TWI621627B - 用於豬生殖與呼吸綜合症及豬環狀病毒關聯疾病之疫苗組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種融合蛋白，其包含一抗原呈現細胞(APC)結合區域或一CD91受體結合區域、一轉位胜肽、一融合抗原、一內質網滯留序列以及屬於隨選性之一出核訊號。該融合抗原包含一豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV) ORF7抗原、一PRRSV ORF1b抗原、一PRRSV ORF6抗原以及一PRRSV ORF5抗原。該融合蛋白可用於誘發抗原特異性細胞中介及體液性反應。

Description

用於豬生殖與呼吸綜合症及豬環狀病毒關聯疾病之疫苗組成物
本發明大致關於疫苗，且詳而言之係關於次單位疫苗。
會感染免疫細胞（例如T細胞、B細胞、樹突細胞、單核細胞或巨噬細胞）之病毒包括豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)、豬環狀病毒第二型(PCV2)以及人類免疫不全病毒(HIV)。其使得免疫細胞無法喚起免疫反應，反而載運病毒。受到上述病毒感染之動物容易受到其他病原體感染。豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)每年均於畜牧業造成重大損失。不僅豬隻，鴨類亦會受PRRSV感染。一般而言，受到此種病毒感染之動物並無顯著症狀，但其免疫力有所降低。此病毒侵襲巨噬細胞（於肺泡及脾臟）、腦部微神經膠細胞及單核細胞，且可存在於受感染動物之血液及器官中，導致體重減輕及因二次感染造成之死亡率提高。
美國專利第7,595,054號揭露一種作為次單位疫苗之融合抗原，其中係將選自ORF1b之一區域或ORF7之一區域之單一抗原部分融合於綠膿桿菌外毒素A(Pseudomnoas exotoxin A)多胜肽（其缺乏細胞毒素區域III，亦即PE (∆III)）與一內質網滯留序列之間。
瑞寶基因股份有限公司(Reber Genetics Co. Ltd.)所命名之疫苗組成物「PRRSFREE™」包含四種不同PRRS抗原，分別稱為D、M、R及P。此四種PRRS抗原分別由四種採用美國專利第7,595,054號揭露設計之不同載體表達，且能夠有效誘發動物體內之細胞中介及體液免疫反應。
於一態樣中，本發明提供一豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)融合蛋白，包含： (a) 一抗原呈現細胞(antigen-presenting cell, APC)結合區域或一CD91受體結合區域，位於該融合蛋白之N端； (b) 一轉位胜肽(translocation peptide)，長度為34-112個胺基酸殘基，包含一至少與序列識別號：4、2、3或6為90%相同之胺基酸序列，位於該APC結合區域或該CD91受體結合區域之C端； (c) 一融合抗原，其係包含： (i) 一豬生殖與呼吸綜合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) ORF7抗原； (ii) 一PRRSV ORF1b抗原； (iii) 一PRRSV ORF6抗原；及 (iv) 一PRRSV ORF5抗原； (d) 一內質網滯留序列(endoplasmic reticulum retention sequence)，位於該融合蛋白之C端；以及 (e) 屬於隨選性的一出核訊號(nuclear export signal, NES)，包含序列識別號：13之胺基酸序列，位於該等抗原與該內質網滯留序列之間或位於該轉位胜肽與該等抗原之間； 其中該融合抗原並不包含全長的ORF7、ORF6、ORF5及ORF1b的蛋白質序列。
於本發明一實施例中，該ORF7或ORF1b抗原位在該ORF6抗原之N端，且該ORF5抗原位在該ORF6抗原之C端。
於本發明另一實施例中，該ORF6抗原位在該ORF5抗原之N端，且ORF6與ORF5抗原之間並無橋樑或連結。
於本發明另一實施例中，該融合抗原包含ORF7抗原之兩個重複序列(tandem repeats)。
於本發明另一實施例中，該ORF5抗原位在該ORF6抗原之C端。
於本發明另一實施例中，該ORF6抗原包含PRRSV ORF6之N端部分胺基酸序列，該ORF5抗原包含PRRSV ORF5之N端部分胺基酸序列，且該融合抗原並不包含ORF6及ORF5之C端部分胺基酸序列。
於本發明另一實施例中，該ORF1b抗原包含ORF1b非結構蛋白(Non-structural protein, NSP) 10之C端部分胺基酸序列以及ORF1b NSP 11之N端部分胺基酸序列，且該融合抗原缺乏ORF1b之N端及C端部分胺基酸序列。
於本發明另一實施例中，該APC結合區域或該CD91受體結合區域係一多胜肽，其包含一與序列識別號：1、8、9、10、11或32至少為90%相同之胺基酸序列。
於本發明另一實施例中，當該出核訊號(NES)存在時，該內質網滯留序列包含該胺基酸序列KDEL（序列識別號：15），且不含該等胺基酸KDEL之重複序列。
