ES2247942B1

ES2247942B1 - Construccion genica, vector y vacuna adn para la vacunacion de animales acuaticos.

Info

Publication number: ES2247942B1
Application number: ES200402093A
Authority: ES
Inventors: Julio Coll Morales
Original assignee: Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria INIA
Current assignee: Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria INIA
Priority date: 2004-08-27
Filing date: 2004-08-27
Publication date: 2006-10-01
Anticipated expiration: 2024-08-27
Also published as: US20070248623A1; ES2310074B1; ES2247942A1; EP1818406A4; WO2006035084A1; EP1818406A1; ES2310074A1

Abstract

Construcción génica, vector y vacuna ADN para la vacunación de animales acuáticos. La construcción génica comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido inmunogénico de un patógeno de un animal acuático bajo el control de una secuencia de control de expresión capaz de dirigir la expresión de dicho péptido inmunogénico en un animal acuático que comprende la secuencia de un promotor de citomegalovirus (CMV) unido a una secuencia potenciadora de la expresión en posición 5''. El vector comprende dicha construcción génica y puede ser utilizado en la elaboración de vacunas ADN útiles para prevenir enfermedades infecciosas en animales acuáticos, especialmente de interés en Acuicultura. Dichas vacunas son útiles para la vacunación en masa de animales acuáticos mediante un proceso de inmersión-sonicación.

Description

Construcción génica, vector y vacuna ADN para la vacunación de animales acuáticos.

Campo de la invención

La invención se relaciona, en general, con la prevención de enfermedades infecciosas (víricas, bacterianas y parasitarias) en animales acuáticos, especialmente de interés en Acuicultura, mediante el empleo de sistemas de expresión de ADN que comprenden la secuencia codificante de péptidos inmunogénicos de patógenos de animales acuáticos. La invención también se relaciona con la administración de dichos sistemas de expresión de ADN a dichos animales acuáticos, en particular, con la vacunación simultánea (en masa) de una pluralidad de animales acuáticos mediante el empleo de dichos sistemas de expresión de ADN.

Antecedentes de la invención

El crecimiento de la Acuicultura intensiva ha provocado un incremento de la incidencia de las enfermedades de peces causadas por virus, bacterias o parásitos. Para controlar estas enfermedades los métodos de prevención utilizando vacunas son uno de los más utilizados. Ahora bien, actualmente sólo varias enfermedades causadas por bacterias (boca roja, forunculosis y vibriosis) se han podido controlar utilizando vacunas tradicionales (bacterias inactivadas). Sin embargo, gracias a la aplicación de las nuevas tecnologías de ADN recombinante a la producción de antígenos proteicos directamente en el hospedador o de vacunas ADN, se esperan productos innovadores en este
campo.

Tradicionalmente las vacunas se han dividido en vivas (atenuadas) y muertas (inactivadas). Los peligros de estas vacunas tradicionales son la reversión y el porcentaje residual de patógeno vivo, respectivamente. Con el advenimiento de la tecnología del ADN recombinante se ha hecho posible la construcción de vectores vivos (bacterias o virus inocuos) que pueden transportar un antígeno de interés para protección frente a un patógeno, o bien la producción externa de dicho antígeno aislado del patógeno (vacunas por subunidades proteicas) o la producción interna del antígeno aislado del patógeno (vacunas ADN). En ambos casos se elimina el manejo de grandes cantidades de patógeno. La vacunación por subunidades para controlar infecciones en peces, consiste en la producción por ingeniería genética de subunidades del agente infeccioso en vez del agente infeccioso completo. Para ello, se obtienen por ingeniería genética vectores ADN plasmídicos de bacterias que codifican las subunidades proteicas del agente infeccioso. Estas vacunas son efectivas sólo si se aplican por inyección intramuscular con adyuvantes, pez a pez.

Algunas de las metodologías actuales para la administración de vacunas no son técnica o económicamente prácticas. Por ejemplo, la inyección directa de una vacuna pez a pez es una tarea intensiva y cara relativa al valor de mercado de las especies piscícolas. Por otro lado, las agujas pueden provocar una reacción cruzada de forma que, una inyección accidental en el hombre, puede acarrear graves infecciones o reacciones anafilácticas. Un método más fácil y barato de administrar una vacuna viral o bacteriana es el método oral, en donde la vacuna es añadida directamente al agua o incorporada en el alimento de los peces, por la que se han desarrollado métodos para la vacunación en masa de peces por inmersión en soluciones que contienen vacunas ADN.

La patente norteamericana US 5.780.448 incluye una revisión sobre el empleo de vacunas ADN para la vacunación de peces. En dicha patente se describe una composición para inducir una respuesta inmune en un pez que comprende un vector de expresión que tiene una secuencia de control de la expresión capaz de dirigir la expresión en un pez de un polipéptido inmunogénico, tal como el promotor de citomegalovirus (CMV) o una secuencia que comprende el promotor de CMV y el intrón A de CMV en posición 3' respecto al promotor de CMV, y (ii) una secuencia codificante de ADN que codifica un péptido inmunogénico de un patógeno de un pez, tal como la proteína G (pG) del virus de la septicemia hemorrágica de la trucha (VHSV). Entre los métodos de vacunación descritos en dicha patente se incluye el método de vacunación por inmersión. Sin embargo, en dicha patente no se menciona la posibilidad de aplicar ultrasonidos al baño de inmersión para aumentar la eficacia de la vacunación en masa por inmersión.

Entre las nuevas tecnologías con mayor aplicación al campo de las vacunas, cabe destacar la inmunización con plásmidos recombinantes de expresión transitoria o vacunas ADN, para lo que se necesitan vectores eucarióticos de la mayor eficacia. Utilizando vacunas ADN, no se manejan virus vivos, no se necesita ensamblaje de las partículas virales y se permite la selección de péptidos relevantes a la protección por cada individuo vacunado. La conformación de las proteínas patógenas es la adecuada ya que se fabrican en el mismo huésped que en la infección natural. Además este método podría utilizarse con varios genes simultáneamente.

Para la elaboración de vacunas ADN es necesario desarrollar vectores eficientes capaces de expresar correctamente el péptido inmunogénico apropiado. Sin embargo, la mayoría de las proteínas eucarióticas expresadas en bacterias se pliegan incorrectamente y por lo tanto exhiben bajas actividades específicas comparadas con las proteínas nativas. Esto es lo que sucede en el caso de las proteínas virales tales como la pG del virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV) [Estepa et al., 1994] o las proteínas parasitarias. Ello es debido a que la producción de proteínas eucarióticas completamente activas requiere modificaciones post-trasduccionales tales como, formación correcta de los puentes disulfuro, glicosilación, fosforilación, ensamblaje correcto de monómeros, procesamiento proteolítico o transporte funcional a membranas, procesos todos ellos que no pueden llevar a cabo las células bacterianas. Los vectores para la expresión de proteínas eucarióticas en células eucarióticas, incorporan tanto secuencias procarióticas para facilitar la propagación del plásmido en bacterias como secuencias eucarióticas para realizar la transcripción (secuencias arriba del 5', promotores, señales para el procesamiento de intrones) y la traducción (señales de poliadenilación) en células eucarióticas.

Sigue existiendo, por tanto, la necesidad de desarrollar sistemas alternativos a los existentes para la vacunación de animales acuáticos y la protección de los mismos frente a diversas enfermedades. Dichos sistemas deberían ser, ventajosamente, fáciles y económicos en cuanto a su producción y administración, y deberían inducir una potente inmunidad a largo plazo sin necesidad de tener que administrar dosis de recuerdo. Preferentemente, dichos sistemas deberían ser aplicables a animales acuáticos de forma no estresante y deberían ser capaces de poder ser utilizados para la vacunación en masa de animales acuáticos con el fin de facilitar su administración y minimizar sus costes de aplicación.

Compendio de la invención

La invención se relaciona con la inmunización de animales acuáticos frente a la infección causada por patógenos virales, bacterianos o parásitos mediante el empleo de sistemas de expresión de ADN (vectores) que comprenden una secuencia 5' potenciadora, un promotor y una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido inmunogénico de un patógeno de un animal acuático. La invención también se relaciona con la administración de dichos sistemas de expresión de ADN a dichos animales acuáticos. En una realización particular y preferida, la administración de dichos vectores se realiza sometiendo a los animales acuáticos a un proceso de inmersión-sonicación en un baño que contiene dichos vectores, permitiendo de este modo la vacunación en masa de animales
acuáticos.

