인 II(a.a. 253 내지 a.a. 364; 서열 번호 6)의 임의의 영역을 함유할 수 있다.

PE₄₀₇(서열 번호 7)은 선행 특허(US 7,335,361 B2)에 PE(ΔIII)로 기재되어 있다.

용어 "최소 전좌 펩타이드"는 항원을 표적 세포의 세포질로 전좌시킬 수 있는 PE_253-313(서열 번호 2)를 의미한다.

용어 "소포체(ER) 보유 서열"은 이의 기능이 세포질로부터 ER로의 항원의 전좌를 보조하고, ER의 내강에 항원을 보유하는 것인 펩타이드를 의미한다. ER 보유 서열은 Lys Asp Glu Leu(KDEL; 서열 번호 15) 또는 RDEL의 서열을 포함한다. ER 보유 서열은 서열 KDEL, RDEL, KDELKDELKDEL(K3; 서열 번호 16), KKDLRDELKDEL(K3; 서열 번호 17), KKDELRDELKDEL(K3; 서열 번호 18), 또는 KKDELRVELKDEL(K3; 서열 번호 19)을 포함할 수 있다.

핵 배출 신호(NES)는 핵 수송을 사용하여 핵 기공 복합체를 통해 세포 핵으로부터 세포질로 배출하는 것을 표적으로 하는 단백질에서 4개의 소수성 잔기의 짧은 아미노산 서열을 의미한다. NES는 배출에 의해 인식되고 결합된다. 소수성 잔기의 가장 흔한 공간은 L_xxKL_xxL_xL_x(서열 번호 13)이고, 여기서 "L"은 류신이고, "K"는 리신이고, "x"는 임의의 자연 발생 아미노산이다. 예를 들면, 인공적인 NES는 서열 Leu Gln Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Leu Ala(LQKKLEELELA; 서열 번호 14)를 포함할 수 있다.

용어 "NESK"는 NES와 ER 보유 신호의 융합 펩타이드(즉, ER 보유 신호에 융합된 NES)를 의미한다. 이는 핵 배출 신호(NES) 및 ER 보유 서열의 기능을 소유한 인공적인 펩타이드이다. 따라서, 이는 항원을 세포 핵으로부터 세포질로 핵 기공 복합체를 통해 배출할 수 있고, 세포질로부터 ER로 항원의 전좌를 보조할 수 있고, ER의 내강에 항원을 보유할 수 있다. 예를 들면, NESK의 아미노산 서열은 LQKKLEELELAKDEL(서열 번호 12)일 수 있다.

아단위 백신은 질환-유발 바이러스의 부분만을 사용하는 백신이다. 이러한 전략은 바이러스의 한 부분이 질환을 생성하는데 원인이 되는 경우에 가장 자주 사용된다. 질환을 생성하는데 원인이 되는 부분은 항원이라고 지칭되는 단백질이다.

항원은 병원체에 의해 유발된 질환의 원인이 되거나, 병원체에 의해 감염된 숙주에서 면역학적 반응을 유도할 수 있는 병원성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드일 수 있다. 항원은 하나 이상의 병원성 단백질로부터 선택된 둘 이상의 항원의 융합으로부터의 융합 항원일 수 있다. 예를 들면, PRRSV ORF6과 ORF5 절편의 융합 항원, 또는 PRRSV과 PCV2 병원체로부터의 로부터의 항원 단백질의 융합.

에피토프는 항원의 부분이다. 보호 에피토프는 에피토프가 항체와 결합하는 경우, 이에 대항하는 대신에 항체의 기능을 돕는 것을 의미한다.

중화(neutralizing/neutralization) 에피토프의 존재는 예방적 백신의 구조적 기반이다. 중화 에피토프는 바이러스성 세포 부착/유입에 중요하다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) ORF7 항원"은 PRRSV ORF7의 부분으로부터 선택되며, 보호 에피토프를 함유하는 펩타이드이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "PRRSV ORF1b 항원"은 PRRSV ORF1b의 부분으로부터 선택되며, 보호 에피토프를 함유하는 펩타이드이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "PRRSV ORF6 항원"은 PRRSV ORF6의 부분으로부터 선택되며, 보호 에피토프를 함유하는 펩타이드이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "PRRSV ORF5 항원"은 PRRSV ORF5의 부분으로부터 선택되며, 보호 에피토프를 함유하는 펩타이드이다.

용어 "PRRSFREE"는 4개의 융합 단백질 PE₄₀₇-M-K3, PE₄₀₇-P-K3, PE₄₀₇-R-K3, 및 PE₄₀₇-D-K3을 포함하는 백신 조성물을 의미한다.

용어 "M12" 및 "M"은 상호교환 가능하다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "M12"는 PRRSV NSP 10(C-말단 도메인 서열)과 NSP 11(N-말단 도메인 서열)의 융합으로부터의 융합 항원을 의미한다.

용어 "PQAB" 및 "P"는 상호교환 가능하다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "P"는 ORF6과 ORF5 서열 사이에 브릿지/링커 서열이 없는 PRRSV ORF6의 N-말단 부분과 ORF5의 N-말단 부분의 융합으로부터의 융합 항원을 의미한다.

용어 "RSAB" 및 "R"은 상호교환 가능하다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "R"은 ORF6과 ORF5 서열 사이에 브릿지/링커 서열이 없는 PRRSV ORF6의 N-말단 부분 및 ORF5의 N-말단 부분의 융합으로부터의 융합 항원을 의미한다.

용어 "DGD" 및 "D"는 상호교환 가능하다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "D"는 PRRSV ORF7의 C-말단 부분의 2개의 반복을 포함하는 항원을 의미한다.

용어 "치료하다" 또는 "치료"는 질환, 이의 증상, 또는 이에 대한 소인의 치료, 완화, 경감, 치유, 개선, 또는 예방을 목적으로 융합 단백질의 유효량을 암 또는 감염, 또는 이러한 질환에 대한 증상 또는 소인을 갖고 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 의미한다. 이러한 대상은 임의의 적합한 진단 방법으로부터 결과를 기반으로 건강 관리 전문가에 의해 식별될 수 있다.

용어 "유효량"은 치료되는 대상에 치료적 효과를 부여하는데 필요한 활성 화합물의 양을 의미한다. 효과적인 용량은 당해 분야의 숙련가에게 인식되는 바와 같이 투여 경로, 부형제 사용, 및 다른 치료적 처치와 동시사용의 가능성에 따라 다양할 것이다.

