JP5519934B2 - 異型交差防御を誘導するロタウイルスワクチン - Google Patents

Description

本発明はロタウイルスワクチン製剤に関する。本発明は、１つのロタウイルス型の弱毒化ロタウイルス集団の使用であって、別のロタウイルス型のロタウイルス感染に関連した疾患の予防における使用に関する。

急性感染性下痢は世界の多数の地域における疾患および死亡の主要原因である。発展途上国においては下痢疾患の影響は計り知れない。アジア、アフリカおよびラテンアメリカにおいては、毎年３０億〜４０億の下痢の症例があり、それらの症例のうちの約５００万〜１０００万が死を招いていると見積られている（Walsh, J.A.ら: N. Engl. J. Med., 301:967-974 (1979)）。

ロタウイルスは乳児および小児における重症下痢の最も重要な原因の１つであると認識されている（Estes, M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, Third Edition, Fieldsら編, Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。ロタウイルス疾患は毎年１００万人以上の死を招いていると見積られている。ロタウイルスにより引き起こされる疾患は、最も一般には、６〜２４月齢の小児を冒し、該疾患の流行のピークは一般に、温帯地方においては冷涼な月に、熱帯地方においては年間を通じて生じる。ロタウイルスは典型的には糞便−経口経路によりヒトからヒトへ感染し、潜伏期間は約１〜約３日である。６〜２４月齢の群における感染とは異なり、新生児では一般に無症状であるか、または軽症であるに過ぎない。小児で通常見られる重症な疾患とは対照的に、ほとんどの成人は過去のロタウイルス感染の結果として防御されているため、ほとんどの成人の感染は軽症または無症状である（Offit, P.A.ら, Comp. Ther., 8(8):21-26, 1982）。

ロタウイルスは一般には球状であり、その名称は、その特徴的な外層および内層または二重殻カプシド構造に由来する。典型的には、ロタウイルスの二重殻カプシド構造は、ゲノムを含有する内層タンパク質殻またはコアを包囲する。ロタウイルスのゲノムは、少なくとも１１個の異なるウイルスタンパク質をコードする１１セグメントの二本鎖ＲＮＡから構成される。ＶＰ４およびＶＰ７と称される、これらのウイルスタンパク質のうちの２つが、二重殻カプシド構造の外部に配置されている。ロタウイルスの内層カプシドは１つのタンパク質を示し、これは、ＶＰ６と称されるロタウイルスタンパク質である。ロタウイルス感染後の免疫応答の惹起におけるこれらの３つの特定のロタウイルスタンパク質の相対的重要性は未だ明らかではない。それでも、ＶＰ６タンパク質は群および亜群を決定し、ＶＰ４およびＶＰ７タンパク質は血清型（中和アッセイにより決定される型）および遺伝子型（非血清学的アッセイにより決定される型）特異性の決定因子である。Ｇ血清型およびＧ遺伝子型に関する名称は同一である。一方、Ｐ血清型および遺伝子型に割り当てられる数字は異なる（Santos N. et Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29-56）。したがって、Ｐ血清型はＰおよびそれに続く割り当てられた数字で示され、Ｐ遺伝子型はＰおよびそれに続く大括弧内の割り当てられた数字で示される。

現在のところ、少なくとも１４個のロタウイルスＧ血清型および１４個のロタウイルスＰ血清型が特定されている（Santos N. et Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29-56）。これらのうち、１０個のＧ（Ｇ１〜６、Ｇ８〜１０およびＧ１２）血清型および９個のＰ（Ｐ１、Ｐ２Ａ、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５Ａ、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ１１およびＰ１２）血清型がヒトロタウイルスにおいて特定されている。２３個のＰ遺伝子型が記載されており、そのうちの１０個がヒトから回収されている（Ｐ［３］〜［６］、Ｐ［８］〜［１１］、Ｐ［１４］およびＰ［１９］）。

ＶＰ７タンパク質は、株に応じてゲノムセグメント７、８または９の翻訳産物である分子量３８，０００（非グリコシル化体の場合には分子量３４，０００）の糖タンパク質である。このタンパク質はロタウイルス感染後に中和抗体の生成を刺激する。ＶＰ４タンパク質は、ゲノムセグメント４の翻訳産物である分子量約８８，０００の非グリコシル化タンパク質である。このタンパク質もロタウイルス感染後に中和抗体を刺激する。

ＶＰ４およびＶＰ７タンパク質は、中和抗体の生成対象となるウイルスタンパク質であるため、それらは、ロタウイルス疾患に対する防御をもたらすロタウイルスワクチンの開発のための主要候補であると考えられる。

小児期早期における自然ロタウイルス感染は防御免疫を惹起することが知られている。したがって、生弱毒化ロタウイルスワクチンが非常に望ましい。好適には、これは経口ワクチンであるべきである。なぜなら、これが該ウイルスの感染の自然経路だからである。

ロタウイルス感染に対する初期ワクチン開発は該ウイルスの発見後の１９７０年代に開始された。当初は、動物およびヒトからの弱毒化株が研究され、様々な結果または失望させるような結果が得られた。その後の研究はヒト−動物再集合体に焦点が合わせられ、より成功した結果が得られている。

８９−１２として公知のロタウイルス株がＷａｒｄにより記載されている。米国特許第５，４７４，７７３号およびBernstein, D.L.ら, Vaccine, 16 (4), 381-387, 1998を参照されたい。８９−１２株は、１９８８年に、自然ロタウイルス疾患に罹患した１４月齢の小児から集められた便試料から分離された。米国特許第５，４７４，７７３号によれば、ついでＨＲＶ８９−１２ヒトロタウイルスが、Ward, J. Clin. Microbiol., 19, 748-753, 1984に記載のとおり初代アフリカミドリザル腎（ＡＧＭＫ）細胞における２継代およびＭＡ−１０４細胞における４継代により培養馴化された。ついでそれはＭＡ−１０４細胞において３回プラーク精製され（９継代まで）、これらの細胞における更に２継代の後で増殖に付された。ＡＴＣＣへの寄託（受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ２２７２）のために更に１継代に付された（１２継代）。寄託株は８９−１２Ｃ２として公知である。

Bernsteinら, Vaccineの１９９８年の論文を以下、Vaccine (1998)論文と称する。該論文は経口投与生ヒトロタウイルスワクチン候補の安全性および免疫原性を記載している。このワクチンは株８９−１２から得られたものであり、プラーク精製無しで初代ＡＧＭＫ細胞において２６回継代、ついで樹立ＡＧＭＫ細胞系において更に７回継代することにより（合計３３継代）弱毒化されたものである。

以下、２６回連続継代された前記物質をＰ２６と称することとし、３３回連続継代された物質をＰ３３と称することとする。一般に、８９−１２をｎ回継代することにより得られたロタウイルスをＰｎと称することとする。

以下の具体例（実施例）においては、Ｐ３３物質をＶｅｒｏ細胞において更に５回継代した。これをＰ３８と称することとする。

Vaccine (1998)論文に記載のＰ２６およびＰ３３分離体はカルチャーコレクションに寄託されておらず、遺伝的特徴づけを確立するための分析もなされていない。

該文献に記載のＰ２６集団は変異体の混合物を含むことが本発明において見出された。これは後記（実施例を参照されたい）の遺伝的特徴づけにより確認されている。したがって、Ｐ２６は、更なる継代のための、特にワクチンロットの製造のための信頼しうる程度に一貫した集団ではない。同様に、Ｐ３３は変異体の混合物を含み、ワクチンロットの製造のための信頼しうる程度に一貫したものではない。

Ｐ２６物質は少なくとも３つのＶＰ４遺伝子変異体の混合物であることが見出されている。同様に、Ｐ３３およびＰ３８は２つの変異体の混合物である。これらの変異体は、これらの変異体に対してＰ３３でワクチン接種された乳児からの血清の中和抗体価を評価した場合、ＡＴＣＣに寄託されている８９−１２Ｃ２株とは中和エピトープの点で抗原的に異なっているらしい。

さらに、Ｐ３３物質を乳児に投与した場合、２つの特定されている変異体が複製され排泄されることが見出されている。ワクチン接種された１００人の乳児のうち、２人だけがロタウイルス感染による胃腸炎の徴候を示し、プラセボ群の２０％が感染した。これらの知見は、特定されている変異体がロタウイルス感染の防御に関連していることを示唆している。

ＷＯ０１／１２７９７は、ロタウイルス変異体の分離方法、およびクローン化（均一）ヒトロタウイルス株から誘導された改良された生弱毒化ロタウイルスワクチンを開示している。ＶＰ４およびＶＰ７と称される主要ウイルスタンパク質の少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列により定められる単一の変異体または実質的に単一の変異体を含むことを特徴とする弱毒化ロタウイルス集団（分離体）も開示されている。ラテンアメリカの乳児におけるＧ９異種株に対するそのような経口弱毒化ヒトロタウイルスワクチンの防御効力が報告されている（Perezら, 42nd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC 2002) 27-30 September 2002, San Diego）。ＷＯ０５／０２１０３３は、１つのロタウイルス血清型を使用して、別の血清型により引き起こされる疾患を防御しうることを開示している。特に、ＷＯ０５／０２１０３３は、Ｇ１および少なくとも１つの非Ｇ１ロタウイルス血清型（限定的なものではないが例えばＧ２、Ｇ３、Ｇ４およびＧ９ロタウイルス血清型）の両方により引き起こされる疾患を予防するための、Ｇ１ロタウイルス集団［例えば、ブダペスト条約の条項に従いEuropean Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdomに受託番号９９０８１３０１として１９９９年８月１３日に寄託されているもの；Ｐ４３またはＲＩＸ４４１４とも称される］の使用を開示している。

ＷＯ０１／１２７９７およびＷＯ０５／０２１０３３の全内容を参照により本明細書に組み入れることとする。

発明の詳細な説明
本発明において、本発明者らは、弱毒化ロタウイルス集団、例えばＷＯ０１／１２７９７において特徴づけされているものをワクチンとして使用して、該ワクチンにおいて使用されているものとは異なる型（血清型および／または遺伝子型）のロタウイルス感染により引き起こされる疾患に対する交差防御を得ることが可能であることを確認した。ＶＰ７タンパク質はＧ型（血清型）を特定し、ＶＰ４タンパク質はＰ型株（血清型または遺伝子型）を特定する。

特に、本発明は、１つのＰ型の弱毒化ロタウイルス集団の、異なるＰ型のロタウイルス感染に関連した疾患の予防における使用、特に、Ｇｘ型およびＰｙ型のいずれでもないロタウイルス株により引き起こされるロタウイルス感染に関連した免疫応答の誘導および／または疾患の予防における、ＧｘＰｙ型の弱毒化ロタウイルス集団または株の使用に関する。

免疫は、該ワクチンに対する中和抗体応答により、または血清ロタウイルスＩｇＡ抗体応答、例えばセロコンバージョン因子（すなわち、Wardら, 1990, J. Infect. Disease, 161, 440-445に記載されているとおり、ワクチン接種後の血清抗体ＩｇＡレベルにおける３倍以上の増加）により測定されうる。

本発明においては、当技術分野における一般的な理解（Santos N. et Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29-56）に合致して、Ｇｘは特定のＧ型、すなわち、Ｇ遺伝子型またはＧ血清型（両方の専門用語は同一である）を意味し、Ｐｙなる語は一般には、Ｐ血清型（例えば、Ｐ８、Ｐ４）またはＰ遺伝子型（例えば、Ｐ［４］、Ｐ［８］）のいずれかの特定のＰ型を意味する。特定のＰ遺伝子型を示す場合には、Ｐおよびそれに続く大括弧内の割り当てられた数字が用いられ、その他の場合には、Ｐ型は血清型または遺伝子型のいずれかを意味する。

本明細書の全体にわたり、ロタウイルス疾患の予防のためのワクチン組成物の製造における本発明のワクチン組成物の使用、または該ワクチン組成物の使用を含む治療方法のような表現は、互換的に用いられる。

本発明者らは本発明において、ＧｘＰ［８］ロタウイルス集団［例えば、ブダペスト条約の条項に従いEuropean Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdomに受託番号９９０８１３０１として１９９９年８月１３日に寄託されているもの］が、ＧｘＰ［８］（例えば、Ｇ１Ｐ［８］）ならびにＧｘ型およびＰｙ型のいずれでもない少なくとも１つのロタウイルス株の両方により引き起こされる疾患を予防するために使用されうることを確認した。特に、本発明者らは、Ｇ１Ｐ［８］ロタウイルス集団が、１つのＧ１Ｐ［８］および少なくとも１つの非Ｇ１Ｐ［８］遺伝子型、例えばＧ２Ｐ［４］ロタウイルス遺伝子型の両方により引き起こされる疾患を予防するために使用されうることを確認した。

したがって、本発明は、１つのロタウイルス型（ここで、該型は、好適には、ロタウイルスＶＰ４タンパク質（Ｐ型）の配列に基づいて定められる）由来の弱毒化ロタウイルス集団の、別のロタウイルス型のロタウイルス感染に関連した疾患の予防における使用に関する。

本発明はまた、１つのロタウイルス株（特定のＧ型およびＰ型の両方により定められる）（ここで、該株は、好適には、ロタウイルスＶＰ４タンパク質（Ｐ型）およびＶＰ７タンパク質（Ｇ型）の両方の配列に基づいて定められる）由来の弱毒化ロタウイルス集団の、別のロタウイルス株のロタウイルス感染に関連した疾患の予防における使用に関する。特に、本発明は、Ｇｘ型およびＰｙ型のいずれでもないロタウイルス株により引き起こされるロタウイルス感染に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造における、ＧｘＰｙ型由来の弱毒化ロタウイルス株の使用に関する。換言すれば、本発明のロタウイルス株は、Ｇ型およびＰ型のいずれとも異なる別のロタウイルスの感染により引き起こされる疾患を予防するために使用されうる。

特に、特許を受けようとする本発明のすべての態様において、該免疫応答は防御免疫応答である。好適には、該ロタウイルス集団は、交差防御効果をもたらすのに適したＥＣＡＣＣ受託番号９９０８１３０１のＶＰ４および／またはＶＰ７ウイルスタンパク質を含む。