De forma más concreta, ahora se ha encontrado que el empleo de un promotor, tal como un promotor seleccionado entre un promotor capaz de dirigir la expresión de un péptido en células de mamífero, tal como el promotor de citomegalovirus (CMV), unido a su secuencia potenciadora de la expresión en posición 5', permite una expresión más eficiente de péptidos inmunogénicos de patógenos de animales acuáticos en células de animales acuáticos que la que se obtiene empleando el promotor de CMV. Dicha combinación potenciador-promotor puede ser utilizada en la generación de construcciones génicas y vectores destinados al desarrollo de vacunas ADN. También se ha observado que es posible vacunar simultáneamente a una pluralidad de animales acuáticos mediante un proceso de inmersión-sonicación y que la integridad de dichos vectores no se ve alterada tras sucesivos ciclos de sonicación por lo que pueden ser reutilizados en diferentes ciclos de vacunación en masa de animales acuáticos.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica que comprende una secuencia de control de expresión capaz de dirigir la expresión de un péptido inmunogénico en un animal acuático, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido inmunogénico de un patógeno de un animal acuático. Dicha secuencia de control de expresión se compone de secuencias 5' potenciadoras de la expresión del promotor de citomegalovirus (CMV) y el propio promotor de CMV.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende dicha construcción génica. Dicho vector puede ser utilizado en la elaboración de una vacuna destinada a conferir protección a animales acuáticos frente a patógenos de animales acuáticos, lo que constituye un aspecto adicional de esta invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una vacuna que comprende dicha construcción génica o dicho vector, y, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, dicha vacuna es una vacuna ADN. Dicha vacuna es útil para proteger animales acuáticos de infecciones virales, bacterianas o causadas por parásitos.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de dicha construcción génica o de dicho vector, en la elaboración de una vacuna para su administración a animales acuáticos mediante un proceso que comprende la inmersión de dichos animales acuáticos en un baño que contiene dicha vacuna y la sonicación de dicho baño conteniendo dichos animales acuáticos y dicha vacuna.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para administrar una vacuna simultáneamente a una pluralidad de animales acuáticos que comprende la inmersión de dicha pluralidad de animales acuáticos en un baño que contiene dicha vacuna y la sonicación de dicho baño conteniendo dichos animales acuáticos y dicha vacuna.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una gráfica que muestra el porcentaje de EPC teñidas por Xgal con plásmidos con distintas longitudes del promotor CMV. Unas 500.000 células EPC (línea celular derivada de Epithelioma Papullosum Cyprini) por ml se transformaron con 0,6 \mug de plásmidos acomplejados con 2 \mul de fugene en 100 \mul de medio sin suero. Los dos experimentos con resultados extremos (izquierda y derecha) representan el rango de valores encontrados en 8 experimentos. Se han representado las medias y las desviaciones estándar de duplicados. [Cuadrados llenos (\blacksquare): células teñidas con Xgal obtenidas con pCMV\beta; estrellas llenas: células teñidas con Xgal obtenidas con pMOK\betagal; círculos llenos (\bullet): células teñidas con Xgal obtenidas con pMVC1.4\betagal; cuadrados vacíos (\Box): actividad \betagal en cps obtenida con pCMV\beta; y círculos vacíos (\medcirc): actividad \betagal en cps obtenida con pMCV1.4.

La Figura 2 es una gráfica que muestra la expresión de la pG de VHSV en la membrana de células EPC transfectadas con pMCV1.4-G, teñidas con anticuerpos (Acs) anti-pG y analizadas por FACS.. Las células, EPC no se transfectaron (gris) o se transfectaron con el plásmido pMCV1.4-G (negro).

La Figura 3 muestra esquemáticamente los mapas de pMCV1.4\betagal, pMOK\betaal y pCMV\beta. El recuadro negro representa el promotor mínimo del CMV; los recuadros blancos a la izquierda de dichos recuadros negros representan las regiones 5'; el recuadro \boxtimes representa el gen de la \betagal; el recuadro rayado representa el gen de resistencia a antibióticos; y el recuadro restante representa las regiones de plásmidos bacterianos comunes a los tres plásmidos.

La Figura 4 muestra la comparación de secuencias del promotor de citomegalovirus (CMV) utilizado por los vectores originales pQBI25, pcDNAI/Amp y el vector mejorado pMOK/pMCV1.4 que contiene las secuencias 5' potenciadoras. Como se aprecia en la figura al vector pQBI25 y pcDNAI/Amp empleados en los estudios ya publicados, les faltan secuencias tanto en el extremo 5' terminal como en el 3' terminal del promotor largo de CMV contenido en los nuevos plásmidos. El promotor largo de CMV de los vectores pMOK y pMCV1.4 son los mismos. La conservación del aumento de la eficiencia de transfección en el vector pMCV1.4, al que se eliminaron secuencias bacterianas, demuestra que las mayores eficiencias del pMOK y del pMCV 1.4 comparadas con el pQBI25 son debidas precisamente a las diferencias de longitud de las secuencias del promotor de CMV incluidas en cada vector.

La Figura 5 es una representación del plásmido pMCV1.4G que incluye la construcción génica que comprende el promotor largo pCMV operativamente unido a un gen de interés que, en este caso concreto, es la proteína G del virus de la septicemia hemorrágica viral.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona, en general, métodos y composiciones para inmunizar animales acuáticos frente a la infección causada por patógenos virales, bacterianos o parásitos. Básicamente, la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido inmunogénico de un patógeno de un animal acuático es introducida en dicho animal con lo que se expresa dicho péptido inmunogénico en las células del animal induciendo de ese modo una respuesta inmune que confiere protección frente a la infección causada por dicho patógeno.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica, en adelante construcción génica de la invención, que comprende una secuencia de control de expresión capaz de dirigir la expresión de un péptido inmunogénico en un animal acuático, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido inmunogénico de un patógeno de un animal acuático, en donde dicha secuencia de control de expresión es una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia A y una secuencia B, en donde dicha secuencia A comprende una secuencia potenciadora de la expresión, y dicha secuencia B comprende la secuencia del promotor de citomegalovirus (CMV), y en donde el extremo 3' de dicha secuencia A está unido al extremo 5' de dicha secuencia B.

La secuencia de control de expresión presente en la construcción génica de la invención que comprende dichas secuencias A y B se denomina en esta descripción, en ocasiones, "promotor largo de CMV", para distinguirla de otras secuencias de control que comprenden el promotor de CMV pero que carecen de dicha secuencia potenciadora de la expresión (secuencia A) en 5' respecto al promotor de CMV. A esta secuencia de control de expresión que comprende únicamente el promotor de CMV, que cae fuera del alcance de la invención, se la denomina, en ocasiones, "promotor corto de CMV", en esta descripción.

La secuencia A comprende una secuencia potenciadora de la expresión. La longitud de dicha secuencia A puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, entre 100 y 1.000 bases, aunque en una realización particular dicha secuencia A tiene una longitud de 218 bases. Prácticamente cualquier secuencia capaz de potenciar la expresión de un péptido en un animal acuático podría ser utilizada en la construcción génica de la invención; no obstante, en una realización particular, dicha secuencia A comprende, o está constituida por, la secuencia de 218 bases comprendida desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 218 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

La secuencia B comprende, o está constituida por, la secuencia del promotor de CMV. Dicha secuencia es conocida y se encuentra presente en plásmidos comerciales, por ejemplo, en el plásmido pcDNA3 (InvitroGen).

En una realización práctica, la secuencia de control de expresión presente en la construcción génica de la invención está formada por dichas secuencias A y B y comprende, o está constituida por, la secuencia de 798 nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

La construcción génica de la invención comprende, operativamente unida a dicha secuencia de control de expresión capaz de dirigir la expresión de un péptido inmunogénico en un animal acuático, una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido inmunogénico de un patógeno de un animal acuático. Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "operativamente unida" significa que el péptido inmunogénico es expresado en el marco de lectura correcto bajo el control de dicha secuencia de control de expresión.

"Animal acuático", tal como aquí se utiliza incluye a cualquier organismo multicelular que vive en el agua, típicamente a los peces. Preferentemente, dicho animal acuático es un animal perteneciente a una especie de pez cultivada mediante acuicultura. Ejemplos ilustrativos de dichos animales acuáticos incluyen los peces teleósteos, tales como peces vertebrados, por ejemplo, salmónidos (e.g., truchas, salmones, etc.), carpas, rodaballos, doradas, lubinas, etc.

El término "péptido inmunogénico de un patógeno de un animal acuático" tal como aquí se utiliza se refiere a proteínas completas y fragmentos de las mismas, así como a péptidos que son epítopos (por ejemplo, epítopos CTL), asociados con virus, bacterias o parásitos que provocan enfermedades en animales acuáticos. Por tanto, la secuencia de ácido nucleico codificante de un péptido inmunogénico presente en la construcción génica de la invención codifica un péptido inmunogénico derivado de un patógeno viral, bacteriano o de un parásito, de un animal acuático.

Cuando se desee obtener inmunidad humoral, la secuencia de ácido nucleico codificante del péptido inmunogénico será, ventajosamente, una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína antigénica completa, o un fragmento relativamente grande de la misma, en lugar de secuencias de ácido nucleico codificantes de fragmentos pequeños. Sin embargo, cuando se desee obtener inmunidad celular, o cuando la inmunidad humoral pueda ser nociva para el animal acuático, la secuencia de ácido nucleico codificante del péptido inmunogénico será, ventajosamente, una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento relativamente pequeño de la correspondiente proteína antigénica (epítopos CTL).

En una realización particular, la construcción génica de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido inmunogénico de un patógeno viral, tal como un novirabdovirus, de un animal acuático. A modo ilustrativo, dicho péptido puede ser la proteína G (pG) o la nucleoproteína (N) del virus de la septicemia hemorrágica de la trucha (VHSV); la pG o la N del virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV); las proteínas VP1, VP2, VP3 o la proteína N estructural del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV); la pG de la viremia primaveral de la carpa (SVC); etc.

En otra realización particular, la construcción génica de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido inmunogénico de un patógeno bacteriano de un animal acuático, tal como algunas proteínas de Renibacterium, por ejemplo, la proteína p57 de R. salmoninarum. Ejemplos adicionales ilustrativos de dichos péptidos inmunogénicos de patógenos bacterianos se citan en US 5.780.448.

Asimismo, en otra realización particular, la construcción génica de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido inmunogénico de un parásito patógeno de un animal acuático, tal como los antígenos de superficie de Ichthyophthirius (US 5.780.448).

La construcción génica de la invención puede contener dos o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican dos o más péptidos inmunogénicos de uno o más patógenos de animales acuáticos: En este caso, la secuencia de control de expresión presente en la construcción génica de la invención puede dirigir la expresión de dichas secuencias de ácido nucleico codificantes de dichos péptidos inmunogénicos siempre y cuando éstas estén unidas en marco de lectura para expresar una proteína de fusión. Esta situación puede ocurrir, por ejemplo, para expresar las proteínas VP2 y VP3 de IPNV como una proteína de fusión.

La construcción génica de la invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica (Sambrook et al., 1989).

La construcción génica de la invención puede encontrarse, ventajosamente, en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, en adelante vector de la invención, que comprende, al menos, una construcción génica de la invención. Dicho vector puede ser un vector viral o un vector no viral. En general, la elección del vector dependerá de la célula huésped en la que se va a introducir posteriormente. El vector de la invención puede ser obtenido mediante métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia (Sambrok et al., 1989).

