JP6808650B2 - 短縮型ロタウイルスvp4タンパク質およびその適用 - Google Patents
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Description
(1)N末端の25のアミノ酸を欠き、配列番号:40のアミノ酸位置276、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、476、482、487、492または497に対応する位置(好ましくは、配列番号:40のアミノ酸位置331、351、381、411、441、461、471、476、482、487、492または497に対応する位置)で終了するC末端を有すること;
(2)N末端の1個のアミノ酸を欠き、配列番号:40のアミノ酸位置476に対応する位置で終了するC末端を有すること;
(3)N末端の5個のアミノ酸を欠き、配列番号:40のアミノ酸位置476に対応する位置で終了するC末端を有すること;
(4)N末端の21個のアミノ酸を欠き、配列番号:40のアミノ酸位置476に対応する位置で終了するC末端を有すること;および
(5)N末端の64個のアミノ酸を欠き、配列番号:40のアミノ酸位置476に対応する位置で終了するC末端を有すること
から選択される特徴を有する。
本発明において、特別の定めのない限り、本明細書において使用される科学用語および専門用語は当業者によって一般的に理解されるような意味を有する。更に、本明細書において使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、および免疫学の実験室での操作は、対応する分野において広く使用される常用の操作である。加えて、より良好に本発明を理解するために、関連用語の定義および説明が以下のように提供される。
(i)E.coli中で可溶性形態で発現させることが可能;
(ii)クロマトグラフィーによって容易に精製することが可能;
(iii)精製の後に良好な均一性および安定性(容易に劣化しない)を有する;
(iv)ウイルスによる細胞の感染をインビトロで阻害できる抗VP4の抗体へ特異的に結合することが可能;
(v)細胞受容体への結合をロタウイルスと競合し、ウイルスによる細胞の感染を阻害することが可能;
(vi)ロタウイルスに対する高力価中和抗体の生成を生物体において誘導することが可能;および
(vii)ロタウイルス感染から被験体(ヒトおよびマウス等)を保護することが可能。
本発明に関与する配列に対する情報は以下の表1中で提供される。
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中国特許出願CN201510165746.2中で記載されるような方法に従って、短縮型ロタウイルスVP8タンパク質(VP8−5(そのアミノ酸配列は配列番号:1中で示される))を発現させ精製した。簡潔には、ロタウイルスのゲノムのRNAをロタウイルスLLR株の培養から抽出し、VP4タンパク質をコードするcDNAを逆転写によって得た。次いで、得られたcDNAを鋳型として使用し、VP8−5をコードする遺伝子断片をPCR増幅によって得た。次いで得られた遺伝子断片を使用してVP8−5についての発現ベクターを構築し、発現ベクターをE.coliの中へ形質転換した。VP8−5発現ベクターを含有するE.coliをOD600が約0.6になるまで37℃で培養し、次いで温度を25℃へ下げた。IPTGを0.8mMの最終濃度で添加し、E.coliを6時間更に培養した。培養後に、細菌を遠心分離によって収集し、超音波で破壊し、可溶性画分を収集した。次いで、VP8−5タンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィーによって可溶性画分から収集し、そこで、使用する機器システムは、GE Healthcare Companyによって生産されたAKTA Explorer 100 Preparative Chromatography Systemであり;使用するクロマトグラフィーメディアはQ−セファロース−HP(GE Healthcare Company)であり;使用するバッファーは、50mMのトリス−HCl(pH8.0)および50mのMトリス−HCl(pH8.0)、2MのNaClであった。溶出プログラムは以下の通りであった。純粋でないタンパク質は1000mMのNaClにより溶出し、対象となるタンパク質は50mMのNaClにより溶出し、50mMのNaClにより溶出された産物を収集した。得られた溶出産物を13.5%のSDS−PAGEによって同定し、結果を図1中で示した。図1中の結果は、精製されたVP8−5タンパク質が得られ、90%を超える純度を有していたことを示した。