於本發明另一實施例中，該APC結合區域或該CD91受體結合區域係一多胜肽，其包含一與序列識別號：1或32至少為90%相同之胺基酸序列。
於本發明另一實施例中，該出核訊號及該內質網滯留序列構成一融合胜肽，具有一與序列識別號：12至少為90%相同之胺基酸序列。
於本發明另一實施例中，當該出核訊號(NES)不存在時，該內質網滯留序列包含序列識別號：16、17、18或19之胺基酸序列。
於本發明另一實施例中，該APC結合區域或該CD91受體結合區域係一多胜肽，其包含一與序列識別號：8至少為90%相同之胺基酸序列。
於另一態樣中，本發明關於一組成物，其係包含： (i) 本發明之PRRSV融合蛋白；以及 (ii) 一豬環狀病毒第二型(porcine circovius type 2, PCV2)融合蛋白，包含： (a) 一抗原呈現細胞(APC)結合區域或一CD91受體結合區域，位於該融合蛋白之N端； (b) 一轉位胜肽，長度為34-112個胺基酸殘基，包含一與序列識別號：4、2、3或6至少為90%相同之胺基酸序列，位於該APC結合區域或該CD91受體結合區域之C端；及 (c) 一PCV2 ORF2抗原； (d) 一內質網滯留序列，位於該融合蛋白之C端；以及 (e) 一出核訊號，包含序列識別號：13之胺基酸序列，位於該抗原與該內質網滯留序列之間或位於該轉位胜肽與該抗原之間； 其中該PCV2 ORF2抗原包含PCV2 ORF2蛋白之C端部分胺基酸序列，且該PCV2融合蛋白並不包含PCV2 ORF2蛋白之N端部分胺基酸序列。
於本發明另一實施例中，該APC結合區域或該CD91受體結合區域不帶有綠膿桿菌外毒素A(PE)結合區域 I之胺基酸序列。
於本發明另一實施例中，該轉位胜肽之長度為34-46個胺基酸殘基。
於本發明另一實施例中，該轉位胜肽之長度為34-61個胺基酸殘基。
於又一態樣中，本發明係關於一種誘發抗原特異性細胞中介及體液性反應之方法，其係包含對一需要治療之個體投以一包含於治療上有效量之本發明融合蛋白之組成物，藉此誘發抗原特異性細胞中介及體液性反應。
於再一態樣中，本發明係關於一種組成物之用途，該組成物包含一於治療上有效量之本發明融合蛋白或本發明組成物，用以製造一種可在一需要治療之個體體內誘發抗原特異性細胞中介及體液性反應之醫藥品。本發明亦關於一組成物，其係包含一於治療上有效量之本發明融合蛋白或本發明組成物，用以在一需要治療之個體體內誘發抗原特異性細胞中介及體液性反應。
或者，本發明係關於一種用以誘發抗原特異性細胞中介及體液性反應之方法，包含對一需要治療之個體投以本發明之組成物，藉此誘發抗原特異性細胞中介及體液性反應。
本發明之融合抗原包含ORF7、ORF6、ORF5及ORF1b上之中和及保護性決定位(neutralization and protective epitopes)，並且不含全長的ORF7、ORF6、ORF5及ORF1b的蛋白質序列。
ORF7抗原包含序列識別號：33、22或23之胺基酸序列。
ORF1b抗原包含ORF1b NSP 10 之C端部分及ORF1b NSP 11之N端部分之胺基酸序列，且缺乏ORF1b 之N端及C端部分。亦即，該融合抗原包含ORF1b NSP 10之C端部分胺基酸序列以及ORF1b NSP 11之N端部分胺基酸序列，但並不包含ORF1b 之N端及C端部分胺基酸序列。
ORF6抗原包含PRRSV ORF6之N端部分胺基酸序列，ORF5抗原包含PRRSV ORF5之N端部分胺基酸序列，且該融合抗原並不包含ORF6及ORF5之C端部分胺基酸序列。換言之，ORF6抗原係選自PRRSV ORF6之N端部分胺基酸序列，且ORF5抗原係選自PRRSV ORF5之N端部分胺基酸序列。
於本發明另一實施例中，PRRSV ORF6之N端部分胺基酸序列為序列識別號：34，且PRRSV ORF5 之 N端部分胺基酸序列為序列識別號：35。
於本發明又一實施例中，PRRSV ORF6之N端部分胺基酸序列為序列識別號：36，且PRRSV ORF5之N端部分胺基酸序列為序列識別號：37。ORF1b抗原包含ORF1b NSP 10之C端部分胺基酸序列及ORF1b NSP 11之N端部分胺基酸序列，且該融合抗原缺乏ORF1b 之N端及C端部分胺基酸序列。於本發明一實施例中，ORF1b抗原之長度少於200個胺基酸殘基，且包含序列識別號：25之胺基酸序列。於本發明另一實施例中，該ORF1b抗原包含一從PRRSV ORF1b之胺基酸殘基1046至1210的胺基酸序列。在本發明一實施例中，序列識別號：13之C端胺基酸為丙胺酸(alanine)。
上述及其他態樣將藉由以下較佳實施例之說明參照附圖加以陳明。附圖繪示本發明之一或多種實施例，連同書面描述，用以解說本發明之原理。於可能之情況下，所有圖面係使用相同之示數指稱一實施例中相同或類似之元件。
