ES2328350T3 - Cuerpos de inclusion como antigenos para la vacunacion oral de animales frente a vppc. - Google Patents
Cuerpos de inclusion como antigenos para la vacunacion oral de animales frente a vppc. Download PDFInfo
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Abstract
Un polipéptido en forma de cuerpos de inclusión producido en un organismo genéticamente modificado que contiene la secuencia de aminoácidos de la proteína E2 de pestivirus, preferiblemente del VPPC, carente del fragmento transmembrana.
Description
Cuerpos de inclusión como antígenos para la
vacunación oral de animales frente a VPPC.
El tema de la invención es una vacuna oral y los
medios y procedimientos usados en su producción. En general, la
invención se refiere a un procedimiento para inducir una reacción
inmunológica, que comprende la administración de una vacuna a
través de tubo digestivo. Los temas de la invención sirven para
producir vacunas orales frente a la enfermedad causada por un
pestivirus, especialmente frente a la peste porcina clásica.
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La peste porcina clásica está causada por el
virus de la peste porcina clásica (VPPC, también conocido en el
pasado como virus de la peste porcina). La peste porcina clásica es
una de las enfermedades causadas por pestivirus pertenecientes a la
familia Flaviviridae. Los pestivirus atacan a animales de la
familia Suidae (cerdo) ya varias especies de rumiantes (vacas,
ovejas y cabras), así como a muchas especies de animales salvajes.
La peste porcina clásica se describió por primera vez en 1833 en
Ohio. Desde entonces se han ampliado considerablemente alcance en
todo el mundo, convirtiéndose en uno de los factores económicos más
limitantes en la cría de cerdos. En 1997, durante una epidemia de
peste porcina en España, se perdieron más de un millón de animales.
Las pérdidas ascendieron a más de 140 millones de dólares. Hasta la
fecha, esta enfermedad no se ha detectado en apenas 16 países. La
organización mundial Office International des Epizooties,
incluye esta enfermedad en su lista A como una de las 15
enfermedades animales más peligrosas. Dependiendo de la virulencia
del virus, la evolución de la enfermedad puede ser: aguda, moderada
o leve. Durante una crisis aguda, los animales presentan fiebre
alta, alternancia de estreñimiento y diarrea, leucopenia (apoptosis
de leucocitos), lesiones cutáneas y una fuerte inmunodepresión. En
la mayoría de los animales, el resultado de un caso agudo de peste
porcina es la muerte. Un caso leve puede cursar asintomáticamente. Y
lo que es más, la enfermedad tiene más bien un periodo largo de
incubación, de 2 a 14 días, lo que complica adicionalmente el
control de una epidemia. La forma más frecuente de transmisión de la
enfermedad es el contacto entre animales enfermos y sanos. La
transmisión física también es posible por personas, aves e insectos,
en utensilios agrícolas, pienso, vehículos, ropa, etc. La infección
se produce a través de la vía nasoesofágica. Hasta la fecha, se ha
demostrado que es imposible tratar la enfermedad. Tras el
descubrimiento del patógeno, todos los rebaños en un radio de 25 km
del epicentro de la epidemia deben ser sacrificados. El hecho de que
el virus puede sobrevivir fuera del organismo hospedador durante un
mes demuestra su resistencia. Actualmente existen tres vacunas: una
basada en la cepa C viva atenuada del virus [Terpstra y col., Dtsch
Tierarztl Wochenschr 1990; 97 (2): 77-9], otra
basada en un clon de ADNc infectivo modificado [Meyers y col. J.
Virol., 1996; 70 (3): 1588-95], así como "vacunas
marcador" basadas principalmente en la glucoproteína E2 [van
Rijn y col., Vaccine 1999; 17 (5): 433-40].
La glucoproteína E2, así como las glucoproteínas
E0 y E1, constituyen la envoltura vírica del virus de la peste
porcina. La virulencia del patógeno se neutraliza de forma más
eficaz mediante anticuerpos dirigidos frente a epítopes de la
proteína E2 (Weiland y col. 1992. J. Virol. 66:3677). La proteína E2
posee epítopes característicos en el extremo
N-terminal que son reconocidos por anticuerpos.
Estos son los cuatro dominios A, B, C y D, expuestos en el exterior
de la membrana, a la que la proteína se ancla con el extremo
C-terminal (van Rijn y col., 1994. J. Virol.
68:3934).
A diferencia de la inmunización parenteral, las
vacunas orales aseguran no sólo la inmunidad sistémica, sino
también la inmunidad de membranas mucosas, lo que es especialmente
importante para prevenir la infección por parásitos gástricos. El
creciente interés en las vacunas orales también está alimentado por
la facilidad de aplicación, lo que facilita la administración a
gran escala (Richter L., Kipp B.B., 1999. Curr. Top Microbial.
Immunol., 240. 159-176). Se han realizado los
primeros intentos para producir vacunas orales. La descripción WO
00/37610 muestra vectores para la fabricación de polipéptidos
inmunogénicos, como HBsAg, en tejidos vegetales comestibles. Las
plantas transgénicas producidas de esta forma se usan para fabricar
vacunas orales.
Sin embargo, estas no están extensas de fallos.
La dificultad estriba de asegurar las dosis adecuadas y precisas de
antígeno en la vacunación. El nivel de antígeno sintetizado varía
en diferentes tejidos y muestras de las plantas transgénicas
obtenidas.
Las descripciones US 5.770.214, US 5.811.105 y
US 5.804.194 está relacionadas con la aplicación de cepas atenuadas
de Salmonella Typhi como vacunas orales.
La descripción US 6.290.962 publicada el 18 de
septiembre de 2001 describe un procedimiento para inducir una
respuesta inmune frente a Helicobacter basada en la
administración de una cantidad inmunogénica de un antígeno, que era
una ureasa de Helicobacter o su subunidad. Vacunas orales
similares que contienen una proteína ureasa recombinante de
Helicobacter producida en células de E. coli son los
temas de las patentes polacas PL 179.149 y PL 174.448.
Una relativa falta de experiencia en
inmunización oral y el destino incierto del antígeno en el tubo
digestivo hace que las condiciones de esta forma de inmunización
estén peor definidas que la vacunación parenteral. Adicionalmente,
la inmunización oral conlleva el riesgo de inducción de tolerancia
basada en la tolerancia a alimentos (McGhee J.R. y col., 1999. en:
Mucosal Immunology (Ogra P.L., Lamm M.E., Bienenstock J., Mestecky
J., Strober W., McGhee J. R., red), págs. 485-505.