실시예

본 발명의 범위를 제한하는 것을 의도하지 않으며, 본 발명의 실시형태에 따른 예시적인 장치, 기구, 방법 및 이와 관련된 결과가 하기 제공된다. 제목 또는 소제목이 독자의 편의를 위한 예시로서 사용될 수 있고, 이는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않아야 한다는 것을 주의한다. 게다가, 본 명세서에서 특정한 이론이 제안되고 기재되고; 그러나, 본 발명이 임의의 특정한 이론 또는 행동 계획을 고려하지 않고 본 발명에 따라 실시될 수 있는 한, 이들은 옳은지 그른지 여부와 관계없이 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않아야 한다.

방법

융합 항원 DRMP 및 MDPR의 합성

융합 항원 DRMP(서열 번호 52), MDPR(서열 번호 53) 및 PCV2 ORF2 항원(서열 번호 20)을 인코딩하는 DNA 서열을 각각 합성하고, 플라스미드 pTAC-2-PE₃₁₃-NESK 또는 pTAC-2-RAP1-PEt_268-313-K3 내로 추가로 클로닝하였다. 모든 합성된 서열을 대장균(E.coli) 성장에 대하여 최적화시켰다. DRMP 또는 MDPR DNA 증폭을 위하여 각각의 정 및 역 프라이머를 PCR에서 사용하였다. 증폭된 DNA 절편을 EcoRI 및 XhoI로 소화시킨 다음, 지시된 벡터 내로 결찰시켰다. 융합 단백질 PE₃₁₃-PCV2-NESK을 유사한 방식으로 클로닝하였다.

표 1은 플라스미드로의 클로닝을 위한 정 및 역 프라이머의 서열을 보여준다. 굵은 글자는 EcoRI 절단 부위를 지시하고; 이탤릭체 글자는 SalI 절단 부위를 지시하고; 이탤릭체이고 굵은 글자는 XhoI 절단 부위를 지시하고; 밑줄 친 글자는 항원 서열을 지시한다.

플라스미드	정 프라이머	역 프라이머
pTAC-2-PE₃₁₃-NESK로의 DRMP 클로닝	gaattc gtcgac caccactttaccccgagt (서열 번호 42)	*ctcgag* agcccagtcgaatttgttagccag (서열 번호 43)
pTAC-2-PE₃₁₃-NESK로의 MDPR 클로닝	gaattc aataacaaagaatgcacggttgct (서열 번호 44)	*ctcgag* agcccagtcaaagtggttagacag (서열 번호 45)
pTAC-2-RAP1-PEt_268-313-K3으로의 DRMP 클로닝	gaattc caccactttaccccgagtgagcgt (서열 번호 46)	*ctcgag* agcccagtcgaatttgttagccag (서열 번호 47)
pTAC-2-RAP1-PEt_268-313-K3으로의 MDPR 클로닝	gaattc aataacaaagaatgcacggttgct (서열 번호 48)	*ctcgag* agcccagtcaaagtggttagacag (서열 번호 49)
pTAC-2-PE₃₁₃-NESK로의 PCV2 ORF2 클로닝	gaattc aatggcattttca (서열 번호 50)	*ctcgag* ggggttcaaggg (서열 번호 51)

실시예 1

발현 벡터의 작제

도 1A는 3개의 도메인(I, II, 및 III)을 함유하는 PE를 보여준다. PE₄₀₇은 PE의 a.a. 1부터 a.a 407까지의 영역이다. PE₄₀₇은 세포독성 도메인 III을 함유하지 않고, 따라서 도메인 I 및 II을 함유한다. PE₃₁₃은 PE의 a.a. 1부터 a.a. 313까지의 영역이다. 따라서, PE₃₁₃은 PE의 도메인 Ia 및 도메인 II의 부분적인 N-말단 영역만을 함유한다.

도 1B 내지 도 1C는 각각이 항원 제시 세포(APC)-결합 도메인, 전좌 펩타이드, 핵 배출 신호(NES)가 있거나(하부 패널) 없는(상부 패널) 항원; 및 소포체(ER) 보유 서열(상부 패널, K3 또는 하부 패널, K)을 포함하고, ER 보유 서열이 융합 단백질의 C-말단에 위치한, 발현 벡터의 작제를 보여준다. 플라스미드 pTac-2-PE₃₁₃-NESK, pTac-2-PE₄₀₇-K3, pTac-2-RAP1-PE_268-313-NESK 및 pTac-2-RAP1-PE_268-313-K3은 하기로부터 발생하였다: ^NdeIPE₃₁₃-^{(EcoRI, XhoI)}-NESK^XhoI,^NdeIPE₄₀₇-^{(EcoRI, XhoI)}-K3^XhoI, ^NdeIRAP1-^(EcoRI)-PE_268-313-^{(EcoRI, XhoI)}-NESK^XhoI 및 ^NdeIRAP1-^(EcoRI)-PE_268-313-^{(EcoRI, XhoI)}-K3^XhoI절편을 PCR 방법으로 합성한 다음, 카나마이신 내성 유전자에 의하여 pUC18 뒤 결합으로 결찰시켜 각각의 플라스미드를 수득하였다.

그 다음, 흥미있는 병원체의 항원 또는 융합 항원을 인코딩하는 표적 DNA를 상기 언급된 플라스미드 내로 삽입하여 융합 단백질의 발현을 위한 발현 벡터를 발생시킬 수 있다. 예를 들면, 돼지 써코바이러스 2형(PCV2) ORF2(서열 번호 20)의 항원을 인코딩하는 DNA 절편을 합성하고, 플라스미드 pTac-2-PE₃₁₃-NESK 내로 삽입하여 발현 벡터 PE₃₁₃-PCV2-NESK(도 1F)를 발생시켰다.

하기 표적 DNA 절편을 합성하였다:

(i) PRRSV ORF7의 C-말단 부분의 2개의 반복을 포함하는 항원을 인코딩하는 표적 DNA. 항원은 "DGD" 또는 "D"로 지정된다.

(ii) PRRSV NSP 10(C-말단 도메인 서열)과 NSP 11(N-말단 도메인 서열)의 융합으로부터의 융합 항원을 인코딩하는 표적 DNA. 항원은 "M12" 또는 "M"로 지정된다.

(iii) ORF6과 ORF5 서열 사이에 브릿지/링커 서열이 없는 PRRSV ORF6의 N-말단 부분과 ORF5의 N-말단 부분의 융합으로부터의 융합 항원을 인코딩하는 표적 DNA. 항원은 "RSAB" 또는 "R"로 지정된다.

