BRPI0615203A2 - uso de uma cepa de rotavÍrus atenuado do tipo gxpy - Google Patents

Abstract

USO DE UMA CEPA DE ROTAVÍRUS ATENUADO DE TIPO GXPY. A invenção provê um método para induzir uma resposta imune contra cepa de rotavírus, o método compreendendo a administração a um indivíduo de uma composição compreendendo uma cepa de rotavírus atenuado de um tipo GxPy, referida composição gerando uma resposta imune contra uma cepa de rotavírus que não é nem de tipo Gx nem de tipo Py.

Description

"USO DE UMA CEPA DE ROTAVÍRUS ATENUADO DE TIPO GXPY"CAMPO TÉCNICO

A presente invenção se refere à formulações de vacina contrarotavírus. A invenção se refere ao uso de uma população de rotavírusatenuado de um tipo de rotavírus na prevenção de doenças associadas àinfecção por rotavírus de outro tipo de rotavírus.

ANTECEDENTE TÉCNICO

Diarréia aguda infecciosa é a causa que leva à doença e morteem muitas áreas do mundo. Em países em desenvolvimento, o impacto dadoença diarréica está disparando. Para a Asia, África e América Latina,estima-se que haja entre 3-4 bilhões de casos de diarréia a cada ano e, dessescasos, cerca de 5-10 milhões resultam em morte (Walsh, J. A. ecolaboradores: N. Engl. J. Med., 301: 967-974 (1979)).

Rotavírus foram reconhecidos como uma das causas maisimportantes de diarréia grave em bebês e crianças novas (Estes, Μ. K.Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, Terceira Edição,editado por Fields e colaboradores, Raven Publishers, Filadélfia, 1996).

Estima-se que a doença por rotavírus é responsável por um milhão de mortesanualmente. Enfermidades induzidas por rotavírus afetam, mais comumente,crianças entre 6 e 24 meses de idade e a prevalência de pico da doençageralmente ocorre durante os meses mais frios em climas temperados e o anotodo em áreas tropicais. Rotavírus são, tipicamente, transmitidos de pessoapara pessoa através da via fecal-oral com um período de incubação de cercade 1 a cerca de 3 dias. Diferente de infecção no grupo de idade de 6 meses a24 meses, neonatos são geralmente assintomáticos ou têm apenas a doençabranda. Em contraste a várias doenças normalmente encontradas em criançasjovens, a maioria dos adultos são protegidos como um resultado de infecçãoanterior com rotavírus, de modo que as infecções em adultos são brandas ouassintomáticas (Offit, P.A. e colaboradores, Comp. Ther., 8(8): 21-26, 1982).

Rotavírus são, geralmente, esféricos e seu nome é derivado desua estrutura de capsídeo com envoltório duplo ou interno e externo distinta.Tipicamente, a estrutura de capsídeo com envoltório duplo de um rotavíruscircunda um envoltório ou núcleo de proteína interno que contém o genoma.

O genoma de um rotavírus é composto de 11 segmentos de RNA fita dupla oqual codifica pelo menos 11 proteínas virais distintas. Duas dessas proteínasvirais, designadas como VP4 e VP7, estão dispostas sobre o exterior daestrutura de capsídeo com envoltório duplo. O capsídeo interno do rotavírusapresenta uma proteína, a qual é a proteína de rotavírus designada VP6. Aimportância relativa dessas três proteínas retrovirais em particular naestimulação da resposta imune que segue a infecção por rotavírus ainda nãoestá clara. Todavia, a proteína VP6 determina o grupo e subgrupo de antígenoe as proteínas VP4 e VP7 são as determinantes de especificidade de sorotipo(tipos determinados através do ensaio de neutralização) e genótipo (tiposdeterminados através de um ensaio não-sorológico). As designações parasorotipos G e genótipos G são idênticas. Em contraste, os números atribuídospara os sorotipos e genótipos P são diferentes (Santos N. e Hoshino Y., 2005,Reviews in Medicai Virology, 15, 29-56). Portanto, o sorotipo P é designadocomo P seguido por um número atribuído e o genótipo P é designado por umP, seguido por um número atribuído entre colchetes.

Até o momento, pelo menos 14 sorotipos G de rotavírus e 14sorotipos P de rotavírus foram identificados (Santos N. e Hoshino Y., 2005,Reviews in Medicai Virology, 15, 29-56). Dentre esses, os sorotipos 10 G(Gl-6, G8-10 e G12) e os sorotipos 9 P (PI, P2A, P3, P4, P5A, P7, P8, Pl 1 eP12) foram identificados entre os rotavírus humanos. Vinte e três genótipos Pforam descritos, dez dos quais foram recuperados de seres humanos (P[3]-[6],P[8]-[ll],P[14]eP[19]).A proteína VP7 é uma glicoproteína com MW de 38.000 (MWde 34.000 quando não glicosilada) a qual é o produto traducional do segmentogenômico 7, 8 ou 9, dependendo da cepa. Essa proteína estimula a formaçãodo anticorpo de neutralização após infecção por rotavírus. A proteína VP4 éuma proteína não glicosilada com MW de aproximadamente 88.000 a qual é oproduto traducional do segmento genômico 4. Essa proteína também estimulao anticorpo de neutralização após infecção por rotavírus.

Uma vez que as proteínas VP4 e VP7 são as proteínas viraiscontra as quais anticorpos de neutralização são dirigidos, acredita-se que elassejam candidatos à produção para o desenvolvimento de vacinas contrarotavírus, proporcionando proteção contra enfermidades por rotavírus.

Infecção natural por rotavírus durante o início da infância éconhecida por estimular imunidade protetora.

Uma vacina contra rotavírus atenuada é, assim, altamentedesejável. Adequadamente, essa deverá ser uma vacina oral, uma vez que essaé a via natural de infecção do vírus.

O desenvolvimento anterior de uma vacina para prevenção deinfecções por rotavírus começou na década de 1970 após a descoberta dovírus. Inicialmente, cepas atenuadas de animais e seres humanos foramestudadas e tiveram resultados confusos ou desalentadores. Esforços maisrecentes têm se focalizado sobre recombinantes humanos-animais que têmtido mais sucesso.

Uma cepa de rotavírus é conhecida como 89-12 foi descritapor Ward; veja Patente US Número 5.474.773 e Bernstein, D.L. ecolaboradores, Vaccine, 16 (4), 381-387, 1998. A cepa 89-12 foi isolada deuma amostra de fezes coletada de uma criança com 14 meses de idade comenfermidade natural pelo rotavírus em 1988. De acordo com a Patente USNúmero 5,474,773, o rotavírus humano HRV 89-12 foi, então, adaptado àcultura através de 2 passagens em células de Rim de Macaco Green Africano(AGMK) e 4 passagens em células MA-104, conforme descrito por Ward emJ. Clin. Microbiol., 19, 748-753, 1984. Ela foi, então, purificada em placa 3vezes em células MA-104 (até a passagem 9) e crescida após mais 2passagens nessas células. Uma passagem adicional foi feita (passagem 12)para depósito com a ATCC sob o número de acesso ATCC VR 2272. A cepadepositada é conhecida como 89-12C.

O documento de 1998 em Vaccine por Bernstein ecolaboradores é referido abaixo como o documento Vaccine (1998). Odocumento descreve a segurança e imunogenicidade de um candidato a vacinade rotavírus humano vivo oralmente administrada. Essa vacina foi obtida apartir da cepa 89-12, atenuada através de passagem sem purificação em placa26 vezes em células AGMK primárias e, então, mais 7 vezes em umalinhagem de células AGMK estabelecida (33 passagens no total).

Aqui depois, o material antes mencionado o qual foiserialmente passado 26 vezes será referido como P26 e o material o qual foiserialmente passado 33 vezes será referido como P33. Em geral, rotavírusderivados através de passagem de 89-12 η vezes serão referidos como Pn.

Nos exemplos os quais seguem, o material P33 foi passadomais 5 vezes sobre células Vero. Esse é referido como P38.

Os isolados P26 e P33 descritos no documento Vaccine (1998)não foram depositados em uma coleção de cultura, nem foram analisados paraestabelecer sua caracterização genética.

Verificou-se agora que a população P26 descrita na literaturacompreende uma mistura de variantes. Isso foi estabelecido através decaracterização genética, conforme descrito aqui abaixo (veja exemplos). P26,portanto, não é uma população confiavelmente consistente para outraspassagens, em particular para a produção de lotes de vacina. Similarmente,P33 compreende uma mistura de variantes e não é confiavelmente consistentepara a produção de lotes de vacina.Verificou-se que o material P26 é uma mistura de pelo menostrês variantes de gene Vp4. P33 e P38 são, similarmente, uma mistura de duasvariantes. Essas variantes parecem ser antigenicamente diferentes, em termosde epítopos de neutralização, da cepa 89-12C2 depositada na ATCC quandode avaliação das titulações de anticorpo de neutralização de soros de bebêsvacinados com P33 contra essas variantes.

Além disso, verificou-se que, quando o material P33 éadministrado a bebês, duas variantes identificadas são replicadas e excretadas.De 100 bebês vacinados, apenas 2 mostraram sinais de gastrenterite emvirtude de infecção pelo rotavírus, enquanto que 20% de um grupo complacebo foram infectados. Essas verificações sugerem que as variantesidentificadas estão associadas à proteção contra doença pelo rotavírus.

O WO 01/12797 divulga um método de separação de variantesde rotavírus e uma vacina de rotavírus atenuada viva aperfeiçoada derivada deuma cepa de rotavírus humano clonada (homogênea). Também divulgada éuma população de rotavírus atenuado (isolado) caracterizada pelo fato decompreender uma única variante ou substancialmente uma única variante, areferida variante definida pela seqüência de nucleotídeo que codifica pelomenos uma das principais proteínas virais designadas como VP4 e VP7. Aeficácia protetora de tal vacina de rotavírus humano atenuada oral contra acepa heteróloga G9 foi reportada em bebês da América Latina (Perez ecolaboradores, 42a Interscience Conference on Antimicrobial Agents andChemotherapy (ICAAC 2002) 27- 30 de Setembro de 2002, San Diego). OWO 05/021033 divulga que um sorotipo de rotavírus pode ser usado paraproteger contra doença causada por outro sorotipo. Em particular, o WO05/021033 divulga o uso de uma população de rotavírus Gl [por exemplo,conforme depositado na European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public HealthLaboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, PortonDown, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG5 Reino Unido, em 13 de Agosto de1999 sob o número de acesso 99081301, sob os termos do Tratado deBudapeste, também denominada P43 ou RIX4414], para prevenir doençacausada por Gle pelo menos um sorotipo de rotavírus não-Gl tal como, masnão limitado a, os sorotipos de rotavírus G2, G3, G4 e G9.

os conteúdos todos do WO 01/12797 e WO 05/021033 sãoaqui incorporados por referência.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura IA (SEQ ID NO: 1) é a seqüência de nucleotídeo dogene VP4 de P43 (RIX4414), incluindo a seqüência que codifica a proteínaVP4 de P43.

Figura IB (SEQ ID NO: 2) tem nucleotídeos adicionais deambas as extremidades do gene e uma substituição de nucleotídeo (em negrito

- uma G ao invés de uma C na posição 18, com TCG resultante ao invés deTCA, contudo, sem impacto sobre a proteína codificada resultante) em virtudeda técnica de seqüenciamento. A seqüência de não-codificação aparece emletras minúsculas. A Figura IB mostra a seqüência correta para o depósito P43.

Figura 2A (SEQ ID NO: 3) é a seqüência de nucleotídeo dogene VP7 de P43 (RIX4414), incluindo a seqüência que codifica a proteínaVP7 de P43.

Figura 2B (SEQ ID NO: 4) tem nucleotídeos adicionais deambas as extremidades do gene e uma substituição de nucleotídeo (em negrito

- uma A ao invés de uma C na posição 58, resultando em uma ATT quecodifica leucina ao invés de CTT que codifica isoleucina) em virtude datécnica de seqüenciamento. A seqüência de não-codificação aparece em letrasminúsculas. A Figura 2B mostra a seqüência correta para o depósito P43.

Figura 3 (SEQ ID NO: 5) é a seqüência de polipeptídeo daVP4 de RIX4414.Figura 4 (SEQ ID NO: 6) é a seqüência de polipeptídeo deVP7 de RIX4414.

Figura 5 (SEQ ID NO: 7) mostra a seqüência de polipeptídeoda proteína NSP4 de RIX4414.

Figura 6 (SEQ ID NO: 8) mostra a seqüência de nucleotídeoda proteína NSP4 de RIX4414. A seqüência de não-codificação aparece emletras minúsculas.

Figura 7 (SEQ ID NO: 9) mostra a seqüência de polipeptídeoda proteína VP6 de RIX4414.

Figura 8 (SEQ ID NO: 10) mostra a seqüência de nucleotídeoda proteína VP6 de RIX4414. A seqüência de não-codificação aparece emletras minúsculas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Na presente invenção, nós determinamos que uma populaçãode rotavírus atenuado, por exemplo, um tal como caracterizado no WO01/12797, pode ser usada como uma vacina para proporcionar proteçãocruzada contra doença causada por infecção por rotavírus de um tipo diferente(sorotipo e/ou genótipo) que aquele usado na vacina. A proteína VP7específica o tipo G (sorotipo) e a proteína VP4 específica o tipo P de cepa(sorotipo ou genótipo).

Em particular, a presente invenção se refere ao uso de umapopulação de rotavírus atenuado de um tipo P na prevenção de doençaassociada à infecção por rotavírus de um tipo P diferente e, especificamente,ao uso de uma população ou cepa de rotavírus atenuada de um tipo GxPy naindução de uma resposta imune e/ou na prevenção de doença associada àinfecção por rotavírus causada por uma cepa de rotavírus a qual não é tipo Gxnem Py.

Imunidade pode ser medida pelas respostas de anticorpo deneutralização à vacina ou pela resposta de anticorpo IgA ao rotavírus no soro,tal como o fator de soroconversão (isto é, aumento > 3 vezes nos níveis deanticorpo IgA no soro após vacinação), conforme descrito em Ward ecolaboradores, 1990, J. Infect. Disease, 161, 440-445).

No contexto da presente invenção e consistente com acompreensão comum na técnica (Santos N. e Hoshino Y., 2005, Reviews inMedicai Virology, 15, 29-56), Gx se referirá a um tipo G específico, isto é, ogenótipo G ou sorotipo G (ambas as terminologias sendo idênticas), enquantoque a terminologia Py se referirá, genericamente, a um tipo P ou sorotipo Pespecífico (por exemplo, P8, P4) ou genótipo P (por exemplo, P[4], P[8]).Quando referido a um genótipo P específico, o P seguido por um númeroentre colchetes será usado; de outro modo, o tipo P significará um sorotipo ougenótipo.

Por toda a especificação, termos tais como o uso de umacomposição de vacina de acordo com a invenção na fabricação de umacomposição de vacina para a prevenção de doenças por rotavírus ou tais comométodos de terapia compreendendo o uso da referida composição de vacina,serão usados permutavelmente.

Nós determinamos agora que uma população de rotavírusGxP[8] (por exemplo, G1P[8], conforme depositado na European Collectionof Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and ProductionLaboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for AppliedMicrobiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG,Reino Unido em 13 de Agosto de 1999 sob o número de depósito 99081301,sob os termos do Tratado de Budapeste) pode ser usada para prevenir doençacausada por GxP[8] (por exemplo, G1P[8]) e pelo menos uma cepa derotavírus o qual não é do tipo Gx nem Py. Em particular, nós determinamosque uma população de rotavírus G1P[8] pode ser usada para prevenir doençacausada por um genótipo G1P[8] e pelo menos um não-GlP[8], tal como ogenótipo de rotavírus Gl P [4].Conseqüentemente, a presente invenção se refere ao uso deuma população de rotavírus atenuado de um tipo de rotavírus na prevenção dedoença associada à infecção por rotavírus de outro tipo de rotavírus, em que otipo é, adequadamente, definido através de referência à seqüência da proteínaVP4 de rotavírus (tipo P).

