ES2386373T3 - Vacuna contra la fiebre aftosa - Google Patents

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Abstract

Vacuna contra la fiebre aftosa, caracterizada porque comprende una cantidad eficaz de antígeno queconsiste en cápsidas vacías del virus aftoso, obtenidas in vitro mediante la expresión en células eucariotas,del ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso que codifica para la cápsida y del ADNc de la regióndel genoma del virus aftoso que codifica para la proteasa 3C, comprendiendo la vacuna además unvehículo o excipiente farmacéutica mente aceptable desde el punto de vista veterinario, en la que el ADNcde la región P1 del genoma del virus aftoso se modifica mediante sustitución del codón que codifica para elaminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEO ID NO: 38, o del codón que codifica para elaminoácido correspondiente al aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEO ID NO: 38 por uncodón que codifica para una cisteína.

Description

Vacuna contra la fiebre aftosa
Sector de la técnica
La presente invención se refiere a vacunas contra la fiebre aftosa y en particular a la mejora de su estabilidad térmica. También se refiere a procedimientos de preparación de esas vacunas, al uso de antígenos para la realización de esas vacunas y a los métodos de vacunación que las usan.
También se refiere concretamente a secuencias de nucleótidos, en particular ADNc, y a secuencias de aminoácidos, modificadas con respecto a las secuencias naturales del virus. Y la invención se refiere a los productos de expresión de las secuencias de nucleótidos modificadas y a los antígenos y a los virus aftosos que incorporan estas modificaciones.
Estado de la técnica
La fiebre aftosa es una de las enfermedades más virulentas y contagiosas que afectan a los animales de producción. Esta enfermedad es endémica en numerosos países en el mundo, concretamente en África, en Asia y en Sudamérica. Además, aparecen focos endémicos de manera episódica.
La presencia de esta enfermedad en un pais puede tener consecuencias económicas muy graves por las pérdidas de productividad, pérdidas de peso y de leche en las ganaderías afectadas y por los embargos comerciales impuestos a ese país.
Las medidas contra esta enfermedad consisten en la aplicación estricta de medidas de restricción de importación, de controles sanitarios y de cuarentenas, en el sacrificio de los animales enfermos y en programas de vacunación con ayuda de vacunas inactivadas, o bien preventivas a nivel nacional o regional, o bien perifocal en caso de aparición de un foco epidémico.
La enfermedad se caracteriza por su corto periodo de incubación, su naturaleza muy contagiosa, la formación de aftas en la boca y en las patas, y algunas veces por la mortalidad en animales jóvenes. La fiebre aftosa afecta a varias especies animales, en particular los animales bovinos, porcinos, ovinos y caprinos.
El agente responsable de esta enfermedad es un virus de ácido ribonucleico (ARN) perteneciente al género de los aftovirus y a la familia de los Picomaviridae (eooper et al., Intervirology, 1978, 10, 165-180). El virus de la fiebre aftosa también se denomina con las siglas en inglés FMDV ("foot-and-mouth disease virus", virus de la glosopeda). Actualmente, se conocen 7 tipos del virus de la fiebre aftosa, los tipos europeos (A, O Y e), los tipos africanos (SAT1, SAT2 YSAT3) y un tipo asiático (Asia 1). También se distinguen numerosos subtipos (Kleid et al. en Science, 1981,214, 1125-1129).
Se trata de un virus desnudo de forma icosaédrica de aproximadamente 25 nm de diámetro que encierra una molécula de ARN monocatenario de polaridad positiva de aproximadamente 8500 nucleótidos. Esta molécula de ARN está compuesta por un único marco de lectura abierto (ORF) que codifica · para una única poliproteína que encierra entre otras cosas el precursor de la cápsida también denominada proteína P1 o P88. La proteína P1 está miristilada en su extremo amino-terminal.