為更詳述本發明，於此提供下列實例，唯其僅屬說明性質，且熟悉此技藝人士應瞭解可為諸多修改變化。現在詳述本發明之各種實施例。參照附圖，各圖中係以類似之號碼指述類似之組件。如在本說明書及申請專利範圍中所使用，除非上下文另有明確之不同指定，否則「一」及「該」之意義包括複數指稱。此外，如在本說明書及下開申請專利範圍中所使用，除非上下文另有明確之不同指定，否則「在其中」之意義包括「在其中」及「在其上」。再者，說明書中所用之標題或副標係便利為讀者，不應對本發明之範圍構成影響。此外，本說明書中所涉部分用語係採如下定義。定義
本說明書中所用語彙一般而言具有其於在此技藝中與本發明語境相關範圍及所用處之特定語境範圍內通常具有之意義。於此處或本說明書中他處針對用於本發明之特定語彙加以陳述，提供額外指引以利閱讀本發明之實行者瞭解。為便於閱讀，某些語彙可能以強調方式表達，例如使用斜體字及／或引號。強調方式之使用並不對於語彙之範圍及意義構成影響；在同一語境中，語彙不論是否以強調方式表達，其範圍及意義俱為相同。應知一事可以多種方式表述。因此，在此討論的一或多項用語可使用替代語言及同義字，且一語彙不論是否在此受到闡述或討論，均不增減其重要性。在此提供某些用語之同義字。使用一或多種同義字並不排除其他同義字之使用。於本說明書中任何部分之實例使用若包括任何在此討論用語之範例，僅屬說明性質，且絕不對本發明或任何例示用語之範圍及意義構成限制。同樣，本發明並不限於本說明書中所提供之各種實施例。
除非另有不同定義，在此使用所有技術及科學語彙與在本技藝中具有通常知識之人共同瞭解之意義相同。若有牴觸，應以本文件及其所提供之定義為準。
「抗原呈現細胞(an antigen-presenting cell,APC)或輔助細胞」意指一細胞，可於其表面展現與主要組織相容性複合物(major histocompatibility complexes,MHC)複合之外來抗原。T細胞可使用其T細胞受體(T-cell receptors,TCR)辨識此等複合物。此等細胞處理抗原並將之呈遞至T細胞。主要種類之專門抗原呈現細胞為樹突細胞 (dendritic cells ,DC)、巨噬細胞（亦為CD4+且因此亦受HIV感染）、單核細胞以及特定B細胞。
「抗原呈現細胞(APC)結合區域」意指可與抗原呈現細胞(APC)結合之區域（其為一多胜肽）。APC結合區域可為一多胜肽，包含一與選自以下序列識別號之序列至少為90%相同之胺基酸序列：1及8-11。APC結合區域為一配體，其可辨識並結合至APC上之受體。
分化簇91 (Cluster of differentiation 91 ,CD91)係一蛋白質，其在細胞膜中構成一受體，且參與受體中介入胞作用。
「PEt 」意指一轉位胜肽(translocation peptide) 或一轉位區域(translocation domain)，長度為34-112個胺基酸殘基。PEt 可包含與序列識別號：2-4及6至少為90%相同之胺基酸序列。例如，PEt 之胺基酸序列可為PE 之a.a. 280 - a.a. 313（序列識別號：4）、a.a. 268 - a.a. 313（序列識別號：3）、a.a. 253 - a.a. 313（序列識別號：2）或a.a. 253 - a.a. 364（序列識別號：6）片段。亦即，PEt 之胺基酸序列可包含PE區域II（a.a. 253至a.a. 364；序列識別號：6）之任何區塊，只要其包含a.a. 280-a.a. 313（序列識別號：4）的必要序列（亦即必要片段）即可。
PE407 （序列識別號：7）於前案專利(US 7,335,361 B2)中稱為PE(∆III)。
「最小轉位胜肽(minimum translocation peptide)」意指PE253-313 （序列識別號：2），其可將一抗原轉位入目標細胞之細胞質。
「內質網 (endoplasmic reticulum, ER)滯留序列」意指一胜肽，其功能為協助抗原從細胞質轉位入內質網，並將抗原留置於內質網腔中。內質網滯留序列包含Lys Asp Glu Leu (KDEL；序列識別號：15)之序列或RDEL。內質網滯留序列可包含序列KDEL、RDEL、KDELKDELKDEL(K3；序列識別號：16)、KKDLRDELKDEL(K3；序列識別號：17)、KKDELRDELKDEL(K3；序列識別號：18)或KKDELRVELKDEL(K3；序列識別號：19)。
出核訊號(nuclear export signal ,NES)意指在一蛋白質中的4個疏水性殘基之短胺基酸序列，其運用核輸送作用使之經由核孔複合物從細胞核輸出至細胞質。NES由外運子(exportins)辨識及固定。最常見之疏水性殘基間隔為Lxx KLxx Lx Lx （序列識別號：13），其中「L」為白胺酸(leucine)，「K」為離胺酸(lysine)，且「x」為任何自然產生之胺基酸。例如，人造NES可包含序列Leu Gln Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Leu Ala （LQKKLEELELA；序列識別號：14）。
「NESK」意指NES與ER滯留訊號之融合胜肽（亦即NES融合於ER滯留訊號）。其係一人造胜肽，具有出核訊號(NES)及ER滯留序列之功能。因此，其可從細胞核經由核孔複合物輸出抗原至細胞質，並協助抗原從細胞質轉位至ER，再將抗原留置於ER腔中。例如，NESK之胺基酸序列可為LQKKLEELELAKDEL（序列識別號：12）。