Academic Press).
La descripción WO 98/32427 publicada el 30 de
julio de 1998 describe un polímero usado para preparar vacunas
orales recubiertas, con liberación retardada del principio
activo.
Independientemente de la vía de administración,
la forma del antígeno garantiza su grado de inmunogenicidad.
La adquisición de inmunidad como resultado de la
vacunación requiere el mantenimiento de la pauta correcta de
inmunización, lo que incluye factores como la descripción precisa
de factores como el tamaño y número, así como la frecuencia de
dosis individuales. El pH ácido de los jugos gástricos, las enzimas
proteolíticas y la peristalsis intestinal hacen que las dosis
efectivas en la vacunación oral sean mucho más altas que en la
vacunación parenteral. Al mismo tiempo, sin embargo, la
administración de una dosis excesivamente alta de antígeno provoca
la tolerancia a alimentos mencionada anteriormente. Esto no
significa que la aplicación de dosis bajas de antígeno no pueda
inducir tolerancia a alimentos. Hasta la fecha no se han elucidado
los mecanismos básicos que rigen este fenómeno y no se han ideado
procedimientos convencionales para resolver el problema de la
tolerancia inducida. Se cree que el fenómeno de tolerancia depende
en cierto grado de los factores mencionados anteriormente, como el
tamaño de la dosis, la pauta posológica y el tipo de antígeno
(Tacket C.O., Mason H.S., 1999. Microbes and Infection 1.
777-783). En vista de la investigación actual las
perspectivas de producir los adyuvantes apropiados, los componentes
óptimos de la vacuna, las dosis eficaces y las pautas de vacunación
oral parecen estar lejos (Makela P.H., 2000. FEMS Microbiology
Rewiews 24. 9-20).
Parece que el requisito previo para la
inmunización a través de las membranas mucosas es una
administración múltiple del antígeno en dosis varias veces superior
a las dosis efectivas para la administración parenteral. Más
preferiblemente son antígenos que forman grupos multiméricos. La
justificación del uso de adyuvantes tampoco está clara. En el caso
de vacunas de plantas comestibles, esto parece ser poco deseable,
aunque para algunos antígenos puede ser esencial (Richter L., Kipp
B.B, 1999. Curr. Top Microbiol. Immunol. 240.
159-176).
En resumen, debido a la naturaleza de las
vacunas orales, parece que es mucho más difícil establecer un
protocolo de inmunización gastrointestinal eficaz de lo que es para
la inmunización que usa procedimientos tradicionales. Para cada
medicamento en concreto, esto es un desafío único, asociado con un
gran riesgo de fracaso.
Existen varios indicadores de la eficacia de la
inmunización a través de membranas mucosas, como el tubo digestivo.
Estos incluyen el nivel de anticuerpos específicos de antígeno
secretados de la clase IgA (S-IgA) asociada con las
membranas mucosas, el valor en suero de anticuerpos de las clases
IgG e IgA, el perfil de anticuerpos de la clase IgG y el perfil de
citocinas. Para determinar la inmunidad celular, se usan pruebas de
citotoxicidad de linfocitos.
El genoma del VPPC es una cadena sencilla de 9,5
a 12,5 kpb y de polaridad positiva. La cadena contiene un marco de
lectura que codifica una poliproteína de aproximadamente 4.000
aminoácidos. Esta última sufre un procesamiento cotraduccional y
postraduccional dando lugar a las cuatro proteínas estructurales C,
E0, E1, E2 y a proteínas no estructurales, es decir, proteasas
virales. Aún no se conoce la estructura del virión. Se sabe que el
virión es una partícula icosaédrica de aproximadamente 50 nm de
diámetro y que está compuesta de una nucleocápside esférica y una
envoltura. La nucleocápside está compuesta de muchas moléculas de
proteína C, mientras que la envoltura está compuesta de
fosfolípidos de membrana y las glucoproteínas de superficie E0, E1 y
E2. Las proteínas forman homodímeros (E0 y E2) y heterodímeros
(E1-E2) a través de puentes disulfuro. Sólo
entonces se incorporan a la envoltura viral (Meyers G., Thiel H.J
1996. van Rijn P. A., van Gennip H. G. P., de Meijer E. J, Moormann
R. J. M. 1993. Thiel H. J., Stark R., Weiland E., Rumenapf T.,
Meyers G. 1991). Las proteínas E1 y E2 poseen dominios
transmembrana que las anclan a la membrana (van Rijn P. A., van
Gennip H. G. P., de Meijer E. J, Moormann R. J. M 1993. van Rijn P.
A., Miedema G. K. W, Wensvoort G, van Gennip H. G. P., Moormann R.
J. M. 1994). Todas las glucoproteínas de la envoltura tienen
propiedades inmunogénicas. Se piensa que la proteína E2 es el
antígeno más potente, más potente que E0 y E1.
La descripción de la patente US 6.207.165
(publicada el 27 de marzo de 2001) describe una solución relativa a
una vacuna que protege al cerdo de estados patológicos causados por
enfermedades de las vías respiratorias y reproductoras. En esta
solución se presenta una composición inmunogénica que induce una
respuesta inmune frente al VPPC y que contiene un plásmido que
codifica al menos una de las proteínas E1 o E2, la cual se expresa
in vivo en la célula hospedadora.
La descripción de la patente US 5.965.134
(publicada el 12 de octubre de 1999) describe polipéptidos
inmunogénicos de pestivirus, especialmente del VPPC y, en
particular, la proteína no estructural p10 y vacunas y diagnósticos
usando los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico
descritas.
A pesar de la investigación descrita
anteriormente dedicada a la producción de una vacuna frente al
VPPC, sigue existiendo la necesidad de producir herramientas
eficaces para la fácil fabricación de vacunas eficaces que inmunicen
frente a este virus.
En vista del estado de la tecnología presentado
anteriormente, la finalidad de la presente invención es la
producción de medicamentos especiales eficaces y de fácil obtención
que se puedan aplicar en vacunaciones orales frente a la peste
porcina clásica, lo que facilitaría la adquisición de inmunidad
sistémica y de membranas mucosas. Los tratamientos según la
presente invención debe ser fácil de aplicar y carecer de otras
dificultades conocidas de la preparación y aplicación de vacunas.