En una realización particular, el vector de la invención es un vector no viral, tal como un plásmido de ADN o un vector de expresión capaz de ser expresado en células eucariotas, por ejemplo, en células animales, que comprende, al menos, una construcción génica de la invención, que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra o no en el genoma de dicha célula.

El vector de la invención puede contener, además, los elementos necesarios para la expresión del péptido inmunogénico, así como los elementos reguladores de su transcripción y/o traducción. Asimismo, el vector de la invención puede contener secuencias de procesamiento de ARN tales como secuencias de intrones para el splicing de un transcrito, secuencias de terminación de transcripción, secuencias para la secreción del péptido, etc. El vector de la invención, si se desea, puede contener un origen de replicación y un marcador seleccionable, tal como un gen de resistencia a un antibiótico.

En una realización particular, el vector de la invención contiene una única construcción génica de la invención. Sin embargo, en otra realización particular, el vector de la invención contiene dos o más construcciones génicas de la invención. En este caso, el vector de la invención puede codificar dos o más péptidos inmunogénicos diferentes del mismo patógeno de animal acuático. Alternativamente, el vector de la invención puede codificar dos o más péptidos inmunogénicos diferentes capaces de inducir una respuesta inmune frente a dos o más patógenos de animales acuáticos diferentes dando lugar a una vacuna multivalente. Por ejemplo junto a la pG de VHSV se podría incluir la VP2 del IPNV en el mismo marco de lectura.

Cuando el vector de la invención comprende dos o más construcciones génicas de la invención la transcripción de cada secuencia de ácido nucleico codificante de cada péptido inmunogénico puede ser dirigida desde su propia secuencia de control de expresión a la que está operativamente unida o puede tratarse de 2 o más peptidos unidos en fase de lectura.

Cuando el vector de la invención se introduce en células de un animal acuático apropiado, las células en las que se ha introducido dicho vector de la invención expresan el péptido inmunogénico presente en el vector de la invención dando como resultado la inmunización del animal acuático frente al patógeno en cuestión ya que dicho péptido inmunogénico desencadena una reacción de respuesta inmune en el animal acuático. De esta manera se pueden inmunizar animales acuáticos frente a diferentes patógenos sin necesidad de utilizar vacunas vivas atenuadas o inactivadas, sino simplemente utilizando las secuencias codificantes de los péptidos inmunogénicos correspondientes incorporadas en los vectores adecuados. El vector de la invención constituye, por tanto, la base de una vacuna ADN y puede ser utilizado para inmunizar animales acuáticos susceptibles de ser infectados por distintos patógenos.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un vector de la invención en la elaboración de una vacuna destinada a conferir protección a animales acuáticos frente a patógenos de animales acuáticos. En una realización particular, dicha vacuna es una vacuna ADN.

La invención también se relaciona, en otro aspecto, con una vacuna, en adelante vacuna de la invención, que comprende una cantidad efectiva de una construcción génica de la invención, o de un vector de la invención, y, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, la vacuna de la invención es una vacuna ADN.

Tal como se utiliza en esta descripción, el término "vacuna" se refiere a un material capaz de producir una respuesta inmune. Por tanto, la vacuna de la invención es capaz de inmunizar animales acuáticos frente a enfermedades causadas por patógenos de tales animales acuáticos. Asimismo, como es conocido, la activación de la actividad CTL (linfocitos T citotóxicos) resultante de la síntesis in vivo del péptido inmunogénico podría producir inmunidad frente a dichas enfermedades no solo desde un punto de vista profiláctico sino también terapéutico, en particular, tras el desarrollo de la enfermedad en animales acuáticos instalaciones de acuicultura.

La vacuna de la invención es útil para proteger animales acuáticos susceptibles de ser infectados por patógenos de animales acuáticos. En una realización particular, dichos patógenos son patógenos de animales acuáticos que se crían en instalaciones de acuicultura. Ejemplos no limitativos de dichos patógenos incluyen VHSV, IHNV, IPNV, el virus causante de la viremia primaveral de la carpa (SVCV), Aeromonis salmonicida, Renibacterium salmoninarum, Yersinia, Pasteurella (incluyendo piscicida), Vibrosis (incluyendo anguillarum y ordalii), Edwardsiella (incluyendo ictaluri y tarda), Streptococci, Ichthyophthirius, etc.

En una realización particular, la construcción génica de la invención está incorporada en un vector de la invención. Para ello, la vacuna de la invención puede prepararse en forma de una solución o suspensión acuosa, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), o cualquier otro vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra realización particular, la construcción génica de la invención, o el vector de la invención, pueden estar incorporados en reactivos de transfección convencionales, tales como liposomas, por ejemplo, liposomas catiónicos, emulsiones fluorocarbonadas, cocleatos, túbulos, partículas de oro, microesferas biodegradables, polímeros catiónicos, etc. Una revision de dichos reactivos de transfección puede encontrarse en US 5.780.448. Dichos reactivos de transfección que comprenden la construcción génica de la invención, o el vector de la invención, constituyen un aspecto adicional de la invención.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva para el tratamiento y prevención de las enfermedades causadas por patógenos de animales acuáticos.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse para formular una vacuna de la invención, tienen que ser estériles y fisiológicamente compatibles tales como, por ejemplo, agua estéril, solución salina, tampones acuosos tales como PBS, alcoholes, polioles y similares. Además, dicha vacuna puede contener otros aditivos, tales como adyuvantes, estabilizadores, antioxidantes, conservantes y similares. Los adyuvantes disponibles incluyen pero no se limitan a sales o geles de aluminio, carbómeros, copolímeros en bloque no iónicos, tocoferoles, dipéptido muramil, emulsiones aceitosas, citoquinas, etc. La cantidad de adyuvante a añadir depende de la naturaleza propia del adyuvante. Los estabilizadores disponibles para su uso en vacunas de acuerdo con la invención son, por ejemplo, carbohidratos, incluyendo sorbitol, manitol, destrina, glucosa y proteínas tales como albúmina y caseina, y tampones como fosfatos alcalinos. Los conservantes disponibles incluyen, entre otros, timerosal, mertiolato y gentamicina.

La construcción génica de la invención, o el vector de la invención, pueden incluir dinucleótidos CpG ya que tienen efectos inmunoestimulatorios, permitiendo de este modo que el ADN ejerza una actividad adyuvante.

La vacuna de la invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada que dé como resultado una respuesta inmune protectora frente al patógeno en cuestión, para lo cual dicha vacuna se formulará en la forma adecuada a la vía de administración elegida. Aunque la vacuna de la invención puede administrarse por vía oral, intramuscular, mediante bombardeo de partículas o mediante pulverización, mediante métodos convencionales (US 5.780.448), para la inmunización simultánea de un gran número de animales acuáticos resulta preferido sumergir dichos animales acuáticos en una solución que comprende la vacuna de la invención. Para ello, la vacuna de la invención puede prepararse en forma de una solución o suspensión acuosa, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), o cualquier otro vehículo farmacéuticamente aceptable.

La vacuna de la invención puede ser preparada empleando métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. En una realización particular, dicha vacuna es preparada mediante la mezcla, en su caso, de un vector de la invención con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

Diversos ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que se obtienen muy buenos resultados cuando los animales acuáticos a inmunizar se someten a un proceso de inmersión en un baño que comprende una vacuna de la invención y la aplicación de ultrasonidos a dicho baño que contiene dicha vacuna y dichos animales acuáticos. La aplicación de ultrasonidos puede realizarse de forma simultánea o posterior a la inmersión de los animales acuáticos en dicho baño. Aunque no se desea estar vinculado por ninguna teoría, se cree que la aplicación de ultrasonidos (sonicación) abre intersticios y/o poros entre las células y tejidos y/o en las membranas celulares de los epitelios de los animales acuáticos permitiendo de este modo que la vacuna de la invención penetre en el animal acuático de una manera no traumática y poco estresante para el animal acuático.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una construcción génica de la invención o de un vector de la invención en la elaboración de una vacuna de la invención para su administración a animales acuáticos mediante un proceso que comprende la inmersión de dichos animales acuáticos en un baño que contiene dicha vacuna y la sonicación de dicho baño conteniendo dichos animales acuáticos y dicha vacuna.

Asimismo, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para administrar una vacuna simultáneamente a una pluralidad de animales acuáticos (vacunación en masa) que comprende la inmersión de dicha pluralidad de animales acuáticos en un baño que contiene dicha vacuna y la sonicación de dicho baño conteniendo dichos animales acuáticos y dicha vacuna. En una realización particular, dicha vacuna es una vacuna de la invención.

Las condiciones en las que se lleva a cabo la inmersión de los animales en el baño que contiene la solución de ADN así como las condiciones de la sonicación (distribución de pulsos, frecuencias, potencia por unidad de superficie, etc.) pueden variar dentro de un amplio intervalo dependiendo de numerosos factores. No obstante, en una realización particular, la inmersión de los animales en el baño que contiene la solución de ADN (vacuna, por ejemplo, vacuna de la invención) puede durar entre 1 y 30 minutos, preferentemente, unos 10 minutos aproximadamente, y la sonicación entre 8 y 24 segundos, distribuida en cuatro o más pulsos seguidos dependiendo del tamaño del animal (2 segundos por pulso para animales de 2-3 cm y 6 segundos por pulso para animales de 5-7 cm), la frecuencia máxima de ultrasonidos a aplicar debe ser de 40 kHz y entre 0,4 y 0,6 Watios/cm^{2}. Ultrasonidos de mayor potencia provocan efectos deletéreos en los animales y menores no tienen ningún efecto. A continuación, los animales se retiran del baño y se llevan a otros tanques (acuarios) donde se les deja desarrollar la inmunidad frente al patógeno en cuestión.

Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que la dificultad práctica de inyectar una vacuna a los animales acuáticos, de uno en uno, cuando hay una gran cantidad de ellos, se solventa con el uso de la sonicación (ultrasonidos de baja potencia) como método de introducción del vector que constituye la vacuna ADN. La eficacia intrínseca del vector mejorada con el nuevo diseño, aumenta las posibilidades prácticas de su aplicación. La reutilización del vector para varias inmersiones aumenta también su posible aplicación práctica.

La vacunación mediante una vacuna de ADN que comprende la construcción génica de la presente invención, induce una respuesta inmune contra un antígeno expresado in vivo mediante la introducción de su gen en el animal, lo cual tiene las siguientes ventajas:

Síntesis in vivo del antígeno, lo que hace posible inmunizar por ADN contra todos aquellos patógenos cuya virulencia y sus respuestas antigénicas sean debidas a una proteína; esto lleva consigo la generación de respuestas citotóxicas específicas por presentación del antígeno procesado, sin el riesgo de generar una verdadera infección (en este sentido, es semejante a las vacunas vivas atenuadas pero sin sus problemas asociados de reversión);

Expresión continuada del antígeno, la expresión del antígeno continúa durante varios días como mínimo, lo que en modelos animales probados significa una fuerte y duradera respuesta inmunológica celular y humoral, sin la utilización de una inmunización de recuerdo; en animales acuáticos, y, en particular, en peces, hay que tener en cuenta que esto sólo ocurre a la temperatura adecuada, y sólo cuando el sistema inmune está maduro;

Inmunidad celular, los virus y muchos patógenos bacterianos (Renibacterium y Aeromonas, por ejemplo) son patógenos intracelulares y es difícil producir anticuerpos contra ellos para su neutralización, por lo que requieren inmunidad celular para una máxima protección (las vacunas ADN son la mejor solución para estos casos);

Actividad adyuvante del ADN, la presencia de dinucleótidos cpG repetidos en el ADN bacteriano pero ausentes en el ADN eucariótico, tiene efectos inmunoestimulatorios; estos efectos pueden incrementarse adicionando el dinucleótido CpG al vector; y

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Ventajas económico-prácticas, las vacunas ADN son de bajo coste y facilidad de fabricación, estables a la temperatura y capaces de ser utilizadas en cualquier especie y edad. Es posible, además, fabricar vacunas multivalentes contra varios patógenos en el mismo o en diferentes plásmidos.

En el caso concreto del VHSV, no se obtiene protección completa usando fragmentos recombinantes de la pG expresados en vectores procariontes, tales como Escherichia coli y Yersinia ruckei o Aeromonis salmonicida. La mejor protección hasta ahora se ha obtenido con pG de VHSV recombinante expresada en levadura o en baculovirus pero con muy baja actividad específica. Utilizando vacunas ADN no se manejan virus vivos, no se necesita ensamblaje vírico y se permite la selección de péptidos relevantes a la protección por cada individuo.

En su conjunto, la invención permite reducir la cantidad de vector necesario para la inmunización de animales acuáticos al optimizar los vectores (mediante la selección de unos promotores más eficientes) y los métodos de transmisión del vector (reutilización de la solución del vector). Por ello, una ventaja del método de vacunación en masa proporcionado por esta invención radica en que la vacuna de la invención puede ser reutilizada dos o más veces, ya que repeticiones de hasta 3 veces el proceso de sonicación no alteraban la integridad de la construcción génica de la invención.

La cantidad de construcción génica de la invención que puede estar presente en la vacuna de la invención depende de numerosos factores, entre los que se encuentran, el animal acuático a tratar y sus características (edad, tamaño, peso, estado general, etc.), el modo de administración, la estabilidad y actividad del péptido inmunogénico, etc. No obstante, aunque no se desea estar vinculado por ninguna de las dosificaciones que se mencionan más abajo, se cree que para la inmunización por vía oral se requieren, típicamente, entre 0,1 y 50 \mug de construcción génica de la invención por animal acuático durante varios días. Para la inmunización mediante inyección i.m. o i.p. se requieren, típicamente, entre 0,1 y 10 \mug de construcción génica de la invención por animal acuático. Para la inmunización mediante pulverización se requiere, típicamente, un volumen de 1 ml por animal acuático conteniendo entre 0,1 y 10 mg/ml de construcción génica de la invención. Los animales acuáticos inmunizados con el método de inmersión-sonicación de la presente invención pueden ser incubados en un baño que contiene, típicamente, entre 1 y 10 \mug /ml de una solución acuosa de la construcción génica de la invención en un volumen mínimo suficiente como para que los animales acuáticos puedan sobrevivir durante el corto período de tiempo (unos segundos) necesario para que puedan captar la construcción génica de la invención y pueda producirse la respuesta inmune en el animal acuático. Una cantidad típica para inmunizar animales acuáticos mediante bombardeo de partículas está comprendida entre 10 ng y 1 \mug.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Desarrollo de un vector ADN mejorado para su utilización-reutilización en un método de vacunación ADN por inmersión-sonicación en peces Aplicación al VHSV de la trucha I. Materiales y métodos Detección de la expresión de GFP

Se utilizó este ensayo para detectar las células transfectadas con plásmidos que codificaban GFP que estaban expresando la proteína. Se examinaron las monocapas de células EPC y se fotografiaron con un microscopio Nikkon invertido provisto de una lámpara de luz ultravioleta utilizando un filtro azul DM510 B-2a y una cámara SBIG ST-7 (Santa Bárbara Instrument group, Sta Bárbara, CA, EEUU). Se incluyó un filtro para evitar la fluorescencia inespecífica de infrarrojos (eyeguard for CFWN 10X MB J99000 ND4). Para tornar y procesar las microfotografías al microscopio se utilizó el programa CCDOPS versión 4,03 (Santa Bárbara Instrument Group) (Fernández-Alonso, 2000; Fernández- Alonso et al., 1999; Fernández-Alonso et al., 2001).

Detección de la expresión de \beta-galactosidasa (\betagal)

Para ensayar la actividad \betagal en las células EPC transfectadas con una máxima sensibilidad, se utilizó el ensayo Gal-screen (Tropix, Bedford, MA, EEUU). Después de eliminar el sobrenadante del cultivo que cubría las monocapas de las células EPC transfectadas, se añadieron 200 \mul de Triton 0,025% x 100 por pocillo y se agitó durante 15 minutos para su lisis. Después se añadieron 100 \mul por pocillo de una mezcla de substrato y tampón de lisis-potenciador y 30 minutos más tarde, se contaron alícuotas de 20 \mul durante 2 segundos cada una en un aparato MiniLumat LB9506 (EG&G Berthold, Postfach, Alemania). En las condiciones usadas, 1 pg de \betagal rendía 4 x 10^{4} cps (López et al., 2001).

Tinción histológica de \betagal

Para visualizar la actividad \betagal en las células EPC transfectadas, las monocapas EPC se fijaron durante 5 minutos con metanol a -20ºC y se tiñeron con 2 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indol-\beta-D-galactopiranósido (Xgal) en ferrocianida II 5 mM, ferrocianida III 5 mM y MgCl_{2} 2 mM en PBS. Después de 16 horas, las monocapas se lavaron con agua y se secaron al aire. Para estimar el porcentaje de células teñidas se tomaron 3 fotografias al azar con un microscopio invertido Olympus provisto de una cámara fotográfica digital. Se contaron 700-1.000 células por pocillo y los resultados se expresaron en medias y desviaciones estándar de 2 pocillos por experimento (López et al., 2001).

Virus de la Septicemia Hemorrágica Vírica (VSHV)

La cepa del virus de la septicemia hemorrágica vírica (VSHV) empleada fue el aislado francés VHSV-07.71 (Bernard et al., 1983; DeKinkelin and LeBerre, 1979; LeBerre et al., 1977) que se obtuvo de la trucha arco iris Oncorhynchus mykiss (Walbaum). La producción y titulación de virus se realizó según la metodología descrita por DeKinkelin (DeKinkelin and LeBerre, 1979). Retirando previamente el medio utilizado para crecer las células, se infectaron monocapas de EPC con VHSV en medio con 2% de suero de ternera fetal (SFB), a baja multiplicidad de infección (m.o.i.=10^{-2}-10^{-4}). Las células se mantuvieron en adsorción con el virus durante 1 h a 14ºC con agitación suave cada 15 minutos y se rellenaron los frascos con medio con 2% de SFB, hasta la lisis completa del tapiz celular (10-14 días). Los inóculos para neutralización se obtuvieron separando los restos celulares del sobrenadante por congelación y descongelación y posterior centrifugación a 3.000 rpm, recuperación del sobrenadante y congelación a -70ºC. En cuanto a la purificación del virus, la metodología seguida es básicamente la descrita por DeKinkelin
(DeKinkelin, 1972), modificada por Basurco (Basurco, 1990). Después de descartar por centrifugación los restos celulares de cultivos de EPC infectados, se precipitó el virus con politilenglicol 6.000 (PEG-6.000) al 7% en ClNa al 2,3% a 4ºC y en agitación durante 2 h. Después de centrifugar a 10.000 g durante 45 minutos se resuspendió el sedimento en 1-2 ml de TNE (Tris 0,15 M, NaCl 0,15 mM, EDTA 1 mM, pH 7,6). Para aumentar la pureza, el virus se ultracentrifugó a través de un gradiente de sacarosa 15-45% en TNE a 80.000 g durante 270 minutos en una ultracentrífuga Beckman 25-75 con rotor SW27. La estimación de la cantidad de proteína se realizó mediante medida de la absorbancia a 280 nm [A_{280 \ nm} (\in = 1,4)] o por tinción con azul de Coomassie y comparación con patrones conocidos, considerado el límite de detección 1 \mug por banda de proteína detectada.