本明細書の全体にわたり、交差防御は、あるロタウイルス型によりもたらされる、異なる型のロタウイルスにより引き起こされる感染に対する防御を意味する。交差防御は同型または異型でありうる。同型交差防御は、Ｇ型またはＰ型のいずれかの株に対する、ロタウイルス株によりもたらされる防御である。例えば、Ｇ１Ｐ［８］株は非Ｇ１の［Ｐ８］株（例えば、Ｇ２Ｐ［８］型）に対する交差防御をもたらす。同型交差防御のもう１つの例は、Ｇ１型を介して、Ｇ１非Ｐ［８］株（例えば、Ｇ１Ｐ［４］）に対して、Ｇ１Ｐ［８］株によりもたらされるものである。異型交差防御は、異なるＰ型およびＧ型のロタウイルス株に対して、ロタウイルス株によりもたらされる防御、例えば、非Ｇ１非Ｐ［８］株（例えば、Ｇ２Ｐ［４］）に対してＧ１Ｐ［８］によりもたらされる防御（Ｇ型およびＰ型の両方を介してもたらされる異型防御）である。

好適には、弱毒化ロタウイルス血清型はＧ１であり、Ｇ１ロタウイルス血清型ならびに非Ｇ１ロタウイルス血清型、例えばＧ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１３およびＧ１４からなる群より選択される血清型により引き起こされる疾患に対する交差防御をもたらしうる。

特に、Ｇ１弱毒化ロタウイルス集団［例えば、ブダペスト条約の条項に従いEuropean Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdomに受託番号９９０８１３０１として１９９９年８月１３日に寄託されているもの］は、Ｇ１ならびにＧ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１３およびＧ１４からなる群より選択される少なくとも１つ、好適には少なくとも２つ、好適には少なくとも３つ、好適には少なくとも４つの非Ｇ１ロタウイルス血清型により引き起こされる疾患を予防するために使用されうる。したがって、Ｇ１型由来ではないロタウイルス株により引き起こされるロタウイルス感染に対する免疫応答を誘導するためのワクチン組成物の製造における、Ｇ１型由来の弱毒化ロタウイルス株の使用を提供する。特定の態様においては、免疫応答は、少なくとも１つ、少なくとも２つまたはそれ以上のロタウイルス非Ｇ１血清型に対して、典型的には、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１３およびＧ１４からなる群より選択される任意の血清型に対して誘導される。典型的には、同型（Ｇ１）防御に加えて、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４およびＧ９の非Ｇ１型の少なくとも１つ、好適には少なくとも２つ、好適には少なくとも３つに対して免疫応答が誘導される。好適には、該組成物はＧ１ロタウイルス株を含み、Ｇ１型およびＧ２型に対する免疫応答を誘導するために使用される。

好適には、ロタウイルス弱毒化株型はＰ［８］であり、Ｐ［８］ロタウイルス型ならびに非Ｐ［８］ロタウイルス型、例えばＰ［１］、Ｐ［２］、Ｐ［３］、Ｐ［４］、Ｐ［５］、Ｐ［６］、Ｐ［７］、Ｐ［９］、Ｐ［１０］、Ｐ［１１］、Ｐ［１２］、Ｐ［１４］およびＰ［１９］からなる群より選択される型により引き起こされる疾患に対する交差防御をもたらしうる。

特に、Ｐ［８］弱毒化ロタウイルス集団［例えば、ブダペスト条約の条項に従いEuropean Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdomに受託番号９９０８１３０１として１９９９年８月１３日に寄託されているもの］は、Ｐ［８］ならびにＰ［１］、Ｐ［２］、Ｐ［３］、Ｐ［４］、Ｐ［５］、Ｐ［６］、Ｐ［７］、Ｐ［９］、Ｐ［１０］、Ｐ［１１］、Ｐ［１２］、Ｐ［１４］およびＰ［１９］からなる群より選択される非Ｐ［８］ロタウイルス型の少なくとも１つにより引き起こされる疾患を予防するために使用されうる。特に、好適には、Ｐ［８］ロタウイルス型に加えて、少なくともＰ［４］型に対して免疫応答が誘導される。

好適には、本発明の使用のためのワクチン組成物はＧ１Ｐ［８］ロタウイルス株を含み、Ｇ２Ｐ［４］ロタウイルス株に対する免疫応答を誘導しうる。

特定の態様においては、本発明は、ロタウイルス株に対する免疫応答を誘導する方法であって、ＧｘＰｙ型の弱毒化ロタウイルス株を含んでなる組成物を被験体に投与するステップを含み、該組成物はＧｘ型およびＰｙ型のいずれでもないロタウイルス株に対する免疫応答を生起するものである、上記方法に関する。

特に、本発明は、ロタウイルスＧ１血清型ワクチンを含んでなる組成物を被験体に投与するステップを含む、ロタウイルスＧ１および非Ｇ１血清型に対する免疫応答を誘導する方法に関する。好適には、非Ｇ１ロタウイルス血清型は、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１３およびＧ１４からなる群より選択される。好適には、該組成物はＧ１ロタウイルス株を含み、Ｇ１およびＧ２型に対する免疫応答を誘導するために使用される。

好適には、本発明の使用のためのワクチン組成物はＧ１Ｐ［８］ロタウイルス株を含み、Ｇ２Ｐ［４］ロタウイルス株に対する免疫応答を誘導しうる。

好適には、該ワクチン組成物中のロタウイルス集団はＧ１Ｐ１Ａ（すなわち、現在の命名法によればＧ１Ｐ［８］）株特異性のものである。適切には、該ロタウイルス集団は、免疫応答を惹起し典型的には交差防御効果をもたらすのに適したＥＣＡＣＣ受託番号９９０８１３０１からのＶＰ４および／またはＶＰ７ウイルスタンパク質を含む。好適には、本発明は、前記の方法または使用におけるＧ１Ｐ［８］ロタウイルス株に関する。典型的には、使用するロタウイルスワクチンはＥＣＡＣＣ受託番号９９０８１３０１であり、あるいは該寄託物から誘導される。

特定の態様においては、該ワクチンは、ワクチン接種されていない個体（プラセボ群）と比較した場合にワクチン接種された個体において胃腸炎に対する交差防御免疫応答または交差防御を誘導する。好適には、該ワクチンはロタウイルス感染症状、例えば下痢または胃腸炎に対する交差防御をもたらす。例えば、胃腸炎は、水様性または正常より軟らかい１日３回以上の排便により特徴づけられる下痢または強制的（forceful）嘔吐および検便試料におけるロタウイルスの検出と定義されうる。

当業者に理解されるとおり、疾患の重症度、およびワクチン接種された個体またはワクチン接種された集団における防御免疫応答を誘導するワクチン接種の効力は、いくつかの手段により評価されうる。防御免疫は、ロタウイルス感染に関連した臨床症状の重症度の軽減をもたらすまたはロタウイルス感染に対する感受性の軽減をもたらす免疫応答を意味する。ワクチン接種されていない個体またはワクチン接種された個体における疾患の重症度は、公開されている評価系、例えば２０ポイントＶｅｓｉｋａｒｉ尺度または該方法の若干の修正形態（Ruuska Tら, Scand. J. Infect. Dis. 1990, 22, 259-267）に従い、あるいはロタウイルス感染の特異的症状を報告し評価する任意の他の好適な系（例えば、Clark HF, Borian EF, Bell LM. Protective effect of WC3 vaccine against rotavirus diarrhea in infants during a predominantly serotype 1 rotavirus season. J Infect Dis. 1988:570-86に報告されている方法）に従い評価されうる。Ｖｅｓｉｋａｒｉ法によれば、重症ＲＶＧＥは通常、１１以上のスコアとして定義される。

防御はワクチン効力（ＶＥ）により集団または群のレベルで評価されうる。ワクチン効力は、以下の式を用いて計算される：
ＶＥ（％）＝１−ＲＲ＝１−（ＡＲＶ／ＡＲＵ）、ここで、
ＲＲ＝相対リスク＝ＡＲＶ／ＡＲＵ
ＡＲＵ＝（プラセボ群から推定される）ワクチン接種されていない集団における疾患罹患率＝少なくとも１つのＲＶ ＧＥエピソードを報告した被験体の数／対照群における被験体の総数
ＡＲＶ＝ワクチン接種された群における疾患罹患率＝少なくとも１つのＲＶ ＧＥエピソードを報告した被験体の数／ＨＲＶワクチン群における被験体の総数。

したがって、本発明の１つの態様においては、ＧｘＰｙ型の弱毒化ロタウイルス株を含んでなる前記組成物が、Ｇｘ型およびＰｙ型のいずれでもないロタウイルス株の感染により引き起こされる、ロタウイルス誘発性胃腸炎、好適には重症ロタウイルス誘発性胃腸炎に対する防御および／または交差免疫防御を誘導する、前記の方法または使用を提供する。特定の実施形態においては、前記防御免疫応答は、任意の好適な評価系により測定した場合に、該疾患の重症度を軽減しうる、またはロタウイルス誘発性疾患を排除しうる。

さらにもう１つの実施形態においては、該疾患、例えば胃腸炎の重症度を軽減するための、またはロタウイルス誘発性疾患を排除するための方法または本発明の組成物の使用であって、該疾患重症度または疾患が前記の任意の好適な評価系により記録される、上記方法または組成物を提供する。

特定の実施形態においては、該組成物は、ワクチン接種された個体集団において、該組成物中に存在する弱毒化ロタウイルスの型とは異なる型のロタウイルスの感染により引き起こされる下痢に対して６０％までの防御力、好適には８１％までの防御力を示す。もう１つの特定の実施形態においては、該組成物は、ワクチン接種された個体集団において、Ｇｘ型およびＰｙ型のいずれでもないロタウイルス株により引き起こされる下痢に対して少なくとも４０％の防御力、好適には少なくとも４５％の防御力、好適には少なくとも５０％の防御力、好適には少なくとも６０％の防御力を示す。特定の態様においては、該組成物は、Ｇｘ型およびＰｙ型のいずれでもないロタウイルス株により引き起こされる下痢に対して４０％〜８０％の防御力、好適には５０％〜７０％の防御力を示す。特定の態様においては、該組成物は、Ｇ２Ｐ[４]型のロタウイルス株の感染により引き起こされる胃腸炎に対して前記の防御のレベルを与えるＧ１Ｐ[８]ロタウイルス株を含む。

好適には、Ｇｘ型およびＰｙ型のいずれでもないロタウイルス株に感染したワクチン接種された個体集団において達成される、下痢および／または胃腸炎および／または重症胃腸炎に対する防御力は、１０〜９０％、好適には２０〜８０％、好適には４０％〜８０％、好適には４５％〜７５％の防御力を示す。典型的には、重症胃腸炎に対する防御のレベルは少なくとも４０％、好適には少なくとも５０％である。

特定の態様においては、該組成物は、ワクチン接種された個体集団において、Ｇ２Ｐ［４］血清型を有するロタウイルスの感染により引き起こされた重症胃腸炎に対してＶｅｓｉｋａｒｉスコアによる測定で４０％〜８０％の防御力、好適には４５％〜７５％の防御力を示すＧ１Ｐ［８］ロタウイルス株を含む。

好適には、該ワクチンは２用量または３用量レジメンで投与される。

交差防御を得るために使用されるロタウイルスワクチンは以下の好適な特徴を有する。

１つの態様においては、本発明の使用のための組成物のロタウイルスは、以下のもの：開始コドンから始めて７８８位のアデニン塩基（Ａ）、８０２位のアデニン塩基（Ａ）および５０１位のチミン塩基（Ｔ）のうち少なくとも１つを含むヌクレオチド配列を含むＶＰ４遺伝子を有する。

もう１つの態様においては、本発明の使用のための組成物のロタウイルスは、以下のもの：開始コドンから始めて６０５位のチミン（Ｔ）、８９７位のアデニン（Ａ）または８９７位のグアニン（Ｇ）のうち少なくとも１つを含むヌクレオチド配列を含むＶＰ７遺伝子を有する。好適には、８９７位にアデニン（Ａ）が存在する。

特定の態様においては、本発明の使用のための組成物のロタウイルスは、開始コドンから始めて７８８位および８０２位のアデニン（Ａ）ならびに５０１位のチミン（Ｔ）をＶＰ４遺伝子配列中に有する。

もう１つの特定の態様においては、本発明の使用のための組成物のロタウイルスは、開始コドンから始めて６０５位のチミン（Ｔ）および８９７位のアデニン／グアニン（Ａ／Ｇ）をＶＰ７配列中に有する。最も好適には、ＶＰ７配列中の８９７位にアデニン（Ａ）が存在する。

特に好適な態様においては、本発明の使用のための組成物のロタウイルスは、開始コドンから始めて７８８位および８０２位のアデニン（Ａ）ならびに５０１位のチミン（Ｔ）をＶＰ４遺伝子配列中に有し、開始コドンから始めて６０５位のチミン（Ｔ）および８９７位のアデニン／グアニン（Ａ／Ｇ）をＶＰ７配列中に有する。好適には、ＶＰ７配列中の８９７位にアデニン（Ａ）が存在する。

もう１つの態様においては、本発明の使用のための組成物のロタウイルスは、図１Ａ（配列番号１）もしくは図１Ｂ（配列番号２）に示す、ＶＰ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および／または図２Ａ（配列番号３）もしくは図２Ｂ（配列番号４）に示す、ＶＰ７タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。もう１つの実施形態においては、本発明の使用のための組成物のロタウイルスは、図３（配列番号５）に記載のＶＰ４タンパク質および／または図４（配列番号６）に記載のＶＰ７タンパク質を含む。もう１つの実施形態においては、本発明の使用のための該ロタウイルス集団は更に、図５（配列番号７）に記載されている、もしくは図６（配列番号８）に記載のヌクレオチド配列によりコードされるＮＳＰ４タンパク質、および／または図７（配列番号９）に記載されている、もしくは図８（配列番号１０）に記載のヌクレオチド配列によりコードされるＶＰ６タンパク質を含む。

本発明における使用のための好適なロタウイルス集団は、
ロタウイルス集団を好適な細胞タイプで継代し、
場合によっては、
ａ）限界希釈または
ｂ）個々のプラークの単離
のいずれかのステップを用いて均一な培養物を選択し、
ＶＰ４および／またはＶＰ７遺伝子配列の適当な領域の配列決定を行うことにより実質的に単一の変異体の存在を調べることを含む方法により入手可能である。

好適には、該ロタウイルス集団は、前記のとおりＰ４３（ＲＩＸ４４１４）、Ｐ３３またはＰ２６株から誘導される。

該配列決定は、好適には、スロットブロットハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションのような定量的または半定量的ハイブリダイゼーション技術により行われうる。

本発明の方法により得られたクローン化ウイルス集団は、好適な細胞株で更に継代することにより増幅されうる。

前記の方法におけるロタウイルス集団を継代するための好適な細胞タイプにはアフリカミドリザル腎（ＡＧＭＫ）細胞が含まれ、これは樹立細胞株または初代ＡＧＭＫ細胞でありうる。好適なＡＧＭＫ細胞株には、例えばＶｅｒｏ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１）、ＤＢＳ−ＦＲｈＬ−２（ＡＴＣＣ ＣＬ−１６０）、ＢＳＣ−１（ＥＣＡＣＣ ８５０１１４２２）およびＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７０）が含まれる。ＭＡ−１０４（アカゲザル）およびＭＲＣ−５（ヒト−ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）細胞株も含まれる。Ｖｅｒｏ細胞は増幅目的に特に好適である。Ｖｅｒｏ細胞での継代は高いウイルス収率を与える。