Durante el proceso de maduración, la proteina P1 se escinde por la proteasa 3e en tres proteínas denominadas VPO, VP1 y VP3 (o respectivamente 1AB, 1 D Y 1e) (Belsham G. J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261). En el virión, la proteína VPO se escinde a continuación en dos proteínas, VP4 y VP2 (o respectivamente 1A y 1 B). Se desconoce el mecanismo de conversión de las proteínas VPO en VP1 y VP3 y de formación de viriones maduros.
Las proteínas VP1, VP2 YVP3 tienen un peso molecular de aproximadamente 26.000 Da, la proteína VP4 es más pequeña, con aproximadamente 8.000 Da.
La asociación simple de las proteínas de cápsida forma el protómero o la molécula 5S, que es el constituyente elemental de la cápsida del virus aftoso. Este protómero se compleja a continuación para dar un pentámero para formar la molécula 12S.
El virión resulta de la encapsidación de una molécula de ARN genómico por medio del ensamblaje de 12 pentámeros 12S, constituyendo así las partículas 146S.
La cápsida viral también puede formarse sin la presencia en el interior de la misma de una molécula de ARN . La cápsida está entonces vacia. A la cápsida vacia también se le denomina particula 70S. La formación de cápsidas vacías puede producirse de manera natural durante la replicación viral o provocarse artificialmente mediante tratamiento químico.
Para ser eficaz, una vacuna contra la fiebre aftosa debe ser en general polivalente. Su composición debe renovarse en cuanto cambian el o los tipos dominantes en el terreno. Por otro lado, para bloquear el rápido desarrollo de la enfermedad en el seno del ganado, conviene tener una vacuna que induzca una inmunidad temprana y que sea fuertemente protectora.
Se han planteado numerosas hipótesis, vías de investigación, propuestas para intentar desarrollar vacunas eficaces contra la fiebre aftosa. Actualmente, las únicas vacunas comercializadas son vacunas de virus inactivados.
El tratamiento químico de inactivación puede conllevar una disminución del poder inmunogénico del virus y de la producción de anticuerpos neutralizantes. Las dosis administradas con frecuencia deben ir acompañadas por adyuvantes para estimular la respuesta inmunitaria, pero según sus composiciones estos adyuvantes también pueden inducir reacciones inflamatorias. Las vacunas inactivadas no confieren inmunidad durante un largo periodo, por tanto hay necesidad de practicar inyecciones de refuerzo todos los años, incluso más en caso de dificultades, concretamente durante apariciones de focos epidémicos.
Además, existen riesgos asociados con una inactivación incompleta y/o el escape de virus durante la producción de vacunas inactivadas (por ejemplo King et al. , 1981, Nature, 293, 479-480).
El desarrollo de las técnicas de ingeniería genética deberia haber permitido considerar la producción de vacunas subunitarias y de vectores recombinados. Sin embargo, a pesar de numerosos intentos, ninguno de ellos se comercializa actualmente.
Previamente a estos trabajos, se han realizado estudios sobre las cápsidas vacías naturales. Concretamente Rowlands et al. (Rowlands et al., J. Gen. Virol., 1975,26,227-238) muestran que los viriones de la fiebre aftosa A10 comprenden principalmente las cuatro proteínas VP1, VP2, VP3 Y VP4. En comparación, las cápsidas vacías naturales (no obtenidas mediante recombinación sino purificadas a partir de cultivos de virus aftoso A 10) contienen esencialmente la proteína VPO no escindida, se describen resultados idénticos con el virus aftoso A-Pando por Rweyemamu (Rweyemamu et al., Archives of Virology, 1979,59,69-79). Las cápsidas vacías artificiales, obtenidas tras diálisis en presencia de Tris-EDTA y tras centrifugación, no contienen ninguna proteína VP4. Estas cápsidas artificiales son, según Rowlands et al., poco inmunogénicas y las cápsidas vacías naturales sólo son inmunogénicas tras tratamiento mediante formaldehído para estabilizarlas, sin embargo la respuesta de anticuerpos inducida por las cápsidas vacías naturales en cobayas no es constante como indica el autor. Además, Rowtands et al. y Rweyemamu et al. no están de acuerdo en cuanto a la necesidad de estabilidad las cápsidas vacías naturales. Para Rweyemamu et al., la ausencia de tratamiento mediante formaldehído no es perjudicial para el nivel de antigenicidad de las cápsidas vacías naturales. La inmunogenicidad sólo se somete a prueba mediante la inducción de anticuerpos neutralizantes en cobayas.
