ES2588225T3 - Secuencias de ácido nucleico de un virus de pece y el uso de las mismas - Google Patents
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Abstract
Una secuencia de ácido nucleico aislada que se origina a partir del virus del SCM que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6 y variantes de las mismas que son al menos un 70 % idénticas a lo largo de la secuencia completa con cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6.
Description
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DESCRIPCION
Secuencias de acido nucleico de un virus de pece y el uso de las mismas
La presente invencion se refiere a secuencias de acido nucleico que se originan a partir de un virus que causa el smdrome de la cardiomioparia (SCM) en peces y el uso de las mismas en inmunologfa y diagnostico veterinario. Mas espedficamente, la invencion proporciona secuencias de acido nucleico que codifican protemas y el uso de las mismas en, ente otras cosas, vacunas recombinantes, vacunas de ADN y en proporcionar una vacuna viva recombinante. Las secuencias codificantes de protemas tambien son utiles respecto del desarrollo de procedimientos que proporcionan determinacion inmunologica de la infeccion por el virus del SCM. La invencion por lo tanto se refiere tambien a anticuerpos, y al uso de los mismos en inmunoensayos.
La presente invencion se refiere tambien a cebadores utiles en procedimientos para la deteccion del virus del SCM en una muestra de ensayo.
Finalmente, la presente invencion proporciona kit de diagnostico que comprenden protemas recombinantes, anticuerpos y cebadores, respectivamente.
Antecedentes de la invencion
El smdrome de la cardiomioparia (SCM) es una enfermedad que afecta principalmente al gran salmon atlantico en el segundo ano en agua marina proximo a su captura y por lo tanto, el impacto economico es significativo. Los peces afectados pueden fallecer repentinamente sin mostrar signos de enfermedad o pueden mostrar smtomas tales como un comportamiento de natacion anormal y anorexia. El SCM se diagnostica basandose en la histopatologfa, que muestra una inflamacion y degeneracion grave del miocardio esponjoso en la auricula y el ventriculo. Un posible efecto secundario de la alteracion circulatoria es la necrosis hepatica multifocal que se observa comunmente.
La causa del SCM ha sido desconocida durante mucho tiempo. Aunque se comunicaron inclusiones intracelulares y parriculas similares a virus, los informes no fueron consistentes segun se evidencio por una revision proporcionada en Kongtorp y col. Cardiomyopathy syndrome (CMS): a literature review, National Veterinary Institute, Noruega, noviembre de 2005. En 1997 Grotmol y col. comunicaron la presencia de parriculas similares a nodavirus en las celulas endoteliales en el corazon de salmones atlanticos a los que se habfa diagnosticado que padedan SCM. Las parriculas teman un diametro de 25 nm (Grotmol y col., 1997, Dis Aquat Org, vol 29, pags. 79-84).
Se ha comunicado la transmision experimental del smdrome de la cardiomioparia en el salmon atlantico, Salmo salar, vease Bruno y Noguera, Disease of Aquatic Organism, vol. 87: 235-242, 2009 y Fritsvold y col., Disease of Aquatic Organism, vol 87: 225-234, 2009.
Finalmente, se demostro la naturaleza infecciosa del SCM mediante el aislamiento y cultivo de un virus que causa el SCM en peces, segun se comunico en la solicitud de patente de Noruega NO 2008 2869. En particular, el documento NO 2008 2869 desvela un virus aislado que se deposito en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Agencia de Proteccion de la Salud, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (RU), SP4 0JG UK el 29 de marzo de 2007 con el numero de referencia 07032902.
El virus desvelado en la solicitud de patente de Noruega anteriormente mencionada puede tener la capacidad de introducir uno o mas smtomas seleccionados entre el grupo que consiste en: hemorragias cutaneas, escamas levantadas, exoftalmos, ascitis, proyeccion fibrinosa sobre la capsula hepatica, sangre o coagulos de sangre que rellenan la cavidad pericardica, roturas en la pared auricular cardfaca, dilatacion de la auricula cardfaca, compresion del ventriculo cardfaco, inflamacion del miocardio esponjoso en el epicardio y endocardio, lesiones hepaticas, incluyendo necrosis multifocal a anastomosante de los hepatocitos y un recubrimiento fibrinoso de la capsula y congestion del bazo y/o de las agallas.
Se ha proporcionado un entendimiento adicional del agente causante del SCM mediante el aislamiento y cultivo del virus del SCM desvelado en el documento NO 2008 2869. Las celulas hospedadoras para el cultivo del virus del SCM desveladas en el documento NO 2008 2869 han demostrado que dan como resultado una baja produccion del virus del SCM. Sigue habiendo una necesidad de un conocimiento adicional para ser capaces de desarrollar medios eficaces para controlar la enfermedad y para ser capaces de desarrollar vacunas eficaces, tales como vacunas recombinantes. Aunque el virus se aislo de manera exitosa y se conocen celulas hospedadoras para el cultivo del mismo a partir del documento NO 2008 2869, ha sido diricil la identificacion adicional y la provision de conocimiento del genoma y la secuencia del mismo debido a las caracteristicas inesperadas del genoma y a la organizacion del mismo.
Por lo tanto es un objeto de la presente invencion proporcionar secuencias de acido nucleico que se originan a partir del virus del SCM. Al proporcionar las secuencias de acido nucleico de la presente invencion, se proporcionan varias aplicaciones utiles de las mismas, tal como se indica a continuacion.
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Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona, por tanto, una secuencia de acido nucleico aislada que se origina a partir del virus del SCM que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6 y variantes de las mismas que son al menos un 70 % identicas con cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6 basandose en la longitud de secuencia completa de dicha secuencia de acido nucleico aislada.
De acuerdo con un aspecto, las secuencias de acido nucleico de la invencion son al menos un 80 %, preferentemente un 90 %, mas preferentemente un 95 % identicas al acido nucleico seleccionado entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6 basandose en la longitud de secuencia completa de dicha secuencia de acido nucleico aislada.
Otro aspecto de la invencion se refiere a un vector que comprende secuencias de acido nucleico de acuerdo con la presente invencion y celulas hospedadoras que comprenden dicho vector.
De acuerdo con otro aspecto de la invencion, se proporcionan vectores que comprenden acidos nucleicos seleccionados entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6 y variantes de las mismas que son al menos un 70 % identicas con cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 6 basandose en la longitud de secuencia completa de dicha secuencia de acido nucleico aislada que esta unida operablemente a secuencias de control que dirigen la expresion de dichas secuencias.
De acuerdo con otro aspecto mas de la invencion, se proporcionan vacunas de ADN que comprenden una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6, y variantes de las mismas que son al menos un 70 % identicas con cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 6 basandose en la longitud de secuencia completa de dicha secuencia de acido nucleico aislada.
Otro aspecto de la invencion se refiere a protemas recombinantes codificadas por una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6, y variantes de las mismas que son al menos un 70 % identicas con cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 6 basandose en la longitud de secuencia completa de dicha secuencia de acido nucleico aislada. Dichas protemas recombinantes de acuerdo con la presente invencion tienen de acuerdo con un aspecto de la invencion una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 7, o una variante de las mismas que sea al menos un 70 % identica a cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 7 basandose en la longitud de secuencia completa de dicha secuencia de acido nucleico.
La presente invencion tambien proporciona una vacuna recombinante que comprende la menos una de las protemas recombinantes de acuerdo con la presente invencion.
Ademas, de acuerdo con otro aspecto de la invencion, se proporciona un anticuerpo que reconoce y se une a una protema recombinante de acuerdo con la presente invencion. El anticuerpo es, de acuerdo con un aspecto, un anticuerpo monoclonal. De acuerdo con otro aspecto, el anticuerpo de la invencion es un anticuerpo policlonal.
De acuerdo con otro aspecto mas de la invencion, se proporciona un inmunoensayo para la deteccion del virus del SCM con un anticuerpo espedfico contra el virus del SCM en una muestra biologica, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
(a) poner en contacto al menos una de las protemas recombinantes de acuerdo con la presente invencion y una muestra biologica que se sospecha que contiene anticuerpos contra un virus del SCM; y
(b) determinar si la al menos una protema recombinante se une a un anticuerpo espedfico para el virus del SCM presente en la muestra biologica, en el que dicha union representa una indicacion de que el animal ha estado en contacto con el virus del SCM.
De acuerdo con otro aspecto mas de la invencion, se proporciona un inmunoensayo para la deteccion del virus del SCM en una muestra biologica, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
(a) poner en contacto uno o mas anticuerpos que reconocen espedficamente y se unen a una protema recombinante de acuerdo con la invencion y una muestra biologica que se sospecha que comprende un virus del SCM; y
(b) determinar si el anticuerpo se une al virus del SCM presente en la muestra biologica, en el que dicha union representa una indicacion de que la muestra contiene un virus del SCM.
La presente invencion tambien proporciona, de acuerdo con otro aspecto, un cebador que comprende una secuencia de al menos aproximadamente 10 nucleotidos, en el que dicho cebador hibrida con una secuencia de acido nucleico que se origina a partir del virus del SCM que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ iD NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6 y variantes o fragmentos de las mismas que son al menos un 70 % identicas con cualquiera de las secuencias de sEq ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6 basandose en
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la longitud de secuencia completa de dicha secuencia. El cebador de acuerdo con la presente invencion puede consistir, de acuerdo con un aspecto, en al menos 15 nucleotidos, preferentemente al menos 20 nucleotidos.
De acuerdo con otro aspecto mas de la invencion, se proporciona un procedimiento para la deteccion del virus del SCM en una muestra biologica, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas:
a) preparar una muestra biologica que comprende secuencias de acido nucleico aisladas a partir de una muestra biologica que se sospecha que comprende virus del SCM para una reaccion de transcripcion inversa con un cebador espedfico o aleatorio;
b) someter a la mezcla de a) a reaccion en cadena de la polimerasa con un par de cebadores espedficos para la secuencia de acido nucleico retrotranscrita correspondiente a la secuencia genomica del virus, en el que cada cebador de dicho par de cebadores hibrida con una secuencia de acido nucleico que se origina a partir del virus del SCM que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6 y variantes de las mismas que son al menos un 70 % identicas con cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SeQ ID NO: 6 basandose en la longitud de secuencia completa de dicha secuencia; y
c) determinar si se ha producido la union de los cebadores a secuencias de acido nucleico en la muestra y la amplificacion de la secuencia entre ellas indicando la presencia de virus del SCM en la muestra ensayada.
De acuerdo con un aspecto del procedimiento anterior, cada cebador del par de cebadores se selecciona entre un grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21.