Esto último incluye los costes relativamente altos de la preparación
del tratamiento y el peligro de intoxicación hematológica
involuntaria durante la vacunación. Las vacunaciones orales según
la presente invención deben asegurar una inmunización eficaz a
través del tubo digestivo.
La siguiente finalidad de la presente invención
es la producción de los medios que se pueden usar para producir una
vacuna eficaz, fácil de administrar y fácilmente disponible frente
a enfermedades causadas por un pestivirus, especialmente la peste
porcina clásica. Un objetivo particular de la presente invención es
la producción de proteínas recombinantes que contendrían antígenos
seleccionados del virus de la peste porcina clásica y herramientas
que facilitan su expresión en E. coli. Un objetivo
particular de la presente invención es la producción de los medios
que facilitan la producción de las proteínas recombinantes que
podrían usarse para producir vacunas comestibles frente a
enfermedades causadas por pestivirus, en particular frente a la
peste porcina clásica.
Inesperadamente, en la presente invención se han
conseguido dicho objetivo descrito y una solución a los problemas
descritos en el estado de la tecnología.
\vskip1.000000\baselineskip
El tema de la presente invención es un
polipéptido producido en un microorganismo genéticamente modificado
que contiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia de la
proteína E2 del pestivirus, en particular VPPC. Preferiblemente,
está en forma de cuerpos de inclusión. Una realización preferida de
la presente invención es un polipéptido según la presente invención
que contiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia de la
proteína E2 del pestivirus, en especial el VPPC, carente de
fragmento transmembrana. En particular, preferiblemente, el
polipéptido según la presente invención contiene la secuencia
codificada por la secuencia que se presenta en la fig. 4 o en la
fig. 5.
El tema de la presente invención también es la
secuencia que codifica un polipéptido que contiene una secuencia
nucleotídica, la cual codifica la secuencia de aminoácidos de la
proteína E2 del pestivirus, especialmente del VPPC.
Preferiblemente, la secuencia según la presente invención contiene
la secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos
de la proteína E2 del pestivirus, especialmente del VPPC, carente
de fragmento transmembrana y, especialmente la que se presenta en
la fig. 4 o en la fig. 5.
El tema de la presente invención también es una
construcción que contiene la secuencia que codifica un polipéptido,
caracterizada porque es una secuencia que codifica un
polipéptido según la presente invención, definida anteriormente.
Preferiblemente, la construcción según la presente invención es un
plásmido producido por la inclusión de la secuencia que codifica el
polipéptido dentro de un plásmido pIGDM1 y, en especial
preferiblemente el plásmido pIGCmT7.
El tema de la presente invención también es una
célula bacteriana transformada con la construcción de expresión
que contiene la secuencia que codifica un polipéptido,
caracterizada porque la construcción contiene una secuencia
según la presente invención definida anteriormente como la secuencia
que codifica un polipéptido. Preferiblemente, la célula bacteriana
según la presente invención contiene un plásmido producido mediante
la inclusión de una secuencia que codifica el polipéptido dentro de
un plásmido pIGDM1, preferiblemente el plásmido pIGCmT7.
Preferiblemente, la célula bacteriana según la presente invención
es una cepa de E. coli. Un especialista también es capaz de
utilizar cualquier otro microorganismo determinado disponible para
la tecnología como cepa capaz de realizar la expresión.
El tema de la presente invención también son
cuerpos de inclusión que contienen el polipéptido definido
anteriormente según la presente invención.
El tema de la presente invención también es un
procedimiento para la producción de una vacuna oral frente a la
enfermedad causada por un pestivirus, especialmente frente a la
peste porcina clásica, caracterizado porque comprende la
transfección de células de E. coli con un vector de
expresión, la expresión del polipéptido codificado por este vector,
el aislamiento de los cuerpos de inclusión que contienen el
polipéptido producido usado en la producción de una vacuna, en la
que el vector contiene una secuencia nucleotídica que codifica una
secuencia polipeptídica según la presente invención definida
anteriormente.
El tema de la presente invención también es la
aplicación del polipéptido según la presente invención definida
anteriormente para producir una vacuna frente a la enfermedad
causada por un pestivirus, especialmente frente a la peste porcina
clásica.
El tema de la presente invención también es una
vacuna frente a la enfermedad causada por un pestivirus,
especialmente frente a la peste porcina clásica, que contiene un
antígeno y, posiblemente, un vehículo y/o adyuvante
farmacéuticamente aceptable, caracterizado porque el antígeno
contiene el polipéptido definido anteriormente según la presente
invención, especialmente en forma de cuerpos de inclusión.
\newpage
El tema de la presente invención también es la
aplicación de cuerpos de inclusión según la presente invención para
producir una vacuna oral frente a la enfermedad causada por un
pestivirus, especialmente frente a la peste porcina clásica.
Las vacunas son proteínas apropiadas, cuya
expresión se consiguió en células bacterianas de E. coli de
la cepa BL21(DE3), transformadas con el plásmido de
expresión pIGCmT7 que contiene un determinad inserto. Las proteínas
se aislaron a partir de las células bacterianas de E. coli
en forma de cuerpos de inclusión.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención posee muchas ventajas
sobre aquellas conocidas de las soluciones conocidas a partir del
estado de la tecnología. Se ha ideado un procedimiento muy eficaz
de inducción de la producción de anticuerpos en membranas mucosas.
Debido al hecho de que las infecciones por VPPC se producen a
través de las membranas mucosas, el procedimiento apropiado de
administrar dicha vacuna es por vía oral, puesto que sólo este tipo
de vacunas induce una reacción inmune especialmente potente en el
sitio natural de penetración del virus. La vacuna producida es
fácil de administrar y carece de los otros aspectos negativos
conocidos de preparación y aplicación de las vacunas clásicas, como
el alto coste de producción y el peligro de intoxicación
hematológica involuntaria durante la vacunación.
La expresión del antígeno se produce en células
bacterianas. La homogeneidad de la composición producida y, por
consiguiente, las dosificaciones precisas, están garantizadas por
la simple organización del hospedador seleccionado y la posibilidad
de controlar la expresión del antígeno de la vacuna aislado y usado
en forma de cuerpos de inclusión.
