CN108431214B - 人轮状病毒g9p[6]毒株和作为疫苗的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了减毒的G9P[6]轮状病毒。在一些实施方案中，公开了包含减毒的G9P[6]轮状病毒或其组分的药物组合物。这些组合物可用于诱导针对轮状病毒的免疫反应，例如保护性免疫反应。所述组合物可用作疫苗，例如用于儿童(婴儿)，例如用于初免‑加强免疫策略中。

Description

人轮状病毒G9P[6]毒株和作为疫苗的用途
相关专利申请的交叉引用
本申请要求于2015年10月5日提交的美国临时专利申请62/237,452的优先权，所述临时申请的全部内容以引用的方式纳入本文中。
技术领域
本发明涉及病毒学领域，具体地涉及使用减毒的G9P[6]轮状病毒诱导针对轮状病毒感染的免疫反应的方法。
背景技术
轮状病毒是儿童腹泻的最常见病因，几乎世界上每一个儿童在5岁前都被轮状病毒感染过。所述病毒被认为是通过粪-口途径的高度传染性的，并且其影响没有特别的社会经济或地理群的差异。尽管大部分儿童能够挺过感染，大量的儿童患病程度严重，并且与该病毒相关的死亡数目是相当大的。除了对人类健康的影响，轮状病毒还感染动物，并且是家畜的病原体。
A型轮状病毒是引起90％以上的人类轮状病毒肠胃炎。A型轮状病毒是呼肠孤病毒科(Reoviridae)的具有明显的轴辐式(hub-and-spoke)形态的二十面体病毒。轮状病毒颗粒包含围绕病毒基因组的三个蛋白层，所述基因组由11个双链RNA片段组成，每一个片段编码一种蛋白。有6种形成病毒颗粒的病毒蛋白(VP)，被称为VP1-7；以及6种非结构蛋白(NSP)，被称为NSP1-NSP6。基于病毒衣壳蛋白所特有的特性通过组、亚组和血清型对轮状病毒进行分类。
很多结构蛋白在引起宿主中的免疫反应中特别重要，因为这些蛋白存在于病毒颗粒的最外层表面。认为VP7和VP4在宿主免疫反应中起到重要作用。VP7和VP4结构蛋白的变体表征不同的A型轮状病毒血清型。具体地，人VP7的变体被鉴定为“G”血清型，至少包括G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G9、Gl0、G11、G12、G13和G14。VP4结构蛋白的变体被鉴定为“P”血清型，至少包括P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6和P8。因为完整的轮状病毒由VP7蛋白和VP4蛋白表征，根据具体的病毒中所含有的这两个蛋白的变体的类型对各个病毒血清型进行命名。A型轮状病毒的G1血清型是最常见的与全世界人类疾病相关的血清型。常见的A型轮状病毒包含VP7和VP4的G1和P[8]变体，并且被称为G1P[8]。已经开发出很多使用A型轮状病毒G1毒株的疫苗，目的在于宿主中产生针对A型轮状病毒G1毒株以及具有其他血清型的A型轮状病毒毒株的免疫。
多种人轮状病毒类型逐渐被认为是导致全世界急性严重腹泻疾病的原因。这种多样性凸显了对能够产生针对多种毒株的免疫的强有力的疫苗的需要。
Figure BDA0001684331970000021
是具有针对全世界儿童中的同型Wa样和异型DS-1样毒株的广谱交叉反应免疫和交叉保护的疫苗。但是，这种疫苗对某些地区的DS-1样毒株具有较低的功效。因此，对于针对常见类型和不太常见类型的人A型轮状病毒的疫苗有着持续的需要。
发明内容
本文提供了减毒的G9P[6]轮状病毒。在一些实施方案中，公开了药物组合物，其包括减毒的G9P[6]轮状病毒。任选地，所述药物组合物可包括佐剂和/或灭活的G1P[8]轮状病毒。
在其他实施方案中，还公开了用于通过给予受试者包括减毒的G9P[6]轮状病毒的药物组合物来诱导受试者中的免疫反应的方法。在一些非限制性的实例中，所述药物组合物通过口服给药，并且不包括佐剂。在其他非限制性的实例中，所述药物组合物通过肠胃外给药，并且包括佐剂。任选地，所述G9P[6]轮状病毒是灭活的。
任选地，所述药物组合物可包括灭活的G1P[8]轮状病毒。在一个具体的非限制性实例中，所述G1P[8]轮状病毒是CDC-9。所述G1P[8]轮状病毒可是减毒的和/或是灭活的。
所述灭活的减毒轮状病毒也可被包括在药物组合物中以诱导针对其他病原体(例如，但不限于，白喉、破伤风、百日咳、b型流感嗜血杆菌、乙型肝炎(HBV)、脊髓灰质炎和/或肺炎球菌疾病)的反应。
所述免疫反应可为保护性免疫反应。所述受试者可为儿童，例如小于5岁或1岁的人类儿童。所述方法可包括至少一次初免(prime)和加强免疫(boost)。
在其他实施方案中，公开了分离的来自G9P[6]轮状病毒的核酸分子和分离的来自G9P[6]轮状病毒的多肽。这些分子可被包括在药物组合物中，并且可用于诱导免疫反应。
从以下参照附图进行的对数个实施方案的详细描述，本发明的上述和其他特征和优点会变得更加清楚。
附图说明
图1示出了VP4和VP7序列与其他轮状病毒的关系。
图2为示出了TLP纯化和RNA电泳型的数字图像。
图3是示出了在病毒的减毒形式中发生的核苷酸和氨基酸序列改变的表格。
图4是示出了CDC-6和GR10924(其为一种有毒力的G9P[6]轮状病毒)之间每一条核苷酸和蛋白序列的序列同一性的表格。
序列表
所列出的核酸和氨基酸序列是使用在37C.F.R.1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母编码显示。只显示每条核酸序列的一条链，但是应理解对提及所示链的任何提及均包括其互补链。所述序列表以ASCII文本文件(序列表，2016年9月20日，75,887个字节)提交，以引用的方式纳入本文。在所附序列表中:
SEQ ID NO:1是来自减毒的G9P[6]轮状病毒的VP1多肽的氨基酸序列：
Figure BDA0001684331970000041
SEQ ID NO:2是来自减毒的G9P[6]轮状病毒的VP2多肽的氨基酸序列：
Figure BDA0001684331970000042
SEQ ID NO:3是来自减毒的G9P[6]轮状病毒的VP3多肽的氨基酸序列：
Figure BDA0001684331970000051
SEQ ID NO:4是来自减毒的G9P[6]轮状病毒的VP4多肽的氨基酸序列：
Figure BDA0001684331970000052
SEQ ID NO:5是来自减毒的G9P[6]轮状病毒的VP5多肽的氨基酸序列：
Figure BDA0001684331970000053
SEQ ID NO:6是来自减毒的G9P[6]轮状病毒的VP7多肽的氨基酸序列：
Figure BDA0001684331970000061
SEQ ID NO:7是来自减毒的G9P[6]轮状病毒的NSP1多肽的氨基酸序列：
Figure BDA0001684331970000062
SEQ ID NO:8是来自减毒的G9P[6]轮状病毒的NSP2多肽的氨基酸序列：
Figure BDA0001684331970000063
SEQ ID NO:9是来自减毒的G9P[6]轮状病毒的NSP3多肽的氨基酸序列：
Figure BDA0001684331970000064
SEQ ID NO:10是来自减毒的G9P[6]轮状病毒的NSP4多肽的氨基酸序列：
Figure BDA0001684331970000065
SEQ ID NO:11是来自减毒的G9P[6]轮状病毒的NSP5多肽的氨基酸序列：
Figure BDA0001684331970000071
SEQ ID NO:12是编码来自减毒的G9P[6]轮状病毒的VP1多肽的示例性核酸序列：
Figure BDA0001684331970000072
Figure BDA0001684331970000081
SEQ ID NO:13是编码来自减毒的G9P[6]轮状病毒的VP2多肽的示例性核酸序列：
Figure BDA0001684331970000091
Figure BDA0001684331970000101
SEQ ID NO:14是编码来自减毒的G9P[6]轮状病毒的VP3多肽的示例性核酸序列：
Figure BDA0001684331970000111
Figure BDA0001684331970000121
Figure BDA0001684331970000131
SEQ ID NO:15是编码来自减毒的G9P[6]轮状病毒的VP4多肽的示例性核酸序列：
Figure BDA0001684331970000141
SEQ ID NO:16是编码来自减毒的G9P[6]轮状病毒的VP6多肽的示例性核酸序列：
Figure BDA0001684331970000151
SEQ ID NO:17是编码来自减毒的G9P[6]轮状病毒的VP7多肽的示例性核酸序列：
Figure BDA0001684331970000152
Figure BDA0001684331970000161
SEQ ID NO:18是编码来自减毒的G9P[6]轮状病毒的NSP1多肽的示例性核酸序列：
Figure BDA0001684331970000162
SEQ ID NO:19是编码来自减毒的G9P[6]轮状病毒的NSP2多肽的示例性核酸序列：
Figure BDA0001684331970000171
SEQ ID NO:20是编码来自减毒的G9P[6]轮状病毒的NSP3多肽的示例性核酸序列：
Figure BDA0001684331970000181
SEQ ID NO:21是编码来自减毒的G9P[6]轮状病毒的NSP4多肽的示例性核酸序列：
Figure BDA0001684331970000182
SEQ ID NO:22是编码来自减毒的G9P[6]轮状病毒的NSP5多肽的示例性核酸序列：
Figure BDA0001684331970000191
具体实施方式
本文公开了减毒的G9P[6]轮状病毒，其可被包括在用于给予至受试者的药物组合物中。在其他实施方案中，所述药物组合物为疫苗。所述减毒的轮状病毒可诱导免疫反应，和/或预防与来自同一轮状病毒类型(即，G9P[6])和/或另一种轮状病毒类型的轮状病毒感染相关的疾病。在一些实施方案中，所述疫苗可有效诱导针对一种以上类型的轮状病毒的免疫反应。在其他实施方案中，所述疫苗可用于诱导针对DS-1样毒株的同型免疫反应。在更多的实施方案中，所述疫苗可用于诱导针对Wa-1样毒株的异型免疫反应。
所述药物组合物可包括其他组分，如灭活的G1P[8]轮状病毒。所述G1P[8]轮状病毒可为热灭活的轮状病毒。在一些实施方案中，所述药物组合物包括佐剂。
还公开了分离的来自减毒的G9P[6]轮状病毒的核酸和蛋白质。这些组分也可用于药物组合物中。
还公开了用于在受试者中诱导针对轮状病毒的免疫反应的方法。所述受试者可为儿童，例如小于5岁或小于1岁的人。所述免疫反应可以是保护性免疫反应。在一些实施方案中，公开了用于疫苗接种的方法。在一些实施方案中，这些方法可包括至少一次初免和加强免疫。
术语
除非另有说明，技术术语以常规用法使用。分子生物学中的常用术语的定义可见于Benjamin Lewin,genesV,published by Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN0-632-02182-9)；和RobertA.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。为了便于阅读本公开内容的各个实施方案，提供了以下对具体术语的解释：
佐剂：非特异性增强对抗原的免疫反应的物质或载体。佐剂可包括其上吸附有抗原的矿物质(明矾、铝盐、氢氧化铝或磷酸盐)悬液；或其中抗原溶液被乳化在矿物油中的油包水乳剂(例如，弗氏不完全佐剂)，有时包括灭活的分枝杆菌(mycobacteria)(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激寡核苷酸(例如包括CpG基序的那些)也可用作佐剂(例如，参见美国专利6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；和6,429,199)。佐剂还包括生物分子，例如共刺激分子。示例性生物佐剂包括白细胞介素(IL)-2、RANTES、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素(IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、淋巴细胞功能相关抗原-3(LFA-3)、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L和4-1BBL。佐剂可以是铝佐剂，如其铝盐、磷酸铝或氢氧化铝。
给药：给予、施用所述组合物或使其与所述受试者接触。给药可通过许多途径中的任一种来完成，例如，局部、透皮、口服、鼻内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内和鞘内给药。可治疗性地或预防性地给予组合物。预防性给药可在感染(如轮状病毒感染)的症状特征表现出来之前进行。
动物：活的多细胞脊椎动物生物——包括例如哺乳动物和鸟类的种类。
抗原：可在动物中刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物中的组合物。抗原与特定体液或细胞免疫的产物反应。抗原包括，但不限于VP4和VP7。
减毒的：在活病毒的情况下，如果与野生型病毒相比，所述病毒感染细胞或受试者的能力和/或其产生疾病的能力降低(例如，消除)，则其是减毒的。通常，减毒的病毒在给药至免疫活性受试者后至少保持一些引起免疫反应的能力。在一些情况下，减毒的病毒能够引起保护性免疫反应而不引起感染(如轮状病毒感染)的任何征象或症状。在一些实施方案中，相对于野生型病毒，减毒的病毒在受试者中引起疾病的能力降低至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％。因此，“减毒突变”是病毒基因组中的突变和/或导致减毒的病毒的编码多肽。
生物样品：从受试者(例如人类或兽医受试者)获得的样品。示例性生物样品包括流体、细胞和/或组织样品。在本文的一些实施方案中，所述生物样品是流体样品。流体样品包括但不限于血清、血液、血浆、尿液、粪便、唾液、脑脊液(CSF)或其他体液。生物样品还可指细胞或组织样品，如活检样品、组织切片或分离的白细胞。
接触：直接物理性结合的放置；包括固体和液体两种形式。“接触”通常与“暴露”互换使用。在一些情况下，“接触”包括转染，如将核酸分子转染入细胞。在其他实例中，“接触”是指将分子(如抗体)与生物样品孵育。
简并变体：在本公开内容的上下文中，“简并变体”是指编码多肽的多核苷酸，其包含由于遗传密码而导致的简并序列。有20种天然氨基酸，其中大多数由一种以上的密码子指定。因此，只要由核苷酸序列编码的肽的氨基酸序列未改变，就包括编码肽的所有简并核苷酸序列。
检测：使用任何方法在细胞内、细胞上和/或细胞或病毒与其接触的培养基中确定病毒或病毒颗粒(包括病毒肽)的存在。所述方法例如但不限于观察细胞病变效应，检测病毒蛋白(例如通过免疫荧光、ELISA或Western印迹杂交)，检测病毒核酸序列(例如通过PCR、RT-PCR、DNA印迹和RNA印迹、核酸杂交、核酸阵列)等。
腹泻：每天至少有三次松散或液体排便的情况。通常会持续几天，并可能由于液体流失而导致脱水。脱水的征象通常以皮肤的正常拉伸性的丧失和个性的改变开始。这可以会发展为排尿减少、肤色损失、心率加快，并且随着其变得更加严重而反应性下降。最常见的原因是由于病毒、细菌或寄生虫引起的肠道感染——一种称为肠胃炎的病症。腹泻最常见的原因是轮状病毒引起的病毒性肠胃炎，其引起了五岁以下儿童病例的40％。
表达载体：本领域已知的质粒、病毒或其他介质，其中可插入或引入编码所需蛋白的核酸序列。
异源的：异源序列是通常情况下(即在野生型序列中)不存在于第二序列附近的序列。在一个实施方案中，所述序列来自与所述第二序列不同的遗传来源，如不同的病毒或生物体。
宿主细胞：对用外源核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导、接合等敏感的细胞。宿主细胞可以来自哺乳动物、植物、细菌、酵母、真菌、昆虫、动物等。宿主细胞可以来自人或非人灵长类动物。
杂交：寡核苷酸及其类似物通过互补碱基之间的氢键键合(其包括Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键键合)杂交。通常，核酸由为嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))的含氮碱基组成。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤之间形成氢键，并且嘧啶与嘌呤的键合被称为“碱基配对”。更具体地，A将氢键键合至T或U，并且G将键合至C。“互补”是指在两个不同的核酸序列或同一核酸序列的两个不同区域之间发生的碱基配对。
“可特异性杂交”和“特异性互补”是这样的术语，其表示足够程度的互补性以使寡核苷酸(或其类似物)与DNA或RNA靶标之间发生稳定和特异性结合。寡核苷酸或寡核苷酸类似物不需要与其靶序列100％互补以特异性杂交。当寡核苷酸或类似物与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能时，寡核苷酸或类似物是可特异性杂交的，并且存在足够程度的互补性以避免在需要特异性结合的条件下寡核苷酸或类似物与非靶序列的非特异性结合，例如在体内测定或系统情况下的生理条件下。这种结合被称为特异性杂交。
产生特定严格性程度的杂交条件将根据选择的杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(特别是Na+和/或Mg++浓度)将决定杂交的严格性，尽管洗涤时间也影响严格性。在Sambrook et al.(ed.),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989,第9和11章；和Ausubel et al.ShortProtocols in Molecular Biology,第4版,John Wiley&Sons,Inc.,1999中论述了关于获得特定严格性程度所需的杂交条件的计算。
出于本公开内容的目的，“严格条件”涵盖仅在杂交分子与靶序列之间的错配少于25％时才发生杂交的条件。“严格条件”可分为具体的严格性水平以更精确地定义。因此，如本文所使用的，“中等严格性”(moderate stringency)条件是具有超过25％的序列错配的分子不会杂交的条件；“中等严格性”(medium stringency)条件是具有超过15％的错配的分子不会杂交的条件，“高严格性”条件是具有超过10％的错配的序列不会杂交的条件。“非常高严格性”条件是具有超过6％的错配的序列不会杂交的条件。
“特异性杂交”是指当特定的核苷酸序列存在于复杂混合物(例如总细胞DNA或RNA)中时，分子仅或基本上仅与该序列结合、双链化或杂交。特异性杂交也可在不同的严格条件下发生。产生特定严格性程度的杂交条件将根据杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。以下是一组示例性的杂交条件，而非限制性的：