該方法から得られたウイルス集団内に単一の変異体が存在するかどうかを調べるための、およびその単一の変異体の性質を決定するための技術は、当技術分野で公知の標準的な配列決定またはハイブリダイゼーション法を含み、これらは後記で説明されている。

特定の態様においては、本発明の方法は、好適なロタウイルス、特に８９−１２株またはその継代誘導体の特性を有するロタウイルスを使用して行われる。

特に好適な単一の変異体の集団はＰ４３であり、これは、一連のエンドポイント希釈クローニング工程、およびそれに続く、増幅のためのＶｅｒｏ細胞上での該クローン化体の継代により、Ｐ３３（好適な細胞型上の培養内で３３回継代された分離ヒトロタウイルス）から得られた。

Ｐ４３集団は、ブダペスト条約の条項に従いEuropean Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdomに受託番号９９０８１３０１として１９９９年８月１３日に寄託されており、ＷＯ０１／１２７９７に開示されている。

この示されている公的な入手可能性は、ヒトロタウイルスＰ４３を入手する最も簡便な方法であるが、本発明の教示を考慮して、これらのまたは他の方法により、同様の機能的に実質的に同一のロタウイルスが製造されうる。そのような機能的に実質的に同一のロタウイルスは本発明のヒトロタウイルスＰ４３と生物学的に同等であるとみなされ、したがって、本発明の全体的な範囲に含まれる。したがって、本発明は、本明細書に記載のＰ４３変異体の特性を有するロタウイルス集団を包含すると理解されるであろう。

また、本発明は、寄託されているＰ４３ ＥＣＡＣＣ ９９０８１３０１を更なる操作に付すことにより（例えば、該生ウイルスを使用する更なる継代、クローニングまたは他の方法によりそれを増殖させることにより、あるいは遺伝子操作技術または再集合技術を含むいずれかの方法でＰ４３を修飾することにより）それから誘導された物質を包含すると理解されるであろう。そのような工程および技術は当技術分野でよく知られている。

本発明に含まれる寄託されたＰ４３から誘導される物質にはタンパク質および遺伝物質が含まれる。特に関心が持たれるのは、Ｐ４３の少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのセグメントを含む再集合ロタウイルス、例えば、１１ゲノムセグメントの１つまたは１つの一部分がＰ４３のゲノムセグメントまたはその一部分により置換されているロタウイルスのビルレント株を含む再集合体である。特に、ＮＳＰ４をコードするセグメントまたは部分セグメントがＰ４３セグメントまたは部分セグメントであるロタウイルス再集合体は有用な特性を有しうる。再集合ロタウイルスおよびそれを製造するための技術はよく知られている（Foster, R. H.およびWagstaff, A. J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, a review. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9 (2), 155-178, 1998）。

特に関心が持たれる物質はＰ４３の後代およびＰ４３の免疫学的に活性な誘導体である。免疫学的に活性な誘導体は、宿主動物内に注入された場合にロタウイルスに対して反応性である免疫応答を惹起しうる、Ｐ４３ウイルスからまたはＰ４３ウイルスを使用して得られた物質、特に該ウイルスの抗原を意味する。

ロタウイルスを適当な細胞株、例えばＶｅｒｏ細胞に馴化させる際には、潜在的混入物（例えば、存在する可能性がある、そうでなければ混入を引き起こす外来性物質）を除去するために該ウイルスを処理することが必要かもしれない。エーテル感受性外来性ウイルスの場合、これは後記のエーテル処理により行われうる。本発明はまた、弱毒化生ロタウイルスまたはそれを使用して製剤化されるワクチンを得るための全体的操作における随意的ステップとして、そのようなエーテル処理を含めることに関する。

本発明の交差防御性ロタウイルスは、ロタウイルス感染または疾患に対する追加的な防御または交差防御を得るために、他のロタウイルス株と組合わされうる。

本発明はまた、好適なアジュバントまたは製薬用担体と混合された、前記で定義されているとおりの交差防御をもたらしうる生弱毒化ロタウイルスワクチンを提供する。

１つの実施形態においては、本発明の使用のためのロタウイルスワクチンは、単一のロタウイルス株、例えばＧ１Ｐ［８］を含有する単価ロタウイルスワクチンである。

本発明は、生弱毒化ロタウイルスがヒトロタウイルスであり腸重積症を引き起こさない生ロタウイルスワクチンの提供において特に有利である。

本発明の弱毒化ロタウイルス株と共に使用するための好適な製薬用担体には、特に乳児への経口投与に好適であるものとして当技術分野で公知の製薬用担体が含まれる。そのような担体には、限定的なものではないが、炭水化物、多価アルコール、アミノ酸、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、ヒドロキシアパタイト、タルク、酸化チタン、水酸化鉄、ステアリン酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微晶質セルロース、ゼラチン、植物性ペプトン、キサンタン、カラギーナン、アラビアゴム、β−シクロデキストリンが含まれる。

本発明はまた、ロタウイルスワクチンの製造方法であって、例えば、該ウイルスを好適な安定化剤の存在下で凍結乾燥させ、または本発明のウイルスを好適なアジュバントまたは製薬用担体と混合することによる上記製造方法を提供する。

脂質に基づくビヒクル、例えばビロゾームもしくはリポソーム中、または水中油型エマルション中、または担体粒子を使用して、本発明のウイルスを製剤化するのが有利かもしれない。その代わりに、またはそれに加えて、免疫刺激物質（例えば、経口ワクチン用の当技術分野で公知のもの）を該製剤中に含有させることが可能である。そのような免疫刺激物質には、細菌毒素、特に完全毒素（全分子）の形態のコレラ毒素（ＣＴ）またはＢ鎖のみの形態のコレラ毒素（ＣＴＢ）、および大腸菌（E. coli）の易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）が含まれる。天然ＬＴと比べて活性化形態へ変換されにくい突然変異ＬＴ（ｍＬＴ）がＷＯ９６／０６６２７、ＷＯ９３／１３２０２およびＵＳ５，１８２，１０９に記載されている。

有利に含有されうる他の免疫刺激物質として、サポニン誘導体、例えばＱＳ２１およびモノホスホリルリピドＡ、特に３−デ−Ｏ−アセチル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）が挙げられる。経口アジュバントとしての精製サポニンがＷＯ９８／５６４１５に記載されている。サポニンおよびモノホスホリルリピドＡは、別々に、または組合せて（例えば、ＷＯ９４／００１５３）使用することが可能であり、他の物質と共にアジュバント系中で製剤化することが可能である。３Ｄ−ＭＰＬは、Ribi Immunochem, Montanaにより製造されたよく知られたアジュバントであり、その製造はＧＢ２１２２２０４に記載されている。

経口免疫用のビヒクルおよびアジュバントに関する全般的な考察がVaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, PowellおよびNewman編, Plenum Press, New York, 1995に見出されうる。

本発明はまた、ヒト被験体、特に乳児にワクチン接種するための方法であって、それを要する被験体に本発明のワクチン組成物の有効量を投与することによる上記方法を提供する。好適には、該生弱毒化ワクチンは経口投与される。

特定の態様においては、本発明の弱毒化ロタウイルス株は、胃内の酸による該ワクチンの不活性化を最小限に抑えるための制酸剤と共に製剤化される。好適な制酸成分には、無機制酸剤、例えば水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）_３および水酸化マグネシウムＭｇ（ＯＨ）_２が含まれる。本発明での使用に好適な商業的に入手可能な制酸剤には、水酸化アルミニウムおよび水酸化マグネシウムを含有するＭｙｌａｎｔａ（商標）が含まれる。これらは水に不溶性であり、懸濁状態で投与される。

水酸化アルミニウムは、制酸効果だけでなくアジュバント化効果をももたらしうるため、本発明のワクチン組成物の特に好適な成分である。

有機制酸剤、例えば有機酸カルボン酸塩も、本発明のワクチン中の制酸剤として使用するのに好適である。本発明のワクチン組成物中の好適な制酸剤には、有機酸カルボン酸塩、特にクエン酸の塩、例えばクエン酸ナトリウムまたはクエン酸カリウムが含まれる。

本発明のワクチン組成物中で使用されうる特に好適な制酸剤は、不溶性無菌塩である炭酸カルシウム（ＣａＣＯ_３）である。炭酸カルシウムはロタウイルスと会合することが可能であり、ロタウイルスの活性は炭酸カルシウムとの会合中に維持される。

最終工程中の炭酸カルシウムの沈降を防ぐために、好適には該製剤中に粘性物質を存在させる。

使用されうる考えられうる粘性物質には擬似塑性賦形剤（pseudoplastic excipient）が含まれる。擬似塑性溶液は、攪拌下の粘度より高い粘度を静置時に有する溶液と定義される。このタイプの賦形剤は、天然ポリマー、例えばアラビアゴム、アドラガンテ（adragante）ガム、アルギナート、ペクチン、または半合成ポリマー、例えばカルボキシメチルセルロース（Ｔｙｌｏｓｅｓ Ｃ（登録商標））、メチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌｓ Ａ（登録商標）、Ｖｉｓｃｏｔｒａｎｓ ＭＣ（登録商標）、Ｔｙｌｏｓｅ ＭＨ（登録商標）およびＭＢ（登録商標））、ヒドロキシプロピルセルロース（Ｋｌｕｃｅｌｓ（登録商標））およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌｓ Ｅ（登録商標）およびＫ（登録商標）、Ｖｉｓｃｏｎｔｒａｎｓ ＭＰＨＣ（登録商標））である。一般に、それらの擬似塑性賦形剤はチキソトロピー物質と共に使用される。使用されうる他の粘性物質としては、低い流動能を有する擬似塑性賦形剤が挙げられる。十分な濃度のそれらのポリマーは、静置時に低い流動能を有する高粘度溶液を与える構造流体配置（structural fluid arrangement）を与える。流動および移動を可能にするためには、ある量のエネルギーが該系に与えられる必要がある。流体溶液を得るために構造流体配置を一時的に破壊するためには、外的エネルギー（攪拌）が必要とされる。そのようなポリマーの具体例として、Ｃａｒｂｏｐｏｌｓ（登録商標）およびキサンタンガムが挙げられる。

チキソトロピー賦形剤は静置時にはゲル構造体になるが、攪拌下では流体溶液を形成する。チキソトロピー賦形剤の具体例としては、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）（マグネシウム−アルミニウムシリカート）およびＡｖｉｃｅｌ ＲＣ（登録商標）（約８９％微晶質セルロースおよび１１％カルボキシメチルセルロースＮａ）が挙げられる。

本発明のワクチン組成物は、好適には、キサンタンガムまたはデンプンから選ばれる粘性物質を含む。

したがって、本発明のワクチン組成物は、典型的には、炭酸カルシウムとキサンタンガムとの組合せと共に製剤化される。

本発明において使用される組成物の他の成分には、好適には、糖、例えばスクロースおよび／またはラクトースが含まれる。

本発明のワクチン組成物は、例えば香味剤（特に経口ワクチン用）および静菌剤などの追加的成分を含有しうる。

本発明のワクチン組成物の種々の形態が想定される。

１つの好適な実施形態においては、該ワクチンは液体製剤として投与される。好適には、該液体製剤は、少なくとも以下の２つの成分：
ｉ）ウイルス成分、
ｉｉ）液体成分
から、投与前に再調製（reconstitute；還元）される。

この実施形態においては、該ウイルス成分および該液体成分は通常、別々の入れ物内に存在し、これは簡便には、単一の容器の別々の区画、または最終ワクチン組成物が空気にさらされることなく再調製されるよう連結されうる別々の容器でありうる。

還元前には、該ウイルスは乾燥形態または液体形態でありうる。好適には、該ウイルス成分は凍結乾燥される。凍結乾燥ウイルスは水溶液中のウイルスより安定である。凍結乾燥ウイルスは、好適には、液体ワクチン製剤を得るために液体制酸組成物を使用して再調製されうる。あるいは、凍結乾燥ウイルスは、水または水溶液で再調製されうる。この場合、凍結乾燥ウイルスは、好適には、制酸成分を含有する。

好適には、該ワクチン製剤は、１つの区画または容器内に、炭酸カルシウムおよびキサンタンガムと共に製剤化されたウイルス成分を含み、これは、第２の区画または容器内に存在する水または水溶液で再調製される。

もう１つの実施形態においては、該ワクチン組成物は、固体製剤、好適には、口内に配置された場合の即座の溶解に好適な凍結乾燥ケークである。凍結乾燥製剤は、簡便には、医薬ブリスター包装内の錠剤の形態で提供されうる。

もう１つの態様においては、本発明は経口投与用の急速溶解性錠剤の形態のロタウイルスワクチンを提供する。

もう１つの態様においては、本発明は、生弱毒化ロタウイルス株、特にヒトロタウイルス株を含む組成物を提供し、ここで、該組成物は、口内に配置された場合に即座に溶解しうる凍結乾燥固体である。

好適には、本発明の急速溶解性錠剤は被験体の口内で、未溶解錠剤の嚥下を防ぐのに十分な程度に急速に溶解する。このアプローチは小児用ロタウイルスワクチンに特に有利である。

好適には、該ウイルスは、無機制酸剤、炭酸カルシウム、および粘性物質、例えばキサンタンガムと共に製剤化された生弱毒化ヒトロタウイルスである。

本発明のもう１つの態様は、ウイルス成分が、炭酸カルシウムおよびキサンタンガムと共に製剤化されたいずれかのロタウイルス株である、凍結乾燥製剤を提供することである。

本発明のワクチンは、典型的なワクチン被接種者において有意な有害な副作用を伴うことなくロタウイルス感染に対する有効な防御をもたらすための好適な量の生ウイルスを使用して、公知技術により製剤化され投与される。生ウイルスの好適な量は通常は１０^４〜１０^７フォーカス形成単位（ｆｆｕ）／用量である。ワクチンの典型的な用量は１０^５〜１０^６ｆｆｕ／用量を含み、ある期間にわたって数回の用量で投与され、例えば、２用量が２ヶ月間隔で投与されうる。しかし、特に発展途上国においては、２用量を超える用量、例えば３または４用量レジメンで投与するのが有利かもしれない。投与間の間隔は２ヶ月より長いまたは短いことが可能である。単一用量（１回量）または複数用量レジメンのための生ウイルスの最適量および投与の最適な時機は、被験体における抗体価の観察および他の応答を含む標準的な研究により確認されうる。