(iv) ORF6과 ORF5 서열 사이에 브릿지/링커 서열이 없는 PRRSV ORF6의 N-말단 부분과 ORF5의 N-말단 부분의 융합으로부터의 융합 항원을 인코딩하는 표적 DNA. 항원은 "PQAB" 또는 "P"로 지정된다.

상기 표적 DNA 절편은 도 1B 상부 패널에 나타낸 플라스미드로 삽입되어 각각 융합 단백질 PE₄₀₇-M-K3, PE₄₀₇-P-K3, PE₄₀₇-R-K3, 및 PE₄₀₇-D-K3을 발생시켰다(도 1D).

모든 4개의 상기 언급된 항원 D, R, M, 및 P를 포함하는 융합 항원(예를 들면, DRMP, MDPR 등)을 인코딩하는 표적 DNA 절편을 합성하고, 플라스미드 pTac-2-PE₃₁₃-NESK 내로 삽입하여 융합 단백질 PE-DRMP-NESK를 발현하는 발현 벡터를 발생시켰고(도 1E), 이는 또한 "PRRSFREE 4-in-1"로도 지정된다.

실시예 2

단백질 발현

융합 단백질의 발현을 위한 플라스미드를 내포한 대장균 BL21 세포를 37℃에서 카나마이신 25 ppm을 함유하는 루리아 베르타니(Luria Bertani) 브로쓰에서 각각 배양하였다. 배양이 각각의 로그기에 도달하면(A600=0.1 내지 0.4), 유도를 위하여 아이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(IPTG)를 0.5 내지 2 mM의 최종 농도로 가하였다. 4시간 유도 후, 세포를 수확하고, 즉시 -70℃에서 저장하였다. 융합 단백질을 이전에 기재된 우레아 추출로 정제한 다음(Liao et al., 1995. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43: 498-507), TNE 버퍼(50mM Tris, 50mM NaCl 및 1mM EDTA)의 50X 용적에 대항하는 투석 방법으로 4℃에서 밤새 재폴딩하였다. 재폴딩된 단백질에 SDS-PAGE 분석 및 브래드포드(Bradford) 단백질 분석 키트(Pierce)를 사용하여 수행된 정량 분석을 수행하였다. 결과는 대부분의 재폴딩된 단백질이 감소되지 않은 조건하에 단량체임을 지시하고, 이는 융합 단백질이 쉽게 재폴딩되고 응집되지 않았음을 지시한다.

실시예 3

PRRSV 아단위 백신 면역원성 분석

2주 동안 1주 1회 s.c. 주사를 통해 30 ㎍/샷의 PRRSFREE 4-in-1 또는 PRRSFREE 및 ISA206 보조제를 함유하는 PRRSV 아단위 백신 200 ㎕로 마우스를 백신 접종하였다. 대조군(플라시보)를 PBS로 주사하였다.

마지막 면역화 후 14일에 모든 마우스를 희생시키고, 비장을 수확하였다. 비장세포를 단리하고, 96-웰 플레이트(10⁵ 세포/100 ㎕/웰)에서 자극성 재조합 항원 단백질의 존재 또는 부재하에 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 면역화에 사용되는 백신에 따라, 항원-특이적 세포-매개 면역 반응의 검출을 위하여 사용된 자극성 재조합 항원 단백질은 PRRSFREE 항원, PRRSFREE-4-in-1 키메라 융합 항원, 또는 PCV2 ORF2 항원이었다. 세포 배양 상청액을 수집하고, 상청액 중의 인터페론-감마(IFN-γ)를 IFN-γ 마우스 항체 쌍(Invitrogen)으로 측정하였다.

면역화에 사용되는 백신에 따라, 체액성 면역 반응의 검출을 위하여 PRRSFREE 항원, 또는 PRRSFREE 4-in-1 융합 항원, 또는 PCV2 ORF2 항원을 ELISA 플레이트에서 코팅하였다. 코팅 후, 플레이트를 세척하고, 희석된 마우스 혈청의 첨가 전에 차단하였다. 그 다음, 플레이트를 세척하고, HRP-컨쥬게이트 이차 항체 후, TMB 기질을 첨가로 혼성화시켰다. 반응이 중단된 후, 결과를 ELISA 리더로 검출하였다.

실시예 4

세포-매개 면역 반응(CMI) 및 체액성 면역 반응

도 2A는 백신 접종된 군의 IFN-γ 농도가 대조군의 것보다 높다는 것을 나타내고, 이는 CMI 반응이 백신 접종에서 유도되었다는 것을 지시한다. 추가로, PRRSFREE 4-in-1 백신을 제공받은 군의 IFN-γ 농도는 PRRSFREE-처리군의 것보다 극적으로 높았다. 결과는 하나의 단일 융합된 항원으로 구성된 PRRSFREE 4-in-1 백신이 놀랍게도 4개의 별개의 항원으로 구성된 PRRSFREE 백신보다 강한 CMI 반응을 유도할 수 있다는 것을 증명한다.

도 2B는 백식-면역화된 군이 대조군보다 높은 항원-특이적 항체 역가를 가졌다는 것을 보여준다. PRRSFREE 4-in-1 백신으로 백신 접종된 마우스는 PRRSFREE 백신으로 면역화된 군보다 높은 항체 역가를 가졌다. 결과는 PRRSFREE 4-in-1이 PRRSFREE 백신보다 강한 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 보여준다.

도 2A-B에서 데이터는 D, M, P, 및 R 항원의 융합과 하나의 단일 융합 항원을 포함하는 융합 단백질을 함유하는 PRRSFREE 4-in-1이, 각각의 융합 단백질에 각각의 항원이 있는, 4개의 개별적인, 별개의 항원을 함유하는(즉, 4개의 항원 M, M, P, R이 융합되지 않음) PRRSFREE 백신보다 강한 세포성 및 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 지시한다.

실시예 5

돼지 써코바이러스 2형(PCV2) ORF2 아단위 백신과의 조합 백신

상기 기재된 바와 같은 면역화 스케줄에 따라 PBS, PRRSFREE 4-in-1 + PE-PCV2-NESK, 또는 PRRSFREE + PE-PCV2-NESK 콤보 백신으로 마우스를 백신 접종하였다. PRRSFREE 4-in-1 + PE-PCV2-NESK 콤보 백신은 PE-DRMP-NESK(도 1D) 및 PE-PCV2-NESK(도 1F) 융합 단백질을 함유한다. PRRSFREE + PE-PCV2-NESK 콤보 백신은 5 별개의 융합 단백질: (1) PE-DGD-K3, PE-M12-K3, PE-PQAB-K3, PE-RSAB-K3(도 1D), 및 PE-PCV2-NESK(도 1F)를 함유한다.