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras incluidas facilitan la explicación
más clara de la naturaleza de la presente invención.
la fig. 1 representa el mapa del plásmido
pIGCmT7, donde: ARG ARNt es el gen del ARNt de arginina para los
codones AGA y AGG, ORI es el origen de replicación del plásmido
pPIGDMI, Cm-R es el gen resistente a cloranfenicol,
T7 es un promotor y stop es un terminador de la transcripción.
la fig. 2 representa un electroforograma de la
proteína E2 aislada del VPPC carente del fragmento transmembrana en
forma de cuerpos de inclusión. Carriles: 1) Patrones de proteínas
de bajo peso molecular 14,4 kDa, 20,1 kDa, 30,0 kDa, 43,0 kDa, 67,0
kDa y 97,0 kDa; 2) proteína E2 aislada del VPPC carente del
fragmento transmembrana en forma de cuerpos de inclusión.
la fig. 3 representa una composición proteica
administrada a ratones. Carriles: 1) patrones de proteínas de bajo
peso molecular 14,4 kDa, 20,1 kDa, 30,0 kDa, 43,0 kDa, 67,0 kDa y
97,0 kDa; 2) y 3) proteína E2 aislada del VPPC carente del
fragmento transmembrana; 49-7) muestras de albúmina
con las siguientes masas 1 \mug, 2 \mug, 4 \mug y 6 \mug de
proteína pura; 8) proteína E2 aislada del VPPC sin fragmento
transmembrana en forma de cuerpos de inclusión.
la fig. 4 representa la secuencia
BresciaE2_Bez_Mem_N que codifica la proteína E2 del VPPC carente
del fragmento transmembrana. El fragmento se inserta en el vector
pBluescript SK(-) en los sitios de digestión de las nucleasas de
restricción BamHI y HindIII.
la fig. 5 representa la secuencia
BresciaE2_Bez_Mem_N que codifica la proteína E2 del VPPC carente
del fragmento transmembrana. El fragmento se inserta en el vector
pIGCmT7 en los sitios de digestión de las nucleasas de restricción
NdeI y HindIII.
la fig. 6 representa los resultados del ensayo
de inmunogenicidad del antígeno E2 del VPPC procedente de una cepa
transformada de E. coli. Los ratones (BALB/c) fueron
inyectados dos veces, por vía subcutánea e intramuscular. La dosis
de refuerzo se aplicó por vía intravenosa. Cada vez se aplicaron
aproximadamente 20 \mug de antígeno E2 con adyuvante completo de
Freund.
la fig. 7 representa los resultados de un ensayo
para la presencia de anticuerpos de clase IgG en suero de ratones
alimentados con cuerpos de inclusión que contenían aproximadamente
10 \mug del antígeno E2 del VPPC. El antígeno se administró los
días 0 y 26 del experimento.
la fig. 8 representa los resultados de un ensayo
para la presencia de anticuerpos de clase IgA en las heces de
ratones alimentados con cuerpos de inclusión que contenían
aproximadamente 10 \mug del antígeno E2 del VPPC.
la fig. 9 representa los resultados de un ensayo
para la presencia de anticuerpos de clase IgG en suero de ratones
alimentados con cuerpos de inclusión que contenían aproximadamente
50 \mug del antígeno E2 del VPPC. El antígeno se administró los
días 0 y 26 del experimento.
la fig. 10 representa los resultados de un
ensayo para la presencia de anticuerpos de clase IgA en las heces
de ratones alimentados con cuerpos de inclusión que contenían
aproximadamente 50 \mug del antígeno E2 del VPPC.
A continuación se muestran ejemplos de
realizaciones de la presente invención definida anteriormente.
Plásmido pIGCmT7 de expresión en bacterias: el
plásmido pIGCmT7 (4.056 pb) (fig. 1) se produjo en el laboratorio
del Prof. Andrzej Plucienniczak en el Instituto de Biotecnología y
Antibióticos en Varsovia, basado en el plásmido pIGDM1 (Mikiewicz
D. y col., Plasmid 1997), que es un plásmido del grupo ColE1 de
Enterobacter agglomerans. El plásmido pIGCmT7 se produjo
mediante la adición de un gen de resistencia a cloranfenicol, un
polienlazador con el promotor de la ARN polimerasa del fago T7 y
una secuencia de codon de terminación de la transcripción del fago
T7.
Plásmidos bacterianos sin expresión: para clonar
fragmentos de ADN tras la amplificación por PCR, se usó el plásmido
pBluescript SK(-) de Stratagene (la secuencia está disponible en
Gene Bank con el número de acceso X52324 S52394). Este plásmido
posee: un origen de replicación Col El, promotores para las ARN
polimerasas de los fagos T3 y T7 que flanquean el polienlazador y un
gen de resistencia a ampicilina.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia nucleotídica que codifica el
antígeno E2 de la cepa Brescia del virus de la peste porcina, de
1.504 pb de longitud, clonado en los sitios de restricción
PstI y KpnI en el plásmido pEVhis13HCVE1 se obtuvo del
Prof. Szewczyk de la Universidad de Gdansk. La secuencia está
disponible en Gene Bank con el número de acceso M31768.
Las coordenadas proporcionadas en las
descripciones de producción de fragmentos incluidos en vectores se
refieren a las coordenadas en la secuencia del antígeno E2
depositada en el American Gene Bank.
Indicaciones para la producción del fragmento
BresciaE2_Bez_Mem_N insertado en el vector de expresión
pIGCmT7.
pIGCmT7.
A partir de un plásmido que contiene la
secuencia nucleotídica completa del antígeno E2 del VPPC, se
amplificó un fragmento de 1.023 pb de longitud, del pb 2.428 al
3.450, mediante PCR. Los cebadores, BRESAMA y UBIBREK2, se
diseñaron en función de la secuencia del gen que codifica la
proteína E2 del VPPC carente del fragmento transmembrana. El
cebador sentido, BRESAMA, introduce un cambio en la secuencia
nucleotídica del extremo 5' de la molécula de ADN, intercambiando
la guanina 2.430 por timina. El cambio introducido en la secuencia
nucleotídica no produce cambio en la secuencia nucleotídica.