次單元疫苗(Subunit vaccines)為僅使用致病病毒一部分之疫苗。此一策略最常用於病毒為疾病成因之情況。該造成疾病之部分係一蛋白質，亦即所謂之抗原。
抗原(antigen)可為一致病蛋白、多胜肽或胜肽，其可能造成因病原體產生之疾病，或能夠誘發宿主體內之免疫反應。抗原可為一融合抗原，由選自一或多種致病蛋白之二或多種抗原融合而成。例如，PRRSV ORF6片段與ORF5片段之融合抗原，或PRRSV與PCV2病原體抗原之融合。
決定位(epitope)為抗原之一部分。保護性決定位(protective epitope)代表當決定位與抗體結合時，其可幫助抗體發揮功能而非妨礙抗體。
中和決定位(neutralizing or neutralization epitopes)之存在為預防性疫苗之結構基礎。中和決定位是病毒細胞連接／進入之關鍵。
如在此所用，「豬生殖與呼吸綜合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus ,PRRSV) ORF7抗原」為一胜肽，係選自PRRSV ORF7之一部分且包含保護性決定位。
如在此所用，「PRRSV ORF1b抗原」為一胜肽，係選自PRRSV ORF1b之一部分且包含保護性決定位。
如在此所用，「PRRSV ORF6抗原」為一胜肽，係選自PRRSV ORF6之一部分且包含保護性決定位。
如在此所用，「PRRSV ORF5抗原」為一胜肽，係選自PRRSV ORF5之一部分且包含保護性決定位。
「PRRSFREE」意指一疫苗組成物，其包含四個融合蛋白 PE407 -M-K3、PE407 -P-K3、PE407 -R-K3以及PE407 -D-K3。
「M12」及「M」可互換使用。「M12」如在此所用，意指一融合抗原，其係PRRSV NSP 10（C端區域序列）與NSP 11（N端區域序列）之融合。
「PQAB」及「P」可互換使用。「P」如在此所用，意指一融合抗原，其係PRRSV ORF6之N端部分與ORF5之N端部分之融合，ORF6與ORF5序列之間並無橋樑／連結序列。
「RSAB」及「R」可互換使用。「R」如在此所用，意指一融合抗原其係 PRRSV ORF6之N端部分與ORF5之N端部分之融合，ORF6與ORF5序列之間並無橋樑／連結序列。
「DGD」及「D」可互換使用。「D」如在此所用，意指一抗原，其包含PRRSV ORF7之C端部分之兩個重複序列。
「治療(treating or treatment)」意指對罹有癌症，或受感染，或展現該等疾病之症狀或傾向，而需治療之個體投以有效量之融合蛋白，以期治療、緩和、減輕、醫治、改善或預防疾病、其症狀或其傾向。此一個體可由健康照護專業人士基於任何適當診斷方法之結果加以辨識。
「有效量(effective amount)」意指活性化合物足以對受治療個體產生治療效果之需要量。有效劑量可能依據投藥路徑、賦形劑的使用及與其他治療方式共用等因素而變化，如熟悉此技藝人士所知者。實施例
於不限制本發明範圍之前提下，以下提供本發明實施例之範例儀器、裝置、方法及其相關結果。標題或副標之使用僅為便利讀者，而不應構成對於本發明範圍之限制。此外，以下亦提及並揭露某些理論。然而，只要本發明可依據本發明實施而不拘於任何特定理論或行動方案，則不論此等理論正確與否，均不應構成對於本發明範圍之限制。方法 融合抗原 DRMP 及 MDPR 之合成
將編碼融合抗原DRMP （序列識別號：52）、MDPR（序列識別號：53）及PCV2 ORF2抗原（序列識別號：20）之DNA序列分別合成並進一步選殖入質體pTAC-2-PE313 -NESK或pTAC-2-RAP1-PEt268-313 -K3。所有合成之序列均經大腸桿菌生長優化。於PCR中使用各自正股及反股引子以提供DRMP或MDPR DNA放大。放大後之DNA片段經EcoRI及XhoI消化，而後接合至(ligated into)指定載體中。融合蛋白PE313 -PCV2-NESK亦以類似方式選殖。
表1顯示用於選殖入質體之正股及反股引子序列。粗體字表示EcoRI剪切位點；斜體字表示SalI剪切位點；斜體加粗表示XhoI剪切位點；加註底線表示抗原序列。 表1 實施例 1 表達載體之架構
圖1A顯示PE包含三個區域(I、II及III)。PE407 為PE中從a.a. 1至a.a 407之區塊。PE407 並不包含細胞毒素區域III，因此包含區域I及II。PE313 為PE中從a.a. 1至a.a. 313之區塊。因此，PE313 僅包含PE之區域Ia及區域II之一部份N端區塊。