Plásmidos utilizados

Se usaron, principalmente, los plásmidos pCMV\beta de 7,2 kpb (Clontech Labs, Palo Alto, CA, EEUU), pMOK\betagal (6,9 kpb) o pMCV1.4\betagal (5,9 kpb) (Ready Vector, Madrid, España). Todos ellos contienen el gen de la \beta-galactosidasa (\betagal) de E. coli bajo el control del promotor temprano mínimo del citomegalovirus (CMV). Ahora bien, mientras que el pCMV\beta solo contiene el promotor mínimo (100 pb) y 687 pb de secuencias potenciadoras (enhancer) (promotor mínimo + 687 pb 5' = promotor corto), los plásmidos pMOK\betagal y pMCV1.4\betagal contienen 218 pb de secuencias enhancer adicionales, desde el nucleótido (nt) 1 hasta el nt 218 de la SEQ ID NO: 1, en posición 5' respecto al promotor de CMV. Los plásmidos pMOK \betagal y pMCV1.4\betagal contienen el promotor identificado en esta descripción como el "promotor largo de CMV" cuya secuencia de 798 nt se muestra en la SEQ ID NO: 1. El plásmido pMCV1.4\betagal deriva del plásmido pMOK\betagal por eliminación de aproximadamente un 1 kpb de secuencias bacterianas innecesarias y por la inclusión de un sitio múltiple de clonaje.

Otros promotores se ensayaron con \betagal tales como el promotor corto de CMV que es un producto comercial en los plásmidos pcDNAI/Amp y pcDNA3 (InVitroGen), el promotor de SV40 (p\betagal ctrl., de Clontech) y el promotor de la actina de carpa (pAE6, de la Dra Estepa, Univ. Elche, y \betaactin-lacZ, del Dr. McLean, Univ. de Southampton).

Como genes marcadores alternativos se ensayaron la proteína verde fluorescente (GFP) y la luciferasa (Luc). El gen de la proteína verde fluorescente (GFP) se utilizó clonado bajo el promotor CMV corto en el plásmido GFP-pQBI_{25} (6,2 kpb) (Quantum Biotech Inc, Montrevil-sous-bois, Francia) o bajo el promotor de la actina de carpa pGFPQBI_{25}-pAE6 que contienen el gen GFP. El gen Luc se utilizó clonado bajo el promotor CMV utilizando los plásmidos comerciales pGL3ctrl, pRL-CMV y pRLnull (Promega, EEUU) y el pCMV-Luc donado por el Dr. Brémont (INRA, Institut National de la Recherche Agronomique, París, Francia).

Para la generación de la construcción G3-pcDNAI/Amp, que codifica la pG de VHSV, se partió de la construcción G-pcDNAI (Dr. Michel Brémont, INRA, Francia), que contiene el gen de la pG de VHSV (aislado francés 07.71) clonado en el vector pcDNAI (4,0 kpb) (InvitroGen) y se subclonó en el vector comercial pcDNAI/Amp (4,8 kpb) (InvitroGen) (Fernández-Alonso et al., 1999). Además se subclonó bajo el promotor de actina de carpa (G-pAE6 donado por la Dra. Estepa, Universidad Miguel Hernández (UMH), España) y de T7 (G-pGEMTeasy donado por el Dr. Brémont, INRA, Francia).

Subclonajes del plásmido pGEMTeasy-G al plásmido pMCV1.4

Para llevar a cabo la prueba de expresión de la pG de VHSV en plásmidos con el promotor largo de CMV, la pG obtenida en pGEMTeasy hubo de subclonarse en el plásmido pMCV1.4, que era el que expresaba con mejor eficiencia la \betagal en EPC. Para ello, se obtuvo el gen pG de VHSV mediante una digestión preparativa a partir de 2 \mug de la construcción pGEMTeasy-G (Dr. Bremont, INRA, Francia) con EcoRI (10 U/\mul) (GibcoBRL, Postfach, Alemania), ya que la pG está clonada entre dos sitios EcoRI, durante 2 h a 37ºC en un aparato Techne dri-block. De igual manera se linearizó el pMCV1.4 (Ready Vector). Para disminuir su religación, primero se inactivó la EcoRI del plásmido digerido pMCV1.4 a 65ºC durante 15 minutos y después se añadió fosfatasa alcalina (Roche, Barcelona, España). La mezcla se incubó a 37ºC durante 60 minutos y después se inactivó la fosfatasa a 65ºC durante 15 minutos. Los productos de las digestiones se separaron en un gel de agarosa de bajo punto de fusión (LMP, low melting point) al 1% (Sambrook et al., 1989), recuperando y purificando las bandas obtenidas con columnas del kit comercial SNAP (InVitroGen, Barcelona, España). Se realizó la ligación del plásmido y el inserto pG (razón plásmido:inserto 1:3, incluyendo controles sin inserto), a temperatura ambiente durante 2 h utilizando la DNA ligasa de T4 (Roche) en un volumen final de 20 \mul por mezcla de ligación. Los 20 \mul de mezclas ligadas se pipetearon en pocillos de placas de 96 pocillos provistas de filtros MF en su fondo (Millipore, Madrid, España) y se dializaron durante 45 minutos poniendo las placas a flotar sobre agua destilada. Después se transformaron por electroporación 10 \mul de bacterias competentes E. coli Top 10 (InVitroGen, Barcelona, España) con 1 \mul de mezcla de ligación dializada en cubetas de 0,1 cm (Biorad) a 1,8 kv en un aparato Eppendorf 2.510. Después de la transformación se añadieron 0,3 ml de medio TB (Sigma) con 8 ml de glicerol/1, pH 7,5 y se incubaron las bacterias a 37ºC durante 1 h en un incubador con agitación. Se sembraron 200 \mul por placa en placas Petri de 9 cm de diámetro de TB-kanamicina (100 \mug/ml) y se incubaron a 37ºC durante toda la noche.

La extracción del ADN plasmídico se realizó por el método del CTAB a partir de 6 colonias transformadas y de una colonia del control de ligación. Para ello, se incubaron cultivos de 2 ml de medio TB-ampicilina (100 \mug/ml) con las colonias en tubos de 13 ml (Starstedt, Inc., Newton, EEUU) a 37ºC con agitación durante la noche. Se recuperó el precipitado bacteriano por centrifugación a 12.000 rpm durante 10 segundos y se sometió a lisis con solución STET (Tris-CIH 50 mM pH 8, EDTA 50 mM pH 8,8% de sacarosa, 0,1% de Triton x100) y lisozima (1 mg/ml) durante 2 minutos a temperatura ambiente y durante 45 segundos en un bloque térmico a 100ºC. Se centrifugó después a 12.000 rpm durante 8 minutos y se recuperó el sobrenadante, que se trató con RNasa (50 \mug/ml) durante 30 minutos a 37ºC. El ADN se trató durante 5 minutos a temperatura ambiente con una solución al 5% de CTAB (Sigma) (0,2% final), previamente solubilizado y se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 minutos. El precipitado recuperado se disoció del CTAB con etanol 100% y ClNa 5 M a una temperatura de -70ºC durante 20 minutos y se lavó con etanol 70% frío. Se resuspendió el precipitado en H_{2}O destilada estéril (Sigma).

Para detectar la presencia del inserto, se digirió el ADN extraído de los distintos clones durante 2 h a 37ºC con EcoRI. Se separaron los productos de la digestión en un gel de agarosa al 1% y se seleccionaron los clones que tenían inserto. Para distinguir la dirección del inserto, los plásmidos aislados se sometieron a digestión con las enzimas SacI y XmaI que producían fragmentos de 4,3+0,08 kpb en el caso de que la dirección del inserto fuera correcta o de 1,6+2,8 kpb en el caso de que la dirección del inserto fuera la contraria. Se escogió uno de los clones que tenía el inserto en la dirección adecuada y se amplificó para la experimentación subsecuente.

Caracterización por PCR y secuenciación

Para la caracterización preliminar de las construcciones se utilizó la secuencia publicada del gen de 1,58 kpb de la pG de VHSV que contenía la construcción de partida G- pcDNAI y pGEMTeasy-G (Thiry et al., 1991a; Thiry et al., 1991b). Se diseñaron 4 oligonucleótidos con el objeto de amplificar dos fragmentos solapados en la zona del frg#11 del gen de pG (nucleótidos (nt) 13 a 339 y nt 184 a 1.536 de la secuencia de pG). La secuencia de los oligonucleótidos en sentido 5'\rightarrow3' fue la siguiente:

#59 (ida): ATG GAA TGG AAC ACT TTT TTC TTG G TG;

#60 (vuelta): GGT GAGC TCG ATA AGT CAC TCT GTG CAG;

#61 (ida): CGA CCA GCT CAA CTC AGG TGT CCT CAT;

#62 (vuelta): TCA GAC CGT CTG ACT TCT GGA GAA CTG.

Se calculó el T_{M} de forma manual y mediante el programa PCGene. El tamaño esperado de los fragmentos amplificados era de 327 (oligos #59 y #60, nt 13 a 339 de la secuencia de G) y de 1.353 (oligos #61 y #62, nt 184 a 1.536 de la secuencia del gen G de VHSV) pares de bases. Se realizaron amplificaciones mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cada una de las dos parejas de oligonucleótidos (#59-#60 y #61-#62) y las dos construcciones con el gen G, la de partida G-pcDNAI y la subclonada G3- pcDNAI/Amp, incluyéndose controles negativos sin ADN y con el plásmido comercial utilizado en el subclonaje (pcDNAI/Amp). Se utilizó la ADN Polymerasa AmpliTaq (Perkin-Elmer, Bucks, Inglaterra). Se mezclaron para la reacción 5 U de Ampli Taq, 200 ng de cada uno de los oligonucleótidos de las parejas correspondientes, 10 ng de ADN plasmídico, el tampón correspondiente, en presencia de MgCl_{2} 2 mM y de una mezcla 0,2 mM de dNTPs (Promega), en un volumen final de 100 \mul. Primero se realizaron 30 ciclos de amplificación de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 55ºC y 2 minutos a 72ºC, seguido de un último ciclo de extensión de 10 minutos a 72ºC. Después se hicieron migrar en un gel del 1% de agarosa 10 \mul de cada PCR durante 2 h a 80 V para comprobar la amplificación.