실시예 6

PCV2 ORF2 아단위 백신과의 조합 백신

도 3A는 PRRSV 항원-특이적(PRRSFREE 4-in-1 융합 항원, 및 PRRSFREE 항원)을 보여주고, 도 3B는 PCV2-ORF2-특이적 CMI 반응을 보여준다. 데이터는 PRRSFREE 4-in-1 융합 항원과 PCV2 ORF2 아단위 백신의 조합으로 면역화된 마우스 군이 PRRSFREE(4 별개의 항원)와 PCV2 ORF2 아단위 백신의 조합으로 면역화된 마우스 군보다 강한 CMI 반응을 나타냈다는 것을 지시한다.

도 4A는 PRRSV 항원-특이적 항체 반응을 보여준다. ELISA 방법을 사용하여 항원-특이적 항체 역가를 측정하였다. PE-DRMP-NESK와 PE-PCV2-NESK(즉, 2개의 융합 단백질)의 조합으로 처리된 군을 위하여, 융합 항원 DRMP를 사용하여 항원-특이적 항체 역가를 측정하였다. PRRSFREE 및 PE-PCV2-NESK(즉, 5개의 융합 단백질)의 조합으로 처리된 군을 위하여, 4개의 항원 D, R, M, 및 P를 사용하여 항원-특이적 항체 역가를 측정하였다. 데이터는 PRRSFREE 4-in-1 융합 항원과 PCV2 ORF2 아단위 백신의 조합으로 면역화된 마우스 군이 PRRSFREE(4 별개의 항원)와 PCV2 ORF2 아단위 백신(도 4A)의 조합으로 면역화된 마우스 군보다 강한 PRRSFREE 4-in-1 융합 항원-특이적 체액성 반응을 나타냈다는 것을 지시한다.

도 4B는 PCV2-ORF2 항원-특이적 항체 반응을 보여준다. 놀랍게도, PRRSFREE(4 별개의 항원)와 PCV2 ORF2 아단위 백신(PE-PCV2-NESK)의 조합으로 면역화된 마우스는 PRRSFREE 4-in-1 융합 항원(PE-DRMP-NESK)과 PCV2 ORF2 아단위 백신(PE-PCV2-NESK)의 조합으로 면역화된 군보다 높은 PCV2-특이적 항체 역가를 가졌다. 결과는 2개의 PRRSV/PCV2 콤보 백신 사이에서 상이한 PRRSV 항원-특이적 및 PCV2-특이적 체액성 면역 반응이 존재하였다는 것을 지시한다.

두 가지 접근법이 CMI 및 체액성 면역 반응을 유도하는데 효과적이라는 것이 명확하다. 2 융합 단백질(PE-DRMP-NESK 및 PE-PCV2-NESK)을 포함하는 PRRSV/PCV2 콤보 백신은 시험된 4개의 면역 반응 중 3개에서 더 우수한 효능을 보여준다. 이러한 연구는 PRRSV 키메라 융합 항원 및 PCV2 ORF2 항원으로 구성된 PRRSV/PCV2 콤보 백신이 5개의 개별적인 항원으로 구성된 하나보다 우수한 선택이라는 것을 증명한다. 그럼에도 불구하고, 두 가지 접근법 모두 동물에서 면역 반응을 유도하는데 유용하다.

실시예 7

2개의 항원의 융합 대 4개의 항원의 융합

6주 연령의 암컷 C57BL/6 마우스의 3개의 군(군당 마우스 3마리)에 (1) PE-DR-NESK 단백질 15 ㎍, (2) PE-DR-NESK 15 ㎍과 PE-MP-NESK 단백질 15 ㎍의 조합, 또는 (3) 50% ISA206 200 ㎕ 중의 PE-DRMP-NESK 30 ㎍를 매주 간격으로 3회 피하 주사하였다. 마지막 면역화 후 1주에 마우스를 죽이고, 비장세포를 수확하였다. 비장세포를 72시간 동안 4개의 PRRSV 항원(M12, DgD, PQAB 및 RSAB, 각각 2.5 ㎍/ml)으로 자극하고, ELISA 키트를 사용하여 각각의 군의 세포-무함유 상청액 중의 IFN-γ를 검출하였다. 도 5는 PE-DRMP-NESK로 면역화된 마우스가 3개의 군 중에서 가장 큰 CMI 반응을 나타냈다는 것을 보여준다.

실시예 8

돼지에서의 세포-매개 면역력

5주 연령의 SPF 돼지(군당 돼지 2-4 마리)에 하기 백신 중 하나를 매주 간격으로 2회 근육 내 주사하였다: (1) PRRSFREE, (2) PE-DRMP-NESK, (3) PE-MDPR-NESK, (4) RAP1-PE_268-313-DRMP-K3, (5) 50% ISA206 2 ml 중의 RAP1-PE_268-313-MDPR-K3, 또는 (6) 플라시보로서 PBS. 도 6은 3개의 백신 디자인을 보여준다. 각각의 주사 중의 항원은 50% ISA206 2 ml 중의 300 ㎍이었다. 백신 접종된 돼지의 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 마지막 면역화 후 3주에 수확하였다. 면역화에 사용된 백신에 따라, PBMC를 PRRSFREE 항원(M12, DgD , PQAB 및 RSAB, 각각 2.5 ug/ml), PE-DRMP-NESK, PE-MDPR-NESK, RAP1-PE_268-313-DRMP-K3, 또는 RAP1-PE_268-313-MDPR-K3로 72시간 동안 자극한 다음, ELISA 키트를 사용하여 각각의 군의 세포-무함유 상청액 중의 IFN-γ을 검출하였다. 도 7은 자극 후 백신 접종된 돼지의 PBMC에 의해 분비된 IFN-γ를 보여준다. 융합 항원을 포함하는 백신은 플라시보 군보다 높은 IFN-γ 분비를 유도할 수 있는 것으로 관찰되었다.