Finalmente, la presente invencion se refiere al uso de las secuencias de acido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para la preparacion de una vacuna de ADN, una vacuna recombinante o un microorganismo vivo recombinante.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 desvela la secuencia genomica del virus del SCM correspondiente a la SEQ ID NO: 1.
La figura 2 desvela la secuencia de acido nucleico de la fase abierta de lectura 1 correspondiente a la SEQ ID NO: 2. La fase de lectura abierta 1 comprende la secuencia que comienza en el nucleotido en la posicion 445 y que codifica hasta la posicion de nucleotido 3028 de la SEQ ID NO: 1.
La figura 3 desvela la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia ilustrada en la figura 2, es decir, la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 3.
La figura 4 desvela la secuencia de acido nucleico de la fase abierta de lectura 2 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. La fase de lectura abierta 2 comprende la secuencia que comienza en el nucleotido en la posicion 3114 y que codifica hasta la posicion de nucleotido 5292 de la SEQ ID NO: 1.
La figura 5 desvela la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia ilustrada en la figura 4, es decir, la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 5.
La figura 6 desvela la secuencia de acido nucleico de la fase abierta de lectura 3 correspondiente a la SEQ ID NO: 6. La fase de lectura abierta 3 comprende la secuencia que comienza en el nucleotido en la posicion 5542 y que codifica hasta la posicion de nucleotido 6448 de la SEQ ID NO: 1.
La figura 7 desvela la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia ilustrada en la figura 6, es decir, la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 7.
La figura 8 muestra graficamente la organizacion genomica del virus de la miocarditis piscina (VMCP). El genoma incluye tres fases de lectura abiertas (ORF). Las ORF1 y ORF2 predichas se asemejan a dos fases abiertas de lectura solapantes. La ORF2 se traduce en forma de una protema de fusion con la ORF1 debido a un desplazamiento de fase de -1 ribosomico o en forma de una protema individual (se indica el codon de inicio). La ORF3 es una fase no solapante.
La figura 9 muestra protemas recombinantes codificadas por la ORF1 y la ORF3 y expresadas en E. coli separadas mediante electroforesis en gel. La figura 9A muestra la expresion de la oRF-1 y una ORF1 parcial (nucleotidos 1-852) en E. coli. La ORF1 (1-852) se expresa en forma de una protema de aproximadamente 30 kD (carriles 3 y 4), mientras que la protema de longitud completa es de aproximadamente 90 kD (carriles 6 y 7). Los carriles 2 y 5 son las fracciones de protema soluble del fermentado. Se hace correr una escala de tamano de protema en el carril 1. La figura 9B muestra a expresion de la ORF3. La ORF3 se expresa en forma de una protema de aproximadamente 30 kD (carriles 3 y 4). El carril 2 es la fraccion de protema soluble. Se hace correr una escala de tamano de protema en el carril 1.
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La figura 10 es una transferencia de Western que muestra que un antisuero provocado contra la protema recombinante de la ORF1 producida en E. coli reconoce una banda correspondiente a la protema de la ORF1 en homogenizado de corazon de salmon atlantico diagnosticado de SCM (carril 2). No se reconoce una banda de este tamano en homogenizado de corazon de un salmon atlantico sano (carril 3). Se hace correr una escala de tamano de protema en el carril 1.
La figura 11 esta formada por transferencias de Western que muestran la union de la ORF3 con suero de salmon atlantico de peces diagnosticados de SCM (A, panel izquierdo). El suero de control de salmon atlantico sano (B, panel derecho) no muestra union a la oRF3. Es visible cierta union inespedfica a una protema de aproximadamente 10-15 kD.
La figura 12 representa una representacion de dos variables que muestra la relacion entre la puntuacion histologica de la parte esponjosa del ventnculo cardfaco y la carga vmca (expresada como valores de Cp) en tejido cardfaco para la muestra 1 (n = 40).
La presente invencion y las diversas realizaciones de la misma se describiran en detalle a continuacion.
Descripcion detallada de la invencion
Definiciones
La presente invencion se refiere a secuencias de acido nucleico aisladas y a variantes o fragmentos de las mismas que son al menos un 70 % identicas a las secuencias de acido nucleico aisladas. Debe entenderse que la expresion "% de identidad" hace referencia al porcentaje de nucleotidos contenidos que son iguales en dos o mas secuencias o fragmentos de las mismas. Un porcentaje de nucleotidos puede citarse como, por ejemplo, un 70 % identico, 80 % identico, 85 % identico, 90 % identico, 95 % identico, 99 % identico o mas a lo largo de una region espedfica cuando se compara y alinea para maxima correspondencia. El experto en la materia reconocera que hay disponibles diversos medios para comparar secuencias. Por ejemplo, un ejemplo no limitante de un programa informatico para homologfa util para determinar el porcentaje de homologfa entre secuencias incluye el programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul y col., 1990, J. of Molec. Biol., 215:403-410, "The BLAST Algorithm; Altschul y col., 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, Karlin y Altschul 1990, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 87:2264-68; 1993, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5873-77).
Debe entenderse que la expresion "fragmentos o variantes de las mismas" usada respecto de las secuencias de acido nucleico y protemas recombinantes de acuerdo con la presente invencion abarca secuencias de acido nucleico y protemas recombinantes que difieren respecto de las secuencias aisladas de las SEQ ID NO: 1-7 en unicamente algunas adiciones, eliminaciones o alteraciones de aminoacidos o nucleotidos que tienen poco efecto, en caso de tenerlo, en la actividad funcional de las secuencias reivindicadas. El experto en la materia reconocera que pueden introducirse modificaciones de una secuencia de nucleotidos que codifica una protema que no alteren la secuencia de aminoacidos, por ejemplo, la sustitucion de un nucleotido que de como resultado que el triplete afectado por la sustitucion siga codificando el mismo aminoacido. Pueden introducirse dichas alteraciones para adaptar la secuencia de acido nucleico a los codones usados preferentemente por una celula hospedadora y de este modo potenciar la expresion de una protema recombinante deseada. Ademas, puede anadirse la adicion de secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos que facilitan la purificacion sin afectar a la actividad de la protema recombinante resultante.
El experto en la materia reconocera ademas que asimismo, las alteraciones de la secuencia de acido nucleico que dan como resultado modificaciones de la secuencia de aminoacidos de la protema recombinante que codifica pueden tener poco efecto, en caso de tenerlo, en la capacidad de la protema para inducir proteccion contra el virus del SCM si la alteracion no tiene impacto en la estructura tridimensional resultante de la protema recombinante. Por ejemplo, puede sustituirse un codon para el aminoacido alanina, un aminoacido hidrofobo, por un codon que codifica otro resto menos hidrofobo, tal como glicina, o un resto mas hidrofobo, tal como valina, leucina o isoleucina. De igual forma, tambien puede esperarse que los cambios que dan como resultado la sustitucion de un resto cargado negativamente, tal como acido aspartico por acido glutamico o un resto cargado positivamente por otro, tal como lisina por arginina produzcan una protema recombinante con sustancialmente la misma actividad funcional que la protema que tiene las secuencias de aminoacidos ilustradas en las SEQ ID NO: 3, 5 y 7 y por lo tanto esperarse que constituyan un producto biologicamente equivalente. Tampoco debe esperarse que los cambios de nucleotidos que den como resultado la alteracion de las partes N-terminal o C-terminal de la molecula de protema alteren la actividad funcional de la protema. Cada una de las modificaciones propuestas se encuentra dentro de las capacidades rutinarias de la tecnica, tales como la determinacion o retencion de la actividad biologica de los productos codificados. Por lo tanto, en los casos donde se usan las expresiones "secuencias de acido nucleico de la invencion" o "protema recombinante de la invencion" ya sea en la memoria descriptiva o en las reivindicaciones debe entenderse que abarcan todas estas modificaciones y variaciones que dan como resultado la produccion de una protema biologicamente equivalente.
Por lo tanto, la presente invencion abarca protemas recombinantes y fragmentos de la misma que difieren en sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoacidos respecto de las protemas recombinantes que tienen las
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secuencias de las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 7, respectivamente, pero que ejercen sustancialmente la misma actividad funcional que las protemas que tienen la secuencia de las sEq ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 7.
Debe entenderse que las expresiones y terminos "antigeno", "protema o peptido inmunogenico", "determinante antigenico" o "epftopo", cuando se usan en relacion a la presente invencion se refieren a una protema recombinante
0 fragmento de la misma de acuerdo con la invencion que es capaz de inducir proteccion contra el SCM en peces o que es capaz de unirse a un anticuerpo que reconoce y se une al virus del SCM. Un fragmento de una protema recombinante que tiene una secuencia ilustrada en la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 7, respectivamente, puede constituir dicho antigeno o epftopo. Un ejemplo no limitante de un fragmento de la presente invencion es, por ejemplo, un fragmento formado por, por ejemplo, 8-11 aminoacidos de la secuencia de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7.
El termino "vacuna", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un material que puede producir una respuesta inmunitaria que bloquea la infectividad, ya sea parcial o completamente, de un agente infeccioso, que con respecto a la presente invencion es el virus del smdrome de la cardiomiopatfa que afecta a peces, tales como, por ejemplo, los salmonidos. Por lo tanto, cuando se administran a un pez las vacunas de la invencion, este se inmuniza contra la enfermedad causada por el virus del SCM. El componente inmunizante de la vacuna puede ser, por ejemplo, ADN como en una vacuna de ADN, una protema recombinante o un fragmento de la misma de acuerdo con la presente invencion o un microorganismo vivo recombinante.
Tal como se indica a continuacion, la presente invencion tambien proporciona cebadores (es decir, secuencias de oligonucleotidos) utiles en tecnicas de reaccion en cadena de la polimerasa para su uso como herramientas diagnosticas. El termino "cebador", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleotido bien de origen natural (por ejemplo, en forma de un fragmento de restriccion) o producido sinteticamente que es significativamente complementario a una secuencia diana del virus del SCM y por lo tanto es capaz de hibridar con secuencias de acido nucleico de la presente invencion. El cebador puede estar marcado para facilitar la deteccion, por ejemplo, usando marcadores fluorescentes u otros medios de marcado bien conocidos por los expertos en la materia.
Descripcion detallada de las realizaciones de la invencion
Secuencias de acido nucleico
Los presentes inventores han proporcionado las secuencias genomicas del virus del SCM. Se infectaron celulas GF-
1 con homogenizado obtenido a partir de salmon que se sospechaba que estaba infectado con el virus del SCM. Se recogio el sobrenadante de cultivo, se sedimento mediante centrifugacion y se sometio a tratamiento de DNasa y RNasa. Se aislo el ARN y se sintetizo ADNc usando cebadores aleatorios. A continuacion, se proporciono ADN bicatenario y se amplifico mediante la PCR usando cebadores aleatorios y se secuenciaron y analizaron los productos obtenidos para obtener parte de la secuencia genomica de acuerdo con la presente invencion ilustrada en la figura 1 y en la SEQ ID NO: 1. La secuencia del resto del genoma se obtuvo mediante la PCR con cebadores espedficos y RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends, amplificacion rapida de extremos de ADNc) 3' y 5'.
