ES2534637T3 - Vacuna de rotavirus que induce protección cruzada heterotípica - Google Patents
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Abstract
Uso de una cepa de Rotavirus atenuado de tipo G1P[8] en la fabricación de una composición para conferir protección contra la infección por rotavirus causada por una cepa de rotavirus de tipo G2P[4].
Description
Vacuna de rotavirus que induce protección cruzada heterotípica
Campo técnico
La presente invención se refiere a formulaciones de vacunas de Rotavirus. La invención se refiere al uso de una población de Rotavirus atenuado de un tipo de Rotavirus en la prevención de una enfermedad asociada a infección por Rotavirus a partir de otro tipo de Rotavirus.
La diarrea aguda, infecciosa es una causa principal de la enfermedad y muerte en muchas áreas del mundo. En lospaíses en vías de desarrollo, el impacto de la enfermedad diarreica es asombroso. Para Asia, África y Latinoamérica, se ha estimado que existen entre 3 - 4 mil millones de casos de diarrea cada año y de aquellos casos aproximadamente 5 - 10 millones dan como resultado la muerte (Walsh, J.A. y col.,: N. Engl. J. Med., 301:967-974 (1979)).
Los rotavirus se han reconocido como una de las causas más importantes de diarrea grave en niños pequeños y niños jóvenes (Estes, M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, tercera edición, editado por Fields y col., Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Se estima que la enfermedad por Rotavirus es responsable de por encima de un millón de muertes anualmente. La enfermedad inducida por Rotavirus lo más comúnmente afecta a los niños entre 6 y 24 meses de edad, y la máxima prevalencia de la enfermedad se produce generalmente durante los meses más fríos en climas templados, y a lo largo del año en áreas tropicales. Los Rotavirus se transmiten típicamente de persona a persona mediante la vía fecal - oral con un período de incubación de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 días. A diferencia de la infección en el grupo de edad de 6 meses a 24 meses, los neonatos son generalmente asintomáticos o tienen solamente la enfermedad leve. En contraste a la grave enfermedad encontrada normalmente en niños jóvenes, la mayoría de los adultos están protegidos como resultado de la infección por Rotavirus previa, de manera que la mayoría de las infecciones de adultos son leves o asintomáticas (Offit, P.A. y col., Comp. Ther., 8 (8):21 - 26, 1982).
Los Rotavirus son generalmente esféricos, y su nombre se deriva de su estructura distintiva de la cápside externa e interna o de doble caparazón. Típicamente, la estructura de la cápside de doble caparazón de un Rotavirus encierra un caparazón de proteína interno o núcleo que contiene el genoma. El genoma de un Rotavirus se compone de 11 segmentos de ARN de doble cadena que codifican al menos 11 proteínas virales distintas. Dos de estas proteínas virales designadas como VP4 y VP7 están dispuestas sobre el exterior de la estructura de la cápside de doble caparazón. La cápside interna del Rotavirus presenta una proteína, que es la proteína de Rotavirus designada VP6. La importancia relativa de estas tres proteínas particulares rotavirales en inducir la respuesta inmune que sigue a la infección por Rotavirus no está todavía clara. Sin embargo, la proteína VP6 determina el antígeno del grupo y subgrupo, y las proteínas VP4 y VP7 son las determinantes de la especificidad del serotipo (tipos determinados por el ensayo de neutralización) y genotipo (tipos determinados por un ensayo no serológico). Las designaciones de los serotipos G y genotipos G son idénticas. Por el contrario, los números asignados para los serotipos y genotipos P son diferentes (Santos N. y Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29 - 56). Por lo tanto el serotipo P se designa como P seguido de un número asignado, y el genotipo P se designa por una P seguida de un número asignado entre paréntesis.
Hasta la fecha, se han identificado al menos 14 serotipos G de Rotavirus y 14 serotipos P de Rotavirus (Santos N. y Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29 - 56). Entre éstos, se han identificado 10 serotipos G (G1-6, G8-10 y G12) y 9 serotipos P (P1, P2A, P3, P4, P5A, P7, P8, P11 y P12) entre los Rotavirus humanos. Se han descrito veintitrés genotipos P diez de los cuales se han recuperado de humanos (P[3]-[6], P[8]-[11], P[14] y P[19]).
La proteína VP7 es una glicoproteína de 38.000 de peso molecular (34.000 de peso molecular cuando no está glicosilada) que es el producto traduccional del segmento genómico 7, 8 ó 9, dependiendo de la cepa. Esta proteína estimula la formación de anticuerpo neutralizante después de la infección por Rotavirus. La proteína VP4 es una proteína no glicosilada de aproximadamente 88.000 de peso molecular que es el producto traduccional del segmento genómico 4. Esta proteína también estimula el anticuerpo neutralizante después de la infección por Rotavirus.
Dado que las proteínas VP4 y VP7 son las proteínas virales contra las que se dirigen los anticuerpos neutralizantes, se cree que son los candidatos principales para el desarrollo de vacunas de Rotavirus, produciendo protección contra enfermedad por Rotavirus.
La infección natural por Rotavirus durante la infancia temprana se sabe que induce una inmunidad protectora.
Una vacuna de Rotavirus atenuado vivo es de este modo altamente deseable. De forma adecuada ésta debe ser una vacuna oral, ya que ésta es la vía natural de la infección del virus.
El desarrollo temprano de vacunas para prevenir infecciones por Rotavirus comenzó en los años 70 después del descubrimiento del virus. Inicialmente, cepas atenuadas de animales y seres humanos se estudiaron y había resultados mixtos o decepcionantes. Los esfuerzos más recientes se han centrado en virus reagrupados de seres humanos - animales que han sido más exitosos.
Una cepa de Rotavirus conocida como 89-12 ha sido descrita por Ward; véase la patente de Estados Unidos Nº
5.474.773 y Bernstein, D.L. y col., Vaccine, 16 (4), 381 - 387, 1998. La cepa 89-12 se aisló de una muestra de deposición recogida de un niño de 14 meses de edad con enfermedad por Rotavirus natural en 1988. De acuerdo con la patente de Estados Unidos nº 5.474.773 el Rotavirus HRV 89-12 humano se adaptó después en cultivo mediante 2 subcultivos en células primarias de riñón de mono verde africano (AGMK) y 4 subcultivos en células MA104 como describe Ward en J. Clin. Microbiol., 19, 748 - 753, 1984. Después se purificó en placa 3 veces en células MA-104 (hasta el subcultivo 9) y se desarrollaron después de 2 subcultivos adicionales en estas células. Se realizó un subcultivo adicional (pase 12) para deposición con la ATCC con el número de acceso ATCC VR 2272. La cepa depositada se conoce como 89-12C2.
El artículo de 1998 en Vaccine, de Bernstein y col, se menciona más adelante como el artículo de Vaccine (1998). El artículo describe la seguridad e inmunogenicidad de un candidato de vacuna de Rotavirus humano vivo administrado por vía oral. Esta vacuna se obtuvo a partir de la cepa 89-12, atenuada mediante subcultivo sin purificación en placa 26 veces en células de AGMK primarias y después otras 7 veces en una línea celular de AGMK establecida (33 subcultivos en total).
De aquí en adelante en la presente memoria descriptiva, el material anteriormente mencionado que ha sido subcultivado en serie 26 veces se denominará P26 y el material que ha sido subcultivado en serie 33 veces se denominará P33. En general, el Rotavirus derivado mediante subcultivo de 89-12 n veces se denominará Pn.
En los ejemplos que siguen, el material P33 se subcultivó 5 veces más sobre células Vero. Esto se denomina P38.
Los aislamientos P26 y P33 descritos en el artículo Vaccine (1998) no se depositaron en una colección de cultivos, ni se analizaron para establecer su caracterización genética.
Ahora, se ha encontrado que la población P26 descrita en la bibliografía comprende una mezcla de variantes. Esto se ha establecido mediante caracterización genética como se describe en la presente memoria descriptiva más adelante (véanse los ejemplos). P26 no es por lo tanto una población consistente fidedigna para subcultivos posteriores, en particular para la producción de lotes de vacuna. De manera similar, P33 comprende una mezcla de variantes y no es de manera fidedigna consistente para la producción de lotes de vacunas.
Se ha encontrado que el material P26 es una mezcla de al menos tres variantes de genes de VP4. P33 y P38 son de manera similar una mezcla de dos variantes. Estas variantes parece que son antigénicamente diferentes, en términos de epítopos neutralizantes, a la cepa 89-12C2 depositada en la ATCC cuando se evaluaban los títulos del anticuerpo neutralizante de sueros de niños vacunados con P33 contra estas variantes.
Además se ha encontrado que cuando el material P33 se administra a niños, dos variantes identificadas se replicaron y se excretaron. De 100 niños vacunados, solamente 2 mostraron signos de gastroenteritis debido a la infección por Rotavirus, mientras que el 20 % de un grupo placebo se infectó. Estos hallazgos sugieren que las variantes identificadas están asociadas a la protección de la enfermedad por Rotavirus.
El documento WO 01/12797 divulga un procedimiento de separación de variantes de Rotavirus y una vacuna de Rotavirus atenuado vivo mejorada derivada de una cepa de Rotavirus humano clonado (homogéneo). También se divulga una población de Rotavirus atenuado (aislado), caracterizada por que comprende una única variante o sustancialmente una única variante, dicha variante definida por la secuencia de nucleótidos que codifica al menos una de las proteínas virales principales designadas como VP4 y VP7. La eficacia protectora de tal vacuna de Rotavirus humano atenuado oral contra la cepa heteróloga G9 se ha reseñado en niños de Latinoamérica (Perez y col., 42ª Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC 2002) 27 - 30 de septiembre de 2002, San Diego). El documento WO 05/021033 divulga un serotipo de Rotavirus se pueden usar para proteger contra la enfermedad provocada por otro serotipo. En particular el documento WO 05/021033 divulga el uso de una población de Rotavirus G1, [por ejemplo como se ha depositado en la Colección Europea de Cultivos de Células animales (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Reino Unido el 13 de agosto de 1999 coon el número de depósito 99081301, bajo los términos del tratado de Budapest, también llamado P43 o RIX4414], para prevenir la enfermedad provocada tanto por el serotipo de Rotavirus G1 como por al menos uno de los serotipos de Rotavirus no- G1, tales como pero sin limitación los serotipos G2, G3, G4 y G9.
El contenido completo de los documentos WO 01/12797 y WO 05/021033 se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1A (SEC ID Nº 1) es la secuencia de nucleótidos del gen VP4 de P43 (RIX4414) que incluye la secuencia que codifica la proteína VP4 de P43.
La Figura 1B (SEC ID Nº 2) tiene nucleótidos adicionales de ambos extremos del gen y una sustitución de nucleótidos (en negrita - una G en lugar de una C en la posición 18 dando como resultado TCG en lugar de TCA sin embargo sin impacto sobre la proteína codificada resultante) debido a la técnica de secuenciación. La secuencia no codificadora aparece en letra pequeña. La Figura 1B muestra la secuencia correcta para el depósito P43.
La Figura 2A (SEC ID Nº 3) es la secuencia de nucleótidos del gen P43 (RIX4414) VP7 que incluye la secuencia codificadora de la proteína VP7 de P43.
La Figura 2B (SEC ID Nº 4) tiene nucleótidos adicionales de ambos extremos del gen y una sustitución de nucleótidos (en negrita - una A en lugar de una C en la posición 58, dando como resultado un ATT que codifica leucina en lugar de CTT que codifica isoleucina) debido a la técnica de secuenciación. La secuencia no codificadora aparece en letra pequeña. La Figura 2B muestra la correcta secuencia del depósito P43.
La Figura 3 (SEC ID Nº 5) es la secuencia de polipéptidos de VP4 de RIX4414.
La Figura 4 (SEC ID Nº 6) es la secuencia de polipéptidos de VP7 de RIX4414.
La Figura 5 (SEC ID Nº 7) muestra la secuencia de polipéptidos de la proteína NSP4 de RIX4414.
La Figura 6 (SEC ID Nº 8) muestra la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína NSP4 de RIX4414. La secuencia no codificadora aparece en letra pequeña.
La Figura 7 (SEC ID Nº 9) muestra la secuencia de polipéptidos de la proteína VP6 de RIX4414.
La Figura 8 (SEC ID Nº 10) muestra la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína VP6 de RIX4414. La secuencia no codificadora aparece en letra pequeña.
Descripción detallada de la invención
En la presente divulgación, los inventores han determinado que una población de Rotavirus atenuado, por ejemplo una tal como la caracterizada en el documento WO 01/12797, se puede usar como una vacuna para proporcionar protección cruzada contra la enfermedad provocada por infección por Rotavirus de un tipo diferente (serotipo y/o genotipo) que el usado en la vacuna. La proteína VP7 especifica el tipo G (serotipo) y la proteína VP4 especifica el tipo P de cepa (serotipo o genotipo).
En particular, la presente divulgación se refiere al uso de una población de Rotavirus atenuado de un tipo P en la prevención de la enfermedad asociada a la infección por Rotavirus de un tipo P diferente, y específicamente al uso de una población de Rotavirus atenuado o cepa de un tipo GxPy en la inducción de una respuesta inmune y/o en la prevención de la enfermedad asociada a la infección por Rotavirus provocada por una cepa de Rotavirus que no es ni un tipo Gx ni Py.
La inmunidad se puede medir neutralizando las respuestas de anticuerpo a la vacuna o mediante la respuesta de anticuerpo IgA de Rotavirus en suero, tal como factor de seroconversión (es decir, incremento de ≥ 3 veces en los niveles de anticuerpo IgA en suero después de la vacunación, como se describe en Ward y col.,, 1990, J. Infect. Disease, 161, 440 - 445).
En el contexto de la presente divulgación, y consistente con el entendimiento común en la técnica (Santos N. y Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29 - 56), Gx se refiere a un tipo G específico, es decir, genotipo G o serotipo G (siendo ambas terminologías idénticas), mientras que la terminología Py se referirá genéricamente a un tipo P específico, o bien el serotipo P (por ejemplo, P8, P4) o el genotipo P (por ejemplo, P[4], P[8]). Cuando se refiere a un genotipo P específico, se usará la P seguida de un número asignado entre paréntesis; por lo demás el tipo P significará o bien serotipo o genotipo.
En un aspecto de la invención, se proporciona el uso de uso de una cepa de rotavirus atenuado del tipo G1 P[8] en la fabricación de de una composición para conferir protección contra la infección por rotavirus causada por una cepa de rotavirus del tipo G2 P[4].
A lo largo de la presente memoria descriptiva, la redacción tal como el uso de una composición de vacuna de acuerdo con la invención en la fabricación de una composición de vacuna para la prevención de enfermedades por Rotavirus, o tal como procedimientos de terapia que comprenden el uso de dicha composición de vacuna se usarán indistintamente.
Los inventores han determinado ahora que una población de Rotavirus GxP[8] [por ejemplo G1P[8] como se ha depositado en la Colección Europea de Cultivos de Células de Animales (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Reino Unido el 13 de agosto de 1999 bajo el número de deposición 99081301, bajo los términos del Tratado de Budapest], se puede usar para prevenir la enfermedad provocada tanto por G1P[8] como al menos por una cepa de Rotavirus que ni es un tipo G1 ni P8. Los inventores han determinado que una población de Rotavirus G1P[8] se puede usar para prevenir la enfermedad provocada tanto por un genotipo G1P[8] como al menos por uno no- G1P[8], tal como genotipo de Rotavirus G2P[4].
De acuerdo con lo anterior, la presente divulgación se refiere al uso de una población de Rotavirus atenuado a partir de un tipo de Rotavirus en la prevención de enfermedad asociada a la infección por Rotavirus a partir de otro tipo de Rotavirus, en la que el tipo se define de manera adecuada por referencia a la secuencia de la proteína VP4 de Rotavirus (tipo P).
La divulgación también se refiere al uso de una población de Rotavirus atenuado de una cepa de Rotavirus (definida mediante un tipo tanto G como P específico) en la prevención de una enfermedad asociada a la infección por Rotavirus a partir de otra cepa de Rotavirus, en la que la cepa se define de manera adecuada por referencia a la secuencia de tanto la proteína VP4 de Rotavirus (tipo P) como la proteína VP7 (tipo G).
En todos los aspectos de la invención reivindicada, dicha respuesta inmune es una respuesta inmune protectora. De manera adecuada la población de Rotavirus comprende las proteínas virales VP4 y/o VP7 de ECACC depósito 99081301 adecuadas para proporcionar un efecto protector cruzado.
En el presente documento, se hará referencia a protección cruzada por ser la protección producida por un tipo de Rotavirus contra la infección provocada por un Rotavirus de un tipo diferente.La protección cruzada puede ser homotípica o heterotípica. La protección cruzada homotípica es una protección producida por una cepa de Rotavirus contra una cepa o bien de tipo G o P, tal como por ejemplo una cepa G1P[8] que produce protección cruzada contra una cepa no- G1, P[8] (por ejemplo, G2P[8]) mediante el tipo P[8]. Otro ejemplo de una protección cruzada homotípica es la producida por una cepa G1P[8] contra una cepa G1 no-P[8] (por ejemplo, G1P[4]) mediante el tipo G1. La protección cruzada heterotípica es una protección producida por una cepa de Rotavirus contra una cepa de Rotavirus de tipos P y G diferentes tales como por ejemplo la protección producida por un G1P[8] contra una cepa no G1- no P[8]- (por ejemplo, G2P[4]) (protección heterotípica producida mediante tanto el tipo G como P).