실시예 9

돼지에서의 바이러스혈증 연구

5주 연령의 SPF 돼지(군당 돼지 2-4 마리)에 하기 백신 중 하나를 매주 간격으로 2회 근육 내 주사하였다: (1) PRRSFREE, (2) PE-DRMP-NESK, (3) PE-MDPR-NESK, (4) RAP1-PE_268-313-DRMP-K3, (5) 50% ISA206 2 ml 중의 RAP1-PE_268-313-MDPR-K3, 또는 (6) 플라시보로서 PBS. 각각의 주사 중의 항원은 50% ISA206 2 ml 중의 300 ㎍이었다. 백신 접종된 돼지를 마지막 면역화 후 3주에 PRRSV 2 x 10⁵ TCID50으로 비강 내 챌린징하였다. 혈액 샘플을 매주 수집하였다. 바이러스 RNA를 혈청으로부터 추출하고, 1-단계 SyBR 그린 실시간 PCR을 사용하여 정량하여 바이러스혈증의 수준을 측정하였다. 실험 결과는 융합 항원을 포함하는 백신이 바이러스 부하량을 감소시킬 수 있다는 것을 지시하였다.

표 2는 다양한 융합 단백질을 만드는데 사용된 펩타이드의 서열 번호를 보여준다.

구성요소	서열 번호	길이
최소 슈도모나스 외독소 A(PE) 결합 도메인 Ia(APC-결합 도메인, PE의 a.a.1 - a.a.252)	1	252
PE_253-313(전좌 도메인)	2	61
PE_268-313(전좌 도메인)*	3	46
PE_t 코어(PE 전좌 도메인 코어; PE의 a.a. 280 - a.a. 313)	4	34
PE₃₁₃(PE의 a.a. 1 - a.a. 313)	5	313
PE_253-364(전좌 도메인)	6	112
PE₄₀₇(PE의 a.a. 1 - a.a. 407)	7	407
RAP1 최소(RAP1의 도메인 III)	8	104
A2M 최소	9	153
HIV-Tat 최소	10	24
HSPs 최소	11	641
NESK는 LQKKLEELELA KDEL이다.**	12	15
NES 공통 서열은 L_XXKL_XXL_XL_X이고, 여기서 "L"은 류신이고, "K"는 리신이고, "_X"는 임의의 자연 발생 아미노산이다.	13	11
NES는 LQKKLEELELA이다.	14	11
KDEL(K)	15	4
KDELKDELKDEL(K3)	16	12
KKDLRDELKDEL(K3)	17	12
KKDELRDELKDEL(K3)	18	13
KKDELRVELKDEL(K3)	19	13
PCV2 ORF2(절두 돼지 써코바이러스 2형 ORF2; aa 42 - aa 233)	20	192
전장 PE(엑소톡식 A, 슈도모나스 애루기노사)	21	613
DGD(반복 배열 D가 있는 ORF7 항원)	22	220
D(반복 배열 D가 없는 ORF7 항원) RHHFTPSERQLCLSSIQTAFNQGAGTCILSDSGRISYTVEFSLPTHHTVRLIRVTAPPSA	23	60
R(RSAB)	24	62
M(M12)***	25	165
P(PQAB)****	26	58
PE₃₁₃-DRMP-NESK(또는 PE-DRMP-NESK)	27	841
PE₃₁₃-MDPR-NESK(또는 PE-MPDR-NESK)	28	746
RAP1-PE_268-313-DRMP-K3	29	677
RAP1-PE_268-313-MDPR-K3	30	584
PE₃₁₃-PCV2-NESK(또는 PE-PCV2-NESK)	31	525
PE1-267(PE 결합 도메인)	32	267
대안적인 D(반복 배열 D가 없는 ORF7 항원) HHFTPSERQLCLSSIQTAFNQGAGTCILSDSGRISYTVEFSLPTHHTVRLIRVTAPPSA	33	59
ORF6의 N-말단 부분[대만에서 PRRSV 단리로부터] GSSLDDFCYDSTAPQKVLLAFSITY	34	25
ORF5의 N-말단 부분[대만에서 PRRSV 단리로부터] ASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFDWA	35	33
ORF6의 N-말단 부분 MGSLDDFCNDSTAAQKLVLAFSITYTPI	36	28
ORF5의 N-말단 부분 FVAGGSSSTYQYIYNLTICELNGTDWLSNHFDWA	37	34
PRRSV ORF5, 1형(유럽) PRRSV 균주 MRCSHKLGRFLTPHSCFWWLFLLCTGLSWS FVAGGSSSTYQYIYNLTICELNGTDWLSNHFDWA VETFVL YPVATHILSLGFLTTSHFFDALGLGAVSTIGFVGGRYVLSSVYGACAFAAFVCFVIRAVKNCMAFRYAHT RFTNFIVDDRGRIHRWKSPIVVEKLGKAEVGGDLVTIKHVVLEGVKAQPLTRTSAEQWEA	38	200
PRRSV ORF6, 1형(유럽) PRRSV 균주 MGSLDDFCNDSTAAQKLVLAFSITYTPI MIYALKVSRGRLLGLLHILIFLNCSFTFGYMTYVRFQSTNRV ALTLGAVVALLWGVYSFTESWKFVTSRCRLCCLGRRYILAPAHHVESAAGLHSIPASGNRAYAVRKPGLT SVNGTLVPGLRSLVLGGKRAVKRGVVNLVKYGR	39	173
PRRSV ORF5, 2형(북아메리카) PRRSV 균주 MLGKCLTAGCCSRLLFLWCTVPSCFVALVG ASNSSSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLANKFDWA VETFVIF PVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGLITVSTAGFYHGRYVLSSIYATCALAALICFVIRLAKNCMSWRYSCTR YTNFLLDTKGRIYRWRSPVIIEKGGKVEVEGHLIDLKRVVLDGSAATPVTKISAEQWGRP	40	200
PRRSV ORF6: 2형(북아메리카) PRRSV 균주 M GSSLDDFCHDSTAPQKVILAFSITY TPVMIYALKVSRGRLLGLLHLLIFLNCAFTFGYMTFVHFQSTNR VALTMGAVVALLWGVYSAIETWRFITSRCRLCLLGRKYILAPAHHVESAAGFHPIAASDNHAFVVRRPGS TTVNGTLVPGLKSLVLGGRKAVKQGVVNLVKYAK	41	174

*: PE_268-313은 전장 PE의 a.a. 268 - a.a. 313이고; PE₃₁₃은 전장 PE의 a.a. 1 - a.a. 313이고; PE₄₀₇은 전장 PE의 a.a. 1 - a.a. 407이다.

**: 굵은 글자는 인공적인 핵 배출 신호의 아미노산 서열을 나타내고; 밑줄 친 글자는 소포체 보유 신호의 아미노산 서열을 나타낸다.

***: M(M12)는 PRRSV NSP 10(C-말단 도메인 서열)과 NSP 11(N-말단 도메인 서열)의 융합에 의해 제조된 융합 폴리펩타이드이다. 즉, 폴리펩타이드는 비구조적 단백질 ORF1b NSP 10 C-말단 부분 및 NSP 11 N-말단 부분으로부터 유도된다.