Purificación de plásmidos

Los plásmidos se usaron para transformar bacterias E. coli DH5alfa (Clontech, Madrid, España). La preparación de plásmidos en gran cantidad se hizo después utilizando el sistema comercial de purificación de ADN Wizard Plus Megaprep (Promega, Madison, WI, EEUU), siguiendo las instrucciones de la casa comercial, y un protocolo de purificación modificado basado en lisis alcalina omitiendo el paso final de cromatografía en resina. El protocolo se simplificó y optimizó en cuanto a rendimiento y grado de pureza. El protocolo optimizado es el siguiente: se resuspendieron 3 g de pasta de bacterias en tubos de 250 ml (rotor GSA) con 40 ml de la solución I (Tris-Cl 50 mM, EDTA 40 mM, 100 \mug/ml de RNAsaA, pH 7,5) y se lisaron durante menos de 20 minutos mezclando por inversión hasta que se obtuvo un medio transparente con una solución de lisis II (NaOH 0,2 N, 0,1% de dodecilsulfato sódico (SDS)). Después, los restos bacterianos se precipitaron con una solución de neutralización III (acetato de potasio 1,3 M, pH 4,8) y se retiró el precipitado por centrifugación a 14.000 g durante 15 minutos y filtración a través de papel de filtro. Para recuperar el plásmido del sobrenadante se precipitó con 55 ml de isopropanol durante 5 minutos, agitando por inversión y se centrifugó a 14.000 g durante 15 minutos. Después de secado y disuelto en H_{2}O (Sigma) se volvió a precipitar el ADN en tubos de 40 ml (rotor SS34) con acetato de sodio 0,25 mM pH 5,2 y etanol al 100% frío y por último se lavó con etanol al 70%. Después de secar el precipitado durante 20 minutos a vacío o durante toda la noche a temperatura ambiente se disolvió el ADN en H_{2}O (Sigma). Finalmente se estimó la cantidad de ADN total por medida de la absorbancia a 260 nm en un espectrofotómetro (A_{260 \ nm}) y el porcentaje de plásmido por electroforesis en gel de agarosa al 1% y se ajustaron las soluciones de plásmido a 0,5-1 mg/ml de ADN total (A_{260 \ nm}). Las preparaciones de plásmidos contenían 80-100% de ADN plasmídico, según se demostró por electroforesis en gel de agarosa, siendo el resto otros ADN bacterianos.

Ensayos con truchas de 2 cm inmunoincompetentes y GFP-pQBI_{25}

Para estos ensayos se utilizó el plásmido GFP-pQBI_{25} que codifica la proteína fluorescente GFP.

Para los ensayos basados en ultrasonidos de baja frecuencia se mantuvieron grupos de 5 truchas de 0,3-0,5 g de peso (2 cm) en un vaso de vidrio con 20 ml de agua de acuario dentro de un baño sonicador de 250 ml de capacidad y de 40 W/cm^{2} de potencia de ultrasonidos a una frecuencia de 40 kHz (Selecta, Barcelona, España) lleno con 100 ml de agua. Primero se aplicaron los ultrasonidos en dos pulsos de 2 s cada uno con 1 minuto de descanso entre pulsos, después se añadió el GFP-pQBI_{25} y se aplicaron 2 pulsos de 1 s cada uno con 1 minuto de descanso entre pulsos. Se mantuvieron después las truchas con el GFP-pQBI_{25} durante 30 minutos, se traspasaron a 500 ml y se mantuvieron a 4-10ºC con aireación durante 1-2 semanas mientras se analizaba la expresión de la GFP.

Ensayos de vacunación/contraprueba in vivo con truchas inmunocompetentes y G3-pcDNAI/Amp

Para estos ensayos se utilizó el plásmido G3-pcDNAI/Amp que codifica la proteína G del VSHV. Se utilizaron truchas de peso y tamaño comprendidos entre 1-5 g (5-7 cm), que fueron adquiridas en la piscifactoría Fuentehermosa (Puebla Lillo, León, España) y El Molino (Manzanares del Real, Madrid, España). Hasta el momento de la vacunación/contraprueba, las truchas se mantuvieron en acuarios de 30 litros en circuito cerrado. Las instalaciones donde se realizaron las pruebas se ubican en el Laboratorio de Alta Seguridad del I.N.I.A. (Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias) en Valdeolmos (Madrid).

Los experimentos de vacunación/contraprueba se realizaron mediante baño-inmersión siguiendo protocolos descritos con anterioridad (Basurco, 1990). En cada experimento se incluyó un acuario con 10 \mug de G3-pcDNAI/Amp inyectado por trucha y un acuario control con truchas no vacunadas. Brevemente, las truchas se mantuvieron en un volumen de 500 ml de agua del acuario con fuerte aireación mediante difusores a 8-10ºC durante 30-120 minutos desde la adición de las vacunas, según los diferentes experimentos. Inmediatamente después, se devolvieron las truchas a los acuarios y se esperaron unos 30 días para dar la contraprueba con VSHV. En todos los casos se añadió la mezcla y baño a los acuarios.

Para la vacunación utilizando ultrasonidos de baja frecuencia se mantuvieron 20-30 truchas de 5-7 cm en un baño sonicador con 100 ml de agua de acuario (volumen total aproximado de 250 ml) con las formulaciones de plásmido. Se aplicaron 2 pulsos de 10 s, se añadió el G3-pcDNAI/Amp y se aplicaron 2 pulsos de 2 s. Entre un pulso y otro se esperó 1 minuto. Se mantuvieron después en contenedores con un volumen total de 500 ml de agua del acuario durante 30 minutos con aireación y se traspasaron después a acuarios de 30 l a 10ºC en circuito cerrado, hasta el momento de la contraprueba.

Los experimentos de vacunación por inyección para el estudio de promotores se realizaron en las mismas condiciones que el resto, inyectando directamente los plásmidos por vía intramuscular. Se utilizaron los plásmidos G-pcDNA3-CMV y el pcDNA3 como control negativo.

Las contrapruebas por inmersión se realizaron con una dosis de 10^{5} unidades formadoras de placa por ml (UFP/ml) de la cepa VSHV 07.71. Las contrapruebas por inyección intramuscular (i.m.) y por vía oral (v.o.) se realizaron con una dosis de 10^{6} UFP/ml de virus 50-200 \mul por trucha. Se utilizó aireación con difusores cuando las contrapruebas se hicieron en 0,5-1 l en recipientes externos a los acuarios. Después de la contraprueba se recopilaron los datos de mortalidad durante 30-40 días y se calculó el porcentaje relativo de supervivencia (PRS) según la fórmula: 1 - mortalidad de truchas tratadas con plásmido/mortalidad en el control de truchas no vacunadas x 100.

II. Resultados Análisis de posibles alteraciones del vector G3-pcDNAI/Amp después de la sonicación

Para la vacunación utilizando ultrasonidos de baja frecuencia se mantuvieron 20-30 truchas de 5-7 cm en un baño sonicador con 100 ml de agua de acuario (volumen total aproximado de 250 ml) con las formulaciones de plásmido. Se aplicaron 2 pulsos de 10 s, se añadió el G3-pcDNAI/Amp y se aplicaron 2 pulsos de 2 s. Entre un pulso y otro se esperó 1 minutos. Se mantuvieron después en contenedores con un volumen total de 500 ml de agua del acuario durante 30 minutos con aireación y se traspasaron después a acuarios de 30 litros a 10ºC en circuito cerrado, hasta el momento de la contraprueba. Se tomaron muestras de la solución del vector en los 100 ml de agua antes y después de la sonicación y se repitió el proceso de sonicación 1-3 veces. El análisis por electroforesis de agarosa del ADN demostró que no había alteraciones significativas ni en la cantidad ni en la emigración de los plásmidos empleados y que por lo tanto pueden emplearse para más de una sonicación.

Estudios de vacunación ADN por inyección de G-pcDNA3 con promotores CMV corto

Se realizaron 4 experimentos de vacunación por inyección y contraprueba con el plásmido G-pcDNA3.

En el primero de los experimentos se realizó la contraprueba por inmersión. La mortalidad en el grupo inyectado con G-pcDNA3 fue del 26%. Puesto que la mortalidad de los grupos control no vacunados estuvo comprendida el 85-90%, el promotor CMV fue capaz de proteger a las truchas.

En el segundo de los experimentos, se realizó la contraprueba por inyección vía intraperitoneal (i.p.) trucha a trucha. En este caso la mortalidad de los grupos control no vacunados fue del 68% y no se hallaron diferencias significativas entre las mortalidades de truchas inyectadas con G-pcDNA3-CMV (38%) o pcDNA3 (34,8%).

En el tercer experimento se utilizaron 2 acuarios por grupo y se realizó la contraprueba por inmersión. En este caso la mortalidad de los grupos control no vacunados fue del 52% y del 70% y de los grupos vacunados con el pcDNA3 varió entre el 10% y el 48% entre acuarios. Este es un ejemplo ilustrativo de las variaciones entre acuarios que tienen esta clase de experimentos. Las mortalidades de truchas inyectadas con G-pcDNA3-CMV (15%) fueron menores en su conjunto que las obtenidas en los controles, confirmando que el promotor CMV es capaz de expresar pG y proteger truchas.

En los dos últimos experimentos descritos se observaron mortalidades más lentas de lo que es habitual en esta infección (50% de mortalidad en 15-17 días frente a 7-9 días). Para comprobar si este retraso era debido a la baja dosis de virus suministrada (10^{5} UFP/ml), se multiplicó por 100 la dosis administrada y se realizó un nuevo experimento con 10 \mug de plásmidos (diez veces más dosis que en anteriores experimentos) y contraprueba con una dosis i.m. y otra administrada por vía oral. Esta abundante dosis vírica en la contraprueba provocó un 50% de mortalidad a los 3-5 días en los controles no vacunados. La mortalidad de ambos controles (inyectados con PBS y pcDNA3) alcanzó el 100% y el 95%, respectivamente. En los grupos vacunados con G-pcDNA3-CMV (72%) la mortalidad de las truchas fue un poco menor pero muy alta. El hecho de que la mortalidad sea tan alta puede deberse a un exceso de inóculo. Sí se observó, sin embargo, un retraso de 5 días en la mortalidad entre control no vacunado y truchas vacunadas con pcDNA3 y G-pcDNA3-CMV.