非常高严格性(检测具有至少90％同一性的序列)：
杂交：5x SSC，65℃，16小时
洗涤两次:2x SSC，室温(RT)，每次15分钟
洗涤两次:0.5x SSC，65℃，每次20分钟
高严格性(检测具有至少80％同一性的序列)：
杂交：5x-6x SSC，65℃-70℃，16-20小时
洗涤两次:2x SSC，RT，每次5-20分钟
洗涤两次:1x SSC，55℃-70℃，每次30分钟
低严格性(检测具有至少60％同一性的序列)：
杂交：6x SSC，RT至55℃，16-20小时
洗涤至少两次:2x-3x SSC，RT至55℃，每次20-30分钟
免疫反应：免疫系统的细胞(例如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞)对刺激物(例如轮状病毒抗原或疫苗)的反应。免疫反应可包括参与宿主防御反应的机体的任何细胞，包括例如，分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫反应包括但不限于先天免疫反应或炎症。如本文所使用的，“保护性”免疫反应是指保护受试者免受感染(预防感染或预防与感染相关的疾病的发生)或降低感染效果的免疫反应。
免疫原：在合适的条件下能够刺激针对例如轮状病毒的免疫反应(例如在动物中产生抗体或T细胞反应)的化合物、组合物或物质。免疫原包括注射或吸收到动物中的组合物。本文所使用的“免疫原性组合物”是包含免疫原的组合物。示例性的免疫原包括轮状病毒、轮状病毒多肽或可在细胞中表达的编码轮状病毒多肽的核酸。
免疫：使受试者受到保护免患传染性疾病，例如通过疫苗接种。
分离的：“分离的”生物组分(例如核酸、蛋白质或病毒)已经从其他生物组分(例如细胞碎片，或其他蛋白质或核酸)中基本上分离或纯化。已经被“分离的”生物组分包括那些通过常规纯化方法纯化的组分。术语“分离的”还包括不在其天然环境中的重组的生物组分，例如核酸、蛋白质或病毒，以及化学方法合成的核酸或肽。分离的组合物可以是至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯的。
标签：可检测的部分或任何原子、分子或其部分，其存在、缺失或水平是可直接或间接监测的。各种可检测部分是本领域技术人员公知的，并且可以是通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的任何材料。这类可检测的标签可包括但不限于磁性小珠、荧光染料、放射性标记、酶和比色标签(如胶体金或有色玻璃或塑料小珠)。
哺乳动物：该术语包括人类和非人类哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人类和兽医受试者。
核酸：单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其聚合物。该术语包括单链核苷酸和cDNA的互补物。该术语还包括RNA。除非另有说明，特定的核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子置换)和互补序列，以及明确指定的序列。具体地，简并密码子置换可通过产生其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka et al.，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini et al.，Mol.Cell.Probes8：91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
特定的核苷酸序列可涵盖“剪接变体”，如名称所暗示的，其是基因的可变剪接产物。转录后，可以剪接初始核酸转录物，以使不同的(替代的)核酸剪接产物编码不同的多肽。产生剪接变体的机制不同，但包括外显子的可变剪接。该定义也包括通过通读转录而从同一核酸衍生的替代多肽。剪接反应的任何产物，包括剪接产物的重组形式，都包括在该定义中。多核苷酸通常是线性核苷酸序列，包括长度大于100个核苷酸碱基的序列。
寡核苷酸：短核酸聚合物。寡核苷酸的长度通常小于100个核苷酸。在本文的一些实施方案中，寡核苷酸的长度为8-100、10-50、12-40、16-30或18-24个核苷酸。在具体的实例中，寡核苷酸的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列以有功能的关系放置时，所述第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子可操作地连接于所述编码序列。可操作地连接的DNA序列通常是连续的，并且当需要连接两个蛋白编码区域时则位于同一读码框中。
ORF(开放阅读框)：编码没有任何终止密码子的氨基酸的一系列核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可翻译成肽。
可药用载体：可在本公开内容中使用的可药用载体(carrier或vehicle)是常规的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版,(1975)，记载了适于一种或多种治疗组合物或分子(例如一种或多种轮状疫苗，例如减毒和/或灭活的病毒)以及其他的药剂的药物递送的组合物和制剂。
通常，所述载体的性质会取决于采用的具体给药模式。例如，肠胃外制剂常常包含可注射流体作为载体，所述可注射流体包括可药用和生理上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括，例如药品级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性的载体之外，待给药的药物组合物还可含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
多肽：其中单体为通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当所述氨基酸为α-氨基酸时，可使用L-光学异构体或D-光学异构体。本文所用的术语“多肽”或“蛋白质”意图包括任何氨基酸序列和包括修饰的序列例如糖蛋白。术语“多肽”特别意欲覆盖天然存在的蛋白质，以及重组或合成方法产生的那些。术语“残基”或“氨基酸残基”包括提及整合入蛋白质、多肽或肽中的氨基酸。
保守性氨基酸置换是当进行氨基酸置换时对原始蛋白质的性质有最少干扰的那些置换，即，所述蛋白的结构以及特别是功能是保守的，且没有被这些置换显著改变。保守性置换的实例如下文所示。
Figure BDA0001684331970000261
保守性置换通常保持了(a)在置换区域中多肽骨架的结构，例如，为片层或螺旋构象，(b)在靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链体积。
通常预期在蛋白质性质上产生最大变化的置换是不保守的，例如发生如下改变(a)亲水残基例如丝氨酰基或苏氨酰基置换(或被置换为)疏水残基例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基；(b)半胱氨酸或脯氨酸置换(或被置换为)任何其他残基；(c)具有带正电荷的侧链的残基例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基置换(或被置换为)带负电荷的残基例如谷氨酰基或天冬氨酰基；或(d)具有庞大侧链的残基例如苯丙氨酸置换(或被置换为)没有侧链的残基例如甘氨酸。
预防、治疗或减轻疾病或感染：“预防”疾病是指抑制疾病或感染症状的全面发生。“治疗”是指当疾病已经开始发生后减轻疾病或病理病症(如感染)的征象或症状的治疗干预。“减轻”是指减少疾病征象或症状的数量或严重程度。
探针和引物：探针包含与可检测标签或其他报告分子连接的分离的核酸分子。典型的标签包括放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。例如，在Sambrook et al.(ed.),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989和Ausubel etal.Short Protocols in Molecular Biology,第4版,John Wiley&Sons,Inc.,1999中论述了适合各种目的的标记物的标记和选择指导的方法。
引物是短的核酸分子，例如长度为10个或更多个核苷酸的DNA寡核苷酸，例如与连续的互补核苷酸或待扩增的序列杂交。更长的DNA寡核苷酸的长度可以是约12、15、18、20、25、30或50个或更多个核苷酸。引物可以通过核酸杂交退火到互补的靶DNA链上以在引物和靶DNA链之间形成杂交体，然后引物通过DNA聚合酶沿着靶DNA链延伸。引物对可用于扩增核酸序列，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或本领域已知的其他核酸扩增方法。扩增的其他实例包括链置换扩增，如在美国专利5,744,311中所公开的；无转录等温扩增，如在美国专利6,033,881中所公开的；修复链式反应扩增，如在WO 90/01069中所公开的；连接酶链式反应扩增；空位填充连接酶链式反应扩增，如在5,427,930中所公开的；和NASBATM RNA无转录扩增，如在美国专利6,025,134中所公开的。
制备和使用核酸探针和引物的方法记载于例如Sambrook et al.(ed.),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989；Ausubel et al.Short Protocols inMolecular Biology,第4版,John Wiley&Sons,Inc.,1999；和Innis et al.PCRProtocols,A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.,San Diego,CA,1990。可从已知的序列衍生出扩增引物对，例如通过使用用于该目的的计算机程序例如Primer(版本0.5，
Figure BDA0001684331970000271
1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA)。
启动子：启动子是指导核酸转录的核酸控制序列的阵列。启动子包括在转录起始位点附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II型启动子的情况中的TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或抑制子元件，其可位于距离转录起始位点多达数千个碱基对的位置处。
纯化的：术语“纯化的”不需要绝对的纯净；而是意欲作为相对的概念。因此，例如，纯化的蛋白制品是其中所提及的蛋白比细胞内其自然环境中的蛋白更纯的蛋白制品。例如，蛋白制品被纯化，以使蛋白占制品总蛋白质含量的至少50％。类似地，纯化的寡核苷酸制品是其中寡核苷酸比在包含寡核苷酸的复杂混合物的环境中更纯的寡核苷酸制品。纯化的核酸或蛋白群体为大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯，或分别不含其他核酸或蛋白质。
重组的：重组核酸、蛋白或病毒是具有非天然存在的序列或具有通过人工组合两个原本分开的序列片段而制备的序列的核酸、蛋白或病毒。这种人工组合通常是通过化学合成完成，或者更常见地通过人工操作分离的核酸片段，例如通过基因工程技术来完成。在一些实例中，重组轮状病毒在病毒毒力因子如NS中包含一个或多个缺失。在其他实例中，重组病毒包含异源基因如报告基因。
报告基因：报告基因是与另一个目的基因或核酸序列(如启动子序列)可操作连接的基因。使用报告基因来确定目的基因或核酸是否是在细胞中表达或是否已在细胞中被激活。报告基因通常具有容易识别的特征(例如荧光)或易于测定的产物(例如酶)。报告基因还可以赋予宿主细胞或组织以抗生素抗性。报告基因包括例如标签，如绿色荧光蛋白(GFP或eGFP)或其他荧光基因、萤光素酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。
轮状病毒：双链RNA病毒；轮状病毒的基因组由总共有18,555个核苷酸的11个独特的RNA双螺旋分子组成。每个螺旋或区段是一个基因，通过减小尺寸而被编号为1到11。除了编码两种蛋白的基因11之外，每个基因编码一种蛋白。轮状病毒有8个种，分别称为A、B、C、D、E、F、G和H。人类主要被种A、B、C和H感染，最常见是被种A感染。A-E种在其他动物中引起疾病。轮状病毒A中有不同的毒株，称为血清型。有六种病毒蛋白(VP)形成病毒颗粒(病毒粒子)。这些结构蛋白被称为VP1、VP2、VP3、VP4、VP6和VP7。除了VP之外，还有六种非结构蛋白(NSP)，它们仅在被轮状病毒感染的细胞中产生。这些被称为NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5和NSP6。糖蛋白VP7定义了G血清型，蛋白酶敏感性蛋白VP4定义了P血清型。野生型轮状病毒主要在肠内复制，并感染小肠绒毛的肠细胞，导致上皮的结构和功能改变。两种公知的轮状病毒A原型毒株是Wa(G1-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1)和DS-1(G2-P[4]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2)。轮状病毒A毒株G1P[8]、G3P[8]、G4P[8]和G9P[8]是纯的Wa基因组成员，因为它们具有由基因型1基因组成的Wa样集群(constellation)(Gx-P[x]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1)；G2P[4]是纯的DS-1基因组成员，因为它具有由基因型2基因组成的DS-1样集群(Gx-P[x]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2)。轮状病毒A基因组的分段性使其能够在1细胞中共感染期间进行基因重配，导致出现含有来自≥2种不同亲本毒株的混合区段的子代病毒。然而，一些人轮状病毒G/P型具有纯的Wa样或DS-1样基因组集群。
序列同一性：氨基酸或核酸序列之间的相似性被表示为所述序列之间的相似性，或者称作序列同一性。序列同一性常以同一性(或相似性或同源性)百分数来度量；所述百分数越高，两个序列越相似。当使用标准方法进行比对时，给定基因或蛋白质的同系物或变体具有相对高的序列同一性程度。
比对用于比较的序列的方法在本领域中是公知的。多种程序和比对算法记载于：Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988；Higgins and Sharp,Gene73:237-244,1988；Higgins and Sharp,CABIOS5:151-153,1989；Corpet et al.,Nucleic Acids Research16:10881-10890,1988以及Pearson andLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988。Altschul et al.,Nature Genet.6:119-129,1994。
NCBI基础局部比对搜索工具(BLASTTM)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990)可以从若干来源获得，包括美国国立生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD)和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联合使用。
在本文的一些实施方案中，提供了与SEQ ID NO:1-10中的任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸或氨基酸序列。
受试者：活的多细胞脊椎生物——包括人和非人哺乳动物的种类。
治疗有效量：足以在用该试剂治疗的受试者中达到所需效果的具体试剂的量。例如，这可以是用于在受试者中引起免疫反应和/或用于预防由轮状病毒引起的感染的减毒轮状病毒的量。理想地，在本公开内容的上下文中，减毒轮状病毒的治疗有效量是足以在受试者中增加对轮状病毒引起的感染的抵抗力，预防、减轻和/或治疗所述感染，而不会在所述受试者中产生明显的有害效应的量。用于在受试者中增加对感染的抵抗力，预防、减轻和/或治疗所述感染的减毒轮状病毒的有效量会取决于，例如，被治疗的受试者、治疗组合物的给药方式及其他因素。
疫苗：能够刺激免疫反应的免疫原性材料的制品，其被给药用于预防、减轻或治疗传染性疾病或其他类型的疾病。所述免疫原性材料可包括减毒或灭活的微生物(例如减毒的病毒)，抗原性蛋白、肽或编码抗原性蛋白或肽的DNA。疫苗可引起预防性(prophylactic或preventative)反应和治疗性反应。给药方法根据所述疫苗有所不同，但可包括接种、食入、吸入或其他给药形式。接种可通过许多途径中的任一种递送，包括肠胃外，例如静脉、皮下或肌内。疫苗可与佐剂一起给药以加强免疫反应。
载体：引入到宿主细胞中的核酸分子，由此产生转化的宿主细胞。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点(参与启动DNA合成的DNA序列)。载体还可包含一种或多种选择性标记基因和本领域已知的其他遗传元件。
除非另有说明，本文所用的所有技术术语和科学术语的含义与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。除非上下文中另有明确说明，单数术语“一”、“一个”和“所述”包括复数指代对象。类似地，除非上下文中另有明确说明，词语“或”意欲包括“和”。因此，“包含A或B”意指包括A，或B，或者A和B。还应该理解，对于核酸或多肽给出的全部碱基大小或氨基酸大小以及全部分子量或分子质量值是近似值，并且用于表述目的。虽然与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可以用于实施或测试本公开内容，但适合的方法和材料在下文描述。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以引用的方式全文纳入本文。所有
Figure BDA0001684331970000311
登录号以其于2013年4月19日在数据库中的形式而以引用的方式纳入本文。如果出现冲突，以本说明书(包括对术语的解释)为准。另外，材料、方法和实施例仅是示例性的，而不意欲进行限制。
免疫原性组合物