****: P(PQAB)는 PRRSV ORF6 a.a. 2 - a.a. 26과 ORF5 aa 31 - aa 63의 융합에 의해 제조된 폴리펩타이드이다. 미국 특허 제7465455호를 참조한다. 일반 글자의 서열은 PRRSV ORF6/기질 단백질 서열로부터 유래되고, 굵은 글자의 서열은 PRRSV ORF 5 서열로부터 유래된다. PRRSV의 ORF5에 의해 인코딩된 주요 엔벨로프 단백질(GP5)은 바이러스 중화(VN) 항체의 유도 및 PRRSV의 상이한 균주 중에서 교차 보호에서 중요한 역할을 한다. 상이한 균주 중에서 서열 변이가 존재하기 때문에, 본 명세서에서 서열은 예시 목적을 위해 기재된다.

본 발명은 예시된 바와 같은 특정한 형태로 제한되지 않으며, 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않는 모든 변형은 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 범위에 속한다. 당해 분야의 숙련가가 본 발명 및 다양한 실시형태를 예상된 특정한 사용에 적합한 다양한 변형과 함께 이용할 수 있도록 하기 위하여, 실시형태 및 실시예는 본 발명의 원리 및 이들의 실제 적용을 설명하기 위하여 선택되고 기재되었다. 대안적인 실시형태는 이의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에게 명백해질 것이다. 특허, 특허 출원 및 다양한 문헌을 포함할 수 있는 몇몇 참조는 본 발명의 설명에서 기재되고 논의된다. 이러한 참조의 기재 및/또는 논의는 본 발명의 설명을 단지 명확하게 하기 위하여 제공되며, 임의의 이러한 참조가 본 명세서에 기재된 본 발명에 대한 "선행 기술"이라는 인정이 아니다. 본 명세서에 기재되고 논의된 모든 참조는 각각의 참조가 개별적으로 참조로서 포함되는 것과 동일한 정도로 그 전문이 참조로서 본 명세서에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Reber Genetics Co., Ltd. <120> VACCINE COMPOSITIONS AGAINST PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME AND PORCINE CIRCOVIRUS ASSOCIATED DISEASES <130> WO 2016/196383 <140> PCT/US2016/034858 <141> 2016-05-27 <150> US 62/169205 <151> 2015-06-01 <160> 53 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 252 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 1 Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val 1 5 10 15 Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro 20 25 30 Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val 35 40 45 Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu 50 55 60 Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu 65 70 75 80 Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser 85 90 95 Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn 100 105 110 Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His 115 120 125 Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met 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PE313-PCV2-NESK <400> 31 Met Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys 1 5 10 15 Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp 20 25 30 Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met 35 40 45 Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala 50 55 60 Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val 65 70 75 80 Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly 85 90 95 Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser 100 105 110 Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser 115 120 125 His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala 130 135 140 Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn 145 150 155 160 Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val 165 170 175 Met Ala Gln Thr Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala 180 185 190 Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn 195 200 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415 Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His 420 425 430 Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Gly Gly Gly Ala 435 440 445 Ala Ala Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr 450 455 460 Ala Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser 465 470 475 480 Ile Tyr Asp Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe 485 490 495 Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Leu Glu Leu Gln 500 505 510 Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Leu Ala Lys Asp Glu Leu 515 520 525 <210> 32 <211> 267 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 32 Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val 1 5 10 15 Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro 20 25 30 Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val 35 40 45 Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu 50 55 60 Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu 65 70 75 80 Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser 85 90 95 Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn 100 105 110 Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His 115 120 125 Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys 130 135 140 Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu 145 150 155 160 Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val Met 165 170 175 Ala Gln Thr Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser 180 185 190 Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr 195 200 205 Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile 210 215 220 Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys 225 230 235 240 Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu 245 250 255 Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu 260 265 <210> 33 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alternative D (ORF7 antigen, without a tandem repeat D) <400> 33 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 1 5 10 15 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Ile Leu Ser Asp Ser Gly 20 25 30 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 35 40 45 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Pro Pro Ser Ala 50 55 <210> 34 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal portion of ORF6 [from a PRRSV isolate in Taiwan] <400> 34 Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys Tyr Asp Ser Thr Ala Pro Gln Lys 1 5 10 15 Val Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr 20 25 <210> 35 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal portion of ORF5 [from a PRRSV isolate in Taiwan] <400> 35 Ala Ser Asn Asp Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr 1 5 10 15 Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp 20 25 30 Ala <210> 36 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal portion of ORF6 <400> 36 Met Gly Ser Leu Asp Asp Phe Cys Asn Asp Ser Thr Ala Ala Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Ile 20 25 <210> 37 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal portion of ORF5 <400> 37 Phe Val Ala Gly Gly Ser Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu 1 5 10 15 Thr Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ser Asn His Phe Asp 20 25 30 Trp Ala <210> 38 <211> 200 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 38 Met Arg Cys Ser His Lys Leu Gly Arg Phe Leu Thr Pro His Ser Cys 1 5 10 15 Phe Trp Trp Leu Phe Leu Leu Cys Thr Gly Leu Ser Trp Ser Phe Val 20 25 30 Ala Gly Gly Ser Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu Thr Ile 35 40 45 Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ser Asn His Phe Asp Trp Ala 50 55 60 Val Glu Thr Phe Val Leu Tyr Pro Val Ala Thr His Ile Leu Ser Leu 65 70 75 80 Gly Phe Leu Thr Thr Ser His Phe Phe Asp Ala Leu Gly Leu Gly Ala 85 90 95 Val Ser Thr Ile Gly Phe Val Gly Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Val 100 105 110 Tyr Gly Ala Cys Ala Phe Ala Ala Phe Val Cys Phe Val Ile Arg Ala 115 120 125 Val Lys Asn Cys Met Ala Phe Arg Tyr Ala His Thr Arg Phe Thr Asn 130 135 140 Phe Ile Val Asp Asp Arg Gly Arg Ile His Arg Trp Lys Ser Pro Ile 145 150 155 160 Val Val Glu Lys Leu Gly Lys Ala Glu Val Gly Gly Asp Leu Val Thr 165 170 175 Ile Lys His Val Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Gln