En particular una población de Rotavirus atenuado G1, del tipo G1 P[8] [por ejemplo, como la depositada en la Colección Europea de Cultivos de Células de Animales (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Reino Unido el 13 de agosto de 1999 bajo el número de deposición 99081301, bajo los términos del tratado de Budapest], se puede usar para prevenir la enfermedad provocada por G1 P[8] y al menos un serotipo rotavirus no G1 seleccionado del grupo que consiste en G3, G4 y G9.
La composición de vacuna para uso de acuerdo con la invención comprende una cepa de Rotavirus G1P[8] y es capaz de inducir una respuesta inmune a una cepa de Rotavirus G2P[4].
En un aspecto particular, la divulgación se refiere a un procedimiento de inducción de una respuesta inmune contra la cepa de Rotavirus, comprendiendo el procedimiento la administración a un sujeto de una composición que comprende una cepa de Rotavirus atenuado de un tipo GxPy, generando dicha composición una respuesta inmune contra una cepa de Rotavirus que ni es del tipo Gx ni Py.
La población de Rotavirus dentro de la composición de vacuna es de especificidad de cepa G1P1A (es decir, G1P[8] de acuerdo con la nomenclatura actual). De manera adecuada la población de Rotavirus comprende las proteínas virales VP4 y/o VP7 de ECACC depósito 99081301 adecuadas para inducir una respuesta inmune y, típicamente, proporcionan un efecto protector cruzado. La invención se refiere a cepas de Rotavirus G1P[8] en procedimientos o usos como se ha descrito anteriormente. En una realización, la vacuna de Rotavirus usada es la ECACC depósito 99081301 o deriva de ese depósito.
En un aspecto específico la vacuna induce una respuesta inmune protectora cruzada o protección cruzada contra gastroenteritis en un individuo vacunado comparado con el individuo no vacunado (del grupo placebo). De manera adecuada, la vacuna proporciona protección cruzada contra síntomas de infección por Rotavirus tales como diarrea
o gastroenteritis. Por ejemplo la gastroenteritis se puede definir como diarrea caracterizada por tres o más, deposiciones acuosas o más sueltas de lo normal en un día o vómitos violentos junto con la detección de Rotavirus en la muestra de deposición examinada.
Como entenderán los expertos en la técnica, la gravedad de la enfermedad y eficacia de la vacunación para inducir una respuesta inmune protectora en un individuo vacunado o una población vacunada se puede determinar mediante varios medios. Por respuesta inmune protectora se quiere indicar una respuesta inmune que conduce a una reducción de la gravedad de los síntomas clínicos asociados a la infección con Rotavirus o que conduce a la susceptibilidad reducida a infección por Rotavirus. La gravedad de la enfermedad en un individuo no vacunado o vacunado se puede clasificar de acuerdo con sistemas de puntuación publicados tales como la escala Vesikari de 20 puntos o una versión ligeramente modificada de dicho procedimiento (Ruuska T y col., Scand. J. Infect. Dis. 1990, 22, 259 - 267), o de acuerdo con cualquier otro sistema adecuado que presenta y clasifica los síntomas específicos de la infección por Rotavirus (tal como el procedimiento reseñado en Clark HF, Borian EF, Bell LM. Protective effect of WC3 vaccine against Rotavirus diarrhea in infants during a predominantly serotype 1 Rotavirus season. J Infect Dis. 1988: 570 - 86). De acuerdo con el procedimiento de Vesikari, RVGE grave se define normalmente como una puntuación ≥11.
La protección se puede evaluar al nivel de una población o un grupo mediante la eficacia de la vacuna (VE). La eficacia de la vacuna se calcula mediante la siguiente fórmula:
VE (%) = 1 – RR = 1 – (ARV/ARU),
con
RR = riesgo relativo = ARV/ARU
ARU = velocidad de ataque de enfermedad en población no vacunada (estimada a partir del grupo placebo) = número de sujetos que presentan al menos un episodio de RV GE / número total de sujetos en el grupo control.
ARV = velocidad de ataque de la enfermedad en el grupo vacunado = número de sujetos que presentan al menos un episodio de RV GE / número total de sujetos en el grupo de vacuna de HRV.
En un aspecto, la divulgacióndescribe un uso como se ha detallado anteriormente en el que la composición que comprende una cepa de Rotavirus atenuado de un tipo GxPy induce una respuesta inmune protectora cruzada y/o protección contra gastroenteritis inducida por Rotavirus, de manera adecuada contra la gastroenteritis grave inducida por Rotavirus, provocada por infección de una cepa de Rotavirus que ni es un tipo Gx ni Py. En un aspecto específico, dicha respuesta inmune protectora es capaz de reducir la gravedad de la enfermedad o eliminar la enfermedad inducida por Rotavirus según se mide de acuerdo con cualquier sistema de puntuación adecuado.
En todavía otro aspecto, se describe un uso de la composición de acuerdo con la invención, para reducir la gravedad de la enfermedad, por ejemplo, gastroenteritis, o para eliminar la enfermedad inducida por Rotavirus, registrando dicha gravedad de enfermedad o enfermedad de acuerdo con cualquier sistema de puntuación adecuado como se ha enseñado anteriormente.
En un aspecto específico, dicha composición es hasta 60 % protectora, adecuadamente hasta 81 % protectora, en una población de individuos vacunados, contra diarrea provocada por infección de un Rotavirus de un tipo diferente al del Rotavirus atenuado presente en la composición. En una realización específica, dicha composición es al menos 40 % protectora, adecuadamente al menos 50 % protectora, , en una población de individuos vacunados, contra la diarrea provocada por una cepa de Rotavirus que es de tipo G2 P[4] En una realización adicional, dicha composición es entre 40 % y 80 % protectora, adecuadamente entre 50 % y 70 % protectora contra la diarrea provocada por una cepa de Rotavirus que es G2 P[4]. En un aspecto específico de la divulgación, dicha composición comprende una cepa de Rotavirus G1P[8] que produce el nivel de protección como se ha mencionado anteriormente contra la gastroenteritis provocada por la infección de cepas de Rotavirus de tipo G2P[4].
Adecuadamente, la tasa de protección contra la diarrea y/o gastroenteritis y/o gastroenteritis grave lograda en una población de individuos vacunados infectados por una cepa de Rotavirus que ni es un tipo Gx ni Py, es entre 10 y 90 %, de manera adecuada entre 20 y 80 %, de manera adecuada entre 40 % y 80 %, de manera adecuada entre 45 % y 75 % protectora. Típicamente el nivel de protección contra la gastroenteritis grave es al menos 40 %, adecuadamente al menos 50 %.
En una realización específica, dicha composición comprende una cepa de Rotavirus G1P[8] que es entre 40 % y 75 % protectora, en una población de individuos vacunados contra gastroenteritis grave, como se mide de acuerdo con la puntuación de Vesikari, provocada por la infección de Rotavirus de un serotipo G2P[4].
De manera adecuada la vacuna se usa en un régimen de 2 dosis o de 3 dosis. En una realización, la composición para su uso según la invención se administra en un régimen de de 2 dosis.
La vacuna de Rotavirus usada para proporcionar protección cruzada tiene las siguientes características adecuadas.
En una realización, el Rotavirus G1 P[8] de la composición para uso de acuerdo con la invención tiene un gen VP4 que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende al menos uno de los siguientes: una base adenina (A) en la posición 788, una base adenina (A) en la posición 802 y una base timina (T) en la posición 501 a partir del codón de iniciación.
En una realización adicional el Rotavirus G1 P[8] de la composición para uso de acuerdo con la invención tiene un gen VP7 que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende al menos uno de los siguientes: una timina
(T) en la posición 605, una adenina (A) en la posición 897, o una guanina (G) en la posición 897 a partir del codón de iniciación. De manera adecuada en la posición 897 existe una adenina (A).
En una realización específica, el Rotavirus G1 P[8] de la composición para uso de acuerdo con la invención tiene una adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una timina (T) en la posición 501 a partir del codón de iniciación en la secuencia del gen VP4.
En una realización particular, el Rotavirus G1 P[8] de la composición para uso de acuerdo con la invención tiene una adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una timina (T) en la posición 501 a partir del codón de iniciación en la secuencia del gen VP4.
En una realización particular, el rotavirus G1 P[8] de la composición para uso de acuerdo con la invención tiene una adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una timina (T) en la posición 501 a partir del codón de iniciación en la secuencia del gen VP4 y una timina (T) en la posición 605 y una adenina/guanina (A/G) en la posición 897 a partir del codón de iniciación en la secuencia VP7.
En otro aspecto de la divulgación, el Rotavirus de la composición para uso de acuerdo con la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína VP4 en la que la secuencia de nucleótidos es como se muestra en la figura 1A (SEC ID Nº 1) o la Figura 1B (SEC ID Nº 2), y/o una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína VP7 en la que la secuencia de nucleótidos es como se muestra en la Figura 2A (SEC ID Nº 3) o la Figura 2B (SEC ID Nº 4). En un aspecto adicional, el Rotavirus de la composición para uso de acuerdo con la invención comprende una proteína VP4 como se establece en la Figura 3 (SEC ID Nº 5), y/o una proteína VP7 como se expone en la Figura 4 (SEC ID Nº 6). En un aspecto adicional, dicha población de Rotavirus para uso de acuerdo con la invención adicionalmente comprende una proteína NSP4 como se expone en la Figura 5 (SEC ID Nº 7), o codificada por la secuencia de nucleótidos como se expone en la Figura 6 (SEC ID Nº 8), y/o una proteína VP6 como se expone en la Figura 7 (SEC ID Nº 9), o codificada por la secuencia de nucleótidos como se expone en la Figura 8 (SEC ID Nº 10).
Las poblaciones de Rotavirus adecuadas para uso en la presente invención se pueden obtener mediante un procedimiento que comprende:
pasar una preparación de Rotavirus en un tipo de célula adecuado;
opcionalmente seleccionar el cultivo homogéneo usando las etapas de o bien:
a) dilución límite; o
b) aislamiento de placa individual; y
comprobar la presencia de una variante sustancialmente única llevando a cabo una determinación de secuencias de una región apropiada de la secuencia de genes VP4 y/o VP7.
De manera adecuada, la población de Rotavirus se deriva de las cepas P43 (RIX4414), P33 o P26 como se ha descrito anteriormente.
La determinación de la secuencia se puede llevar a cabo adecuadamente mediante una técnica de hibridación cuantitativa o semicuantitativa tal como una hibridación de transferencia en ranura o hibridación en placa.
La población de virus clonada resultante que se produce a partir del procedimiento de acuerdo a la invención se puede amplificar subcultivando adicionalmente sobre una línea celular adecuada.
Los tipos de células adecuados para subcultivar la población de Rotavirus en el procedimiento anterior incluyen células de riñón de mono verde africano (AGMK), que pueden ser líneas de células establecidas o células AGMK primarias. Las líneas de células AGMK adecuadas incluyen por ejemplo Vero (ATCC CCL-81), DBS-FRhL-2 (ATCC CL-160), BSC-1 (ECACC 85011422) y CV-1 (ATCC CCL-70). Son también adecuadas líneas de células MA-104 (mono rhesus) y MRC-5 (humanas – ATCC CCL-171). Las células Vero son particularmente adecuadas para propósitos de amplificación. El subcultivo sobre células Vero proporciona una alta producción de virus.
Las técnicas para comprobar si existe una sola variante en una población de virus que se produce a partir del procedimiento, y para determinar la naturaleza de esa única variante implican procedimientos de secuenciación o de hibridación convencionales conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria descriptiva más adelante.
En un aspecto específico, el procedimiento de la invención se lleva a cabo usando un Rotavirus apropiado, particularmente Rotavirus que tienen las características de la cepa 89-12 o de un derivado subcultivado del mismo.
Una población variante única particularmente adecuada es P43, que se obtuvo de P33 (un Rotavirus humano aislado subcultivado 33 veces en cultivo sobre tipos de células apropiados) mediante una serie de etapas de clonación de dilución final seguidas del subcultivo del material clonado en células Vero para amplificación.
Una población P43 se depositó en la Colección Europea de Cultivos de Células de Animales (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Reino Unido el 13 de agosto de 1999 bajo el número de deposición 99081301, bajo los términos del tratado de Budapest, y se divulga en el documento WO 01/12797.
Aunque esta disponibilidad pública indicada es el procedimiento más sencillo de obtener el Rotavirus humano P43, se pueden producir Rotavirus similares y funcionalmente sustancialmente idénticos mediante estos u otros procedimientos en vista de las enseñanzas de la presente invención. Tales Rotavirus funcionalmente sustancialmente idénticos se consideran que son biológicamente equivalentes al Rotavirus humano P43 de La presente invención y por lo tanto están dentro del alcance general de la presente invención. Por lo tanto se entenderá que la invención abarca poblaciones de Rotavirus que tienen las características de la variante P43 como se ha descrito en la presente memoria descriptiva.
También se entenderá que la divulgación abarca materiales derivados del P43 depositado ECACC 99081301 sometiéndolo a un procesamiento adicional tal como propagándolo mediante subcultivo adicional, clonación, u otros procedimientos usando el virus vivo o modificando P43 de cualquier forma incluyendo mediante técnicas de ingeniería genética o técnicas de reagrupación. Tales etapas y técnicas se conocen bien en la técnica.
Los materiales derivados de P43 depositado que están cubiertos por la invención incluyen material genético y proteico. De particular interés son Rotavirus reagrupados que comprenden al menos un antígeno o al menos un segmento de P43, por ejemplo reagrupamientos que comprenden una cepa virulenta de Rotavirus en la que una parte de uno o parte de los 11 segmentos de genoma se ha reemplazado por el segmento de genoma o parte del mismo de P43. Específicamente, un reagrupamiento de Rotavirus en el que el segmento o segmento parcial que codifica NSP4 es un segmento se P43 o segmento parcial pueden tener propiedades útiles. Los Rotavirus de reagrupamiento y técnicas para prepararlos son bien conocidas (Foster, R. H. y Wagstaff, A. J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, una revisión. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9 (2), 155 - 178, 1998).
Los materiales de interés particular son descendientes de P43 y derivados inmunológicamente activos de P43. Los derivados inmunológicamente activos significa los materiales obtenidos a partir de o con el virus P43, particularmente antígenos del virus, que son capaces de inducir una respuesta inmune que es reactiva contra Rotavirus cuando se inyecta en un animal huésped.
En la adaptación del Rotavirus a una línea celular apropiada, por ejemplo células Vero, puede ser necesario tratar el virus de manera que consiga librarse de cualquier contaminante potencial tal como cualesquiera agentes inesperados que pueden estar presentes y que de otra manera provocarían contaminación. En el caso de virus inesperados sensibles a éter, esto se puede hacer mediante tratamiento con éter como se describe en la presente memoria descriptiva más adelante. La presente invención también se refiere a la inclusión de tal tratamiento con éter como una etapa opcional en el procedimiento global para obtener un Rotavirus vivo atenuado o vacuna formulada con él.
La cepa de Rotavirus de protección cruzada para su uso de acuerdo con la presente invención se puede combinar con otras cepas de Rotavirus para proporcionar protección adicional o protección cruzada contra infección o enfermedad por Rotavirus.
La presente divulgación también se refiere a una vacuna de Rotavirus atenuado vivo capaz de proporcionar protección cruzada, como se ha definido en la presente memoria descriptiva anteriormente, mezclada con un adyuvante o vehículo farmacéutico adecuado.
En unaspecto, la vacuna de Rotavirus para uso de acuerdo con la invención es una vacuna de Rotavirus monovalente que contiene una única cepa de Rotavirus tal como la cepa G1P[8].
La presente invención es particularmente ventajosa proporcionando una vacuna de Rotavirus vivo en la que el Rotavirus atenuado vivo es un rotavirus humano y no provoca invaginación intestinal.
Los vehículos farmacéuticos adecuados para uso con la cepa de Rotavirus atenuado de acuerdo con la invención incluyen los conocidos en la técnica por ser adecuados para la administración oral, especialmente a niños. Tales vehículos incluyen, y no se limitan a, carbohidratos, polialcoholes, aminoácidos, hidróxido de aluminio, hidróxido de magnesio, hidroxiapatita, talco, óxido de titanio, hidróxido de hierro, estearato de magnesio, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, gelatina, peptona vegetal, xantano, carragenano, goma arábiga, β-ciclodextrina.La divulgación también describe un procedimiento para preparar una vacuna de Rotavirus, por ejemplo secando por congelación el virus en presencia de estabilizadores adecuados o mezclando el virus de acuerdo con la invención con un adyuvante adecuado o un vehículo farmacéutico.