先前尚未产生或鉴定出减毒形式的G9P[6]轮状病毒。减毒轮状病毒是特别有利的，因为它可用于诱导免疫反应，同时不引起腹泻。这种类型的轮状病毒也是有利的，因为所述免疫反应可针对DS-1样病毒。在一个具体的非限制性实例中，所述减毒的G9P[6]轮状病毒是非天然存在的CDC-6。可以产生包括可用作疫苗的减毒的G9P[6]轮状病毒的组合物，例如以产生对Wa(基因组1)和/或DS-1(基因组2)轮状病毒的免疫反应。
在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒可以被包含在药物组合物中并且可以用于诱导针对轮状病毒的免疫反应。在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒在体外在宿主细胞中增殖时可生长至至少约107至约108的滴度。想到了更高的滴度。
在一些实施方案中，所公开的减毒的G9P[6]轮状病毒可用于诱导针对G9P[6]轮状病毒的免疫反应，例如保护性免疫反应。减毒的G9P[6]轮状病毒可用于诱导针对一种以上类型的轮状病毒(如DS-1样毒株)的免疫反应。在另外的实施方案中，轮状病毒可用于诱导针对至少一种G9P[6]轮状病毒和至少一种G1P[8]轮状病毒的免疫反应。在其他实施方案中，轮状病毒可用于至少诱导针对G2P[4]轮状病毒和G1P[8]轮状病毒的免疫反应。
轮状病毒包括编码VP1、VP2、VP3、VP4、NSP1、NSP1、NSP3、NSP5和NSP4多肽的11个RNA区段(核酸分子)。这些蛋白的功能和活性结构域在本领域中是已知的，参见例如PrasadBV,Chiu W(1994),Curr.Top.Microbiol.Immunol.185:9–29；Patton JT(1995)Gen.Virol.76(11):2633–44；和Pesavento et al.,(2006),Curr.Top.Microbiol.Immunol.309:189–219，所有文献均以引用的方式纳入本文。在具体的非限制性实例中，减毒轮状病毒。应注意的是，在本上下文中，对于任何G9P[6]多肽或多核苷酸，同一性百分数的“约”表示在0.05％内。
在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒包括编码VP1多肽的核酸分子，所述多肽包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少约99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括编码包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VP1多肽的核酸序列。在另外的实施方案中，轮状病毒包含VP1核酸序列，其与SEQ IDNO:12所示的核酸序列至少约99.7％相同，至少约99.8％相同或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括SEQ ID NO:12所示的核酸序列。在其他实施方案中，轮状病毒包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少约99.8％相同、或至少约99.9％相同的VP1多肽。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VP1多肽。
在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒包括编码包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VP2多肽的核酸分子。在另外的实施方案中，轮状病毒包含VP2核酸序列，其与SEQ ID NO:13所示的核酸序列至少约99.5％相同、至少约99.6％相同、至少约99.7％相同、至少约99.8％相同、或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括SEQ ID NO:13所示的核酸序列。在其他实施方案中，轮状病毒包括含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VP2多肽。
在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒包括编码VP3多肽的核酸分子，所述VP3多肽包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括编码包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的VP3多肽的核酸序列。在另外的实施方案中，轮状病毒包含VP3核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO:14所示的核酸序列至少约99.4％相同、约99.5％相同、约99.6％相同、约99.7％相同、至少约99.8％相同或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括SEQ ID NO:14所示的核酸序列。在其他实施方案中，轮状病毒包括与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列至少约99.6％相同、约99.7％相同、约99.8％相同、或至少约99.9％相同的VP3多肽。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括VP3多肽，所述VP3多肽包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒包括编码VP4多肽的核酸分子，所述多肽VP4包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少约99.1％相同、至少约99.2％相同、至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、至少约99.5％相同、至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同、或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括编码包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的VP4多肽的核酸序列。在另外的实施方案中，轮状病毒包含VP4核酸序列，所述VP4核酸序列与SEQ ID NO:15所示的核酸序列至少约99.2％相同、至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、约99.5％相同、约99.6％相同、约99.7％相同、至少约99.8％相同、或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括SEQ ID NO:15所示的核酸序列。在其他实施方案中，轮状病毒包括VP4多肽，所述VP4多肽与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少约99.1％相同、至少约99.2％相同、至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、至少约99.5％相同、至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的VP4多肽。
在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒包括编码VP6多肽的核酸分子，所述VP6多肽包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，轮状病毒包含VP6核酸序列，所述VP6核酸序列与SEQ ID NO:16所示的核酸序列至少约99.7％相同、至少约99.8％相同、或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例、实施方案中，轮状病毒包括SEQID NO:16所示的核酸序列。在其他实施方案中，轮状病毒包括含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的VP6多肽。
在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒包括编码VP7多肽的核酸分子，所述VP7多肽包含与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列至少约98.9％相同、至少约99.0％相同、至少约99.1％相同、至少约99.2％相同、至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、至少约99.5％相同、至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括编码包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的VP7多肽的核酸序列。在另外的实施方案中，轮状病毒包含VP7核酸序列，所述VP7核酸序列与SEQ ID NO:17所示的核酸序列至少约99.4％相同、约99.5％相同、约99.6％相同、约99.7％相同、至少约99.8％相同或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括SEQ ID NO:17所示的核酸序列。在其他实施方案中，轮状病毒包括VP7多肽，所述VP7多肽与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列至少约98.9％相同、至少约99.0％相同、至少约99.1％相同、至少约99.2％相同、至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、至少约99.5％相同、至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同、或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括VP7多肽，所述VP7多肽包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒包括编码NSP1多肽的核酸分子，所述NSP1多肽包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列至少约98.9％相同、至少约99.0％相同、至少约99.1％相同、至少约99.2％相同、至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、至少约99.5％相同、至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同、或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括编码NSP1多肽的核酸序列，所述NSP1多肽包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，轮状病毒包括NSP1核酸序列，所述NSP1核酸序列与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列至少约99.2％相同、至少99.3％相同、至少99.4％相同、约99.5％相同、约99.6％相同、约99.7％相同、至少约99.8％相同、或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括SEQ ID NO:18所示的核酸序列。在其他实施方案中，轮状病毒包括NSP1多肽，所述NSP1多肽与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列至少约98.9％相同、至少约99.0％相同、至少约99.1％相同、至少约99.2％相同、至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、至少约99.5％相同、至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括含有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的NSP1多肽。
在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒包括编码包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的NSP2多肽的核酸分子。在另外的实施方案中，轮状病毒包括NSP2核酸序列，所述NSP2核酸序列与SEQ ID NO:19所示的核酸序列至少约99.8％相同或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括SEQ ID NO:19所示的核酸序列。在其他实施方案中，轮状病毒包括含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的NSP2多肽。
在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒包括编码NSP3多肽的核酸分子，所述NSP3多肽包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少约99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括编码包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的NSP3多肽的核酸序列。在另外的实施方案中，轮状病毒包含NSP3核酸序列，所述NSP3核酸序列与SEQ ID NO:20所示的核酸序列至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、至少约99.5％相同、至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括SEQ ID NO:20所示的核酸序列。在其他实施方案中，轮状病毒包括与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少约99.8％相同或至少约99.9％相同的NSP3多肽。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的NSP3多肽。
在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒包括编码包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的NSP4多肽的核酸分子。在其他实施方案中，轮状病毒包含NSP4核酸序列，所述NSP4核酸序列与SEQ ID NO:21所示的核酸序列至少约99.2％相同、至少99.3％相同、至少99.4％相同、约99.5％相同、约99.6％相同、约99.7％相同、至少约99.8％相同、或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括SEQ ID NO:21所示的核酸序列。在其他实施方案中，轮状病毒包括NSP4多肽，其包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒包括编码NSP5多肽的核酸分子，所述NSP5多肽包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括编码包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的NSP5多肽的核酸序列。在另外的实施方案中，轮状病毒包括NSP5核酸序列，所述NSP5核酸序列与SEQ ID NO:22所示的核酸序列至少约99.6％相同、约99.7％相同、至少约99.8％相同或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括SEQ ID NO:22所示的核酸序列。在其他实施方案中，轮状病毒包括NSP5多肽，所述NSP5多肽与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约99.6％相同、约99.7％相同、约99.8％相同或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例中，轮状病毒包括NSP5多肽，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒包括a)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(VP1)至少99.8％相同的氨基酸序列；b)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(VP2)；c)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列(VP3)至少99.6％相同的氨基酸序列；d)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列(VP4)至少99.1％相同的氨基酸序列；e)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列(VP6)；f)编码多肽的核酸分子。所述多肽包含与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列(VP7)至少98.9％相同的氨基酸序列；h)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(NSP1)至少98.9％相同的氨基酸序列；i)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQID NO:8所示的氨基酸序列(NSP2)；j)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列(NSP3)至少98.8％相同的氨基酸序列；k)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列(NSP4)；和l)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列(NSP5)至少99.6％相同的氨基酸序列。该轮状病毒可包括包含以下中的1个、2个、3个、4个或全部：a)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列(VP1)；b)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列(VP4)；c)编码多肽的核酸，所述多肽包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列(VP7)；d)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(NSP1)；和e)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列(NSP3)。