A invenção também se refere ao uso de uma população derotavírus atenuado de uma cepa de rotavírus (definida por um tipo GePespecífico) na prevenção de doença associada à infecção por rotavírus deoutra cepa de rotavírus, em que a cepa é, adequadamente, definida através dereferência à seqüência da proteína VP4 (tipo P) e proteína VP7 (tipo G) derotavírus.

Especificamente, a presente invenção se refere ao uso de uma cepade rotavírus atenuado de um tipo GxPy na fabricação de um medicamentopara indução de uma resposta imune contra infecção por rotavírus causada poruma cepa de rotavírus a qual não é do tipo Gx nem Py. Em outras palavras,uma cepa de rotavírus da invenção pode ser usada para prevenir doençacausada por infecção de um segundo rotavírus o qual difere nos tipos G e P.

Em particular, em todos os aspectos da invenção reivindicada,a referida resposta imune é uma resposta imune protetora. Adequadamente, apopulação de rotavírus compreende proteínas virais VP4 e/ou VP7 dodepósito 99081301 na ECACC adequada para proporcionar um efeito protetorcruzado.

Por todo o documento, será referida como proteção cruzada aproteção proporcionada por um tipo de rotavírus contra infecção causada porum rotavírus de um tipo diferente.

Proteção cruzada pode ser homotípica ou heterotípica.Proteção cruzada homotípica é uma proteção proporcionada por uma cepa derotavírus contra uma cepa de um tipo G ou P tal como, por exemplo, umacepa G1P[8], que proporciona proteção cruzada contra uma cepa não-GlP[8](por exemplo, G2 P[8]) via o tipo P[8]. Outro exemplo de uma proteçãocruzada homotípica é aquela proporcionada por uma cepa G1P[8] contra umacepa não-GlP[8] (por exemplo, Gl P[4]) via o tipo Gl. Proteção cruzadaheterotípica é uma proteção proporcionada por uma cepa de rotavírus contrauma cepa de rotavírus de tipos PeG diferentes tal como, por exemplo, aproteção proporcionada por uma cepa G1P[8] contra uma cepa não-GlP[8](por exemplo, Gl P[4]) (proteção heterotípica proporcionada via os tipos G eP).

Adequadamente, o sorotipo de rotavírus atenuado é Gl e écapaz de proporcionar proteção cruzada contra doença causada pelossorotipos Gl e não-Gl de rotavírus, tais como sorotipos selecionados dogrupo consistindo de: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, Gl 1 , G12, G13e G14.

Em particular, o uso de uma população de rotavírus atenuadoGl (por exemplo, conforme depositado na European Collection of AnimalCell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, PublicHealth Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research,Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido, em 13 de Agostode 1999 sob o número de depósito 99081301, sob os termos do Tratado deBudapeste), pode ser usado para prevenir doença causada por Gl e pelomenos, adequadamente pelo menos dois, adequadamente pelo menos três,adequadamente pelo menos quatro sorotipos de rotavírus não-Gl selecionadosdo grupo consistindo de: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, Gll , G12,Gl3 e G14. Conseqüentemente, é proporcionado o uso de uma cepa derotavírus atenuado de um tipo Gl na fabricação de uma composição de vacinapara a indução de uma resposta imune contra uma infecção por rotavíruscausada por uma cepa de rotavírus a qual não é de um tipo Gl. Em umaspecto particular, uma resposta imune é induzida contra pelo menos um, pelomenos dois ou mais sorotipos não-Gl de rotavírus, tipicamente contraqualquer sorotipo selecionado do grupo consistindo de: G2, G3, G4, G5, G6,G7, G8, G9, GlO, Gl 1 , G12, G13 e G14. Tipicamente, uma resposta imune éinduzida contra pelo menos um, adequadamente pelo menos dois,adequadamente pelo menos três dos seguintes tipos não-Gl: G2, G3, G4 eG9, além de proteção homotípica (Gl). Adequadamente, a composiçãocompreende uma cepa de rotavírus Gl e é usada para induzir uma respostaimune aos tipos Gle G2.

Adequadamente, o tipo de cepa de rotavírus atenuado é P [8] eé capaz de proporcionar proteção cruzada contra doença causada pelo tipoP[8] de rotavírus e pelos tipos não-P[8] de rotavírus, tais como tiposselecionados do grupo consistindo de: P[l], P[2], P[3], P[4], P[5], P[6], P[7],P[9], P[10], P[11], P[12] , P[14] e P[19].

Em particular, o uso de uma população de rotavírus atenuadoP[8] (por exemplo, conforme depositado na European Collection of AnimalCell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, PublicHealth Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research,Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido em 13 de Agostode 1999 sob o número de depósito 99081301 , sob os termos do Tratado deBudapeste), pode ser usado para prevenir doença causada por P[8] e pelomenos um dos tipos de rotavírus não-P[8], selecionados do grupo consistindode: P[l], P[2], P[3], P[4], P[5], P[6], P[7], P[9], P[10], P[11], P[12] , P[14] eP[19]. Em particular, uma resposta imune é, adequadamente, induzida contrapelo menos um tipo P[4] além do tipo de rotavírus P[8].

Adequadamente, a composição de vacina para uso de acordocom a invenção compreende uma cepa de rotavírus G1P[8] e é capaz deinduzir a uma resposta imune a uma cepa de rotavírus G2P[4].

Em um aspecto particular, a invenção se refere a um métodode indução de uma resposta imune contra cepa de rotavírus, o métodocompreendendo administração, a um indivíduo, de uma componentecompreendendo uma cepa de rotavírus atenuado de um tipo GxPy, a referidacomposição gerando uma resposta imune contra uma cepa de rotavírus a qualnão é do tipo Gx nem Py.

Em particular, a invenção se refere a um método de indução deuma resposta imune contra o sorotipo Gl e não-Gl de rotavírus, o métodocompreendendo administração a um indivíduo, de uma composiçãocompreendendo uma vacina de sorotipo Gl de rotavírus. Adequadamente,sorotipos não-Gl de rotavírus são selecionados do grupo consistindo de: G2,G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, Gl 1 , G12, G13 e G14. Adequadamente, acomposição compreende uma cepa de rotavírus Gl e é usada para induzir auma resposta imune aos tipos Gl e G2.

Adequadamente, a composição de vacina para uso de acordocom a invenção compreende uma cepa de rotavírus G1P[8] e é capaz deinduzir a uma resposta imune a uma cepa de rotavírus G1P[4].

Adequadamente, a população de rotavírus dentro dacomposição de vacina é de especificidade pela cepa Gl Pl A (isto é, G1P[8]de acordo com a presente nomenclatura). Adequadamente, a população devírus compreende proteínas virais VP4 e/ou VP7 do depósito 99081301 naECACC para estimular uma resposta imune e, tipicamente, proporciona umefeito protetor cruzado. Adequadamente, a invenção se refere à cepas derotavírus G1P[8] em métodos ou usos conforme descrito acima. Tipicamente,a vacina contra rotavírus usada é o depósito 99081301 na ECACC ou éderivada desse depósito.

Em um aspecto específico, a vacina induz a uma respostaimune protetora cruzada ou proteção cruzada contra gastrenterite em umindivíduo vacinado comparado com o indivíduo não vacinado (do grupo complacebo). Adequadamente, a vacina proporciona proteção cruzada contrasintomas de infecção por rotavírus, tais como diarréia ou gastrenterite. Porexemplo, gastrenterite pode ser definida como diarréia caracterizada por trêsou mais fezes aquosas ou mais moles do que o normal dentro de um dia ouvômito forte junto com a detecção de rotavírus na amostra de fezesexaminada.

Conforme será compreendido por aqueles habilitados, agravidade da doença e eficácia da vacinação para induzir a uma respostaimune protetora em um indivíduo vacinado ou uma população vacinada podeser avaliada através de vários meios. Por resposta imune protetora entenda-seuma resposta imune a qual leva a uma redução da gravidade de sintomasclínicos associados à infecção por rotavírus ou que leva à suscetibilidadereduzida à infecção por rotavírus. A gravidade da doença em um indivíduonão vacinado ou vacinado pode ser classificada de acordo com sistemas declassificação publicados, tal como a escala de 20 pontos de Vesikari ou umaversão ligeiramente emendada do referido método (Ruuska T e colaboradores,Scand. J. Infect. Dis. 1990, 22, 259-267) ou de acordo com qualquer sistemaadequado que reporta e classifica sintomas específicos da infecção porrotavírus (tal como a metodologia reportada em Clark HF, Borian EF, BellLM. Protective effect of WC3 vaccine against rotavirus diarrhea in infantsduring a predominantly serotype 1 rotavirus season. J Infect Dis. 1988: 570-86). De acordo com o método de Vesikari, RVGE grave é usualmentedefinida como um escore >11.

Proteção pode ser avaliada a nível de uma população ou umgrupo pela eficácia da vacina (VE). A eficácia da vacina é calculada usando aseguinte fórmula:

VE (%) = 1 - RR = 1 - (ARV/ARU), com:RR = risco relativo = ARV/ARU

ARU = taxa de ataque da doença em uma população nãovacinada (estimada a partir do grupo com placebo) = número de indivíduosque reportam pelo menos um episodio de RV GE/número total de indivíduosno grupo de controle

ARV = taxa de ataque de doença no grupo vacinado = númerode indivíduos que reportam pelo menos um episodio de RV GE/número totalde indivíduos no grupo com vacina contra HRV.

Conseqüentemente, em um aspecto da presente invenção, éproporcionado um método ou uso conforme detalhado acima, em que acomposição compreendendo uma cepa de rotavírus atenuado de um tipo GxPyinduz a uma resposta imune protetora cruzada e/ou proteção contragastrenterite induzida por rotavírus, adequadamente contra gastrenterite graveinduzida por rotavírus, causada por infecção de uma cepa de rotavírus a qualnão é do tipo Gx nem Py. Em uma modalidade específica, a referida respostaimune protetora é capaz de reduzir a gravidade da doença ou eliminar adoença induzida por rotavírus, conforme medido de acordo com qualquersistema de classificação adequado.

Em ainda outra modalidade, é proporcionado um método ouuso da composição de acordo com a invenção, para reduzir a gravidade dadoença, por exemplo, gastrenterite, ou eliminar doença induzida por rotavírus,a referida gravidade da doença ou a doença sendo registrada de acordo comqualquer sistema de classificação adequado, conforme ensinado acima.

Em uma modalidade específica, a referida composição é até60% protetora, adequadamente até 81% protetora, em uma população deindivíduos vacinados, contra diarréia causada por infecção de um rotavírus deum tipo diferente daquele do rotavírus atenuado presente na composição. Emoutra modalidade específica, a referida composição é pelo menos 40%protetora, adequadamente pelo menos 45% protetora, adequadamente pelomenos 50% protetora, adequadamente pelo menos 60% protetora, em umapopulação de indivíduos vacinados, contra diarréia causada por uma cepa derotavírus a qual não é do tipo Gx nem Py. Em um aspecto específico, areferida composição é entre 40% e 80% protetora, adequadamente entre 50%e 70% protetora contra diarréia causada por uma cepa de rotavírus a qual nãoé do tipo Gx ou Py. Em um aspecto específico, a referida composiçãocompreende uma cepa de rotavírus G1P[8] a qual proporciona o nível deproteção conforme mencionado acima contra gastrenterite causada porinfecção de cepas de rotavírus do tipo G1P[4].

Adequadamente, a taxa de proteção contra diarréia e/ougastrenterite e/ou gastrenterite grave obtida em uma população de indivíduosvacinados infectados por uma cepa de rotavírus a qual não é do tipo Gx nemPy está entre IOa 90%, adequadamente entre 20 a 80%, adequadamente entre40%) e 80%, adequadamente entre 45% e 75% protetora. Tipicamente, o nívelde proteção contra gastrenterite grave é pelo menos 40%, adequadamente pelomenos 50%.

Em um aspecto específico, a referida composição compreendeuma cepa de rotavírus G1P[8] a qual é entre 40% e 80% protetora,adequadamente entre 45% e 75% protetora, em uma população de indivíduosvacinados contra gastrenterite grave, conforme medido de acordo com oescore de Vesikari, causada por infecção por rotavírus com um sorotipoG1P[4],

Adequadamente, a vacina é usada em um regime de 2 doses ou3 doses.

A vacina contra rotavírus usada para proporcionar proteçãocruzada tem as características adequadas a seguir.

Em um aspecto, o rotavírus da composição para uso de acordocom a invenção tem um gene VP4 compreendendo uma seqüência denucleotídeo compreendendo pelo menos um dos seguintes: uma base adenina(A) na posição 788, uma base adenina (A) na posição 802 e uma base timina(T) na posição 501 do códon inicial.

Em um outro aspecto, o rotavírus da composição para uso deacordo com a invenção tem um gene VP7 compreendendo uma seqüência denucleotídeo compreendendo pelo menos um dos seguintes: uma timina (T) naposição 605, uma adenina (A) na posição 897 ou uma guanina (G) na posição897 a partir do códon inicial. Adequadamente, na posição 897 há uma adenina(A).

Em um aspecto específico, o rotavírus da composição para usode acordo com a invenção tem uma adenina (A) nas posições 788 e 802 e umatimina (T) na posição 501 a partir do códon inicial da seqüência do gene VP4.

Em outro aspecto específico, o rotavírus da composição parauso de acordo com a invenção tem uma timina (T) na posição 605 e umaadenina/guanina (A/G) na posição 897 a partir do códon inicial na seqüênciade VP7. Mais adequadamente, na seqüência de VP6, há uma adenina (A) naposição 897.

Em um aspecto particularmente adequado, o rotavírus dacomposição para uso de acordo com a invenção tem uma adenina (A) nasposições 788 e 802 e uma timina (T) na posição 501 a partir do códon inicialna seqüência do gene VP4 e uma timina (T) na posição 605 e umaadenina/guanina (A/G) na posição 897 a partir do códon inicial na seqüênciade VP7. Adequadamente, na seqüência de VP7 há uma adenina (A) naposição 897.

Em outro aspecto, o rotavírus da composição para uso deacordo com a invenção compreende uma seqüência de nucleotídeo quecodifica uma proteína VP4, em que a seqüência de nucleotídeo é conformemostrado na Figura IA (SEQ ID NO: 1) ou Figura IB (SEQ ID NO: 2) e/ouuma seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína VP7, em que aseqüência de nucleotídeo é conforme mostrada na Figura 2A (SEQ ID NO: 3)ou Figura 2B (SEQ ID NO: 4). Em uma modalidade alternativa, o rotavírus dacomposição para uso de acordo com a invenção compreende uma proteínaVP4 conforme apresentado na Figura 3 (SEQ ID NO: 5) e/ou uma proteínaVP7 conforme apresentado na Figura 4 (SEQ ID NO: 6). Em outramodalidade, a referida população de rotavírus para uso de acordo com ainvenção compreende, adicionalmente, uma proteína NSP4 apresentada naFigura 5 (SEQ ID NO: 7) ou codificada pela seqüência de nucleotídeoconforme apresentado na Figura 6 (SEQ ID NO: 8) e/ou uma proteína VP6conforme apresentado na Figura 7 (SEQ ID NO: 9) ou codificada pelaseqüência de nucleotídeo conforme apresentado na Figura 8 (SEQ ID NO:10).

Populações de rotavírus adequadas para uso na presenteinvenção podem ser obtidas através de um método compreendendo:

passagem de um preparado de rotavírus sobre um tipo decélula adequado;

opcionalmente seleção de cultura homogênea usando as etapasde:

a) diluição limite; ou

b) isolamento de placa individual; e

verificação com relação à presença de uma variantesubstancialmente simples realizando uma determinação de seqüência de umaregião apropriada da seqüência de gene VP4 e/ou VP7.

Adequadamente, a população de rotavírus é derivada das cepasP43 (RIX4414), P33 ou P26, conforme descrito acima.

A determinação de seqüência pode, adequadamente, serrealizada através de uma técnica de hibridização quantitativa ou semi-quantitativa, tal como hibridização de Slot Blot ou hibridização de placa.