El analisis adicional de la SEQ ID NO: 1 por los presentes inventores revelo tres fases de lectura abiertas que se cree que incluyen la region codificante para tres protemas vfticas. Las comparaciones de secuencia con otras secuencias vmcas conocidas ha revelado que la fase abierta de lectura 1 (SEQ ID NO: 2) de acuerdo con la presente invencion muestra una homologfa muy debil con otras secuencias vmcas. Ademas, El analisis de la fase abierta de lectura 1 (SEQ ID NO: 3) indica que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una protema de la envuelta. La secuencia de aminoacidos de la fase abierta de lectura 1 se muestra en la figura 3 y en la SEQ ID NO: 3. Dicha secuencia muestra una homologfa unicamente debil con otras protemas conocidas. (Poilos y col., 2006, Jour. General Virology, 87, 987-996, Tang y col., 2008, PNAS, 105:45, 17526-17531).
Una secuencia de acido nucleico aislada adicional de la invencion (fase abierta de lectura 2, SEQ ID NO: 4) comprende una secuencia que codifica una ARN polimerasa dependiente de ARN y la secuencia de aminoacidos de la misma se ilustra en la figura 5 y en la SEQ ID NO: 5. La comparacion con otras secuencias codificantes de polimerasas vmcas conocidas demuestra que esta secuencia es debilmente identica a una polimerasa de totivirus, en particular, a una de Giardia lamblia virus que pertenece a los Totiviridae cuando se lleva a cabo una busqueda de homologfa con el programa BLAST (n.° de referencia AAB01579).
La tercera fase abierta de lectura (SEQ ID NO: 6) de la invencion comprende una secuencia que se cree que tambien incluye la secuencia codificante de una protema de envuelta, cuya secuencia de aminoacidos se lustra en la figura 6/SEQ ID NO: 6. Sorprendentemente, dicha secuencia solo muestra una homologfa debil con otras protemas de envuelta vftica y ningun otro miembro de la familia Totiviridae comprende esta fase abierta de lectura concreta. (Poilos y col., 2006, Jour. General Virology, 87, 987-996).
Al proporcionar las secuencias anteriores, se logra un progreso adicional respecto del control y prevencion del smdrome de la cardiomiopatfa en peces. Las secuencias de las fases abiertas de lectura 1 y/o 3 (SEQ ID NO: 2 y 6) puede conformar la base para el desarrollo de protemas recombinantes para su uso en una vacuna, o el desarrollo
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de vacunas de ADN o de un microorganismo vivo recombinante.
Las protemas recombinantes codificadas por secuencias basadas en las fases abiertas de lectura 1 y 3 tambien pueden formar la base para el desarrollo de herramientas diagnosticas, es decir, mediante la produccion de anticuerpos y el desarrollo de inmunoensayos para la deteccion de la presencia del virus del SCM en muestras biologicas.
Finalmente, las secuencias proporcionadas pueden formar la base para el desarrollo de herramientas diagnosticas en las que las secuencias de acido nucleico o los fragmentos de las mismas se usan para detectar la presencia del virus del SCM en peces.
Las diversas realizaciones de la invencion que son el resultado de proporcionar las secuencias de acido nucleico de la invencion se indican adicionalmente a continuacion. El experto en la materia reconocera que dichas realizaciones no deben entenderse como limitantes del ambito de las secuencias de acido nucleico reivindicadas. Se entiende que estan cubiertos por el ambito de la presente invencion otros usos de las secuencias de acido nucleico reivindicadas.
Prote^nas recombinantes
De acuerdo con un aspecto de la invencion, la invencion proporciona protemas recombinantes del virus de la cardiomiopatfa.
El experto en la materia esta familiarizado con las diversas tecnicas biotecnologicas disponibles que proporcionan la expresion de secuencias de acido nucleico aisladas para la preparacion de protemas recombinantes mediante expresion heterologa en diversos sistemas de celulas hospedadoras que usan tecnicas de ingeniena genetica comunmente disponibles y sistemas de expresion de ADN recombinante. Se conocen diversos protocolos para la expresion de protemas recombinantes, vease, por ejemplo, "Recombinant Gene Expression Protocols, en Methods in Molecular Biology, 1997, Ed. Rocky S Tuan, Human Press (ISSN 1064-3745) o Sambrook y col., Molecular Cloning: A laboratory Manual (tercera edicion), 2001, CSHL Press, (ISBN 978-087969577-4). Por ejemplo, las secuencias de acido nucleico de las fases abiertas de lectura 1 y 3 o fragmentos o variantes de las mismas pueden insertarse en vectores de expresion adecuados que comprenden todas las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales necesarias adaptadas espedficamente para dirigir la expresion de la secuencia de acido nucleico codificante de la protema en una celula hospedadora adecuada. Los vectores de expresion adecuados son, por ejemplo, plasmidos, cosmidos, virus o cromosomas de levadura artificiales (YAC). Una lista no limitante de ejemplos de sistemas de vector de expresion adecuados es, por ejemplo, los vectores de tipo pET (disponibles a traves de Invitrogen), vectores pcDNA3.1 (disponibles a traves de Invitrogen), o los vectores de expresion de tipo pBR, pUC o pGEM. Entonces se introduce el vector de expresion obtenido que incluye las fases abiertas de lectura (SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 6) o un fragmento de las mismas en celulas hospedadoras adecuadas para la produccion de la protema recombinante deseada.
De acuerdo con una realizacion de la invencion, se proporciona un vector que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6, y variantes o fragmentos de las mismas que son al menos un 70 % identicas con cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 6 unidas operablemente a secuencias de control que dirigen la expresion de dichas secuencias. La expresion "unida operablemente" significa que la secuencia deseada que codifica una protema recombinante esta unida a todas las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales necesarias adaptadas espedficamente para dirigir la expresion de la secuencia de acido nucleico codificante de protema deseada en una celula hospedadora.
Debe entenderse que pueden introducirse diversas modificaciones en las secuencias de acido nucleico de la presente invencion utilizando tecnicas bien conocidas para los expertos en la materia, por ejemplo, para facilitar la expresion. Mediante el uso de mutagenesis de sitio dirigido o de smtesis, puede introducirse una modificacion para adaptar la secuencia codificante al hospedador deseado para que exprese la secuencia y de este modo produzca la protema recombinante. El experto en la materia es consciente del hecho de que la presencia de codones espedficos para el hospedador y de que la adaptacion de una secuencia de acido nucleico heterologa para los codones espedficos del hospedador aumenta la eficacia de la expresion. Tambien pueden introducirse otras modificaciones, por ejemplo, para facilitar el aislamiento y la purificacion, es decir, anadiendo una secuencia que codifica un peptido o protema util para dichos fines. Asimismo, tambien pueden unirse secuencias de acido nucleico que codifican peptidos de senal que posibilitan la secrecion de la protema recombinante deseada por la celula hospedadora a secuencias de acido nucleico de la presente invencion. En caso de que la protema recombinante se exprese en un microorganismo vivo recombinante (vease mas adelante), puede modificarse la secuencia de acido nucleico para permitir el anclaje de la protema recombinante en la membrana o pared celular del microorganismo, dando como resultado la presentacion de la protema recombinante sobre la superficie del microorganismo vivo recombinante. De acuerdo con dicha realizacion de la invencion, se modifica la secuencia de acido nucleico de la presente invencion anadiendo una secuencia que codifica una protema o peptido que da como resultado el anclaje de la protema recombinante resultante en la membrana o la pared celular del microorganismo vivo recombinante.
La presente invencion proporciona, por lo tanto, vectores que comprenden la secuencia de acido nucleico ilustrada en la figura 2 y/o 6 (SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6) o variantes o fragmentos de las mismas. La presente invencion
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tambien proporciona celulas hospedadoras que comprenden los vectores de la invencion.
Pueden usarse varias celulas hospedadoras disponibles comercialmente adaptadas espedficamente a la produccion de protemas recombinantes que son tanto celulas hospedadoras procariotas como celulas hospedadoras eucariotas. Los ejemplos no limitantes de celulas procariotas adecuadas son, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacilus sp, Caulobacter cresentus, Yersinia ruckeri, o Vibrio anguillarum. Los ejemplos no limitantes de celulas eucariotas adecuadas son, por ejemplo, levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae o celulas de ovario de hamster chino. Tambien pueden usarse virus para la producir la expresion recombinante de una protema deseada, veanse, por ejemplo, los sistemas de vector de alfavirus, adenovirus o baculovirus (sistemas de expresion de baculovirus Bac-to-Bac®, Invitrogen, sistema de expresion en levadura PichiaPink™, Invitrogen).
De acuerdo con una realizacion de la invencion, se usa un vector pET disponible a traves de Invitrogen y adaptado espedficamente para la expresion de protemas recombinantes en Escherichia coli.
Tambien puede proporcionarse una protema recombinante usando sistemas de expresion sin celulas. Pueden usarse protemas recombinantes que sean el resultado de la expresion de las fases abiertas de lectura 1 o 3 (SEQ ID NO: 2 o 6) o fragmentos o combinaciones de las mismas en una vacuna para obtener proteccion contra infecciones adicionales por virus CMV.
Composicion de vacuna recombinante
Pueden usarse protemas recombinantes preparadas mediante expresion heterologa de secuencias de acido nucleico de acuerdo con la presente invencion como componentes inmunogenicos de una composicion de vacuna recombinante.
La presente invencion proporciona, por lo tanto, una composicion de vacuna que comprende al menos una protema recombinante que tiene una secuencia de aminoacidos como la ilustrada en la figura 3 o la figura 7 (SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 7), o fragmentos o variantes de la misma.
De acuerdo con un aspecto de la invencion, la al menos una protema recombinante usada en una vacuna consiste en un fragmento de la protema de la envuelta codificada por las secuencias de las fases abiertas de lectura 1 o 3 que inducen una respuesta inmunitaria en el individuo al que se administra la vacuna recombinante de la invencion. Dichos fragmentos pueden formar un epftopo de la protema de la envuelta codificada por las fases abiertas de lectura 1 o 3, tambien conocido como un determinante antigenico. El experto en la materia esta familiarizado con el hecho de que las protemas de la envuelta de un virus pueden comprender uno o mas epftopos que forman parte de la protema de la envuelta que son reconocidos por el sistema inmunitario y por lo tanto dan como resultado el desarrollo de proteccion contra infecciones adicionales. Los epftopos pueden encontrarse como una secuencia lineal continua de aminoacidos, tal como de 8-11 aminoacidos, en una protema de la envuelta u otra estructura de la superficie de un organismo patogeno. Dicho epftopo se denomina comunmente epftopo lineal. Un epftopo de una protema de la envuelta puede ser tambien el resultado de una estructura tridimensional de la protema de la envuelta, por ejemplo, formado por el ensamblaje de aminoacidos de la secuencia que no son consecutivos. Dichos epftopos se denominan comunmente epftopos discontinuos, y a menudo son mayores que un epftopo lineal.