También puede ser ventajoso formular el virus de la invención en vehículos basados en lípidos tales como virosomas
o liposomas, en emulsiones de aceite en agua o con partículas de vehículo. Como alternativa, o además, se pueden incluir en la formulación inmunoestimulantes tales como los conocidos en la técnica para vacunas orales. Tales inmunoestimulantes incluyen toxinas bacterianas, particularmente toxina de cólera (CT) en la forma de la holotoxina (molécula entera) o la cadena B solamente (CTB) y la enterotoxina lábil por calor de E. coli (LT). Las LT mutadas (mL T) que es menos probable que se conviertan en su forma activa que la LT nativa se describen en los documentos WO 96/06627, WO 93/13202 y US 5.182.109.
Otros inmunoestimulantes que se pueden incluir de manera ventajosa son derivados de saponina tales como QS21 y monofosforilo lípido A, en particular 3-des-O-acilado monofosforilo lípido A (3D-MPL). Las saponinas purificadas como adyuvantes orales se describen en el documento WO 98/56415. Las saponinas y el monofosforil lípido A se pueden emplear de manera separada o en combinación (por ejemplo, el documento WO 94/00153) y se pueden formular en sistemas de adyuvantes junto con otros agentes. 3D-MPL es un adyuvante fabricado por Ribi Immunochem, Montana y su fabricación se describe en el documento GB 2122204.
Una explicación general de vehículos y adyuvantes para la inmunización oral se puede encontrar en Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, editado por Powell y Newman, Plenum Press, Nueva York, 1995.
La divulgación también se refiere a un procedimiento de vacunación de sujetos humanos, especialmente niños, mediante la administración a un sujeto en necesidad del mismo de una cantidad eficaz de una composición de vacuna de acuerdo con la invención. De manera adecuada la vacuna atenuada viva se administra mediante administración oral.
En un aspecto específico, la cepa de Rotavirus atenuada de acuerdo con la invención se formula con un antiácido para minimizar la inactivación de la vacuna mediante el ácido del estómago. Los componentes antiácido adecuados incluyen antiácidos inorgánicos por ejemplo hidróxido de aluminio Al(OH)3 e hidróxido de magnesio Mg(OH)2. Los antiácidos comercialmente disponibles que son adecuados para uso en la invención incluyen Mylanta (marca comercial) que contiene hidróxido de aluminio e hidróxido de magnesio. Éstos son insolubles en agua y se proporcionan en suspensión.
El hidróxido de aluminio es un componente particularmente adecuado de una composición de vacuna para su uso de acuerdo con la invención ya que puede proporcionar no sólo un efecto antiácido sino también un efecto adyuvante.
Son también adecuados para uso como antiácidos en la vacuna de la invención los antiácidos orgánicos tales como sales carboxilato de ácidos orgánicos. Un antiácido adecuado en la composición de vacuna para su uso de acuerdo con la invención contiene una sal carboxilato de ácido orgánico, específicamente una sal de ácido cítrico tal como citrato de sodio o citrato de potasio.
Un antiácido particularmente adecuado que se puede usar en la composición de vacuna para su uso de acuerdo con la presente invención es la sal inorgánica insoluble, carbonato de calcio (CaCO3). El carbonato de calcio es capaz de asociarse con el Rotavirus y la actividad de Rotavirus se mantiene durante la asociación con el carbonato de calcio.
Para prevenir la sedimentación de carbonato de calcio durante la etapa de llenado, los agentes viscosos se presentan de manera adecuada en la formulación.
Los posibles agentes viscosos que se pueden usar incluyen excipientes pseudoplásticos. Una solución pseudoplástica se define como una solución que tiene mayor viscosidad tras reposo comparada con su viscosidad bajo agitación. Los excipientes de este tipo son polímeros naturales tales como goma arábiga, goma adragante, agar
- -
- agar, alginatos, pectinas o polímeros semisintéticos por ejemplo: carboximetilcelulosa (Tyloses C®), metilcelulosa (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® y MB®), hidroxipropilcelulosa (Klucels®), e hidroxipropilmetilcelulosa (Methocels E® y K®, Viscontrans MPHC®). En general, aquellos excipientes pseudoplásticos se usan juntos con agentes tixotrópicos. Agentes viscosos alternativos que se pueden usar son excipientes pseudoplásticos con poca capacidad de fluir. Esos polímeros, a una concentración suficiente, dan lugar a una disposición de fluido estructural que da como resultado una solución de alta viscosidad que tiene poca capacidad de fluir tras reposo. Se requiera proporcionar una cierta cantidad de energía al sistema para permitir el flujo y transferencia.
Se necesitan energías externas (agitación) para destruir de manera temporal la disposición de fluido estructural con el fin de obtener una solución fluida.
Los ejemplos de tales polímeros son Carbopol® y goma xantano.
Los excipientes tixotrópicos llegan a tener una estructura de gel tras reposo mientras que si están bajo agitación forman una solución fluida. Los ejemplos de excipientes tixotrópicos son: Veegum ® (silicato de Magnesio-aluminio) y Avicel RC® (celulosa microcristalina aproximadamente al 89 % y carboximetilcelulosa de sodio al 11 %).
La composición de vacuna para su uso de acuerdo con la presente invención comprende de manera adecuada un agente viscoso seleccionado entre goma xantano o almidón.
De este modo, la composición de vacuna para su uso de acuerdo con la presente invención se formula típicamente con una combinación de carbonato de calcio y goma xantano.
Otros componentes de una composición usada en la invención incluyen de manera adecuada azúcares por ejemplo sacarosa y/o lactosa.
La composición de vacuna para su uso de acuerdo con la invención puede contener componentes adicionales que incluyen por ejemplo aromatizantes (particularmente para una vacuna oral) y agentes bacteriostáticos.
Se conciben diferentes presentaciones de la composición de vacuna para uso de acuerdo con la invención.
En un aspecto, la divulgación se refiere a una vacuna administrada en forma de una formulación líquida. De manera adecuada, la formulación líquida se reconstituye antes de la administración a partir de al menos los siguientes dos componentes:
i) componente de virus ii) componente líquido
En este aspecto, el componente de virus y el componente líquido están normalmente presentes en envases separados, que pueden ser convenientemente compartimentos separados de un único recipiente, o recipientes separados que pueden estar conectados de tal forma que la composición de vacuna final se reconstituye sin exposición al aire.
Antes de la reconstitución, el virus puede estar en una forma seca o una forma líquida. De manera adecuada el componente de virus se liofiliza. El virus liofilizado es más estable que el virus en una solución acuosa. El virus liofilizado se puede reconstituir de manera adecuada usando una composición de antiácido líquida para producir una formulación de vacuna líquida. Como alternativa el virus liofilizado se puede reconstituir con agua o solución acuosa, en cuyo caso la composición de virus liofilizado contiene de manera adecuada un componente antiácido.
De manera adecuada, la formulación de vacuna comprende un componente de virus formulado con carbonato de calcio y goma xantano en un compartimiento o recipiente y éste se reconstituye con agua o solución acuosa presente en el segundo compartimiento o recipiente.
En otro aspecto, la composición de vacuna como se divulga en el mismo es una formulación sólida, de manera adecuada una torta liofilizada que es adecuada para la disolución inmediata cuando se coloca en la boca. Las formulaciones liofilizadas se pueden proporcionar de manera conveniente en la forma de comprimidos en un envase blíster farmacéutico.
En otro aspecto, la divulgación describe una vacuna de Rotavirus en la forma de un comprimido de disolución rápida para la administración oral.
En otro aspecto, la divulgación describe una composición que comprende una cepa de Rotavirus atenuado vivo, en particular una cepa de Rotavirus humano, en la que la composición es un sólido liofilizado capaz de disolución inmediata cuando se coloca en la boca.
De manera adecuada, el comprimido de disolución rápida de acuerdo con la invención se disuelve en la boca del sujeto lo suficientemente rápido para prevenir la deglución del comprimido no disuelto. Este planteamiento es particularmente ventajoso para vacunas de Rotavirus pediátricas.
De manera adecuada, el virus es un Rotavirus humano atenuado vivo que se formula con un antiácido inorgánico tal como carbonato de calcio y un agente viscoso tal como goma xantano.Un aspecto adicional de la presente divulgación es la descripción de una formulación liofilizada en la que el componente de virus es cualquier cepa de rotavirus que se formula con carbonato de calcio y goma xantano.
Las vacunas para su uso de acuerdo con la invención se pueden formular y administrar mediante técnicas conocidas, usando una cantidad adecuada del virus vivo para proporcionar protección eficaz contra infección por Rotavirus sin efectos secundarios adversos significativos en las vacunas típicas. Una cantidad adecuada de virus vivo estará normalmente entre 104 y 107 unidades formadoras de focos (uff) por dosis. Una dosis típica de vacuna puede comprender 105 - 106 uff por dosis y se puede proporcionar en varias dosis durante un período de tiempo, por ejemplo en dos dosis proporcionadas con un intervalo de dos meses. Los beneficios pueden sin embargo obtenerse tomando más de 2 dosis, por ejemplo un régimen de 3 o 4 dosis, particularmente en países en vías de desarrollo. El intervalo entre dosis puede ser más o menos que dos meses de duración. Una cantidad óptima de virus vivo para una sola dosis o para un régimen de dosis múltiple, y programación óptima para las dosis, se puede determinar mediante estudios convencionales que implican la observación de títulos de anticuerpos y otras respuestas en sujetos.
La vacuna para su uso de acuerdo con la invención también puede comprender otros virus vivos adecuados para protección contra otras enfermedades, por ejemplo poliovirus. Como alternativa otras vacunas de virus vivo adecuadas para la administración oral se pueden proporcionar en una dosis separada pero en la misma ocasión que la composición de vacuna de Rotavirus de acuerdo con la invención.
Sueros de 12 niños de 4 a 6 meses de edad vacunados con el material de P33 como se describe en el artículo de Vaccine (1998) se ensayaron para neutralización de P33, P38, P43 y 89-12C2.
El intervalo de los títulos de neutralización de todos los sueros ensayados es similar para P33, P38 y P43. El análisis estadístico no muestra diferencia significativa en los títulos globales de neutralización contra los tres virus. Esto sugiere que los epítopos de neutralización conformacional y no conformacional de P33, P38 y P43 se reconocen igual de bien por los sueros anti-P33 de niños vacunados con P33. Esta observación indirectamente sugiere que los epítopos de neutralización revelados en este ensayo in vitro no estaban alterados entre P33, P38 y P43.
Sin embargo el intervalo de los títulos de neutralización de P89-12C2 difiere significativamente de P33, P38 and P43. Esta observación sugiere que los epítopos de neutralización conformacional y no conformacional de P33, P38 y P43 no son reconocidos igual de bien por los sueros anti-P33 de niños vacunados con P33. Esta observación sugiere indirectamente que los epítopos de neutralización revelados en este ensayo in vitro estaban alterados entre 89- 12 C2 y P33, P38 y P43.
Los fragmentos inmunogénicos se pueden definir en el contexto de la presente invención como fragmentos que cuando se administran a una dosis eficaz (o bien solos o como un hapteno unido a un vehículo) inducen una respuesta protectora inmune contra infección por Rotavirus.
5 Los siguientes ejemplos no limitantes, ilustran la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Demostración de que la cepa 89-12 en el subcultivo 26 (P26) es una mezcla de variantes
Se realizó la secuenciación de los genes VP4 y VP7 del subcultivo P26 (células AGMK primarias), subcultivo P33
10 (línea de células establecida AGMK (como opuestas a las primarias)), subcultivo P41 y subcultivo P43. La extracción del ARN total se transcribió inversamente y se amplificó mediante PCR en un tubo/una etapa.
Los cebadores Rota 5bis y Rota 29bis amplificaron el gen completo VP4 y los cebadores Rota 1 y Rota 2bis amplificaron el gen completo VP7. El material de PCR se ha secuenciado usando cebadores diferentes (véase la Tabla 1).
15 La secuencia del subcultivo P26 difería de la secuencia del subcultivo P33 en 3 bases (en las posiciones 501, 788 y 802 pares de bases a partir del codón de iniciación) en VP4 y en tres bases en VP7 (108, 605 y 897 pares de bases a partir del codón de iniciación).
Las exploraciones de la secuencia del subcultivo P26 de VP4 y VP7 muestran en posiciones mutadas la presencia de la secuencia del subcultivo P33 como un fondo. De este modo se puede ver que el subcultivo de subcultivo P26
20 es una mezcla de al menos 2 variantes.
Las exploraciones de la secuencia del subcultivo P33 parecen homogéneas en VP4 y heterogéneas para VP7 (véase la Tabla 2).
El subcultivo P38 (derivado del subcultivo 33) se subcultivó 5 veces sobre células Vero y mostró el mismo conjunto de secuencias VP4 y VP7 que el subcultivo P33 (línea de células de AGMK). De este modo no existía ningún cambio
25 principal en las poblaciones entre P33 y P38.
TABLA 1: Oligonucleótidos usados para RT-PCR y secuenciaciónTABLA 2: oligonucleótidos usados en hibridación
- nombre
- secuencia posición
- VP7
- Rota 1 GGC TTT AAA AGA GAG AAT TTC CGT CTG G (SEC ID Nº 11) -49 a –22
- Rota 1bis
- GGT TAG CTC CTT TTA ATG TAT GGT A (SEC ID Nº 12) -16 a 10
- Rota 2bis
- GGT CAC ATC GAA CAA TTC TAA TCT AAG (SEC ID Nº 13) 1014-988
- Rota 7
- CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G (SEC ID Nº 14) 266-287
- Rota 12
- TGT TGA TTT TTC TGT CGA TCC AC (SEC ID Nº 15) 372-394
- Rota 46
- GGT TGC TGA GAA TGA GAA ATT AGC TAT AGT GG (SEC ID Nº 16) 651-682
- Rota 18
- CCA CTA TAG CTA ATT TCT CAT TCT CAG CAA CC (SEC ID Nº 17) 682 - 651
- VP4
- Rota 5 TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC A (SEC ID Nº 18) 2-23
- Rota 6
- ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC (SEC ID Nº 19) 878 - 859
- Rota 5bis
- TGG CTT CAC TCA TTT ATA GAC A (SEC ID Nº 20) 2 - 23
- Rota 6bis
- ATT TCA GAC CAT TTA TAA CCT AG (SEC ID Nº 21) 878 - 856
- Rota 25
- GGA GTA GTA TAT GAA AGT ACA AAT AAT AG (SEC ID Nº 22) 268 - 296
- Rota 26
- CTA TTA TTT GTA CTT TCA TAT ACT ACT CC (SEC ID Nº 23) 296 - 268
- Rota 27bis
- TCG ATA CAG TAT AAG AGA GCA CAA G (SEC ID Nº 24) 721 - 745
- Rota 28
- TTC ATT AAC TTG TGC TCT CTT ATA CTG (SEC ID Nº 25) 753 - 727
- Rota 31
- GTA TAT GTA GAC TAT TGG GAT G (SEC ID Nº 26) 1048 - 1070
- Rota 32
- CAT CCC AAT AGT CTA CAT ATA C (SEC ID Nº 27) 1070 - 1048
- Rota 45
- TGT AAC TCC GGC AAA ATG CAA CG (SEC ID Nº 28) 1205 - 1227
- Rota 53
- CGT TGC ATT TTG CCG GAG TTA CA (SEC ID Nº 29) 1227 - 1205
- Rota 54
- GTA AGA CAA GAT TTA GAG CGC CA (SEC ID Nº 30) 1465 - 1487
- Rota 55
- TGG CGC TCT AAA TCT TGT CTT AC (SEC ID Nº 31) 1487 - 1465
- Rota 40
- CTT GAT GCT GAT GAA GCA GCA TCT G (SEC ID Nº 32) 1703 - 1727
- Rota 39
- CAG ATG CTG CTT CAT CAG CAT CAA G (SEC ID Nº 33) 1727 - 1703
- Rota 33
- CGA TCA TAT CGA ATA TTA AAG GAT G (SEC ID Nº 34) 2008 - 2032
- Rota 34
- CAT CCT TTA ATA TTC GAT ATG ATC G (SEC ID Nº 35) 2032 - 2008
- Rota 29bis
- AGC GTT CAC ACA ATT TAC ATT GTA G (SEC ID Nº 36) 2335 - 2311
- nombre
- secuencia posición
- VP7
- Rota 41 Rota 42 AGT ATT TTA TAC TAT AGT AGA TTA TAT TAA TC (SEC ID Nº 37) AGT ATT TTA TAC TAT GGT AGA TTA TAT TAA TC (SEC ID Nº 38) 882 - 913 882 - 913
- VP4
- Rota 15 Rota 16 Rota 35 Rota 36 ATC CCC ATT ATA CTG CAT TCC TTT C (SEC ID Nº 39) ATC CCT ATT ATA CTG CAT TTC TTT C (SEC ID Nº 40) ATC CCC ATT ATA CTG CAT TTC TTT C (SEC ID Nº 41) ATC CCT ATT ATA CTG CAT TCC TTT C (SEC ID Nº 42) 807 - 783 807 - 783 807 - 783 807 - 783
Las bases mostradas en letra negrita en la Tabla 2 son los sitios de variación de secuencia específica en VP4 y VP7.