A população de vírus clonado resultante do método de acordocom a invenção pode ser amplificada através de passagem adicional sobreuma linhagem de célula adequada.

Tipos adequados de célula para passagem da planta derotavírus no método acima incluem células de rim de macaco Green African(AGMK), as quais podem ser linhagens de células estabelecidas ou célulasAGMK primárias. Linhagens de células AGMK adequadas incluem, porexemplo, Vero (ATCC CCL- 81), DBS-FRhL-2 (ATCC CL-160), BSC-I(ECACC 85011422) e CV-I (ATCC CCL-70). Também adequadas são aslinhagens de células MA-104 (macaco rhesus) e MRC-5 (humana - ATCCCCL-171). Células Vero são particularmente adequadas para fins deamplificação. Passagem em células Vero proporciona um alto rendimento devírus.

Técnicas para verificar se há uma única variante em umapopulação de vírus resultante do método e para determinação da naturezadessa variante única envolvem procedimentos padrão de seqüenciamento ouhibridização conhecidas na técnica e são descritos aqui abaixo.

Em um aspecto específico, o método da invenção é realizadousando um rotavírus apropriado, particularmente rotavírus tendo ascaracterísticas da cepa 89-12 ou de um derivado submetido à passagem damesma.

Uma população de variante única particularmente adequada éP43, a qual foi obtida de P33 (um rotavírus humano isolado passado 33 vezesem cultura sobre tipos de células apropriados) através de uma série de etapasde clonagem por diluição terminal, seguido por passagem do material clonadosobre células Vero para amplificação.

Uma população de P43 foi depositada na European Collectionof Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and ProductionLaboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for AppliedMicrobiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG,Reino Unido em 13 de Agosto de 1999 sob o número de depósito 99081301 ,sob os termos do Tratado de Budapeste e é divulgada no WO 01/12797.

Embora essa disponibilidade pública indicada seja o métodomais simples de obtenção do rotavírus P43 humano, rotavírus similares esubstancialmente idênticos de modo funcional podem ser produzidos poresses e outros métodos em vista dos ensinamentos da presente invenção. Taisrotavírus substancialmente idênticos de modo funcional são consideradoscomo sendo biologicamente equivalentes ao rotavírus P43 humano dapresente invenção e, portanto, estão dentro do escopo geral da presenteinvenção. Portanto, será compreendido que a invenção abrange populações derotavírus tendo as características da variante P43 conforme descrito aqui.

Também será compreendido que a invenção abrange materiaisderivados do P43 99081301 depositado na ECACC através de sujeição dosmesmos a processamento adicional, tal como através de propagação domesmo por meio de passagem adicional, clonagem ou outros procedimentosusando o vírus vivo ou através de modificação de P43 de qualquer forma,incluindo através de técnicas de engenharia genética ou técnicasrecombinantes. Tais etapas e métodos são bem conhecidos na técnica.

Materiais derivados do P43 depositado os quais são cobertospela invenção incluem proteína e material genético. De interesse particular,são rotavírus recombinantes os quais compreendem pelo menos um antígenoou pelo menos um segmento de P43, por exemplo, recombinantes os quaiscompreendem uma cepa virulenta de rotavírus na qual um ou uma parte deum dos 11 segmentos genômicos foi substituída pelo segmento genômico ouparte do mesmo de P43. Especificamente, um recombinante de rotavírus noqual o segmento ou segmento parcial que codifica a NSP4 de um segmento ousegmento parcial de P43 pode ter propriedades úteis. Rotavírus recombinantese técnicas para preparo dos mesmos são bem conhecidas (Foster, R. H. eWagstaff, A. J. Tetravalent Rotavírus Vaccine, a review. ADIS drugevaluation, BioDrugs, Gev, 9 (2), 155-178, 1998).

Materiais de interesse particular são a prole de P43 e derivadosimunologicamente ativos de P43. Derivados imunologicamente ativossignifica materiais obtidos de ou com o vírus P43, particularmente antígenosdo vírus, os quais são capazes de estimular uma resposta imune que é reativacontra rotavírus quando injetados em um animal hospedeiro.

Na adaptação do rotavírus a uma linhagem de célulaapropriada, por exemplo, células Vero, pode ser necessário tratar os vírus demodo a eliminar qualquer contaminante potencial, tal como quaisquer agentesadventícios que possam estar presentes e que, de outro modo, causariamcontaminação. No caso de vírus adventícios sensíveis a éter, isso pode serfeito através de tratamento conforme descrito aqui abaixo, a presenteinvenção também se refere à inclusão de tal tratamento com éter como umaetapa opcional no procedimento global para obtenção de um rotavírus vivoatenuado ou vacina formulada com o mesmo.

A cepa de rotavírus com proteção cruzada da presenteinvenção pode ser combinada com quaisquer outras cepas de rotavírus paraproporcionar proteção ou proteção cruzada adicional contra infecção oudoença por rotavírus.

A presente invenção também proporciona uma vacina derotavírus atenuada capaz de proporcionar proteção cruzada, conformedefinido aqui acima, misturada com um adjuvante ou um carreadorfarmacêutico adequado.

Em uma modalidade, a vacina de rotavírus para uso de acordocom a invenção é uma vacina de rotavírus monovalente contendo uma únicacepa de rotavírus, tal como a cepa G1P[8].

A presente invenção é particularmente vantajosa aoproporcionar uma vacina de rotavírus vivo na qual o rotavírus vivo atenuado éum rotavírus humano e não causa intussuscepção.

Carreadores farmacêuticos adequados para uso com a cepa derotavírus atenuado de acordo com a invenção incluem aqueles conhecidos natécnica como sendo adequados para administração oral, especialmente parabebês. Tais carreadores incluem e não estão limitados a, carboidratos,polialcoóis, aminoácidos, hidróxido de alumínio, hidróxido de magnésio,hidróxiapatita, talco, óxido de titânio, hidróxido de ferro, estearato demagnésio, carbóximetilcelulose, hidróxipropilmetil celulose, celulosemicrocristalina, gelatina, peptona vegetal, xantana, carragenano, gomaarábica, β-ciclodextrina.

A invenção também proporciona um processo para o preparode uma vacina de rotavírus, por exemplo, através de liofilização do vírus napresença de estabilizantes adequados ou mistura do vírus de acordo com ainvenção com um adjuvante ou carreador farmacêutico adequado.

Pode também ser vantajoso formular o vírus da invenção emcarreadores baseados em lipídio, tais como virossomas ou lipossomas, ememulsões óleo-em-água ou com partículas de carreador. Alternativamente oualém disso, imunoestimulantes tais como aqueles conhecidos na técnica paravacinas orais podem ser incluídos na formulação. Tais imunoestimulantesincluem toxinas bacterianas, particularmente toxina do cólera (CT) na formada holotoxina (molécula inteira) ou cadeia B apenas (CTB) e a enterotoxinasensível ao calor de E. coli (LT). LTs com mutação (mLTs) as quais sãomenos prováveis de converter à sua forma ativa do que a LT nativa sãodescritas no WO 96/06627, WO 93/13202 e US 5.182.109.

Outros imunoestimulantes os quais podem, vantajosamente,ser incluídos são derivados de saponina tal como QS21 e monofosforil lipídioA, em particular monofosforil lipídio A 3-de-O-acilado (3D-MPL). Saponinaspurificadas como adjuvantes orais são descritas no WO 98/56415. Saponinase monofosforil lipídio A podem ser empregados separadamente ou emcombinação (por exemplo, WO 94/00153) e podem ser formulados emsistemas adjuvantes junto com outros agentes. 3D-MPL é um adjuvante bemconhecido fabricado pela Ribi Immunochem, Montana e sua fabricação édescrita no GB 2122204.

Uma discussão geral de carreadores e adjuvantes paraimunização oral pode ser encontrada em Vaccine Design, The Subunit andAdjuvant Approach, editado por Powell and Newman, Plenum Press, NovaIorque, 1995.A invenção também proporciona um método para vacinaçãode seres humanos, especialmente bebês, através de administração, a umindivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade de uma composição devacina de acordo com a invenção. Adequadamente, a vacina atenuada viva éadministrada através de administração oral.

Em um aspecto específico, a cepa de rotavírus atenuado deacordo com a invenção é formulada com um anti-ácido para minimizar aativação da vacina pelo ácido no estômago. Componentes anti-ácidoadequados incluem anti-ácidos inorgânicos, por exemplo, hidróxido dealumínio Al(OH)3 e hidróxido de magnésio Mg(OH)2. Anti-ácidoscomercialmente disponíveis os quais são adequados para uso na invençãoincluem Mylanta (marca comercial), a qual contém hidróxido de alumínio ehidróxido de magnésio. Esses são insolúveis em água e são fornecidos emsuspensão.

Hidróxido de alumínio é um componente particularmenteadequado de uma composição de vacina de acordo com a invenção, uma vezque ele pode proporcionar não apenas um efeito anti-ácido, mas também umefeito adjuvante.

Também adequados para uso como anti-ácidos na vacina dainvenção são anti-ácidos orgânicos, tais como sais de carboxilato de ácidoorgânico. Um anti-ácido adequado na composição de vacina da invençãocontém um sal de carboxilato de ácido orgânico, especialmente um sal deácido cítrico, tal como citrato de sódio ou citrato de potássio.

Um anti-ácido particularmente adequado que pode ser usadona composição de vacina da presente invenção é o sal inorgânico insolúvel,carbonato de cálcio (CaCO3). O carbonato de cálcio é capaz de se associar aorotavírus e a atividade do rotavírus é mantida durante a associação com ocarbonato de cálcio.

Para prevenir sedimentação do carbonato de cálcio durante aetapa de enchimento, agentes viscosos estão, adequadamente, presentes naformulação.

Possíveis agentes viscosos que podem ser usados incluemexcipientes pseudoplásticos. Uma solução pseudoplástica é definida comouma solução tendo maior viscosidade quando de descanso comparado comsua viscosidade sob agitação. Excipientes desse tipo são polímeros naturais,tais como goma arábica, goma tragacanto, agar-agar, alginatos, pectinas oupolímeros semi-sintéticos, por exemplo: carboximetil celulose (Tyloses C®),metil celulose (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® e MB®),hidróxipropil celulose (Klucels®) e hidróxipropil metilcelulose (MethocelsE® e K®, Viscontrans MPHC®). Em geral, esses excipientes pseudoplásticossão usados junto com agentes tixotrópicos. Agentes viscosos alternativos quepodem ser usados são excipientes pseudoplásticos com baixa capacidade defluxo. Esses polímeros, em uma concentração suficiente, dão origem a umadisposição de fluido estrutural resultando em uma solução de alta viscosidadetendo baixa capacidade de fluxo quando de descanso. Uma determinadaquantidade de energia precisa ser fornecida ao sistema para permitir fluxo etransferência.

Energias externas (agitação) são necessárias para destruirtemporariamente a disposição de fluido estrutural de forma a obter umasolução fluida. Exemplos de tais polímeros são Carbopol® e goma xantana.

Excipientes tixotrópicos se tornam uma estrutura de gelquando de descanso enquanto que, sob agitação, eles formam uma soluçãofluida. Exemplos de agentes tixotrópicos são: Veegum® (silicato demagnésio-alumínio) e Avicel RC® (cerca de 89% de celulose microcristalinae 11% de carboximetil celulose de Na).

A composição de vacina da presente invenção compreende,adequadamente, um agente viscoso selecionado de goma xantana ou amido.

Assim, a composição de vacina da presente invenção é,tipicamente, formulada com uma combinação de carbonato de cálcio e gomaxantana.

Outros componentes de uma composição usados na invençãoincluem, adequadamente, açúcares, por exemplo, sacarose e/ou lactose.

A composição de vacina de acordo com a invenção podeconter componentes adicionais incluindo, por exemplo, flavorizantes(particularmente para uma vacina oral) e agentes bacteriostáticos.

Diferentes apresentações da composição de vacina de acordocom a invenção são consideradas.

Em uma modalidade adequada, a vacina é administrada comouma formulação líquida. Adequadamente, a formulação líquida éreconstituída antes de administração a partir de pelo menos um dos doiscomponentes a seguir:

i) componente viral

ii) componente líquido

Nessa modalidade, o componente viral e o componente líquidonormalmente estão presentes em recipientes distintos, os quais podem,convenientemente, ser compartimentos distintos de um único vaso ou vasosseparados os quais podem ser conectados de uma forma que a composição devacina final seja reconstituída sem expô-la ao ar.

Antes de reconstituição, o vírus pode estar em uma forma secaou em uma forma líquida. Adequadamente, o componente viral é liofilizado.Vírus liofilizado é mais estável do que vírus em uma solução aquosa. O vírusliofilizado pode ser, adequadamente, reconstituído usando uma composiçãode anti-ácido líquida para produzir uma formulação de vacina líquida.

Alternativamente, o vírus liofilizado pode ser reconstituído com água ousolução aquosa, caso no qual a composição viral liofilizada contém,adequadamente, um componente anti-ácido.

Adequadamente, a formulação de vacina compreende umcomponente viral formulado com carbonato de cálcio e goma xantana em umcompartimento ou vaso e esse é reconstituído com água ou solução aquosapresente no segundo compartimento ou vaso.

Em uma modalidade, a composição de vacina é umaformulação sólida, adequadamente um bolo liofilizado o qual é adequado paradissolução imediata quando colocado na boca. Formulações liofilizadaspodem, convenientemente, ser proporcionadas na forma de tabletes em umpacote de bolha farmacêutico.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma vacina contrarotavírus na forma de um tablete de dissolução rápida para administração oral.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composiçãocompreendendo uma cepa de rotavírus atenuado vivo, em particular uma cepade rotavírus humano, em que a composição é um sólido liofilizado capaz dedissolução imediata quando colocado na boca.

Adequadamente, o tablete de dissolução rápida de acordo coma invenção dissolve na boca do indivíduo de modo suficientemente rápidopara prevenir que se engula o tablete não dissolvido. Essa abordagem éparticularmente vantajosa para vacinas contra rotavírus pediátricas.

Adequadamente, o vírus é um rotavírus humano atenuado vivoo qual é formulado com um antiácido inorgânico, tal como carbonato decálcio, e um agente viscoso, tal como goma xantana.

Um outro aspecto da presente invenção é proporcionar umaformulação liofilizada em que o componente viral é qualquer cepa derotavírus a qual é formulada com carbonato de cálcio e goma xantana.

Vacinas da invenção podem ser formuladas e administradasatravés de técnicas conhecidas usando uma quantidade adequada de vírus vivopara proporcionar proteção eficaz contra infecção por rotavírus sem efeitoscolaterais adversos significativos em vacinas típicas. Uma quantidadeadequada de vírus vivo normalmente estará entre IO4 e IO7 unidades deformação de foco (ffu) por dose. Uma dose típica de vacina podecompreender IO5 - IO6 ffu por dose e pode ser fornecida em várias dosesdurante um período de tempo, por exemplo, em duas doses fornecidas comum intervalo de dois meses. Benefícios podem, contudo, ser obtidos ao ter umregime de mais de 2 doses, por exemplo, 3 ou 4 doses, particularmente empaíses em desenvolvimento. O intervalo entre as doses pode ser mais oumenos do que dois meses de distância. Uma quantidade ótima de vírus vivopara uma única dose ou para um regime com múltiplas doses e sincronizaçãoótima para as doses, pode ser determinada através de estudos padrãoenvolvendo observação de titulações de anticorpo e outras respostas emindivíduos.

A vacina da invenção pode também compreender outros vírusvivos adequados para proteção contra outras doenças, por exemplo,poliovírus. Alternativamente, outras vacinas de vírus vivo adequadas paraadministração oral podem ser fornecidas em uma dose separada, mas namesma ocasião que a composição de vacina contra rotavírus de acordo com ainvenção.

Soros de doze bebês de 4 a 6 meses de idade vacinados com omaterial P33 conforme descrito no documento Vaccine (1998) foram testadoscom relação à neutralização de P33, P38, P43 e 89-12C2.