在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒包括a)编码包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(VP1)的多肽的核酸分子；b)编码包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(VP2)的多肽的核酸分子；c)编码包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列(VP3)的多肽的核酸分子；d)编码包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列(VP4)的多肽的核酸分子；e)编码包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列(VP6)的多肽的核酸分子；f)编码包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列(VP7)的多肽的核酸分子；h)编码包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(NSP1)的多肽的核酸分子；i)编码包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(NSP2)的多肽的核酸分子；j)编码包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列(NSP3)的多肽的核酸分子；k)编码包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列(NSP4)的多肽的核酸分子；和l)编码包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列(NSP5)的多肽的核酸分子。
在其他实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒包括a)包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(VP1)的多肽；b)包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(VP2)的多肽；c)包含SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列(VP3)的多肽；d)包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列(VP4)的多肽；e)包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列(VP6)的多肽；f)包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列(VP7)的多肽；h)包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(NSP1)的多肽；i)包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(NSP2)的多肽；j)包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列(NSP3)的多肽；k)包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列(NSP4)的多肽；和l)包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列(NSP5)的多肽。
所公开的轮状病毒通常包括核酸分子，例如编码轮状病毒蛋白的RNA。在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒是CDC-6。
与减毒的G9P[6]轮状病毒一起使用的合适药物载体包括本领域中已知的适合于口服给药(特别是给药至小于五岁或小于一岁的儿童)的那些。这类载体包括但不限于碳水化合物、多元醇、氨基酸、氢氧化铝、氢氧化镁、羟基磷灰石、滑石、氧化钛、氢氧化铁、硬脂酸镁、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、明胶、植物蛋白胨、黄原胶、鹿角菜胶(caraghenane)、阿拉伯树胶、β-环糊精。还提供了通过在合适的稳定剂存在下冷冻干燥病毒而制备的疫苗。药物组合物可被配制用于全身给药或局部给药。在一个实施方案中，药物组合物被配制用于口服给药。任选地，可包括佐剂。佐剂可以是铝佐剂，例如铝盐、磷酸铝或氢氧化铝。佐剂可以是生物分子，例如免疫刺激核酸或细胞因子。以上公开了合适的佐剂。
在一些实施方案中，减毒的G9P[6]轮状病毒也可是灭活的，例如通过热灭活，用于热灭活的方法公开在例如PCT公开WO2009/032913中，其以引用的方式纳入本文。
药物组合物和疫苗还可包含其他化合物，其可以是有生物活性的或无生物活性的。例如，其他抗原的一个或多个免疫原性部分可以(以纳入到融合多肽的形式或作为单独的化合物的形式)存在于所述组合物或疫苗中。在一些实施方案中，可以包括额外的轮状病毒，例如但不限于活的或灭活的G1P[8]轮状病毒，例如热灭活的G1P[8]轮状病毒。如上所述，例如在PCT公开WO2009/032913中公开了用于热灭活的方法。在一些实施方案中，本发明的减毒的G9P[6]轮状病毒与
Figure BDA0001684331970000381
或
Figure BDA0001684331970000382
组合。在另外的实施方案中，本发明的减毒的G9P[6]轮状病毒与CDC-9或其变体组合，参见PCT公开WO 2010/132561，其以引用的方式纳入本文。G1P[8]轮状病毒(如CDC-9)可以是减毒的和/或失活的。这些药物组合物通常可用于预防和治疗目的。这些药物组合物可被配制用于口服或肠胃外给药。
灭活的减毒轮状病毒也可被包含在药物组合物中以诱导对其他病原体的反应，如白喉、破伤风、百日咳、b型流感嗜血杆菌、乙型肝炎(HBV)，脊髓灰质炎和/或肺炎球菌疾病。因此，可将其与DTaP、Hib、乙型肝炎、脊髓灰质炎和/或PCV-13一起使用，例如多价疫苗VIS。在一些实施方案中，可将所公开的减毒的G9P[6]轮状病毒与IPV组合作为二价疫苗或与五价(DT、全细胞百日咳、Hib、乙型肝炎病毒(HBV))组合作为六价疫苗。任选地，组合物中也可包括灭活的G1P[8]轮状病毒，例如但不限于CDC-9。G1P[8]轮状病毒可以是减毒的和/或灭活的。在一些实施方案中，这些药物组合物可以用于预防目的。
灭活的减毒的G9P[6]轮状病毒可被配制在基于脂质的载体(如病毒体或脂质体)中，配制在水包油乳剂中或与载体颗粒一起配制。可选地或另外地，免疫刺激剂(例如本领域已知的用于口服疫苗的那些)可以被包含在所述制剂中。这类免疫刺激剂包括细菌毒素，特别是以全毒素(整个分子)形式或仅B链(CTB)形式的霍乱毒素(CT)和大肠杆菌的不耐热肠毒素(LT)。相比于天然LT，突变LT(mLT)转化为它们的活性形式的可能性更小，参见PCT公开WO96/06627，PCT公开WO 93/13202和美国专利5,182,109。可配制这些组合物用于在有或没有佐剂的情况下进行肠胃外递送。
在一些实施方案中，可包括皂苷衍生物，例如QS21和单磷酰脂质A，特别是3-脱-O-酰化的单磷酰脂质A(3D-MPL)。在PCT公开WO98/56415中公开了用作口服佐剂的纯化皂苷。可使用皂苷和单磷酰脂质A，参见PCT公开WO 94/00153，并且可将其与其他药剂一起配制在佐剂系统中。3D-MPL是由Ribi Immunochem(Montana)制备的公知的佐剂，其制备记载于GB2122204中。载体和佐剂也在Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach,edited by Powell and Newman,Plenum Press,New York,1995中公开。这些组合物可被配制用于肠胃外递送。
对于口服制剂，减毒的G9P[6]轮状病毒可以与抗酸剂一起配制，以最小化胃中酸对疫苗的灭活。合适的抗酸剂组分包括无机抗酸剂，例如氢氧化铝Al(OH)3和氢氧化镁Mg(OH)2。适合使用的市售抗酸剂包括氢氧化铝和氢氧化镁，它们不溶于水但可以悬液形式提供。氢氧化铝也可用作佐剂。有机酸羧酸盐也可被包含在组合物中。非限制性的实例是柠檬酸的盐，如柠檬酸钠或柠檬酸钾。在一个非限制性的实例中，可使用不溶性无机盐，碳酸钙(CaCO3)。碳酸钙能够与轮状病毒缔合并维持活性。另外，可包括碳酸氢钠。
在一些实施方案中，为了防止填充步骤期间碳酸钙的沉降，粘稠剂适合存在于所述制剂中。粘稠剂包括假塑性赋形剂。假塑性溶液被定义为与在搅拌下的其粘度相比，静置时粘度较高的溶液。这种类型的赋形剂是天然聚合物，如阿拉伯树胶、黄耆树胶、琼脂、藻酸盐、果胶或半合成聚合物，例如：羧甲基纤维素
Figure BDA0001684331970000401
甲基纤维素(
Figure BDA0001684331970000402
和
Figure BDA0001684331970000403
)、羟丙基纤维素
Figure BDA0001684331970000404
和羟丙基甲基纤维素(METHOCELS
Figure BDA0001684331970000405
和
Figure BDA0001684331970000406
VISCONTRANS
Figure BDA0001684331970000407
)。通常，所述假塑性赋形剂与触变剂一起使用。
可被使用的替代的粘稠剂是具有低流动能力的假塑性赋形剂。足够浓度的那些聚合物产生了结构流体布置，导致在静置时具有低流动能力的高粘度溶液。需要给系统一定数量的能量以允许流动和转移。为了获得流体溶液，可能需要搅拌来暂时破坏结构流体布置。这类聚合物的实例是
Figure BDA0001684331970000408
和黄原胶。
触变性赋形剂在静置时变成凝胶结构，而在搅拌下形成流体溶液。触变赋形剂的实例是
Figure BDA0001684331970000409
(硅酸镁铝)和AVICEL
Figure BDA00016843319700004010
(约89％微晶纤维素和11％羧甲基纤维素钠)。
在一些实施方案中，所述药物组合物包括选自黄原胶或淀粉的粘稠剂。所述组合物可包括碳酸钙和黄原胶的组合。
其他组分包括糖例如蔗糖和/或乳糖。所述组合物可包括其他组分，包括例如调味剂(特别是用于口服疫苗)和抑菌剂。
在一个合适的实施方案中，所述药物组合物作为液体制剂给药。适当地，所述液体制剂在给药之前从至少以下两种组分重构：i)病毒组分ii)液体组分。在该实施方案中，所述病毒组分和液体组分通常存在于分开的容器(其可便利地为单个容器的分开的隔室)中，或分开的容器中(其连接方式使最终的疫苗组合物被重构而不会暴露于空气中)。
在重构之前，病毒可以是干燥形式或液体形式。适当地，病毒组分是冻干的。冻干的病毒可比水溶液中的病毒更稳定。可使用液体抗酸组合物以适当方法重构冻干的病毒以产生液体疫苗制剂。或者，可用水或水溶液重构冻干的病毒，在这种情况下，冻干的病毒组合物可含有抗酸组分。在一些实施方案中，将病毒组分用碳酸钙和黄原胶在一个隔室或容器中配制，并且用存在于第二隔室或容器中的水或水溶液重构该病毒组分。在另一个实施方案中，所述组合物是固体制剂，适当地为放入口中时适于立即溶解的冻干块。
冻干制剂可便利地以药物泡罩包装中的片剂形式提供。减毒的G9P[6]轮状病毒可以快速溶解片剂的形式提供以用于口服给药。因此，所述组合物可包含活的减毒轮状病毒毒株，特别是减毒的G9P[6]轮状病毒毒株，其中所述组合物是放入口中时能够立即溶解的冻干固体。轮状病毒可以快速溶解的片剂形式提供，所述片剂能足够快地溶解于受试者口中以防止吞咽未溶解的片剂。这种方法对于小儿轮状病毒疫苗特别有利。
因此，适用于口服给药的制剂可包括或由以下组分组成：(a)液体溶液，例如悬浮在稀释剂(如水、盐水或PEG 400)中的有效量；(b)胶囊、小药囊或片剂，它们各自含有预定量的活性成分(作为液体、固体、颗粒或明胶形式)；(c)适当的液体中的悬液；和(d)合适的乳剂。片剂形式可包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药物相容性载体。糖锭(lozenge)形式可包括在调味料(如蔗糖)中的活性成分，以及包括在惰性基质中的活性成分的锭剂(pastille)，所述惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶乳剂、凝胶等，其除活性成分外还含有本领域已知的载体。
气雾剂制剂(即，它们可以被“气雾化”)是通过吸入给药。气雾剂制剂可被置于加压的可接受的推进剂(例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等)中。
适于肠胃外给药(例如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、皮内、腹膜内和皮下途径)的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射溶液(其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使所述制剂与目的受体血液等渗的溶质)，以及可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬液。组合物可例如通过静脉内输注、吸入、肠胃外、口服、局部、皮内、腹膜内、静脉内、膀胱内、直肠或鞘内给药。所述制剂可以单位剂量或多剂量密封的容器(如安瓿和小瓶)提供。可药用的载体部分地是由所给予的特定组合物(例如，核酸、蛋白质、调节化合物或经转导的细胞)，以及由用于给予所述组合物的特定方法来确定。因此，存在本发明药物组合物的多种合适制剂(参见，例如Remington's PharmaceuticalSciences,第17版,1989)。
对于任何途径的给药，所述组合物可包括缓冲剂(例如，中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质或氨基酸(如甘氨酸)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(如EDTA或谷胱甘肽)、佐剂(如氢氧化铝)、使所述制剂相对于受体血液等渗、低渗或弱高渗的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。或者，本发明的组合物可被配制成冻干物。
注射溶液和悬液可以从之前描述的那种无菌粉末、颗粒和片剂来制备。所公开的组合物可经肠胃外给药。
给药至受试者的剂量应足以影响受试者的有益免疫反应。剂量将由所使用的具体组合物的功效和受试者的状态，以及待治疗的受试者的体重或体表面积来确定。剂量的大小也将通过在特定的患者中给予特定载体或经转导的细胞类型时相伴随的任何不良副作用的存在、特性和程度来确定。可以通过单次或分次剂量完成给药。
免疫原性组合物(如疫苗)可通过已知技术配制和给药，使用适量的活病毒以提供有效的抗轮状病毒感染的保护，而没有典型疫苗中的显著的不良副作用。适量的活病毒可以在104至108个斑点形成单位(focus forming unit,ffu)之间，例如104至107/剂量之间。典型的疫苗剂量可包含105-106个ffu/剂量，并且可以在一段时间内以几次剂量给予，例如给予间隔两个月的两次剂量。因此，所述组合物可以初免-加强免疫策略给予。然而，可通过给予2次以上的剂量(例如3或4剂量方案)获益，特别是在发展中国家。剂量之间的间隔的长度可多于或少于两个月。可通过包括观察受试者中的抗体滴度和其他反应的标准研究来确定用于单剂量组合物或多剂量试剂盒的活病毒的最佳量以及所述剂量的最佳时机。
用于诱导免疫反应的方法
本文公开了用于诱导针对轮状病毒的免疫反应的方法。该方法包括给予本文公开的药物组合物。免疫原性组合物的给药可用于预防性或治疗性目的。当预防性提供时，所述免疫原性组合物在任何症状出现前提供，例如在感染轮状病毒前提供。免疫原性组合物的预防性给药用于预防或减轻任何后续感染。因此，可以在预期暴露于轮状病毒之前提供免疫原性组合物，以在暴露或怀疑暴露于病毒后或在感染真正开始后，减轻感染和/或相关疾病症状的预期严重程度、持续时间或程度。因此，所述方法可诱导保护性免疫反应。在一些实施方案中，治疗有效量可减少或消除随后暴露于轮状病毒导致的症状，例如腹泻。
例如，由于暴露或可能暴露于轮状病毒，可选择具有或处于发生轮状病毒感染的风险的受试者。在给予所公开的免疫原后，可监测受试者的轮状病毒感染或与其相关的症状，或两者。
当治疗性提供时，所述免疫原性组合物在疾病或感染症状发作时或之后提供，例如在轮状病毒感染症状出现后、或在诊断轮状病毒感染后。所公开的免疫原性组合物的治疗有效量是这样的量：由临床医生或其他合格观察者所注意到的，提供症状的主观缓解或客观可识别的改善的量。
所述受试者可以是任何目的受试者，例如人类或兽医受试者。在一些实施方案中，受试者不具有轮状病毒感染，例如健康受试者。在一些非限制性的实例中，受试者是人类，例如人类儿童。人类儿童可小于5岁，例如小于一岁。在一些非限制性的实例中，疫苗接种可发生在出生时，约1至2月龄、约4月龄、约6月龄、约6月至18月龄、12至15月龄。在一些实施方案中，在六月龄之前给予两至三个剂量。任选地，也在6至18月龄之间给予一次或多次加强剂量。因此，考虑到了对儿童(婴儿)进行多次给药。
如上所述可使用任何给药途径。在具体的非限制性实例中，所述药物组合物是通过肠胃外或口服给药。
在具体的实施方案中，所述组合物包含至少两种轮状病毒毒株。所述两种或更多种轮状病毒菌株各自独立地具有G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13或G14G血清型。因此，例如，至少一种CDC-6与至少一种具有G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13或G14G血清型的第二人轮状病毒株一起存在于组合物中。在具体的实施方案中，包括在组合物中的至少两种轮状病毒毒株中的每一株均具有为P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6、P8、P11或P12的P血清型。在组合物的具体实施方案中，用于增强受试者中针对轮状病毒介导的疾病的免疫保护的组合物包括特征在于具有G9血清型的第一人轮状病毒毒株和特征在于具有G1血清型的第二人轮状病毒毒株。两种轮状病毒毒株中的每一株独立地具有P组血清型，其中G9病毒具有P6血清型并且另一轮状病毒可以是P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6、P8、P11或P12血清型。