圖1B-C顯示表達載體之架構，其各包含一抗原呈現細胞(APC)結合區域、一轉位胜肽、一抗原、具有（下欄）或不具（上欄）一出核訊號(NES)，以及一內質網(ER)滯留序列（上欄為K3或下欄為K），該內質網滯留序列位於融合蛋白之C端。質體pTac-2-PE313 -NESK、pTac-2-PE407 -K3、pTac-2-RAP1-PE268-313 -NESK及pTac-2-RAP1-PE268-313 -K3之產生方式如下：以PCR方法合成NdeI PE313 -(EcoRI, XhoI) -NESKXhoI 、NdeI PE407 -(EcoRI, XhoI) -K3XhoI 、NdeI RAP1-(EcoRI) -PE268-313 -(EcoRI, XhoI) -NESKXhoI 及NdeI RAP1-(EcoRI) -PE268-313 -(EcoRI, XhoI) -K3XhoI 片段，而後以抗卡納黴素基因(kanamycin resistance gene)接合至pUC18骨架以取得各自的質體。
之後可將編碼一抗原或一特定病原體融合抗原之目標DNA嵌入上述質體以產生一表達載體，用以表達一融合蛋白。例如，合成編碼豬環狀病毒第二型(PCV2) ORF2（序列識別號：20）抗原之DNA片段並將之嵌入質體pTac-2-PE313 -NESK以產生表達載體PE313 -PCV2-NESK（圖1F）。
合成以下目標DNA片段： (i) 一目標DNA，其編碼一包含PRRSV ORF7之C端部分兩個重複序列之抗原。此抗原稱為「DGD」或「D」。 (ii) 一目標DNA，其編碼一由PRRSV NSP 10（C端區域序列）與NSP 11（N端區域序列）構成之融合抗原。此抗原稱為「M12」或「M」。 (iii) 一目標DNA，其編碼一由PRRSV ORF6之 N端部分與ORF5之N端部分構成之融合抗原，序列ORF6與ORF5序列之間並無橋樑/連結融合抗原。此抗原稱為「RSAB」或「R」。 (iv) 一目標DNA，其編碼一由PRRSV ORF6 之N端部分與ORF5之N端部分構成之融合抗原，序列ORF6與ORF5序列之間病無橋樑／連結。此抗原稱為「PQAB」或「P」。
將上述目標DNA片段嵌入圖1B上欄所示之質體，分別產生融合蛋白PE407 -M-K3、PE407 -P-K3、PE407 -R-K3及PE407 -D-K3（圖1D）。
合成一目標DNA片段，其編碼一包含上述所有四種抗原D、R、M及P（例如DRMP、MDPR等等）之融合抗原，並將之嵌入質體pTac-2-PE313 -NESK以產生一表達載體，用以表達融合蛋白PE-DRMP-NESK（圖1E），此融合蛋白亦稱為「PRRSFREE四合一」。實施例 2 蛋白表達
將含有融合蛋白表達質體之大腸桿菌BL21細胞分別置入含有 25 ppm卡納黴素(kanamycin)之Luria Bertani培養基，於37°C培養。當培養物達到初期指數期時(A600=0.1 至 0.4)，將異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside ,IPTG)加入，最終濃度為0.5至2 mM，以誘發反應。誘發後四小時收獲細胞並立即儲存於−70° C。如先前所述，藉由使用尿素萃取來純化融合蛋白(Liao et al., 1995. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43: 498-507)，而後利用50倍量之TNE緩衝液(50mM Tris、50mM NaCl及1mM EDTA)以透析方法再折疊，於4o C溫度下過夜。使用 Bradford蛋白檢驗套件(Pierce)對再折疊之蛋白進行SDS-PAGE分析及定量分析。結果顯示多數再折疊之蛋白為於非還原條件下為單體，顯示融合蛋白可輕易再折疊且不會聚集。實施例 3 PRRSV 次單位疫苗之免疫生成性分析 (immunogenicity assay)
以s.c.注射方式對小鼠接種200µl PRRSV次單位疫苗，其含有每劑30μg之PRRSFREE四合一或PRRSFREE及ISA206佐劑，每週一次，為期兩週。對照組（安慰劑）注射PBS。
所有小鼠於最後一次免疫接種後14天犧牲，收獲其脾臟。分離出脾细胞並置入96孔盤（105 細胞/100 µl/孔），加入或不加入刺激性重組抗原蛋白，並在37°C之溫度下培養72 小時。依據免疫接種所用疫苗，對應之刺激性重組抗原蛋白為PRRSFREE抗原、PRRSFREE-四合一嵌合性融合抗原或PCV2 ORF2抗原，以偵測抗原特異性細胞中介免疫反應。收集細胞培養上層液，並使用IFN-γ小鼠抗體對(Mouse Antibody Pair)(Invitrogen)測定上層液中之干擾素伽瑪(IFN-γ )。
依據免疫接種所用疫苗，將PRRSFREE抗原或PRRSFREE四合一融合抗原或PCV2 ORF2抗原塗佈於ELISA中以偵測體液免疫反應。塗佈後，將培養皿清洗並封起，接著加入稀釋後之小鼠血清。而後清洗培養皿，以HRP結合之二級抗體雜交之，繼而加入TMB基質。反應停止後，以ELISA讀取器偵測結果。實施例 4 細胞中介免疫反應 (Cell-mediated immune response ,CMI) 以及體液免疫反應