Los epftopos lineales y continuos comprendidos en las fases abiertas de lectura 1 y 3 de la invencion pueden determinarse mediante el uso de tecnologfas de mapeo epitopico disponibles para los expertos en la materia, vease, Methods in Molecular Biology: Epitope Mapping Protocols, 1996, vol. 66, Ed. Glenn E Morris, Human Press (ISBN 978-0-89603-375-7). Debe entenderse que las vacunas que comprenden protemas recombinantes de acuerdo con la presente invencion que estan formadas por epftopos protectores de las protemas de la envuelta del virus del SCM preparadas mediante la expresion de fragmentos de las fases abiertas de lectura 1 o 3 o variantes o fragmentos de las mismas, estan abarcadas por el ambito de la presente invencion. Mas espedficamente, son particularmente interesantes los epftopos que son reconocidos por anticuerpos neutralizantes.
Se prefieren los epftopos que se encuentran en aquellas partes de las protemas recombinantes de acuerdo con la presente invencion que son particularmente espedficos para el virus del SCM.
La composicion de vacuna recombinante de acuerdo con la invencion que comprende protemas recombinantes o fragmentos de las mismas tal como se ha indicado anteriormente puede comprender ademas un adyuvante. Los ejemplos de adyuvantes usados frecuentemente en peces y en la cna de moluscos son dipeptidos de muramilo, lipopolisacaridos, varios glucanos y glicanos, aceite mineral, Montanide™ y Carbopol®. Se proporciona una descripcion general extensiva de adyuvantes utiles para vacunas para peces y moluscos en el artmulo de revision de Jan Raa, 1996, Reviews in Fisheries Science 4(3): 229-228.
La vacuna de la invencion puede comprender ademas un transportador farmaceutico adecuado. En una realizacion actualmente preferida, la vacuna se formula como una emulsion de agua en aceite. La vacuna puede comprender ademas lo que se denomina un "vehmulo". Un vehmulo es un dispositivo al que se adhiere el antfgeno, sin unirse covalentemente a este. Dichos vehmulos son, entre otras cosas, nano/micropartmulas o capsulas de PLGA (acido poli-lactida-co-glicolico), alginato o quitosano, liposomas, niosomas, micelas, multiples emulsiones y macrosoles, todos conocidos en la tecnica. Una forma especial de dicho vehmulo, en la que el antfgeno esta parcialmente
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incluido en el vehmulo, es el denominado ISCOM (Patentes Europeas EP 109.942, EP 180.564 y EP 242.380).
Ademas, la vacuna puede comprender uno o mas compuestos tensioactivos o emulsionantes adecuados, por ejemplo, Cremophore®, Tween® y Span®. Tambien pueden usarse adyuvantes tales como interleucina, CpG y glicoprotemas.
Debe entenderse que la vacuna puede estar ademas en una formulacion que comprende un antfgeno de una fuente bacteriana, un material antigenico obtenido a partir de una fuente vmca distinta del virus de peces como se ha definido anteriormente, un material antigenico obtenido a partir de una fuente parasitica y/o un material antigenico obtenido a partir de una fuente fungica. Se conocen en la tecnica vacunas polivalentes que contienen antigenos de patogenos de peces tfpicos distintos del virus del SCM y ya estan disponibles comercialmente. Ademas, hay disponibles a traves de diversas fuentes aislados representativos de patogenos de peces relevantes.
En realizaciones particulares de la invencion, dicho antigeno procedente de una fuente bacteriana se selecciona entre el grupo que consiste en: bacterias vivas, atenuadas o muertas de las especies Piscirickettsias sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Listonella sp., Moritella viscosa, Photobacterium damsela, Flavobacterium sp., Yersinia sp., Renibacterium sp., Streptococcus sp., Lactococcus sp., Leuconostoc sp., Bifidobacterium sp., Pediococcus sp., Brevibacterium sp., Edwarsiella sp., Francisella sp., Pseardomonas sp., Cytophaga sp., Nocardia sp., Mycobacerium sp., partes o subunidades de estas bacterias y cualquier combinacion de las mismas.
Hay disponibles aislados de dichas bacterias, por ejemplo, a traves de LGC Promochem/repositorio y centro de distribucion de la ATCC, American Type Culture Collection, incluyendo cepas de A. salmonicida (ATCC 33658), V. salmonicida (ATCC 43839), V. anguillarum serotipo O1 (ATCC 43305) y O2 (ATCC 19264), y Moritella viscosa (ATCC BAA-105). Ademas, se han depositado cultivos de Piscirickettsias salmonis en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Agencia de Proteccion de la Salud, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (RU), sP4 0JG UK el 9 de junio de 2006 con los siguientes numeros de registro: 06050901, 06050902, 06050903 y 07032110.
Otra realizacion espedfica se refiere a una vacuna, en la que dicho material antigenico obtenido a partir de una fuente vmca distinta del virus de peces definido anteriormente es de un virus seleccionado entre el grupo que consiste en: virus de la septicemia hemorragica vmca (VSHV), virus de la septicemia hemorragica vmca (VSHV), virus de la necrosis hematopoyetica infecciosa (VNHI), virus de la necrosis pancreatica infecciosa (VNPI), viremia primaveral de la carpa (VPC), virus del bagre de canal (VPGC), virus de la anemia del salmon infecciosa (VASI), virus de la enfermedad pacreatica (VEPS), Iridovirus, y el virus de la inflamacion del corazon y el musculo esqueletico (VICME), partes o subunidades de uno cualquiera de estos virus, y combinaciones de los mismos. Hay disponibles especies representativas de dichos virus para los expertos en la materia, por ejemplo, a traves de los siguientes depositos: virus de la necrosis pancreatica infecciosa (VNPI, ATCC VR-1318, pafs de origen: desconocido), virus de la septicemia hemorragica vmca (VSHV, ATCC VR_1389, pafs de origen: Dinamarca); virus de la necrosis hematopoyetica infecciosa (VNHI, ATCC VR-1392, pafs de origen: EE.UU.)); virus de la necrosis pancreatica; viremia primaveral de la carpa (VPC, ATCC VR-1390, pafs de origen: Dinamarca); virus del bagre de canal (VPGC) (ATCC VR-665, pafs de origen: EE.UU.); virus de la anemia del salmon infecciosa (ASI) (ATCC VR- 1554, pafs de origen: Canada).
Anteriormente, se han efectuado depositos de patente por los presentes solicitantes acerca de las siguientes especies vmcas: virus de la inflamacion del corazon y el musculo esqueletico (VICME, deposito de patente n.° ECACC 04050401, pafs de origen: Noruega).
En realizaciones mas espedficas, dicho material antigenico obtenido a partir de una fuente vmca distinta del virus de peces definido anteriormente es del grupo que consiste en: glucoprotema del virus de la septicemia hemorragica vmca (VSHV), nucleoprotema del virus de la septicemia hemorragica vmca (VSHV), glucoprotema del virus de la necrosis hematopoyetica infecciosa (VNHI), protemas estructurales del virus de la necrosis pancreatica infecciosa (VNPI), protema G de la viremia primaveral de la carpa (VPC), y una protema asociada a membrana, tegumina o protema de la capside o glucoprotema del virus del bagre de canal (VPGC), fragmentos antigenicos de una cualquiera de estas protemas y combinaciones de las mismas.
En otras realizaciones, dicho material antigenico de una fuente parasitica es de una fuente seleccionada entre el grupo que consiste en Lepeophtheirus Sp., Caligus Sp., y Ichthyophthirius Sp, partes de uno cualquiera de estos parasitos, y combinaciones de los mismos.
En otras realizaciones mas, dicho material antigenico es de una fuente fungica seleccionada entre el grupo que consiste en Saprolegnia Sp., Branchiomyces sanguinis, Branchiomyces demigrans e Icthyophonus hoferi.
La vacuna de acuerdo con la invencion puede formularse, en particular, para su administracion a un pez. Mas espedficamente, la vacuna puede ser (o formulares) para su administracion a un teleosteo. Los teleosteos incluyen, pero sin limitacion, salmonidos, perciformes, doradas, bacalao, pargos, platijas, bagre, jureles y tilapias.
En una realizacion preferida en el presente documento, la vacuna se formula para su administracion al salmon atlantico (Salmo Salar L.), a la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) y/o al salmon plateado (Oncorhychus kisutch).
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En realizaciones adicionales de la invencion, la vacuna se formula para su administracion a traves de una v^a seleccionada entre el grupo que consiste en: bano, inmersion, inyeccion intraperitoneal, inyeccion intramuscular y administracion oral. Opcionalmente, la vacuna se administrara a peces jovenes en su etapa de agua dulce.
Microorganismo vivo recombinante
De acuerdo con otra realizacion de la invencion, tambien pueden usarse las secuencias de las fases abiertas de lectura 1 y/o 3 para desarrollar un microorganismo vivo recombinante para su uso en una vacuna contra la infeccion por el virus del SCM. Un organismo vivo recombinante funciona como transportador para la informacion genetica de acuerdo con la presente invencion mediante la insercion de las fases abiertas de lectura 1 o 3 o variantes o fragmentos de las mismas. Dichas fases abiertas de lectura o variantes o fragmentos de las mismas puede insertarse en el microorganismo de un modo que hace que el microorganismo sea capaz de expresar dichas secuencias de acido nucleico. Las secuencias de acido nucleico o las variantes o fragmentos de las mismas de acuerdo con la invencion pueden insertarse en el genoma del microorganismo o mediante la introduccion de un vector que comprende las secuencias de acido nucleico deseadas. El microorganismo vivo recombinante puede ser, por lo tanto, un portador de secuencias de acido nucleico que codifican las protemas recombinantes o variantes o fragmentos de las mismas de acuerdo con la presente invencion. Tal como se menciona anteriormente, el organismo vivo recombinante puede, por ejemplo, portar una o mas protemas recombinantes de acuerdo con la presente invencion en su superficie, por ejemplo, en el que dichas protemas recombinantes se anclan en la membrana o en la pared celular del organismo vivo recombinante.