Adicionalmente, el cebador BRESAMA elonga el extremo 5' de la
molécula de ADN, introduciendo un codon GCA de alanina y los sitios
de reconocimiento para las nucleasas de restricción NdeI y
BamHI. El cebador UBIBREK2 elonga el extremo 3' de la
molécula de ADN introduciendo un codon de terminación TA y sitios de
reconocimiento para las nucleasas de restricción HindIII y
XhoI. Tras la PCR, la mezcla se separó electroforéticamente
en un gel de poliacrilamida. El fragmento de AND amplificado, 1.058
pb de longitud, se eluyó del gel de poliacrilamida y, a
continuación, se digirió con las nucleasas de restricción
BamHI y HindIII y se desproteinizó. El fragmento
obtenido se ligó al vector pBluescript SK(-) digerido con las
mismas nucleasas de restricción y posteriormente desproteinizado. El
producto de este ligamiento se usó para transformar células de
E. coli de la cepa DH5\alpha. Tras el aislamiento del ADN
del plásmido de las células de E. coli transformadas, se usó
un análisis de restricción para confirmar la presencia del inserto
BresciaE2_Bez_Mem_N. La precisión de la secuencia del fragmento
BresciaE2_Bez_Mem_N incluido en el vector pBluescript SK(-) se
confirmó mediante secuenciación.
A partir del vector pBluescript SK(-) que
contenía el inserto clonado, se digirió un fragmento usando las
nucleasas de restricción NdeI y HindIII. Tras la
digestión, la mezcla se separó en un gel de poliacrilamida y el
fragmento correspondiente al inserto BresciaE2_Bez_Mem_N digerido
con las nucleasas de restricción NdeI y HindIII se
escindió y eluyó. El fragmento de ADN obtenido se ligó al vector de
expresión pIGCmT7 digerido con las nucleasas de restricción
NdeI y HindIII. El producto de ligamiento se usó
para transformar células de E. coli de la cepa DH5\alpha.
Tras el aislamiento del ADN del plásmido de las células de E.
coli transformadas, se usó un análisis de restricción para
confirmar la presencia del inserto BresciaE2_Bez_Mem_N. La
precisión de la secuencia del fragmento BresciaE2_Bez_Mem_N
incluido en el vector pIGCmT7 se confirmó mediante
secuenciación.
Las células de E. coli de la cepa
BL21(DE3), se transformaron con el plásmido que contenía el
inserto confirmado.
El procedimiento usado fue la transformación de
células bacterianas de E. coli competentes, como
describieron J. Sambrook y col.
\vskip1.000000\baselineskip
Las bacterias E. coli de la cepa
BL21(DE3) que portaban el plásmido apropiado se cultivaron
en medio LB con cloranfenicol (20 \mug/ml) a 37°C durante 3 horas
y, a continuación, se diluyeron con medio LB recién preparado
(1:100). Después de 3 horas de agitación a 37°C, se indujo la
expresión mediante la adición de
isopropil-tio-\beta-D-galactósido
(IPTG, a una solución final de 0,1 \mug/ml). Después de 3 horas
las bacterias se centrifugaron. El sedimento de células se
resuspendió en tampón de lisis (NaCl 0,5 M,
Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, EDTA 0,01 M,
2-mercaptoetanol 0,005 M y 0,35 mg/ml de lisozima) y
se incubó durante 30 minutos a 20°C. Se añadió Triton
X-100 hasta alcanzar una concentración del 1%. La
suspensión se sonicó y se centrifugó. El sedimento de cuerpos de
inclusión se resuspendió dos veces en tampón PBS que contenía
Triton X-100 al 1%, se sonicó y centrifugó. Los
cuerpos de inclusión aislados se lavaron dos veces con tampón PBS.
Los cuerpos de inclusión resultantes se resuspendieron en tampón
PBS.
La presencia de una fracción pura de cuerpos de
inclusión se confirmó mediante electroforesis en un gel de
poliacrilamida al 15% (PAGE-SDS). Las proteínas se
visualizaron con colorante azul de Coomassie.
Las imágenes de la electroforesis de las
muestras de los cuerpos de inclusión aislados se presentan en la
fig. 2.
La concentración de proteína se determinó
midiendo la absorbancia a \lambda=595 nm usando el reactivo de
Bradford.
Los cebadores usados para amplificar los
fragmentos de ADN usados se solicitaron a la empresa Perkin Elmer,
donde también se fabricaron.
\vskip1.000000\baselineskip
Nombre: BRESAMA
5'-GAG GGG ATC CAT ATG GCA CGT
CTA GCC TGC AG GA GAT-
\vskip1.000000\baselineskip
Nombre: UBIBREK2
5'-AA AGC TTC TCG AGT TAT TCT
GCG AG TA TCT GAG TG-
\vskip1.000000\baselineskip
Aparatos y demás material:
Enzimas usada para la clonación: ADN polimerasa
Taq y tampón (Roche, kit Expand Long Template PCR System, N° Cat. 1
681 834; ADN ligasa del fago T4 y tampón (USB); polinucleótido
cinasa de T4 y tampón (USB).
Se usaron nucleasas de restricción disponibles
en el mercado.
PCR: Termociclador de PCR controlador térmico
programable PTC-100^{TM} de MJ Research, Inc.
Secuenciación: secuenciador Visible Genetics,
Inc.; kit de secuenciación de Amersham, N° Cat. US79840 (según las
indicaciones del fabricante); kit de purificación de ADN plasmídico
de Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne.
Determinación de la concentración de proteína:
espectrofotómetro Philips PU 8730.
Documentación: sistema de documentación de geles
Sony Digital Graphics Printer UP 0890 y programa Grab
it.
Cepas bacterianas: las cepas de E. coli
usadas en el trabajo son:
DH5\alpha supE44 \DeltalacU169
(\varphi80 lacZ\DeltaM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96
thi-1 relA1
BL21(DE3) hsdS gal
(\lambdaclts857 ind1 Sam7 nin5
lacUV5-T7 gen 1)
Las secuencias de los insertos añadidos a los
vectores se presentan en las fig. 4 y 5.