Algunos autores no siguen esta corriente de pensamiento en cuanto a las cápsidas vacías, incluso se oponen a la misma. Es el caso de Doel T. R. Y Chong W. K. T. (Doel et al., Archives of Virology, 1982, 73, 185-191) que concluyen a partir de sus resultados de experimentos que las cápsidas vacías son menos inmunogénicas ya que son menos estables que los viriones aftosos de subtipo A24.
Se compara la expresión del gen que codifica para el precursor P1 de las proteínas de cápsidas por un baculovirus recombinado en células de insectos con la expresión del gen que codifica para P1 asociado a la proteasa 3C en E. coli (Grubman et al., Vaccine, 1993, 11, 825-829; Lewis et al., J. Virol., 1991, 65, 6572~580). La coexpresión de P1 y 3C en E. coli da como resultado el ensamblaje de cápsidas vacías 70S. El producto de expresión de estos dos constructos induce anticuerpos neutralizantes en cobayas y cerdos. Los títulos obtenidos con el constructo P1/baculovirus son bajos. Estos mismos productos de expresión inducen en cerdos una protección parcial. No obstante, algunos cerdos protegidos contra la enfermedad no se protegen contra la replicación del virus de prueba.
Los autores constatan por otro lado que el sistema de expresión de E. coli no miristila las proteínas y que la proteasa 3C es tóxica para esta célula. Lewis et al. concluyen que quedan sin responder preguntas fundamentales referentes al ensamblaje del virus y la estructura de la cápsida necesarias para obtener una protección máxima en los animales. Por otro lado Grubman et al. precisan que sería necesario estabilizar las cápsidas vacías antes de formular la vacuna; aúnan en ello los problemas encontrados con las cápsidas vacías obtenidas mediante extracción a partir de cultivos virales (véase anteriormente). BEARD C et al, J. Biotechnol., vol. 73, págs. 243-249 describen el desarrollo de vacunas de ADN contra la fiebre aftosa.
El sistema de expresión constituido por el virus vaccinia también se ha usado para la obtención de cápsidas vacías de virus aftoso A10, A24 y 01 K (Abrams et al., J. Gen. Virol., 1995,76,3089-3098). Se han realizado principalmente dos constructos para cada subtipo, que comprenden los fragmentos de la secuencia de nucleótidos que codifican para el precursor P1 y para la proteasa 3C o bien bajo el control del promotor temprano/tardío p7 ,5K del virus vaccinia, o bien del promotor del bacteriófago T7. Sólo se han llevado a cabo experimentos de recombinación y de expresión in vitro, con cultivos de células humanas. Los cultivos de células transformadas mediante los constructos que comprenden el promotor p7,5K no han permitido el aislamiento de virus vaccinia recombinados. Los motivos se desconocen. Los cultivos de células transformadas mediante los constructos que comprenden el promotor T7 han permitido la obtención de vectores de virus vaccinia recombinados, la expresión de las proteínas virales VPO, VP1 y VP3 y la obtención de cápsidas vacías. Estos experimentos estaban destinados a estudiar la morfogénesis del virus aftoso y no se referian a la producción de vacunas ni a la evaluación de su eficacia.