本発明のワクチンは、他の疾患、例えばポリオウイルスに対する防御のための他の好適な生ウイルスをも含みうる。あるいは、経口投与のための他の好適な生ウイルスワクチンは、本発明のロタウイルスワクチン組成物と異なる用量で、しかしそれと同じ機会に投与されうる。

Vaccine (1998)論文Ｐ３３物質でワクチン接種された１２人の４〜６月齢の乳児からの血清をＰ３３、Ｐ３８、Ｐ４３および８９−１２Ｃ２の中和に関して試験した。

試験された血清のすべての中和力価の範囲はＰ３３、Ｐ３８およびＰ４３に関して類似している。統計解析は全３種のウイルスに対する全体的な中和力価における有意差を示していない。このことは、Ｐ３３、Ｐ３８およびＰ４３のコンホメーション中和エピトープおよび非コンホメーション中和エピトープがＰ３３ワクチン接種乳児の抗Ｐ３３血清により同等に良く認識されることを示唆している。この観察は、このｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて示された中和エピトープがＰ３３、Ｐ３８およびＰ４３の間で変わらなかったことを間接的に示唆している。

しかし、Ｐ８９−１２Ｃ２の中和力価の範囲はＰ３３、Ｐ３８およびＰ４３と有意に異なる。この観察は、Ｐ３３、Ｐ３８およびＰ４３のコンホメーション中和エピトープおよび非コンホメーション中和エピトープがＰ３３ワクチン接種乳児の抗Ｐ３３血清により同等に良くは認識されないことを示唆している。この観察は、このｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて示された中和エピトープが８９−１２Ｃ２とＰ３３、Ｐ３８およびＰ４３との間で変わっていたことを間接的に示唆している。

本発明の特に好適な実施形態には以下のものが含まれる。

１．ワクチン組成物の製造における、Ｐ型由来の弱毒化ロタウイルス株の使用であって、該ワクチン組成物が、該ワクチン組成物のものとは異なるＰ型のロタウイルスに対する免疫応答の誘導のためのものである、上記使用。

２．Ｐ［８］ではないロタウイルスに対する免疫応答の誘導のためのワクチン組成物の製造における、Ｐ［８］型由来の弱毒化ロタウイルス株の使用。

３．Ｇ１Ｐ［８］ではないロタウイルスに対する免疫応答の誘導のためのワクチン組成物の製造における、Ｇ１Ｐ［８］型由来の弱毒化ロタウイルス株の使用。

４．免疫応答が更に、Ｇ１Ｐ［８］型によるロタウイルス感染に対して誘導される、前記１〜３のいずれか１つに記載の使用。

５．免疫応答が２以上のロタウイルス血清型に対して誘導され、これらの血清型がＧまたはＰ型に基づいて定められる、前記１〜４のいずれか１つに記載の使用。

６．ワクチン株の血清型がＧ１血清型であり、非Ｇ１血清型が、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、Ｇ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１３およびＧ１４からなる群より選択される、前記１〜５のいずれか１つに記載の使用。

７．免疫応答がＧ１型およびＧ２型の両方に対して誘導される、前記６に記載の使用。

８．ワクチン株の型がＰ［８］型であり、非Ｐ［８］型が、Ｐ［１］、Ｐ［２］、Ｐ［３］、Ｐ［４］、Ｐ［５］、Ｐ［６］、Ｐ［７］、Ｐ［９］およびＰ［１１］型からなる群より選択される、前記１〜５のいずれか１つに記載の使用。

９．免疫応答がＰ［８］型およびＰ［４］型の両方に対して誘導される、前記８に記載の使用。

１０．前記組成物が、以下のもの：開始コドンから始めて７８８位のアデニン塩基（Ａ）、８０２位のアデニン塩基（Ａ）および５０１位のチミン塩基（Ｔ）のうち少なくとも１つをヌクレオチド配列中に含むＶＰ４遺伝子を有するロタウイルスを含んでなる、前記１〜９のいずれか１つに記載の使用。

１１．ＶＰ４遺伝子が、開始コドンから始めて７８８位および８０２位のアデニン塩基（Ａ）ならびに５０１位のチミン塩基（Ｔ）を含むヌクレオチド配列を含む、前記１０に記載の使用。

１２．前記組成物が、以下のもの：開始コドンから始めて６０５位のチミン（Ｔ）、８９７位のアデニン（Ａ）および８９７位のグアニン（Ｇ）のうち少なくとも１つをヌクレオチド配列中に含むＶＰ７遺伝子を有するロタウイルスを含んでなる、前記１１に記載の使用。

１３．ＶＰ７遺伝子が、開始コドンから始めて６０５位のチミン（Ｔ）および８９７位のアデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）を含むヌクレオチド配列を含む、前記１２に記載の使用。

１４．該組成物が、開始コドンから始めて７８８位および８０２位のアデニン（Ａ）ならびに５０１位のチミン（Ｔ）をヌクレオチド配列中に含むＶＰ４遺伝子を有するロタウイルスを含んでなり、ＶＰ７遺伝子が、開始コドンから始めて６０５位のチミン（Ｔ）および８９７位のアデニンをヌクレオチド配列中に含む、前記１〜１３のいずれか１つに記載の使用。

１５．該組成物が、該組成物中に存在する弱毒化ロタウイルスのＧ型および／またはＧ型に基づいて定められるものとは異なる型のロタウイルスによる感染により引き起こされる胃腸炎および／または下痢を軽減しまたはそれらに対して防御する、前記１〜１４のいずれか１つに記載の使用。

１６．前記組成物が、ワクチン接種された個体集団において、Ｇ型および／またはＰ型に基づいて定められる少なくとも２つの株のロタウイルスの感染により引き起こされる重症胃腸炎に対して少なくとも４０％の防御力を示すＧ１Ｐ［８］ロタウイルス株を含んでなり、これらの型が、該組成物中に存在する弱毒化ロタウイルスのＧ１Ｐ［８］型とは異なる、前記１５に記載の使用。

１７．重症胃腸炎が、少なくとも３つ、少なくとも４つの非Ｇ１血清型のロタウイルスの感染により引き起こされる、前記１６に記載の使用。

１８．非Ｇ１血清型がＧ２、Ｇ３、Ｇ４およびＧ９血清型のいずれかである、前記１７に記載の使用。

１９．重症胃腸炎が少なくとも２つの非Ｐ［８］型のロタウイルスの感染により引き起こされる、前記１８に記載の使用。

２０．重症胃腸炎がＰ［４］型のロタウイルスの感染により引き起こされる、前記９に記載の使用。

２１．前記ロタウイルス株が、ＥＣＡＣＣ受託番号９９０８１３０１であるか、またはＥＣＡＣＣ受託番号９９０８１３０１から取得可能もしくは誘導可能である、前記１〜２０のいずれか１つに記載の使用。

２３．前記ワクチンを、２用量レジメンで投与する、前記１〜２０のいずれか１つに記載の使用。

もう１つの態様においては、本発明はまた、ロタウイルス株によるロタウイルス感染に対する免疫応答を誘導する方法であって、異なる株由来の弱毒化ロタウイルスワクチンを含んでなる組成物を被験体に投与するステップを含む方法に関する。特に、本発明は、１つのＰ型のロタウイルスに対する免疫応答を誘導する、および／または１つＰ型のロタウイルス感染に関連した疾患を予防するための方法であって、異なるＰ型の弱毒化ロタウイルス集団を、それを要する患者に投与するステップを含む方法に関する。

本発明の特定の態様においては、ロタウイルスＰ［８］型ワクチンを含んでなる組成物を被験体に投与するステップを含んでなる、Ｐ［８］ロタウイルス型ならびにＰ［１］、Ｐ［２］、Ｐ［３］、Ｐ［４］、Ｐ［５］、Ｐ［６］、Ｐ［７］、Ｐ［９］、Ｐ［１１］、Ｐ［１２］、Ｐ［１４］およびＰ［１９］型、好適にはＰ［４］ロタウイルス型からなる群より選択される非Ｐ［８］型の少なくとも１つに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。

本発明のもう１つの態様においては、（ｉ）図５（配列番号７）に示す単離された非構造タンパク質４（ＮＳＰ４）タンパク質配列またはその免疫原性断片、（ｉｉ）該ＮＳＰ４ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）図６（配列番号８）に示す核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。

本発明の更にもう１つの態様においては、（ｉ）図７（配列番号９）に示す単離されたロタウイルスタンパク質６（ＶＰ６）タンパク質配列またはその免疫原性断片、（ｉｉ）該ＶＰ６ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）図８（配列番号１０）に示す核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。

免疫原性断片は、本発明においては、（単独でまたは担体結合ハプテンとして）有効量で投与された場合にロタウイルス感染に対する防御免疫応答を惹起する断片と定義されうる。

以下の非限定的な実施例は本発明を例示するものである。

継代２６（Ｐ２６）の株８９−１２が変異体の混合物であることの証明
種々の継代ロットからのＶＰ４およびＶＰ７遺伝子の配列決定
継代Ｐ２６（初代ＡＧＭＫ細胞）、継代Ｐ３３（（初代に対立するものとしての）樹立ＡＧＭＫ細胞株）、継代Ｐ４１および継代Ｐ４３からのＶＰ４およびＶＰ７遺伝子の配列決定を行った。全ＲＮＡ抽出物を逆転写し、ＰＣＲにより増幅した（１チューブ／１工程）。

プライマーＲｏｔａ５ｂｉｓおよびＲｏｔａ２９ｂｉｓはＶＰ４遺伝子全体を増幅し、プライマーＲｏｔａ１およびＲｏｔａ２ｂｉｓはＶＰ７遺伝子全体を増幅した。該ＰＣＲ物質は種々のプライマー（表１を参照されたい）を使用して配列決定されている。

継代Ｐ２６配列は継代Ｐ３３配列と、ＶＰ４においては３塩基（開始コドンから５０１、７８８および８０２ｂｐの位置）、ＶＰ７においては３塩基（開始コドンから１０８、６０５および８９７ｂｐ）異なっていた。

ＶＰ４およびＶＰ７の継代Ｐ２６配列スキャンは、突然変異点において、バックグラウンドとしての継代Ｐ３３配列の存在を示している。したがって、継代Ｐ２６は少なくとも２つの変異体の混合物であることが認められうる。

継代Ｐ３３配列スキャンはＶＰ４においては均一であり、ＶＰ７においては不均一であるらしい（表２を参照されたい）。

継代Ｐ３８（継代３３から誘導）はＶｅｒｏ細胞で５回継代され、継代Ｐ３３（ＡＧＭＫ細胞株）と同じ組合せのＶＰ４およびＶＰ７配列を示した。したがって、Ｐ３３とＰ３８との間で集団において大きな変化は存在しなかった。

表２において太字で示されている塩基はＶＰ４およびＶＰ７における特異的配列変異の部位である。

表３．１において、特定の位置において二者択一の塩基が存在する場合、それらの２つのうちの最初の塩基は、主要集団に存在する塩基を表し、２番目の塩基は、副次的集団に存在する塩基である。主要および副次的変異体集団は配列決定におけるシグナルの強度により判定される。

表３．２は、変異体間のヌクレオチドの相違により生じたアミノ酸の変化を示す。

スロットブロットハイブリダイゼーション
ＡＧＭＫ細胞での継代Ｐ２６〜Ｐ３３の間の集団における変化を更に、スロットブロットハイブリダイゼーションにより確認した。ＲＴ／ＰＣＲにより作製されたＶＰ４およびＶＰ７遺伝子断片を、各変異体（表３．１および表３．２を参照されたい）に特異的なオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。Ｒｏｔａ１６、Ｒｏｔａ３５およびＲｏｔａ３６とはハイブリダイズしたがＲｏｔａ１５とはハイブリダイズしなかったＰ２６とは対照的に、Ｐ３３物質のＶＰ４ ＰＣＲ断片は、７８８位および８０２位において、Ｒｏｔａ１６のみとハイブリダイズし、Ｒｏｔａ１５およびＲｏｔａ３５およびＲｏｔａ３６のいずれともハイブリダイズしなかった。これらの結果はＰ２６における少なくとも３つの変異体の存在を確証するものであった（表４を参照されたい）。

Ｐ３３物質のＶＰ７ ＰＣＲ断片に関しては、８９７位はＲｏｔａ４１およびＲｏｔａ４２とハイブリダイズした。これらの結果はＰ３３物質における少なくとも２つの変異体の存在を確証するものであった。

Ｐ４３クローンの単離および特徴づけ
Ｐ３３成分を均一ウイルス集団として単離するために、Ｖｅｒｏ細胞上でのＰ３３／ＡＧＭＫの３回のエンドポイント希釈を行い、得られたウイルスを使用してＶｅｒｏ細胞に感染させた。

以下の２つの基準を用いて陽性ウェルを選択した：該ウェルにおいて検出された最大数のフォーカスにより示された増殖、および古典的な方法で行った場合に該プレート上で最もよく単離された陽性ウェル。９６ウェルマイクロタイタープレートにおける３回のエンド希釈継代の後、１０個の陽性ウェルをＶｅｒｏ細胞で連続的に増殖させ、それらの収量に関して評価した。収量に基づき、３個のクローンを製造用ロットの継代レベルへに進めた。ポリクローナル抗体による免疫認識は、それらの３つのクローン間およびそれらのクローンとＰ３３との間の両方で類似していることが示された。それらのクローンの均一性をスロットブロットハイブリダイゼーションにより評価した。単一クローンの最終選択は収量および配列に基づくものであった。

選択されたクローンをＶｅｒｏ細胞での連続継代により増幅させて、マスターシード、実施用シード、そして最終的な製造用ロットを得た。

これらの選択されたクローンを、ＰＣＲ増幅物質のＶＰ４およびＶＰ７の特異的スロットブロットハイブリダイゼーション（均一性）ならびにＶＰ４およびＶＰ７の配列決定（同一性）により種々の継代レベルで遺伝的に特徴づけした。Ｐ４３物質のＶＰ４およびＶＰ７遺伝子の配列を、それぞれ図１および図２に示す。それらはＰ４１と同じである。

選択されたクローンの均一性を、Ｐ２６／初代ＡＧＭＫの配列決定中に特定された各変異体に関して、ＶＰ４および／またはＶＰ７領域におけるヌクレオチドの変化を識別するオリゴヌクレオチドプローブを使用する選択的ハイブリダイゼーションにより評価した（表４を参照されたい）。