在一些实施方案中，也向受试者给予减毒或灭活的G1P[8]轮状病毒。在一些实施方案中，将本发明的减毒的G9P[6]轮状病毒与
Figure BDA0001684331970000441
或CDC-9或CDC-66轮状病毒(参见，PCT公开WO 2010/132561，其以引用的方式纳入本文)同时或按顺序给予。提供了包括本文公开的减毒的G9P[6]轮状病毒，以及CDC-9或CDC-66中的至少一种的药物组合物。任选地，减毒的G9P[6]轮状病毒也是灭活的。G9P[6]轮状病毒可以是CDC-6。这些组合物可被配制用于口服或肠胃外给药。例如，在所公开的美国专利2012/0121629(其以引用的方式纳入本文)中公开了CDC-9和CDC-66。
对活的减毒轮状病毒或灭活的轮状病毒的选择取决于诸如疫苗组合物给药的途径的因素。在一个具体的实施方案中，所述组合物包括人轮状病毒A毒株CDC-9和/或CDC-66，一种或多种轮状病毒A CDC-9、和/或CDC-66多肽和/或一种或多种轮状病毒A CDC-9的免疫原性片段、和/或CDC-66多肽的免疫原性片段。在一些实施方案中，包括灭活的CDC-9和灭活的G9P[6]，并且该组合物被配制用于肠胃外给药。该组合物可包括佐剂。在一个具体的非限制性实例中，G9P[6]轮状病毒是CDC-6。
给药诱导足够的免疫反应以治疗或预防病原体感染，例如以抑制感染和/或减少轮状病毒的征象和/或症状(如腹泻)。有效用于该用途的量取决于疾病的严重程度、受试者健康的一般状态以及受试者免疫系统的稳健性。
对于预防和治疗目的，可将免疫原性组合物通过以下方式给予受试者：以单次推注递送、通过在延长的时间段内的连续递送(例如，连续透皮、粘膜或静脉内递送)或在重复给药方案中(例如，通过每小时、每日或每周的重复给药方案)。免疫原性组合物的治疗有效剂量可以在延长的预防或治疗方案内作为重复剂量提供，所述延长的预防或治疗方案将产生临床上显著的结果以减轻与轮状病毒感染相关的一种或多种症状或可检测的病症。在这种情况下有效剂量的确定通常是基于动物模型研究和随后的人类临床试验，并且由给药方案指导，所述给药方案显著降低受试者中被靶向的疾病症状或病症的发生或严重程度。在这一点上，合适的模型包括例如鼠、大鼠、猪、猫、雪貂、非人灵长类动物和本领域已知的其他公认的动物模型受试者。或者，可使用体外模型(例如免疫学和组织病理学测定)确定有效剂量。使用这样的模型，仅需要普通的计算和调整来确定合适的浓度和剂量以给药治疗有效量的免疫原性组合物(例如，有效引起所需的免疫反应或缓解所靶向的疾病的一种或多种症状的量)。在可选的实施方案中，免疫原性组合物的有效量或有效剂量可抑制或增强一种或多种所选的生物活性。
在一个实施方案中，合适的免疫方案包括用一种或多种免疫原性组合物进行至少两次或三次单独接种，第二次接种是在第一次接种后约两周、约三至八周或约四周以上，或在第一次接种后约2、约4、约6、约8、约10或约12个月以上给予。可以在第二次接种数月后，例如一至两个月后给予第三次接种，并且在具体的实施方式中，在第一次接种约五个月以上后，在第一次接种约六个月至约两年以上后，或在第一次接种约八个月至约一年以上后给予第三次接种。超过第三次的定期接种也可用于增强受试者的“免疫记忆”。这些接种可被给予至大龄儿童或成人。
所选择的疫苗接种参数(例如制剂、剂量、方案等)的适当性(adequacy)可通过从受试者获取血清的等分试样并在免疫程序过程中测定抗体滴度来确定。如果这种监测表明疫苗接种是次优的，则可以用额外剂量的免疫原性组合物来对受试者进行加强免疫，并且可以预期增强免疫反应的方式修改所述疫苗接种参数。想到了可以有几次加强免疫。
对于初免-加强免疫方案，初免可以单剂量或多剂量形式给药，例如可以在数天、数周或数月内向受试者给药两剂量、三剂量、四剂量、五剂量、六剂量或更多剂量。加强免疫可以单剂量或多剂量形式给药，例如2-6剂量、或更多剂量可在一天、一周或数月内给药至受试者。也可给予多次(例如1至5或更多次)加强免疫。不同的剂量可用于一系列连续疫苗接种中。例如，在初次接种中使用相对较大的剂量，然后使用相对较小的剂量进行加强。可通过用本文公开的免疫原性组合物对受试者进行一次或多次接种来产生针对所选的抗原表面的免疫反应。
在一些实施方案中，给药导致交叉保护。交叉保护可以是同型或异型的。同型交叉保护是轮状病毒毒株针对G或P型毒株提供的保护，例如通过P[6]型提供针对非G9、P[6]毒株(例如G2P[6])的交叉保护的G9P[6]毒株。同型交叉保护的另一个实例是G9P[6]毒株通过G1型提供的针对G9非P[6]毒株(例如G9P[4])的保护。异型交叉保护是轮状病毒毒株提供的针对不同P型和G型轮状病毒毒株的保护，例如由G9P[6]提供的针对非G9-非P[6]-毒株(例如G1P[8])的保护(通过G和P型提供的异型保护)。在一些实施方案中，减毒的轮状病毒血清型是G9并且能够提供针对由G9和非G9轮状病毒血清型(例如选自G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G10、G11、G12、G13和G14的血清型)引起的疾病的交叉保护。在另外的实施方案中，轮状病毒减毒毒株的类型是P[6]并且能够提供针对由P[6]轮状病毒类型和非P[6]轮状病毒类型(例如选自P[1]、P[2]、P[3]、P[4]、P[5]、P[7]、P[8]、P[9]、P[10]、P[11]、P[12]、P[14]和P[19]的类型)引起的疾病的交叉保护。
例如，可通过针对药物组合物的中和抗体反应或通过血清轮状病毒IgA抗体反应(例如血清转化因子)(即，疫苗接种后血清抗体IgA水平增加23倍，如Ward et al.,1990,J.Infect.Disease,161,440-445中所记载的)来测量免疫。在大多数情况下，评估获自受试者的血清或血浆中的抗体滴度已足够。关于是否给予加强接种和/或是否改变给药至个体的治疗剂的量的决定可至少部分地基于抗体滴度水平。
有效剂量的确定通常是基于动物模型研究和随后的人类临床试验，并且由给药方案指导，所述给药方案显著降低受试者中被靶向的疾病症状或病症的发生或严重程度，或在受试者中诱导所需反应(如中和免疫反应)。在这一点上，合适的模型包括，例如，小鼠、猪、非人灵长类动物和本领域已知的其他公认的动物模型受试者(见下文)。使用这样的模型，仅需要普通的计算和调整来确定合适浓度和剂量以给药治疗有效量的组合物(例如，有效引起所需的免疫反应或缓解一种或多种症状的量)。
本文公开了用于诱导针对一种以上病原体的免疫反应的方法。在一些实施方案中，可将额外的轮状病毒包括在药物组合物中。所述额外的轮状病毒可以是但不限于活的或灭活的G1P[8]轮状病毒，如热灭活的G1P[8]轮状病毒。如上文所注意到的，例如在PCT公开WO2009/032913中公开了用于热失活的方法。在一些实施方案中，将本发明的减毒的G9P[6]轮状病毒与
Figure BDA0001684331970000471
或
Figure BDA0001684331970000472
组合并用于在受试者中诱导免疫反应。在另外的实施方案中，将本发明的减毒的G9P[6]轮状病毒与CDC-9或其变体组合(参见PCT公开WO2010/132561，其以引用的方式纳入本文)，并用于在受试者中诱导免疫反应。G1P[8]轮状病毒(例如CDC-9)可以是减毒的和/或灭活的，并被给药至受试者。这些药物组合物通常可用于预防和治疗目的。在一些实施方案中，将所述组合物经口服或肠胃外给药至受试者。
灭活的减毒轮状病毒也可被包括在药物组合物中并用于诱导针对不同病原体(如白喉、破伤风、百日咳、B型流感嗜血杆菌、乙型肝炎(HBV)、脊髓灰质炎和/或肺炎球菌疾病)的反应。因此，可将其与DTaP、Hib、乙型肝炎、脊髓灰质炎和/或PCV-13一起给药，例如多价疫苗VIS。在一些实施方案中，可将所公开的减毒的G9P[6]轮状病毒与IPV组合作为二价疫苗或与五价(DT、无细胞或全细胞百日咳、Hib、乙型肝炎病毒(HBV))组合作为六价疫苗，并用于在受试者中诱导免疫反应。任选地，灭活的G1P[8]轮状病毒(例如，但不限于CDC-9)也可被包括在组合物中并被给药至受试者。G1P[8]轮状病毒可以是减毒的和/或灭活的。在一些实施方案中，多价疫苗包括五价疫苗(DT、无细胞或全细胞百日咳、Hib、乙型肝炎病毒(HBV))、G1P[8]轮状病毒和G9P[6]轮状病毒如CDC-6。在其他实施方案中，多价疫苗包括五价疫苗(DT、无细胞或全细胞百日咳、Hib、乙型肝炎病毒(HBV))、CDC-9和/或CDC66和G9P[6]轮状病毒如CDC-6。在一些实施方案中，这些药物组合物可用于预防目的。在一些实施方案中，将所述组合物经口服或肠胃外给药至受试者。
核酸分子和多肽
本文还提供了分离的核酸分子和多肽。这些分离的核酸分子和多肽也可被包括在药物组合物中并用于以上公开的方法中。一种或多种多肽或一种或多种多核苷酸可被包括在药物组合物中。
在一些实施方案中，提供了VP1多肽，其包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少约99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述VP1多肽包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或由其组成。在其他实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或由其组成的VP2多肽。在其他实施方案中，提供了VP3多肽，其包括与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列至少约99.6％相同、约99.7％相同、约99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述VP3多肽包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或由其组成。在其他实施方案中，提供了VP4多肽，其包括与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少约99.1％相同、至少约99.2％相同、至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、至少约99.5％相同、至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同或至少约99.9％的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述VP4多肽包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或由其组成。在其他实施方案中，提供了VP6多肽，其包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或由其组成。在其他实施方案中，提供了VP7多肽，其包括与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列至少约98.9％相同、至少约99.0％相同、至少约99.1％相同、至少约99.2％相同、至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、至少约99.5％相同、至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述VP7多肽包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或由其组成。这些多肽或其免疫原性片段中的一种或多种可被包括在药物组合物中。在一个具体的非限制性实例中，所述组合物包括VP4、VP7或VP4和VP7二者。还提供了在SEQ ID NO:1-6所示的氨基酸序列中包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性氨基酸置换的多肽。
在其他实施方案中，提供了NSP1多肽，其包括与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列至少约98.9％相同、至少约99.0％相同、至少约99.1％相同、至少约99.2％相同、至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、至少约99.5％相同、至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述NSP1多肽包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或由其组成。在其他实施方案中，提供了NSP2多肽，其包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或由其组成。在其他实施方案中，提供了NSP3多肽，其包括与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少约99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列或由其组成。在一个具体的非限制性实例中，所述NSP3多肽包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或由其组成。在其他实施方案中，提供了NSP4多肽，其包括SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或由其组成。在其他实施方案中，提供了NSP5多肽，其包括与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约99.6％相同、约99.7％相同、约99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述VP3多肽包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或由其组成。还提供了在SEQ ID NO:7-11所示的氨基酸序列中包括至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性氨基酸置换的多肽。
这些多肽或其片段中的一个或多个可包括在药物组合物中。
在一些实施方案中，公开了编码VP1多肽的核酸分子，所述VP1多肽包含与SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列至少约99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述核酸分子编码包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VP1多肽。在另外的实施方案中，所述核酸分子与SEQ ID NO:12所示的核酸序列至少约99.7％相同、至少约99.8％相同、或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例中，所述核酸分子包括SEQ ID NO:12所示的核酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，公开了编码VP2多肽的核酸分子，所述VP2多肽包含SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述核酸分子与SEQ ID NO:13所示的核酸序列至少约99.5％相同、至少约99.6％相同、至少约99.7％相同、至少约99.8％相同、或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例、实施方案中，所述核酸分子包括SEQ ID NO:13所示的核酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，公开了编码VP3多肽的核酸分子，所述VP3多肽包括与SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述核酸分子包括编码VP3多肽的核酸序列，所述VP3多肽包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述核酸序列与SEQ ID NO:14所示的核酸序列至少约99.4％相同、约99.5％相同、约99.6％相同、约99.7％相同、至少约99.8％相同或至少约99.9％相同。在一个具体的非限制性实例，所述核酸分子包括SEQ ID NO:14所示的核酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，公开了编码VP4多肽的核酸分子，所述VP4多肽包含与SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列至少约99.1％相同、至少约99.2％相同、至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、至少约99.5％相同、至少约99.5％相同、至少约99.7％相同、至少约99.7％相同、至少约99.8％相同、或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的的非限制性实例中，所述核酸分子包括编码VP4多肽的核酸序列，所述VP4多肽包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述核酸分子包括与SEQ ID NO:15所示的核酸序列至少约99.2％相同、至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、约99.5％相同、约99.6％相同、约99.7％相同、至少约99.8％相同或至少约99.9％相同的核酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述核酸分子包括SEQ ID NO:15所示的核酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，公开了编码VP6多肽的核酸分子，所述VP6多肽包含SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述核酸分子包含与SEQ ID NO:16所示的核酸序列至少约99.7％相同、至少约99.8％相同、或至少约99.9％相同的核酸序列。