El microorganismo vivo recombinante puede ser, por ejemplo, un virus, una bacteria o un parasito. El microorganismo vivo recombinante puede funcionar del mismo modo que una vacuna viva para peces, es decir, el microorganismo se replicara en el pez diana y dara como resultado una respuesta inmunologica contra las protemas recombinantes codificadas por los acidos nucleicos de la invencion.
El microorganismo vivo recombinante puede tener la ventaja de cultivarse de manera eficaz y por lo tanto optimizarse para procedimientos de fermentacion deseados y para la produccion de alto rendimiento de la vacuna.
El experto en la materia sera capaz, mediante el uso de tecnicas biotecnologicas comunes para clonacion y construccion de organismos recombinantes, de construir un microorganismo vivo recombinante de acuerdo con la presente invencion.
El microorganismo vivo recombinante tambien puede ser el portador de acido nucleico que codifica otros patogenos de peces, proporcionando de este modo proteccion contra una diversidad de patogenos. El organismo vivo recombinante puede incluir de este modo acidos nucleicos que codifican, por ejemplo, protemas de la envuelta o fragmentos de las mismas de otros virus de peces, tales como, por ejemplo, VASI, VNPI, VNHI o VICME.
De acuerdo con una realizacion de la invencion, el microorganismo vivo recombinante es un virus capaz de replicarse en peces, preferentemente salmonidos. Por ejemplo, puede usarse el VNHI como microorganismo vivo recombinante, vease, el documento WO 03/097090 que comunica el uso de un novirhabdovirus modificado para obtener vacunas. Tambien se sugiere el uso de microorganismos vivos recombinantes como portadores para acidos nucleicos que codifican antfgenos para otros patogenos de peces, por ejemplo, en el documento WO 2007/031572.
Una composicion de vacuna que comprende un microorganismo vivo recombinante puede comprender ademas, respecto de la vacuna recombinante descrita anteriormente, adyuvantes, transportador, compuestos tensioactivos o emulsionantes como aquellos descritos anteriormente. Ademas, es igualmente aplicable la ventaja de combinar diferentes componentes de vacuna a la vacuna viva recombinante de acuerdo con la presente invencion en cuanto a la composicion de vacuna recombinante desvelada anteriormente.
Vacuna de ADN
De acuerdo con un aspecto de la invencion, se proporciona una vacuna de ADN que comprende acidos nucleicos de acuerdo con la presente invencion.
Las vacunas de ADN se basan en la administracion a un paciente de secuencias de acidos nucleico que codifican un antfgeno, y el que la expresion de dichos acidos nucleicos da como resultado una respuesta inmunitaria en dicho paciente. Para los fines de la presente invencion, el paciente es un pez. Una vacuna de ADN puede consistir en un plasmido de ADN desnudo que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica el antfgeno deseado de un patogeno unida operablemente a secuencias promotoras adecuadas y otras secuencias de control adecuadas que posibilitan la expresion de dicha secuencia de acido nucleico por celulas del paciente despues de la administracion de la misma. Una vacuna de ADN tambien puede estar portada en un microorganismo hospedador que este implicado en el suministro del material genetico al paciente.
Se conocen diversas vacunas de ADN para combatir patogenos de peces. Heppell y col. comunica la proteccion contra virus vivos despues de la inyeccion de una vacuna de ADN que comprende los genes G y N del virus de la septicemia hemorragica vmca clonados en un plasmido de expresion e inyectados en truchas arco iris (Fish and Shellfish Immunology, 1998, vol 8, 4a edicion, pags. 271-286). Lorenzen y LaPatra describen una vacuna de ADN
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contra un rabdhovirus de peces en "DNA vaccines for aquacultured fish", Rev. sci.tech. Off int. Epiz., 2005 (1), 201213. Ademas, se comunica una vacuna de ADN que da como resultado efectos protectores por Mikalsen y col., 2005, "Protective effects of a DNA vaccine expressing the infectious salmon anaemia virus hemagglutinin esterase in Atlantic salmon", Vaccine, 23:30, pags. 4895-4905.
En el documento EP 818 406 A1, se describe un sistema de expresion de ADN que puede usarse para producir una vacuna de ADN que previene enfermedades infecciosas en animales acuaticos, en el que la expresion esta dirigida por un promotor de citomegalovirus.
El documento WO 2007/31572 desvela, entre otras cosas, una vacuna de ADN util para combatir infecciones por VASI en salmonidos.
El documento WO 2009/002376 desvela una vacuna de ADN util para combatir infecciones vmcas en carpas (virus de la viremia primaveral de la carpa).
El documento EP 2 011 876 se refiere al desarrollo de vacunas de ADN para peces utiles para combatir la enfermedad del Herpes KOI que afecta a las carpas.
Basandose en la tecnica anterior y el conocimiento general comun citado anteriormente, el experto en la materia es capaz de construir una vacuna de ADN que comprende la fase abierta de lectura 1 o 3 de la presente invencion o fragmentos o variantes de la misma que utilizan procedimientos usados comunmente en el campo de la ingeniena genetica.
Las vacunas de ADN que consisten en un plasmido desnudo que comprende las fases abiertas de lectura 1 o 3 o fragmentos o variantes de las mismas pueden administrarse a peces mediante inyeccion intramuscular o suministro mediado por partmulas mediante un canon de genes. Este ultimo implica el recubrimiento de pequenas partmulas de oro con la vacuna de ADN, y despues se efectua la administracion mediante suministro intradermico mediado por aire a presion. Se prefiere la inyeccion intramuscular de una vacuna de ADN de acuerdo con la presente invencion ya que es mas economico que el procedimiento del canon de genes, vease, Lorenz y LaPatra, anteriormente citado. Ademas, se desvelan procedimientos para la administracion de vacunas de ADN a peces en "Intramuscular Injection of DNA vaccines in Fish" por Heppel y Davis en "DNA Vaccines: Methods and Protocols", Methods of Molecular Medicine, 2000, vol. 29 (ISBN 978-0-89603-508-5).
Anticuerpos e inmunoensayos
Las protemas recombinantes de acuerdo con la presente invencion pueden usarse para obtener anticuerpos capaces de unirse a un virus del SCM y por lo tanto son utiles en procedimientos inmunologicos disenados para la determinacion del virus del SCM en muestras biologicas.
Otro aspecto de la invencion se refiere, por lo tanto, a un antisuero o a un anticuerpo o anticuerpos aislados (monoclonales o policlonales) que se unen selectivamente a un virus del SCM o a un componente o parte de dicho virus. El antisuero se obtiene de manera convencional, por ejemplo, inmunizando a un animal de laboratorio con el determinante antigenico adecuado. Una vez que la concentracion de anticuerpos en el suero del animal ha alcanzado un nivel deseado, se exanguina al animal. El suero obtenido de este modo debe contener anticuerpos producidos en respuesta al estfmulo inmunogenico.
Igualmente, los expertos en la materia conocen tecnicas para la preparacion de anticuerpos. Las tecnicas incluyen la tecnologfa de hibridoma tradicional y tecnicas alternativas, tales como presentacion de ARNm, presentacion ribosomica, presentacion en fagos y presentacion covalente.
En algunas realizaciones de la invencion, el anticuerpo aislado comprende un marcador, por ejemplo, una radioetiqueta, una etiqueta fluorescente, una etiqueta quimioluminiscente o una enzima. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. Los expertos en la materia conocen protocolos para el etiquetado de anticuerpos mediante el acoplamiento de los diversos marcadores mencionados anteriormente.
Para una proteccion suficiente y el control de la enfermedad causada por el virus del SCM, se necesitan medios para el diagnostico eficaz del virus del SCM. La presente invencion proporciona, por lo tanto, inmunoensayos utiles para el diagnostico del virus del SCM en peces. Un inmunoensayo dentro del significado de la presente invencion es una prueba bioqmmica que mide la presencia y/o concentracion del virus del SCM en una muestra biologica, tal como, por ejemplo, suero. Por lo tanto, un inmunoensayo utiliza la union espedfica de un anticuerpo a su antfgeno. Tanto la presencia de antfgenos (por ejemplo, presentes en el virus del SCM) como la presencia de anticuerpos contra el virus del SCM puede medirse en la muestra biologica.
La presente invencion proporciona ademas un inmunoensayo para la deteccion del virus del SCM en una muestra biologica, que comprende (a) poner en contacto las protemas recombinantes de acuerdo con la presente invencion y una muestra biologica que se sospecha que contiene anticuerpos contra un virus del SCM; y (b) determinar si los uno o mas anticuerpos se unen a un virus del SCM presente en la muestra biologica, en el que dicha union representa una indicacion de que la muestra contiene un virus del SCM.
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De acuerdo con otro aspecto de la invencion, se proporciona un inmunoensayo para la deteccion del virus del SCM en una muestra biologica, que comprende (a) poner en contacto uno o mas anticuerpos que reconocen espedficamente y se unen a una protema recombinante de acuerdo con la invencion y una muestra biologica que se sospecha que comprende un virus del SCM; y (b) determinar si el anticuerpo se une al virus del SCM presente en la muestra biologica, en el que dicha union representa una indicacion de que la muestra contiene un virus del SCM.
El complejo formado en el inmunoensayo de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo, la union de un anticuerpo a un virus CMV en una muestra biologica o la union de un anticuerpo presente en una muestra biologica a una protema recombinante o fragmento de la misma de acuerdo con la presente invencion, puede determinarse mediante, por ejemplo, densitometna, fluorimetna, colorimetna o similares.
Los inmunoensayos de la invencion tal como se ha descrito anteriormente pueden ser un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) convencional. El experto en la materia sera capaz de proporcionar protocolos de ELISA usando anticuerpos desarrollados contra las protemas recombinantes de acuerdo con la presente invencion, o las protemas recombinantes. A este respecto, se hace referencia a la grna de ELISA, Methods in Molecular biology, vol. 149, editado por John R Crowther, Humana Press, 2001.
La presente invencion tambien proporciona un kit diagnostico para llevar a cabo los inmunoensayos de acuerdo con la presente invencion. De acuerdo con otra realizacion, el kit de acuerdo con la invencion comprende anticuerpos que reconocen una protema recombinante de acuerdo con la invencion y medios habituales para llevar a cabo un inmunoensayo, tales como, por ejemplo, pocillos de una placa de ELISA, reactivo para producir una reaccion de color tras la union de los anticuerpos a un virus del SCM en una muestra biologica que va a ensayarse. De acuerdo con otra realizacion, se proporciona un kit que comprende una o mas protemas recombinantes de acuerdo con la invencion y medios habituales para llevar a cabo un inmunoensayo, tales como, por ejemplo, pocillos de una placa de ELISA, reactivo para producir una reaccion de color tras la union de dichas protemas recombinantes a anticuerpos en una muestra biologica que va a ensayarse.