圖2A顯示接種組之IFN-γ濃度高於對照組，證明接種誘發CMI反應。此外，PRRSFREE四合一疫苗使用組之IFN-γ濃度高於PRRSFREE治療組。意料外之結果證明由單一融合抗原構成之PRRSFREE四合一疫苗較由四種抗原組成之PRRSFREE疫苗能夠誘發更強之CMI反應。
圖2B顯示疫苗免疫組較對照組具有更高之抗原特異性抗體。小鼠以PRRSFREE四合一疫苗接種後，具有較注射PRRSFREE疫苗組別更高之抗體滴定量。結果顯示PRRSFREE四合一可較PRRSFREE疫苗誘發更高之體液免疫反應。
圖2A-B之資料顯示PRRSFREE四合一，包含由D、M、P及R抗原融合而成之單一融合抗原所構成之融合蛋白，較包含四種分別位於各自融合蛋白之分離單獨抗原（亦即四種抗原D、M、P、R未融合）之PRRSFREE疫苗能夠引發更高之細胞及體液免疫反應。實施例 5 具豬環狀病毒第二型 (PCV2) ORF2 次單位疫苗 之 組合疫苗
依據上述之免疫接種時程，以PBS、PRRSFREE四合一加PE-PCV2-NESK，或PRRSFREE加PE-PCV2-NESK混合疫苗對小鼠接種。PRRSFREE四合一加PE-PCV2-NESK混合疫苗包含PE-DRMP-NESK（圖1E）以及PE-PCV2-NESK（圖1F）融合蛋白。PRRSFREE加 PE-PCV2-NESK混合疫苗包含5種分離融合蛋白：(1) PE-DGD-K3、PE-M12-K3、PE-PQAB-K3、PE-RSAB-K3（圖1D）及PE-PCV2-NESK（圖1F）。實施例 6 具 PCV2 ORF2 次單位疫苗之組合疫苗
圖3A顯示PRRSV抗原特異性（PRRSFREE四合一融合抗原及PRRSFREE抗原）CMI反應，以及圖3B顯示PCV2-ORF2抗原特異性CMI反應。資料指出以PRRSFREE四合一融合抗原與PCV2 ORF2次單位疫苗組合進行免疫之小鼠較以 PRRSFREE（4種分離抗原）與PCV2 ORF2次單位疫苗組合進行免疫之小鼠展現更強的CMI反應。
圖4A顯示PRRSV抗原特異性抗體反應。使用ELISA方法測量抗原特異性抗體滴定量。對於以PE-DRMP-NESK與PE-PCV2-NESK（亦即兩種融合蛋白）組合治療之組別，使用融合抗原DRMP測量抗原特異性抗體滴定量。對於以PRRSFREE與PE-PCV2-NESK（亦即5種融合蛋白）組合治療之組別，使用四種抗原 D、R、M及P測量抗原特異性抗體滴定量。資料指出使用PRRSFREE四合一融合抗原與PCV2 ORF2次單位疫苗組合進行免疫之小鼠較以 PRRSFREE（4種分離抗原）與PCV2 ORF2次單位疫苗組合進行免疫之小鼠展現更強的PRRSFREE四合一融合抗原特異性體液性反應（圖4A）。
圖4B顯示PCV2-ORF2抗原特異性抗體反應。意外發現以PRRSFREE （4種分離抗原）與PCV2 ORF2次單位疫苗(PE-PCV2-NESK)組合免疫之小鼠較以PRRSFREE四合一融合抗原 (PE-DRMP-NESK)與PCV2 ORF2次單位疫苗(PE-PCV2-NESK)組合免疫之小鼠具有更高之PCV2特異性抗體滴定量。結果顯示兩種PRRSV/PCV2混合疫苗之間存在有不同的PRRSV抗原特異性及 PCV2抗原特異性的體液免疫反應。
顯然兩種方案皆可有效誘發CMI及體液免疫反應。PRRSV/PCV2混合疫苗包含2種融合蛋白(PE-DRMP-NESK與PE-PCV2-NESK)，於四種受測免疫反應中之三者顯示較佳效率。此研究證明由PRRSV嵌合抗原與PCV2 ORF2抗原構成之PRRSV/PCV2混合疫苗優於由五種個別抗原所組成者。然兩種方案皆可於動物體內誘發免疫反應。實施例 7 兩種抗原之融合與四種抗原之融合
三組六週齡雌性C57BL/6小鼠（每組3隻小鼠）以皮下注射方式投予(1) 15 µg之 PE-DR-NESK蛋白、(2) 15 µg之PE-DR-NESK與15 µg之 PE-MP-NESK蛋白之組合，或(3) 30 µg之 PE-DRMP-NESK，皆配於200 µl之50% ISA206中，以週間間隔(weekly intervals)施打三次。最後一次免疫接種後一週犧牲小鼠，取得脾臟細胞。將脾臟細胞以4 PRRSV抗原(M12、DgD、PQAB及 RSAB，各2.5 µg/ml)刺激72小時，並使用ELISA 套件偵測各組無細胞上層液中之IFN-γ。圖5顯示以PE-DRMP-NESK免疫之小鼠在三組中展現最強之CMI反應。實施例 8 豬隻之細胞中介免疫力 (Cell-mediated immunity)
以下列疫苗之一對五週齡之SPF豬（每組2-4頭豬隻）實施肌內注射：(1) PRRSFREE、(2) PE-DRMP-NESK、(3) PE-MDPR-NESK、(4) RAP1-PE268-313 -DRMP-K3、(5) RAP1-PE268-313 -MDPR-K3，皆配於2 mL的50% ISA206中，或(6) PBS作為安慰劑，以週間間隔施打二次。圖6顯示上述疫苗之設計。每次注射所含抗原為300 µg，其配於2 mL的50% ISA206中。最後一次免疫處理之三週後採集接種後豬隻之周邊血液單核細胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。依據用於免疫之疫苗，PBMCs之刺激係使用 PRRSFREE抗原 (M12、DgD、PQAB及RSAB，各2.5 ug/ml)、PE-DRMP-NESK、PE-MDPR-NESK、RAP1-PE268-313 -DRMP-K3或RAP1-PE268-313 -MDPR-K3，時間為72小時，而後使用ELISA套件偵測各組無細胞上層液中之IFN-γ。圖7顯示接種後豬隻之PBMC經刺激後所分泌IFN-γ。結果顯示包含融合抗原之疫苗較安慰劑組更能夠誘發 IFN-γ分泌。實施例 9 豬隻病毒血症研究 (Viremia studies)