A faixa de titulações de neutralização de todos os sorostestados é similar para P33, P38 e P43. A análise estatística não mostradiferença significativa nas titulações de neutralização globais contra todos ostrês vírus. Isso sugere que os epítopos de neutralização conformacional e não-conformacional de P33, P38 e P43 são igualmente bem reconhecidos pelossoros anti-P33 de bebês vacinados com P33. Essa observação sugereindiretamente que os epítopos de neutralização revelados nesse ensaio in vitronão foram alterados entre P33, P38 e P43.

A faixa de titulações de neutralização de P89-12C2, contudo,difere significativamente do P33, P38 e P43. Essa observação sugere que osepítopos de neutralização conformacional ou não-conformacional de P33, P38e P43 não são igualmente bem reconhecidos pelos soros anti-P33 de bebêsvacinados com P33. Essa observação sugere indiretamente que os epítopos deneutralização revelados nesse ensaio in vitro foram alterados entre 89-12 C2 eP33, P38 e P43.

Modalidades particularmente adequadas da presente invençãoincluem:

1. O uso de uma cepa de rotavírus atenuado de um tipo P nafabricação de uma composição de vacina para a indução de uma respostaimune contra um rotavírus de um tipo P diferente daquele da referidacomposição de vacina.

2. O uso de uma cepa de rotavírus atenuado de um tipo P [8] nafabricação de uma composição de vacina para a indução de uma respostaimune contra um rotavírus o qual não é P[8].

3. O uso de uma cepa de rotavírus atenuado de um tipo G1P[8]na fabricação de uma composição de vacina para a indução de uma respostaimune contra um rotavírus o qual não é G1P[8].

4. O uso de acordo com 1 a 3 em que uma resposta imune éadicionalmente induzida contra infecção por rotavírus por um tipo G1P[8].

5. O uso de acordo com 1 a 4 em que a resposta imune éinduzida contra dois ou mais sorotipos de rotavírus, esses sorotipos sendodefinidos através de referência aos tipos G ou P.

6. O uso de acordo com 1 a 5 em que o sorotipo da cepa devacina é um sorotipo Gl e o sorotipo não-Gl é selecionado da listaconsistindo de: G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G10, Gl 1 , G12, G13 e G14.

7. O uso de acordo com 6 em que uma resposta imune éinduzida contra o tipo Gl e o tipo G2.

8. O uso de acordo com qualquer um de 1 a 5 em que o tipo decepa da vacina é um tipo P [8] e o tipo não-P[8] é selecionado da listaconsistindo de: os tipos P[l], P[2], P[3], P[4], P[5], P[6], P[7], P[9] e P[11],

9. Uso de acordo com 8 em que uma resposta imune é induzidacontra os tipos P[8] e P[4].

10. Uso de acordo com qualquer um de 1 a 9 em que acomposição compreende um rotavírus tendo um gene VP4 compreendendo,na seqüência de nucleotídeo, pelo menos um dos seguintes: uma base adenina(A) na posição 788, uma base adenina (A) na posição 802 e uma base timina(T) na posição 501 a partir do códon inicial.

11. Uso de acordo com 10 em que o gene VP4 compreendeuma seqüência de nucleotídeo compreendendo uma base adenina (A) emposições 788 e 802 e uma base timina (T) na posição 501 a partir do códoninicial.

12. Uso de acordo com 11 em que a composição compreendeum rotavírus tendo um gene VP7 compreendendo, na seqüência denucleotídeo, pelo menos um dos seguintes: uma timina (T) na posição 605,uma adenina (A) na posição 897 e uma guanina (G) na posição 897 a partir docódon inicial.

13. Uso de acordo com 12 em que o gene VP7 compreendeuma seqüência de nucleotídeo compreendendo uma timina (T) na posição 605e uma adenina aA) ou uma guanina (G) na posição 897 a partir do códoninicial.

14. Uso de acordo com qualquer um de 1 a 13 em que acomposição compreende um rotavírus tendo um gene VP4 compreendendo,na seqüência de nucleotídeo, uma adenina (A) nas posições 788 e 802 e umatimina (T) na posição 501 a partir do códon inicial; e em que o gene VP7compreende, na seqüência de nucleotídeo, uma timina (T) na posição 605 euma adenina (A) na posição 897 a partir do códon inicial.

15. Uso de acordo com qualquer um de 1 a 14 em que acomposição é capaz de reduzir ou proteger contra gastrenterite e/ou diarréiacausada por infecção por um rotavírus de um tipo diferente através dereferência ao tipo G e/ou P do rotavírus atenuado presente na composição.

16. Uso de acordo com 15 em que a composição é pelo menos40% protetora em uma população de indivíduos vacinados contra gastrenteritegrave causada por infecção por rotavírus de pelo menos duas cepas definidasatravés de referência ao tipo G e/ou P, esses tipos sendo diferentes do tipoG1P[8] do rotavírus atenuado presente na composição.

17. Uso de acordo com 16 em que a gastrenterite grave écausada por infecção por um rotavírus de pelo menos três, pelo menos quatrosorotipos não-Gl.

18. Uso de acordo com 17 em que os sorotipos não-Gl sãoqualquer um dos sorotipos G2, G3, G4 e G9.

19. Uso de acordo com 18 em que a gastrenterite grave écausada por infecção por um rotavírus de pelo menos dois tipos não-P[8].

20. Uso de acordo com 9 em que a gastrenterite grave écausada por infecção por um rotavírus do tipo P [4].

21. Uso de acordo com qualquer um de 1 a 20 em que a cepade rotavírus é o depósito 99081301 na ECACC ou é obtenível ou derivado dodepósito 99081301 na ECACC.

22. Uso de acordo com qualquer um de 1 a 20 em que a vacinaé usada em um regime de 2 doses.

Em um aspecto, a invenção também se refere a um método deindução de uma resposta imune contra infecção por rotavírus a partir de umacepa de rotavírus, o método compreendendo administração, a um indivíduo,de uma composição compreendendo uma vacina de rotavírus atenuado deuma cepa diferente. Especificamente, a invenção se refere a um método paraindução de uma resposta imune contra rotavírus de um tipo P e/ou paraprevenção de doença associada à infecção por rotavírus de um tipo Ρ, oreferido método compreendendo administração, a um paciente que precisa domesmo, de uma população de rotavírus atenuado de um tipo P diferente.

Em um aspecto específico da invenção, é proporcionado ummétodo de indução de uma resposta imune a um tipo de rotavírus P[8] e pelomenos um dos tipos não-P[8] selecionado do grupo consistindo de: os tiposP[l], P[2], P[3], P[4], P[5], P[6], P[7], P[9], P[ll], P[12] , P[14] e P[19],adequadamente ao tipo de rotavírus P [4], o método compreendendoadministração, a um indivíduo, de uma composição compreendendo umavacina do tipo P[8] de rotavírus.

Em outro aspecto da invenção, é proporcionada i) umaseqüência de proteína 4 não estrutural isolada (NSP4) conforme apresentadona Figura 5 (SEQ ID NO: 7) ou um fragmento imunogênico da mesma; ii)uma seqüência de polinucleotídeo isolada a qual compreende uma seqüênciade ácido nucleico que codifica o referido polipeptídeo de NSP4 ou fragmentoimunogênico da mesma; iii) uma seqüência de polinucleotídeo isolada a qualcompreende uma seqüência de ácido nucleico conforme apresentado naFigura 6 (SEQ ID NO: 8).

Em ainda outro aspecto da invenção, é proporcionada: i) umaseqüência de proteína 6 (VP6) de rotavírus isolada conforme apresentado naFigura 7 (SEQ ID NO: 9) ou fragmento imunogênico da mesma; ii) umaseqüência de polinucleotídeo isolada a qual compreende uma seqüência deácido nucleico que codifica o referido polipeptídeo de VP6 ou fragmentoimunogênico da mesma; iii) uma seqüência de polinucleotídeo isolada a qualcompreende uma seqüência de ácido nucleico conforme apresentado naFigura 8 (SEQ ID NO: 10).

Fragmentos imunogênicos podem ser definidos no contexto dapresente invenção como fragmentos que, quando administrados em uma doseeficaz (sozinha ou como um hapteno ligado a um carreador), estimula umaresposta imune protetora contra infecção por rotavírus.Os exemplos não limitativos a seguir ilustram a invenção.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Demonstração da cepa 89-12 na passagem 26(P26) é uma mistura de variantes

Seqüenciamento de genes VP4 e VP7 de diferentes lotes depassagem

Seqüenciamento dos genes VP4 e VP7 da passagem P26(células AGMK primárias), passagem P33 (linhagem de células AGMKestabelecida (em oposição à primária)), passagem P41 e passagem P43 foirealizado. Extração de RNA total foi feita através de transcrição reversa eamplificado através de PCR em um tubo/uma etapa.

Iniciadores Rota 5bis e Rota 29bis amplificaram o gene VP4inteiro e iniciadores Rota 1 e Rota 2bis amplificaram o gene VP7 inteiro. Omaterial de PCR foi seqüenciado usando diferentes iniciadores (veja Tabela 1).

A seqüência da passagem P26 diferia da seqüência dapassagem P33 por 3 bases (nas posições 501, 788 e 802 bp a partir do códoninicial) em VP4 e por três bases em VP7 (108, 605 e 897 bp a partir do códoninicial).

Varreduras de seqüência da passagem P26 de VP4 e VP7mostram, em posições com mutação, a presença da seqüência da passagemP33 como uma base. Assim, pode ser observado que a passagem P26 é umamistura de pelo menos 2 variantes.

As varreduras de seqüência da passagem P33 parecemhomogêneas em VP4 e heterogêneas para VP7 (veja Tabela 2).

A passagem P38 (derivada da passagem 33) foi passada 5vezes em células Vero e mostraram o mesmo conjunto de seqüências de VP4e VP7 que a passagem P33 (linhagem de células AGMK). Assim, não houveuma grande alteração nas populações entre P33 e P38.TABELA 1: Oligonucleotídeos usados para RT-PCR eseqüenciamento

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TABELA 2: Oligonucleotídeos usados em hibridização

<table>table see original document page 33</column></row><table>

As bases mostradas em negrito na Tabela 2 são os sítios devariação de seqüência específica em VP4 e VP7.

TABELA 3: Variação de seqüência dos genes VP4 e VP7

Tabela 3.1

<table>table see original document page 33</column></row><table>Ν.Β. Em um segundo clone de 3 clones os quais foramdesenvolvidos ao nível do lote de produção, o nucleotídeo na posição 897 bpda VP7 é G, ao invés de A, conforme no clone selecionado P43. Isso resultaem uma metionina em lugar de uma isoleucina na seqüência de aminoácido.Variantes correspondendo ao clone P43 selecionado e o clone no qual há umaG na 897 bp da VP7 a partir do códon inicial, foram excretadas nas fezes debebês que tinham sido vacinados com o material P33.

Na Tabela 3.1, onde existem duas bases alternativas em umaposição particular, a primeira das duas representa a base a qual aparece emuma população principal e a segunda é a base a qual aparece em umapopulação menor. Populações de variantes principal e menor são julgadaspela resistência do sinal em seqüenciamento.

Tabela 3.2

<table>table see original document page 34</column></row><table>

A Tabela 3.2 mostra as alterações de aminoácido resultantesdas diferenças de nucleotídeo entre as variantes.

TABELA 4

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Hibridização por slot blot

A alteração nas populações entre as passagens P26 e P33 sobrecélulas AGMK foi ainda confirmada através de hibridização por slot blot. Osfragmentos de gene VP4 e VP7 gerados através de RT/PCR foramhibridizados com sondas de oligonucleotídeo específicas para cada variante(veja Tabela 3.1 e 3.2). Em contraste a P26, a qual hibridizou com Rota 16,Rota 35 e Rota 36 e não com Rota 15, o fragmento de PCR de VP4 domaterial P33, nas posições 788 e 802, hibridizaram apenas com Rota 16 e nãocom Rota 15 ou Rota 35 ou Rota 36. Esses resultados estabeleceram apresença de pelo menos 3 variantes em P26 (veja Tabela 4).

Para o fragmento de PCR de VP7 do material P33, a posição897 hibridizou com Rota 41 e Rota 42. Esses resultados estabeleceram apresença de pelo menos duas variantes no material P33.

EXEMPLO 2: Isolamento e caracterização do clone P43

Para isolar componentes P33 como uma população viralhomogênea, três diluições de ponto final de P33/AGMK sobre células Veraforam realizadas e o vírus resultante foi usado para infectar células Vero.

Cavidades positivas foram selecionadas usando dois critérios:crescimento demonstrado pelo maior número de focos detectados nascavidades e as cavidades positivas mais isoladas sobre as lâminas, conforme éfeito classicamente. Após 3 passagens de diluição final em lâminas demicrotitulação com 96 cavidades, 10 cavidades positivas foram amplificadassucessivamente sobre células Vero e avaliadas com relação a seu rendimento.Baseado no rendimento, três clones foram desenvolvidos para nível depassagem de lote de produção. Imuno-reconhecimento por anticorpospoliclonais foi mostrado ser similar entre os três clones e entre os clones eP33. A homogeneidade dos clones foi avaliada através de hibridização de slotblot. A seleção final de um único clone foi baseada no rendimento eseqüência.

O clone selecionado foi amplificado através de sucessivaspassagens sobre células Vero para gerar uma semente Mestre, uma sementede Trabalho e finalmente lotes de produção. O clone selecionado foigeneticamente caracterizado em diferentes níveis de passagem através deseqüenciamento de VP4 e VP7 (identidade) e através de hibridização de slotblot específica da VP4 e VP7 (homogeneidade) dos materiais amplificadospor PCR. A seqüência dos genes VP4 e VP7 do material P43 são fornecidasnas Figuras 1 e 2, respectivamente, e são idênticas à P41.

A homogeneidade do clone selecionado foi avaliada através deuma hibridização seletiva usando sondas de oligonucleotídeo que discriminamalterações de nucleotídeo em regiões de VP4 e/ou VP7 para cada varianteidentificada durante seqüenciamento de P26/AGMK primária (veja Tabela 4).

O fragmento de VP4 hibridizou com Rota 16 e não com Rota15, Rota 35 ou Rota 36. O fragmento de VP7 hibridizou com Rota 41 e nãocom Rota 42.

Esses resultados confirmaram que P43 é uma populaçãohomogênea.

EXEMPLO 3: Remoção de vírus adventício potencial

Eter foi adicionado a P33 (AGMK crescida) até umaconcentração final de 20% durante 1 hora. O éter foi, então, borbulhado comN2 durante 35 min. Nenhum impacto sobre a titulação de semente P33 foiobservado.

EXEMPLO 4: Formulação de uma vacina atenuada viva

Os lotes de produção descritos acima são formulados paraadministração oral a bebês através do método a seguir.

1. Vírus liofilizado

Técnicas padrão são usadas para preparo de doses de vírus. Ovolume viral purificado congelado é descongelado e diluído com umacomposição de meio apropriada, nesse caso, Meio de Eagle Modificado deDulbecco, até uma concentração viral padrão desejada, nesse caso, IO62ffu/ml. O vírus diluído é, então, ainda diluído com estabilizante de liofilização(sacarose a 4%, dextrana a 8%, sorbitol a 6%, aminoácido a 4%) até atitulação viral alvo, nesse caso, IO56 ffu/dose. Alíquotas de 0,5 ml decomposição viral estabilizada são assepticamente transferidas para frascos de3 ml. Cada frasco é, então, parcialmente fechado com uma rolha de borracha,a amostra é liofilizada sob vácuo, o frasco é, então, totalmente fechado e umatampa de alumínio é presa no lugar em torno do frasco para manter a rolha nolugar.

Para uso, o vírus é reconstituído usando um dos seguintesreconstituintes anti-ácido:

(a) Reconstituinte de citrato

Citrato de sódio é dissolvido em água, esterilizado através defiltração e assepticamente transferido para recipientes reconstituintes emquantidades de 1,5 ml em uma concentração de 544 mg de Na3Citrato.2H20por dose de 1,5 ml. Os recipientes reconstituintes podem ser, por exemplo,frascos de 3 ml ou frascos de 4 ml ou seringas de 2 ml ou cápsulas de plásticomole apertáveis para administração oral. Como uma alternativa a manter oscomponentes estéreis sob condições estéreis, o recipiente final pode sersubmetido à autoclave.