免疫血清に連続希釈を行い、希釈された免疫血清およびプレート上にコーティングされたVP8−5に間接ELISA分析を行って(そこで、使用した二次抗体はヤギ抗マウス抗体(Wanyumeilan)であった)、VP8−5との反応性を有する免疫血清の最大の希釈を決定した。免疫血清の最大の希釈が大きいほど、免疫血清中の抗VP8−5抗体の力価は高く、免疫血清の産生のためのタンパク質の免疫原性は高かった。
MA104細胞を96ウェルの細胞培養プレート(1.9×104細胞/ウェル)の上へ播種した。20時間後に、免疫血清の中和抗体価をELISPOTによって決定した(Li,Lin,Yu, et al.J Virol Methods,209 7−14,2014)。特定の方法は以下の通りであった。試験される免疫血清サンプル(試験される中和抗体を含有する)に、トリプシンを含有するDMEMの使用による2倍の希釈を連続的に行い;次いで100μLの各々の希釈されたサンプルをDMEM中で希釈されたロタウイルス溶液(TCID50=1.5×105)と混合し;37℃で1時間のインキュベーション後に、混合物を、MA104細胞を前もって播種した96ウェルの細胞培養プレートへ添加し、37℃で14時間培養し;次いで以下の通りに免疫血清サンプルのウイルス感染阻害率を計算した。
免疫付与手順が完了した後(免疫付与後42日目)に、各々の群におけるマウスを、2匹のメスマウス対1匹のオスマウスの比で交配する。交配の約20日後に、メスマウスは哺乳中のマウスを出産し、哺乳中のマウスを7日間飼育した。5×106TCID50/マウスの用量のLLRウイルス株を7日目の哺乳中のマウスの胃内に攻撃投与した。攻撃投与後に、哺乳中のマウスの下痢病態を毎日7日間観察および記録し、排泄物の形および状態に応じてスコアリングした。スコアリング尺度は図2中で示される通りであった。哺乳中のマウスにおける下痢の程度に応じて、スコアは、3つのグレードへと分割される。正常な便は1ポイントとしてスコアリングされ(図2C)、軟便は2ポイントとしてスコアリングされ(図2B)、形が崩れた水様便は3ポイントとしてスコアリングされる(図2A)。
ロタウイルスのLLR株およびSA11株を胎児アカゲザル腎臓株化細胞(MA−104)により培養した。使用される培養培地は、2μg/mlのトリプシン、0.5mg/mlのアンピシリンおよび0.4mg/mlのストレプトマイシン、3.7mg/mlの重炭酸ナトリウムならびに0.34mg/mlのL−グルタミンにより補足したDMEMであった。
上流プライマー:
5’−GGATCCCATATGATGGCTTCGCTCATTTAC−3’(配列番号:42)
5’−GGATCCCATATGTACAGACAATTACTTACGAATTC−3’(配列番号:43)
5’−GGATCCCATATGATACAGTTAATTGGATCAGAAAA−3’(配列番号:44)
5’−GGATCCCATATGGGATCAGAAAAAACGCAG−3’(配列番号:45)
5’−GGATCCCATATGTTGAATGGACCA−3’(配列番号:46)
下流プライマー:
そこで、下線が引かれた配列は酵素制限部位を指摘し、イタリック体は導入された終止コドンを指摘する。
実施例2において調製された陽性の発現ベクターを保有するE.coli溶液を、−70℃の冷却装置から取り出し、カナマイシンを含有する50mlの液体LB培養培地の中へ播き、180rpmで37℃で約4時間培養し;次いで500mlのカナマイシン含有LB培養培地の10本のボトルへ移した(各々のボトルについて500ulの細菌溶液)。培養物の吸光度が600nmの波長で0.5に達したときに、IPTGを1mMの最終濃度まで添加し、180rpmで25℃で6時間更に培養した。
実施例3において得られたE.coli溶液を遠心分離し、細菌沈殿物を収集した。15ml/gの湿潤細菌の比で50mMのTB8.0を使用して、短縮型VP4タンパク質を発現する細菌を再懸濁した。次いでE.coli細胞を超音波で破壊し、超音波破壊の条件は以下の通りであった。1グラムの細菌の破壊について、超音波処理を2秒間および休止を4秒間で、4分間の超音波処理期間であった。超音波破壊後に、混合物を25000gで遠心分離し、上清を収集した(すなわち組換えにより発現された短縮型VP4タンパク質を含有するE.coli溶解物の可溶性画分)。