TABLA 3: variación de secuencia de los genes VP4 y VP7
Tabla 3.1
- VP4
- VP7
- 501 pb 167 aa
- 788 pb 263 aa 802 pb 268 aa 108 pb 36 aa 605 pb 202 aa 897 pb 299 aa
- P26 (AGMK)
- A G / A G / A A C / T A
- P33 (AGMK)
- T A A G / A T / C A / G
- P38 (VERO)
- T A A A / G T G / A
- P43 (VERO)
- T A A A T A
N.B. En un segundo clon de los 3 clones que se desarrollaron hasta el nivel de lote de producción, el nucleótido de
la posición 897 pares de bases de VP7 es G, en lugar de A como en el clon seleccionado P43. Esto da como 10 resultado una metionina en lugar de una isoleucina en la secuencia de aminoácidos. Las variantes correspondientes a tanto el clon de P43 seleccionado como el clon en el que hay una G en VP7 a 897 pares de bases a partir del codón de iniciación, se excretaron en las deposiciones de niños que habían sido vacunados con el material P33.
En la Tabla 3.1, donde hay dos bases alternativas en una posición particular, la primera de las dos representa la base que aparece en la población mayoritaria y la segunda es la base que aparece en la población minoritaria. Las poblaciones variantes mayoritaria y minoritaria se juzgan por la fuerza de la señal en la secuenciación.
Tabla 3.2
- VP4
- VP7
- 501 pb
- 788 pb 802 pb 108 pb 605 pb 897 pb
- 167 aa
- 263 aa 268 aa 36 aa 202 aa 299 aa
- P26 (AGMK)
- Leu Gly/Glu Gly/Arg Arg Thr/Met Ile
- P33 (AGMK)
- Phe Glu Arg Arg/Arg Met/Thr Ile/Met
- P38 (VERO)
- Phe Glu Arg Arg/Arg Met Met/Ile
- P43 (VERO)
- Phe Glu Arg Arg Met Ile
Tabla 3.2 muestra los cambios de aminoácidos que se producen por las diferencias de nucleótidos entre las variantes.
10 TABLA 4
- VP4 ( posiciones 788 - 802)
- VP7 ( posición 897)
- G-G
- A-A A-G G-A A G
- Sondas
- Rota 15 Rota 16 Rota 35 Rota 36 Rota 41 Rota 42
- Subcultivos
- P26
- - + + + nd nd
- P33
- - + - - + + +
- P38
- - + - - + ++
- P43
- - + - - + -
El cambio en poblaciones entre los subcultivos P26 a P33 sobre células AGMK se ha confirmado adicionalmente mediante hibridación de transferencia en ranura. Los fragmentos de los genes VP4 y VP7 generados por RT/PCR se
15 hibridaron con sondas de oligonucleótidos específicas para cada variante (véase la Tabla 3.1 y 3.2). En contraste a P26 que se hibrida con Rota 16, Rota 35 y Rota 36 y no con Rota 15, el fragmento de la PCR de VP4 del material P33, en las posiciones 788 y 802 se hibridó solamente con Rota 16 y no con o bien Rota 15 o Rota 35 o Rota 36. Estos resultados establecían la presencia de al menos 3 variantes en P26 (véase la Tabla 4).
Para el fragmento de PCR de VP7 del material P33, posición 897 se hibridó con Rota 41 y Rota 42. Estos resultados 20 establecieron la presencia de al menos dos variantes en el material P33.
Ejemplo 2: Aislamiento y caracterización del clon P43
Para aislar los componentes de P33 como una población de virus homogénea, se realizaron tres diluciones de punto final de P33/AGMK sobre células Vero y el virus resultante se usó para infectar células Vero.
Se seleccionaron pocillos positivos usando dos criterios: crecimiento demostrado por el mayor número de focos
25 detectados en los pocillos y la mayoría de pocillos positivos aislados en las placas, como se hace de manera clásica. Después de 3 subcultivos de dilución final en placas de microtitulación de 96 pocillos, se amplificaron sucesivamente 10 pocillos positivos sobre células Vero y se evaluaron por su rendimiento.
Basado en el rendimiento, se desarrollaron tres clones hasta el nivel de subcultivo del lote de producción. El inmunorreconocimiento mediante anticuerpos policlonales se mostró que era similar tanto entre los tres clones como entre los clones y P33. La homogeneidad de los clones se determinó mediante hibridación de transferencia en ranura. La selección final de un solo clon se basó en el rendimiento y secuencia.
El clon seleccionado se amplificó mediante pases sucesivos sobre células Vero para generar una semilla Maestra, una semilla de Trabajo y finalmente lotes de producción.
El clon seleccionado se caracterizó genéticamente a niveles de subcultivo diferentes mediante la secuenciación de VP4 y VP7 (identidad) y mediante hibridación de transferencia en ranura específica del VP4 y VP7 (homogeneidad) de los materiales amplificados por la PCR. Las secuencias de los genes VP4 y VP7 del material P43 se proporcionan en las Figuras 1 y 3 respectivamente y son idénticas a P41.
La homogeneidad del clon seleccionado se determinó mediante hibridación selectiva usando sondas de oligonucleótidos que discriminan los cambios de nucleótidos en las regiones VP4 y/o VP7 para cada variante identificada durante la secuenciación de P26/ AGMK primarias (véase la tabla 4).
El fragmento VP4 se hibridó con Rota 16 y no con Rota 15, Rota 35 o Rota 36. El fragmento VP7 se hibridó con Rota 41 y no con Rota 42.
Estos resultados confirman que P43 es una población homogénea.
Ejemplo 3: Retirada de potenciales virus inesperados
Se añadió éter a P33 (cultivadas en AGMK) hasta una concentración final de 20 % durante 1 hora. Después se retiró el éter mediante burbujas con N2 durante 35 minutos. No se observó ningún impacto sobre la titulación de la semilla de P33.
Ejemplo 4: Formulación de una vacuna atenuada viva
Los lotes de producción descritos anteriormente se formulan para administración oral a niños mediante el siguiente procedimiento.
1. Virus liofilizado
Se usan técnicas convencionales para preparar dosis de virus. Se descongela una masa viral purificada congelada y se diluye con composición de medio apropiada, en este caso Medio de Eagle modificado por Dulbecco, hasta una concentración viral convencional deseada, en este caso 106,2 uff/ml. El virus diluido se diluye después adicionalmente con estabilizador de liofilización (sacarosa 4 %, dextrano 8 %, sorbitol 6 %, aminoácido 4 %) hasta la titulación viral diana, en este caso 105,6 uff/dosis. Se transfieren de manera aséptica alícuotas de 0,5 ml de composición de virus estabilizada a viales de 3 ml. Cada vial se cerró después parcialmente con un tapón de caucho, la muestra se seca por congelación a vacío, después el vial se cierra completamente y se engasta una tapa de aluminio en el sitio alrededor del vial para mantener el tapón en el sitio.
Para uso, el virus se reconstituye usando uno de los siguientes reconstituyentes antiácidos:
- (a)
- Reconstituyente de citrato
Se disuelve citrato sódico en agua, se esteriliza mediante filtración y se transfiere de manera aséptica en recipientes reconstituyentes en cantidades de 1,5 ml a una concentración de 544 mg de Na3Citrato.2H2O por dosis de 1,5 ml. Los recipientes reconstituyentes pueden ser por ejemplo viales de 3 ml, o viales de 4 ml, o jeringas de 2 ml, o cápsulas que se pueden comprimir plásticas blandas para la administración oral. Como una alternativa para mantener los componentes estériles en condiciones estériles, el recipiente final se puede esterilizar en autoclave.
- (b)
- Reconstituyente de Al(OH)3
Una suspensión de hidróxido de aluminio aséptica (marca registrada - Mylanta) se diluye de manera aséptica en agua estéril, se transfiere de manera aséptica a recipientes reconstituyentes (por ejemplo jeringas de 2 ml, o cápsulas que se pueden comprimir plásticas blandas) en cantidades de 2 ml que contiene cada una de ellas 48 mg de Al(OH)3. Una alternativa a usar componentes estériles en condiciones estériles es irradiar con rayos γ la suspensión de hidróxido de aluminio (preferiblemente en una fases diluida).
Se incluyen ingredientes convencionales para evitar que la suspensión se sedimente. Tales ingredientes convencionales incluyen por ejemplo estearato de magnesio, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, y polímeros de silicona. También se pueden incluir agentes bacteriostáticos por ejemplo, butilparabeno, propilparabeno u otros agentes bacteriostáticos convencionales usados en alimentación, y aromatizantes.
2. Virus liofilizados con Al(OH)3 en formulación líquida
Se usan técnicas convencionales para preparar dosis de virus. Se descongela una masa viral purificada congelada y se diluye con composición de medio apropiada, en este caso Medio de Eagle modificado por Dulbecco, hasta una concentración viral convencional deseada, en este caso 106,2 uff/ml. Se añade suspensión de hidróxido de aluminio
5 hasta alcanzar una cantidad final de 48 mg/dosis y la composición de virus se diluye con estabilizador de liofilización (sacarosa 4 %, dextrano 8 %, sorbitol 6 %, aminoácido 4 %) hasta el título viral diana, en este caso 105,6 uff/dosis. Se transfieren asépticamente alícuotas de 0,5 ml de composición de virus estabilizado a viales de 3 ml. La liofilización y cierre de los viales se lleva después a cabo como se ha descrito en la parte 1.
3. Virus liofilizados con Al(OH)3 para presentación de blíster
10 Se usan técnicas convencionales para preparar dosis de virus. Se descongela una masa viral purificada congelada y se diluye con composición de medio apropiada, en este caso Medio de Eagle modificado por Dulbecco, hasta una concentración viral convencional deseada, en este caso 106,2 uff/ml. Se añade suspensión de hidróxido de aluminio hasta alcanzar una cantidad final de 48 mg/dosis y la composición de virus se diluye con estabilizador de liofilización que puede ser sacarosa, dextrano o aminoácido 4 %, o gelatina, o peptona vegetal, o xantano hasta la titulación viral
15 diana de 105,6 uff/dosis. Se emplea una operación de llenado aséptico para transferir dosis de 0,5 ml o preferiblemente menores a cavidades blíster. La composición se liofiliza, y las cavidades blíster se sellan mediante sellado térmico.
Se incluyen opcionalmente ingredientes convencionales para prevenir que la suspensión de hidróxido de aluminio se sedimente. Tales ingredientes convencionales incluyen por ejemplo estearato de magnesio, carboximetilcelulosa, 20 hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, y polímeros de silicona. También se pueden incluir aromatizantes.
Ejemplo 5. Titulación viral de Rotavirus para diversas formulaciones
Tabla 5
- Nº de lote
- Composición de formulación Titulación viral antes de la liofilización Titulación viral después de la liofilización y 1 semana a 37 °C
- 98G06/01
- Lactosa:2 %; Dextrano:4 %; 105,22 104,67
- Sorbitol:3 %;
- Aminoácidos:2 %
- 98G06/03
- Sacarosa:2 %; Dextrano:4 %; 105,28 104,92
- Sorbitol:3 %;
- Aminoácidos:2 %
25 El Rotavirus P43 se formuló o bien con sacarosa o con lactosa como se ha mostrado en la tabla anterior.
La titulación viral antes de la liofilización es la titulación viral en el líquido formulado completo (que contiene sacarosa dextrano sorbitol aminoácidos) y sin la etapa de liofilización. Buenos resultados son aquellos en los que se logran una disminución <0,5 log en la etapa de liofilización y una
disminución <0,5 log durante la “1 semana a 37 °C” (ensayo de estabilidad acelerada). 30 La precisión de la titulación viral es aproximadamente + o - 0,2 log.
Los resultados indican que se puede usar sacarosa en lugar de lactosa.
Tabla 6
- Nº de lote
- Composición de formulación Titulación viral en el momento = 0 después de la liofilización Titulación viral después de la liofilización y 1 semana a 37 °C
- 98L16/01
- Lactosa:2 %; Dextrano:4 %; Sorbitol:3 %; Aminoácidos:2 % 104,8 104,8
- 98L16/02
- Lactosa:2 %; Dextrano:4 %; Sorbitol:3 %; Aminoácidos:2 % Arginina: 3 % 104,8 104,9
- 98L16/04
- Lactosa:2 %; Dextrano:4 %; Maltitol:3 %; Aminoácidos:2 % Arginina: 3 % 104,7 105
5 Los resultados demuestran que la adición de arginina (que se sabe que mejora la estabilidad del virus durante la liofilización y también proporciona un medio básico con el fin de compensar la acidez del estómago) mantiene la titulación viral.
El sorbitol tiende a disminuir la temperatura de transición vítrea de la torta liofilizada en tanto como un grado. Esto se puede superar usando maltitol en lugar de sorbitol como se ha mostrado anteriormente y la titulación viral se
10 mantiene todavía.
Este experimento demuestra que son posibles una serie de formulaciones.
Tabla 7
- Nº de lote
- Composición de formulación Titulación viral antes de la liofilización Titulación viral después de la liofilización y 1 semana a 37 °C
- 99C11/01
- Sacarosa:2 %; Dextrano:4 %; Sorbitol:3 %; Aminoácidos:2 % 105,24 105,07
- 99C11/02
- Sacarosa:2 %; 105,09 104,92
- Dextrano:4 %;
- Maltitol:3 %;
- Aminoácidos:2 %
- 99C11/04
- Dextrano:4 %; 104,89 105,06
- Maltitol:3 %;
- Aminoácidos:2 %
- Nº de lote
- Composición de formulación Titulación viral en el momento = 0 después de la liofilización Titulación viral después de la liofilización y 1 semana a 37°C
- 99C17/01
- Sacarosa:2 %; Dextrano:4 %; Sorbitol:3 %; Aminoácidos:2 % 105,40 105,41
- 99C17/02
- Sacarosa:2 %; Dextrano:4 %; Sorbitol:1,5 %; Aminoácidos:2 % 105,30 104,93
- 99C17/03
- Sacarosa:2 %; Dextrano:4 %; Aminoácidos:2 % 105,31 105,24
- 99C17/04
- Sacarosa:2 %; Dextrano:4 %; Maltitol:3 %; Aminoácidos:2 % 10 4,42 10 4,45
- 99C17/05
- Sacarosa:2 %; Dextrano:4 %; Maltitol:1,5 %; Aminoácidos:2 % 104,39 104,40
- 99C17/06
- Sacarosa:2 %; Dextrano:4 %; Sorbitol:3 %; 105,44 104,97
- 99C17/07
- Sacarosa:2 %; 105,11 104,89
- Dextrano:4 %;
- Sorbitol:1,5 %;
Tabla 8
- Rotavirus
- Al(OH)3 H2O Tiempo de contacto a temperatura ambiente Centrifuga- ción Titulación viral del sobrenadante en uff/ml Titulación viral de los sedimentos en uff/ml
- 105,6 uff/ml
- 48 mg en 0,240 ml 0,76 ml 30 min 8000 rpm, 10 min 103,66
- 105,6 uff/ml
- 0,48 mg en 0,240 ml 0,76 ml 30 min 8000 rpm, 10 min 104,41
- 105,6 uff/ml
- 1 ml 30 min 8000 rpm, 10 min 105,68
- Rotavirus en torta liofilizada
- 12 mg en 0,120 ml 1,380 ml 30 min 8000 rpm, 10 min Por debajo de la detección 104,7
Se usa Al(OH)3 como un antiácido. Esto muestra que el Rotavirus está asociado con la sal inorgánica insoluble de (Al(OH)3) ya que se centrifuga con el Al(OH)3 (disminución de actividad viral en el sobrenadante).
Tabla 9
- Muestras virales
- Disolución Condiciones Titulaciones virales uff/ml
- formulación líquida 99B10/06 antes de la liofilización; 105.43
- 1,5 ml de CitratoNa3 24 h a ambiente temperatura 105,11
- 99B10/06:liofilizado 105,43
- 1,5 ml de CitratoNa3 24 h a ambiente temperatura 104,53
Cuando el Rotavirus está asociado al Al(OH)3, es posible liofilizar todo (incluyendo el Al(OH)3). Después de la 5 liofilización es posible recuperar Rotavirus disolviendo Al(OH)3 en citrato sódico. Esta etapa no daña el Rotavirus y retiene su actividad después de la etapa de disolución.
El mecanismo de la liberación de virus (mediante disolución del vehículo) se puede muy bien producir in vivo. De hecho, por debajo de pH 6, el hidróxido de aluminio se llega a hacer completamente soluble, y de esta manera, el 10 Rotavirus se liberará en el estómago.
Al(OH)3 + 3 H+ --- Al+++ (soluble en agua) + 3 H2O
En el estómago, los iones Al+++ no se absorben (J.J. Powell, R. Jugdaohsingh y R.P.H. Thompson, The regulation of mineral adsorption in the gastrointestinal track, Proceedings of the Nutrition Society (1999), 58, 147 - 153).