Vacunación ADN por inmersión en G3-pcDNAI/Amp con sonicación

En sucesivos experimentos se probaron solamente ultrasonidos, DOTAP (dioleoil trimetil amonio propano) y bactofección (inmersión en bacterias recombinantes conteniendo el plasmido), métodos con los que se obtuvieron los mejores resultados en los experimentos previos con GFP-pQBI_{25}. Las menores mortalidades correspondieron al grupo de truchas vacunadas con G3-pcDNAI/Amp+ultrasonidos (aproximadamente 50%) y las mayores a las truchas vacunadas con E. coli (G3-pcDNAI/Amp) (93,3%), G3-pcDNAI/Amp+DOTAP (95%) y a la combinación de formulaciones (100%) [G3-pcDNAI/Amp + DOTAP + ultrasonidos] y (85,7%) [G3-pcDNAI/Amp + bactofección + ultrasonidos] (datos no mostrados).

En un segundo experimento de nuevo las truchas vacunadas por inmersión en G3-pcDNAI/Amp+ultrasonidos presentaron la menor de las mortalidades relativas (47,6%) frente a las vacunadas por G3-pcDNAI/Amp+bactofección (57,1%) y G3-pcDNAI/Amp+DOTAP (87,5%). La mortalidad de truchas inyectadas con G3-pcDNAI/Amp fue del 15,5%.

El porcentaje relativo de supervivencia calculado a partir de tres experimentos de vacunación por inmersión y sonicación con relación a las mortalidades de las truchas no vacunadas se muestra en la Tabla 1. La máxima supervivencia relativa del 71,5% se obtuvo por inyección de G3-pcDNAI/Amp. De los métodos ensayados por inmersión, la aplicación de G3-pcDNAI/Amp+ultrasonidos a las truchas fue el método que proporcionó una mayor supervivencia a la contraprueba (50,1%). La inmersión en G3-pcDNAI/Amp+DOTAP (12,3%) y la inmersión E. coli (G3-pcDNAI/Amp) (20,7%) así como el G3-pcDNAI/Amp (8,8%) obtuvieron PRS muy cercanos a la mortalidad total. Asimismo, se observó mayor reproducibilidad entre diferentes experimentos (dato muy dificil de obtener en los experimentos de vacunación/contraprueba con peces) en el caso de G3-pcDNAI/Amp+ultrasonidos (CV=3,2%), que en G3-pcDNAI/Amp+DOTAP y E. coli (G3-pcDNAI/Amp) (CV=10,9 y 14,0%, respectivamente).

TABLA 1 Porcentaje relativo de supervivencia (PRS) de las truchas 1 mes después de vacunación por inmersión en G3-pcDNAI/Amp

Método de inmersión	PRS
G3-pcDNAI/Amp+inyección	71,5 \pm 0,0 (n=1)
G3-pcDNAUAmp+ultrasonidos	50,1 \pm 3,2 (n=3)
G3-pcDNAI/Amp	8,8 \pm 0,0 (n=2)

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{162mm} Se utilizaron aproximadamente 20
truchas de 5-7 g por trucha por punto experimental.
En cada uno de los tres experimentos se incluyó un acuario control
con truchas no vacunadas. La mortalidad en los acuarios sin vacunar
fue del 100%, 87,5% y 63,6%, respectivamente, para los tres
experimentos. Se calcularon las medias y desviaciones estándar para
el número de experimentos (indicado entre paréntesis). En negrita se
destacan los resultados 
significativos.\end{minipage} \cr}

Aumento de eficiencia de transfección mediante el uso de vectores con el promotor largo de CMV

La Figura 1 muestra que el plásmido pMOK\betagal y su derivado de menor peso molecular, el plásmido pMCV
1.4\betagal, pero ambos con el promotor largo de CMV, teñían con Xgal 3-4-veces mayor número de células EPC transfectadas que el plásmido pCMV\beta. Los incrementos en la eficiencia de transfección fueron incluso mayores cuando la actividad \betagal se estimó por luminiscencia (aproximadamente 10 veces mayores, es decir correspondientes a aproximadamente 170 x 10^{6} cps equivalentes a 3.400 ng de \betagal). No se encontraron diferencias significativas entre las eficiencias de transfección de pMOK\betagal y su derivado de menor peso molecular pMCV1.4\betagal (n=8). Sin embargo, el valor absoluto de la eficiencia variaba de experimento a experimento. Como resultado de la mayor eficiencia de transfeccción, la inspección visual de las placas de EPC transfectadas por pMOK\betagal/pMCV1.4\betagal y teñidas por Xgal, mostraba un color azul que nunca se había podido obtener con pCMV\beta.

La actividad \betagal obtenida con los pMOK\betagal/pMCV1.4\betagal fue también óptima a 1-3 \mug de plásmido por ml. Concentraciones de ADN más altas o más bajas disminuían la actividad de \betagal a niveles de fondo confirmando los resultados obtenidos anteriormente con pCMVB (López et al., 2001).

Estos resultados se confirmaron por tinción de las monocapas EPC transfectadas con pMCV1.4\betagal y teñidas con Xgal. Las células con una gran cantidad de \betagal aparecen teñidas de un azul muy intenso mientras que otras células aparecen teñidas con azul claro. El número de células teñidas permanecía constante durante varios días antes de difundirse a otras células adyacentes al cabo de una semana.

La Tabla 2 muestra un resumen de las eficiencias de transfección y su reproducibilidad obtenidos durante 57 experimentos a lo largo de unos 3 años de experimentación. Los resultados obtenidos demuestran que, usando pCMVB (promotor de CMV corto) se obtuvieron 12,8\pm6,5% de células EPC transfectadas (n=24) con un coeficiente de variación (CV) del 54,1%. El uso de pMOK\betagal o pMCV1.4\betagal, plásmidos que utilizan un promotor de CMV más largo que el de pCMV\beta, aumentaron la eficiencia de transfección estimada por número de células EPC teñidas con X-gal en 2,2-2,4 veces (hasta un aproximadamente 30%), y disminuyeron el CV aproximadamente al 40%. Es de resaltar que, aunque el número de células EPC transfectadas aumenta unas 2 veces, la cantidad de \betagal expresada por célula puede aumentar unas 10 veces.

TABLA 2 Eficiencias de transfección y reproducibilidad con plásmidos con diferentes promotores y tratamientos celulares

Plásmido	Tratamiento	Células teñidas con Xgal,	CV, %	AET
		% (nº experimentos)
pCMV\beta	- - -	12,8 \pm 6,5 (24)	54,1	1
pMOK\betagal	- - -	29,1 \pm 12,3 (6)	42,2	2,2
pMCV1.4\betagal	- - -	30,7\pm 12,1 (13)	39,3	2,4

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{162mm} Las eficiencias de transfección del
pcDNAI/Amp \beta gal o del pQBI25 GFP fueron similares a las del
pCMV \beta . CV, coeficiente de variación expresado en porcentaje.
AET, aumento de la eficiencia de transfección que se calculó según
la formula: porcentaje de células transfectadas / porcentaje de las
células transfectadas con
pCMV \beta .\end{minipage} \cr}

Se comprobó después, que la mejora de la transfección no dependía del gen que se hubiera utilizado bajo el promotor. Para ello se sustituyó el gen de la \betagal por el de la pG de VHSV y se estimó la expresión de la pG de VHSV en membrana por tinción con anticuerpos específicos y por formación de sincitios. Se transfectaron células EPC y se demostró que la pG se expresaba en la membrana en un número mayor de células y con mayor intensidad (Figura 2) en el caso de utilizar el pMCV1.4 con el promotor largo de CMV, en vez del pcDNAI/Amp con el promotor corto de CMV. Además el número de sincitios formados con el pMCV1.4-G fue mayor y de mayor tamaño (número de núcleos por sincitios) en el caso de usar el promotor largo de CMV (datos no mostrados).

Estudios de la diferencia de secuencias entre el promotor largo y corto de CMV

La Figura 3 muestra las diferencias de las secuencias de los plásmidos pCMV\beta, pMOK\betagal y pMCV1.4\betagal, que se restringen a las longitudes de sus promotores CMV. Asimismo, la Figura 4 muestra las diferencias de secuencias entre los promotores CMV cortos, que se encuentran en los vectores pcDNAI/Amp, pcDNA3 o pQBI25, y el promotor largo de CMV (SEQ ID NO: 1) de los vectores pMOK\betagal o pMCV1.4\betagal.

III. Discusión Mecanismo de la protección de truchas vacunadas con G3-pcDNAI/Amp a la contraprueba con VSHV

Mediante vacunación ADN por inmersión y la aplicación de una serie de ultrasonidos de baja frecuencia, se inmunizaron y protegieron truchas de 5-7 cm (mínimo tamaño con el que se pueden vacunar). Utilizando vacunación ADN con ultrasonidos se ha podido establecer alrededor de un 50% de protección con muy poca variación entre los experimentos (Tabla 1). Esto indica que los ultrasonidos, a pesar de las dificultades en reproducir los resultados de este tipo de experimentos, es suficientemente reproducible y que podría mejorarse su posible aplicación práctica si se reutilizarán las soluciones de vector utilizadas para varias series de aplicaciones aumentando el número de truchas vacunadas por cantidad de vector.

Se desconocen los mecanismos por los cuales los ultrasonidos pueden inducir la transfección en las truchas. A nivel macroscópico se puede observar una liberación al medio acuoso del mucus que cubre las branquias y la superficie corporal de la trucha durante la aplicación de los ultrasonidos. La eliminación o disminución de la barrera física que constituye el mucus que rodea toda la superficie de la trucha podría facilitar el acceso del ADN a las células de la piel. Sin embargo, se desconoce si el ADN accedió a las células epiteliales de la trucha a través de las branquias y desde el sistema circulatorio o directamente desde el agua.