Secuencias de cebador y procedimiento para la deteccion de la infeccion por virus del SCM
Las secuencias de acido nucleico de la presente invencion pueden usarse ademas para detectar la presencia del virus del SCM en peces. La presente invencion se refiere tambien, por lo tanto, a un procedimiento diagnostico en el que los cebadores se hibridan a un acido nucleico en una muestra de ensayo que es similar a las secuencias de acido nucleico de la invencion. Dichas pruebas pueden ser en forma de una prueba PCR o una prueba de hibridacion sin amplificacion.
La deteccion de acidos nucleicos presentes en una muestra biologica se aplica ampliamente en diagnosticos tanto humanos como veterinarios, en los que se afslan acidos nucleicos de, por ejemplo, patogenos presentes en muestras biologicas y se hibridan a uno o mas cebadores. Los uno o mas cebadores para su uso en los procedimientos de deteccion basados en hibridacion se construyen de tal forma que son capaces de unirse espedficamente a una secuencia de acido nucleico en caso de que este presente en la muestra que se va a ensayar. Los cebadores pueden estar unidos a una unidad de senalizacion, tal como, por ejemplo, una radioetiqueta, una molecula luminiscente o una molecula fluorescente que permite la visualizacion de la union de los cebadores a una secuencia diana.
Un cebador, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de acido nucleico que puede usarse como sonda en un procedimiento de deteccion de la presencia del virus del SCM en peces. Los cebadores de acuerdo con la presente invencion consisten en al menos 10, preferentemente de al menos 15, y mas preferentemente al menos 20 nucleotidos que son capaces de hibridar a secuencias de acido nucleico aisladas de un virus del SCM.
El cebador de acuerdo con la presente invencion es capaz de hibridarse a otra molecula de acido nucleico, tal como ARN genomico que se origina a partir del virus del SCM o ADNc preparado a partir de dicho ARN genomico, en condiciones adecuadas de temperatura y fuerza ionica de la solucion, vease, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A laboratory Manual (tercera edicion), 2001, CSHL Press, (ISBN 978-087969577-4). Las condiciones de temperatura y fuerza ionica determinan lo que el experto en la materia reconoce como "rigurosidad" de la hibridacion. La rigurosidad adecuada para la hibridacion de un cebador a acidos nucleico diana depende, entre otras cosas, de la longitud del cebador y del grado de complementacion, variables bien conocidas por los expertos en la materia. Una longitud minima de un cebador hibridable es normalmente de al menos aproximadamente 10 nucleotidos, preferentemente de aproximadamente 15 nucleotidos y mas preferentemente de aproximadamente 20 nucleotidos.
Hay disponibles varios protocolos para la deteccion de secuencias de acido nucleico mediante la PCR; vease, por ejemplo, Methods in Molecular Biology, vol. 226, PCR protocols, segunda edicion, Ed. Barlett and Stirling, Humana Press, 2003. El experto en la materia sera capaz ademas, cono el conocimiento de la secuencia genomica del virus del SCM ilustrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) de proporcionar cebadores adecuados con el fin de usar dichos cebadores en un procedimiento para la deteccion de la presencia del virus del SCM de acuerdo con la presente invencion. A este respecto, se hace referencia al libro de texto PCR Primer Design, vol. 402 de la serie Methods in
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Molecular Biology, Ed. A. Yuryev, 2007, Humana Press.
De acuerdo con una realizacion de la invencion, se proporcionan los siguientes cebadores:
5’-TCCAGTGCCTTGATGTCTG-’3 (SEQ ID NO: 8) 5’-CATCTCCATCCGCTAAGTACG-’3 (SEQ ID NO: 9) 5’-TGCCTGTCGTTGAGTTTAGC-’3 (SEQ ID NO: 10) 5’-CCCGAATGAAGCAAGATGG-’3 (SEQ ID NO: 11) 5’-GAAAGCCCAGACTCAGGATG-’3 (SEQ ID NO: 12) 5’-ACACCAGGTGACCGAAAAG-’3 (SEQ ID NO: 13) 5’-ACATGGTGCGAGGTAACGAC-’3 (SEQ ID NO: 14) 5’-AGTTCCTGCCCGTAGATGG-’3 (SEQ ID NO: 15) 5’-GGCGAGAATGGTGTTTGTG-’3 (SEQ ID NO: 16) 5’-CCTGGTCTCACTCCCAAGAG-’3 (SEQ ID NO: 17)
5’- AGGGAACAGGAGGAAGCAGAA -’3 (SEQ ID NO: 18)
5’- CGTAATCCGACATCATTTTGTG -’3 (SEQ ID NO: 19)
5’- GGAAGCAGAAGTGGTGGAGCGT-’3 (SEQ ID NO: 20) 5’-CCGGTTTTGCGCCCTTCGTC-’3 (SEQ ID NO: 21)
Experimentos
Ejemplo 1. Identificacion de secuencias vmcas.
Aunque se comunico el aislamiento del virus que causa el SCM en la solicitud de patente NO2008 2869, la identificacion del genoma de este virus ha resultado dif^cil. El virus es cultivable en celulas GF-1, pero la produccion de virus es muy baja en este sistema. Se han probado muchos procedimientos diferentes para clonar secuencias de genomas vmcos desconocidos, pero ninguno con exito.
Los estudios previos indican el SCM es una enfermedad cronica que se desarrolla a lo largo de varios meses antes de la fase clmica terminal. Se observan cambios histopatologicos consistentes unicamente en el corazon y en ocasiones se observan cambios histopatologicos tambien en el tngado. Nada se sabe acerca de la distribucion del virus en los diferentes estadios de la enfermedad. A menudo es diffcil proporcionar un diagnostico claro de SCM en salmones, ya que otras muchas enfermedades proporcionan los mismos signos clmicos, es decir, enfermedad pancreatica e inflamacion del corazon y musculo esqueletico (Kongtorp RT, Halse M, Taksdal T, Falk K, J Fish Dis. abril de 2006;29(4):233-44.
Se infectaron celulas GF-1 con homogenizado producido a partir de salmon atlantico procedente de un sitio de acuicultura que estaba experimentando problemas compatibles con el SCM. Despues de 14 dfas, los cultivos celulares comenzaron a mostrar un cpe leve (efecto citopatogenico), y este se desarrollo en un cpe mas fuerte despues de 21 dfas. No fue posible reproducir el cpe en mas de tres pases, y se hizo mas debil en cada pase.
Se recogieron 50 ml de sobrenadante de cultivos infectados, se pasaron a traves de un filtro de 0,22 pm y se centrifugaron a 100.000 x g durante tres horas para recoger el virus en forma de un sedimento. Despues de retirar practicamente todo el sobrenadante del sedimento de virus resultante, se resuspendio el sedimento y se ajusto el volumen con medio de cultivo nuevo dando como resultado una suspension de virus de 500 pl. Este se digirio con 250 U de DNasa I y 5 pg de RNAsa A en tampon RDD (incluido con la DNasa I de Qiagen) durante 1 h a 37 °C.
El ARN se preparo a partir de la muestra usando el kit vmco QIAamp (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sintetizo ADNc monocatenario usando el kit de transcriptasa inversa SuperScript® III (Invitrogen) y cebadores aleatorios con un saliente 5' fijo (cebador FR26VRN 5' GCC GGA GCT CTG CAG aTa TCN NNN NN 3'; Djikeng y col., BMC Genomics 2008, 9:5). El ARN se incubo a 95 °C antes de la smtesis del ADNc para evitar los problemas causados por una posible estructura secundaria del ARN. Despues de la smtesis, se digirio la hebra de ARN usando RNAsa H antes de producir el ADN bicatenario usando una combinacion de los componentes del tampon de la 2a hebra del sistema de smtesis de ADNc Universal RiboClone® (Promega) y polimerasa Exo-Klenow e incluyendo un suministro adicional de los cebadores aleatorios. Se llevo a cabo una reaccion PCR de un solo cebador usando cebador contra el saliente fijo del cebador aleatorio (FR20RV 5’ GCC GGA GCT CTG CAG ATA TC 3’; Djikeng y col., BMC Genomics 2008, 9:5) y polimerasa Taq convencional (Invitrogen) (desnaturalizacion inicial del ADNc a 95 °C durante 5 minutos, 40 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, hibridacion del cebador a 60 °C durante 15 segundos y smtesis a 72 °C durante 1 minuto y despues smtesis final a 72 °C durante 10 minutos), y los productos resultantes se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Se cortaron del gen de una pieza los productos de la pCr en el intervalo de tamano de 500 - 1000 pb, se purificaron y se clonaron usando el sistema de clonacion TOPO-TA (Invitrogen). Se secuenciaron aproximadamente 300 clones y se sometieron a
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analisis.
Las secuencias sin coincidencias relacionadas con el virus de las celulas hospedadoras/tejidos despues del analisis con Blastn o BlastX del NCBI se sometieron a analisis en el programa ContigExpress de Vector NTI Software, dando como resultado la identificacion de dos secuencias diferentes sin solapamiento. Una secuencia incluyo dos contigos (contigo 1 = 2,4 kB, contigo 2 = 4,0 kB con una coincidencia inicial de BlasstX de ARN polimerasa de varios totivirus (mejor coincidencia E = 1e-04 sobre aprox. 430 pb).
El contigo 1 (2,4 kb) de la secuencia mas pequena no mostro homologfa con otras secuencias conocidas, mientras que la secuencia mayor mostro una homologfa debil con la ARN polimerasa de un totivirus en una region de 870 pb (Esperado = 7e-15, identidades de aminoacidos = 81/312 (25%), Positivos = 138/312 (44%), Huecos = 32/312 (10 %). El ensamblaje de ambas secuencias mostro varios numeros de secuencias de clon individuales en diferentes regiones que dieron como resultado solapamientos de baja calidad en algunas regiones. Cuando se analizaron las secuencias mediante la PCR, se hizo evidente que algunas partes de las secuencias son diffciles de amplificar mediante la PCR, lo que indica fuertes estructuras secundarias en estas regiones. Especialmente, se predice que la PCR en la region entre la parte terminal de la ORF1 y la primera parte de la ORF2 contendra fuertes estructuras secundarias ya que la pCr en esta region es muy ineficaz y diffcil de llevar a cabo (aproximadamente los nucleotidos 2800 - 3200). [Sin ligarse a cualquier teona espedfica, se cree que esto puede explicar en parte las dificultades experimentadas con el aislamiento y caracterizacion del genoma del virus del SCM].