En el intestino, debido al incremento del pH, las formas insolubles de aluminio se precipitan (Al(OH)3 o AlPO4), y se 15 eliminan por la forma natural.
Se desconoce si el precipitado Al(OH)3 (o AlPO4) nuevamente formado será capaz de reasociarse con los Rotavirus libres. Esto hace surgir la cuestión de la infecividad de la propia asociación Al(OH)3-Rotavirus.
La liberación del Rotavirus de la asociación Al(OH)3-Rotavirus por otros mecanismos es también posible. La lisina, por ejemplo, interfiere con la adsorción viral sobre Al(OH)3.
20 Otros aniones como borato, sulfato, carbonato y fosfato se conoce que se adsorben específicamente sobre hidróxido de aluminio, de este modo, teóricamente, debe ser posible desplazar (mediante competición por el sitio de adsorción) Rotavirus de la asociación Al(OH)3-Rotavirus.
De este modo, se puede liberar Rotavirus de la asociación Rotavirus - Al(OH)3 y el Rotavirus liberado permanece activo.
Esta liberación se puede hacer o bien disolviendo Al(OH)3 (por HCl en el estómago, o por CitratoNa3 in vitro) o desplazando el Rotavirus por un aminoácido básico (por ejemplo lisina).
Se reconstituyó una única dosis de Rotavirus liofilizado con agua y se dividió en dos partes. La primera parte, considerada como referencia, recibió un volumen adicional de agua. La segunda parte recibió 24 mg de Al(OH)3 se suspendió en 0,240 ml de agua (titulaciones virales preclínicas).
DRVC003A46
+
1,5 ml H2O
0,750 ml 0,750 ml
+ +
0,240 ml H2O 24 mg Al(OH)3
en 0,240 ml
1 hora 1 hora
10 Cuando está presente Al(OH)3, el Rotavirus está activo y el valor de titulación viral es mayor comparado con la muestra de referencia.
Este experimento se repitió sin dividir la dosis liofilizada, y añadiendo 12 mg de Al(OH)3 o 24 mg de Al(OH)3.
Aquí la muestra de referencia era la reconstituida con un tampón Citrato-Bicarbonato. De este modo, la titulación
viral es otra vez mayor en la presencia de Al(OH)3.
DRVC003A46
+
1,5 ml de tampón WL
DRVC003A46
+
12 mg de Al(OH)3
en 0,120 ml
+
1,380 ml H2O
6,24
DRVC003A46
+
24 mg de Al(OH)3
en 0,240 ml
+
1,260 ml H2O
6,05
6,26
Como en el ejemplo anterior, el Rotavirus se asocia con las partículas de Al(OH)3, ya que el virus se puede desechar por centrifugación. DRVC003A46 es un Rotavirus formulado liofilizado (Sacarosa: 2 %; Dextrano: 4 %, Sorbitol: 3 %; aminoácidos: 2 %).
De acuerdo con la titulación viral llevada a cabo sobre el sobrenadante, la cantidad de Al(OH)3 necesaria para adsorber el Rotavirus parece ser baja (comenzando con una dosis liofilizada de 5,7 log) aumentada a escala la titulación viral):
Tabla 10
- Al(OH)3
- Tiempo de adsorción Titulación en el sobrenadante
- 12 mg
- 1 hora a T. A. 2,7
- 24 mg
- 1 hora a T. A. 3,4
- 48 mg
- 1 hora a T. A. 3,4
- 72 mg
- 1 hora a T. A. 2,0
- 96 mg
- 1 hora a T. A. por debajo de la detección
- 12 mg
- Durante toda una noche 2,7
- 24 mg
- Durante toda una noche por debajo de la detección
- 48 mg
- Durante toda una noche 2,5
- 12 mg
- inmediato por debajo de la detección
- 24 mg
- Inmediato 2,0
- 48 mg
- Inmediato por debajo de la detección
El tiempo necesario para adsorber Rotavirus sobre Al(OH)3 parece ser corto: Una dosis de Rotavirus liofilizado se reconstituyó en presencia de 24 mg de Al(OH)3, y se centrifugó después de 0, 15, 60 min y 24 horas. El “Sedimento” se volvió a suspender en SDSAA antes de la titulación viral: Tabla 11
- Tiempo
- Sedimento Sobrenadante
- 0 min
- 5,26 3,17
- 15 min
- 5,34 <1,44
- 60 min
- 5,96 <1,44
- 24 horas
- 6,13 <1,44
Con el fin de evitar aluminio en la vacuna, el antiácido Al(OH)3 se reemplazó por otra sal inorgánica insoluble: CaCO3 (carbonato de calcio).
10 Los fenómenos observados con CaCO3 son paralelos a los descritos para Al(OH)3:
- -
- Asociación de Rotavirus con la sal inorgánica;
- -
- Mantenimiento de la actividad de Rotavirus cuando está asociado con la sal inorgánica;
- -
- Posibilidad de liberación de Rotavirus de la asociación mediante disolución de la base inorgánica por un ácido;
- -
- Posibilidad de coliofilización del antiácido y el Rotavirus. 15 Asociación de CaCO3 y Rotavirus
En el primer ensayo, Rotavirus liofilizado (titulación viral 5,7) se reconstituyó con una suspensión de CaCO3 en agua (50 mg en 1,5 ml); y después se centrifugó y la titulación viral del sobrenadante se comparó con el sedimento.
DRVC003A46
+
50mg CaCO3
en
1,5 ml H2O
+
Centrifugación
8000 rpm 10 min
DRVC003A46
+
50 mg CaCO3
en
1,5 ml H2O
+
Centrifugación
8000 rpm 10 min
- Sedimento
- Sobrenadante Sedimento Sobrenadante
- +
- +
- 1,5 ml
- 1,5 ml
- SDSAA
- Citrato Na
Esto indica que más del 90 % del Rotavirus está asociado a CaCO3.
También, cuando el virus estaba asociado, fue posible realizar la titulación y recuperar las cantidades virales
originales.
También, las titulaciones virales son ligeramente mayores que las obtenidas sin CaCO3.
DRVC003A46
+
1,5 ml H2O
+
Centrifugación
8000 rpm 10 min
DRVC003A46
+
1,5 ml
tampón W.L
5,35
“Sedimento Sobrenadant
Se reconstituyó Rotavirus con una suspensión de CaCO3 en agua (1,5 ml): 10 mg 50 mg 100 mg
y después se centrifugó, y la titulación viral del sobrenadante se comparó con el sedimento. Tabla 12
- CaCO3
- Extempo + Centri. 1 Hora + Centri
- Sedimento
- Sobrenadante Sedimento Sobrenadante
- 100 mg
- 4,57 3,01 4,79 3,09
- 50 mg
- 4,17 4,15 4,22 3,86
- 10 mg
- 3,17 4,77 3,87 4,87
5 De este modo, está claro que más CaCO3 y más virus se asocia, y se encuentra menos en el sobrenadante.
Sin embargo, la dosis total no se recupera completamente (se espera un total de 5,3 al menos o incluso 5,8 como se ha obtenido antes, véase anteriormente).
Protección por CaCO3 de Rotavirus durante titulación de antiácido Rossett-Rice en bebés
Usando 10 dosis de Rotavirus liofilizado (DRVC003A46) y 50 mg de CaCO3, se llevaron a cabo dos tipos de 10 titulación por Rossett-Rice en bebés:
En una titulación clásica por Rossett- Rice, el antiácido se mezcla con Rotavirus y se vierte HCl en este medio.
En la titulación Rossett-Rice en bebés “inversa”, la situación es la inversa: se añade gota a gota antiácido en el
conjunto de HCl (como se produce in vivo).
Tabla 13
- Titulación clásica de Rossett-Rice en bebés
- Rotavirus liofilizado almacenado a:
- Tampón Titulación viral teórica Titulación viral medida
- 4°C
- 60 mg de CaCO3 5,3 4,6
- -80°C
- 60 mg de CaCO3 5,3 4,6
- 4°C
- 24 mg de Al(OH)3 5,4 <2,9
- -80°C
- 24 mg de Al(OH)3 5,4 <2,9
- Titulación inversa por Rossett-Rice en bebé
- Rotavirus liofilizado almacenado a:
- Tampón Titulación viral teórica Titulación viral medida
- 4°C
- 60 mg de CaCO3 5,3 4,6
- -80°C
- 60 mg de CaCO3 5,3 4,6
- 4°C
- 24 mg de Al(OH)3 5,4 <2,9
- -80°C
- 24 mg de Al(OH)3 5,4 <2,9
De este modo, en este experimento in vitro, el carbonato de calcio es capaz de proteger aproximadamente 20 % de Rotavirus de la presencia de HCl, mientras el hidróxido de aluminio no es capaz de hacerlo.
Tabla 14
- Nº de lote
- Composición Titulación viral en el momento = 0 después de la liofilización Titulación viral después de la liofilización y 1 semana a 37°C
- 99K08/01
- Sacarosa: 2 % Dextrano: 4 % Sorbitol: 3 % aminoácidos: 2 % CaCO3: 50 mg 105,28 105,10
- 99K08/02
- Sacarosa: 2 % Dextrano: 4 % Sorbitol: 3 % Aminoácidos: 2 % CaCO3: 60 mg 105,16 105,15
- 00C24/01
- Sacarosa: 2 % Dextrano: 4 % Sorbitol: 3 % Aminoácidos: 2 % CaCO3: 60 mg Xantano 0,3 % 105,07 104,69
- 00C24/03
- Sacarosa: 2 % Dextrano: 4 % Sorbitol: 3 % Aminoácidos: 2 % CaCO3: 60 mg Xantano 0,3 % 105,07 104,85
- 00E09/25
- Sacarosa: 2 % Dextrano: 4 % Sorbitol: 3 % Aminoácidos: 2 % CaCO3: 60 mg Xantano 0,25 % 105,03 104,91
- 00E09/30
- Sacarosa: 2 % 105,01 104,87
- Dextrano: 4 %
- Sorbitol: 3 %
- Aminoácidos: 2 %
- CaCO3: 60 mg
- Xantano 0,30 %
- 00F26/06
- Sacarosa: 2 % Dextrano: 4 % 104,50 104,70
- Sorbitol: 3 %
- Aminoácidos: 2 %
- CaCO3: 60 mg Almidón: 2 %
Esta es la liofilización de “todo en uno” de Rotavirus y antiácido (CaCO3) juntos en el mismo vial. Para evitar la sedimentación de CaCO3 durante la etapa de llenado, son necesarios agentes viscosos. Los ejemplos de tales agentes viscosos incluyen goma Xantano y almidón. La actividad de Rotavirus se mantiene incluso en la presencia de goma Xantano y almidón.
Las siguientes formulaciones demuestran el concepto “lyoc”. Es decir, la disolución rápida de la torta liofilizada en la boca.
Tabla 15
- Nº de lote
- Composición de formulación Titulación viral antes de la liofilización Titulación viral después de la liofilización y 1 semana a 37°C
- 99B10/06
- Sacarosa 4 % glutamato de sodio 3,7 % Al(OH)3 48 mg 105,11 104,53
- 99C11/12
- Maltitol 3 % Al(OH)3 48 mg hidroxipropilmetil celulosa: 1 % 104,16 103,79
- Nº de lote
- Composición de formulación Titulación viral en el momento = 0 después de la liofilización Titulación viral después de la liofilización y 1 semana a 37°C
- 00C24/05
- Sacarosa: 2 % Dextrano: 4 % Sorbitol: 3 % Aminoácidos: 2 % CaCO3: 60 mg Xantano 0,3 % 105,02 104,54
- 00C24/06
- Sacarosa: 2 % Dextrano: 4 % Sorbitol: 3 % Aminoácidos: 2 % CaCO3: 60 mg Xantano 0,3 % 104,86 104,56
- 00F26/11
- Sacarosa: 1 % Dextrano: 2 % Sorbitol: 1,5 % Aminoácidos: 1 % CaCO3: 60 mg Almidón: 2 % 104,70 104,40
En el “concepto lyoc” se puede usar tanto Xantano como almidón (manteniendo las propiedades de disolución rápida de la torta liofilizada).
Ejemplo 6: Uso de carbonato de calcio como el antiácido para la composición de vacuna de Rotavirus
Cuando se usa una suspensión de CaCO3 en agua como el antiácido para el Rotavirus existe un problema porque las partículas de carbonato de calcio sedimentan rápidamente cuando se colocan en agua ya que el valor de la densidad de polvo se aproxima a 2,6 y el tamaño medio de partícula es 30 µm. Esta sedimentación se puede ralentizar mediante:
1 incremento de la densidad del medio circundante
2 incremento de la viscosidad del medio circundante
3 reducción del tamaño de partícula
4 mantenimiento de las partículas separadas entre sí
Cuando la suspensión en agua de CaCO3 (cuando se coloca en la jeringa) se coloca en la torta liofilizada (que contiene sacarosa 2 %, dextrano 4 %; sorbitol 3 %; aminoácidos 2 %) se incrementa la densidad del medio circundante pero la velocidad de sedimentación de CaCO3 no es muy diferente a la de la suspensión en agua de CaCO3.
Excipientes pseudoplásticos
Una solución pseudoplástica se define como una solución que tiene una viscosidad mayor en reposo cuando se compara con su viscosidad en agitación. Los excipientes usuales de este tipo son: Polímeros naturales, por ejemplo: goma arábiga goma adragante agar-agar alginatos pectinas Polímeros semisintéticos, por ejemplo: carboximetilcelulosa (Tyloses C®) metilcelulosa (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® y MB®) hidroxipropilcelulosa (Klucels®) hidroxipropilmetilcelulosa (Methocels E® y K®, Viscontrans MPHC®) En general dichos excipientes pseudoplásticos se usan junto con agentes tixotrópicos.
Excipientes pseudoplásticos con baja capacidad de fluir
Esos polímeros, a una concentración suficiente, dan lugar a una disposición de fluido estructural que da como resultado una solución de alta viscosidad que tiene capacidad de fluir baja en reposo. Una cierta cantidad de energía necesita proporcionarse al sistema para dejar que fluya y se transfiera. Son necesarias energías externas (agitación) para destruir temporalmente la disposición de fluido estructural con el fin de obtener una solución fluida.
Ejemplos de dichos polímeros son Carbopols ® y goma xantano.
Excipientes tixotrópicos
Con estos excipientes, en reposo, se obtiene una estructura de gel; mientras en agitación se obtiene una solución fluida.
Los ejemplos de excipientes tixotrópicos son: Veegum ® (silicato de magnesio y aluminio) y Avicel RC® (aproximadamente 89 % de celulosa microcristalina y 11 % de carboximetilcelulosa de Na).
Una reducción del tamaño de partículas de CaCO3 dio como resultado una disminución de la capacidad antiácido del compuesto.
5 Este es el caso en Veegum® y Avicel® para los que partículas insolubles más pequeñas (aproximadamente 1 µm) que las partículas de CaCO3, se colocan entre las partículas de CaCO3 con el fin de prevenir la agregación.
Ejemplo 7: Diseño de producto
Los siguientes esquemas demuestran los ejemplos de posibles diseños de producto.
7. 1 CaCO3 en la jeringa
10 Teniendo ya lotes clínicos de Rotavirus en viales liofilizados, el antiácido se puede colocar en el líquido reconstituyente contenido en la jeringa.
Jeringa con 1,3 ml de CaCO3 (60 mg/ml)
Aguja
rotavirus liofilizado
En esta presentación del producto, la sedimentación de CaCO3 debe estar bajo control no solamente durante las etapas de llenado, sino también durante la vida útil completa del producto (al menos 2 años).
15 7. 2 CaCO3 en el vial liofilizado
jeringa con 1,3 de agua
aguja
7.3. Liofilización en un blíster
En este caso el Rotavirus, CaCO3 y goma Xantano se liofilizan juntos directamente en el blíster.
Ejemplo 8: Liofilización de cepa diferente de Rotavirus
Tabla 16
- Nº de lote
- Cepa de Rotavirus Composición de formulación Titulación viral en el momento = 0 después de la liofilización Titulación viral después de la liofilización y 1 semana a 37 °C
- 00F26/01
- G1 SB purif n°61 PRO/0232 Sacarosa: 2 % Dextrano: 4 % Sorbitol: 3 % Aminoácidos: 2 % 104,6 104,7
- 00F26/02
- G2 (DS-1) Sacarosa: 2 % Dextrano: 4 % Sorbitol: 3 % Aminoácidos: 2 % 104,4 104,4
- 00F26/03
- G3(P) Sacarosa: 2 % Dextrano: 4 % Sorbitol: 3 % Aminoácidos: 2 % 104,6 104,5
- 00F26/04
- G4 (VA-70) Sacarosa: 2 % Dextrano: 4 % Sorbitol: 3 % Aminoácidos: 2 % 104,8 104,8
- 00F26/05
- G9 (W161) Sacarosa: 2 % Dextrano: 4 % Sorbitol: 3 % Aminoácidos: 2 % 104,6 104,5
5 Las cepas DS-1, P y VA70 se describen como cepas de referencia de Rotavirus humanos para el serotipo G2, G3 y G4 respectivamente en la página 1361 de “Fields” Raven press 1990, segunda edición.