ＶＰ４断片はＲｏｔａ１６にはハイブリダイズしたが、Ｒｏｔａ１５、Ｒｏｔａ３５およびＲｏｔａ３６のいずれにもハイブリダイズしなかった。ＶＰ７断片はＲｏｔａ４１にはハイブリダイズしたが、Ｒｏｔａ４２にはハイブリダイズしなかった。

これらの結果は、Ｐ４３が均一集団であることを証明した。

潜在的外来ウイルスの除去
Ｐ３３（ＡＧＭＫ増殖体）にエーテルを２０％の最終濃度まで１時間加えた。ついで窒素を３５分間通気させてエーテルを除去した。Ｐ３３シードの力価に対する影響は観察されなかった。

生弱毒化ワクチンの製剤化
前記の製造用ロットを、以下の方法により、乳児への経口投与用に製剤化する。

１．凍結乾燥ウイルス
ウイルス用量を調製するためには標準的な技術を用いる。凍結精製ウイルスバルクを解凍し、適当な培地組成物、この場合はダルベッコ変法イーグル培地で、所望の標準的なウイルス濃度、この場合は１０^６．２ｆｆｕ／ｍｌまで希釈する。ついで、希釈されたウイルスを凍結乾燥安定剤（スクロース４％、デキストラン８％、ソルビトール６％、アミノ酸４％）で、目標ウイルス力価、この場合は１０^５．６ｆｆｕ／用量まで、更に希釈する。安定化ウイルス組成物の０．５ｍｌアリコートを３ｍｌバイアルへ無菌的に移す。ついで各バイアルをゴム栓で部分的に閉じ、該サンプルを真空下で凍結乾燥させ、ついで該バイアルを完全に閉じ、該栓を所定の位置に維持するために該バイアルの周囲に適所にアルミニウムキャップをクリンプ（crimp）する。

使用する際には、以下の制酸再調製剤の１つを使用して該ウイルスを再調製する。

（ａ）クエン酸塩再調製剤
クエン酸ナトリウムを水に溶解し、濾過滅菌し、５４４ｍｇ クエン酸Ｎａ_３．２Ｈ_２Ｏ／１．５ｍｌ用量の濃度で１．５ｍｌの量で再調製容器内に無菌的に移す。該再調製容器は、例えば３ｍｌバイアルまたは４ｍｌバイアルまたは２ｍｌシリンジ、または経口投与用の軟プラスチック圧搾可能カプセルでありうる。無菌条件下で無菌成分を維持する代わりに、最終容器を高圧滅菌することが可能である。

（ｂ）Ａｌ（ＯＨ） _３ 再調製剤
無菌水酸化アルミニウム懸濁液（Ｍｙｌａｎｔａ−商標）を無菌水中で無菌的に希釈し、４８ｍｇのＡｌ（ＯＨ）_３をそれぞれ含む２ｍｌの量で再調製容器（例えば、２ｍｌシリンジまたは軟プラスチック圧搾可能カプセル）へ無菌的に移す。無菌条件下で無菌成分を使用する代替手段は、該水酸化アルミニウム懸濁液に（好ましくは希釈段階で）γ線照射することである。

該懸濁液の沈降を防ぐための標準的な成分を含有させる。そのような標準的な成分には、例えば、ステアリン酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微晶質セルロースおよびシリコーンポリマーが含まれる。静菌剤、例えばブチルパラベン、プロピルパラベン、または食品中で使用される他の標準的な静菌剤、および香味剤も含有させることが可能である。

２．液体製剤中のＡｌ（ＯＨ） _３ の存在下の凍結乾燥ウイルス
ウイルス用量を調製するためには標準的な技術を用いる。凍結精製ウイルスバルクを解凍し、適当な培地組成物、この場合はダルベッコ変法イーグル培地で、所望の標準的なウイルス濃度、この場合は１０^６．２ｆｆｕ／ｍｌまで希釈する。水酸化アルミニウム懸濁液を加えて４８ｍｇ／用量の最終量とし、該ウイルス組成物を凍結乾燥安定剤（スクロース４％、デキストラン８％、ソルビトール６％、アミノ酸４％）で、目標ウイルス力価、この場合は１０^５．６ｆｆｕ／用量まで希釈する。安定化ウイルス組成物の０．５ｍｌアリコートを３ｍｌバイアルへ無菌的に移す。ついで、第１部に記載されているとおりに、凍結乾燥、および該バイアルの密封を行う。

３．ブリスター形態のためのＡｌ（ＯＨ） _３ の存在下の凍結乾燥ウイルス
ウイルス用量を調製するためには標準的な技術を用いる。凍結精製ウイルスバルクを解凍し、適当な培地組成物、この場合はダルベッコ変法イーグル培地で、所望の標準的なウイルス濃度、この場合は１０^６．２ｆｆｕ／ｍｌまで希釈する。水酸化アルミニウム懸濁液を加えて４８ｍｇ／用量の最終量とし、該ウイルス組成物を、スクロース、デキストランまたはアミノ酸４％、またはゼラチン、または植物性ペプトン、またはキサンタンでありうる凍結乾燥安定剤で、１０^５．６ｆｆｕ／用量の目標ウイルス力価まで希釈する。０．５ｍｌまたは好ましくはそれ未満の用量をブリスター腔へ移すために、無菌的充填操作を用いる。該組成物を凍結乾燥し、加熱密封（ヒートシール）によりブリスター腔を密封する。

場合によっては、水酸化アルミニウム懸濁液の沈降を防ぐために標準的な成分を含有させる。そのような標準的な成分には、例えば、ステアリン酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微晶質セルロースおよびシリコーンポリマーが含まれる。香味剤を含有させることも可能である。

種々の製剤のロタウイルスウイルス力価
５．１：ラクトースおよびスクロースに基づく製剤の間の比較

前記表に示すとおり、Ｐ４３ロタウイルスをスクロースまたはラクトースと共に製剤化した。凍結乾燥前のウイルス力価は、凍結乾燥工程に付されていない完全製剤液（スクロース、デキストラン、ソルビトール、アミノ酸を含有する）中のウイルス力価である。

良好な結果は、凍結乾燥工程において０．５ ｌｏｇ未満の減少および「３７℃で１週間」（促進安定性試験）において０．５ ｌｏｇ未満の減少が達成されたものである。ウイルス力価測定の精度は約＋または−０．２ ｌｏｇである。

結果は、ラクトースの代わりにスクロースが使用可能であることを示している。

５．２：アルギニンの効果およびマルチトールによるソルビトールの置換の効果

結果は、アルギニン（これは凍結乾燥中の該ウイルスの安定性を改善し、胃の酸性を相殺するために塩基性環境をも付与することが公知である）の添加がウイルス力価を維持することを示している。

ソルビトールは凍結乾燥ケークのガラス転移温度を著しく減少させる傾向にある。前記で示されているとおり、これは、ソルビトールの代わりにマンニトールを使用することにより克服可能であり、ウイルス力価は尚も維持される。

５．３：種々の製剤組成物
この実験は、多数の製剤が可能であることを示すものである。

５．４：ロタウイルスとＡｌ（ＯＨ） _３ 制酸剤との会合

制酸剤としてＡｌ（ＯＨ）_３を使用する。これは、ロタウイルスが不溶性無機塩（Ａｌ（ＯＨ）_３）と会合することを示している。なぜなら、それはＡｌ（ＯＨ）_３と共に遠心分離されたからである（上清におけるウイルス活性の低下）。

５．５：ウイルス力価測定前のクエン酸ナトリウムによる制酸剤Ａｌ（ＯＨ） _３ の溶解

ロタウイルスがＡｌ（ＯＨ）_３と会合している場合、（Ａｌ（ＯＨ）_３を含む）全体を凍結乾燥することが可能である。凍結乾燥後、Ａｌ（ＯＨ）_３をクエン酸ナトリウムに溶解させることによりロタウイルスを回収することが可能である。この工程はロタウイルスを損なわず、この溶解工程後にもその活性が維持される。

５．６：Ａｌ（ＯＨ） _３ −ロタウイルス会合体の解離後のロタウイルスの感染力
（担体の溶解による）ウイルス遊離のメカニズムはｉｎ ｖｉｖｏで非常によく働きうる。実際、ｐＨ６未満で水酸化アルミニウムは完全に溶解性になり、したがってロタウイルスは胃内で遊離するであろう。

Ａｌ（ＯＨ）_３ ＋ ３Ｈ^＋ −−−→ Ａｌ^＋＋＋（水溶性） ＋ ３Ｈ_２Ｏ
胃内では、Ａｌ^＋＋＋イオンは吸収されない（J.J. Powell, R.JugdaohsinghおよびR.P.H. Thompson, The regulation of mineral adsorption in the gastrointestinal track, Proceedings of the Nutrition Society (1999), 58, 147-153）。腸内では、ｐＨの上昇のため、アルミニウムの不溶性形態（Ａｌ（ＯＨ）_３またはＡｌＰＯ_４）が析出し、天然様態により排出される。新たに生じたＡｌ（ＯＨ）_３（またはＡｌＰＯ_４）析出物が遊離ロタウイルスと再会合可能かどうかは不明である。これはＡｌ（ＯＨ）_３−ロタウイルス会合体自体の感染力の問題を提議するものである。

他のメカニズムによるＡｌ（ＯＨ）_３−ロタウイルス会合体からのロタウイルスの遊離も考えられうる。例えば、リシンはＡｌ（ＯＨ）_３へのウイルス吸着を妨げる。ボラート、スルファート、カルボナートおよびホスファートのような他のアニオンは水酸化アルミニウムに特異的に吸着されることが知られている。したがって、理論的には、（吸着部位に関する競合により）Ａｌ（ＯＨ）_３−ロタウイルス会合体からロタウイルスを脱離させることが可能なはずである。

したがって、ロタウイルスはロタウイルス−Ａｌ（ＯＨ）_３会合体から遊離可能であり、遊離したロタウイルスは活性なままである。この遊離は、（胃内のＨＣｌまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでのクエン酸Ｎａ_３により）Ａｌ（ＯＨ）_３を溶解させることにより、あるいは塩基性アミノ酸（リシン）によりロタウイルスを脱離させることにより行われうる。

５．７：Ａｌ（ＯＨ） _３ −ロタウイルス会合体の感染力
凍結乾燥ロタウイルスの単一用量を水で再調製し、２つの部分に分割した。参照体とみなされる第１の部分には追加容量の水を加えた。第２の部分には、０．２４０ｍｌの水に懸濁させた２４ｍｇのＡｌ（ＯＨ）_３を加えた（前臨床ウイルス力価測定）。

Ａｌ（ＯＨ）_３が存在する場合、ロタウイルスは活性であり、ウイルス力価測定値は参照サンプルと比べて高かった。

該凍結乾燥用量を分割することなく、１２ｍｇのＡｌ（ＯＨ）_３または２４ｍｇのＡｌ（ＯＨ）_３を加えることにより、この実験を繰返した。

この場合、参照サンプルは、クエン酸−重炭酸バッファーで再調製されたものであった。したがって、この場合も、ウイルス力価は、Ａｌ（ＯＨ）_３の存在下で、より高い。

前記の実施例と同様に、ロタウイルスはＡｌ（ＯＨ）_３粒子と会合する。なぜなら、該ウイルスは遠心分離により除去されうるからである。ＤＲＶＣ００３Ａ４６は凍結乾燥製剤化ロタウイルス（スクロース：２％、デキストラン：４％、ソルビトール：３％、アミノ酸：２％）である。

ＳＤＳＡＡ＝スクロース２％、デキストラン４％、ソルビトール３％、アミノ酸２％。

上清に関して行ったウイルス力価測定によれば、ロタウイルスを吸着させるのに要するＡｌ（ＯＨ）_３の量は少ないようである（１つの凍結乾燥用量５．７ ｌｏｇから開始し、ウイルス力価測定の規模を拡大させる）。

Ａｌ（ＯＨ）_３にロタウイルスを吸着させるのに要する時間は短いようである。１用量の凍結乾燥ロタウイルスを２４ｍｇのＡｌ（ＯＨ）_３の存在下で再調製し、０分、１５分、６０分および２４時間後に遠心分離した。「凝集塊（Ｃｕｌｏｔ）」は、ウイルス力価測定前にＳＤＳＡＡに再懸濁させた。

５．８：制酸剤としてのＣａＣＯ _３ の使用
該ワクチン中のアルミニウムの使用を避けるために、制酸剤Ａｌ（ＯＨ）_３の代わりに別の不溶性無機塩であるＣａＣＯ_３（炭酸カルシウム）を使用した。ＣａＣＯ_３で観察される現象は、Ａｌ（ＯＨ）_３に関して記載されているものに対応する：
・該無機塩とのロタウイルスの会合；
・該無機塩と会合した場合のロタウイルス活性の維持；
・酸による該無機塩基の溶解による該会合体からのロタウイルスの遊離が可能であること；
・該制酸剤とロタウイルスとの同時凍結乾燥が可能であること。

ＣａＣＯ _３ とロタウイルスとの会合
最初の試験では、凍結乾燥ロタウイルス（ウイルス力価５．７）を水中のＣａＣＯ_３の懸濁液（１．５ｍｌ中、５０ｍｇ）で再調製し、ついで遠心分離し、該上清のウイルス力価をペレットと比較した。

これは、該ロタウイルスの９０％以上がＣａＣＯ_３と会合していることを示している。

また、該ウイルスが会合した場合、力価測定を行い元のウイルス量を回収することが可能であった。また、ウイルス力価は、ＣａＣＯ_３の非存在下で得られたものより若干高い。

ＣａＣＯ _３ とロタウイルスとの会合体の量

凍結乾燥ロタウイルスを水（１．５ｍｌ）中のＣａＣＯ_３（１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ）の懸濁液で再調製し、ついで遠心分離し、上清のウイルス力価を凝集塊（culot）と比較した。

したがって、明らかに、より多くのＣａＣＯ_３およびより多くのウイルスが会合し、上清中で見出されるものは、より少ない。しかし、全用量が完全に回収されるわけではない（少なくとも合計５．３、またはより早く得た場合には更には５．８と予想される；前記を参照されたい）。

ベービー・ロゼット・ライス制酸剤力価測定中のロタウイルスのＣａＣＯ _３ 防御
１０用量の凍結乾燥ロタウイルス（ＤＲＶＣ００３Ａ４６）および５０ｍｇのＣａＣＯ_３を使用して、２つのタイプのベービー・ロゼット・ライス（baby Rossett-Rice）力価測定を行った。