(b) Reconstituinte de Al(OH)1

Uma suspensão de hidróxido de alumínio (Mylanta - marcacomercial) é assepticamente diluída em água estéril, assepticamentetransferida para recipientes reconstituintes (por exemplo, seringas de 2 ml oucápsulas de plástico mole apertáveis) em quantidades de 2 ml cada, contendo48 mg de Al(OH)3. Uma alternativa a usar componentes estéreis sobcondições estéreis é irradiar γ na suspensão de hidróxido de alumínio (depreferência em um estágio diluído).

Ingredientes padrão são incluídos para impedir a suspensão deassentar. Tais ingredientes padrão incluem, por exemplo, estearato demagnésio, carboximetil celulose, hidróxipropilmetil celulose, celulosemicrocristalina e polímeros de silicone.

Agentes bacteriostáticos, por exemplo, butilparabeno,propilparabeno ou outros agentes bacteriostáticos padrão usados em alimento,e flavorizantes, também podem ser incluídos.2. Vírus liofilizado com Al(OH)1 em formulação líquidaTécnicas padrão são usadas para preparo de doses de vírus. O

volume viral purificado congelado é descongelado e diluído com composiçãode meio apropriada, nesse caso, Meio de Eagle Modificado de Dulbecco, atéuma concentração viral padrão desejada, nesse caso, IO62 ffu/ml. Suspensãode hidróxido de alumínio é adicionada para atingir uma quantidade final de 48mg/dose e a composição viral é diluída com estabilizante de reconstituição(sacarose a 4%, dextrana a 8%, sorbitol a 6%, aminoácido a 4%) até atitulação viral alvo, nesse caso, IO56 ffu/dose. Alíquotas de 0,5 ml decomposição viral estabilizada são assepticamente transferidas para frascos de3 ml. Liofilização e fechamento dos frascos são, então, realizados conformedescrito na parte 1.

3. Vírus liofilizado com Al(OH)2 para apresentação em blisterTécnicas padrão são usadas para preparo de doses de vírus. O

volume viral purificado congelado é descongelado e diluído com composiçãode meio apropriada, nesse caso, Meio de Eagle Modificado de Dulbecco, atéuma concentração viral padrão desejada, nesse caso, IO62 ffu/ml. Suspensãode hidróxido de alumínio é adicionada para atingir uma quantidade final de 48mg/dose e a composição viral é diluída com estabilizante de reconstituição oqual pode ser sacarose, dextrana ou aminoácido a 4% ou gelatina ou peptonavegetal ou xantana até a titulação viral alvo, nesse caso, IO56 ffu/dose. Umaoperação de enchimento asséptico é empregada para transferir doses de 0,5 mlou, de preferência, menos, para cavidades de blister. A composição éliofilizada e as cavidades do blister são vedadas através de vedação térmica.

Opcionalmente, ingredientes padrão são incluídos para impedira suspensão de hidróxido de alumínio de assentar. Tais ingredientes padrãoincluem, por exemplo, estearato de magnésio, carboximetil celulose,hidróxipropilmetil celulose, celulose microcristalina e polímeros de silicone.Flavorizantes também podem ser incluídos.EXEMPLO 5: Titulação viral de rotavírus para várias formulacoes

5.1 Comparação entre formulações baseadas em lactose esacarose

Tabela 5

<table>table see original document page 39</column></row><table>

Rotavírus P43 foi formulado com sacarose ou com lactose,conforme mostrado na tabela acima.

Titulação viral antes de liofilização é a titulação viral nolíquido formulado completo (contendo sacarose, dextrana, sorbitol eaminoácidos) e sem a etapa de liofilização.

Bons resultados são aqueles nos quais uma diminuição <0,5Iog na etapa de liofilização e diminuição de <0,5 Iog durante a "1 semana a 370C" (teste de estabilidade acelerada) são obtidos. A precisão da titulação viralestá em torno de ± 0,2 log.

Os resultados indicam que sacarose pode ser usada ao invés delactose.

5.2: Efeito de arginina e substituição de sorbitol por maltitolTabela 6

<table>table see original document page 39</column></row><table>Os resultados demonstram que a adição de arginina (a qual éconhecida por melhorar a estabilidade do vírus durante liofilização e tambémproporciona um meio básico de forma a compensar a acidez do estômago)mantém a titulação viral.

Sorbitol tende a diminuir a temperatura de transição do vidro dobolo liofilizado até grande ponto. Isso pode ser superado usando maltitol ao invésde sorbitol, conforme mostrado acima e a titulação viral ainda é mantida.

5.3: Várias composições de formulação

Esse experimento demonstra que uma série de formulações sãopossíveis.

Tabela 7

<table>table see original document page 40</column></row><table>5.4: Associação entre rotavírus e antiácido AKOHh

Tabela 8

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Al(OH)3 é usado como um anti-ácido. Isso mostra que orotavírus está associado ao sal inorgânico insolúvel (Al(OH)3), uma vez queele é centrifugado junto com Al(OH)3 (diminuição de atividade viral nosobrenadante).

5.5: Dissolução de antiácido Al(OH)3 por citrato de sódioantes de titulação viral

Tabela 9

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Quando rotavírus está associado com Al(OH)3, é possívelliofilizar qualquer coisa (incluindo o Al(OH)3). Após liofilização, é possívelrecuperar o rotavírus através de dissolução de Al(OH)3 em citrato de sódio.

Essa etapa não danifica o rotavírus e retém sua atividade após essa etapa dedissolução.

5.6: Infectividade do rotavírus após liberação da associaçãoAl (OH)3-rotavírus

O mecanismo de liberação do vírus (através de dissolução docarreador) pode ocorrer muito bem in vivo. Na verdade, abaixo de um pH de6, o hidróxido de alumínio se torna completamente solúvel e, assim, orotavírus será liberado no estômago.

Al(OH)3 + 3 Hf —> Al+^ (solúvel em água) + 3 H2ONo estômago, íons de Al não são absorvidos ( J.J. Powell,R. Jugdaohsingh e RP. H. Thompson, The regulation of mineral adsorption inthe gastrointestinal track, Proceedings of the Nutrition Society (1999), 58,147-153).

No intestino, em virtude do aumento de pH, formas insolúveisde alumínio são precipitadas (Al(OH)3 ou AIPO4) e eliminadas através da vianatural.

Não se sabe se o precipitado de AI(OH)3 (ou AIPO4)recentemente formado será capaz de re-associar com o rotavírus livre. Isso fazsurgir a questão da infectividade da associação Al(OH)3-rotavírus em si.

Liberação de rotavírus da associação Al(OH)3-rotavírus poroutros mecanismos também é possível. Lisina, por exemplo, interfere com aadsorção viral sobre Al(OH)3. Outros ânions, tais como borato, sulfato,carbonato e fosfato são conhecidos por serem especificamente adsorvidosobre o hidróxido de alumínio, assim, teoricamente, seria possível deslocar(através de competição pelo sítio de adsorção) o rotavírus da associaçãoAl(OH)3-rotavírus.

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Assim, o rotavírus pode ser liberado da associação rotavírus-Al(OH)3 e o rotavírus liberado permanece ativo.

Essa liberação pode ser feita através de dissolução do Al(OH)3(pelo HCl no estômago ou através de Na3Citrato in vitro) ou através dedeslocamento do rotavírus por um aminoácido básico (Iisina).

5.7: Infectividade da associação AKOHVrotavírus

Uma única dose de rotavírus liofilizado foi reconstituída com águae dividida em duas partes. A primeira parte, considerada como referência, recebeuum volume adicional de água. A segunda parte recebeu 24 mg de Al(OH)3suspensos em 0,240 ml de água (titulações virais pré-clínicas).

<table>table see original document page 43</column></row><table>

Quando Al(OH)3 está presente, o rotavírus é ativo e o valor detitulação viral é maior comparado com a amostra de referência.

Esse experimento foi repetido sem dividir a dose liofilizada eatravés da adição de 12 mg de Al(OH)3 ou 24 mg de Al(OH)3.

Aqui, a amostra de referência era aquela reconstituída com umtampão de citrato-bicarbonato. Assim, a titulação viral é novamente maior napresença de Al(OH)3.

<table>table see original document page 43</column></row><table>

Conforme no exemplo acima, o rotavírus se associa com aspartículas de Al(OH)3, uma vez que o vírus pode ser descartado através decentrifugação. DRVC003A46 é um rotavírus formulado liofilizado (sacarose:2%; dextrana: 4%; sorbitol: 3%; aminoácidos: 2%).

<formula>formula see original document page 44</formula>

SDSAA = Sacarose a 2%, Dextrana a 4%, Sorbitol a 3%,Aminoácidos a 2%.

De acordo com a titulação viral realizada no sobrenadante, aquantidade de Al(OH)3 necessária para adsorver o rotavírus parece ser baixa(começando com uma dose liofilizada de 5,7 log) elevando até a titulação viral):

Tabela 10

<table>table see original document page 44</column></row><table>

O tempo necessário para adsorver o rotavírus sobre Al(OH)3parece ser curto: uma dose de rotavírus liofilizado foi reconstituída napresença de 24 mg de Al(OH)3 e centrifugada após 0, 15, 60 min e 24 horas.O "restante" foi ressuspenso em SDSAA antes de titulação viral:

Tabela 11

<table>table see original document page 45</column></row><table>

5.8: Usando CaCCh como antiácido

De forma a evitar alumínio na vacina, o antiácido Al(OH)3 foisubstituído por outro sal inorgânico insolúvel: CaCO3 (carbonato de cálcio).

Os fenômenos observado com CaCO3 são paralelos àquelesdescritos para Al(OH)3:

- associação de rotavírus com o sal inorgânico;

- manutenção de atividade de rotavírus quando associado como sal inorgânico;

- possibilidade de liberação de rotavírus da associação atravésde dissolução da base inorgânica por um ácido;

- possibilidade de co-liofilização do antiácido e o rotavírus.

Associação de CaCO3 e rotavírus

Em um primeiro experimento, rotavírus liofilizado (titulaçãoviral de 5,7) foi reconstituído com uma suspensão de CaC03 em água (50 mgem 1,5 ml); e, então, centrifugado e a titulação viral do sobrenadantecomparada com a pelota.

<table>table see original document page 45</column></row><table>Isso indica que mais de 90% do rotavírus estão associados aoCACO3.

Também, quando o vírus estava associado, foi possível realizara titulação e recuperar as quantidades virais originais. Também, as titulaçõesvirais são ligeiramente maiores do que aquelas obtidas sem CaCO3.

Quantidade de CaCO3 e associação de rotavírus

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Rotavírus liofilizado foi reconstituído com uma suspensão deCACOo3 em água (1,5 ml):

<table>table see original document page 46</column></row><table>

E, então, centrifugados e a titulação viral do sobrenadantecomparado com o restante.

TABELA 12

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Assim, claramente, mais caco3 e mais vírus estão associados emenos é encontrado no sobrenadante.

Contudo, a dose total não é completamente recuperada(esperado um total de 5,3 pelo menos ou mesmo 5,8 conforme obtidoanteriormente - veja acima).Proteção com CaCO3 de rotavírus durante titulação deantiácido de Rossett-Rice de bebês

Usando 10 doses de rotavírus liofilizado (DRVC003A46) e 50 mgde CaCO3, dois tipos de titulação de Rossett-Rice de bebês foram realizados:

Em uma titulação de Rossett-Rice clássica, o antiácido émisturado com rotavírus e HCl é entornado nesse meio.

Em Rossett-Rice "invertida", o antiácido é gotejado noreservatório de HCl (uma vez que ela ocorre in vivo).

Tabela 13

<table>table see original document page 47</column></row><table> Assim, nesse experimento in vitro, carbonato de cálcio é capazde proteger cerca de 20% do rotavírus da presença de hcl, enquanto quehidróxido de alumínio não é capaz.

5.9: Liofilização de rotavírus na presença de antiácido de CaCO3

Tabela 14

<table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table>

Isso é a liofilização "todas em uma" de rotavírus e antiácido(caco3) juntos no mesmo frasco, para impedir sedimentação de caco3 durantea etapa de enchimento, agentes viscosos são necessários, exemplos de taisagentes viscosos incluem goma xantana e amido, a atividade do rotavírus émantida mesmo na presença de goma xantana e amido.

5.10: Tabletes liofilizados para desintegração rápida quandocolocados na boca

As formulações a seguir demonstram o conceito "lioc". Isto é,dissolução rápida do bolo liofilizado na boca.Tabela 15

<table>table see original document page 49</column></row><table>

No conceito "lioc." xantana e amido podem ser usados(mantendo as propriedades de dissolução rápida do bolo liofilizado).

EXEMPLO 6: Uso de carbonato de cálcio como o antiácidopara composição de vacina contra rotavírus

Quando uma suspensão de CaCO3 em água é usada como oantiácido para rotavírus, há um problema de que as partículas decarbonato de cálcio sedimentam rapidamente quando colocadas em água,uma vez que o valor de densidade do pó se aproxima de 2,6 e o tamanhomédio de partícula é de 30 μηι. Essa sedimentação pode ser diminuídaatravés de:1. aumento da densidade do meio circundante

2. aumento da viscosidade do meio circundante

3. redução do tamanho de partícula

4. manter as partículas distantes umas das outras

6.1 Aumento de densidade do meio circundante

Quando a suspensão de CaC03-água (quando colocado naseringa) é colocada sobre o bolo liofilizado (contendo sacarose a 2%, dextranaa 4%, sorbitol a 3%, aminoácidos a 2%), a densidade do meio circundante éaumentada, mas a velocidade de sedimentação de CaCO3 não é muitodiferente da suspensão de CaCC>3-água.

6.2 Aumento da viscosidade do meio circundante

Excipientes pseudoplásticos

Uma solução pseudoplástica é definida como uma soluçãotendo maior viscosidade quando de descanso comparado com sua viscosidadesob agitação.

Excipientes usuais desse tipo são:

Polímeros naturais, por exemplo:Goma arábicaGoma tragacantoAgar-agar

AlginatosPectinas

Polímeros semi-sintéticos, por exemplo:

carbóximetilcelulose (Tyloses C®)metilcelulose (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH®eMB®)

hidróxipropil celulose (Klucels®)

hidróxipropilmetil celulose (Methocels E® e K®, ViscontransMPHC®)em geral, esses excipientes pseudoplásticos são usados juntocom agentes tixotrópicos.

Excipientes pseudoplásticos com baixa capacidade de fluxo

Esses polímeros, em uma concentração suficiente, dão origema uma disposição de fluido estrutural, resultando em uma solução de altaviscosidade tendo baixa capacidade de fluxo quando de descanso. Umadeterminada quantidade de energia precisa ser fornecida ao sistema parapermitir fluxo e transferência. Energias externas (agitação) são necessáriaspara destruir temporariamente a disposição de fluido estrutural de forma aobter uma solução fluida.

Exemplos de tais polímeros são Carbopols® e goma xantana.

Excipientes tixotrópicos

Com esses excipientes, quando de descanso, uma estrutura degel é obtida; enquanto que, sob agitação, uma solução fluida é obtida.

Exemplos de excipientes tixotrópicos são: Veegum® (silicatode magnésio-alumínio) e Avicel RC® (cerca de 89% de celulosemicrocristalina e 11% de carbóximetilcelulose de Na).

6.3 Redução do tamanho de partícula

Uma redução no tamanho de partícula do CaCO3 resultou emuma diminuição na capacidade anti-ácido do composto.

6.4 Manter as partículas distantes umas das outras

Esse é o caso em Veegum® e Avicel®, para os quaispartículas insolúveis menores (cerca de 1 μηι) do que as partículas deCaCO3 são colocadas entre partículas de CaCO3 de forma a impedir aagregação.