Pro Leu Thr Arg 180 185 190 Thr Ser Ala Glu Gln Trp Glu Ala 195 200 <210> 39 <211> 173 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 39 Met Gly Ser Leu Asp Asp Phe Cys Asn Asp Ser Thr Ala Ala Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Ile Met Ile Tyr Ala 20 25 30 Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Ile Leu Ile 35 40 45 Phe Leu Asn Cys Ser Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Tyr Val Arg Phe 50 55 60 Gln Ser Thr Asn Arg Val Ala Leu Thr Leu Gly Ala Val Val Ala Leu 65 70 75 80 Leu Trp Gly Val Tyr Ser Phe Thr Glu Ser Trp Lys Phe Val Thr Ser 85 90 95 Arg Cys Arg Leu Cys Cys Leu Gly Arg Arg Tyr Ile Leu Ala Pro Ala 100 105 110 His His Val Glu Ser Ala Ala Gly Leu His Ser Ile Pro Ala Ser Gly 115 120 125 Asn Arg Ala Tyr Ala Val Arg Lys Pro Gly Leu Thr Ser Val Asn Gly 130 135 140 Thr Leu Val Pro Gly Leu Arg Ser Leu Val Leu Gly Gly Lys Arg Ala 145 150 155 160 Val Lys Arg Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Gly Arg 165 170 <210> 40 <211> 200 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 40 Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Trp Cys Thr Val Pro Ser Cys Phe Val Ala Leu Val Gly Ala Ser 20 25 30 Asn Ser Ser Ser Ser Tyr Ser Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val 50 55 60 Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly 65 70 75 80 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Ile Thr Val 85 90 95 Ser Thr Ala Gly Phe Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr 100 105 110 Ala Thr Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala 115 120 125 Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140 Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Ile Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile 145 150 155 160 Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu 165 170 175 Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Lys Ile 180 185 190 Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro 195 200 <210> 41 <211> 174 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 41 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gln 1 5 10 15 Lys Val Ile Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Val Met Ile Tyr 20 25 30 Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu 35 40 45 Ile Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Val His 50 55 60 Phe Gln Ser Thr Asn Arg Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val Ala 65 70 75 80 Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Arg Phe Ile Thr 85 90 95 Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro 100 105 110 Ala His His Val Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Ser 115 120 125 Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn 130 135 140 Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys 145 150 155 160 Ala Val Lys Gln Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys 165 170 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 42 gaattcgtcg accaccactt taccccgagt 30 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 43 ctcgagagcc cagtcgaatt tgttagccag 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 44 gaattcaata acaaagaatg cacggttgct 30 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 45 ctcgagagcc cagtcaaagt ggttagacag 30 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 46 gaattccacc actttacccc gagtgagcgt 30 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 47 ctcgagagcc cagtcgaatt tgttagccag 30 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 48 gaattcaata acaaagaatg cacggttgct 30 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 49 ctcgagagcc cagtcaaagt ggttagacag 30 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 50 gaattcaatg gcattttca 19 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 51 ctcgaggggg ttcaaggg 18 <210> 52 <211> 1518 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DRMP coding seqeunce <400> 52 caccacttta ccccgagtga gcgtcaattg tgtttgtcgt caatccagac tgcctttaat 60 caaggcgctg gtacttgcat cctgtcagat tctgggcgta tcagttacac tgtggagttt 120 agtttgccta cgcatcatac tgtgcgcctg atccgcgtta cagcaccacc gtcagcactc 180 gaccaggtga tccgcaacgc cctggccagc cccggcagcg gcggcgacct gggcgaagcg 240 atccgcgagc agccggagca ggcccgtctg gccctgaccc tggccgccgc cgagagcgag 300 cgcttcgtcc ggcagggcac cggcaacgac gaggccggcg cggccaacgc cgacgtggtg 360 agcctgacct gcccggtcgc cgccggtgaa tgcgcgggcc cggcggacag cggcgacgcc 420 ctgctggagc gcaactatcc cactggcgcg gagttcctcg gcgacggcgg cgacgtccgt 480 caccacttta ccccgagtga gcgtcaattg tgtttgtcgt caatccagac tgcctttaat 540 caaggcgctg gtacttgcat cctgtcagat tctgggcgta tcagttacac tgtggagttt 600 agtttgccta cgcatcatac tgtgcgcctg atccgcgtta cagcaccacc gtcagcaatg 660 ggtagcctgg acgacttttg taacgacagc accgctgctc agaaactggt tctggctttt 720 agcatcacct acaccccaat ctttgttgct ggtggtagca gcagcaccta ccagtacatc 780 tacaacctga ccatctgtga actgaacggt accgactggc tgagcaacca ctttgactgg 840 gctctcgaca ataacaaaga atgcacggtt gctcaggctc tgggcaacgg ggataaattt 900 cgtgccacag acaagcgtgt tgtagattct ctccgcgcca tttgtgctga tctggaaggg 960 tcgagctctc cgctcccgaa ggtcgcacac aacttgggtt tttatttttc acctgacttg 1020 acacagtttg ccaaactccc aatagaactt gcaccacact ggccggtggt gtcaacccag 1080 aacaatgaaa agtggccgga tcgtctggtt gccagccttc gccctctcga caaatacagc 1140 cgcgcgtgca tcggtgccgg ctatatggtg ggcccttcgg tgtttctggg cactccaggg 1200 gtcgtgtcat actatctcac aaagtttgtt aagggcgagg ctcaagtgct tccggaaacg 1260 gtcttcagta ccggccgaat tgaggtagac tgccgtgaat atcttgatga tcgtgagcga 1320 gaagttgctg cgtccctccc acacggtagc agcctggacg acttctgcta cgacagcacc 1380 gctccgcaga aagttctgct ggctttcagc atcacctacg cttccaacga cagcagcagc 1440 cacctgcaac tgatctacaa cctgaccctg tgcgaactga acggtaccga ctggctggct 1500 aacaaattcg actgggct 1518 <210> 53 <211> 1239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MDPR coding seqeunce <400> 53 aataacaaag aatgcacggt tgctcaggct ctgggcaacg gggataaatt tcgtgccaca 60 gacaagcgtg ttgtagattc tctccgcgcc atttgtgctg atctggaagg gtcgagctct 120 ccgctcccga aggtcgcaca caacttgggt ttttattttt cacctgactt gacacagttt 180 gccaaactcc caatagaact tgcaccacac tggccggtgg tgtcaaccca gaacaatgaa 240 aagtggccgg atcgtctggt tgccagcctt cgccctctcg acaaatacag ccgcgcgtgc 300 atcggtgccg gctatatggt gggcccttcg gtgtttctgg gcactccagg ggtcgtgtca 360 tactatctca caaagtttgt taagggcgag gctcaagtgc ttccggaaac ggtcttcagt 420 accggccgaa ttgaggtaga ctgccgtgaa tatcttgatg atcgtgagcg agaagttgct 480 gcgtccctcc cacaccgtca ccactttacc ccgagtgagc gtcaattgtg tttgtcgtca 540 atccagactg cctttaatca aggcgctggt acttgcatcc tgtcagattc tgggcgtatc 600 agttacactg tggagtttag tttgcctacg catcatactg tgcgcctgat ccgcgttaca 660 gcaccaccgt cagcacgtca ccactttacc ccgagtgagc gtcaattgtg tttgtcgtca 720 atccagactg cctttaatca aggcgctggt acttgcatcc tgtcagattc tgggcgtatc 780 agttacactg tggagtttag tttgcctacg catcatactg tgcgcctgat ccgcgttaca 840 gcaccaccgt cagcactcga gggatccggt tcctccctgg acgacttctg ctacgactcc 900 accgctcccc agaaagttct gctggctttc tccatcacct acgcttccaa cgactcctcc 960 tcccacctgc aactgatcta caacctgacc ctgtgcgaac tgaacggtac cgactggctg 1020 gctaacaaat tcgactgggc tcatatggtc gacatgggtt ctctcgacga cttttgtaac 1080 gactctaccg ctgctcagaa actggttctg gctttttcta tcacctacac cccaatcttt 1140 gttgctggtg gttcttcttc tacctaccag tacatctaca acctcaccat ctgtgaactc 1200 aacggtaccg actggctgtc taaccacttt gactgggct 1239