古典的なロゼット・ライス力価測定においては、制酸剤をロタウイルスと混合し、ＨＣlをこの培地内に注ぐ。

「逆」ベービー・ロゼット・ライスにおいては、状況は逆であり、（ｉｎ ｖｉｖｏで生じるのと同様に）制酸剤をＨＣｌプール内に滴下する。

これより、このｉｎ ｖｉｔｒｏ実験においては、炭酸カルシウムはロタウイルスの約２０％をＨＣｌの存在から防御することが可能であるが、水酸化アルミニウムはそれが不可能である。

５．９：ＣａＣＯ _３ 制酸剤の存在下のロタウイルスの凍結乾燥

これは「すべてが一緒になった形態（all in one）」である（すなわち、ロタウイルスおよび制酸剤（ＣａＣＯ_３）が同一バイアル内で一緒に凍結乾燥される）。充填工程中のＣａＣＯ_３の沈降を防ぐためには、粘性物質が必要である。そのような粘性物質の具体例には、キサンタンガムおよびデンプンが含まれる。ロタウイルス活性はキサンタンガムおよびデンプンの存在下においても維持される。

５．１０ 口内に配置された場合の急速崩壊のための凍結乾燥錠剤
以下の製剤は、「ｌｙｏｃ」概念（すなわち、口内での凍結乾燥ケークの急速溶解）を示すものである。

「ｌｙｏｃ」概念においては、（凍結乾燥ケークの急速溶解特性を維持しつつ）キサンタンおよびデンプンの両方を使用することが可能である。

ロタウイルスワクチン組成物用の制酸剤としての炭酸カルシウムの使用
水中のＣａＣＯ_３の懸濁液をロタウイルス用の制酸剤として使用する場合、炭酸カルシウム粒子が、水中に配置された場合に急速に沈降するという問題が生じる。なぜなら、粉末密度値が２．６に近く、平均粒径が３０μｍであるからである。この沈降は、
１．周囲の媒体の密度を増加させる、
２．周囲の媒体の粘度を増加させる、
３．粒径を減少させる、
４．粒子をお互いから離れた状態で維持する
ことにより遅くすることが可能である。

６．１：周囲の媒体の密度を増加させる：
ＣａＣＯ_３−水懸濁液（シリンジ内に配置されている場合）を凍結乾燥ケーク（スクロース２％、デキストラン４％、ソルビトール３％、アミノ酸２％を含有するもの）上に配置すると、周囲の媒体の密度は増加するが、ＣａＣＯ_３沈降の速度は該ＣａＣＯ_３−水懸濁液とそれほど変わらない。

６．２ 周囲の媒体の粘度を増加させる：擬似塑性賦形剤（Pseudoplastic excipient）
擬似塑性溶液は、攪拌下の粘度より高い粘度を静置時に有する溶液と定義される。このタイプの通常の賦形剤としては以下のものが挙げられる。

天然ポリマー、例えば
アラビアゴム、
アドラガンテ（adragante）ガム、
寒天、
アルギナート、
ペクチン。

半合成ポリマー、例えば
カルボキシメチルセルロース（Ｔｙｌｏｓｅｓ Ｃ（登録商標））、
メチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌｓ Ａ（登録商標）、Ｖｉｓｃｏｔｒａｎｓ ＭＣ（登録商標）、Ｔｙｌｏｓｅ ＭＨ（登録商標）およびＭＢ（登録商標））、
ヒドロキシプロピルセルロース（Ｋｌｕｃｅｌｓ（登録商標））、
ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌｓ Ｅ（登録商標）およびＫ（登録商標）、Ｖｉｓｃｏｎｔｒａｎｓ ＭＰＨＣ（登録商標））。

一般に、それらの擬似塑性賦形剤はチキソトロピー物質と共に使用される。

低い流動能を有する擬似塑性賦形剤
十分な濃度のそれらのポリマーは、静置時に低い流動能を有する高粘度溶液を与える構造流体配置（structural fluid arrangement）を与える。流動および移動を可能にするためには、ある量のエネルギーが該系に与えられる必要がある。流体溶液を得るために構造流体配置を一時的に破壊するためには、外的エネルギー（攪拌）が必要とされる。そのようなポリマーの具体例として、Ｃａｒｂｏｐｏｌｓ（登録商標）およびキサンタンガムが挙げられる。

チキソトロピー賦形剤
これらのチキソトロピー賦形剤では、静置時にはゲル構造体が得られるが、攪拌下では流体溶液が得られる。

チキソトロピー賦形剤の具体例としては、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）（マグネシウム−アルミニウムシリカート）およびＡｖｉｃｅｌ ＲＣ（登録商標）（約８９％微晶質セルロースおよび１１％カルボキシメチルセルロースＮａ）が挙げられる。

６．３ 粒径を減少させる
ＣａＣＯ_３の粒径の減少は該化合物の制酸能の低下を招いた。

６．４ 粒子をお互いから離れた状態で維持する
これはＶｅｅｇｕｍ（登録商標）およびＡｖｉｃｅｌ（登録商標）の場合に該当し、この場合、凝集を防ぐために、ＣａＣＯ_３粒子より小さい（約１μｍ）不溶性粒子がＣａＣＯ_３粒子間に配置される。

製造設計
以下のスキームは、考えられうる製造設計の具体例を示す。

７．１ シリンジ内のＣａＣＯ _３
ロタウイルスの臨床バッチが凍結乾燥バイアル内に既に入っている場合、シリンジ内に入れる再調製液中に該制酸剤を入れることが可能である。

この製品形態では、充填工程だけでなく該製品の全体的な貯蔵寿命中（少なくとも２年間）においてもＣａＣＯ_３の沈降が抑制されていなければならない。

７．２ 凍結乾燥バイアル内のＣａＣＯ _３

７．３ ブリスターにおける凍結乾燥
この場合、ロタウイルス、ＣａＣＯ_３およびキサンタンガムをブリスター内で直接的に一緒に凍結乾燥させる。

異なるロタウイルス株の凍結乾燥

株ＤＳ−１、ＰおよびＶＡ７０は、“Fields” Raven press 1990, second edition, p. 1361に、それぞれ血清型Ｇ２、Ｇ３およびＧ４に関するヒトロタウイルス参考株として記載されている。

この実験においては、種々のロタウイルス株を凍結乾燥した。すべての場合に、凍結乾燥中にウイルス力価が維持されており、かつ、促進安定性（３７℃で１週間）が示されている。

成人におけるロタウイルスワクチンの１回の経口投与のフェーズＩ安全性試験
１８〜４５歳の健康な成人におけるＰ４３ワクチンの１０^６．０ｆｆｕの単一経口用量の安全性および反応生成性（reactogenicity）を評価するために、フェーズＩ試験を行った。該臨床試験は無作為化二重盲検法であった。それはプラセボ対照法であり、自己充足的（self-contained）なものであった。この研究はベルギーの１つの単一施設において行われた。

９．１．研究集団
合計３３人の被験者（被験体）（１１人はプラセボ群、２２人はワクチン群）を登録した。全員が該研究を完了した。すべてのボランティアは白人であった。ワクチン接種時の彼らの平均年齢は３５．３歳であり、１８〜４４歳の範囲であった。該試験は１月に開始され、ちょうど１ヵ月にわたって実施された。

９．２．材料
ワクチン
Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓに従い、Ｐ４３ワクチンの臨床ロットを調製し、精製し、製剤化し、凍結乾燥した。該ロットはＱｕａｌｉｔｙ ＣｏｎｔｒｏｌおよびＱｕａｌｉｔｙ Ａｓｓｕｒａｎｃｅによりリリース（release）された。ワクチンの各バイアルは以下の成分を含有していた。

有効成分：
Ｐ４３株 最小で１０^５．８ｆｆｕ。

賦形剤、安定剤：
スクロース ９ｍｇ
デキストラン １８ｍｇ
ソルビトール １３．５ｍｇ
アミノ酸 ９ｍｇ。

プラセボ
プラセボのバイアルを調製し、リリース（release）した。プラセボの各バイアルは以下の成分を含有していた。

賦形剤、安定剤：
スクロース ９ｍｇ
デキストラン １８ｍｇ
ソルビトール １３．５ｍｇ
アミノ酸 ９ｍｇ。

希釈剤
ワクチンおよびプラセボを再調製するための希釈剤として、注射用水を使用した。

９．３．投与
ワクチンまたはプラセボの投与の約１０〜１５分前に、両方の群の被験者に１０ｍｌのＭｙｌａｎｔａ（登録商標）を経口投与した。Ｍｙｌａｎｔａ（登録商標）は、登録された制酸剤である。該制酸剤は胃内のｐＨを上昇させ、ロタウイルスが胃を通過する際の該ロタウイルスの不活性化を防ぐ。ワクチンを調製するために、１０^５．８ｆｆｕ／バイアルを含有する凍結乾燥Ｐ４３の２本のバイアルを、希釈剤である１．５ｍｌの注射用水で再調製した。これにより１０^６．１ｆｆｕ／用量のウイルス力価理論値が得られた。再調製されたワクチンを即座に単一経口用量として投与した。プラセボを調製するために、凍結乾燥プラセボの２本のバイアルを１．５ｍｌの注射用水で再調製し、単一用量として経口投与した。

９．４．安全性および反応生成性
安全性および反応生成性の以下の基準を適用した。請願される（solicited）全身症状は発熱、下痢、嘔吐、悪心、腹痛および食欲不振であった。それらを投与後の８日間にわたって記録した。非請願（unsolicited）症状は、投与後の３０日間にわたって記録した。重篤な有害事象は全研究期間を通じて記録した。下痢サンプルは、投与後の８日間にわたって集められることになっていた。

結果は以下のとおりであった。それぞれの観察期間中に請願症状、非請願症状および重篤な有害事象のいずれも報告されなかった。下痢のケースは報告されなかった。

９．５．結論
ＳＢ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｐ４３ワクチンは、１８〜４４歳の健康な成人ボランティアに１０^６．１ｆｆｕの用量の単一用量として二重盲検法で経口投与された場合に、プラセボとの比較において安全なものであった。

Ｇ１および非Ｇ１（Ｇ９）ロタウイルスによる胃腸炎の予防における、ＲＩＸ ４４１４を含有するヒト単価ロタウイルスワクチンの２用量の効力
１０．１．方法
乳児への免疫のためのＧ１Ｐ［８］ヒト株８９−１２由来のワクチン（ＲＩＸ４４１４ヒトロタウイルス株）の防御効力を評価するために、無作為化二重盲検プラセボ対照フェーズＩＩ試験をラテンアメリカにおいて行った。ＲＩＸ４４１４ワクチンは、ＥＣＡＣＣ受託番号９９０８１３０１（ＷＯ０１／１２７９７）として寄託されている弱毒化Ｇ１Ｐ［８］ヒト株をロタウイルス成分として含む。

ワクチン組成（表１７）
炭酸カルシウムバッファーを含有する予め充填された１本のシリンジの全内容物を凍結乾燥産物（ワクチンまたはプラセボ）のバイアル内に注入することにより、投与用のＨＲＶワクチンまたはプラセボを調製した。該ワクチン／プラセボを再懸濁させるために該バイアルを振とうした。該再懸濁産物の全容量を同一シリンジ内に回収し、針を捨て、該懸濁産物を即座に単一経口用量（約１．０ｍｌ）として投与した。

ワクチン投与
健康な乳児（４９３人）に２用量のＲＩＸ４４１４−ロタウイルスワクチン（濃度：１０^５．８ｆｆｕ／用量）、またはプラセボ（５０４人）を、２および４月齢で、ＤＴＰｗ−ＨＢＶおよびＨｉｂワクチンと共に投与した。３用量のＯＰＶ（経口ポリオウイルスワクチン）は、研究ワクチンから２週間の間隔で投与され、すなわち、研究ワクチンの各用量投与の２週間前から２週間後までの期間中には投与されないこととされた。２つの他の群には２用量のＲＩＸ４４１４−ロタウイルスワクチンを、異なるウイルス濃度（１０^４．７ｆｆｕおよび１０^５．２ｆｆｕ）で投与した。下痢サンプルをロタウイルスの存在に関して試験し（ＥＬＩＳＡ）、陽性サンプルにおいて血清型を決定した（ＲＴ−ＰＣＲ）。第２用量投与の２週間後以降に報告された下痢エピソードを効力分析において考慮した。２０ポイント尺度（RuuskaおよびVesikari, 1990）を用いて重症度を決定した。この研究において各下痢エピソードの重症度を評価するために用いた２０ポイントスコア系を以下の表１８に示す。１１以上のスコアが重症疾患と定義された。

１０．２．結果
前記の群において効力の中間分析を行った。単離された血清型は主としてＧ１およびＧ９であり、ほぼ均等に分布していた。プラセボ群における全侵襲率は、６ヶ月の観察期間中、Ｇ１に関する４．８％からＧ９に関する３．６％まで様々であった。１０^５．８ｆｆｕの２用量のＲＩＸ４４１４ロタウイルスワクチンは、Ｇ１により引き起こされる全ての型の下痢に対しては８３％の効力［９５％ＣＩ：５０．４〜９５．７］で、重症胃腸炎に対しては９２．１％の効力［９５％ＣＩ：４７〜９９．８］で防御した。下痢がＧ９により引き起こされた場合には、全ての型の下痢に対する防御力は６０．２％［９５％ＣＩ：０．２〜８６．０］、重症胃腸炎に対しては８０．８％［９５％ＣＩ：３３．０〜９６．４］であった。これらの効力エンドポイント（Ｇ１およびＧ９に関して任意および重症）のそれぞれに関して、ＨＲＶ群においては、プラセボ群と比較して下痢エピソードにおける統計的に有意な減少が認められた（ｐ＜０．０５；両側フィッシャー正確確率検定）。

その他の２つのワクチン群において得られた結果（異なるロタウイルス濃度）は、本実施例において報告されている結果と一致しており、最終分析において記載されている（実施例１１）。Ｇ２、Ｇ３およびＧ４に関する効力データも分析した。Ｇ２、Ｇ３およびＧ４交差防御に関しては、報告されているケースが少なすぎたため、この研究からの結論は導き出されなかった。しかし、より重要なサンプルサイズに関して、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４に対する効力のデータが最終分析において記載されている（実施例１１）。

１０．３．結論
これらの結果は、Ｇ１株に対する若い乳児の防御およびＧ９株に対する交差防御における２用量の単価ＨＲＶワクチン、ＲＩＸ４４１４ロタウイルスワクチンの効力を強く支持するものである。

３つの異なるウイルス濃度で投与されるＲＩＸ４４１４株を含有する２用量のヒト単価ロタウイルスワクチンの、Ｇ１および非Ｇ１（Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ９）ロタウイルスによる胃腸炎の予防における効力
１１．１．方法
乳児への免疫のためのＧ１Ｐ［８］ヒト株８９−１２由来のワクチンの防御効力および入院に対する効力を評価するために、無作為化二重盲検プラセボ対照フェーズＩＩ試験をラテンアメリカにおいて行った。具体的には、使用したワクチンはＲＩＸ４４１４ロタウイルスワクチンと称され、ＥＣＡＣＣ受託番号９９０８１３０１として寄託されている弱毒化Ｇ１ヒト株をロタウイルス成分として含む。