En este experimento se han liofilizado cepas de Rotavirus diferentes.
Para todas, se ha mostrado tanto que se ha mantenido la titulación viral durante la liofilización como la estabilidad
acelerada (una semana a 37 ºC).
10 Ejemplo 9: Estudio de seguridad de fase I en adultos de una administración oral de la vacuna de Rotavirus.
Se llevó a cabo un estudio de fase I para determinar la seguridad y reactogenicidad de una única dosis oral de 106,0
uff de la vacuna de P43 en adultos sanos de 18 a 45 años de edad.
El ensayo clínico era doble ciego y aleatorio. Estaba controlado por placebo y auto-contenido. El estudio se realizó en un único centro en Bélgica.
9.1. Población de estudio
Un total de 33 sujetos, 11 en el grupo placebo y 22 en el grupo de vacuna, se alistaron y todos completaron el 5 estudio. Todos los voluntarios eran caucásicos. Su edad media en el momento de la vacunación era 35,3 años, con un intervalo de 18 a 44 años. El ensayo comenzó en enero y se desarrolló durante poco más de un mes.
Vacuna Se produjeron lotes clínicos de vacuna de P43, se purificaron, se formularon y se liofilizaron de acuerdo a las
10 Buenas Prácticas de Fabricación. Los lotes fueron liberados por Control de calidad y Seguridad de Calidad. Cada vial de vacuna contenía los siguientes componentes: Ingrediente activo:
Cepa P43 Min. 105,8 uff
Excipientes, estabilizantes: Sacarosa 9 mg Dextrano 18 mg Sorbitol 13,5 mg Aminoácidos 9 mg
15 Placebo Se prepararon viales de placebo y se liberaron. Cada vial de placebo contenía los siguientes componentes: Excipientes, estabilizantes: Sacarosa 9 mg Dextrano 18 mg Sorbitol 13,5 mg Aminoácidos 9 mg Diluyente
20 Se usó agua para inyección como diluyente para reconstituir la vacuna y placebo.
Aproximadamente 10 a 15 minutos antes de la administración de la vacuna o del placebo, a los sujetos de ambos grupos se les administraron 10 ml de Mylanta® por vía oral. Mylanta® es un antiácido registrado. El antiácido incrementa el pH del estómago y evita la inactivación del Rotavirus durante su pase a través del estómago.
25 Para preparar la vacuna, dos viales de P43 liofilizado que contenía 105,8 uff por vial se reconstituyeron con 1,5 ml del diluyente agua para inyección. Esto logró una titulación viral calculada de 106,1 uff por dosis. La vacuna reconstituida se administró prontamente como una única dosis oral.
Para preparar el placebo, dos viales de placebo liofilizado se reconstituyeron con 1,5 ml de agua para inyección y se administró por vía oral como una única dosis.
30 9.4. Seguridad y reactogenicidad Los siguientes criterios de seguridad y reactogenicidad se aplicaron. Los síntomas generales inducidos fueron fiebre, diarrea, vómitos, nauseas, dolor abdominal y pérdida de apetito. Se
registraron durante ocho días después de la administración.
Los síntomas no inducidos se registraron durante 30 días después de la administración.
Los episodios adversos graves se registraron durante el período completo de estudio.
Las muestras de diarrea se recogieron durante ocho días después de la administración.
5 Los resultados fueron:
No se registraron síntomas inducidos, ni síntomas no inducidos ni episodios adversos graves durante los períodos
de observación respectivos.
No se registraron casos de diarrea.
10 La vacuna de P43 de SB Biologicals era segura con relación al placebo cuando se administraba por vía oral de una manera doble ciego como una única dosis a la dosis de 106,1 uff a voluntarios adultos sanos de 18 a 44 años de edad.
Ejemplo 10 - Eficacia de dos dosis de una vacuna de Rotavirus monovalente humana, que contiene RIX 4414 en la prevención de gastroenteritis debida a Rotavirus G1 y no-G1 (G9)
15 10.1. Procedimientos
Un ensayo de fase II aleatorio, doble - ciego, controlado por placebo se llevó a cabo en Latinoamérica para evaluar la eficacia protectora de una vacuna (cepa de Rotavirus humano RIX4414) derivada de la cepa humana 89-12 de G1P[8] para inmunización de niños. La vacuna RIX4414 comprende como componente de Rotavirus la cepa humana atenuada de G1P[8] depositada como ECACC depósito 99081301 (documento WO 01/12797).
20 Composición de vacuna (Tabla 17)
La vacuna de HRV o placebo se preparó para administración mediante la inyección del contenido entero de una jeringa llenada previamente que contenía el tampón de carbonato cálcico en el vial del producto liofilizado (vacuna o placebo). El vial se agitó para resuspender la vacuna/placebo. El volumen entero del producto resuspendido se recogió en la misma jeringa, la aguja se desechó y el producto resuspendido se administró prontamente como una
25 única dosis oral (aproximadamente 1,0 ml).
Tabla 17 - Composición de vacuna de Rotavirus RIX4414
- Ingredientes Cantidad (por dosis nominal: 1 ml)
- Ingrediente activo RIX4414 105,8 uff/dosis
- Excipientes Vacuna liofilizada en vial de vidrio Sacarosa 9 mg Dextrano 18 mg Sorbitol 13,5 mg Aminoácidos 9 mg Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) 2,25 mg Diluyente líquido (basado en CaCO3) en la jeringa llenada previamente Carbonato de calcio 60 mg Xantano 2,5 mg Agua para inyecciones c. s. para 1 ml
Administración de vacunas
Niños sanos (493) recibieron dos dosis de la vacuna de Rotavirus RIX4414 a una concentración viral de 105,8 uff por dosis, o placebo (504) a una edad de 2 y 4 meses, simultáneamente con vacunas DTPw-HBV y Hib. Se proporcionaron tres dosis de OPV (vacuna de virus del polio oral) con una separación de 2 semanas de la vacuna de 5 estudio, es decir, no se administraron durante el período que comienza 2 semanas antes de cada dosis de vacuna de estudio y que termina 2 semanas después. Otros dos grupos recibieron 2 dosis de la vacuna de Rotavirus RIX4414 a diferentes concentraciones virales: 104,7 uff y 105,2 uff. Se ensayaron muestras de diarrea para determinar la presencia de Rotavirus (ELISA) y se determinaron los serotipos en muestras positivas (RT-PCR). Los episodios de diarrea reseñados a partir de dos semanas después de la segunda dosis se consideraron para el análisis de
10 eficacia. La gravedad se determinó usando una escala de 20 puntos (Ruuska y Vesikari, 1990). El sistema de puntuación de 20 puntos usado para determinar la gravedad de cada episodio de diarrea en este estudio se muestra más adelante en la tabla 18. Una puntuación 11 definía una enfermedad grave.
Tabla 18
- Experiencia adversa
- Puntos
- Duración de deposiciones más sueltas que lo normal (días) 1 - 4 5 6
- 1 2 3
- Número máximo de deposiciones más sueltas que lo normal/24 horas 1 - 3 4 - 5 6
- 1 2 3
- Duración de vómitos (días) 1 2 3
- 1 2 3
- Número máximo de episodios de vómitos/24 horas 1 2 - 4 5
- 1 2 3
- Fiebre (medida por vía rectal/vía axilar) 37,1 - 38,4 °C/36,6 - 37,9 °C 38,5 - 38,9 °C/38,0 - 38,4 °C 39 °C/ 38,5 °C
- 1 2 3
- Tratamiento RehidrataciónHospitalización
- 1 2
- Deshidratación 1 - 5 %
- 2
6 %
Se puntuó la temperatura más alta registrada durante el episodio.
10.2. Resultados
Se realizó un análisis provisional de eficacia sobre el grupo anteriormente mencionado y los serotipos aislados eran principalmente G1 y G9, distribuidos de manera casi equitativa. La velocidad de ataque global en el grupo placebo variaba entre 4,8 % para G1 a 3,6 % para G9 durante el período de 6 meses de observación. Dos dosis de vacuna de Rotavirus RIX4414 a 105,8 uff protegían contra todos los tipos de diarrea provocada por G1 con 83 % de eficacia [IC del 95 %: 50,4 - 95,7] y 92,1 % de eficacia [IC del 95 %: 47,6 - 99,8] contra gastroenteritis grave. Si la diarrea estaba provocada por G9, la protección contra todos los tipos de diarrea era 60,2 % [IC del 95 %: 0,2 - 86,0] y 80,8 % [IC del 95 %: 33,0 - 96,4] contra gastroenteritis grave. Para cada uno de estos puntos finales de eficacia (cualquiera y grave para G1 y G9), había una disminución estadísticamente significativa en los episodios de diarrea en el grupo HRV comparado con el grupo placebo (p < 0,05, Prueba exacta de Fisher de dos colas).
Los resultados obtenidos en los otros dos grupos de vacuna (concentración de Rotavirus diferente) son consistentes con los reseñados en el Ejemplo, y se presentan en el análisis final (Ejemplo 11). También se analizaron los datos de eficacia para G2, G3 y G4. No se extrajo ninguna conclusión de este estudio sobre protección cruzada de G2, G3 y G4 ya que se reseñaron muy pocos casos. Sin embargo los datos de eficacia contre G2, G3 y G4 se presentan en el análisis final en un tamaño de muestra más importante (Ejemplo 11).
10.3. Conclusión.
Estos resultados apoyan en gran medida la eficacia de dos dosis de una vacuna de HRV monovalente, la vacuna de Rotavirus RIX4414 en la protección de niños jóvenes contra la cepa G1 y protección cruzada contra la cepa G9.
Ejemplo 11 - Eficacia de dos dosis de una vacuna de Rotavirus monovalente humana, que contiene la cepa RIX4414, administrada a tres concentraciones de virus diferentes en la prevención de gastroenteritis debido a Rotavirus G1 y no- G1 (G2, G3, G4, G9)
11.1. Procedimientos
Un ensayo de fase II aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo se llevó a cabo en Latinoamérica para evaluar la eficacia protectora y eficacia contra la hospitalización de una vacuna derivada de la cepa humana 89-12 de G1P[8] para inmunización de niños. Específicamente la vacuna usada se llamó vacuna de Rotavirus RIX4414, y comprende como componente de Rotavirus la cepa humana atenuada de G1 depositada como ECACC depósito 99081301.
Niños sanos recibieron dos dosis de vacuna de Rotavirus RIX4414 a tres concentraciones de virus diferentes. La cohorte para análisis de eficacia constaba de 1846 sujetos (468 sujetos en el grupo de vacuna de HRV de 104,7 uff, 460 sujetos en el grupo de vacuna de HRV de 105,2 uff, 464 sujetos en el grupo de vacuna de HRV de 105,8 uff y 454 en el grupo placebo a la edad de 2 y 4 meses, simultáneamente con vacunas DTPw-HBV y Hib. Se proporcionaron tres dosis de OPV con una separación de 2 semanas de la vacuna de estudio, es decir, no se administraron durante el período que comienza 2 semanas antes de cada dosis de vacuna de estudio y que termina 2 semanas después. Se ensayaron muestras de diarrea para determinar la presencia de Rotavirus (ELISA) y se determinaron los serotipos en muestras positivas (RT-PCR). Los episodios de diarrea reseñados a partir de dos semanas después de la segunda dosis hasta que los sujetos alcanzaban un año de edad se consideraron para el análisis de eficacia. La gravedad se determinó usando una escala de 20 puntos (Ruuska and Vesikari, 1990). Una puntuación 11 definía una enfermedad grave (véase el ejemplo 10 para la descripción del sistema de puntuación de 20 puntos).
Los resultados que son el análisis final de los datos mencionados en el Ejemplo 10 se ilustran en las tablas más adelante. Los niños en los grupos de vacuna tenían significativamente menos episodios de gastroenteritis por Rotavirus que los niños en el grupo placebo (p < 0,001, Prueba exacta de Fisher de dos colas) (Tabla 19). Dependiendo de la dosificación, la eficacia protectora contra gastroenteritis por Rotavirus grave alcanzaba el 85,6 % (IC del 95 %: 63,0 % - 95,6 %), y 70 % (IC del 95 %, 45,7 % - 84,4 %) contra cualquier gastroenteritis de Rotavirus (Tabla 20). Para cada uno de estos puntos finales de eficacia, existía una disminución estadísticamente significativa en episodios de diarrea en el grupo de HRV comparado con el grupo placebo (p < 0,001, Prueba exacta de Fisher de dos colas). Se identificaron múltiples serotipos de Rotavirus (G1, G2, G3, G4 y G9) a partir de deposiciones de gastroenteritis (ELISA y RT-PCR) permitiendo calcular también la eficacia de vacuna contra serotipos no- G1. Como se puede ver a partir de la tabla 21 en particular, para los serotipos no- G1 (G2, G3, G4 y G9), y dependiendo de la dosificación, la eficacia contra gastroenteritis por Rotavirus grave alcanzó el 82,7 % (IC del 95 %: 40,3 % - 96,8 %), proporcionando la prueba del concepto de que la vacuna monovalente de Rotavirus humano de G1P1A P[8] basado en G1 induce protección cruzada contra cepas heterotípicas (es decir, no- G1 y no- P[8]).
Tabla 19: Características de episodios de gastroenteritis por Rotavirus reseñados durante el estudio RIX4414 104,7 uff RIX4414 105,2 uff RIX4414 105,8 uff Placebo
Cualquier gastroenteritis
21 22 15 51
por Rotavirus
nº de episodios (por ciento) con característica específica entre todos los episodios de gastroenteritis por Rotavirus reseñados
Puntuaciones de
< 7 4 (19,0) 8 (36,4) 2 (13,3) 5 (9,8)
gravedad
7 - 10 5 (23,8) 4 (18,2) 8 (53,3) 12 (23,5)
11 12 (57,1) 10 (45,5) 5 (33,3) 34 (66,7)
Serotipos de Rotavirus identificados
G1 salvaje 12 (57,1) 6 (27,3) 7 (46,7) 30 (58,8)
G2 0 0 1 (6,7) 3 (5,9)
G3 1 (4,8) 0 0 2 (3,9)
G4 0 0 1 (6,7) 0
G9 8 (38,1) 14 (63,6) 7 (46,7) 15 (29,4)
Canino 0 0 0 1(2,0)
Desconocido 0 2 (9,1) 0 0
Tabla 20: Eficacia protectora de dos dosis de vacuna de Rotavirus humano RIX4414 contra gastroenteritis por Rotavirus
Cualquier Gastroenteritis por Hospitalización por gastroenteritis por Rotavirus grave Gastroenteritis por Rotavirus Rotavirus
N n (%) Eficacia n (%) Eficacia n (%) Eficacia (IC del 95 %) (IC del 95 %) (IC del 95 %)
Grupos de 1392 58 61,4 27 74,1 9 (0,6) * 79,0 vacuna reunidos (4,2)* (42,3; 4,1) (1,9)* (55,8; 85,0) (48,0;92,0)
RIX4414 464 15 70,0 5 (1,1)* 85,6 3 (0,6)‡ 79,0 105,8 uff
(3,2)* (45,7; 84,4) (63,0; 95,6) (24,9; 96,1)
RIX4414 460 22 55,7 10 71,0 1 (0,2)* 93,0 105,2 uff
(4,8)* (25,3;74,5) (2,2)* (39,9; 87,2) (53,7; 99,8)
RIX4414 468 21 58,4 12 65,8 5 (1,1)† 65,4104,7 uff
(4,5)* (29,4;76,3) (2,6)* (32,2;83,9) (-1,8; 90,2) Placebo 454 49 -34 (7,5) -14 (3,1) -(10,8)
*p < 0,001 para cada comparación entre los grupos de vacuna y de placebo mediante Prueba exacta de Fisher de dos colas (nivel de significación de = 0,05)
†p = 0,037 para la comparación entre los grupos de vacuna y de placebo mediante Prueba exacta de Fisher de dos colas (nivel de significación de = 0,05) 5 ‡p = 0,007 para la comparación entre los grupos de vacuna y de placebo mediante Prueba exacta de Fisher de dos colas (nivel de significación de = 0,05)
N = número de sujetos n/% = número/porcentaje de sujetos que presentan al menos un episodio de gastroenteritis por Rotavirus especificado
10 Se muestran intervalos de confianza al 95 % exactos
Tabla 21: Eficacia protectora de dos dosis de vacuna de Rotavirus humano RIX4414 contra gastroenteritis grave por Rotavirus específica de serotipo
Gastroenteritis por Rotavirus grave
N n(%) Eficacia (IC del 95 %) valor de p*
Rotavirus de tipo salvaje G1 Grupos de vacuna reunidos 1392 13 (0,9) 73,5 (41,2;88,3) < 0,001 RIX4414 105,8 uff 464 2 (0,4) 87,8 (48,0;98,6) < 0,001 RIX4414 105,2 uff 460 4 (0,9) 75,3 (23,5; 94,0) 0,006 RIX4414 104,7 uff 468 7 (1,5) 57,6 (-9,0; 85,2) 0,057 Placebo 454 16 (3,5) --
Rotavirus No- G1 (principalmente G9 con tipos G2, G3 y G4) Grupos de vacuna reunidos 1392 14 (1,0) 73,1 (42,1; 87,7) < 0,001 RIX4414 105,8 uff 464 3 (0,6) 82,7 (40,3; 96,8) 0,001 RIX4414 105,2 uff 460 6 (1,3) 65,2 (7,4; 88,8) 0,020 RIX4414 104,7 uff 468 5 (1,1) 71,5 (19,4; 91,8) 0,009 Placebo 454 17 (3,7) --
*Prueba exacta de Fisher de dos vías (nivel de significación de = 0,05) usado para cada comparación entre los grupos de vacuna y de placebo. N = número de sujetos n/% = número/porcentaje de sujetos que presentan al menos un episodio de gastroenteritis grave
por Rotavirus especificado Se muestran intervalos de confianza al 95 % exactos
11.3. Conclusión
15 Estos resultados apoyan en gran medida la eficacia de 2 dosis de una vacuna monovalente de HRV que contiene RIX4414, en la protección de niños jóvenes contra cualquier gastroenteritis por Rotavirus y gastroenteritis por Rotavirus grave provocadas por la cepa G1 y protección cruzada contra otros tipos G de RV, a saber G2, G3, G4 y G9.