機器システム:GE Healthcare Company(もとAmershan Pharmacia Company)によって生産されたAKTA Explorer 100分取液体クロマトグラフィーシステム。
クロマトグラフィー媒質:Q−セファロース−HP(GE Healthcare Company)。
カラム体積:5.5cm×20cm。
バッファー:Aポンプ:50mMのトリス−HCl(pH8.0);
Bポンプ:50mMのトリス−HCl(pH8.0)、2MのNaCl
流速:6mL/分。
検出器の波長:280nm。
クロマトグラフィー媒質:フェニルセファロース−HP(GE Healthcare Company)。
カラム体積:5.5cm×20cm。
バッファー:Aポンプ:50mMのトリス−HCl(pH8.0)、2MのNaCl;
Bポンプ:50mMのトリス−HCl(pH8.0)
流速:6mL/分。
検出器の波長:280nm。
短縮型タンパク質26−476のインビトロのアセンブリーを以下の方法によって行った。室温で、短縮型タンパク質26−476を、TB8.0バッファーから表4中で規定された透析バッファーに対して透析し、透析バッファーを6時間ごとに1回変えた。透析後に、溶液を12000rpmで10分間遠心分離し、上清を収集した。その後に、上清を、表4中で規定された温度で30分間〜24時間の期間の間放置した。放置した後に、上清を氷浴中で迅速に置き、12000rpm/分で10分間遠心分離した。上清(インビトロでアセンブルした26−476を含有する)を、詳しい分析のために、第2の遠心分離後に収集した。
実施例4において得られた精製された短縮型VP4タンパク質を、トリプシンによって37℃で1時間切断した。酵素切断された構成要素(100ul)へ、20μLの6×ローディングバッファーを添加し、もたらされた混合物を均一に混合し、10分間100℃の水浴中でインキュベーションした。次いで混合物(10μl)で13.5%のSDSポリアクリルアミドゲル中の電気泳動を120Vの電圧で120分間行い;次いで電気泳動ストリップをクマシーブルー染色によって示した。電気泳動の結果を図9中で示した。
実施例4において得られた精製された短縮型VP4タンパク質をプレートの上へコーティングして、コーティングプレートを得た。中和抗体A3、B1、B5、B6、D6、E2、E5および8F6(1mg/mlの濃度で、研究室においてハイブリドーマ技術によって調製された)に、勾配希釈を行い、次いで実施例1において記載されるように間接ELISA方法によって検出した。
実施例4において得られた精製された短縮型タンパク質26−476をプレートの上にコーティングして、コーティングプレートを得た。実施例1において記載されるような方法に従って、アルミニウムアジュバントの存在下において、Balb/cマウスを、試験されるサンプル(短縮型VP4タンパク質、実施例4において得られた26−476の三量体、実施例5において得られた26−476の重合体、不活性化ウイルス(RV、陽性対照として)およびPBS(NC、陰性対照))により、それぞれ免疫付与し、マウスの血清を収集した。その後に、実施例1において記載されるような方法に従って、26−476コーティングプレートを使用して、マウス血清中の抗体価を間接ELISAによって決定した。
実施例1において記載されるような方法によって、実験群中のBalb/cマウス(1群あたり7匹のマウス)を、試験されるサンプル(短縮型VP4タンパク質、実施例4において得られた26−476の三量体、実施例5において得られた26−476の重合体、不活性化ウイルス(RV、陽性対照として)およびPBS(NC、陰性対照))により、それぞれ免疫付与し、免疫血清を収集した。
実施例1において記載されるような方法の使用によって、Balb/cマウス(1群あたり7匹のマウス)を、試験されるサンプル(短縮型VP4タンパク質、実施例4において得られた26−476の三量体、実施例5において得られた26−476の重合体、不活性化ウイルス(RV、陽性対照として)およびPBS(NC、陰性対照))により、それぞれ免疫付与し、血清を収集した。