健康な乳児に２用量のＲＩＸ４４１４ロタウイルスワクチンを３つの異なるウイルス濃度で投与した。効力分析のためのコホートは２〜４月齢の１８４６人の被験者（１０^４．７ｆｆｕ ＨＲＶワクチン群においては４６８人の被験者、１０^５．２ｆｆｕ ＨＲＶワクチン群においては４６０人の被験者、１０^５．８ｆｆｕ ＨＲＶワクチン群においては４６４人の被験者、およびプラセボ群においては４５４人の被験者）からなり、ＤＴＰｗ−ＨＢＶおよびＨｉｂワクチンと共に投与を行った。３用量のＯＰＶは、研究ワクチンから２週間の間隔で投与され、すなわち、研究ワクチンの各用量投与の２週間前から２週間後までの期間中には投与されないこととされた。下痢サンプルをロタウイルスの存在に関して試験し（ＥＬＩＳＡ）、陽性サンプルにおいて血清型を決定した（ＲＴ−ＰＣＲ）。第２用量投与の２週間後から被験者が１歳になるまでに報告された下痢エピソードを、効力分析において考慮した。２０ポイント尺度（RuuskaおよびVesikari, 1990）を用いて重症度を決定した。１１以上のスコアが重症疾患と定義された（２０ポイントスコア系に関しては実施例１０を参照されたい）。

１１．２．結果
実施例１０に記載のデータの最終分析である結果を以下の表に示す。ワクチン群の乳児は、プラセボ群の小児より有意に少ないロタウイルス胃腸炎エピソードを示した（ｐ＜０．００１；両側フィッシャー正確確率検定）（表１９）。投与量に応じて、重症ロタウイルス胃腸炎に対する防御効力（防御力）は８５．６％（９５％ＣＩ：６３．０％〜９５．６％）、いずれかのロタウイルス胃腸炎に対しては７０％（９５％ＣＩ、４５．７％〜８４．４％）に達した（表２０）。これらの効力エンドポイントのそれぞれに関して、ＨＲＶ群においては、プラセボ群と比較して下痢エピソードにおける統計的に有意な減少が認められた（ｐ＜０．００１；両側フィッシャー正確確率検定）。複数のロタウイルス血清型（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４およびＧ９）が胃腸炎便から特定され（ＥＬＩＳＡおよびＲＴ−ＰＣＲ）、非Ｇ１血清型に対するワクチン効力の計算をも可能にした。表２１から認められうるとおり、特に、非Ｇ１血清型（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４およびＧ９）に関して、投与量に応じて、重症ロタウイルス胃腸炎に対する効力は８２．７％（９５％ＣＩ：４０．３％〜９６．８％）に達し、これは、Ｇ１に基づく単価Ｇ１Ｐ１Ａ Ｐ［８］ヒトロタウイルスワクチンが異型（すなわち、非Ｇ１および非Ｐ［８］）株に対する交差防御を惹起するという見解の証明を与えるものであった。

１１．３．結論
これらの結果は、Ｇ1株により引き起こされる任意および重症のロタウイルス胃腸炎に対する若い乳児の防御ならびに他のＲＶ Ｇ型、すなわちＧ２、Ｇ３、Ｇ４およびＧ９に対する広範な交差防御における２用量のＲＩＸ４４１４含有単価ＨＲＶワクチンの効力を強く支持するものである。

２用量のヒト弱毒化ロタウイルスワクチンＲＩＸ４４１４ワクチンはラテンアメリカおよび欧州において異型防御を示す
ＲＩＸ４４１４株を含有する２用量の経口生弱毒化Ｇ１Ｐ［８］ヒトロタウイルス（ＲＶ）ワクチンの効力をフィンランドおよびラテンアメリカの乳児においてフェーズＩＩ／ＩＩＩ臨床試験において分析した。ＲＩＸ４４１４ロタウイルスワクチンは、ＥＣＡＣＣ受託番号９９０８１３０１として寄託されている弱毒化Ｇ１ヒト株をロタウイルス成分として含む。

１２．１．方法
実施例１２の結果の一部は実施例１０および１１に既に示されている。フィンランドにおける１つのフェーズＩＩ研究およびラテンアメリカ（ブラジル、メキシコおよびベネズエラ）における１つのフェーズＩＩ研究（実施例１０および１１）ならびに１１カ国のラテンアメリカ諸国における１つのフェーズＩＩＩ研究（実施例１３）から、同じ方法および効力基準を用いて、データをプール（pool）した。２および４月齢で２用量のＲＩＸ４４１４ワクチンまたはプラセボでワクチン接種された合計２００８１人の健康な乳児（効力に関するコホート）を、Ｖｅｓｉｋａｒｉ（Ruuska Tら, Scand. J. Infect. Dis. 1990, 22, 259-267）重症度尺度で１１以上のスコアを示す重症胃腸炎（ＧＥ）に関して、１歳まで追跡調査した。ＧＥサンプルをロタウイルスに関して（ＥＬＩＳＡにより）試験し、ＲＴ−ＰＣＲにより型決定した。

前記の３つの研究に関してメタ分析を行った。重症ＲＶ ＧＥ（１１以上のＶｅｓｉｋａｒｉ重症度スコアとして定義される）に関するプールされた効力を、第２用量投与の２週間後から１歳までについて計算した（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ近似を用いた研究効果に関して補正）。

１２．２．結果
効力に関するコホートにおいて、ワクチン群では、１１以上のＶｅｓｉｋａｒｉスコアを有する、５つのＧ２Ｐ［４］型重症ロタウイルスＧＥエピソードが検出され、プラセボ群では１３のエピソードが検出された。Ｇ２Ｐ［４］型に対するワクチン効力は６７．２％（９５％ＣＩ：１４．８；８７．１）であった。これは、同型株（Ｇ１Ｐ［８］、Ｇ３Ｐ［８］およびＧ４Ｐ［８］）に対する防御に加えて、ＲＩＸ４４１４ワクチンが、異型非Ｐ［８］非Ｇ１であるＧ２Ｐ［４］株により引き起こされる重症ロタウイルスＧＥに対しても防御することを示している。

それらの種々の研究を通じて得られた型特異的効力を以下に示す（表２２）。

全部で３つの試験において僅か３つのＧ４ケース（ワクチン被投与群において１つおよびプラセボ被投与群において２つ）が認められたに過ぎなかった。

１２．３．結論
この分析は、ＲＩＸ４４１４ワクチンが、同型Ｇ１ロタウイルス株（これは、該ワクチンに抗原的に類似している２つの外層カプシドタンパク質（ＶＰ４およびＶＰ７）および１つの内層カプシドタンパク質（ＶＰ６）を有する）に対して高レベルの防御をもたらすことに加えて、異なるＧ型（例えばＧ３、Ｇ９）、異なるＰ型（例えばＰ［４］）または異なるＧ型およびＰ型の両方（Ｇ２Ｐ［４］に対する効力により示されるとおり）のいずれかを有する他の株に対しても高度に防御性であることを示している。

２用量のヒト弱毒化ロタウイルスワクチンＲＩＸ４４１４が異型防御を示すことを示すメタ分析
より多くのデータがシンガポールおよび欧州の研究から入手可能になるにつれて、実施例１２に記載の研究に加えてこれらの研究を含めるための追加的なメタ分析を行った。

１３．１．方法
３つのフェーズＩＩ研究（フィンランドおよびラテンアメリカおよびシンガポール）および２つのフェーズＩＩＩ研究（ラテンアメリカおよび欧州）を該メタ分析に含めた。０、１〜２ヶ月のスケジュールに従い、第１用量投与時に６〜１４週齢の健康な乳児に２経口用量を投与した。すべての研究において、重症ＲＶＧＥは２０ポイントＶｅｓｉｋａｒｉ尺度において１１以上のスコアと定義された。下痢サンプルをＲＶの存在に関してＥＬＩＳＡにより分析し、ＲＴ−ＰＣＲに基づく方法により型決定した。フェーズＩＩＩラテンアメリカ研究においては重症ＲＶ ＧＥのみが記録されたため、３つのフェーズＩＩ研究およびフェーズＩＩＩ欧州研究のみにおいて、いずれかのＲＶ ＧＥに対する効力を評価した。

研究層化正確ポアソン率比（exact Poisson rate ratio stratified by study）（Proc StatXact4 for SAS Users, 1999, cytel software corporation, exact Confidence Interval for common relative risk, p298）を用いて、ＶＥおよびその９５％ＣＩはプラセボに対して率（rate）１のＲＶＧＥと評価された。

１３．２．結果
２用量のＲＩＸ４４１４またはプラセボでワクチン接種された合計８２２１人の乳児において、ＲＩＸ４４１４群（Ｎ＝５７８３）ではいずれかのＧ２Ｐ［４］ＲＶＧＥの４エピソードが検出され、プラセボ群（Ｎ＝２４３８）では９エピソードが検出された。これはＧ２Ｐ［４］株によるいずれかの重症度のＲＶＧＥに対する８１．０％（９５％ＣＩ：３１．６；９５．８）のＶＥを示している。

２用量のＲＩＸ４４１４またはプラセボでワクチン接種された合計２６０８８人の健康な乳児において、ＲＩＸ４４１４群（Ｎ＝１４７９２）ではＧ２Ｐ［４］型による重症ＲＶＧＥの６エピソードが検出され、プラセボ群（Ｎ＝１１２９６）では１５エピソードが検出された。これはＧ２Ｐ［４］株による重症ＲＶＧＥに対する７１．４％（９５％ＣＩ：２０．１；９１．１）のＶＥを示している。結果を表２３に示す。

１３．３．結論：
Ｇ２Ｐ［４］ＲＶ型に対するワクチン効力に関するこのメタ分析は、Ｇ２Ｐ［４］型による任意のＲＶ ＧＥに対する８１．０％（９５％ＣＩ：３１．６％；９５．８％）のワクチン効力、およびＧ２Ｐ［４］型による重症ＲＶ ＧＥに対する７１．４％（９５％ＣＩ：２０．１％；９１．１％）のワクチン効力を示している。

複数国のフェーズＩＩＩ試験におけるヒト弱毒化ロタウイルスワクチンＲｏｔａｒｉｘ（商標）の効力
１４．１．方法
１１ヶ国のラテンアメリカ諸国からの２０１６９人の健康な乳児に、約２および４月齢の時点で、２経口用量のＨＲＶワクチン（１０１５９）またはプラセボ（１００１０）を投与した。糞便試料をロタウイルス（ＲＶ）に関してＥＬＩＳＡにより試験し、適切なプライマーおよび型特異的プローブを使用してＲＴ−ＰＣＲにより型決定した。重症胃腸炎エピソードの捕捉（capture）に関する臨床ケースの定義は、病院、クリニックまたは監督された地方医療機関のような医療施設におけるＷＨＯプランＢ（経口再水化（rehydration）療法）またはＷＨＯプランＣ（静脈内再水化療法）と同等の一晩の入院および／または再水化療法を要する嘔吐を伴うまたは伴わない下痢（２４時間以内に３回以上の正常より軟らかいまたは水様性の排便）のエピソードであった（http://www.who.int/child-adolescent-health/New_Publications/CHILDHEALTH/textrev4.htm）。疾患の重症度は、２０ポイントＶｅｓｉｋａｒｉ尺度を用いて等級分けされ、重症ＲＶＧＥは１１以上のスコアと定義された。Ｖｅｓｉｋａｒｉスコアは修飾された。脱水はｅＣＲＦにおいて記録されなかったため、以下の規則が適用された。重症ＧＥエピソードを示した被験者は、この被験者が経口再水化療法を受けた場合には、１％から５％脱水したとみなされた。被験者が入院し、および／または静脈内（ＩＶ）再水化療法を受けた場合には、該被験者は６％以上脱水したとみなされた。

１４．２．ワクチン効力
重症ロタウイルス胃腸炎に対するワクチン効力（表２４）
効力に関するコホートは、ＨＲＶワクチンでワクチン接種された９００９人の被験者、およびプラセボの投与を受けた８８５８人の被験者からなるものであった。ワクチン群においては１２人の小児、およびプラセボ群においては７７人の小児が、該臨床定義による重症ロタウイルス胃腸炎を示し（それぞ、小児１，０００人年当たり１以上のエピソードを示す小児２．０人対１３．３人；ｐ＜０．００１，両側フィッシャー正確確率検定）、これは、第２用量投与の１５日後から１歳までにおける重症ロタウイルス胃腸炎に対する８４．７％のワクチン効力であった（表２４に示す）。第１用量投与から１歳までにおいて全ワクチン接種コホートで同様の結果が得られた（８１．１％のワクチン効力；９５％Ｃ．Ｉ．６８．５−８９．３；ｐ＜０．００１，両側フィッシャー正確確率検定）。ワクチン接種群における９人の小児およびプラセボ群における５９人の小児において、少なくとも一晩の入院が必要であり（それぞれ、小児１０００人年当たり入院１．５回対１０．２回）、重症ロタウイルス胃腸炎による入院に対するワクチン効力は８５％であった（ｐ＜０．０１，両側フィッシャー正確確率検定）（表２４）。

Ｖｅｓｉｋａｒｉスコアによるワクチン効力
ワクチン群における重症ロタウイルスエピソードを示した１２人中１１人の小児およびプラセボ群における７７人中７１人の小児が１１以上のＶｅｓｉｋａｒｉスコアを有し、これは８４．７％（Ｐ＜０．００１，両側フィッシャー正確確率検定）のワクチン効力を与えた。１１〜２０スコアで疾患重症度が上昇すると、ワクチン効力は次第に高くなり、より重症のロタウイルス胃腸炎に対しては１００％に達した。１１以上のＶｅｓｉｋａｒｉスコアを有する合計１６人の重症ロタウイルス胃腸炎エピソードが第１用量投与から第２用量投与までに報告された（ワクチン群で６人およびプラセボ群で１０人）。