A nivel celular, la interacción de los ultrasonidos de baja frecuencia y duración con los tejidos vivos es compleja y poco estudiada en el caso de los peces. Se sabe que el ultrasonido penetra bien en. los tejidos vivos, produciendo efectos térmicos, cavitacionales, relacionados con la presión osmótica, la tensión superficial y la adhesión de las células. La intensidad y duración de los ultrasonidos aplicados a la trucha en este trabajo no puede producir ni hipertermia, ni daño por cavitación en el epitelio externo de la piel, ya que su intensidad y duración están por debajo de los niveles que los provocan. Por otra parte, los ultrasonidos terapéuticos (aproximadamente 2 Wcm^{-2} a 3.000 kHz durante 30 a 90 s) producen un ensanchamiento del espacio intercelular así como la rotura de los microfilamentos de los desmosomas que conectan células adyacentes en el epitelio de la piel de carpa (Frenkel and Kimmel, 2000). En los experimentos que aquí se mencionan se utilizaron 0,4-0,6 Wcm^{-2} a 40 kHz durante 8 s totales para truchas de 2 cm ó 24 s totales para truchas de 5-7 cm. El tiempo de aplicación de los ultrasonidos a dichas intensidades se escogió como aproximadamente la mitad del tiempo al que los pulsos de ultrasonidos producían efectos deletéreos observables a simple vista en las truchas (hemorragias, desprendimiento de la mucosa, o muerte). A las intensidades y tiempos aquí utilizados las truchas tratadas continuaron viviendo sin alteraciones macroscópicas durante los 2-3 meses que duraron los experimentos más largos. A nivel celular se ha comprobado también que la aplicación de ultrasonidos a dichas intensidades y tiempos a una suspensión de células (EPC) no disminuía la capacidad de adhesión ni la viabilidad de éstas (datos no mostrados).

Las condiciones de aplicación de los ultrasonidos variaban con respecto a los experimentos detallados en otros trabajos, en cuanto a la superficie del baño, la existencia de barreras de vidrio (en el caso de las truchas de 2 cm), la distancia de la superficie de transducción a las truchas (variaba entre 0-8 cm) y el ángulo de aplicación de los ultrasonidos. Estas dos últimas variaciones se deben a que las truchas no se encontraban inmovilizadas como se han hecho los experimentos en otros trabajos sino libres en el baño de ultrasonidos.

Dado que la perforación del espacio intercelular descrita en membranas celulares requiere intensidades mayores de ultrasonidos (2,2 Wcm^{-2} a 3.000 kHz durante 30 a 90 s), no es probable que dicho efecto tenga algo que ver con la adquisición del ADN plasmídico por las células de la piel de la trucha en nuestros experimentos, pero se necesita más evidencia experimental para clarificar esta posibilidad. Esta perforación podría ser temporal y/o variar con la potencia aplicada, la duración de los pulsos, el tiempo entre pulsos, el momento de adición del ADN, así como pequeñas variaciones en la temperatura.

Existen muchas variables en un protocolo de tratamiento por ultrasonidos y sólo unas pocas se han estudiado hasta ahora. Todas estas variables se han mantenido constantes en nuestros experimentos, pero su estudio podría llevar a una optimización de la cantidad de ADN que accede al interior de las células, a una mayor expresión de la proteína G para ser presentada al sistema inmune y con ello una inducción de una respuesta inmune más eficaz en la contraprueba.

Posible aplicación de la vacunación por inmersión utilizando ultrasonidos en acuicultura

La vacunación por inmersión tiene actualmente una gran proyección y aplicación en Acuicultura, ya que son métodos efectivos y prácticos para la vacunación en masa de peces. La mayoría de las vacunas bacterianas o bacterinas comerciales se administran de ordinario por este método. Es, por lo tanto, de gran interés práctico el continuar los estudios de vacunación ADN en esta línea, a la vista de los prometedores resultados de protección utilizando ultrasonidos.

Aunque el uso de ultrasonidos de baja frecuencia podría ser de fácil escalado para uso práctico en granjas piscícolas, la cantidad de plásmido requerido parece ser excesiva para ello. La concentración óptima de ADN fue de aproximadamente 10 \mug/ml. Para minimizar dicha cantidad, se ha demostrado que es posible reutilizar la solución de plásmido ya que no se degrada con, al menos, 3 series de sonicaciones y, además, se han seleccionado secuencias adicionales de promotor para hacerlo más eficaz. La permanencia sin alteración del ADN en el baño en el que se mantienen inmersas las truchas después del tratamiento con ultrasonidos podría dirigir los ensayos futuros hacia la reutilización de las mismas soluciones de plásmidos para vacunar varios grupos de truchas en el mismo baño, dentro de un límite de tiempo y de uso, que habría que estudiar. Los resultados de este trabajo abren un nuevo cauce para mejorar los métodos de vacunación de las especies piscícolas.

Mejora del promotor en los plásmidos utilizados

Otra manera de aumentar la transfección del ADN fue la de ensayar la influencia en la eficiencia de transfección de varios promotores. El promotor de CMV siempre consiguió mayores eficiencias de transfección que el de SV40 (datos no mostrados). Ahora bien, aunque todos los promotores comerciales de CMV poseen un mínimo de 100 pb, difieren en la longitud de las secuencias 5' (Figura 4). Al ensayar 2 plásmidos con distintas longitudes del promotor de CMV (pCMV\beta y pMOK\betagal) se demostró un aumento de 2-3 veces en el número de células transfectadas cuando se utilizó el plásmido con mayor longitud de secuencias 5' (pMOK\betagal) ["promotor largo de CMV" (SEQ ID NO: 1)]. En algunos experimentos el aumento de transfección permitía visualizar monocapas azules. Además, el aumento de expresión de \betagal estimado por luminiscencia podía llegar a ser de 10 veces (Figura 1), sugiriendo que el uso del promotor largo de CMV no solo aumentaba el porcentaje de células que expresaban \betagal sino también la expresión por cada célula transfectada.

Un derivado más pequeño del pMOK\betagal, el denominado pMCV 1.4\betagal, también era capaz de aumentar la eficiencia de transfección. Puesto que este derivado contenía además un sitio múltiple de clonaje, fue el plásmido elegido para subclonar la pG de VHSV para demostrar que el aumento obtenido no dependía del gen ubicado bajo el control del promotor. La comparación de secuencias entre los 3 plásmidos (Figura 3), permite concluir que la diferencia esencial está en las 218 pb adicionales que posee el promotor de CMV en los plásmidos pMOK\betagal y pMCV1.4\betagal. Ni el tamaño (el pMOK\betagal es del mismo tamaño que el pCMV\beta), ni las secuencias bacterianas comunes a los 3 plásmidos son responsables de las diferencias observadas.

La utilización de estas 218 pb adicionales bien con el promotor corto de CMV o con otros promotores de pez, puede servir para optimizar vectores para su uso en vacunas ADN, tanto por inyección (Anderson et al., 1996b; Lorenzen et al., 1998), como por inmersión-sonicación (Fernández-Alonso et al., 1999, Fernández-Alonso, 2000; Fernández-Alonso et al., 1998; Fernández-Alonso et al., 2001).

Referencias bibliográficas

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<110> Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)

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<120> Construcción génica, vector y vacuna ADN para la vacunación de animales acuáticos

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<160> 1

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<170> PatentIn version 2.0

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<210> 1

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<211> 798

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia del promotor de citomegalovirus (CMV) desde el nucleótido 1 al 798 que contiene fusionado al extremo 5' (nucleótidos 1 a 218) una secuencia de CMV potenciadora de la expresión

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<400> 1

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5

Claims

1. Una construcción génica que comprende una secuencia de control de expresión capaz de dirigir la expresión de un péptido inmunogénico en un animal acuático, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido inmunogénico de un patógeno de un animal acuático, en donde dicha secuencia de control de expresión es una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia A y una secuencia B, en donde dicha secuencia A comprende una secuencia potenciadora de la expresión, y dicha secuencia B comprende la secuencia del promotor de citomegalovirus (CMV), y en donde el extremo 3' de dicha secuencia A está unido al extremo 5' de dicha secuencia B.

2. Construcción según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia A está constituida por la secuencia de 218 bases comprendida desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 218 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

3. Construcción según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia B está constituida por la secuencia del promotor de CMV.

4. Construcción según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de control de expresión comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

5. Construcción según la reivindicación 1, en la que dicho péptido inmunogénico de un patógeno de un animal acuático se selecciona entre proteínas completas y fragmentos de las mismas, y epítopos peptídicos asociados con virus, bacterias o parásitos que provocan enfermedades en animales acuáticos.

6. Construcción según la reivindicación 5, en la que dicho péptido inmunogénico de un patógeno de un animal acuático se selecciona entre la proteína G (pG) del virus de la septicemia hemorrágica de la trucha (VHSV); la pG del virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV); las proteínas VP1, VP2, VP3 o la proteína N estructural del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV); la pG de la viremia primaveral de la carpa (SVC); la proteína p57 de Renibacterium salmoninarum; y antígenos de superficie de Ichthyophthirius.

7. Construcción según la reivindicación 1, que comprende dos o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican dos o más péptidos inmunogénicos de uno o más patógenos de animales acuáticos.

8. Un vector que comprende una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Vector según la reivindicación 8, seleccionado entre un vector viral y un vector no viral.

10. Vector según la reivindicación 8, que comprende una única construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

11. Vector según la reivindicación 8, que comprende dos o más construcciones génicas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

12. Empleo de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en la elaboración de una vacuna destinada a conferir protección a animales acuáticos frente a patógenos de animales acuáticos.

13. Empleo según la reivindicación 12, en el que dicha vacuna es una vacuna ADN.

14. Una vacuna que comprende una cantidad efectiva de una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, y, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

15. Vacuna según la reivindicación 14, caracterizada porque es una vacuna ADN.