En la secuencia se han subrayado los sitios de
reconocimiento de las nucleasas de restricción y, tras la digestión
con dichas enzimas, el inserto se introdujo en el vector. Los
codones de inicio y terminación se muestran en negrita.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cuerpos de inclusión que contenían el
antígeno E2 se aislaron a partir de la cepa de E. coli
transformada según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
Los cuerpos de inclusión aislados se separaron
en un gel de poliacrilamida al 15% con SDS
(PAGE-SDS). Se realizó una transferencia de 24 horas
de las proteínas en una membrana de PVDF (Immobilon
TM-P de MILLIPORE). A continuación, el fragmento de
la membrana de PVDF se unió a la proteína E2 del VPPC carene del
fragmento transmembrana. La proteína se eluyó de la membrana en
tampón de elución (Triton X-100 al 1%, SDS al 1% en
Tris HCl 50 mM, pH 9,5) a la cual se añadieron 4 volúmenes de
acetona y 1 volumen de tampón de elución. El volumen final se dejó
a -20°C. Después de 12 horas, la mezcla se centrifugó y el
precipitado resultante se secó. Durante la última etapa, las
proteínas se resuspendieron en solución salina fisiológica.
La pureza y concentración de la preparación de
proteína administrada mediante inyección a los ratones se determinó
por electroforesis en gel de poliacrilamida en comparación con una
solución de albúmina de concentración conocida (fig. 3, carriles
2-7).
\vskip1.000000\baselineskip
El experimento se realizó en hembras de 10
semanas de la cepa endogámica BALB/c (Laboratorio de Genética y
Cría de Animales, Centro de Oncología, Varsovia). Se inocularon
tres ratones por vía subcutánea e intramuscular dos veces con
aproximadamente 20 \mug del antígeno E2 con adyuvante completo de
Freund, con un intervalo de 2 semanas. Un mes después de la segunda
inyección, se administró una dosis de refuerzo intravenosa
(aproximadamente 20 \mug de antígeno E2 + adyuvante completo de
Freund).
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajo sangre de la vena caudal 7 y 9 días
después de la dosis de refuerzo usando heparina (Sigma) como
anticoagulante. Los sueros obtenidos mediante centrifugación se
congelaron en alícuotas a -20°C.
El análisis en los sueros de la presencia de
anticuerpos frente al antígeno E2 se realizó usando un ELISA. Las
placas se cubrieron con antígeno E2 de la cepa Brescia del VPPC
carente del fragmento transmembrana (TM-) obtenido en un sistema de
baculovirus (Laboratorio de Virología Molecular, Universidad de
Gdansk). Las placas MaxiSorp (Nunc) se recubrieron con el antígeno a
una concentración de 3 \mug/ml. Los sueros se analizaron a una
dilución 1:10. El control negativo se realizó usando los sueros de
ratones no inmunizados a una dilución 1:10. El control positivo se
realizó usando el sobrenadante de cultivos de un hibridoma que
producía anticuerpos monoclonales (AcMo) frente a E2 (Laboratorio
de Bioingeniería, Instituto de Biotecnología y Antibióticos,
Varsovia). El AcMo frente al antígeno E2 se produjo usando el
producto de baculovirus (Laboratorio de Virología Molecular,
Universidad de Gdansk).
La placa se desarrollo usando anticuerpos frente
a IgG de ratón, específicos para la cadena \gamma y marcados con
HRP (Sigma) a una dilución de 1:1.000. Se usó TBM (Sigma) como
sustrato de la HRP. La reacción se detuvo con H_{2}SO_{4} 0,5 M.
La absorbancia de las muestras se midió a 450 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
El antígeno E2 del VPPC, aislado de la cepa de
E. coli transformada y administrado por vía parenteral,
inducía una respuesta inmune en todos los ratones, como demostraba
la presencia de anticuerpos IgG específicos de antígeno en los
sueros (fig. 6). Los resultados obtenidos de la aplicación de un
procedimiento de vacunación convencional demuestran que:
- el antígeno E2 producido mediante
sobreexpresión en E. coli, carente del fragmento
transmembrana es un inmunógeno activo, al igual que el antígeno E2
(TM-) soluble producido en el sistema de baculovirus (Ficinska J. y
col. 1999),
- la glucosilación no es un requisito previo
para este inmunógeno (las proteínas recombinantes producidas en
sistemas bacterianos no están glucosiladas).
Los anticuerpos presentes en el suero de ratones
inmunizados por vía parenteral con el antígeno E2 aislado de la
cepa de E. coli transformada reaccionan en un ensayo de
ELISA con el producto de baculovirus, exactamente igual que los
anticuerpos monoclonales producidos usando el producto de
baculovirus (fig. 6). La reactividad indicada de los anticuerpos
sugiere que son activos frente al antígeno E2 nativo del VPPC.
Los experimentos realizados demuestran que el
antígeno E2 recombinante producido por medio de la sobreexpresión
en E. coli es un inmunógeno válido y puede aplicarse como
antígeno para vacuna.
Los cuerpos de inclusión que contenían el
antígeno E2 se aislaron a partir de la cepa de E. coli
transformada según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
Se inmunizó a un grupo de ratones (tres hembras
de 10 semanas) de la cepa endogámica BALB/c (Laboratorio de
Genética y Cría de Animales, Centro de Oncología, Varsovia)
mediante la administración de una suspensión de cuerpos de
inclusión que contenía 20 \mug de proteína junto con su pienso, de
los cuales aproximadamente 10 \mug estaban compuestos por el
antígeno E2. Se usaron dos dosis, con un intervalo de 26 días. El
grupo control estaba compuesto de tres ratones sin inmunizar.
El material de investigación era sangre y heces
recogidas en paralelo de los ratones inmunizados y control. La
sangre se extrajo de la vena caudal 2 días antes de la
inmunización, 14 días después de la primera alimentación y 10, 20 y
30 días después de la segunda alimentación con los cuerpos de
inclusión. El suero se obtuvo mediante centrifugación del
hematocrito usando heparina (Sigma) como anticoagulante. Hasta su
análisis, las muestras se conservaron congeladas en alícuotas a
-20°C.
Las heces se recogieron cada 3-6
días durante todo el mes siguiente a la segunda dosis de antígeno.
Para resuspender las heces, se usó un tampón que contenía
inhibidores de proteasas (AEBSF, aprotinina, leupeptina y
bestatina). La cantidad de tampón usada era proporcional a la
cantidad de heces recogida. Tras la centrifugación, el sobrenadante
se congeló en alícuotas a -20°C.