ロタウイルス型ごとのＶｅｓｉｋａｒｉスコアによるワクチン効力
野生型株に対する型特異的ワクチン効力を表２４に示す。ワクチン株と同種（homologous）であるＧ１Ｐ［８］型株により引き起こされる、１１以上のＶｅｓｉｋａｒｉスコアを示す重症ロタウイルスエピソードに対するワクチン効力は、９１．８％（Ｐ＜０．００１，両側フィッシャー正確確率検定）であった。Ｐ［８］抗原を共有する株（Ｇ３Ｐ［８］、Ｇ４Ｐ［８］およびＧ９Ｐ［８］）に対するワクチン効力は８６．９％（Ｐ＜０．００１，両側フィッシャー正確確率検定）であった。Ｇ抗原およびＰ抗原のいずれをもワクチン株と共有していないＧ２Ｐ［４］ロタウイルス型が、ワクチン群における５エピソードおよびプラセボ群における９エピソードにおいて検出され、これは４５％（Ｐ＝０．２９８，両側フィッシャー正確確率検定）の効力を与えた。この研究で観察されたＧ２エピソードの数が少なかったため、５つの研究のメタ分析（実施例１３）を行い、この研究で観察された傾向が、それらの５つの研究の結果をプールした場合に有意値となった（実施例１３）。

下痢疾患の負荷に対するワクチン効力
ＷＨＯプランＢ／Ｃによる入院および／または再水化を要する、いずれかの原因による胃腸炎を示す小児は、ワクチン群においては疾患発生率３０．９／小児１，０００人年を示し、一方、プラセボ群においては５１．７を示し、ワクチン被投与者におけるあらゆる原因による重症下痢エピソードにおける、全体で４０％（Ｐ＜０．００１，両側フィッシャー正確確率検定）の減少を示した。同様に、いずれかの原因による下痢による入院が有意に、４２％減少した（Ｐ＜０．００１，両側フィッシャー正確確率検定）（表２４、あらゆる原因によるＧＥ）。

１４．３．結果の要約
重症ロタウイルス胃腸炎（ＲＶ ＧＥ）に対するおよびロタウイルス関連入院に対するワクチン効力は８５％（Ｐ＜０．００１，両側フィッシャー正確確率検定）であり、１９以上のＶｅｓｉｋａｒｉスコアを示すＲＶ ＧＥを有する集団においては１００％に達した。Ｇ１Ｐ［８］、およびＰ［８］エピトープのみをＨＲＶと共有する株に対する効力は、それぞれ９２％（９５％Ｃ．Ｉ．７４，９８）および８７％（９５％Ｃ．Ｉ．６４，９７）（Ｐ＜０．００１，両側フィッシャー正確確率検定）であった。あらゆる原因の下痢による入院は４２％減少した（９５％Ｃ．Ｉ．２９，５３；Ｐ＜０．００１，両側フィッシャー正確確率検定）。

欧州６ヶ国におけるヒト弱毒化ロタウイルスワクチンＲｏｔａｒｉｘ（商標）の効力
１５．１．方法
欧州６ヶ国における３，９９４人の小児を、通常の小児用ワクチン接種と共に投与される１０^６．５ＣＣＩＤ_５０ ＨＲＶ（ヒトロタウイルス）ワクチンＲｏｔａｒｉｘ（商標）（組成を参照されたい）またはプラセボの投与を受けるよう無作為化した。第１の効力追跡期間は第２用量投与の２週間後から開始し、２００５年６月〜７月に終了した。合計３８７４人の被験者が第１年効力コホートの一部であった。

１５．２．ワクチン効力
ＨＲＶワクチンは該第１効力期間におけるＲＶ ＧＥに対する防御に非常に有効であった。ワクチン効力はＲＶ ＧＥのいずれかのエピソードに対しては８７．１％（９５％ＣＩ：７９．６％；９２．１％）、重症ＲＶ ＧＥエピソードに対しては９５．８％（９５％ＣＩ：８９．６％；９８．７％）であった。疾患重症度が上昇（１１〜２０のＶｅｓｉｋａｒｉスコア）すると、ワクチン効力は次第に高くなり、１７ポイント以上のＶｅｓｉｋａｒｉスコアを示すＲＶ ＧＥを有する集団では１００％に達した。ＲＶ ＧＥによる入院に対するワクチン効力は１００％（９５％ＣＩ：８１．８％；１００％）であり、医学的注意を要するＲＶ ＧＥエピソードに対するワクチン効力は９１．８％（９５％ＣＩ：８４．０％；９６．３％）であった（表２６および２７）。

ＨＲＶワクチンは、Ｇ１Ｐ［８］、Ｇ３Ｐ［８］、Ｇ４Ｐ［８］およびＧ９Ｐ［８］株により引き起こされる任意および重症のＲＶ ＧＥに対して非常に防御性が高かった（表２８）。ＨＲＶワクチンの外層カプシド抗原のいずれをも共有しないＧ２Ｐ［４］ＲＶ型に対する防御は、この研究では、より低かったが、フェーズＩＩおよびフェーズＩＩＩの効力研究を考慮したメタ分析の結果は、Ｇ２Ｐ［４］による任意および重症のＧＥに対する有意な防御効力を示した（実施例１３を参照されたい）。

１５．３．結果の要約
小児用ワクチン接種と共に投与された２経口用量のＨＲＶ Ｒｏｔａｒｉｘ（商標）ワクチンは、Ｇ１Ｐ［８］野生型ＲＶによりおよび非Ｇ１Ｐ［８］ＲＶ型により引き起こされる任意のＲＶ ＧＥに対する乳児の防御において、プラセボと比較して該第１効力期間中に非常に有効であった。ワクチン効力はそれぞれ９５．６％（９５％ＣＩ：８７．９％；９８．８％）および７９．３％（９５％ＣＩ：６４．６％；８８．４％）であった。Ｇ１Ｐ［８］野性型ＲＶによりおよび非Ｇ１Ｐ［８］ＲＶ型により引き起こされる重症ＲＶ ＧＥに対する効力はそれぞれ９６．４％（９５％ＣＩ：８５．７％；９９．６％）および９５．４％（９５％ＣＩ：８５．３％；９９．１％）であった。

これらの結果は、ＨＲＶワクチンが循環ＲＶ株に対する広範な防御をもたらすという結論を強く支持するものである（表２８を参照されたい：Ｇ１Ｐ［８］、Ｇ２Ｐ［４］、Ｇ３Ｐ［８］、Ｇ４Ｐ［８］、Ｇ９Ｐ［８］）。特異的なＧ２Ｐ［４］に対するワクチン効力に関するメタ分析を行った。実施例１３を参照されたい。

全体的な結論
入院および再水化に焦点を合わせたケース捕捉（case capture）に関する臨床的定義により、ならびに下痢、嘔吐、発熱、脱水および入院に関連した定量可能な罹患結果を含む、妥当性が立証されたＶｅｓｉｋａｒｉ尺度により計測すると、ロタウイルス胃腸炎エピソードに対して、ＲＩＸ４４１４ロタウイルスワクチンは非常に防御性であることが判明した。２経口用量のＨＲＶワクチンは、複数の循環ロタウイルス株による任意および重症のＲＶＧＥおよび入院に対する乳児の防御において非常に有効であった。

ＨＲＶワクチンに抗原的に類似している２つの外層カプシドタンパク質（ＶＰ４およびＶＰ７）および１つの内層カプシドタンパク質（ＶＰ６）を有する同種（homologous）Ｇ１Ｐ［８］ロタウイルスに対して高レベルの防御が実証された。それは、遺伝子型Ｐ［８］（ＶＰ４抗原）およびＶＰ６抗原のみを共有する株に対しても十分に防御した。フィンランド、シンガポールおよびラテンアメリカからの３つのフェーズＩＩ研究（すべて、同一の方法および効力基準を用いている）ならびにラテンアメリカおよび欧州からの２つのフェーズＩＩＩ研究の結果を含むメタ分析において、ＨＲＶワクチンの外層カプシド抗原のいずれをも共有しないロタウイルス株に対する防御も実証された。これは実施例１３に示した。いずれかの重症度のＧ２Ｐ［４］型に対するワクチン効力は８１％（９５％Ｃ．Ｉ．３１．６−９５．８）であり、Ｇ２Ｐ［４］型による重症ＧＥに対するワクチン効力は７１．４％（９５％Ｃ．Ｉ．２０．１−９１．１）であった。このことは、該ワクチンが、該ワクチン株と同一のＧまたはＰタンパク質を共有しない株に対しても防御しうることを示している。

図１Ａ（配列番号１）は、Ｐ４３のＶＰ４タンパク質をコードする配列を含むＰ４３（ＲＩＸ４４１４）ＶＰ４遺伝子のヌクレオチド配列である。 図１Ｂ（配列番号２）は、該遺伝子の両末端からの追加的ヌクレオチド、および配列決定技術によるヌクレオチド置換（太字−１８位のＣがＧにより置換されて、ＴＣＡの代わりにＴＣＧとなっているが、得られるコード化タンパク質に対する影響を伴わない）を有する。非コード配列は小文字で示されている。図１ＢはＰ４３寄託物の正式な配列を示す。 図２Ａ（配列番号３）は、Ｐ４３のＶＰ７タンパク質をコードする配列を含むＰ４３（ＲＩＸ４４１４）ＶＰ７遺伝子のヌクレオチド配列である。図２Ｂ（配列番号４）は、該遺伝子の両末端からの追加的ヌクレオチド、および配列決定技術によるヌクレオチド置換（太字−５８位のＣがＡにより置換されて、イソロイシンをコードするＣＴＴの代わりにロイシンをコードするＡＴＴとなっている）を有する。非コード配列は小文字で示されている。図２ＢはＰ４３寄託物の正式な配列を示す。 図３（配列番号５）はＲＩＸ４４１４ ＶＰ４のポリペプチド配列である。 図４（配列番号６）はＲＩＸ４４１４ ＶＰ７のポリペプチド配列である。 図５（配列番号７）はＲＩＸ４４１４のＮＳＰ４タンパク質のポリペプチド配列を示す。 図６（配列番号８）はＲＩＸ４４１４のＮＳＰ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。非コード配列は小文字で示されている。 図７（配列番号９）はＲＩＸ４４１４のＶＰ６タンパク質のポリペプチド配列を示す。 図８（配列番号１０）はＲＩＸ４４１４のＶＰ６タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。非コード配列は小文字で示されている。

Claims (24)

1. Ｇ２Ｐ［４］型ロタウイルス株により引き起こされるロタウイルス感染に対する免疫応答を誘導するための組成物の製造における、Ｇ１Ｐ［８］型由来の弱毒化ロタウイルス株の使用であって、該弱毒化ロタウイルス株は、開始コドンから始めて７８８位と８０２位にアデニン（Ａ）及び５０１位にチミン（Ｔ）をヌクレオチド配列中に含むＶＰ４遺伝子、並びに開始コドンから始めて６０５位にチミン（Ｔ）及び８９７位にアデニン（Ａ）をヌクレオチド配列中に含むＶＰ７遺伝子を有する、前記使用。
2. 前記組成物が、Ｇ１並びにＧ３、Ｇ４及びＧ９から成る群より選択される非Ｇ１血清型のうち少なくとも１つに対する免疫応答をさらに誘導する、請求項１に記載の使用。
3. Ｇ１Ｐ［８］型の弱毒化ロタウイルス株を含んでなる前記組成物が、Ｇ２Ｐ［４］型ロタウイルス株の感染により引き起こされる、ロタウイルス誘発性重症胃腸炎への防御をもたらすものである、請求項１又は２に記載の使用。
4. Ｇ１Ｐ［８］型の弱毒化ロタウイルス株を含んでなる前記組成物が、ワクチン接種された個体集団において、Ｇ２Ｐ［４］型ロタウイルス株により引き起こされる下痢に対して少なくとも４０％の防御力を示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
5. 前記組成物が、少なくとも５０％の防御力を示す、請求項４に記載の使用。
6. 前記組成物が、少なくとも６０％の防御力を示す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
7. 前記組成物が、４０％〜８０％の防御力を示す、請求項３〜６のいずれか１項に記載の使用。
8. 前記組成物が、５０％〜７０％の防御力を示す、請求項７に記載の使用。
9. 前記組成物が、Ｇ１Ｐ［８］ロタウイルス株を含んでなり、ワクチン接種された個体集団において、Ｇ２Ｐ４血清型を有するロタウイルスの感染により引き起こされる重症胃腸炎に対して４０％〜７５％の防御力を示す、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
10. 前記組成物中のロタウイルス株が、ＥＣＡＣＣ受託番号９９０８１３０１であるか、又はＥＣＡＣＣ受託番号９９０８１３０１から取得若しくは誘導されたものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
11. 前記組成物を、２用量レジメンで投与する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
12. 前記弱毒化ロタウイルス株を、好適な製薬用担体を用いて、若しくは制酸剤を用いて、又はその両者を用いて製剤化する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
13. Ｇ１Ｐ［８］型由来の弱毒化ロタウイルス株を含む、Ｇ２Ｐ［４］型ロタウイルス株により引き起こされるロタウイルス感染に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、該弱毒化ロタウイルス株は、開始コドンから始めて７８８位と８０２位にアデニン（Ａ）及び５０１位にチミン（Ｔ）をヌクレオチド配列中に含むＶＰ４遺伝子、並びに開始コドンから始めて６０５位にチミン（Ｔ）及び８９７位にアデニン（Ａ）をヌクレオチド配列中に含むＶＰ７遺伝子を有する、前記組成物。
14. Ｇ１並びにＧ３、Ｇ４及びＧ９から成る群より選択される非Ｇ１血清型のうち少なくとも１つに対する免疫応答をさらに誘導する、請求項１３に記載の組成物。
15. Ｇ２Ｐ［４］型ロタウイルス株の感染により引き起こされる、ロタウイルス誘発性重症胃腸炎への防御をもたらすものである、請求項１３又は１４に記載の組成物。
16. ワクチン接種された個体集団において、Ｇ２Ｐ［４］型ロタウイルス株により引き起こされる下痢に対して少なくとも４０％の防御力を示す、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
17. 少なくとも５０％の防御力を示す、請求項１６に記載の組成物。
18. 少なくとも６０％の防御力を示す、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
19. ４０％〜８０％の防御力を示す、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
20. ５０％〜７０％の防御力を示す、請求項１９に記載の組成物。
21. Ｇ１Ｐ［８］ロタウイルス株を含んでなり、ワクチン接種された個体集団において、Ｇ２Ｐ４血清型を有するロタウイルスの感染により引き起こされる重症胃腸炎に対して４０％〜７５％の防御力を示す、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
22. 前記組成物中のロタウイルス株が、ＥＣＡＣＣ受託番号９９０８１３０１であるか、又はＥＣＡＣＣ受託番号９９０８１３０１から取得若しくは誘導されたものである、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
23. ２用量レジメンで投与される、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
24. 前記弱毒化ロタウイルス株が、好適な製薬用担体を用いて、若しくは制酸剤を用いて、又はその両者を用いて製剤化される、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の組成物。

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