在一个具体的非限制性实例、实施方案中，所述轮状病毒包括SEQ ID NO:16所示的核酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，公开了编码VP7多肽的核酸分子，所述VP7多肽包含与SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列至少约98.9％相同、至少约99.0％相同、至少约99.1％相同、至少约99.2％相同、至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、至少约99.5％相同、至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述核酸分子编码VP7多肽，所述VP7多肽包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，核酸分子包括与SEQ ID NO:17所示的核酸序列至少约99.4％相同、约99.5％相同、约99.6％相同、约99.7％相同、至少约99.8％相同或至少约99.9％相同的核酸序列。在一个具体的非限制实例中，所述核酸分子包括SEQ ID NO:17所示的核酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，公开了编码NSP1多肽的核酸分子，所述NSP1多肽包含与SEQID NO:7所示的氨基酸序列至少约98.9％相同、至少约99.0％相同、至少约99.1％相同、至少约99.2％相同、至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、至少约99.5％相同、至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述核酸分子包括编码NSP1多肽的核酸序列，所述NSP1多肽包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述核酸分子包括与SEQ ID NO:18所示的核酸序列至少约99.2％相同、至少99.3％相同、至少99.4％相同、约99.5％相同、约99.6％相同、约99.7％相同、至少约99.8％相同或至少约99.9％相同的核酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述核酸分子包括SEQ ID NO:18所示的核酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，公开了编码NSP2多肽的核酸分子，所述NSP2多肽包含SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述核酸分子包括与SEQ ID NO:19所示的核酸序列至少约99.8％相同、或至少约99.9％相同的NSP2核酸序列。在一个具体的非限制性实例、实施方案中，所述核酸分子包括SEQ ID NO:19所示的核酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，公开了编码NSP3多肽的核酸分子，所述NSP3多肽包含与SEQID NO:9所示的氨基酸序列(NSP3)至少约99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述核酸分子包括编码NSP3多肽的核酸序列，所述NSP3多肽包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述核酸分子包括与SEQ IDNO:20所示的核酸序列至少约99.3％相同、至少约99.4％相同、至少约99.5％相同、至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同或至少约99.9％相同的核酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述核酸分子包括SEQ ID NO:20所示的核酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，公开了编码NSP4多肽的核酸分子，所述NSP4多肽包含SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述核酸分子包含与SEQ ID NO:21所述的核酸分子至少约99.2％相同、至少99.3％相同、至少99.4％相同、至少约99.5％相同、至少99.6％相同、至少约99.7％相同、至少99.8％相同、或至少99.9％相同的核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:21所示的核酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，公开了编码NSP5多肽的核酸分子，其包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约99.6％相同、至少99.7％相同、至少99.8％相同或至少约99.9％相同的氨基酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述核酸分子包括编码NSP5多肽的核酸序列，所述NSP5多肽包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述核酸分子包括与SEQ ID NO:22所示的核酸序列至少约99.6％相同、约99.7％相同、至少约99.8％相同或至少约99.9％相同的NSP5核酸序列。在一个具体的非限制性实例中，所述轮状病毒包括SEQ ID NO:22所示的核酸序列或由其组成。
这些多核苷酸中的一种或多种，或包含这些核酸分子(例如DNA或RNA)中的一种或多种的载体可被包括在药物组合物中。在具体的非限制性实例中，所述组合物中的多核苷酸编码VP4、VP7或VP4和VP7二者。
本公开内容提供了包含本文公开的任一核酸分子，或编码本文公开的蛋白和肽的载体，并且其可用于转化细胞。所述载体可以是任何适合的载体，如质粒载体或病毒载体。在一些实施方案中，所述载体包含启动子、复制起点和/或选择性标记物。所述载体也可编码报告分子。在一些实例中，所述载体的核酸分子可操作地连接于启动子。示例性的启动子包括病毒启动子，如巨细胞病毒即刻早期基因启动子(“CMV”)、单纯疱疹病毒胸苷激酶(“tk”)、SV40早期转录单位、多瘤病毒、逆转录病毒、乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒以及人类和猿类免疫缺陷病毒。其他启动子分离自哺乳动物基因，包括免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链、T细胞受体、HLA DQα和DQβ、β-干扰素、白细胞介素-2、白细胞介素-2受体、MHC II类、HLA-DRα、β-肌动蛋白、肌肉肌酸激酶、前清蛋白(甲状腺素运载蛋白)、弹性蛋白酶I、金属硫蛋白、胶原酶、白蛋白、胎儿球蛋白、β-珠蛋白、c-fos、c-HA-ras、胰岛素、神经细胞粘附分子(NCAM)、a1-抗胰蛋白酶、H2B(TH2B)组蛋白、I型胶原、葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)、大鼠生长激素、人血清淀粉样蛋白A(SAA)、肌钙蛋白I(TNI)、血小板源生长因子、和肌养蛋白、树突状细胞特异性启动子如CD11c、巨噬细胞特异性启动子如CD68、朗氏细胞特异性启动子如Langerin，以及特异性针对角质细胞以及皮肤和肺的上皮细胞的启动子。
在一些实施方案中，所述启动子是诱导型的。诱导型启动子是除了存在诱导物的情况以外为失活的或显示出低活性的启动子。诱导型启动子的实例包括，但不限于，MT II、MMTV、胶原酶、基质溶素、SV40、鼠Mx基因、α-巨球蛋白、MHC I类基因h-2kb、HSP70、多育曲菌素(proliferin)、肿瘤坏死因子，或促甲状腺激素基因启动子。在其他实施方案中，所述启动子是组成型启动子，当其在缺乏其他因子的情况下被引入宿主细胞时导致高水平的转录。任选地，所述转录控制序列包括一个或多个增强元件，其为一个或多个转录因子的结合识别位点，所述转录因子将转录增加至超过在单独的最小启动子时所观察到的转录。
可能需要包括多聚腺苷酸化信号以实现基因转录物的合适的终止和多聚腺苷酸化。示例性的多聚腺苷酸化信号已经分离自牛生长激素、SV40和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。这些或其他多聚腺苷酸化信号中的任一种均可用在本文所述的腺病毒载体的上下文中。
所述载体可以是，例如，病毒载体。许多病毒载体已经被构建，包括多瘤病毒，SV40(Madzak et al.,1992,J.Gen.Virol.,73:15331536)，腺病毒(Berkner,1992,Cur.Top.Microbiol.Immunol.,158:39-6；Berliner et al.,1988,Bio Techniques,6:616-629；Gorziglia et al.,1992,J.Virol.,66:4407-4412；Quantin et al.,1992,Proc.Nad.Acad.Sci.USA,89:2581-2584；Rosenfeld et al.,1992,Cell,68:143-155；Wilkinson et al.,1992,Nucl.Acids Res.,20:2233-2239；Stratford-Perricaudet etal.,1990,Hum.Gene Ther.,1:241-256)，痘苗病毒(Mackett et al.,1992,Biotechnology,24:495-499)，腺伴随病毒(Muzyczka,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:91-123；On et al.,1990,Gene,89:279-282)，疱疹病毒，包括HSV和EBV(Margolskee,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:67-90；Johnsonet al.,1992,J.Virol.,66:29522965；Fink et al.,1992,Hum.Gene Ther.3:11-19；Breakfield et al.,1987,Mol.Neurobiol.,1:337-371；Fresse et al.,1990,Biochem.Pharmacol.,40:2189-2199)，辛德毕斯病毒(H.Herweijer et al.,1995,HumanGene Therapy 6:1161-1167；美国专利5,091,309和5,2217,879)，α病毒(S.Schlesinger,1993,Trends Biotechnol.11:18-22；I.Frolov et al.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11371-11377)以及禽类的逆转录病毒(Brandyopadhyay et al.,1984,Mol.CellBiol.,4:749-754；Petropouplos et al.,1992,J.Virol.,66:3391-3397)，鼠科动物(Miller,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:1-24；Miller et al.,1985,Mol.CellBiol.,5:431-437；Sorge et al.,1984,Mol.Cell Biol.,4:1730-1737；Mann et al.,1985,J.Virol.,54:401-407)，以及人类来源(Page et al.,1990,J.Virol.,64:5370-5276；Buchschalcher et al.,1992,J.Virol.,66:2731-2739)。杆状病毒(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multinuclear polyhedrosis virus)；AcMNPV)载体也是本领域已知的，并且可以从商业来源获得(例如PharMingen,San Diego,Calif.；Protein Sciences Corp.,Meriden,Conn.；Stratagene,La Jolla,Calif.)。
还提供了包括这些载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。适合的宿主细胞的非限制性实例包括细菌、古细菌、昆虫、真菌(例如酵母)、植物和动物细胞(例如，哺乳动物细胞，如人类)。所使用的示例性的细胞包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、SF9细胞、C129细胞、293细胞、脉孢菌(Neurospora)和永生化的哺乳动物骨髓和淋巴细胞系。用于培养中的哺乳动物细胞的繁殖的技术是公知的(参见Jakoby and Pastan(主编),1979,Cell Culture.Methods in Enzymology,第58卷,Academic Press,Inc.,Harcourt Brace Jovanovich,N.Y.)。常用的哺乳动物宿主细胞系的实例为Vero细胞和Hela细胞、CHO细胞和WI38、BHK和COS细胞系，但是可使用细胞系，例如被设计用于提供较高表达所需要的糖基化模式或其他特征的细胞。转化酵母细胞的技术(如聚乙二醇转化、原生质体转化和基因枪)也是本领域已知的(参见Gietz and WoodsMethods in Enzymology350:87-96,2002)。
使用重组DNA转化宿主细胞可通过本技术领域技术人员公知的常规技术进行。当宿主是原核的(例如但不限于，大肠杆菌)时，能够摄取DNA的感受态细胞可从以下细胞制备：在对数生长期后收集的，随后使用本领域公知的步骤通过CaCl2方法处理的细胞。或者，可使用MgCl2或RbCl。也可(如果需要的话)在形成宿主细胞原生质体以后，或通过电穿孔进行转化。当宿主是真核生物时，可使用如磷酸钙共沉淀这样的DNA转染方法、传统的机械方法(如显微注射、电穿孔、包裹在脂质体的质粒或病毒载体的插入)。
当例如从重宿主细胞中纯化重组蛋白时，可使用许多方法。例如，具有已建立的分子粘附特性的蛋白可被可逆地融合至所述蛋白。使用适当的配体或底物，特定蛋白可被选择性地吸附到纯化柱上，然后以相对纯的形式从该柱子上释放。然后可通过酶活性除去融合的蛋白。最后，可以使用免疫亲和柱纯化蛋白。可从任何合适的来源(包括酵母、昆虫、细菌和哺乳动物细胞)中纯化重组蛋白。
重组蛋白可从重组核酸中(例如从质粒中)表达，并通过大量的转化细菌来纯化，通常在启动子诱导后；但表达可以是组成型的。使用IPTG进行的启动子诱导是诱导型启动子系统的一个实例。根据本领域的标准方法使细胞生长。新鲜或冷冻的细菌细胞用于蛋白的分离。
在细菌中表达的蛋白质可形成不溶性聚集体(“包涵体”)。几种方案适用于蛋白包涵体的纯化。例如，包涵体的纯化通常包括通过破坏细菌细胞(例如，通过在50mM Tris/HClpH7.5、50mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT、0.1mM ATP和1mM PMSF的缓冲剂中孵育)来提取、分离和/或纯化包涵体。细胞悬液可以通过弗氏细胞压碎器(French Press)使用2-3个通道来裂解，使用均化器(例如Polytron(Brinkman Instruments))均化或在冰上超声。裂解细菌的其他方法对本领域技术人员而言是显而易见的(参见，例如Sambrooke et al.,见上文；Ausubel et al.,见上文)。
如果有必要的话，将包涵体溶解，并且通常将经裂解的细胞悬液离心以除去不想要的不溶物。形成包涵体的蛋白可以通过使用相容性缓冲剂进行稀释或透析来复性。适合的溶剂包括，但不限于尿素(约4M到约8M)，甲酰胺(至少约80％，以体积/体积计)，以及盐酸胍(约4M到约8M)。能够溶解形成聚集体的蛋白的一些溶剂(例如SDS(十二烷基硫酸钠)、70％甲酸)不适用于该方法，因为存在蛋白的不可逆变性的可能性，并伴有免疫原性和/或活性的缺乏。虽然盐酸胍和类似的溶剂是变性剂，但这种变性是可逆的并且在去除(例如通过透析)或稀释所述变性剂时可发生复性，允许重新形成具有免疫学和/或生物学活性的蛋白。其他合适的缓冲剂是本领域技术人员已知的。人类蛋白可通过标准分离技术(例如使用Ni-NTA琼脂糖树脂)从其他细菌蛋白中分离。
或者，可从细菌周质中纯化重组蛋白。在细菌裂解后，除了本领域技术人员已知的其他方法以外还可通过冷渗透休克法来分离细菌的周质级分。为了从周质中分离重组蛋白，离心细菌细胞以形成沉淀。将所述沉淀在含20％蔗糖的缓冲剂中重悬。为了裂解细胞，将细菌离心并将所述沉淀重悬在冰冷的5mM MgSO4中重悬并保持在冰浴中大约10分钟。将细胞悬液离心，弃去上清液并存储。可通过本领域技术人员公知的标准分离技术从宿主蛋白中分离上清液中存在的重组蛋白。
溶解度分级分离可用作纯化蛋白的标准蛋白分离技术。作为初始步骤，特别是如果蛋白质混合物是复杂的，初始盐分级分离可从目的重组蛋白中分离许多不需要的宿主细胞蛋白(或来源于细胞培养基的蛋白质)。优选的盐是硫酸铵。硫酸铵通过有效地减少蛋白混合物中的水的量来沉淀蛋白。然后蛋白基于其溶解度发生沉淀。蛋白越疏水，越可能在较低的硫酸铵浓度下沉淀。常规的方案包括将饱和的硫酸铵加入到蛋白溶液中，以使所得的硫酸铵浓度介于20-30％之间。该浓度将沉淀大多数疏水蛋白。然后弃去沉淀(除非目的蛋白质是疏水的)，向上清液中加入硫酸铵至已知会沉淀目的蛋白的浓度。然后将沉淀溶解在缓冲剂中，如果需要的话通过透析或渗滤来去除过量的盐。依赖于蛋白溶解度的其他方法(如冷乙醇沉淀)是本领域技术人员公知的，并可用于分级分离复杂的蛋白混合物。
使用超滤方法，穿过具有不同孔径的膜(例如，Amicon或Millipore膜)，可利用蛋白质的分子量将其从更大和更小尺寸的蛋白质中分离出来。作为第一步，使用具有比目的蛋白的分子量低的分子量截留值的孔径的膜超滤蛋白混合物。然后将超滤残留液再次对膜超滤，所述膜的分子截留值大于目的蛋白的分子量。所述重组蛋白将穿过膜进入滤液中。然后可如下所述对所述滤液进行层析。
可使用柱层析法根据蛋白的大小、表面净电荷、疏水性和对于配体或底物的亲和力将其从其他蛋白中分离。此外，针对蛋白所产生的抗体可被缀合至柱基质，然后免疫纯化所述蛋白。所有这些方法都是本领域中公知的。对于技术人员来说，可以任何规模并使用来自很多不同的制造商的设备(例如Pharmacia Biotech)来进行层析技术是显而易见的。
所公开的多肽、多核苷酸和重组体中的任一种可用于免疫原性组合物中以引起免疫反应，例如以提供针对轮状病毒感染的保护。因此，可预防性或治疗性地使用本文公开的组合物。所述组合物可用于在健康的受试者或感染轮状病毒的受试者中产生免疫反应。所述免疫原性组合物任选地包括佐剂。所公开的多肽或多核苷酸可包括在药物组合物中，例如以上所公开的那些。