EXEMPLO 7: Design de produção

Os esquemas a seguir demonstram exemplos de possíveisconfigurações de produto.7.1 CaCO3 na seringa

<image>image see original document page 52</image>

Tendo já lotes clínicos de rotavírus em frascos liofilizados, oantiácido pode ser colocado no líquido reconstituinte contido na seringa.

Nessa apresentação de produto, sedimentação de CaCO3 deveestar sob controle não apenas durante as etapas de enchimento, mas tambémdurante a vida útil toda do produto (pelo menos 2 anos).

7.2 CACO, NO FRASCO LIOFILIZADO

<image>image see original document page 52</image>

7.3 Liofilização em um blister

NESSE CASO, ROTAVÍRUS, CACO3 E XANTANA SÃOLIOFILIZADOS JUNTOS DIRETAMENTE NO BLISTER.EXEMPLO 8: Liofilização de diferentes cepas de rotavírus

Tabela 16

<table>table see original document page 53</column></row><table>

As cepas DS-1, P e VA70 são descritas como cepas dereferência de rotavírus humano para sorotipos G2, G3 e G3, respectivamente,na página 1361 de "Fields", Raven Press 1990, Segunda Edição.

Nesse experimento, diferentes cepas de rotavírus foramliofilizadas.

Para todas, a titulação viral foi mantida durante liofilização eestabilidade acelerada (uma semana a 37 0C) foi mostrada.

EXEMPLO 9: Estudo de segurança de fase I em adultos emuma administração oral da vacina de rotavírus

um estudo de fase i foi realizado para avaliar a segurança ereatogenicidade de uma única dose oral de IO60 ffu da vacina p43 em adultossaudáveis com idade de 18 a 45 anos. o experimento clínico era duplamentecego e aleatório, ele foi placebo-controlado e auto-contido. o estudo foirealizado em um único centro na Bélgica.

9.1. População de estudo

Um total de 33 indivíduos, 11 no grupo com placebo e 22 nogrupo com vacina, foi arrolado e todos completaram o estudo. Todos osvoluntários eram caucasianos. Sua idade média no momento de vacinação erade 35,3 anos, com uma faixa de 18 a 44 anos. O experimento começou emJaneiro e durou apenas um mês.

9.2 Material

Vacina

Lotes clínicos de vacina P43 foram produzidos, purificados,formulados e liofilizados de acordo com as Boas Práticas de Fabricação. Oslotes foram liberados pelo Controle de Qualidade e Garantia de Qualidade.

Cada frasco de vacina continha os seguintes componentes:

Ingrediente ativo:Cepa P43min. 105'8ffuExcipientes, estabilizantes:Sacarose9 mgDextrana 18 mg

Sorbitol 13,5 gAminoácidos 9 mgPlacebo

Frascos de placebo foram preparados e liberados. Cada frascode placebo continha os seguintes componentes:

Excipientes, estabilizantes:Sacarose9 mgDextranal 8 mgSorbitol 13,5 gAminoácidos 9 mg

Diluente

Água para injeção foi usada como diluente para reconstituir avacina e o placebo.

9.3 Administração

Aproximadamente 10 a 15 minutos antes de administração davacina ou placebo, a indivíduos de ambos os grupos foram fornecidos 10 mlde Mylanta® oralmente. Mylanta® é um antiácido registrado. O antiácidoaumenta o pH do estômago e impede inativação do rotavírus durante suapassagem através do estômago.

Para preparar a vacina, dois frascos de P43 liofilizadocontendo 10^58 ffu por frasco foram reconstituídos com 1,5 ml de diluente,água para injeção. Isso obteve uma titulação viral calculada de IO61 ffu pordose. A vacina reconstituída foi administrada prontamente como uma únicadose oral.

Para preparar o placebo, dois frascos de placebo liofilizadoforam reconstituídos com 1,5 ml de água para injeção e administradosoralmente como uma única dose.

9.4 Segurança e Reatogenicidade

Os critérios a seguir de segurança e reatogenicidade seaplicam:

Sintomas gerais esperados eram febre, diarréia, vômito,náusea, dor abdominal e perda de apetite. Eles foram registrados durante oitodias pós-administração. Sintomas não esperados foram registrados durante 30dias pós-administração. Eventos adversos graves foram registrados durantetodo o período de estudo. Amostras de diarréia foram coletadas durante oitodias pós-administração.

Os resultados foram:

Nenhum sintoma esperado, nenhum não esperado e nenhumevento adverso grave foram reportados durante os respectivos períodos deobservação. Nenhum caso de diarréia foi reportado.

9.5 Conclusões

a vacina p43 da sb biologicals era segura com relação aoplacebo quando administrada oralmente de um modo duplamente cego comouma única dose na dose de 1061 ffu a voluntários adultos saudáveis comidade de 18 a 44.

EXEMPLO 10 - Eficácia de duas doses de uma vacinamono valente contra rotavírus humano contendo RIX4414 na prevenção degastrenterite em virtude de rotavírus Gl e não-Gl (G9)

10.1 Métodos

Um experimento duplamente cego, aleatório, placebo-controlado, de fase II foi conduzido na America Latina para avaliar a eficáciaprotetora de uma vacina (cepa de rotavírus humano RIX4414) derivada dacepa humana de G1P[8] humana 89-12 para imunização de bebês. A vacinaRIX4414 compreende um componente de rotavírus da cepa humana G1P[8]atenuada depositada como depósito 99081301 na ECACC (WO 01/12797).

Composição de vacina (Tabela 17)

A vacina contra HRV ou placebo foi preparado paraadministração através de injeção do conteúdo todo de uma seringa pre-enchida contendo o tampão de carbonato de cálcio no frasco do produtoliofilizado (vacina ou placebo). O frasco foi sacudido para ressuspender avacina/placebo. O volume todo do produto ressuspenso foi extraído na mesmaseringa, a agulha descartada e o produto ressuspenso administradoprontamente como uma única dose oral (aproximadamente 1,0 ml).Tabela 17 - Composição de vacina contra rotavírus RIX4414

<table>table see original document page 57</column></row><table>

Administração de vacinabebês saudáveis (493) receberam duas doses da vacina derotavírus rix4414 em uma concentração viral de 10 5'8 ffu por dose ou placebo(504) na idade de 2 e 4 meses, concomitantemente com as vacinas dtpw-hbv ehib. três doses de opv (vacina oral contra pólio vírus) foram fornecidas 2semanas após a vacina de estudo, isto é, não foram administradas durante operíodo começando 2 semanas antes de cada dose da vacina de estudo eterminando 2 semanas depois, dois outros grupos receberam 2 doses da vacinade rotavírus rix4414 em diferentes concentrações virais: 10 4'7 ffu e 10 5,2 ffu.amostras de diarréia foram testadas com relação à presença de rotavírus(elisa) e os sorotipos determinados em amostras positivas (rt-pcr). episódiosde diarréia reportados a partir de duas semanas após a segunda dose foramconsiderados para a análise de eficácia, a gravidade foi determinada usandouma escala de 20 pontos (ruuska e vesikari, 1990). o sistema de classificaçãode 20 pontos usado para avaliar a gravidade de cada episodio de diarréia nesseestudo é mostrado abaixo na tabela 18. um escore >11 definia doença grave.TABELA 18

<table>table see original document page 58</column></row><table>

*A maior temperatura registrada durante o episodio foiclassificada.

10.2. Resultados

Uma análise ínterim de eficácia foi realizada sobre o grupoacima mencionado e os sorotipos isolados eram principalmente Gl e G9,quase que uniformemente distribuídos. A taxa global de ataque no grupo complacebo variava de 4,8% para Gl e 3,6% para G9 durante o período deobservação de 6 meses. Duas doses de vacina contra rotavírus RIX4414 a 105,8 ffu protegeram contra todos os tipos de diarréia causada por Gl com 83%de eficácia [95% Cl: 50,4-95,7] e eficácia de 92,1% [95% Cl: 47,6-99,8]contra gastrenterite grave. Se a diarréia foi causada por G9, a proteção contratodos os tipos de diarréia foi de 60,2% [95% Cl: 0,2- 86,0] e 80,8% [95% Cl:33,0-96,4] contra gastrenterite grave. Para cada um desses pontos finais deeficácia (qualquer e grave para Gl e G9), houve uma diminuiçãoestatisticamente significativa nos episódios de diarréia no grupo com HRVquando comparado com o grupo com placebo (P < 0,05, teste exato de Fishercom dois parâmetros).

Os resultados obtidos nos outros 2 grupos com vacina(diferente concentração de rotavírus) são consistentes com aqueles reportadosno exemplo e são apresentados na análise final (exemplo 11). os dados deeficácia para g2, g3 e g4 também foram analisados, nenhuma conclusão apartir desse estudo foi extraída sobre a proteção cruzada contra g2, g3 e g4,uma vez que poucos casos foram reportados, contudo, dados de eficáciacontra g2, g3 e g4 são apresentados na análise final sobre um tamanho deamostra mais importante (exemplo 11).

10.3. Conclusão

Esses resultados sustentam a eficácia de 2 doses de uma vacinacontra HRV monovalente, vacina de rotavírus RIX4414, na proteção de bebêsnovos contra cepa Gl e proteção cruzada contra a cepa G9.

EXEMPLO 11 - Eficácia de duas doses de uma vacina contrarotavírus monovalente humana, contendo a cepa RIX4414, administrada emtrês concentrações de vírus diferentes na prevenção de gastrenterite emvirtude de rotavírus Gl e não-Gl (G2, G3, G4, G9)

11.1. Métodos

Um experimento de fase II placebo-controlado, duplamentecego, aleatório, foi conduzido na América Latina para avaliar a eficáciaprotetora e eficácia contra hospitalização de uma vacina derivada da cepahumana G1P[8] 89-12 para imunização de bebês. Especificamente, a vacinausada foi denominada vacina contra rotavírus RIX4414 e compreende, comoo componente de rotavírus, a cepa humana Gl atenuada depositada comodepósito 99081301 naECACC.

Bebês saudáveis receberam duas doses de vacina de rotavírusRIX4414 em três concentrações diferentes de vírus. O grupo para análise deeficácia consistia de 1846 indivíduos (468 indivíduos no grupo com vacinacontra HRV a 10^4'7 ffu, 460 indivíduos no grupo com vacina contra HRV a10^5'2 ffu, 464 indivíduos no grupo com vacina contra HRV a 10 5'8 ffu e 454indivíduos no grupo com placebo na idade de 2 e 4 meses,concomitantemente com vacinas DTPw-HBV e Hib). As três doses de OPVforam fornecidas 2 semanas após a vacina de estudo, isto é, não foramadministradas durante o período começando 2 semanas antes de cada dose davacina de estudo e terminando 2 semanas depois. Amostras de diarréia foramtestadas com relação à presença de rotavírus (ELISA) e os sorotiposdeterminados em amostras positivas (RT-PCR). Episódios de diarréiareportados a partir de duas semanas após a segunda dose até que os indivíduosestivessem com um ano de idade foram considerados para a análise deeficácia. A gravidade foi determinada usando uma escala de 20 pontos(Ruuska e Vesikari, 1990). Um escore : 11 definia doença grave (vejaExemplo 10 para a descrição do sistema de classificação de 20 pontos).

11.2. Resultados

Resultados os quais são a análise final dos dados mencionadosno Exemplo 10 são ilustrados nas tabelas abaixo. Bebês nos grupos comvacina tinha significativamente menos episódios de gastrenterite do quecrianças no grupo com placebo (p < 0,001, teste exato de Fisher com doisparâmetros) (Tabela 19). Dependendo da dosagem, a eficácia protetora contragastrenterite grave por rotavírus atingiu 85,6% (95% Cl: 63,0%-95,6%) e70% (95% Cl, 45,7%-84,4%) contra qualquer gastrenterite por rotavírus(Tabela 20). Para cada um desses pontos finais de eficácia, havia umadiminuição estatisticamente significativa em episódios de diarréia no grupocom HRV quando comparado com o grupo com placebo (p < 0,001, testeexato de Fisher com dois parâmetros). Múltiplos sorotipos de rotavírus (Gl,G2, G3, G4 e G9) foram identificados a partir de fezes com gastrenterite(ELISA e RT-PCR) permitindo também calcular a eficácia da vacina contrasorotipos não-Gl. Conforme pode ser observado a partir da Tabela 21 emparticular, para sorotipos não-Gl (G2, G3, G4 e G9) e, dependendo dadosagem, a eficácia contra gastrenterite grave por rotavírus atingiu 82,7%(95% Cl: 40,3%-96,8%), proporcionando uma prova do conceito de que avacina contra rotavírus humano Gl PlA P[8] baseada em Gl monovalenteestimula proteção cruzada contra cepas heterotípicas (isto é, não-Gl e não- P[8]).

Tabela 19: características de episódios de gastrenterite porrotavírus reportados durante o estudo

<table>table see original document page 61</column></row><table>Tabela 20: Eficácia protetora de duas doses de vacina derotavírus humano RIX4414 contra gastrenterite por rotavírus

<table>table see original document page 62</column></row><table>

*p<0,001 para cada comparação entre os grupos com vacina e placebo atravésde Teste exato de Fisher com dois parâmetros (nível significativo de α =0,05).

ρ = 0,037 para a comparação entre os grupos com vacina e placebo atravésde Teste exato de Fisher com dois parâmetros (nível significativo de α =0,05).

Jp = 0,007 para a comparação entre os grupos com vacina e placebo atravésde Teste exato de Fisher com dois parâmetros (nível significativo de α =0,05).

N = número de indivíduos

n/% = número/percentual de indivíduos que reportaram pelo menos umepisódio de gastrenterite por rotavírus especificadoIntervalos de confiança de 95% exatos são mostrados.Tabela 21 - Eficácia protetora de duas doses de vacina derotavírus humano RIX4414 contra gastrenterite grave por rotavírus sorotipo-específica

<table>table see original document page 63</column></row><table>

*Teste exato de Fisher com dois parâmetros (nível significativo de α = 0,05)usado para cada comparação entre os grupos com vacina e placebo.

N = número de indivíduos

n/% = número/percentual de indivíduos que reportaram pelo menos umepisódio de gastrenterite grave por rotavírus especificadoIntervalos de confiança de 95% exatos são mostrados.

11.3. Conclusão

Esses resultados sustentam a eficácia de 2 doses de uma vacinacontra HRV mono valente contendo RIX4414 na proteção de bebês novoscontra qualquer gastrenterite e gastrenterite grave por rotavírus causada pelacepa Gl e ampla proteção cruzada contra outros tipos G de RV, isto é, G2,G3, G4 e G9.

EXEMPLO 12 - Duas doses da vacina contra rotavírusatenuado humana RIX4414 mostra proteção heterotípica na América Latina eEuropa

A eficácia de uma vacina de rotavírus humano (RV) G1P[8]atenuada viva em 2 doses orais contendo a cepa RIX4414 foi analisada emexperimentos clínicos de fase II/III em bebês na Finlândia e América Latina.A vacina contra rotavírus RIX4414 compreende, como o componente derotavírus, a cepa humana Gl atenuada depositada como depósito 99081301 naECACC.

12.1. Métodos

Parte dos resultados do Exemplo 12 já foi apresentada nosExemplos 10 e 11. Os dados foram agrupados a partir de estudos de Fase II,um na Finlândia e um na América Latina (Brasil, México e Venezuela)(Exemplos 10 e 11) e de um estudo de Fase III em 11 países da AméricaLatina (Exemplo 13) usando a mesma metodologia e critérios de eficácia. Nototal, 20081 bebês saudáveis (grupo para eficácia) vacinados com 2 doses devacina RIX4414 ou placebo em 2 e 4 meses de idade foram acompanhadosaté um ano de idade com relação à gastrenterite grave (GE) com um escore naescala de gravidade de Vesikari (Ruuska T e colaboradores. Scand. J. Infect.Dis. 1990, 22, 259-267) >11. Amostras de GE foram testadas com relação aorotavírus (através de ELISA) e tipificadas através de RT-PCR.