Se identifico una secuencia que une las dos partes de secuencia mediante PCR usando cebadores. Se disenaron dos cebadores, VMCP-puente F (5'-AGCAGGAGCAACAGCACAC-3') y VMCP-puente R (5'- TACCCGCCAAATGGTACTTC-3'), para abarcar la region entre los dos contigos, dando como resultado un producto de 96 pb. Al analizar manualmente las secuencias no asignadas obtenidas, se identifico una secuencia 3' del contigo 2. Los extremos 5' y 3' del genoma se identificaron usando RACE 5' y 3'.
Finalmente, se ensamblo un genoma de 6688 pb, que contiene tres fases abiertas de lectura. Esta es la primera vez que se identifica un supuesto miembro de los Totiviridae en un vertebrado. Tambien fue muy sorprendente el hallazgo de la fase de lectura 3 (SEQ ID NO: 6). Ningun otro miembro de los Totiviridae tiene esta fase abierta de lectura.
Ejemplo 2
Expresion de proteina recombinante en un sistema de expresion de procariota.
ORF1
Se produjeron sinteticamente las secuencias genicas de la fase abierta de lectura 1 en forma de una secuencia optimizada para E. coli y se clonaron en un sistema de vector pET usando procedimientos convencionales. Se transformo una celula hospedadora de E. coli adecuada, y la proteina recombinante se expreso y purifico tal como se desvela en detalle a continuacion.
Se clonaron la ORF1 y una ORF1 parcial que consistfa en los primeros 852 nucleotidos (ORF1 (1-852)) en la fase abierta de lectura en el vector pET14b (Novagen) usando tecnicas convencionales. El plasmido se transformo en E. coli qmmicamente competentes OneShot ® BL21(DE3)pLysS de Invitrogen (n.° de cat. C606003). Para la preparacion de un pre-cultivo, se cogieron 2 colonias de cada transformante y se cultivaron en 3 ml de LB + antibioticos ((ampicilina (50 mg/ml), cloranfenicol (34 mg/ml)).
Despues de cultivar durante aproximadamente 7,5 horas, se transfirio 1 ml de cada pre-cultivo a 50 ml de medio precalentado que contema antibioticos.
Los cultivos se indujeron mediante la adicion de IPTG (0,5 mM) despues de crecimiento durante aproximadamente 2 horas a una DO entre 0,7 y 1 y se redujo la temperatura a 16 °C. Los cultivos crecieron durante toda la noche a esta temperatura.
- Construccion
- DO de induccion DO recogida
- ORF1(1-852)
- 0,8 3,09
- ORF1(1-852)
- 0,78 3,18
- ORF1
- 0,7 4,2
- ORF1
- 0,76 4,2
Los cultivos se recogieron 15 h despues de la induccion y se precipitaron las bacterias a 3300 x g durante 20 min. Se desecharon los sobrenadantes y los sedimentos se almacenaron a -20 °C hasta la purificacion de los cuerpos de inclusion. El aislamiento de los cuerpos de inclusion se efectuo usando los reactivos de extraccion de protemas B- PER® (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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Las protemas aisladas separadas mediante electroforesis en gel usando el sistema de gen Phast de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare Life Sciences) se muestran en la figura 9A.
B. ORF3
Se construyo un vector de expresion para la ORF3 usando un sistema de vector con un sistema de induccion Pm/xylS (Blatny, J. M., Brautaset, T., Winther-Larsen, H. C., Haugan, K., y Valla, S. 1997a. Construction and use of a versatile set broad-host-range cloning and expression vectors based on the RK2 replicon. Appl. Environ. Microbiol. 63:370-379, Blatny, J. M., Brautaset, T., Winther-Larsen, H. C., Karunakaran, P., y Valla, S. 1997b. Improved broad- host-range RK2 vectors for high and low regulated gene expression levels in gram-negative bacteria. Plasmid 38:3551).
El vector tema la version cop 271 de la protema de replicacion TrfA, proporcionando un numero de copias de 15-30 en E. coli, y una etiqueta c-myc y 6xHis fusionada al extremo 3' de la ORF3.
El plasmido se transformo en E. coli RV308 y se fermento de acuerdo con Sletta y col., 2007 (Sletta, H., T0ndervik, A., Hakvag, S., Aune, T. E. V., Nedal, A., Aune, R., Evensen, G., Valla, S. y Brautaset, T. 2007. The presence of N- terminal secretion signal sequences leads to strong stimulation of the total expression levels of three tested medically important proteins during high-cell-density cultivations of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 73:906-912).
Los cuerpos de inclusion se aislaron del fermentado usando el kit de extraccion de protemas B-PER® (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las protemas aisladas separadas mediante electroforesis en gel usando el sistema de gen Phast de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare Life Sciences) se muestran en la figura 9B.
Ejemplo 3
Expresion de protema recombinante en un sistema de expresion de eucariota.
Se clonaron las secuencias genicas de las fases abiertas de lectura 1 y 3 en un sistema de vector usando procedimientos convencionales. Se transformo una celula hospedadora eucariota adecuada, y la protema recombinante se expreso y purifico entonces tal como se describe en detalle a continuacion.
Se clonaron una ORF1 parcial que consistfa en los primeros 852 aminoacidos de la fase abierta de lectura y la ORF3 completa en el vector pcDNA4 (Invitrogen) usando tecnicas convencionales. Se transfectaron celulas HeLa cultivadas sobre portaobjetos usando FuGENE® (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para determinar si se expresaron las fases abiertas de lectura, se fijaron las celulas transfectadas en paraformaldelddo al 3 % durante 15 minutos, se lavaron en PBS y se inactivaron con NH4Cl durante 15 min, se lavaron en PBS y se incubaron con anticuerpo primario anti-His (anticuerpo disponible comercialmente a traves de Qiagen, 1:100) durante 2 h a temperatura ambiente. Despues de lavar con PBS, se incubaron las muestras con Ac secundario disponible comercialmente a traves de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. durante 45 min (IgG de cabra anti-raton- CY3 1:500 e IgG de burro anti-raton-CY3 1:500, respectivamente). Despues de lavar con PBS, se empaparon los portaobjetos en H2Odd antes de montarlos en un medio anti-decoloracion de alcohol polivimlico de alta calidad Mowiol® (Polysciences, Inc.) que contema 2 ug/ml de Hoechst para la tincion del nucleo.
No se observaron estructuras un dfa despues de la transfeccion. Despues de dos dfas de la transfeccion, las celulas transfectadas con la ORF1(1-852) mostraron estructuras bastante grandes que conteman la protema etiquetada con His expresada. Un numero menor de celulas transfectadas con la ORF3 mostraron las mismas estructuras. Las celulas de control negativo no mostraron tincion espedfica. Esto demuestra que las protemas de la ORF1 y la ORF3 pueden expresarse en sistemas de expresion eucariotas.
Ejemplo 4
Inmunogenicidad de las protemas de la ORF1 recombinantes
Se inmunizo a ratones con la ORF1 recombinante producida como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 2 usando procedimientos convencionales. Se inyecto a los ratones 60-100 mg de protema y se les reforzo tres veces consecutivas. Se recogio el suero tras 10 semanas y se ensayo mediante transferencia de Western.
Se sometio a homogenizado de corazon de salmon atlantico diagnosticado de SCM y a homogenizado de corazon de pez sano a PAGE y se transfirio a una membrana de PVDF (fluoruro de polivinildeno) usando un aparato PhastGel® (GE Healthcare). La membrana se incubo con antisuero (1:250) durante 120 minutos, se lavo en PBS y se incubo con un anticuerpo secundario acoplado a fosfatasa alcalina (1:500, DAKO, Dinamarca) durante 60 minutos. La transferencia se visualizo con NBT-BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/nitroazul de tetrazolio) (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Las transferencias de Western muestran la presencia de una banda espedfica con un peso molecular de aproximadamente 90 kD en el carril con homogenizado de corazon de salmon atlantico diagnosticado de SCM (figura 10). Esto se corresponde bien con el peso molecular estimado de la OFR1. Estos resultados demuestran que
la protema de la ORF1 recombinante provoca una respuesta inmunitaria que produce un antisuero que reconoce una protema del virus del SCM. Por lo tanto, la ORF1 es un buen candidato a antigeno en una vacuna contra el SCM.
Ejemplo 5.
Inmunogenicidad de las protemas de la ORF3 recombinantes.
5 Se produjo la protema de la ORF3 recombinante tal como se describe en el ejemplo 2 y se sometio a PAGE y se transfirio a membranas de PVDF (fluoruro de polivinilideno) usando un aparato PhastGel® (GE Healthcare). Las membranas se transfirieron durante 2 horas a 37 °C en TBS-Tween al 0,05 % (TTBS) que contema leche desnatada en polvo al 5 %.
Se diluyo a una razon de 1:2 el suero de pez de salmon atlantico diagnosticado de SCM o de pez de control sano 10 con TTBS + leche en polvo desnatada al 5 % y se incubo la membrana O/N a 4 °C. Las membranas se lavaron 3 x 5 min en TTBS + leche en polvo desnatada al 1 % antes de la incubacion de 1 h con IgM de raton anti-trucha 4C10 (1:1000) 3 x 5min en TTBS + leche en polvo desnatada al 1 % a TA. Las membranas se lavaron 3 x 5 min en TBS- Tween antes de una incubacion de 1 h con IgG de cabra anti-raton-AP (1:500) solo en TTBS. Entonces la membrana se lavo 3 x 5 min en TTBS antes de la incubacion a TA durante 5 minutos en tampon de sustrato NBT/BCIP antes de 15 anadir NBT/BCIP (Promega) para visualizar las proteinas.
El suero del salmon atlantico diagnosticado de SCM reconocio las proteinas recombinantes de la ORF3, mientras que el suero del pez sano no (figura 11). Esto demuestra que la protema de la ORF3 recombinante tiene epttopos comunes con el virus que causa el SCM. Por lo tanto, la ORF3 es un buen candidato a antfgeno en una vacuna contra el SCM.