Ejemplo 12 - Dos dosis de la vacuna de Rotavirus atenuado humano RIX4414 muestran protección 20 heterotípica en Latinoamérica y Europa
La eficacia de una vacuna de Rotavirus (RV) humano G1P[8] atenuado, oral de dos dosis, vivo que contenía la cepa RIX 4414 se analizó en ensayos clínicos de fase II/III en niños finlandeses y latino americanos. La vacuna de Rotavirus RIX 4414 comprende como el componente de Rotavirus la cepa humana G1 atenuada depositada como ECACC depósito 99081301.
5 12.1. Procedimientos
Parte de los resultados del Ejemplo 12 se ha presentado ya en los Ejemplos 10 y 11. Se reunieron los datos de los estudios de fase II, uno en Finlandia y uno en Latinoamérica (Brasil, México y Venezuela) (Ejemplos 10 y 11) y a partir de un estudio de fase III en 11 países de Latinoamérica (Ejemplo 13) usando la misma metodología y criterios de eficacia. En total, 20081 niños sanos (cohorte para eficacia) vacunados con 2 dosis de vacuna RIX 4414 o
10 placebo a los 2 y 4 meses de edad se siguieron hasta un año de edad para evaluar la gastroenteritis (GE) grave con una puntuación en la escala de gravedad Vesikari (Ruuska T y col., Scand. J. Infect. Dis. 1990, 22, 259 - 267) 11. Muestras de GE se ensayaron para evaluar Rotavirus (por ELISA) y se determinó el tipo por RT-PCR.
Un análisis meta se llevó a cabo en los tres estudios mencionados. La eficacia reunida para GE por RV grave (definida como puntuación de gravedad de Vesikari ≥ 11) se calculó a partir de 2 semanas después de la dosis 2
15 hasta 1 año de edad (ajuste para el efecto de estudio usando la aproximación de Mantel- Haenszel).
En la cohorte para determinar la eficacia se detectaron 5 episodios graves de GE por RV de tipo G2P[4] con una puntuación de Vesikari 11 en el grupo de vacuna y 13 episodios en el grupo de placebo. La eficacia de la vacuna contra el tipo G2P[4] era 67,2 % (IC del 95 %: 14,8; 87,1), que muestra que además de proteger contra cepas
20 homotípicas (G1P[8], G3P[8] y G4P[8]), la vacuna RIX4414 protege contra GE por Rotavirus grave provocada por la cepa de G2P[4] no- P[8] no-G1 heterotípica.
La eficacia específica del tipo a través de los diferentes estudios se proporciona a continuación (Tabla 22).
Tabla 22
- Cepa
- Número de casos de RV graves % de eficacia de vacuna * (VE)
- (IC del 95 %)
- N vacunas
- N Placebo
- (N = 10646)
- (N = 9435)
- G1
- 17 52 83,7 (70,0; 91,2)
- G2P[4]
- 5 13 67,2 (14,8; 87,1)
- G3
- 2 8 82,7 (5,9; 96,8)
- G9
- 15 34 79,5 (59,2; 89,7)
*VE ajustado para el efecto de estudio usando aproximación de Mantel- Haenszel
25 Solamente 3 casos G4 se produjeron en los 3 ensayos, 1 en los receptores de vacuna y 2 en los receptores de placebo.
12.3. Conclusión
Este análisis muestra que, además de proporcionar, un alto nivel de protección contra las cepas de Rotavirus G1 homólogas (que tienen dos proteínas de cápside externas (VP4 y VP7) y una proteína de cápside interna (VP6)
30 antigénicamente similar a la vacuna), la vacuna RIX 4414 es también altamente protectora contra otras cepas que tienen o bien un tipo G diferente (por ejemplo, G3, G9), un tipo P diferente (por ejemplo, P[4]), o tanto tipo G como tipo P diferentes, como se ilustra por la eficacia contra G2P[4].
Ejemplo 13 – Análisis meta que muestra que dos dosis de la vacuna de Rotavirus atenuado humano RIX 4414 muestran protección heterotípica
35 A medida que más datos se hicieron disponibles de Singapur y de un estudio europeo (Ejemplo 15), se llevó a cabo un análisis meta adicional para incluir estos estudios además de los estudios mencionados en el Ejemplo 12.
Tres estudios de fase II (Finlandia y Latinoamérica y Singapur) y dos de fase III (Latinoamérica y Europa) se incluyeron en el metaanálisis. Se administraron dos dosis orales de acuerdo con el programa de 0,1 a 2 meses a niños sanos que tenían 6 -14 semanas de edad a la Dosis 1. En todos los estudios, se definió GE por RV grave
5 como una puntuación ≥11 en la escala de Vesikari de 20 puntos. Se analizaron muestras de diarrea para determinar la presencia de RV por ELISA y se determinó el tipo mediante el procedimiento basado en RT-PCR. La eficacia contra cualquier GE por RV se evaluó en los tres estudios de fase II y el estudio de Europa de fase III solamente como en el estudio de Latinoamérica de fase III, solamente se registraron GE por RV grave.
VE y su IC del 95 % se estimó como una tasa 1 de la GE por RV con relación al placebo usando la relación de tasas
10 de Poisson exacta estratificada por estudio (Proc StatXact4 for SAS Users, 1999, cytel software corporation, exact Confidence Interval for common relative risk, p 298)
13.2. Resultados
En un total de 8.221 niños vacunados con dos dosis de RIX4414 o placebo, se detectaron 4 episodios de cualquier GE por RV de G2P[4] en el grupo de RIX4414 (N = 5.783) y 9 episodios en el placebo (N = 2.438), indicando una VE
15 de 81,0 % (IC del 95 %: 31,6; 95,8) contra GE por RV de cualquier gravedad debido a la cepa G2P[4].
En un total de 26.088 niños sanos vacunados con dos dosis de RIX4414 o placebo, se detectaron 6 episodios de GE por RV grave debido al tipo G2P[4] en el grupo RIX4414 (N = 14.792) y 15 episodios en el placebo (N = 11.296), indicando una VE de 71,4 % (IC del 95 %:20,1; 91,1) contra GE por RV grave debido a la cepa G2P[4]. Los resultados se reseñan en la tabla 23.
20 Tabla 23 - Número de sujetos que presentan cualquier episodio o grave de GE por RV provocado por el tipo de RV G2P[4] y el porcentaje de eficacia de vacuna durante el primer período de eficacia - (análisis meta), cohorte para eficacia
Tabla 23
- Grupos Cepa de RV
- Cualquier GE por RV * (excluida Latinoamérica) GE por RV grave (puntuación 11 en la escala de Vesikari) (5 estudios)
- N
- n % Eficacia de vacuna N n % Eficacia de vacuna
- % VE IC del 95 %
- % VE IC del 95 %
- G2P[4]
- Vacuna de VRH
- 5783 4 0,07 81,0 31,6 - 95,8 14792 6 0,04 71,4 20,1 - 91,1
- Placebo
- 2438 9 0,37 11296 15 0,13
- N = número de sujetos incluido en cada grupo; n/% = número/porcentaje de sujetos que presentan al menos un episodio de GE de G2P[4] por RV especificado en cada grupo; % VE = eficacia de vacuna observada, IC del 95 % = Intervalos de confianza al 95 % * Dos de 13 G2 no eran del tipo P
25 13.3. Conclusión:
Este metaanálisis sobre la eficacia de vacuna contra el tipo de RV G2P[4] muestra una eficacia de vacuna de 81,0 % (IC del 95 %: 31,6 %; 95,8 %) contra cualquier GE por RV debida al tipo G2P[4] y una eficacia de vacuna de 71,4 % (IC del 95 %: 20,1 %; 91,1 %) contra GE por RV grave debida al tipo G2P[4].
Ejemplo 14 - Eficacia de vacuna de Rotavirus atenuado humano Rotarix en un ensayo de fase III de
múltiples países
20.169 niños sanos de 11 países de Latinoamérica recibieron dos dosis orales de vacuna de HRV (10.159) o
5 placebo (10.010) a aproximadamente 2 y 4 meses de edad. Se ensayaron muestras de deposiciones para determinar Rotavirus (RV) por ELISA y se determinó el tipo por RT-PCR usando cebadores adecuados y sondas específicas del tipo. La definición de caso clínico para captura de episodios de gastroenteritis grave era un episodio de diarrea (pase de tres o más deposiciones acuosas o más sueltas de lo normal en 24 horas) con o sin vómitos que requirieron hospitalización durante toda la noche y/o terapia de rehidratación equivalente al plan B de OMS (terapia
10 de rehidratación oral) o plan C de la OMS (terapia de rehidratación intravenosa) en una instalación médica tal como un hospital, clínica o centro de cuidado de salud rural supervisado (http://www.who.int/child-adolescenthealth/New_Publications/CHILDHEALTH/textrev4.htm). La gravedad de la enfermedad se clasificó usando la escala de Vesikari de 20 puntos; la GE por RV grave se definió como una puntuación >11. La puntuación de Vesikari se modificó: ya que la deshidratación no se registró en el CRDe, se aplicó la siguiente regla: un sujeto que tenía un
15 episodio de GE grave se consideró que estaba deshidratado entre 1 y 5 % si este sujeto recibía rehidratación oral. Un sujeto se consideró que estaba deshidratado > 6 % si se hospitalizaba al sujeto y/o recibía rehidratación intravenosa (IV).
14.2. Eficacia de la vacuna
Eficacia de la vacuna contra gastroenteritis por Rotavirus grave (Tabla 24)
20 La cohorte para eficacia constaba de 9.009 sujetos vacunados con vacuna de y 8.858 sujetos que recibían un receptor de placebo. Habían 12 niños con gastroenteritis por Rotavirus grave de acuerdo con la definición clínica en la vacuna y 77 en el grupo placebo (2,0 vs. 13,3 niños con 1 episodio por 1.000 niños-años, respectivamente; p < 0,001, Prueba exacta de Fisher de dos colas), dando como resultado una eficacia de vacuna del 84,7 % contra gastroenteritis por Rotavirus grave a partir de 15 días después de la dosis 2 hasta un año de edad (mostrado en la
25 tabla 24). Resultados similares se obtuvieron con la cohorte vacunada total (eficacia de vacuna de 81,1 %; IC del 95 %. 68,5 - 89,3; p < 0,001, Prueba exacta de Fisher de dos colas) desde la dosis 1 hasta un año de edad. Se requirió hospitalización durante al menos una noche en 9 niños en el grupo de la vacuna y 59 en el de placebo (1,5 vs. 10,2 hospitalizaciones 1.000 niños-años, respectivamente), para una eficacia de vacuna contra la hospitalización de gastroenteritis por Rotavirus grave de 85 % (p < 0,001, Prueba exacta de Fisher de dos colas) (Tabla 24).
30 Tabla 24 - Eficacia de vacunas contra gastroenteritis grave por Rotavirus, gastroenteritis grave de tipos G de Rotavirus específica y gastroenteritis graves de todas las causas, durante el período desde dos semanas después de la dosis 2 hasta un año de edad
- grupo de vacuna (N = 9.009)
- Grupo de placebo (N = 8.858) RR Eficacia de vacuna (IC del 95 %) y valores
- p
- n
- relación n relación
- 1000 niños
- 1000 niños
- año
- año
Gastroenteritis por Rotavirus grave de acuerdo con la definición de caso clínico* Gastroenteritis por Rotavirus
- Grave
- 12 2,0 77 13,3 0,153 84,7
- (71,7; 92,4)
- <0,001
- Hospitalización
- 9 1,5 59 10,2 0,150 85,0
- (69,6; 93,5)
- <0,001
Gastroenteritis por todas las causas
grupo de vacuna Grupo de placebo RR Eficacia de vacuna (IC del (N = 9.009) (N = 8.858) 95 %) y valores p
n relación n relación 1000 niños -1000 niños año año
Grave 183 30,9 300 51,7 0,600 40,0 (27,7; 50,4) <0,001 Hospitalización 145 24,5 246 42,4 0,580 42,0 (28,6; 53,1) <0,001
Gastroenteritis específica de tipo
G1P[8]# 3a 0,5 36b 6,2 0,082 91,8 (74,1; 98,4) <0,001 G3P[8], G4P[8], 4c 0,66 31d 5,3 0,126 87,3 (64,1;96,7) G9P[8] <0,001 G2P[4] 6 1,0 10e 1,7 0,590 41,0 (-79,2; 82,4) 0,328
Gastroenteritis grave por Rotavirus con una puntuación 11 en la escala de Vesikari
Grupo de vacuna (N= Grupo de placebo (N= RR Eficacia de la vacuna
9.009 8.858 (IC del 95 %) y valores p
n Proporción 1.000 lactantes-año n Proporción 1.000 lactantes-año Gastroenteritis específica de tipo
G1P[8]# 3 0,5 32 5,5 0,092 90,8 (70,5;98,2) <0,001 G3P[8], G4P[8], 4 0,66 30 5,2 0,130 86,9 (62,8;96,6) G9P[8] <0,001 G2P[4] 5 0,8 9 1,5 0,546 45,4 (-81,5;85,6) 0,298
Leyenda para la tabla 24:
Se contaron participantes con episodios con más de un tipo aislado G en cada una de las categorías de tipo de Rotavirus detectado. n = número de niños que presentan al menos un episodio especificado
RR = Riesgo Relativo = relación de la tasa de incidencia de sujetos que presentan al menos un episodio en el grupo de vacuna sobre la tasa de incidencia de sujetos que presentan al menos un episodio en el grupo de placebo.
CI = intervalo de confianza
La relación 1000-niños año es el número de niños que presentan con >= 1 episodio especificado por niño -año
* Definición de caso de acuerdo con el protocolo de estudio: un episodio de diarrea (pase de tres o más deposiciones acuosas o más sueltas de lo normal en un día) con o sin vómitos que requiriera hospitalización durante toda la noche y/o terapia de rehidratación equivalente al plan B de OMS (terapia de rehidratación oral) o plan C de OMS (terapia de rehidratación intravenosa) en una instalación médica tal como un hospital, clínica o centro de cuidado de salud rural supervisado
# Todos los tipos G1 aislados eran de Rotavirus de tipo salvaje; G1P[8] y G9P[8] se aislaron de un niño
a El tipo G1P[8] solo se aisló de 2 niños; G1P[8] y G9P[8] se aislaron de un niño
b el tipo G1P[8] solo se aisló de 34 niños; G1P[8] y G9P[8] se aislaron de un niño; los tipos G1, G2, G9 se aislaron de un niño
c el tipo G3P[8] solo se aisló de un niño, el tipo G4P[8] solo de 1 niño; y G9P[8] solo de un niño; G1P[8] y G9P[8] se aislaron de un niño
d el tipo G3P[8] solo se aisló de 8 niños, el tipo G4P[8] solo de 2 niños; y G9P[8] solo de 19 niños; G1P[8] y G9P[8] se aislaron de un niño; y G1P[8] y G2P[4] y G9P[8] de 1 niño;
e G2P[4] solo se aisló de 9 niños y G1P[8], G2P[4] y G9P[8] se aislaron de un niño;
los valores de p = Prueba exacta de Fisher de dos colas (nivel de significación de = 0,05)
Eficacia de la vacuna de acuerdo con la puntuación de Vesikari
Once de 12 niños con episodios de Rotavirus graves en el grupo de vacuna y 71 de 77 en el grupo de placebo tenían una puntuación de Vesikari ≥11, dando como resultado una eficacia de vacuna de 84,7 % (P < 0,001, Prueba exacta de Fisher de dos colas). Para un incremento de la gravedad de la enfermedad con puntuaciones entre 11 y 20, la eficacia de la vacuna se incrementaba más, alcanzando 100 % contra gastroenteritis por Rotavirus más grave. Un total de 16 episodios de gastroenteritis por Rotavirus grave con una puntuación de Vesikari ≥11 se reseñaron entre la dosis 1 hasta la dosis 2, seis en el grupo de vacuna y 10 en el placebo.