En las muestras de suero y heces se analizó la
presencia de anticuerpos frente a E2 usando un ELISA, recubriendo
las placas con antígeno E2 de la cepa Brescia del VPPC carente de
fragmento transmembrana obtenido a partir del sistema de
baculovirus (Laboratorio de Virología Molecular, Universidad de
Gdansk). Los sueros de los ratones inmunizados y control, diluidos
1:10, se analizaron en placas MaxiSorp (Nunc) recubiertas con el
antígeno a una concentración de 3 \mug/ml. El control positivo
era el suero de ratones inmunizados por vía parenteral con el
antígeno E2 aislado de los cuerpos de inclusión (Ejemplo 2) con el
nivel más bajo de anticuerpos (ratón 1, fig. 6). Para detectar los
anticuerpos unidos al antígeno, se usaron anticuerpos frente a
anticuerpos de clase IgG de ratón, que eran específicos de la
cadena \gamma, marcados con HRP (Sigma) a una dilución de 1:500.
Las muestras preparadas a partir de las heces de ratones
inmunizados y control se analizaron a una dilución 1:1 en placas
recubiertas con antígeno E2 a una concentración de 5 \mug/ml. Las
placas se desarrollaron usando anticuerpos frente a anticuerpos de
clase IgA de ratón (específico de la cadena \alpha) conjugados
con HRP (Sigma). El anticuerpo secundario se diluyó a 1:500. En
ambos ELISA se usó TBM como sustrato de la peroxidasa. La reacción
de detuvo mediante la adición de una solución de H_{2}SO_{4}
0,5 M y la absorbancia se midió a \lambda=450 nm.
Los sueros de los ratones inmunizados, obtenidos
de la sangre recogida 14 días después de la primera y 10, 20 y 30
días después de la segunda administración oral de aproximadamente
10 \mug del antígeno E2 contenido en cuerpos de inclusión, no
muestran una reacción específica al antígeno en el ensayo de ELISA
para la presencia de anticuerpos de clase IgG (fig. 7). Tampoco se
apreció en las heces de los ratones alimentados con cuerpos de
inclusión la presencia de anticuerpos, en este caso, de clase IgA
de anticuerpos frente al antígeno E2 (fig. 8). De este modo, en el
experimento realizado, no se apreciaba una respuesta sistémica del
sistema inmunitario al antígeno administrado, ni tampoco una
respuesta inmune de membranas mucosas.
Las condiciones de una inmunización oral eficaz
no están tan estrictamente definidas como lo están para la
inmunización parenteral, en la que el uso de un procedimiento
convencional facilita la inducción de una respuesta inmune como en
el experimento descrito en el Ejemplo 2. Tanto en la inmunización
parenteral como en la oral, se usó el antígeno procedente de la
cepa de E. coli transformada. Por tanto, la causa del
fracaso no era la incapacidad del antígeno recombinante para
inducir una respuesta inmune, sino la aplicación de una pauta de
inmunización ineficaz.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cuerpos de inclusión que contenían el
antígeno E2 se aislaron a partir de la cepa de E. coli
transformada según el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, según
el procedimiento de aislamiento.
Los experimentos se realizaron en hembras de 10
semanas de la cepa endogámica BALB/c (Laboratorio de Genética y
Cría de Animales, Centro de Oncología, Varsovia). Se inmunizaron
tres ratones dos veces con un intervalo de 26 días, administrándose
cada vez una suspensión de cuerpos de inclusión con el alimento,
que contenía 100 \mug de proteína, de los cuales el antígeno E2
constituía aproximadamente 50 \mug. Tres ratones sin inmunizar
constituían el grupo control.
La sangre se extrajo de la vena caudal 2 días
antes de la inmunización, 14 días después de la primera
alimentación y 10, 20 y 30 días después de la segunda alimentación
con los cuerpos de inclusión que contenían el antígeno E2. Las heces
se recogieron cada 3-6 días durante todo el mes
siguiente a la segunda dosis de antígeno. Se prepararon las
muestras para su análisis y se analizó la presencia de anticuerpos
específicos de antígeno según el protocolo descrito en el Ejemplo 3.
El análisis estadístico de los datos se realizó usando la prueba U
de Mann-Whitney. No se detectaron anticuerpos IgG
específicos de antígeno en los sueros de ratones alimentados con
cuerpos de inclusión que contenían aproximadamente 50 \mug del
antígeno E2 del VPPC (fig. 9). La reactividad de las muestras de
suero procedente de la sangre recogida 14 días después de la
primera inmunización, así como de 10, 20 y 30 días después de la
segunda administración del antígeno, no difería de las muestras
recogidas 2 días antes de la inmunización y de los sueros de los
ratones control.
La reactividad de las muestras de heces de los
ratones inmunizados, que se recogieron de 6 a 20 días después de la
segunda dosis de antígeno, era significativamente (p < 0,001)
mayor que en los extractos de las heces de los ratones control
(fig. 10). Del mismo modo, el análisis estadístico de los datos
obtenidos de cada ratón inmunizado mostraba un aumento significativo
de la reactividad de las muestras tomadas de las heces de los
ratones inmunizados 1, 2 y 3 (fig. 10) en relación con los tres
ratones control (ratón 1, p = 0,025; ratón 2, p < 0,01, ratón 3,
p = 0,001). La reactividad máxima de las muestras, observada en las
muestras de heces recogidas 6 días después de la segunda dosis era,
individualmente, 1,8, 2,2 y 3,7 veces superior a la reactividad
promedio observada en el grupo control. Por tanto, el ensayo de
ELISA demostró la presencia de anticuerpos de clase IgA frente al
antígeno E2 del VPPC en las heces de todos los animales
inmunizados. La capacidad para detectar estos anticuerpos usando
placas recubiertas con antígeno E2 producido en el sistema de
baculovirus sugiere la reactividad de los anticuerpos producidos
con un antígeno nativo del VPPC.
Los resultados obtenidos demuestran que los
anticuerpos de clase IgA se producían en el tubo digestivo de los
ratones inmunizados podían detectarse, posteriormente, en sus heces.
La producción de estos anticuerpos tenía in patrón característico,
similar en todos los animales inmunizados (fig. 10). Los primeros
anticuerpos producidos aparecían en las heces de los animales
inmunizados entre el 3^{er} y el 6° día tras la segunda dosis de
antígeno. Tras llegar a un máximo, el nivel disminuía de modo que
30 días después de la inmunización no eran detectables mediante
ELISA.