20 Ejemplo 6
Vacuna de ADN que protege contra el SCM
Se clonaron la fase abierta de lectura 1 (nucleotidos 1-852) y la 3 en un vector de vacuna de ADN adecuado, pcDNA4 (Invitrogen) usando tecnicas convencionales. El vector resultante se inyecto por via intramuscular en salmon atlantico que habfa mostrado estar libre del virus del SCM a una dosis de 100 pg/pez. Despues de un
25 periodo de inmunizacion de 6 semanas a 12 grados Celsius, se expuso por via i.p. al pez con virus de la
cardiomiopatfa del salmon. Se incluyo como control un grupo al que se habfa inyectado PBS en lugar de vacuna. Se recogieron muestras de tejido de peces vacunados expuestos y no vacunados para su analisis mediante RT-PCR en tiempo real para evaluar la carga vmca en el rinon tres semanas despues de la exposicion. Las muestras se mantuvieron en RNAlater® (Ambion) hasta su analisis. El ARN se extrajo usando el kit RNeasy® (Qiagen). Todas las 30 muestras de ARN se diluyeron hasta 50 ng/pl antes de la smtesis de ADNc. Para la smtesis de ADN y la PCR en tiempo real, se uso el kit para PCR en tiempo real en dos etapas SuperScript® III Platinum® con SYBR® Green. Para la PCR en tiempo real, se usaron los cebadores VMCP ORF2-3F/ORF2-3R (ORF2-3F= (5'- GGAAGCAGAAGTGGTGGAGCGT-3') y ORF2-3R= (5'-CCGGTTTTGCGCCCTTCGTC-3'), y las condiciones de ciclado fueron: 50 °C - 2 min, 95 °C - 2 min, (95 °C -15 s, 60 °C -1 min) x 45 ciclos.
35 Ya que la carga vmca maxima a causa de la infeccion por el virus del SCM se observa en el rinon, esta se uso como medida para la eficacia de la vacuna. La carga vmca en el rinon de los peces infectados y los peces de control comunicada como ciclo umbral (Schmitgen TD, LIvak KJ, Nat. Protoc. 2008; 3(6): 1101-8 "Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method"), Ct, fueron las siguientes:
- Promedio de Ct
- ORF1(1-852)
- 27,33
- ORF3
- 26,27
- Control de PBS
- 24,62
40 Una diferencia de valor ce Ct de 3 representa una diferencia de 100 veces en la carga vmca. El valor promedio de Ct del analisis de tejido de rinon para el grupo de control fue de 24,62. Tanto el grupo vacunado con ORF1 (1-852) como con ORF3 tuvo mayores valores de Ct que el control. Un mayor valor de Ct indica que la carga vmca era menor en los grupos vacunados que en el grupo de control. Este resultado demuestra que las construcciones de vacuna de ADN de ORF1(1-852) y de ORF3 fueron eficaces para reducir la carga vmca en los peces y por lo tanto 45 tienen potencial como vacunas de ADN contra el SCM.
5
10
15
20
25
30
35
Ejemplo 7
Diaanosticos por PCR
Se ensayaron los siguientes cebadores y se vio que eran adecuados para el diagnostico por PCR para el virus del SCM.
- CEBADOR
- DIRECTO (5' -3') INVERSO (5' -3') LONG. PRODUCT O
- VMCP
- ACACCAGGTGACCGAAAAG TCCAGTGCCTTGATGTCTG (SEQ ID NO: 8) 237 pb
- A01
- ACATGGTGCGAGGTAACGAC CATCTCCATCCGCTAAGTACG (SEQ ID NO: 9) 124 pb
- B04
- AGTTCCTGCCCGTAGATGG TGCCTGTCGTTGAGTTTAGC (SEQ ID NO: 10) 531 pb
- F02
- GGCGAGAATGGTGTTTGTG CCCGAATGAAGCAAGATGG (SEQ ID NO: 11) 269 pb
- A09
- GAAAGCCCAGACTCAGGATG CCTGGTCTCACTCCCAAGAG (SEQ ID NO: 17) 242 pb
- ORF2-3
- GGAAGCAGAAGTGGTGGAGCGT CCGGTTTTGCGCCCTTCGTC (SEQ ID NO: 21) 107 pb
Tambien es posible disenar procedimientos de PCR en tiempo real usando cebadores y sondas, por ejemplo:
- CEBADOR
- DIRECTO (5' -3') INVERSO (5' -3') PROBE
- VMCP-F2
- AGGGAACAGGAGGAAGCAGAA CGTAATCCGACATCATTTTGT (SEC ID NO: 19) TGGTGGAGCGTTCAA
La mitad 5' del genoma del virus es mucho mas rica en contenido de GC que la parte 3'. Se predice que la PCR en la parte 3' del genoma es mas eficaz que en el extremo 5'. Tambien hay una parte en medio del genoma en la region entre y parcialmente solapante con la ORF1 y la ORF2 que forma un seudonudo, haciendo que la PCR en esta region sea diffcil.
Ejemplo 8
El SCM clinico se correlaciona con la presencia del VMCP en el tejido cardiaco.
Para examinar si el SCM clinico en peces criados coincide con la presencia de VMCP en el tejido cardfaco, se recogieron muestras de tres piscifactonas. Dos de estas (1 y 2) teman un diagnostico de SCM, mientras que la del tercer sitio no tema un historial previo de SCM. La RT-PCR en tiempo real en las muestras de campo se llevo a cabo en el dispositivo MXpro 3000P (Stratagene) efectuandose todas las reacciones por triplicado usando los siguientes cebadores:
ORF2-3F (5'-GGAAGCAGAAGTGGTGGAGCGT-3') y ORF2-3R (5'-CCGGTTTTGCGCCCTTCGTC-3').
Se observaron cambios histomorfologicos en los peces recogidos de la muestra 1 (al sacrificar el pescado) tfpicos del SCM con puntuaciones en el intervalo de 0,6 a 4 (abarcando la escala completa; fig. 12). La relacion entre las puntuaciones histologicas y los valores de Cp evaluados mediante RT-PCR en tiempo real muestra que hay una tendencia clara a encontrar mayor cantidad de virus en el tejido cardfaco con mayores puntuaciones histologicas (r2 = 0,76). Como se ha sugerido que los peces mayores mueren mas frecuentemente a causa del SCM, tambien se representaron los valores de Cp frente al factor de condicion (peso x 100/longitud) de los peces sin encontrarse correlacion alguna (r2 = 0,08).
Para la muestra 2 (SCM clinico), 10 de 10 peces fueron positivos mediante RT-PCR en tiempo real y todos mostraron los cambios histopatologicos del SCM.
Para la muestra 3 (historial previo de HSMI), no se observaron peces positivos a VMCP mediante RT-PCR en tiempo real, mientras que todos fueron positivos mediante RT-PCR en tiempo real para VRP. Ninguno de los peces tema cambios tfpicos del SCM.
Estos hallazgos demuestran que los casos clmicos del SCM se correlacionan con la presencia de VMCP en el tejido cardfaco y sustancian ademas que el VMCP es el agente causante del SCM.
Claims (22)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Una secuencia de acido nucleico aislada que se origina a partir del virus del SCM que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID nO: 4 y SEQ ID NO: 6 y variantes de las mismas que son al menos un 70 % identicas a lo largo de la secuencia completa con cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6.
- 2. Una secuencia de acido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la secuencia es al menos un 80 %, preferentemente un 90 %, mas preferentemente un 95 % identica a lo largo de la secuencia completa al acido nucleico seleccionado entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6.
- 3. Un vector que comprende una secuencia de acido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1-2.
- 4. Un vector de acuerdo con la reivindicacion 3 que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 6 y variantes de las mismas que son al menos un 70 % identicas a lo largo de la secuencia completa con cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 6, en el que dicha secuencia de acido nucleico aislada esta unida operativamente a secuencias de control que dirigen la expresion de dichas secuencias.
- 5. El vector de acuerdo con la reivindicacion 3-4, en el que el vector es un vector pET.
- 6. Una celula hospedadora que comprende un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-5.
- 7. Una vacuna de ADN que comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6, y variantes de las mismas que son al menos un 70 % identicas a lo largo de la secuencia completa con cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 6.
- 8. Una protema recombinante codificada por una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6 y variantes de las mismas que son al menos un 70 % identicas a lo largo de la secuencia completa con cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 6.
- 9. Una protema recombinante de acuerdo con la reivindicacion 8 que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 7 o una variante de las mismas que es al menos un 70 % identica a lo largo de la secuencia completa con cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 7.
- 10. Una vacuna recombinante que comprende al menos una protema recombinante de acuerdo con la reivindicacion 8-9.
- 11. Un anticuerpo que reconoce espedficamente y se une espedficamente a una protema recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 8-9.
- 12. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
- 13. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que dicho anticuerpo es policlonal.
- 14. Un inmunoensayo para la deteccion de anticuerpos espedficos para el virus del SCM contra el virus del SCM en una muestra biologica, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:a) poner en contacto al menos una de las protemas recombinantes de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-9 y una muestra biologica sospechosa de comprender anticuerpos contra un virus del SCM; y (b) determinar si la al menos una protema recombinante se une a un anticuerpo espedfico para el virus del SCM presente en la muestra biologica, en el que dicha union representa una indicacion de que el animal ha estado en contacto con el virus del SCM.
- 15. Un inmunoensayo para la deteccion del virus del SCM en una muestra biologica, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:(a) poner en contacto uno o mas anticuerpos que reconocen espedficamente y se unen a una protema recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 8-9 y una muestra biologica que se sospecha que comprende un virus del SCM; y(b) determinar si los uno o mas anticuerpos se unen al virus del SCM presente en la muestra biologica, en el que dicha union representa una indicacion de que la muestra contiene un virus del SCM.
- 16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 15, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
- 17. Un cebador que comprende una secuencia de al menos 15 nucleotidos, en el que dicho cebador hibrida espedficamente con una secuencia de acido nucleico que se origina a partir del virus del SCM, que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SeQ ID NO: 6y variantes de las mismas que son al menos un 70 % identicas a lo largo de la secuencia completa con cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6.
- 18. Un cebador de acuerdo con la reivindicacion 17, en el que dicho cebador tiene al menos 20 nucleotidos.
- 19. Un cebador de acuerdo con la reivindicacion 17, en el que dicho cebador se selecciona entre el grupo que 5 consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ IDNO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21.
- 20. Un procedimiento de deteccion del virus del SCM en una muestra biologica caracterizado porque comprende las siguientes etapas:10 a) preparar una muestra biologica que comprende secuencias de acido nucleico aisladas a partir de una muestrabiologica que se sospecha que comprende virus del SCM para una reaccion de transcripcion inversa;b) someter a la mezcla de a) a una reaccion en cadena de la polimerasa con un par de cebadores seleccionados entre los cebadores de acuerdo con las reivindicaciones 17-19; yc) determinar si se ha producido la union de los cebadores a secuencias de acido nucleico en la muestra y la15 amplificacion de la secuencia entre ellas indicando la presencia de virus del SCM en la muestra ensayada.
- 21. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 20, en el que cada cebador del par de cebadores se selecciona entre un grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21.20 22. Un kit diagnostico que comprende al menos una secuencia de cebador de acuerdo con cualquiera de lasreivindicaciones 17-19.
- 23. El uso de las secuencias de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para la preparacion de una vacuna de ADN, una vacuna recombinante o un microorganismo vivo recombinante.
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