Claims

융합 단백질로서,
(a) 상기 융합 단백질의 N-말단에 위치한, 항원 제시 세포(APC)-결합 도메인 또는 CD91 수용체-결합 도메인;
(b) 상기 APC-결합 도메인 또는 상기 CD91 수용체-결합 도메인의 C-말단에 위치한, 서열 번호 4, 2, 3, 또는 6과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 길이 34-112 아미노산 잔기의 전좌 펩타이드;
(c) (i) 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) ORF7 항원;
(ii) PRRSV ORF1b 항원;
(iii) PRRSV ORF6 항원; 및
(iv) PRRSV ORF5 항원
을 포함하는 융합 항원;
(d) 상기 융합 단백질의 C-말단에 위치한 소포체 보유 서열(endoplasmic reticulum retention sequence); 및
(e) 임의로, 상기 항원과 상기 소포체 보유 서열 사이 또는 상기 전좌 펩타이드와 상기 항원 사이에 위치한, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 핵 배출 신호를 포함하되;
상기 융합 항원은 전장 ORF7, ORF6, ORF5 및 ORF1b 단백질 서열을 포함하지 않는, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 ORF7 또는 ORF1b 항원이 상기 ORF6 항원에 대하여 N-말단에 위치하고, 상기 ORF5 항원이 상기 ORF6 항원에 대하여 C-말단에 위치하는, 융합 단백질
제1항에 있어서, 상기 융합 항원이 상기 ORF7 항원의 2개의 반복 배열을 포함하는, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 ORF5 항원이 상기 ORF6 항원에 대하여 C-말단에 위치하는, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 ORF6 항원이 상기 PRRSV ORF6의 N-말단 부분 아미노산 서열을 포함하고, 상기 ORF5 항원이 상기 PRRSV ORF5의 N-말단 부분 아미노산 서열을 포함하며, 상기 융합 항원이 상기 ORF6 및 ORF5의 C-말단 부분 아미노산 서열을 포함하지 않는, 융합 단백질.
제5항에 있어서, 상기 ORF1b 항원이 상기 ORF1b NSP 10의 C-말단 부분 아미노산 서열 및 상기 ORF1b NSP 11의 N-말단 부분 아미노산 서열을 포함하고, 상기 융합 항원에는 상기 ORF1b의 N-말단 및 C-말단 부분 아미노산 서열이 없는, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 APC-결합 도메인 또는 상기 CD91 수용체-결합 도메인이 서열 번호 1, 8, 9, 10, 11, 또는 32와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드인, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 전좌 펩타이드가 길이 34-61 아미노산 잔기를 갖는, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 소포체 보유 서열이 상기 아미노산 KDEL의 반복 배열 없이 상기 아미노산 서열 KDEL(서열 번호 15)을 포함하고, 단, 상기 핵 배출 신호가 존재하는, 융합 단백질.
제9항에 있어서, 상기 핵 배출 신호 및 상기 ER 보유 서열이 서열 번호 12와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 융합 펩타이드를 형성하는, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 소포체 보유 서열이 상기 서열 번호 16, 17, 18, 또는 19의 아미노산 서열을 포함하고, 단 상기 핵 배출 신호가 존재하지 않는, 융합 단백질.
제11항에 있어서, 상기 APC-결합 도메인 또는 상기 CD91 수용체-결합 도메인이 서열 번호 8와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드인, 융합 단백질.
조성물로서,
(i) 제1항의 융합 단백질; 및
(ii) 돼지 써코바이러스 2형(porcine circovirus type II: PCV2) 융합 단백질을 포함하되, 상기 PCV2 융합 단백질은,
(a) 상기 융합 단백질의 N-말단에 위치한, 항원 제시 세포(APC)-결합 도메인 또는 CD91 수용체-결합 도메인;
(b) 상기 APC-결합 도메인 또는 상기 CD91 수용체-결합 도메인의 C-말단에 위치한, 서열 번호 4, 2, 3, 또는 6과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 길이 34-112 아미노산 잔기의 전좌 펩타이드; 및
(c) PCV2 ORF2 항원;
(d) 상기 융합 단백질의 C-말단에 위치한, 소포체 보유 서열; 및
(e) 상기 항원과 상기 소포체 보유 서열 사이 또는 사익 전좌 펩타이드와 상기 항원 사이에 위치한, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 핵 배출 신호를 포함하며;
상기 PCV2 ORF2 항원은 상기 PCV2 ORF 2 단백질의 C-말단 부분 아미노산 서열을 포함하고, 상기 PCV2 융합 단백질은 상기 PCV2 ORF2 단백질의 N-말단 부분 아미노산 서열을 포함하지 않는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 전좌 펩타이드가 길이 34-61 아미노산 잔기를 갖는, 융합 단백질.
이를 필요로 하는 대상에서 항원-특이적 세포-매개 및 체액성 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서의 치료적 유효량의 제1항의 융합 단백질을 포함하는 조성물 또는 제13항의 조성물의 용도.