Los resultados experimentales indican que la
aplicación de dos dosis de 50 \mug del antígeno en cuerpos de
inclusión induce una respuesta en el sistema inmune de las
membranas mucosas del tubo digestivo, evidenciado por la producción
de IgA secretada (S-IgA). La falta de niveles
detectables de anticuerpos de clase IgG en el suero de los ratones
no es sinónimo de la falta de estimulación de la respuesta inmune
sistémica por un antígeno administrado por vía oral. Como demuestra
la inmunización parenteral, en muchos casos este sistema sensibiliza
de forma eficaz, aunque la producción de anticuerpos es
indetectable (Harlow E., Lane D. 1988). A diferencia de la
circulación de anticuerpos en el sistema inmunitario sistémico, los
anticuerpos producidos por las células plasmáticas de las membranas
mucosas tienen una función importante en la inmunidad a enfermedades
trasmitidas por las membranas mucosas, como la peste porcina. Esto
se ha demostrado mediante experimentos como la inmunización oral
con antígenos de Helicobacter pylori (descripción de la
invención WO 95122987, publicada el 31 de agosto de 1995) y otros
diversos antígenos bacterianos (McGhee J.R., Kyono, H. 1993). Así,
en el experimento realizado, se ha logrado el principal objetivo de
la inmunización oral, no conseguida a través de la inmunización
parenteral, lo que significa una estimulación del sistema inmune
asociado a las membranas mucosas, que podría proteger a estas
últimas frente a infecciones. A pesar de la falta de respuesta
sistémica discernible, el efecto obtenido de inmunización con el
antígeno E2 contenido en los cuerpos de inclusión parece ser
preferencial para experimentos como los de vacunas comestibles
frente al virus de Norwalk, virus causante de inflamación aguda del
estómago e intestino en humanos (Mason H.S. y col. 1996). De los
once ratones que reaccionaron con producción de anticuerpos
detectados en sangre tras la administración de raíces de patata que
expresaban proteínas de la cápside NV (NVCP), sólo un ratón produjo
niveles detectables de IgA intestinal.
Los resultados obtenidos demuestran que la
aplicación de cuerpos de inclusión para la inmunización de animales
a través del tubo digestivo no requiere la formulación de
vehículos diseñados específicamente que potencien la absorción del
antígeno a través de las células epiteliales y/o protejan al
antígeno frente a la degradación en el intestino, ni de adyuvantes
(factores usados con frecuencia en experimentos sobre vacunación
oral) para provocar una respuesta en el sistema inmunitario de las
membranas mucosas. Todo ello apunta a una interesante aplicación de
los cuerpos de inclusión que contienen el antígeno E2 como vacunas
veterinarias comestibles frente a la peste porcina.
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ANTYBIOTYKOW UNIWERSYTET GDANSKI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Cuerpos de inclusión como antígenos
para la vacunación oral de animales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PZ/0061/RW
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PL 358082
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 31/12/2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 973
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<212> ADN
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<213> sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (16)
1. Un polipéptido en forma de cuerpos de
inclusión producido en un organismo genéticamente modificado que
contiene la secuencia de aminoácidos de la proteína E2 de
pestivirus, preferiblemente del VPPC, carente del fragmento
transmembrana.
2. Un polipéptido de la reivindicación 1 que
contiene la secuencia codificada por la secuencia de SEQ ID NO: 1 o
SEQ ID NO: 2.
3. Una célula bacteriana transformada con la
construcción de expresión que contiene la secuencia que codifica la
secuencia de aminoácidos de la proteína E2 de pestivirus,
preferiblemente del VPPC, carente del fragmento transmembrana.
4. Una célula bacteriana de la reivindicación 3
que contiene la construcción que contiene la secuencia de SEQ ID
NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
5. Una célula bacteriana de la reivindicación 3
que es una cepa de E. coli.
6. Cuerpos de inclusión purificados que
contienen un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos
de la secuencia de la proteína E2 de pestivirus, preferiblemente
del VPPC, carente del fragmento transmembrana.
7. Cuerpos de inclusión purificados de la
reivindicación 6 que se producen en E. coli.
8. Cuerpos de inclusión purificados según la
reivindicación 6, caracterizados porque el polipéptido
contiene la secuencia codificada por la secuencia de SEQ ID NO: 1 o
SEQ ID NO: 2.
9. Un procedimiento para la producción de una
vacuna oral frente a una enfermedad causada por un pestivirus,
preferiblemente la peste porcina clásica, caracterizado
porque comprende la transformación de células de E. coli con
un vector de expresión, la expresión de un polipéptido codificado
por este vector, el aislamiento de los cuerpos de inclusión que
contienen el polipéptido producido que sirve para preparar una
vacuna, en el que el vector contiene la secuencia nucleotídica que
codifica la secuencia de aminoácidos de la secuencia de la proteína
E2 de pestivirus, preferiblemente del VPPC, carente del fragmento
transmembrana.
10. Un procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque la secuencia nucleotídica mencionada es
la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
11. Uso del polipéptido en forma de cuerpos de
inclusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 para la
preparación de una vacuna frente a una enfermedad causada por un
pestivirus, preferiblemente frente a la peste porcina clásica.
12. Una vacuna oral frente a una enfermedad
causada por un pestivirus, preferiblemente frente a la peste
porcina clásica, que contiene el antígeno y, posiblemente, un
vehículo y/o adyuvante farmacéuticamente permitido,
caracterizada porque el antígeno contiene un polipéptido
purificado que contiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia
de la proteína E2 de pestivirus, preferiblemente del VPPC, carente
del fragmento transmembrana.
13. Una vacuna según la reivindicación 12,
caracterizada porque el polipéptido se produce en un
organismo hospedador procariota genéticamente modificado.
14. Una vacuna según la reivindicación 12,
caracterizada porque el polipéptido está en forma de cuerpos
de inclusión.
15. Una vacuna según la reivindicación 12,
caracterizada porque el polipéptido contiene la secuencia
codificada por la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
16. Uso de los cuerpos de inclusión purificados
según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para la preparación
de una vacuna oral frente a una enfermedad causada por un
pestivirus, preferiblemente frente a la peste porcina clásica.
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2003
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