Uma meta análise foi conduzida sobre os três estudosmencionados. A eficácia agrupada para GE grave por RV (definida como umescore de gravidade de Vesikari >11) foi calculada a partir de 2 semanas pós-dose 2 a 1 ano de idade (ajuste para o efeito do estudo usando a aproximaçãode Mantel-Haenszel).

12.2. Resultados

No grupo para eficácia, 5 episódios graves de GE por rotavírusdo tipo G2P[4] com um escore de Vesikari >11 foram detectados no grupocom vacina e 13 episódios no grupo com placebo. A eficácia da vacina contrao tipo G2P[4] foi de 67,2% (95% Cl: 14,8; 87,1) a qual mostra que, além deproteção contra cepas homotípicas (G1P[8], G3P[8] e G4P[8]), a vacinaRIX4414 protege contra GE grave por rotavírus causada pela cepa não-P[8]não-Gl G2P[4] heterotípica.

Eficácia tipo-específica através dos diferentes estudos éfornecida abaixo (Tabela 22).

Tabela 22

<table>table see original document page 65</column></row><table>

*VE ajustada para efeito do estudo usando a aproximação de Mantel-Haenszel

Apenas 3 casos G4 ocorrem em todos os 3 experimentos, 1 nos recipientes davacina e 2 no placebo.

12.3. Conclusão

Essa análise mostra que, além de proporcionar um alto nível deproteção contra cepas de rotavírus Gl homólogas (as quais têm duas proteínasde capsídeo externas (VP4 e VP7) e uma proteína de capsídeo interna (VP6)antigenicamente similares à vacina), a vacina RIX4414 também é altamenteprotetora contra outras cepas as quais têm um tipo G diferente (por exemplo,G3, G9), um tipo P diferente (por exemplo, P[4]) ou um tipo G e um tipo Pdiferentes, conforme ilustrado pela eficácia contra G2P[4].

EXEMPLO 13 - Meta análise mostrando que duas doses davacina de rotavírus atenuado humana RIX4414 mostra proteção heterotípica

Uma vez que mais dados se tornaram disponíveis do estudoem Singapura e na Europa (Exemplo 15), uma meta análise adicional foirealizada para incluir esses estudos, além dos estudos mencionados noExemplo 12.

13.1. Métodos

Três estudos de fase II (Finlândia e América Latina eSingapura) e dois estudos de fase III (América Latina e Europa) foramincluídos na meta-análise. Duas doses orais foram administradas de acordocom um esquema de 0,1 a 2 meses a bebês saudáveis que tinham 6-14semanas de idade na Dose 1. Em todos os estudos, GE grave por RV foidefinida como um escore >11 na escala de Vesikari de 20 pontos. Amostrasde diarréia foram analisadas com relação à presença de RV através de ELISAe tipificadas através do método baseado em RT-PCR. A eficácia contraqualquer GE por RV foi avaliada nos três estudos de fase II e no estudo naEuropa de fase III apenas; no estudo de fase III na América Latina, apenas GEgrave por RV foi registrada.

A VE e seu 95% CI foram estimados com 1-taxa de GE porRV com relação ao placebo usando a proporção de taxa de Envenenamentoexata estratificada pelo estudo (Proc StatXact4 for SAS Users, 1999, CytelSoftware Corporation, Exact Confidence Interval for Common Relative Risk,página 298).

13.2. Resultados

Em um total de 8221 bebês vacinados com duas doses deRIX4414 ou placebo, 4 episódios de qualquer GE por RV G2P[4] foramdetectados no grupo com RIX4414 (N = 5783) e 9 episódios no grupo complacebo (N = 2438), indicando uma VE de 81,0% (95% Cl: 31,6; 95,8) contraGE por RV de qualquer gravidade em virtude da cepa G2P[4].

Em um total de 26088 bebês saudáveis vacinados com duasdoses de RIX4414 ou placebo, 6 episódios de GE grave por RV em virtude dotipo G2P[4] foram detectados no grupo com RIX4414 (N = 14792) e 15episódios no grupo com placebo (N = 11296), indicando uma VE de 71,4%(95% Cl: 20,1; 91,1) contra GE grave por RV em virtude da cepa G2P[4]. Osresultados são reportados na Tabela 23.Tabela 23 - Numero de indivíduos que reportaram qualquerepisodio de GE ou GE grave por RV causada pelo tipo G2P[4] de RV epercentual de eficácia da vacina durante o primeiro período de eficácia -(meta análise), grupo para eficácia

Tabela 23

<table>table see original document page 67</column></row><table>

N = número de indivíduos incluídos em cada grupo;

n% = número/percentual de indivíduos que reportaram pelo menos umepisódio de GE por RV G2P[4] especificado em cada grupo;% VE = eficácia observada da vacina,95%CI = Intervalos de Confiança de 95%*Dois de 13 G2 não foram tipificados P

13.3. Conclusão

Essa meta análise sobre a eficácia da vacina contra o tipoG2P[4] de RV mostra uma eficácia da vacina de 81,0% (95% Cl: 31,6%;95,8%) contra qualquer GE por RV em virtude do tipo G2P[4] e uma eficáciada vacina de 71,4% (95% Cl: 20,1%; 91,1%) contra GE grave por RV emvirtude do tipo G2P[4].

EXEMPLO 14 - Eficácia da vacina contra rotavírus atenuadohumana Rotarix™ em um experimento de fase III em múltiplos países

14.1 Métodos

20169 bebês saudáveis de 11 países na América Latinareceberam duas doses orais de vacina contra HRV (10159) ou placebo(10010) a aproximadamente 2 e 4 meses de idade. Amostras de fezes foramtestadas com relação ao rotavírus (RV) através de ELISA e tipificadas atravésde RT-PCR usando iniciadores e sondas tipo-específlcas adequados. Adefinição de caso clínico para captura de episodio de gastrenterite grave foium episodio de diarréia (passagem de três ou mais fezes mais moles do que onormal ou aquosas dentro de 24 horas) com ou sem vômito que requeriahospitalização durante a noite e/ou terapia de reidratação equivalente ao planoB da OMS (terapia de reidratação oral) ou plano C da OMS (terapia dereidratação intravenosa) em uma unidade médica, tal como hospital, clínicaou centro de assistência a saúde rural supervisionado(http://www.who.int/criilcl-adolescent-

healtri/N e wPub 1 i cations/CHILDHE ALTH/textre v4. htm). A gravidade dadoença foi graduada usando a escala de Vesikari de 20 pontos; GE por RVgrave foi definida como um escore >11.0 escore de Vesikari foi modificado:uma vez que a desidratação não foi registrada no eCRF, a seguinte norma foiaplicada: um indivíduo que tinha um episodio grave de GE foi consideradocomo estando desidratado entre 1 a 5% se esse indivíduo recebeu reidrataçãooral. Um indivíduo foi considerado como estando desidratado > 6% se oindivíduo foi hospitalizado e/ou recebeu reidratação intravenosa (IV).

14.2. Eficácia da vacina

Eficácia da vacina contra gastrenterite grave por rotavírus(Tabela 24)

O grupo para eficácia consistia de 9009 indivíduos vacinadoscom vacina contra HRV e 8858 indivíduos que receberam um recipiente deplacebo. Havia 12 crianças com gastrenterite grave por rotavírus de acordocom a definição clínica no grupo com vacina e 77 no grupo com placebo (2,0vs. 13,3 crianças com >1 episodio por 1.000 crianças-ano, respectivamente; ρ< 0,001, teste exato de Fisher com dois parâmetros), resultando em umaeficácia da vacina d 84,7% contra gastrenterite grave por rotavírus de 15 diaspós-dose 2 até um ano de idade (mostrado na Tabela 24). Resultados similaresforam obtidos com o grupo total vacinado (eficácia da vacina de 81,1%; 95 %C.I. de 68,5-89,3; p< 0,001, teste exato de Fisher com dois parâmetros) dadose 1 até um ano de idade. Hospitalização durante pelo menos uma noite foirequerida em 9 crianças no grupo com vacina e 59 no grupo com placebo (1,5vs. 10,2 hospitalizações por 1.000 crianças-ano, respectivamente) para umaeficácia da vacina contra hospitalização para gastrenterite grave por rotavírusde 85% (p< 0,001, teste exato de Fisher com dois parâmetros) (Tabela 24).

Tabela 24 - Eficácia da vacina contra gastrenterite grave porrotavírus, gastrenterite grave tipos G de rotavírus-específica e gastrenteritegrave de todas as causas, durante o período de duas semanas apos a dose 2 atéum ano de idade

<table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table>

Legenda da Tabela 24:

Participantes com episódios de mais de um tipo G isolado foramcomputados em cada uma das categorias de tipo de rotavírus detectados.

η = número de bebês que reportaram pelo menos um episodioespecificado

RR = Risco Relativo = proporção da taxa de incidência deindivíduos que reportaram pelo menos um episódio no grupo com vacina comrelação à taxa de incidência de indivíduos que reportaram pelo menos umepisódio no grupo com placebo.

CI = intervalo de confiança

A proporção de 1000 bebês-ano é o número de bebêsapresentado >1 episodio especificado por bebê-ano.

* Definição de caso de acordo com o protocolo de estudo: umepisodio de diarréia passagem de três ou mais fezes mais moles do que onormal ou aquosas dentro de um dia) com ou sem vômito que requeriahospitalização durante a noite e/ou terapia de reidratação equivalente ao planoB da OMS (terapia de reidratação oral) ou plano C da OMS (terapia dereidratação intravenosa) em uma unidade médica, tal como hospital, clínicaou centro de saúde rural supervisionado.#Todos os tipos Gl isolados eram rotavírus do tipo silvestre;G1P[8] e G9P[8] foram isolados de um bebê.

aTipo G1P[8] apenas foi isolado de 2 bebês; G1P[8] e G9P[8]foram isolados de um bebê;

bTipo G1P[8] foi isolado de 34 bebês; G1P[8] e G9P[8] foramisolados de um bebê; tipos Gl, G2, G9 foram isolados de um bebê;

cTipo G3P[8] apenas foi isolado de um bebê, tipo G4P[8]apenas de 1 bebê; e G9P[8] apenas de um bebê; G1P[8] e G9P[8] foramisolados de um bebê;

dTipo G3P[8] apenas foi isolado de 8 bebês, tipo G4P[8]apenas de 2 bebês; e G9P[8] apenas de 19 bebês; G1P[8] e G9P[8] foramisolados de 1 bebê; e G1P[8] e G2P[4] e G9P[8] de 1 bebê.

eG4P[8] apenas foi isolado de 9 bebês e G1P[8], G2P[4] eG9P[8] foram isolados de 1 bebê.

p-valores = teste exato de Fisher com dois parâmetros (nívelsignificativo de α = 0,05).

Eficácia da vacina de acordo com o escore de VesikariOnze de 12 crianças com episódios graves por rotavírus no grupocom vacina e 71 de 77 no grupo com placebo tinham um escore de Vesikari >11,resultando em uma eficácia da vacina de 84,7% P< 0,001, teste exato de Fisher comdois parâmetros). Para aumento de gravidade da doença com escores entre 11 e 20,a eficácia da vacina era ligeiramente maior, atingindo 100% contra gastrenteritemais grave por rotavírus. Um total de 16 episódios de gastrenterite grave porrotavírus com um escore de Vesikari >11 foi reportado da dose 1 até a dose 2, seisno grupo com vacina e 10 no grupo com placebo.

Eficácia da vacina de acordo com o escore de Vesikari por tipode rotavírus

A eficácia da vacina tipo-específica contra cepas do tiposilvestre é mostrada na Tabela 24. A eficácia da vacina contra episódiosgraves por rotavírus com um escore de Vesikari >11 causado por cepas dotipo G1P[8] homólogas à cepa da vacina, foi de 91,8% (P< 0,001, teste exatode Fisher com dois parâmetros). A eficácia da vacina contra cepascompartilhando o antígeno P[8] (G3P[8], G4P[8] e G9P[8]) foi de 86,9% (P<0,001, teste exato de Fisher com dois parâmetros). O tipo de rotavírus G1P[4],o qual não compartilha nem o antígeno G nem P com a cepa da vacina foidetectado em cinco episódios na vacina e nove no grupo com placebo,resultando em uma eficácia de 45 por cento (P = 0,298, teste exato de Fishercom dois parâmetros). Em virtude do pequeno número de episódios por G2observado nesse estudo, uma meta análise de 5 estudos (Exemplo 13) foirealizada e a tendência observada nesse estudo se tornou um valorsignificativo quando os resultados dos 5 estudos foram agrupados (Exemplo 13).

Eficácia da vacina sobre a carga de enfermidade por diarréia

Crianças com gastrenterite de qualquer causa requerendohospitalização e/ou reidratação de acordo com o plano B/C da OMS tinhamuma taxa de incidência de 30,9/1.000 crianças-ano na vacina comparado com51,7 no grupo com placebo, para uma redução total de 40% (P< 0,001, testeexato de Fisher com dois parâmetros) nos episódios de diarréia grave de todasas causas entre os recipientes da vacina. Da mesma forma, a hospitalizaçãopara diarréia de qualquer etiologia foi significativamente reduzida em 42%(P< 0,001, teste exato de Fisher com dois parâmetros) (Tabela 24, GE detodas as causas).

14.3. Sumário dos Resultados

A eficácia da vacina contra gastrenterite grave por rotavírus(GE por RV) e contra hospitalização rotavírus-associada foi de 85% (P <0,001, teste exato de Fisher com dois parâmetros), atingindo 100% em umapopulação tendo GE por RV com um escore de Vesikari >19. A eficáciacontra G1P[8] e cepas compartilhando apenas o epítopo P[8] com HRV foi de92% (95% C.I. de 74,98) e 87% (95% CL de 64,97) , respectivamente (P <0,001, teste exato de Fisher com dois parâmetros). Hospitalização paradiarréia de todas as causas foi reduzida em 42% (95% C.I. de 29,53; P<0,001, teste exato de Fisher com dois parâmetros).

Exemplo 15 - Eficácia de vacina de rotavírus atenuadohumano Rotarix™ em seis países da Europa

15.1. Métodos

3.994 crianças em seis países da Europa foram aleatoriamenteescolhidas para receber IO65 CdD50 de vacina contra HVR (rotavírushumano) Rotarix™ (veja composição) ou placebo quando co-administradacom vacinações de rotina em crianças. O primeiro período deacompanhamento de eficácia começou a partir de duas semanas após a Dose 2e terminou em Junho-Julho de 2005. Um total de 3874 indivíduos fazia partedo grupo de eficácia no 1° ano.

Composição de vacina: (Tabela 25)

<table>table see original document page 73</column></row><table>

15.2. Eficácia da Vacina

A vacina contra HRV era altamente eficaz na proteção contraGE por RV durante o primeiro período de eficácia. A eficácia da vacina foi de87.1% (95% CL 79,6%; 92,1%) contra quaisquer episódios de GE por RV e95.8% (95% CL 89,6%; 98,7%) contra episódios de GE por RV grave. Paraaumento de gravidade da doença (escores de Vesikari entre lie 20), aeficácia da vacina era crescentemente maior, atingindo 100% em umapopulação tendo GE por RV, com um escore de Vesikari >17 pontos. Aeficácia da vacina contra hospitalização para GE por RV era de 100% (95%Cl: 81,8%; 100%) e contra episódios de GE por RV requerendo atençãomédica foi de 91,8% (95% Cl: 84,0%; 96,3%) (Tabelas 26 e 27).