以下列疫苗之一對五週齡之SPF豬（每組2-4頭豬隻）實施肌內注射：(1) PRRSFREE、(2) PE-DRMP-NESK、(3) PE-MDPR-NESK、(4) RAP1-PE268-313 -DRMP-K3、(5) RAP1-PE268-313 -MDPR-K3，皆配於2 mL的50% ISA206中，或(6) PBS作為安慰劑，以週間間隔施打二次。每次注射所含抗原為300 µg，其配於2 mL的50% ISA206中。最後一次免疫處理之三週後對接種後之豬隻經鼻腔投予2 x 105 TCID50之PRRSV。每週收集血液樣本。從血清中提取病毒RNA並使用單一步驟SyBR Green即時PCR定量，以判定病毒血症的程度。實驗結果顯示包含融合抗原之疫苗能夠降低病毒量。
表2顯示用於製作各種融合蛋白之胜肽序列識別號。 表2
本發明並不限於所述特定形式，且所有不脫離本發明精神之範疇之修改俱應屬於所附申請專利範圍所定義之範疇。實施例及實例之選擇與描述係為解說本發明之原理及其實務應用，以利其他熟悉本技藝人士運用本發明、各種實施例連同各種適合其實務應用之修改。熟悉本發明所屬技藝之人士應可思及不脫離本發明精神及範圍之替代實施例。本發明引用及討論之參照資料可能包括專利、專利申請及各種公開文獻。此等參照資料之引用及／或討論僅為澄清本發明之描述，並非承認任何此等參考資料為本發明之「前案」。所有在本說明書中引述及討論之參照資料俱以其參照而整體合併於此，如同各參照資料個別合併於此。
無
圖1A係一概要圖，顯示一全長綠膿桿菌外毒素A(PE)及PE部分片段。 圖1B-C顯示載體圖譜。 圖1D係一概要圖，顯示用於製備疫苗組成物PRRSFREE之四種不同質體。疫苗組成物 PRRSFEE包含四種不同單獨PE融合蛋白。 PRRSFREE疫苗組成物中之個別PE融合蛋白包含一PE(∆ III) 片段(PE407 )、一單一抗原部分（稱為M、P、R或D），以及一內質網滯留序列(K3)。「D」或「DGD」代表來自PRRSV 核蛋白ORF7之抗原。「R」或「RSAB」代表PRRSV ORF6/膜蛋白與ORF5/主要外膜蛋白之融合抗原，兩者間並無橋樑／連結序列。「M」或「M12」代表來自PRRSV ORF1b之抗原，其為PRRSV非結構蛋白NSP 10與 NSP 11之人造融合抗原。「P」或「PQAB」代表PRRSV ORF6/膜蛋白與ORF5/主要外膜蛋白之融合抗原，兩者間並無橋樑/連結序列。「PE(∆ III)」代表一PE片段，不帶細胞毒素區域III。「PE407 」代表一從胺基酸1至407的綠膿桿菌外毒素A(PE)多胜肽。 圖1E係一概要圖，顯示一用於製備PE融合蛋白之質體，該PE融合蛋白稱為PE-DRMP-NESK或PRRSFREE四合一。PE-DRMP-NESK融合蛋白包含一PE(∆ III)片段(PE313 )、一具有四個抗原部分（稱為DRMP）之單一融合多胜肽、一出核訊號 (NES)以及一內質網滯留序列(K)。 圖1F係一概要圖，顯示一編碼一融合蛋白的質體，該融合蛋白包含一PE(∆ III)片段(PE313 )、一單一抗原部分（稱為PCV2）、一出核訊號(NES)以及一內質滯留序列(K)。 圖2A係一圖表，顯示使用PBS或疫苗組成物PRRSFREE四合一或PRRSFREE免疫之小鼠之抗原特異性細胞中介免疫(CMI)反應。 圖2B係一圖表，顯示使用PBS或疫苗組成物PRRSFREE四合一或PRRSFREE免疫之小鼠的抗原特異性抗體(IgG)反應。 圖3A係一圖表，顯示使用PBS或不同PRRS/PCV2混合疫苗免疫之小鼠的PRRSFREE抗原特異性CMI反應。 圖3B係一圖表，顯示使用 PBS或不同PRRS/PCV2 ORF2混合疫苗免疫之小鼠的PCV2 ORF2抗原特異性CMI反應。 圖4A係一圖表，顯示使用 PBS或不同PRRS/PCV2混合疫苗免疫之小鼠的PRRSFREE抗原特異性抗體(IgG)反應。 圖4B係一圖表，顯示使用PBS或不同PRRS/PCV2混合疫苗免疫之小鼠的PCV2 ORF2抗原特異性抗體(IgG)反應。 圖5係一圖表，顯示使用以下項目免疫之小鼠的PRRSFREE抗原特異性CMI反應：(1)一融合蛋白，包含兩種抗原之融合（亦即，在PE313 -DR-NESK中抗原D與R之融合）；或(2)兩種不同融合蛋白之組合，各融合蛋白包含兩種抗原之融合（亦即，在PE313 -DR-NESK中抗原D與R之融合，或在PE313 -MP-NESK中抗原M與P之融合）；或(3)一融合蛋白，包含四種抗原之融合（亦即，在PE313 -DRMP-NESK中抗原D、R、M與P之融合）。 圖6係一概要圖，顯示用於對豬隻進行免疫接種以抗PRRSV感染之各種融合蛋白。 圖7係一圖表，顯示在不同PRRSV抗原刺激後之免疫豬隻中的PSMC所分泌出的IFN-γ表現量。