遺伝子バンクにおいて提供されるEDIMウイルス株のVP4遺伝子配列(アクセッション番号:AF039219.2)に基づいて、ロタウイルスEDIM株からの26−476をコードする遺伝子断片はSangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd.によって合成された。加えて、遺伝子バンクにおいて提供されるロタウイルスP[6]のVP4遺伝子配列(アクセッション番号:FJ183356.1)に基づいて、ロタウイルスP[6]からの26−476をコードする遺伝子断片はSangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd.によって合成された。その後に、合成遺伝子断片を鋳型として使用し、ロタウイルスP[6]およびEDIMからの短縮型タンパク質26−476をコードする遺伝子断片をPCR増幅によって得た。
上流プライマー:
5’−GGATCCCATATGGGATCGGAGAAAACTCAA−3’(配列番号:77)
5’−GGATCCCATATGGGATCAGAGAAAAGTCAAAAT−3’(配列番号:79)
5’−GGATCCCATATGGGATCAGAAAAAACTCAAAATG−3’(配列番号:81)
5’−GGATCCCATATGGGAGCAGAGAAGACACA−3’(配列番号:83)
5’−GGATCCCATATGGGATCAACTAAATCACAAAATG−3’(配列番号:85)
下流プライマー:
そこで、下線が引かれた配列は酵素認識部位を指摘し、イタリック体は導入された終止コドンを指摘する。
Claims (22)
- 短縮型(truncated)ロタウイルスVP4タンパク質またはそのバリアントであって、該短縮型ロタウイルスVP4タンパク質が、野生型ロタウイルスVP4タンパク質と比較して、N末端からの5個以上64個以下のアミノ酸を欠き(truncated)、該野生型ロタウイルスVP4タンパク質における配列番号:40のアミノ酸位置331〜497の中の任意の位置に対応する位置で終了するC末端を有する、短縮型ロタウイルスVP4タンパク質またはそのバリアント。
- 前記短縮型ロタウイルスVP4タンパク質が、前記野生型ロタウイルスVP4タンパク質と比較して、N末端からの5個以上21個以下、21個以上25個個以下または25個以上64個以下のアミノ酸を欠き;該野生型ロタウイルスVP4タンパク質の配列番号:40のアミノ酸位置276〜497、281〜497、291〜497、301〜497、311〜497、321〜497、331〜497、341〜497、351〜497、361〜497、371〜497、381〜497、391〜497、401〜497、411〜497、421〜497、431〜497、441〜497、451〜497、461〜497、471〜497、476〜497、482〜497、487〜497、または492〜497の中の任意の位置に対応する位置で終了するC末端を有する、請求項1に記載の短縮型ロタウイルスVP4タンパク質またはそのバリアント。
- 前記短縮型ロタウイルスVP4タンパク質が、前記野生型ロタウイルスVP4タンパク質と比較して、N末端からの5、21、25または64個のアミノ酸を欠き、該野生型ロタウイルスVP4タンパク質の配列番号:40のアミノ酸位置331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、476、482、487、492または497に対応する位置で終了するC末端を有する、請求項1に記載の短縮型ロタウイルスVP4タンパク質またはそのバリアント。
- 前記短縮型ロタウイルスVP4タンパク質は、前記野生型ロタウイルスVP4タンパク質と比較して、N末端からの25個のアミノ酸を欠き、配列番号:40のアミノ酸位置331、351、381、411、441、461、471、476、482、487、492または497に対応する位置で終了するC末端を有するか;または、前記短縮型ロタウイルスVP4タンパク質は、N末端からの5、21、25または64個のアミノ酸を欠き、配列番号:40のアミノ酸位置476に対応する位置で終了するC末端を有する、請求項1に記載の短縮型ロタウイルスVP4タンパク質またはそのバリアント。
- 前記野生型ロタウイルスVP4タンパク質は、ロタウイルスLLR株、SA11株、もしくはEDIM株に由来するVP4タンパク質であるか、またはP[4]、P[6]、もしくはP[8]遺伝子型のロタウイルスに由来するVP4タンパク質である、請求項1から4の何れか1項に記載の短縮型ロタウイルスVP4タンパク質またはそのバリアント。