还提供了通过向受试者给药治疗有效量的所公开的多肽、或编码该多肽的核酸分子、或本文公开的免疫原性组合物以在受试者中引起针对轮状病毒的免疫反应的方法。在一些实施方案中，所述受试者被预防性地给药重组多肽、多肽或免疫原性组合物以预防轮状病毒感染。在其他情况下，所公开的组合物可用于治疗已存在的轮状病毒感染。上文公开了给药免疫原性组合物的方法。
本文所公开的编码G9P[6]多肽的核酸疫苗可用于引起免疫反应以治疗或预防轮状病毒感染。多种基因递送技术是本领域中公知的，例如由Rolland(1998)Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems 15:143-198和其中引用的参考文献中所述的那些。适当的核酸表达系统包括用于在患者中表达的必需DNA序列(如合适的启动子和终止信号)。在一个优选的实施方案中，可使用病毒表达系统(例如，痘苗病毒、痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入DNA，这可涉及使用非致病性的(缺陷型)、复制型病毒。合适的系统公开于，例如，Fisher-Hoch et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:317-321；Flexner et al.(1989)Ann.N.Y.Acad.Sci.569:86-103；Flexner et al.(1990)Vaccine 8:17-21；美国专利4,603,112、4,769,330、4,777,127和5,017,487；PCT公开WO89/01973；英国公开2,200,651；欧洲公开0,345,242；PCT公开WO91/02805；Berkner(1988)Biotechniques6:616-627；Rosenfeld et al.(1991)Science 252:431-434；Kolls et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:215-219；Kass-Eisler et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11498-11502；Guzman et al.(1993)Circulation88:2838-2848和Guzman et al.(1993)Cir.Res.73:1202-1207中。将DNA纳入这样的表达系统中的技术是本领域技术人员公知的。所述DNA也可以是“裸露的”，例如在Ulmer et al.(1993)Science 259:1745-1749中描述以及由Cohen(1993)Science 259:1691-1692综述的。裸露的DNA的摄取可通过将DNA包被在可生物降解小珠上来增加，所述小珠可被有效地运输到细胞中。很明显，疫苗可包括多核苷酸和多肽组分。这种疫苗可提供增强的免疫应答。
疫苗制备通常记载在例如Powell and Newman,eds.,Vaccine Design(thesubunit and adjuvant approach)，Plenum Press(NY，1996)中。疫苗可被设计以产生抗体免疫和/或细胞免疫，例如由CTL或CD4+T细胞产生的。
非特异性免疫应答增强剂可以是增强对外源抗原的免疫应答的任何物质。非特异性免疫应答的增强剂的实例包括佐剂、可生物降解的微球体(例如，聚乳酸(polylacticgalactide))以及脂质体(化合物被纳入至其中，参见，例如，美国专利4,235,877)。大多数佐剂含有被设计用于保护抗原免受快速分解代谢的物质(如氢氧化铝或矿物油)，以及免疫应答刺激物(如脂质A，百日咳杆菌(Bortadella pertussis)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)源性蛋白)。合适的佐剂可以以下形式购得例如，弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,MI)；Merck佐剂65(Merck andCompany,Inc.,Rahway,NJ)；AS-2(SmithKline Beecham)；铝盐例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙盐、铁盐或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈(polyphosphazene)；可生物降解的微球体；单磷酰脂质A和植物皂甙A(quil A)。细胞因子，如GM-CSF或白细胞介素-2、-7或-12，也可用作佐剂。这些可用于诱导免疫反应，并可被包括在所公开的组合物中。
通过以下非限制性实施例来举例说明本公开内容。
实施例
目前获得许可的单价人轮状病毒疫苗
Figure BDA0001684331970000591
(G1P[8])已在全世界的儿童中显示出广泛的针对同型Wa样和异型DS-1样毒株的交叉反应免疫和交叉保护。然而，在一些地区，这种疫苗似乎对DS-1样毒株赋予较低的功效——一个持续的关于是否需要第二毒株来提供针对所有毒株的全面保护的问题。然而，DS-1样毒株通常在细胞培养中需要复杂营养进行生长(fastidious growth)，使得难以开发低成本疫苗。此外，最近的数据——一些接受轮状病毒疫苗的具有某些组织-血型抗原(Lewis阴性)的婴儿仍然对P6轮状病毒毒株敏感，表明具有P6特异性的疫苗可能具有额外的价值。本文公开了称为CDC-6的G9P[6]毒株及其用于诱导免疫反应的用途。
实施例1
分离和表征
在良好实验室规范(Good Laboratory Practice)条件下，通过连续传代和噬菌斑纯化从收集自美国婴儿的粪便样本中分离出G9P[6]毒株——称为CDC-6。使用Illumina(新一代测序格式)对病毒基因组进行测序。使用CLC Genomic Workbench 7分析Illumina数据。使用RotaC v2.0在线工具进行全基因分型。用Mega 5.1软件使用邻接法(1000个引导)和Kimura-2校正生成系统发生树。
与大多数人轮状病毒不同，CDC-6可在Vero细胞中生长至107-108ffu/ml的滴度并表现出强的稳定性，如在上游生产和下游纯化过程中的主要(>90％)的三层颗粒所证明的。CDC-6毒株显示出短的RNA电泳型。全基因组分析表明其基因型集群为G9-P[6]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2，其中9个基因(I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2)类似于DS-1样人轮状病毒。CDC-6VP4基因与在1996年收集的来自美国的毒株US1205(G9P[6])的VP4基因相似(99.22％)。CDC-6VP7基因与在1999-2000年收集的来自美国的G9毒株KC268密切相关(99.25％)以及与在1998-1999年收集的来自南非的毒株密切相关(98.87-99.25％)，所述毒株与谱系III中的循环G9毒株聚类(cluster)，但与谱系I(WI61和F45)或谱系II(116E)毒株不同。CDC-6毒株具有良好的病毒学特征和分子特征，并可用作新的口服的活或灭活的轮状病毒疫苗。
实施例2
适应和传代
按照美国公开专利申请2015/0079122(其以引用的方式纳入本文)中所公开的，对病毒进行传代。简言之，在1.7mL无菌的低结合管中在1毫升(mL)的在DMEM中的10％病毒悬液中补加新霉素，充分混合，然后在Eppendorf微量离心机中以3,000rpm离心10分钟(min)。将上清液转移到新管中，并以10,000rpm(8,000×g)离心10分钟。将澄清的上清液通过0.45微米孔径过滤器进行灭菌。通过EIA(Rotaclone；Meridian Biosciences)测试上清液，如果OD值>1.0，则在用于感染之前将其储存在4℃。粪便提取和Rotaclone测试可在感染前一天完成。
将培养基从单个滚管(roller tube)中的细胞单层中除去。每个滚管用2mL维持培养基洗涤，然后将2mL维持培养基加入到每个管中，并在滚动装置中于37℃孵育直至病毒接种物准备好。
将0.5mL上清液的等分试样转移到无菌管中，并加入1微升CaCl2储液(300克/升)以使终浓度为800微克/毫升。将管在室温下孵育30分钟，然后加入3微升猪胰蛋白酶储液(2.5毫克/毫升)-终浓度为15微克/毫升。将混合物在37℃下孵育60分钟。以相同的方式处理相同体积MEM，作为模拟接种物。使用单独的移液枪头移液病毒悬液和胰蛋白酶溶液。在生物安全柜内完成对病毒的所有移液。
从每个滚管中去除培养基，并使用单独的无菌移液管将0.2至0.3毫升的胰蛋白酶化的病毒悬液或模拟接种物加入到每个滚管中。将盖拧紧并将管在位于培养箱中的滚管装置上于37℃下进行孵育。孵育2小时(hr)后，使用1mL移液管去除接种物并用2mL维持培养基温和洗涤。
将2毫升的含有各种浓度胰蛋白酶(10、20或30微克/mL，取决于毒株)的维持培养基添加到每个管中，并在位于培养箱中的滚管装置上于37℃下孵育2小时。
每天观察细胞的细胞病变效应(CPE)，在第4天收获并储存在-70℃。在下一次传代之前将细胞冻融两次。
如上所述将经冻融的细胞裂解物用CaCl2和胰蛋白酶处理，随后如上所述进行传代。使细胞进行至少一次冻融并通过Rotaclone试剂盒测定轮状病毒抗原，或通过FFA测定确定病毒滴度。
实施例3
轮状病毒毒株的产生和纯化
通过使用大规模生产滚瓶来实现轮状病毒的生产(参见美国公开专利申请2015/0079122，其以引用的方式纳入本文)。简言之，将Vero细胞培养在补充有5％胎牛血清(Invitrogen Corp.，Grand Island，NY)和50微克/毫升新霉素(Sigma Corp.，St.Louis，MO)的Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)中。将滚瓶中Vero细胞的汇合单层用感染复数为0.1的特定轮状病毒毒株感染。
将通过大规模生产获得的轮状病毒根据本领域已知的程序进行纯化。简言之，在感染后四天从感染的Vero细胞培养物中收获轮状病毒。通过使用SW32Ti转子以106,750×g离心穿过TNC缓冲液中的40％蔗糖垫(持续2小时)，然后使用SW32Ti转子以111,160g在CsCl梯度中等密度离心17小时，从上清液中纯化三层轮状病毒颗粒。轮状病毒颗粒也可使用蔗糖梯度纯化。TNC缓冲液是10mM Tris、pH8.0、140mM NaCl和10mM CaCl2。将纯化的轮状病毒颗粒重悬于稀释缓冲液中，所述缓冲液是含有CaCl2和MgCl2的Hanks平衡盐溶液，其获自Invitrogen Corp.,Grand Island,N.Y.，补充有10％山梨糖醇(Sigma Corp.，St.Louis，MO)。将重悬的分离的轮状病毒储存在-70℃下直至其失活并被给药至受试者。
通过多种技术中的任一种来分析纯化的轮状病毒的纯度和类型，所述技术示例性地包括SDS-PAGE及随后的考马斯蓝染色、使用轮状病毒特异性抗体的蛋白质印迹和/或电子显微镜。另外，通过鉴定特定的结构病毒蛋白来获得纯化的轮状病毒毒株的纯度和类型。
实施例4
灭活的轮状病毒(IRV)的免疫原性
在小鼠模型中测试轮状病毒毒株的免疫原性。将不含佐剂的纯化的灭活轮状病毒颗粒通过肌内给药至小鼠。使用含量在2至20微克范围内的灭活轮状病毒蛋白免疫动物。
通过测量在给药后不同时间获得的血液样品中的免疫球蛋白(包括IgM、IgA和IgG)滴度来测定免疫原性。通过如Jiang,B.,Vaccine,17:1005-1013,1999(其以引用的方式纳入本文)中所详细描述的微量中和测定法测量中和抗体滴度。简言之，将小鼠血清在两个孔中连续稀释两倍并与胰蛋白酶灭活的RRV轮状病毒一起孵育。将活化的轮状病毒或经类似处理的无血清MEM培养基在不存在小鼠血清的情况下孵育并分别用作阳性和阴性对照。将补充有终浓度为10微克/毫升的胰蛋白酶和0.5％鸡血清的MEM培养基中的MA104细胞(获自Invitrogen Corp.,Grand Island,N.Y.)加入到每个孔中。在37℃下孵育18小时后，将细胞用福尔马林固定。通过用兔抗RRV超免疫血清、用HRP标记的抗兔IgG、然后用四甲基联苯胺孵育细胞来检测MA104细胞中的轮状病毒抗原。血清中的中和抗体滴度被定义为使与病毒对照相比吸光度值降低70％的最高稀释度的倒数。
将注射有灭活的纯化轮状病毒颗粒的小鼠中的抗体滴度与对照小鼠中的抗体滴度进行比较。对照小鼠中的抗体滴度通常小于100。将小鼠通过肌内(i.m.)疫苗接种两次，并且通过EIA测定轮状病毒特异性总抗体(IgA、IgG和IgM)和中和抗体。对于总抗体，以1：100的初始稀释度对每个血清样本进行测试。在这种稀释度下，前采血的血清样本没有可检测的抗体。使用数值20来确定几何平均滴度和进行说明。以1:20的初始稀释度测试中和抗体。抗体滴度被表示为每个组的几何平均值(n＝7或6)。误差条代表1个标准误差。
实施例5
佐剂
在其他实施例中，将Al(OH)3作为佐剂添加到给药至小鼠的疫苗中的轮状病毒颗粒中。在存在或不存在600微克Al(OH)3的情况下，用2微克或0.2微克灭活的纯化轮状病毒颗粒通过肌内免疫动物一次。在所给药的两种轮状病毒浓度下，Al(OH)3都显著增强了小鼠中的总抗体滴度。在用600微克Al(OH)3免疫的对照小鼠中未检测到抗体滴度(小于100倍稀释)。
实施例6
悉生小猪模型(gnotobiotic piglet model)
使用轮状病毒疾病的悉生小猪模型。这种小猪模型使得能够在确定的条件下进行测试，避免了动物暴露于环境的问题，并使得能够使用疾病作为结果变量。该模型还使得能够测试具有针对同型Wa攻击的G1血清型的灭活轮状病毒疫苗。悉生小猪是用于人轮状病毒株感染和疾病的良好动物模型(参见Saif L J,et al.,Archives of Virology,1996；12:S153-61；和Iosef C,et al.,Vaccine,2002；20:1741-53，两者都以引用的方式纳入本文)。如在美国公开专利申请2015/0079122中所公开的(其以引用的方式纳入本文)，设计本研究。
如下表所示，选择13只婴儿悉生小猪，并随机分配到四组。
Figure BDA0001684331970000631
将每组动物保持在单独隔离装置中。将BB组和CC组中的动物分别用不含或含有佐剂的灭活轮状病毒疫苗通过肌内疫苗接种3次。本实施例中的疫苗制剂包含5微克在稀释液(混合有600微克氢氧化铝)中的灭活的纯化CDC-6轮状病毒。以相同方式分别用600微克氢氧化铝和缓冲液接种AA组和DD组中的动物。通过Bradford方法来确定抗原吸附，其显示90％以上的抗原与氢氧化铝结合。在这些免疫接种中注入结合和未结合的抗原。
如上表所示，用疫苗制剂免疫小猪，所述疫苗制剂如下：不含抗原但包括600微克氢氧化铝、包括5微克抗原但不含氢氧化铝、包括5微克抗原和600微克氢氧化铝、或不含抗原且不含氢氧化铝(例如单独的缓冲液)。通过将0.5毫升疫苗制剂注射到小猪后腿肌肉中来进行每次疫苗接种。以10-12天的间隔给药三剂量疫苗制剂后，用有毒力的轮状病毒通过口服攻击小猪。在病毒攻击前，将每只小猪用3毫升碳酸氢钠接种以中和胃酸。每天从经攻击的小猪中收集粪便样本，持续10天。在整个实验期间以7-14天的间隔收集血液样品。仅用氢氧化铝或仅用稀释剂缓冲液进行模拟疫苗接种的小猪全部都以高的滴度脱落轮状病毒最长达5天。相比之下，用不含氢氧化铝和/或含有氢氧化铝的灭活的轮状病毒接种的小猪受到保护，如通过完全保护、缩短的1-天脱落或延迟且减少的脱落所证明的。用抗原接种的小猪产生显著水平的血清IgG。所述结果证明了疫苗制剂的有效性。
鉴于本发明的原理可应用于许多可能的实施方案，应认识到，所举例说明的实施方案只是本发明的实例，不应被认为是对本发明范围的限制。相反，本发明的范围是由以下的权利要求书限定。因此，本申请人要求保护落入这些权利要求的范围和主旨的所有发明。
序列表
<110> THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the
Secretary, Department of Health and Human Services
Jiang, Baoming
Wang, Yuhaun
<120> 人轮状病毒G9P[6]毒株和作为疫苗的用途
<130> 4239-95859-02
<150> 62/237,452
<151> 2015-10-05
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1088
<212> PRT
<213> 轮状病毒 G9(Rotavirus G9)
<400> 1
Met Gly Lys Tyr Asn Leu Ile Leu Ser Glu Tyr Leu Ser Phe Ile Tyr
1 5 10 15
Asn Ser Gln Ser Ala Val Gln Ile Pro Ile Tyr Tyr Ser Ser Asn Ser
20 25 30
Glu Leu Glu Ser Arg Cys Ile Glu Phe His Ser Lys Cys Leu Glu Asn
35 40 45
Ser Lys Asn Gly Leu Ser Leu Lys Lys Leu Phe Asn Glu Tyr Ser Asp
50 55 60
Val Ile Glu Asn Ala Thr Leu Leu Ser Ile Leu Ser Tyr Ser Tyr Asp
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Val Met Phe Trp Leu Glu Lys His Glu Asn Asp Thr Ala Glu Lys Phe
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<213> 轮状病毒 G9(Rotavirus G9)
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Ile Ile Tyr Arg Phe Leu Leu Leu Ile Val Ile Ala Ser Pro Phe Val
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Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Thr Glu Ala Ser Thr Gln Ile Gly Asp Thr
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<213> 轮状病毒 G9(Rotavirus G9)
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acaattaacg tcagttacat cattatgtat gcttattgga aatgcgactg ttataccaag 1800
tccacaaaca ttatttcatt attataacgt taacgttaat tttcattcaa attacaatga 1860