Se han sometido a prueba plásmidos que comprenden el casete que codifica para P1-2A y 3C bajo el control de un promotor de hCMV-IE por Chinsangaram et al. (Chinsangaram et al., J. Virol. , 1998, 72(5), 4454-4457). Las inyecciones de estos plásmidos en cerdos inducen anticuerpos neutralizantes, y según los grupos de animales una ausencia de protección tras 2 inyecciones o una protección tras 4 inyecciones. Los autores concluyen que conviene mejorar la respuesta inmunitaria inducida mediante la coexpresión de citocina.
Paralelamente a estos enfoques, que no han dado lugar a la realización de vacunas, otros autores se han orientado hacia el uso de proteina VP1 de virus aftoso, sola o en fusión , o de péptidos sintéticos.
Se han llevado a cabo trabajos con una proteína de fusión compuesta por la proteína LE del operón de triptófano de
E. coli y por un fragmento de la proteína VP1 del virus aftoso A24 (aminoácidos 131-157 en forma de monómero) en cerdos (Morgan et al., Am. J. Vet. Res., 1990, 51, 40-45) comparando los resultados con los obtenidos con una proteína de fusión similar pero construida a partir del virus aftoso A12 (aminoácidos 137-168 en tándem). Giavedoni et al. (Giavedoni el al., J. Gen. Virol., 1991,72,967-971) describen una proteína de fusión TrpE con fragmentos de la región C-terminal de la proteína VP1 del virus aftoso 01. Huang et al. describen una proteína de fusión recombinada que comprende la beta-galactosidasa y dos secuencias repetidas en tándem de VP1 del virus aftoso O (Huang el al., Virallmmunol., 1999, 12(1),1-8).
También se han obtenido proteínas de la fusión que comprende la totalidad o una parte de la proteína VP1 mediante el uso de vectores virales, a saber un virus del herpes o el virus vaccinia. El documento CA-A-2.047.585 describe concretamente un virus del herpes bovino usado para la producción de proteínas de fusión que comprende una secuencia peptídica del virus aftoso (aminoácidos 141 a 158 de VP1 unidos a los aminoácidos 200 a 213 de VP1) fusionada con la glicoproteína gplll de ese virus del herpes bovino.
También se han elaborado y sometido a prueba vacunas que comprenden péptidos sintéticos basados en las regiones inmunogénicas de la proteina VP1 (con respecto a estas regiones, véase Strohmaier el al., J. Gen. Virol., 1982, 59, 295-306).
Agterberg et al. (Vaccine, 1990, 8, 438-440) produjeron en bacterias E. co/i transformadas una proteína de fusión que comprende dos determinante inmunogénicos de la proteína VP1 del virus aftoso A10 (regiones 141-153 y 200207) Y la proteína de membrana PhoE de E. coli K-12. A continuación se administraron 100 Ilg de esta proteína de fusión por vía intramuscular a cobayas que posteriormente mostraron una tasa de anticuerpos neutralizantes detectable y una protección tras una exposición homóloga.
El documento WO-A-99/66954 describe péptidos sintéticos correspondientes a secuencias consenso de sitios antigénicos de VP1 de virus aftoso de los tipo A, O o Asia (correspondientes a la región 134-168 de VP1 del virus
aftoso A 12).
.
El documento WO-A-98/12333 describe péptidos sintéticos que correspondientes a una secuencia parcial de proteínas de virus aftoso.
comprenden al menos 8 aminoácidos
Objeto de la invención
La presente invención tiene como objetivo proponer vacunas eficaces y seguras contra la fiebre aftosa.
La presente invención también tiene como objetivo proponer vacunas antiaftosas estables.
La presente invención también tiene como objetivo proponer tales vacunas antiaftosas eficaces a dosis baja. La invención tal como se define en las reivindicaciones independientes.