Tabela 26 - Percentual de indivíduos que reportaram qualquere GE por RV grave, percentual de indivíduos hospitalizados em virtude deepisódios de GE por RV e eficácia da vacina durante o primeiro período deeficácia — grupo para eficácia

<table>table see original document page 74</column></row><table>

N = número de indivíduos incluídos em cada grupo;

n% = número/percentual de indivíduos que reportaram pelo menos umepisódio de GE por RV requerendo atenção médica em cada grupo;valor P = teste exato de Fisher com dois parâmetros (nível significativo de α= 0,05);

% VE = eficácia observada da vacina,

95%CI = Intervalos de Confiança de 95%

Um escore >11 na escala de Vesikari de 20 pontos foi definido como grave.Tabela 27 - Percentual de indivíduos que reportaram episódiosde GE por RV requerendo atenção médica e eficácia da vacina durante oprimeiro período de eficácia - grupo para eficácia

<table>table see original document page 75</column></row><table>

N = número de indivíduos incluídos em cada grupo;

n% = número/percentual de indivíduos que reportaram pelo menos umepisódio de GE por RV requerendo atenção médica em cada grupo;valor P = teste exato de Fisher com dois parâmetros (nível significativo de α= 0,05);

% VE = eficácia observada da vacina,95%CI = Intervalos de Confiança de 95%

A vacina contra HRV era altamente protetora contra qualquere GE por RV grave causada pelas cepas G1P[8], G3P[8], G4P[8] e G9P[8](Tabela 13).

Proteção contra RV do tipo G1P[4] que não compartilhaqualquer um dos antígenos de capsídeo externo da vacina contra HRV eramenor nesse estudo; contudo, os resultados de uma meta análise levando emconta estudos de eficácia de fase II e III mostraram uma eficácia protetorasignificativa contra qualquer e GE grave em virtude de G1P[4] (veja Exemplo 13).Tabela 28 - Percentual de indivíduos que reportaramquaisquer episódios ou GE por RV grave e eficácia da vacina através dosorotipo durante o primeiro período de eficácia - grupo para eficácia

Tabela 28

<table>table see original document page 76</column></row><table>

N = número de indivíduos incluídos em cada grupo;

n% = número/percentual de indivíduos que reportaram pelo menos umepisódio de GE por RV em cada grupo;

valor P = teste exato de Fisher com dois parâmetros (nível significativo de α= 0,05);

% VE = eficácia observada da vacina,

95%CI = Intervalos de Confiança de 95%

Um escore >11 na escala de Vesikari de 20 pontos foi definido como grave

Um indivíduo do grupo com placebo foi computado nas categorias Gl eG4, uma vez que ambos os sorotipos foram isolados.

15.3. Sumário dos resultadosduas doses orais de vacina contra HRV Rotarix™, co-administrada com vacinações da infância, foram altamente eficazes durante oprimeiro período de eficácia comparado com o placebo na proteção de bebêscontra qualquer GE por RV causada por RV do tipo silvestre G1P[8] e portipos de RV não-GlP[8]; a eficácia da vacina foi de 95,6% (95% Cl: 87,9%;98,8%) e 79,3% (95% Cl: 64,6%; 88,4%), respectivamente. A eficácia contraGE por RV grave causada por RVs do tipo silvestre G1P[8] e por tipos de RVnão-GlP[8] é 96,4% (95% Cl: 85,7%; 99,6%) e 95,4% (95% Cl: 85,3%;99,1%), respectivamente. Esses resultados sustentam a conclusão de que avacina contra HRV proporciona boa cobertura contra as cepas de RV emcirculação (veja Tabela 28: G1P[8], G2 P[4], G3P[8], G4P[8], G9P[8]). Umameta análise sobre a eficácia da vacina contra G1P[4] foi especificamenterealizada, por favor refira-se ao Exemplo 13.

Conclusões globais

A vacina de rotavírus RIX4414 provou ser altamente protetoracontra episódios de gastrenterite por rotavírus medido através de umadefinição clínica para focalização de captura de caso quando de hospitalizaçãoe reidratação, bem como pela escala de Vesikari validada, a qual inclui surtosde morbidez quantificáveis relacionados à diarréia, vômito, febre,desidratação e hospitalização. Duas doses orais de vacina contra HRV foramaltamente eficazes na proteção de bebês contra qualquer RVGE grave ehospitalização em virtude de múltiplas cepas de rotavírus em circulação.

Um alto nível de proteção foi demonstrado contra rotavírusG1P[8] homólogos, os quais têm duas proteínas de capsídeo externas (VP4 eVP7) e uma proteína de capsídeo interna (VP6) antigenicamente similares àvacina contra HRV. Ela também protegeu bem contra cepas compartilhandoapenas o genótipo P[8] (antígeno VP4) e o antígeno VP6. Proteção contracepas de rotavírus não compartilhando qualquer um dos antígenos de capsídeoexterno da vacina contra HRV também foi demonstrada em uma meta análiseincluindo os resultados de três estudos de fase II da Finlândia, Singapura eAmérica Latina (todos usando metodologia e critérios de eficácia idênticos) ede 2 estudos de fase III da América Latina e Europa e os quais são reportadosno Exemplo 13. A eficácia da vacina contra o tipo G1P[4] de qualquergravidade foi de 81% (95% C.I. de 31,6-95,8) e a eficácia da vacina contraGE grave em virtude do tipo G1P[4] foi de 71,4 % (95% C.I. de 20,1-91,1),indicando que a vacina também pode proteger contra cepas as quais nãocompartilham proteínas G ou P idênticas com a cepa da vacina.LISTAGEM DE SEOÜENCIAS

<110> GlaxoSmithKline Biologicals s.a.<120> Vacina<130> VB61582<160> 42

<170> FastSEQ para versão 4.0 do windows

<210> 1

<211> 2350

<212> DNA

<213> Rotavirus

<4 00> 1

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<210> 3<211> 1009<212> DNA<213> Rotavírus<400> 3

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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690 695 700

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725 730 735

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740 745 750

Asn Phe Ile Asn Gln Asn Asn Pro Ile Ile Arg Asn Arg Ile Glu Gln

755 760 765

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<210> 6<211> 326<212> PRT<213> Rotavirus<400> 6Met Tyr Gly Ile Glu Tyr Thr Thr Ile Leu Ile Phe Leu Ile Ser Ile1 5 10 15 Ile Leu Leu Asn Tyr Ile Leu Lys Ser Val Thr Arg Ile Met Asp Tyr 20 25 30 Ile Ile Tyr Arg Ser Leu Leu Ile Tyr Val Ala Leu Phe Ala Leu Thr 35 40 45 Arg Ala Gln Asn Tyr Gly Leu Asn Leu Pro Ile Thr Gly Ser Met Asp 50 55 60 Thr Val Tyr Ala Asn Ser Thr Gln Glu Gly Ile Phe Leu Thr Ser Thr65 70 75 80Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Thr Glu Ala Ser Thr Gln Ile Asn Asp Gly 85 90 95 Glu Trp Lys Asp Ser Leu Ser Gln Met Phe Leu Thr Lys Gly Trp Pro 100 105 110 Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Glu Tyr Ser Ser Ile Val Asp Phe Ser 115 120 125 Val Asp Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Leu Val Leu Met Lys Tyr 130 135 140 Asp Gln Asn Leu Glu Leu Asp Met Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu145 150 155 160Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Thr Leu Tyr Tyr Tyr Gln 165 170 175 Gln Ser Gly Glu Ser Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Ser Ser Cys Thr 180 185 190 Val Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Met Leu Gly Ile Gly Cys Gln 195 200 205 Thr Thr Asn Val Asp Ser Phe Glu Met Val Ala Glu Asn Glu Lys Leu 210 215 220 Ala Ile Val Asp Val Val Asp Gly Ile Asn His Lys Ile Asn Leu Thr225 230 235 240Thr Thr Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys Lys Leu Gly Pro Arg Glu 245 250 255 Asn Val Ala Val Ile Gln Val Gly Gly Ser Asn Val Leu Asp Ile Thr 260 265 270 Ala Asp Pro Thr Thr Asn Pro Gln Thr Glu Arg Met Met Arg Val Asn 275 280 285 Trp Lys Lys Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Ile Val Asp Tyr Ile Asn 290 295 300 Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asn Ser Ala305 310 315 320Ala Phe Tyr Tyr Arg Val 325 <210> 7 <211> 175 <212> PRT <213> Rotavirus <400> 7 Met Asp Lys Leu Ala Asp Leu Asn Tyr Thr Leu Ser Val Ile Thr Leu1 5 10 15 Met Asn Asp Thr Leu His Ser Ile Ile Gln Asp Pro Gly Met Ala Tyr 20 25 30 Phe Ser Tyr Ile Ala Ser Val Leu Thr Val Leu Phe Ile Leu His Lys 35 40 45 Ala Ser Ile Pro Thr Met Lys Ile Ala Leu Lys Thr Ser Lys Cys Ser 50 55 60 Tyr Lys Val Ile Lys Tyr Cys Ile Val Thr Ile Ile Asn Thr Leu Leu65 70 75 80Lys Leu Ala Gly Tyr Lys Glu Gln Val Thr Thr Lys Asp Glu Ile Glu 85 90 95 Gln Gln Met Asp Arg Ile Val Lys Glu Met Arg Arg Gln Leu Asp Met 100 105 110 Ile Asp Lys Leu Thr Thr Arg Glu Ile Glu Gln Val Glu Leu Leu Lys 115 120 125Arg Ile His Asp Asn Leu Ile Thr Arg

130 135

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ttctaagacc aaacaatgta gaggtagaat ttttattgaa tggacaaatt attaatacat 840

atcaggctag atttggtact atcatcgcaa gaaattttga tacaattcgt ttattatttc 900

agttgatgcg tccacctaat atgacaccag ctgttaatgc actatttcca caagcacaac 960

cttttcagca ccatgcaaca gttggactta cattacgtat tgaatctgcg gtttgtgaat 1020

cagtgcttgc ggacgcgaat gaaactctgt tagcaaatgt gaccgcggtg cgtcaagaat 1080atgccatacc agttggaccg gtatttccac caggcatgaa ttggactgaa ttgattacta 1140actattcgcc atctagagaa gataacttgc aacgcgtttt cacggtagct tccattagaa 1200gcatgttgat taagtgagga ccagactaaa catctggtat ccaatcttag ttagcatgta 1260

gctacatcaa gtcattcaga ctcttcaagt aaggacatga tttcatgttc gctacgtaga 1320

gtaactgtct gaatgatgta gtgagaggat gtgacc 1356

<210> 11<211> 28<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus

<4 00> 11

ggctttaaaa gagagaattt ccgtctgg 28

<210> 12<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<4 00> 12

ggttagctcc ttttaatgta tggta 25<210> 13<211> 27<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 13

ggtcacatcg aacaattcta atctaag 27

<210> 14<211> 22<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<4 00> 14

caagtactca aatcaatgat gg 22

<210> 15<211> 23<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<4 00> 15

tgttgatttt tctgtcgatc cac 23

<210> 16<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 16

ggttgctgag aatgagaaat tagctatagt gg 32

<210> 17<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<4 00> 17

ccactatagc taatttctca ttctcagcaa cc 32

<210> 18<211> 22<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<4 00> 18

tggcttcgcc attttataga ca 22

<210> 19<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<4 00> 19

atttcggacc atttataacc 20<210> 20<211> 22<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 20

tggcttcact catttataga ca<210> 21<211> 23<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 21

atttcagacc atttataacc tag<210> 22<211> 29<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 22

ggagtagtat atgaaagtac aaataatag<210> 23<211> 29<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 23

ctattatttg tactttcata tactactcc<210> 24<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 24

tcgatacagt ataagagagc acaag<210> 25<211> 27<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 25

ttcattaact tgtgctctct tatactg<210> 26<211> 22<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 26

gtatatgtag actattggga tg

22

23

29

29

25

27

22<210> 27<211> 22<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 27

catcccaata gtctacatat ac<210> 28<211> 23<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 28

tgtaactccg gcaaaatgca acg<210> 29<211> 23<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 29

cgttgcattt tgccggagtt aca<210> 30<211> 23<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 30

gtaagacaag atttagagcg cca<210> 31<211> 23<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 31

tggcgctcta aatcttgtct tac<210> 32<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 32

cttgatgctg atgaagcagc atctg<210> 33<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 33

cagatgctgc ttcatcagca tcaag<210> 34<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 34

cgatcatatc gaatattaaa ggatg 25

<210> 35<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 35

catcctttaa tattcgatat gatcg 25

<210> 36<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 36

agcgttcaca caatttacat tgtag 25

<210> 37<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 37

agtattttat actatagtag attatattaa tc 32

<210> 38<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus -<400> 38

agtattttat actatggtag attatattaa tc 32

<210> 39<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 39

atccccatta tactgcattc ctttc 25

<210> 40<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhando homologia com seqüências denucleotideo de rotavirus<400> 40

atccctatta tactgcattt ctttc 25<210> 41<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhandonucleotideo de rotavirus<400> 41

atccccatta tactgcattt ctttc<210> 42<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligonucleotideo compartilhandonucleotideo de rotavirus<400> 42

atccctatta tactgcattc ctttc

homologia com seqüências de

25

homologia com seqüências de

25

Claims (19)

1. Uso de uma cepa de rotavírus atenuado de tipo GxPy5caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para induziruma resposta imune contra infecção por rotavírus causada por uma cepa derotavírus de um tipo G2P[4].

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a composição compreende um rotavírus tendo um gene VP4,compreendendo na seqüência de nucleotídeos, pelo menos uma das seguintes:uma base adenina (A) em posição 788, uma base adenina (A) em posição 802e uma base timina (T) em posição 501 do códon de partida.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o gene VP4 compreende uma seqüência de nucleotídeoscompreendendo uma base adenina (A) em posições 788 e 802 e uma basetimina (T) em posição 501 do códon de partida.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato de que a composição compreende um rotavírus tendoum gene VP7 compreendendo, na seqüência de nucleotídeos, pelo menos umadas seguintes: uma timina (T) em posição 605, uma adenina (A) em posição-897 e uma guanina (G) em posição 897 do códon de partida.

5. Uso de acordo com a reivindicação 4 caracterizado pelo fatode que o gene VP7 compreende uma seqüência de nucleotídeoscompreendendo uma timina (T) em posição 605 e uma adenina (A) ou umaguanina (G) em posição 897 do códon de partida.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que a composição compreende um rotavírus tendoum gene VP4 compreendendo, na seqüência de nucleotídeos, uma adenina(A) em posições 788 e 802 e uma timina (T) em posição 501 do códon departida; e em que o gene VP7 compreende, na seqüência de nucleotídeos, umatimina (T) em posição 605 e uma adenina (A) em posição 897 do códon departida.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,caracterizado pelo fato de que a composição adicionalmente induz umaresposta imune a Gl e pelo menos um dos serotipos não Gl selecionadosdentre o grupo consistindo de: serotipos G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, GlO5Gll , G12, G13 e G14.

8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que a composição é adicionalmente capaz de induzir uma respostaimune a pelo menos um dos serotipos não Gl selecionados dentre o grupoconsistindo de: G3, G4 e G9.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8,caracterizado pelo fato de que a composição é usada para induziradicionalmente uma resposta imune a P[8] e pelo menos um dos tipos nãoP[8] selecionados dentre o grupo consistindo de: tipos P[l], P[2], P[3], P[4],P[5], P[6], P[7], P[9], P[11], P[12], P[14] e P[19].

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9,caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo uma cepa derotavírus atenuado de um tipo G1P[8] provê proteção contra váriasgastroenterites induzidas por rotavírus severas causadas por infecção de umacepa de rotavírus de um tipo GlP[4].

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo uma cepa derotavírus atenuada de um tipo G1P[8] é pelo menos 40% protetora, em umapopulação de indivíduos vacinados, contra a diarréia causada por uma cepa derotavírus de um tipo G1P[4].

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelofato de que a composição é pelo menos 50% protetora.

13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a composição é pelo menos 60% protetora.

14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que a composição é entre 40% e 80% protetora.

15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelofato de que a composição é entre 50% e 70% protetora.

16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a composição compreende uma cepa derotavírus G1P[8] que é entre 40% e 75% protetora em uma população deindivíduos vacinados contra gastrenterite severa causada por infecção derotavírus com um serotipo G2P4.

17. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a cepa de rotavírus na referida composiçãoé ECACC depósito 99081301, ou é obtenível ou derivável de ECACCdepósito 99081301.

18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada em um regimede 2 doses.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a cepa de rotavírus atenuado é formuladacom um carreador farmacêutico apropriado com ou com um tampãoantiácido, ou ambos.