gagaattaat gatgcagtag ctataataac tgctgctaac agactgaatc tatatcagaa 1920
aaaaatgaag gctattgttg aggatttctt aaaaagatta tacatttttg atgtatctag 1980
agttccggac gaccaaatgt atagattaag ggatagatta cgcttattgc cagtagaaat 2040
cagaagattg gatatcttca atctaatact aatgaacatg gatcaaattg aacgtgcctc 2100
agataaaatt gctcaaggtg taatcattgc ttatcgtgac atgcatcttg aaagagatga 2160
gatgtacgga tatgtaaata tagctagaaa tttagaggga tttcaacaga taaatttaga 2220
ggagctgatg agatcaggtg actatgcgca aataactaac atgcttttga ataatcaacc 2280
agtagcattg gttggagcac ttccatttat tactgattca tcagttatat cgctaatagc 2340
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<213> 轮状病毒 G9(Rotavirus G9)
<400> 14
ggcttttaaa gcaatatcag tagtgtgttt tacctctgat ggtgtaaata tgaaagtatt 60
agctttaaga catagtgtgg ctcaggtgta tgcagacact caggtgtaca cacatgatga 120
ttctaaagat gagtatgaga acgcattctt aatttctaat ctcactacac ataatatatt 180
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cattgatgat gttgtttact tacatgacta ttcatattat actaataatg aaatacggac 360
tgaccaacat tggataacca agacaaatat agaagattat ttattaccag gatggaagct 420
gacatacgtt ggatacaatg gaagtgatac gcgcggacat tataattttt catttagatg 480
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cttccagagt tttatactca agaagattaa agaaaggatg acaacatcac taccaatagc 600
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aataaaacag ttttcgaatg gaccgtattt agttaaagat acaattaaac tcaaacaaga 780
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tgtattaacg actttgtatc aatattacga tatatatcat gaaaaaccaa tcgtatacat 900
gataggatca gcgccctcat attggatata tgacgtcaaa cagtattcta acttgaaatt 960
tgaaacgtgg gatccactag atacaccata ctctaattta catcataagg aattatttta 1020
catgaatgac gtgcaaaaac ttaaagataa ttcaatacta tatatagata taagaacaga 1080
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gattagatca gaattttatc tagtgatgga tatatgggac tctaaaaata ttaaaagatt 1320
cataccaaaa ggtgtattat actcatatat aaacaataca attactgaaa acgtattcat 1380
acaacaacct tttaagttga aaacattgaa aaacgaatat ataatagcac tttatgcttt 1440
atcaaatgat tttaacaaca gagaagatgt ggtgaaacta attaataatc agaaaaaagc 1500
gttaatgaca gtgagaatta ataatacgtt taaagatgaa ccaaaagtcg gatttaaaaa 1560
catttacgat tggacatttc taccaacgga ttttgaaact aatggatcaa taattacttc 1620
atatgatggg tgtctaggta tctttggttt atcaatatcg ctagcttcaa aaccaactgg 1680
taataatcat ttgttcattt taagtggaac agacaagtat tttaaactgg atcaatttgc 1740
aaatcatatg agcatatcac gacgatcaca tcagatacga ttttcggagt cagccacttc 1800
atattcggga tatattttta gggatttgtc taataataat ttcaatttaa taggtacgaa 1860
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tggtaagtat tatgaacatg ctccaattga attgatttat gcatgcagat cagcaagaga 2040
atttgcgaaa ctgcaagatg atttaacggt attaagatat tcaaatgaga tagaaaacta 2100
tatcaataaa gtttatagca taacatacgc cgacgatcct aattacttta ttggagttaa 2160
gtttaaaaat attccttata agtataacgt taaagtacca catctcacat ttggcgtgtt 2220
aaatatttct gaacaaatgc taccagatgt aataacgatt ttaaagagat ttaagaatga 2280
gttatttgga atggaagtaa caacgagtta tacgtatatg ttatctgatg aggtgtatgt 2340
agcaaatata agtggtgtac tatcaacata tttcaaaatt tataatgagt tttataaaga 2400
gcaaatcaca tttggacagt caagaatgtt tattcctcat gtaacgttga gttttagtaa 2460
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<212> DNA
<213> 轮状病毒 G9(Rotavirus G9)
<400> 15
ggctataaaa tggcttcgct catttataga cagctactca ctaattcata cacagttgaa 60
ttatcagatg aaattaatac aattggatca gaaaaaagtc aaaatgtaac gattaatccc 120
ggaccgtttg ctcaaacaaa ttatgcacca gtgacttgga gtcatgggga agtgaatgat 180
tcgacaacga tagagccagt actcgatggt ccttatcaac caacaaattt taagccacca 240
aatgattact ggatattatt gaatccaact aatcaacaag ttgtattaga gggtaccaat 300
aaaattgata tttgggttgc tttattactt gttgaaccaa acgtaaccaa tcaaagtaga 360
caatacacat tatttggaga aacgaaacaa attactgtag aaaataacac aaacaaatgg 420
aaattcttcg aaatgttcag aagtaatgtt agtgccgaat ttcaacataa gcgcacttta 480
acatcagaca ctaaattagc tgggtttatg aaattttata atagtgtttg gactttccgc 540
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tacataaata ctggattacc accaatgcag aatacaagga atatagttcc agttgcgtta 720
tcatctaggt cagtgactta tcaacgtgct caggttaatg aggatatcat tatatcaaag 780
acatcgttgt ggaaagaaat gcaatgtaac agagatatta taataaggtt taaatttaat 840
aatagtatag taaaacttgg tgggctaggt tataaatggt cagaaatttc gtttaaagcg 900
gctaattatc agtacagtta cttgcgagat ggagagcaag ttacggcaca tactacttgc 960
tcagttaatg gtgtgaataa cttcagttat aatggaggat cactaccaac tgattttagt 1020
gtatcaagat atgaagtgat taaagagaat tcttatgttt atgttgatta ttgggatgac 1080
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gtatcactta attcgttaag atttagattc agtttaaccg ttgaagagcc accgttttca 1320
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tctcaagcgt tagacttaat cagatctgat cccagagttt tacgcgattt tatcaaccag 2280
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ttattcttga ctaaagggtg gccaactgga tcagtctatt ttaaagaata caccgatatc 420
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tgaaataaat tggaatgtta tgaatgtatt aattaatagt atcggtaaag taccaaaaat 1320
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<213> 轮状病毒 G9(Rotavirus G9)
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tgaagcactg aattcaatta aagtcacgca gtctgatgtt gcaagtgtac tttcaagagt 360
agtttctgtg agacatcttg agaatttagt attgagaaga gaaaatcatc aggacgttct 420
ttttcactca aaggagctac tactcaaatc agttttaata gctattggtc attcaaagga 480
gattgaaacg actgccactg ctgaaggggg agaaattgtt tttcaaaatg cagcatttac 540
aatgtggaaa ttgacatact tggaacataa actaatgcca attcttgatc aaaactttat 600
tgaatataaa attacattaa atgaagataa accaatttca gagtcacacg taaaagaact 660
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atggcaaaat tggtacgcat ttacgtcctc aatgaaacaa ggtaatgctc ttgatgtatg 900
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attggtagga gtgaacagta catttcacca gatgcagaag ctttcaataa gtacatgttg 180
tcaaaatctc cagaagatat tggaccttct gattctgcat cgaacgatcc actcaccagc 240
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atcgcgttat tgaatttaac aactttctaa tgagagaaga ttaatgcgtc taccctaaga 780
gatcactagg gagctcccca ctcccgtttt gtgacc 816

Claims (9)

1.一种分离的减毒的轮状病毒，其中所述轮状病毒为G9P[6]轮状病毒；其包含：
a）多肽VP4，其中多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，以及编码所述多肽的核酸分子；
b）多肽VP7，其中多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示，以及编码所述多肽的核酸分子；
c）多肽NSP1，其中多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列至少98.9％相同，以及编码所述多肽的核酸分子；
d）多肽VP1，其中多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列至少99.8％相同，以及编码所述多肽的核酸分子；
e）多肽VP2，其中多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，以及编码所述多肽的核酸分子；
f）多肽VP3，其中多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列至少99.6％相同，以及编码所述多肽的核酸分子；
g）多肽VP6，其中多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示，以及编码所述多肽的核酸分子；
h）多肽NSP2，其中多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示，以及编码所述多肽的核酸分子；
i）多肽NSP3，其中多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列至少98.8％相同，以及编码所述多肽的核酸分子；
j）多肽NSP4，其中多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示，以及编码所述多肽的核酸分子；和
k）多肽NSP5，其中多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列至少99.6％相同，以及编码所述多肽的核酸分子。
2.权利要求1的分离的减毒的轮状病毒，其包含以下中的至少一个或全部：
a）编码包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的多肽的核酸分子；
b）编码包含SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列的多肽的核酸分子；和
c）编码包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列的多肽的核酸分子。
3.权利要求1或2中的分离的减毒的轮状病毒，其中所述轮状病毒在体外宿主细胞中增殖时生长至滴度为107至108。
4.权利要求1或2中的分离的减毒的轮状病毒，其包含：
a）多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，以及编码所述多肽的核酸分子；
b）多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示，以及编码所述多肽的核酸分子；
c）多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，以及编码所述多肽的核酸分子；
d）多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，以及编码所述多肽的核酸分子；
e）多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，以及编码所述多肽的核酸分子；
f）多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，以及编码所述多肽的核酸分子；
g）多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示，以及编码所述多肽的核酸分子；
h）多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示，以及编码所述多肽的核酸分子；
i）多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示，以及编码所述多肽的核酸分子；
j）多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示，以及编码所述多肽的核酸分子；和
k）多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示，以及编码所述多肽的核酸分子。
5.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-4中任一项的分离的减毒的轮状病毒以及可药用载体。
6.权利要求5中的药物组合物，还包含佐剂。
7.权利要求6中的药物组合物，其中所述佐剂是铝佐剂。
8.权利要求5中的药物组合物，其中所述药物组合物包含氢氧化铝或铝盐。
9.权利要求5中的药物组合物，其中所述药物组合物包含磷酸铝。
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