- 前記野生型ロタウイルスVP4タンパク質は、配列番号:40および87〜91から選択されるアミノ酸配列を有し;及び/又は
前記短縮型ロタウイルスVP4タンパク質は、配列番号:3〜5および15〜39から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1から5の何れか1項に記載の短縮型ロタウイルスVP4タンパク質またはそのバリアント。 - 請求項1から6の何れか1項に記載の短縮型ロタウイルスVP4タンパク質またはそのバリアントをコードする、単離された核酸。
- 請求項7に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
- 請求項7に記載の単離された核酸または請求項8に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1から6の何れか1項に記載の短縮型ロタウイルスVP4タンパク質またはそのバリアントを含むかまたはそれからなる、重合体。
- 請求項1から6の何れか1項に記載の短縮型ロタウイルスVP4タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項7に記載の単離された核酸、または請求項8に記載のベクター、または請求項9に記載の宿主細胞、または請求項10に記載の重合体を含む、組成物。
- 請求項1から6の何れか1項に記載の短縮型ロタウイルスVP4タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項10に記載の重合体と、随意に、薬学的に許容される担体および/または賦形剤とを含む、医薬組成物。
- (1)前記医薬組成物が、アジュバントを更に含み;
(2)前記短縮型タンパク質もしくはそのバリアントまたは前記重合体が、ロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防または治療のために効果的な量で存在し;
(3)前記医薬組成物が、追加の活性成分を更に含み;および/または
(4)前記医薬組成物は、ワクチンである、
請求項12に記載の医薬組成物。 - 前記アジュバントは、アルミニウムアジュバントである、請求項13に記載の医薬組成物。
- 短縮型タンパク質またはそのバリアントの発現を可能にする条件下で、請求項9に記載の宿主細胞を培養し;発現された該短縮型タンパク質またはそのバリアントを回収することを含む、請求項1から6の何れか1項に記載の短縮型ロタウイルスVP4タンパク質またはそのバリアントを調製する方法。
- E.coliを使用して該短縮型タンパク質またはそのバリアントを発現するステップ、次いでE.coliを溶解するステップ、および該溶解物から該短縮型タンパク質またはそのバリアントを精製するステップを含む、請求項15に記載の方法。
- 請求項1から6の何れか1項に記載の短縮型ロタウイルスVP4タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項10に記載の重合体を、薬学的に許容される担体および/または賦形剤、ならびに随意に、アジュバント、および/または追加の活性成分と、混合することを含む、ワクチンを調製するための方法。
- ロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防または治療するための、請求項12に記載の医薬組成物。
- 前記ロタウイルス感染によって引き起こされる該疾患が、ロタウイルス胃腸炎または下痢である、請求項13または18に記載の医薬組成物。
- 被験体におけるロタウイルス感染またはロタウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防または治療のための医薬組成物の製造において、請求項1から6の何れか1項に記載の短縮型ロタウイルスVP4タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項10に記載の重合体の使用。
- 前記ロタウイルス感染によって引き起こされる疾患がロタウイルス胃腸炎または下痢であり、および/または
前記被験体は、哺乳類である、
請求項20に記載の使用。 - 前記被験体は、マウスまたはヒトである、請求項20または21の使用。
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