無

Claims (15)

  1. 一種融合蛋白，其係包含：(a)一抗原呈現細胞(APC)結合區域或一CD91受體結合區域，位於該融合蛋白之N端；(b)一轉位胜肽，長度為34-112個胺基酸殘基，包含一至少與序列識別號：4、2、3或6為90%相同之胺基酸序列，位於該APC結合區域或該CD91受體結合區域之C端；(c)一融合抗原，其係包含：(i)一豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)ORF7抗原；(ii)一PRRSV ORF1b抗原；(iii)一PRRSV ORF6抗原：及(iv)一PRRSV ORF5抗原；(d)一內質網滯留序列，位於該融合蛋白之C端；以及(e)屬於隨選性的一出核訊號，包含序列識別號：13之胺基酸序列，位於該等抗原與該內質網滯留序列之間或位於該轉位胜肽與該等抗原之間；其中該融合抗原並不包含全長的ORF7、ORF6、ORF5及ORF1b的蛋白質序列。
  2. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該ORF7或ORF1b抗原位在該ORF6抗原之N端，且該ORF5抗原位在該ORF6抗原之C端。
  3. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該抗原呈現細胞(APC)結合區域或CD91受體結合區域係為綠膿桿菌外毒素A(PE)結合區域Ia。
  4. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該ORF5抗原位在該ORF6抗原之C端。
  5. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該ORF6抗原包含該PRRSV ORF6之N端部分胺基酸序列，該ORF5抗原包含該PRRSV ORF5之N端部分胺基酸序列，且該融合抗原並不包含該ORF6及ORF5之C端部分胺基酸序列。
  6. 如請求項5所述之融合蛋白，其中該ORF1b抗原包含ORF1b NSP 10之C端部分胺基酸序列及ORF1b NSP 11之N端部分胺基酸序列，且該融合抗原缺乏該ORF1b之N端及C端部分胺基酸序列。
  7. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該APC結合區域或該CD91受體結合區域係一多胜肽，其包含一與序列識別號：1、8、9、10、11或32至少為90%相同之胺基酸序列。
  8. 如請求項1所述之融合蛋白，其中該轉位胜肽之長度為34-61個胺基酸殘基。
  9. 如請求項1所述之融合蛋白，其中當該出核訊號存在時，該內質網滯留序列包含該胺基酸序列KDEL(序列識別號：15)，且不含該等胺基酸KDEL之重複序列。
  10. 如請求項9所述之融合蛋白，其中該出核訊號及該ER滯留序列構成一融合胜肽，具有一與序列識別號：12至少為90%相同之胺基酸序列。
  11. 如請求項1所述之融合蛋白，其中當該出核訊號不存在時，該內質網滯留序列包含序列識別號：16、17、18或19之胺基酸序列。
  12. 如請求項1所述之融合蛋白，其包含序列識別號：27、28、29或30之胺基酸序列。
  13. 一種組成物，其係包含：(i)如請求項1所述之融合蛋白；(ii)一豬環狀病毒第二型(PCV2)融合蛋白，包含：(a)一抗原呈現細胞(APC)結合區域或一CD91受體結合區域，位於該融合蛋白之N端；(b)一轉位胜肽，其長度為34-112個胺基酸殘基，包含一與序列識別號：4、2、3或6至少為90%相同之胺基酸序列，位於該APC結合區域或該CD91受體結合區域之C端；及(c)一PCV2 ORF2抗原；(d)一內質網滯留序列，位於該融合蛋白之C端；以及(e)一出核訊號，包含序列識別號：13之胺基酸序列，位於該抗原與該內質網滯留序列之間或位於該轉位胜肽與該抗原之間；其中該PCV2 ORF2抗原包含PCV2 ORF 2蛋白之C端部分胺基酸序列，且該PCV2融合蛋白並不包含PCV2 ORF2蛋白之N端部分胺基酸序列。
  14. 一種包含一於治療上有效量之如請求項1所述之該融合蛋白的組成物或者如請求項13所述之該組成物供用於製備一醫藥品的用途，該醫藥品係可於一需要治療之個體體內誘發抗原特異性細胞中介及體液性反應。
  15. 如請求項1至11中之任一請求項所述之融合蛋白，其中該融合抗原係包含：(i)序列識別號：22、23或33之胺基酸序列；(ii)序列識別號：24之胺基酸序列；(ii)序列識別號：25之胺基酸序列；以及(iv)序列識別號：26之胺基酸序列。
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