Eficacia de la vacuna de acuerdo con la puntuación de Vesikari por tipo de Rotavirus
La eficacia de vacuna específica del tipo contra las cepas de tipo salvaje se muestra en la tabla 24. La eficacia de la vacuna contra episodios de Rotavirus graves con una puntuación de Vesikari ≥11 provocados por cepas de tipo G1P[8], homólogas a la cepa de vacuna, era 91,8 % (P < 0.001, Prueba exacta de Fisher de dos colas). La eficacia de la vacuna contra las cepas que comparten el antígeno P[8] (G3P[8], G4P[8] y G9P[8]) era 86,9 % (P < 0,001, Prueba exacta de Fisher de dos colas). El tipo de Rotavirus G2P[4], que no comparte ni el antígeno G ni el P con la cepa de vacuna se detectó en cinco episodios en el grupo de la vacuna y nueve en el de placebo, dando como resultado una eficacia de 45 por ciento (P = 0,298, Prueba exacta de Fisher de dos colas). Debido al pequeño número de episodios de G2 observados en este estudio, se realizó un análisis meta de 5 estudios (Ejemplo 13) y la tendencia observada en este estudio llegaba a tener un valor significativo cuando los resultados de los 5 estudios se reunían (Ejemplo 13)
Eficacia de vacuna sobre la carga de enfermedad de diarrea
Niños con gastroenteritis de cualquier causa que requiere hospitalización y/o rehidratación de acuerdo con el plan B/C de OMS tenían una tasa de incidencia de 30,9/1.000 niños-años en el grupo de la vacuna comparado con 51,7 en el placebo, para una reducción global de 40 % (P < 0.001, Prueba exacta de Fisher de dos colas) en episodios de diarrea grave de toda causa entre receptores de vacunas. Del mismo modo, la hospitalización por diarrea de cualquier etiología se reducía significativamente en un 42 % (P < 0,001, Prueba exacta de Fisher de dos colas) (Tabla 24, todas GE de todas las causas)).
14.3. Resumen de resultados
La eficacia de vacuna contra gastroenteritis por Rotavirus grave (RV GE) y contra la hospitalización asociada a Rotavirus era 85 % (P < 0,001, Prueba exacta de Fisher de dos colas), alcanzando 100 % en una población que tiene RV GE con una puntuación de Vesikari >=19. La eficacia contra G1P[8] y cepas que comparten solamente el epítopo P[8] con HRV era 92 % (IC del 95 % 74,98) y 87 % (IC del 95 % 64,97) respectivamente (P < 0.001, Prueba exacta de Fisher de dos colas). Hospitalización por diarrea de toda causa se redujo en un 42 % (IC del 95 % 29,53; P<0,001, Prueba exacta de Fisher de dos colas).
Ejemplo 15 - Eficacia de vacuna de Rotavirus atenuado humano Rotarix en seis países europeos
3.994 niños en seis países europeos se distribuyeron al azar para recibir vacuna de HRV (Rotavirus humano) RotarixTM 106,5 CCID50 (véase la composición) o placebo cuando se coadministra con vacunaciones para la infancia de rutina. El primer período de seguimiento de la eficacia comenzaba desde dos semanas después< de la dosis 2 y terminaba junio - julio de 2005. Un total de 3874 sujetos eran parte de la cohorte de eficacia del primer año.
Composición de vacuna: (Tabla 25)
- Vacuna
- Formulación
- Vacuna de HRV de
- La cepa de RIX4414 derivada de la cepa
- GSK Biologicals
- de vacuna de HRV 89-12 Dosis infecciosa de cultivo celular mediana 106.5 (CCID50) Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) 3,7 mg Sacarosa 9 mg Dextrano 18 mg Sorbitol 13,5 mg Aminoácidos 9 mg
- Diluyente de GSK
- Carbonato de calcio 80 mg
- Biologicals
- Xantano 3,25 mg
- Agua para inyección c.s. para 1,3 ml
15.2. Eficacia de la vacuna
La vacuna de HRV era altamente eficaz en la protección contra RV GE durante el primer período de eficacia. La eficacia de la vacuna era 87,1 % (IC del 95 %: 79,6 %; 92,1 %) contra cualquier episodio de RV GE y 95,8 % (IC del 95 %: 89,6 %; 98,7 %) contra episodios de RV GE graves. Para un incremento de la gravedad de la enfermedad
15 (puntuaciones de Vesikari entre 11 y 20), la eficacia de la vacuna se incrementaba más, alcanzando un 100 % en una población que tiene RV GE con una puntuación de Vesikari 17 puntos. La eficacia de la vacuna contra la hospitalización por RV GE era 100 % (IC del 95 %: 81,8 %; 100 %) y contra episodios RV GE que requerían atención médica era 91,8 % (IC del 95 %: 84,0 %; 96,3 %) (Tablas 26 y 27).
Tabla 26 - Porcentaje de personas que presentan cualquier RV GE y RV GE grave, porcentaje de sujetos hospitalizados debido a episodios RV GE, y eficacia de vacuna durante el primer período de eficacia - cohorte para eficacia
Grupos Cualquier RV GE
RV GE grave (puntuación 11 en la escala Vesikari)
Sujetos
Eficacia de vacuna
Sujetos Eficacia de vacuna
N
n % valor de P
% VE IC del 95
n % valor de P
% VE IC del 95 %
%
106,5
24 0,9 <0,001
87,1 79,6-92,1
5 0,2 <0,001
95,8 89,6-98,7 CCID50
Placebo 1302
94 7,2 -
60 4,6 -
RV GE hospitalizado
Sujetos
Eficacia de vacuna
N
n % valor de P
% VE IC del 95 %
Estudio
106,5
2572 0 0,0 <0,001
100 81,8-100 CCID50
Placebo 1302
12 0,9 -
N = número de sujetos incluido en cada grupo; N% = número/porcentaje de sujetos que presentan al menos un episodio RV GE especificado en cada grupo valor de P = Prueba exacta de Fisher de dos colas (nivel de significación de = 0,05) % VE = eficacia de vacuna observada IC del 95 % = intervalos de confianza de 95 % una puntuación 11 sobre la escala de Vesikari de 20 puntos se definió como grave
Tabla 27 - Porcentaje de sujetos que presentan episodios RV GE que requieren atención médica y eficacia de vacuna durante el primer período de eficacia - cohorte para eficacia
Grupos RV GE que requiere atención médica
- N
- n % Eficacia de vacuna Valor de P
- % VE
- IC del 95 %
- 106,5 CCID50
- 2572 10 0,4 91,8 84,0-96,3 <0,001
- Placebo
- 1302 62 4,8 - - -
N = número de sujetos incluido en cada grupo;
N/% = número/porcentaje de sujetos que presentan al menos un episodio RV GE que requiere atención médica
en cada grupo;
valor de P = Prueba exacta de Fisher de dos colas (nivel de significación de = 0,05)
% VE = eficacia de vacuna observada, IC del 95 % = intervalos de confianza de 95 %
La vacuna de HRV era altamente protectora contra cualquier RV GE y RV GE grave provocado por las cepas G1P[8], G3P[8], G4P[8] y G9P[8] (Tabla 28).
La protección contra el tipo G2P[4] de RV que no comparte ninguno de los antígenos de cápside exterior de la
10 vacuna de HRV era inferior en este estudio, sin embargo los resultados de un análisis meta teniendo en cuenta los estudios de eficacia de fase II y III mostraron una eficacia protectora significativa contra cualquier GE y GE grave debida a G2P[4] (véase el Ejemplo 13).
15.3. Sumario de resultados
Dos dosis orales de la vacuna de HRV RotarixTM, coadministrada con vacunaciones para infancia, eran altamente eficaces durante el primer período de eficacia comparado con el placebo en la protección de niños contra cualquier RV GE provocado por los tipos de RV de tipo salvaje G1P[8] y por no- G1P[8] de RV, la eficacia de vacuna era 95,6 % (IC del 95 %: 87,9 %; 98,8 %) y 79,3 % (IC del 95 %: 64,6 %; 88,4 %) respectivamente. La eficacia contra RV GE grave provocada por los tipos de RV de tipo salvaje G1P[8] y por no- G1P[8] de RV es 96,4 % (IC del 95 %: 85,7 %; 99,6 %) y 95,4 % (IC del 95 %: 85,3 %; 99,1 %) respectivamente.
Estos resultados son muy de apoyo hacia la conclusión de que la vacuna de HRV proporciona una amplia cobertura contra las cepas de RV circulantes (véase la tabla 28: G1P[8], G2 P[4], G3P[8], G4P[8], G9P[8]). Se realizó específicamente un análisis meta sobre la eficacia de la vacuna contra G2 P[4], por favor referirse al Ejemplo 13.
Conclusiones generales
La vacuna de Rotavirus RIX4414 probaba que era altamente protectora contra episodios de gastroenteritis por Rotavirus medido mediante una definición clínica para centrar la captura del caso en hospitalización y rehidratación, así como mediante la escala validada de Vesikari que incluye resultados de morbilidad cuantificables relacionados con diarrea, vómitos, fiebre, deshidratación y hospitalización. Dos dosis orales de vacuna de HRV eran altamente eficaces en la protección de niños contra cualquier RVGE y RVGE grave y hospitalización debida a múltiples cepas de Rotavirus circulantes.
Se demostró un alto nivel de protección contra Rotavirus G1P[8] homólogos, que tienen dos proteínas de cápside externas (VP4 y VP7) y una proteína de cápside interna (VP6) antigénicamente similar a la vacuna de HRV. También protege contra cepas que comparten solamente el genotipo P[8] (antígeno VP4) y el antígeno VP6. La protección contra cepas de Rotavirus que no comparten ninguno de los antígenos de la cápside externos de la vacuna de HRV también se demostró en un análisis meta que incluye los resultados de tres estudios de fase II de Finlandia, Singapur y Latinoamérica (todos usando metodología y criterios de eficacia idénticos) y 2 estudios de fase III de Latinoamérica y Europa, y que se reseñan en el Ejemplo 13, la eficacia de vacuna contra el tipo G2P[4] de cualquier gravedad era 81 % (IC del 95 %. 31,6 - 95,8) y eficacia de vacuna contra GE grave debida al tipo G2P[4] era 71,4 % (IC del 95 % 20,1 - 91,1) indicando que la vacuna también protege contra cepas que no comparten proteínas idénticas de G o P con la cepa de la vacuna.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> GlaxoSmithKline Biologicals s.a.
<120> Vacuna
<130> VB61582
5 <160> 42
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 2350
<212> ADN 10 <213> Rotavirus xxx
<400> 1
<210> 2
<211> 2359
<212> ADN
<213> Rotavirus
<400> 2
<210> 3
<211> 1009
<212> ADN
<213> Rotavirus
<400> 3 <210> 4
<211> 1046
<212> ADN
<213> Rotavirus
<400> 4
<210> 5
<211> 775 10 <212> PRT
<213> Rotavirus
<400> 5
<210> 6
<211> 326
<212> PRT
<213> Rotavirus
<400> 6 <210> 7
<211> 175
<212> PRT
<213> Rotavirus
<400> 7 <210> 8
<211> 750
<212> ADN
<213> Rotavirus
<400> 8
<210> 9
<211> 397
<212> PRT 10 <213> Rotavirus
<400> 9
<210> 10
<211> 1356
<212> ADN
<213> Rotavirus
<400> 10
<210> 11
<211> 28 10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótidos que comparten homología con secuencias de nucleótidos de Rotavirus
<400> 11 ggctttaaaa gagagaattt ccgtctgg 28
<210> 12
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótidos que comparten homología con secuencias de nucleótidos de Rotavirus
<400> 12 ggttagctcc ttttaatgta tggta 25
<210> 13
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótidos que comparten homología con secuencias de nucleótidos de Rotavirus
<400> 13 ggtcacatcg aacaattcta atctaag 27
<210> 14
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótidos que comparten homología con secuencias de nucleótidos de Rotavirus
<400> 14 caagtactca aatcaatgat gg 22
<210> 15
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótidos que comparten homología con secuencias de nucleótidos de Rotavirus
<400> 15 tgttgatttt tctgtcgatc cac 23
<210> 16
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótidos que comparten homología con secuencias de nucleótidos de Rotavirus
<400> 16 ggttgctgag aatgagaaat tagctatagt gg 32
<210> 17
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótidos que comparten homología con secuencias de nucleótidos de Rotavirus
<400> 17 ccactatagc taatttctca ttctcagcaa cc 32
<210> 18
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótidos que comparten homología con secuencias de nucleótidos de Rotavirus
<400> 18
tggcttcgcc attttataga ca 22
<210> 19
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótidos que comparten homología con secuencias de nucleótidos de Rotavirus
<400> 19 atttcggacc atttataacc 20
<210> 20
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótidos que comparten homología con secuencias de nucleótidos de Rotavirus
<400> 20 tggcttcact catttataga ca 22
<210> 21
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atccctatta tactgcattc ctttc 25 20
Claims (17)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Uso de una cepa de Rotavirus atenuado de tipo G1P[8] en la fabricación de una composición para conferir protección contra la infección por rotavirus causada por una cepa de rotavirus de tipo G2P[4].
-
- 2.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la composición comprende un Rotavirus que tiene un gen VP4 que comprende, en la secuencia de nucleótidos, al menos uno de los siguientes: una base adenina (A) en la posición 788, una base adenina (A) en la posición 802 y una base timina (T) en la posición 501 desde el codón iniciación.
-
- 3.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el gen VP4 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una base adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una base timina (T) en la posición 501 desde el codón de iniciación.
-
- 4.
- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 en el que la composición comprende un Rotavirus que tiene un gen VP7 que comprende, en la secuencia de nucleótidos, al menos uno de los siguientes: una timina
(T) en la posición 605, una adenina (A) en la posición 897 y una guanina (G) en la posición 897 desde el codón de iniciación. -
- 5.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 4 en el que el gen VP7 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una timina (T) en la posición 605 y una adenina (A) o una guanina (G) en la posición 897 desde el codón de iniciación.
-
- 6.
- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la composición comprende un Rotavirus que tiene un gen VP4 que comprende, en la secuencia de nucleótidos, una adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una timina (T) en la posición 501 desde el codón de iniciación; y en el que el gen VP7 comprende, en la secuencia de nucleótidos, una timina (T) en la posición 605 y una adenina (A) en la posición 897 desde el codón de iniciación.
-
- 7.
- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la composición confiere además protección contra al menos uno de los serotipos no-G1 seleccionados del grupo que cosiste en; G3, G4 y G9.
-
- 8.
- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición comprende una cepa de rotavirus atenuado de G1P[8] que proporciona protección contra gastroenteritis grave inducida por rotavirus que tiene una puntuación igual o superior a 11 en la escala de Vesikari causada por infección de una cepa de rotavirus de un tipo G2P[4].
-
- 9.
- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la composición que comprende una cepa de Rotavirus atenuado de un tipo G1P[8] es al menos un 40 % protectora, en una población de individuos vacunados contra la diarrea provocada por una cepa de Rotavirus que es de tipo G2P[4].
-
- 10.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la composición es al menos un 50 % protectora.
-
- 11.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la composición es entre 40 % y 80 % protectora.
-
- 12.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la composición es entre 50 % y 70 % protectora.
-
- 13.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la composición es entre 40 % y 75 % protectora en una población de individuos vacunados contra la gastroenteritis grave que tienen una puntuación igual o superior a 11 en la escala de Vesikari causada por infección de Rotavirus con un serotipo G2P[4].
-
- 14.
- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la cepa de Rotavirus en dicha composición es ECACC depósito 99081301, o se puede obtener o derivar de ECACC depósito 99081301.
-
- 15.
- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la composición es administrada en un régimen de 2 dosis.
-
- 16.
- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la cepa de Rotavirus atenuado es formulada con un vehículo farmacéutico adecuado o con un tampón antiácido o ambos.
-
- 17.
- Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la composición es para conferir protección en un sujeto humano.
FIG. 1A secuencia VP4 de P43 FIG. 1B secuencia VP4 de P43 (RIX4414 VP4; 2359 pb) Fig. 2A secuencia VP7 de P43Fig. 2B secuencia VP7 de P43 - (RIX4414 VP7; 1046 pb)Figura 3 - Secuencia de polipéptidos de P43 VP4. (RIX4414 VP4.pro; 775 aa)Figura 4 - Secuencia de polipéptidos de P43 VP7 (RIX4414 VP7.pro; 326 aa). Figura 5 - Secuencia de polipéptidos de la proteína NSP4 de RIX4414 (175 aa).Figura 6 - Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína NSP4 de RIX4414 (750 pb). Figura 7 - Secuencia de polipéptidos de la proteína VP6 de RIX4414 (397 aa).Figura 8 - Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína VP6 de RIX4414 (1356 pb).
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