La invención tiene por tanto por objeto una vacuna contra la fiebre aftosa, que usa como antígeno una cantidad eficaz de cápsidas vacías del virus aftoso, obteniéndose esas cápsidas vacías in vilro mediante la expresión, en células eucariotas, del ADN complementario (ADNc) de la región P1 del genoma del virus aftoso que codifica para la cápsida y del ADNc de la región del genoma del virus aftoso que codifica para la proteasa 3C, comprendiendo la vacuna además un vehículo o excipiente farmacéutico aceptable desde el punto de vista veterinario, en la que el ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso se modifica mediante sustitución del codón que codifica para el aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SED ID NO. 38 o del codón que codifica para el aminoácido correspondiente al aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 38 por un codón que codifica para una cisteína. Por definición, no se expresa proteína L funcional y por consiguiente los constructos no comprenden ADNc que codifica para L, y preferiblemente no comprenden ningún ADNc que codifica para la totalidad o una parte de L.
Se prefiere realizar la expresión de P1 y de al menos una parte de 2A, preferiblemente de la totalidad de 2A. La expresión también puede implicar regiones más allá de 2A, y comprender por ejemplo una parte de 2B, por ejemplo tal como se ha realizado en los ejemplos.
Se prefiere realizar la expresión de 3C y de al menos una parte de las proteínas 3B, por ejemplo de dos proteinas 38 adyacentes y una parte no funcional de 3D, por ejemplo tal como se ha realizado en los ejemplos.
La figura 3 (SEO ID NO. 38) proporciona la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente a P1 (aminoácidos 2 a 737), 2A (aminoácidos 738 a 753), 3C (aminoácidos 913 a 1126) de la cepa A10 del virus aftoso. Las secuencias de otras cepas de los diferentes tipos y subtipos están disponibles, concretamente en Genbank tal como se menciona en los ejemplos.
Según una primera modalidad de la invención, las cápsidas vacias están presentes en la vacuna como subunidades y ello en cantidad eficaz. Preferiblemente, estas subunidades se obtienen mediante expresión de los ADNc de las regiones P1 y 3C bajo el control de un promotor, preferiblemente un mismo promotor. De manera preferida, se trata de un promotor inducible o de un promotor tardío de origen viral.
Los vectores de expresión que pueden usarse comprenden concretamente los vectores virales, preferiblemente los poxvirus, concretamente el virus vaccinia, o incluso por ejemplo los adenovirus, los virus del herpes y los vectores plasmidicos. Estos vectores de expresión se usan para garantizar la expresión in vitro de las cápsidas vacias en células eucariotas primarias o de líneas. Una variante consiste en usar un vector de integración que permite integrar el casete de expresión en la célula eucariota. Las células eucariotas que pueden usarse son preferiblemente células de línea por ejemplo las células BHK-21, CHO, COS, RK13, Vero, MDBK, PK15.
Como promotor inducible puede mencionarse concretamente el promotor del bacteriófago T7, el promotor "heatshock" (de choque térmico), el promotor de metalotioneína, los promotores inducibles mediante ecdisona o mediante esteroides. Cuando se usa el promotor del bacteriófago T7, se realiza la coexpresión de la polimerasa del bacteriófago T7 y de las cápsidas vacias.
Como promotor tardio de origen viral puede mencionarse concretamente, cuando se usa un poxvirus como vector, el promotor P11 K del virus vaccinia, P28K del virus vaccinia, P160K ATI del virus de la viruela bovina.
La conservación y el almacenamiento de las subunidades se garantizan preferiblemente mediante congelación o mediante liofilización.
Las dosis administradas pueden estar comprendidas concretamente entre 0,3 y 30 ~g, concretamente entre 0,5 y 20 ~g, preferiblemente entre 1 y 10 ~g e incluso más preferiblemente entre 1 y 5 Ilg, por dosis.
Los volúmenes de dosis pueden estar comprendidos preferiblemente entre 0,2 y 5 mi, preferiblemente entre 1 y 3 mI.
El medio de recuperación (excipiente, vehículo) para las vacunas subunitarias es preferiblemente un medío que permite la conservación de las cápsidas vacías, por ejemplo del tipo DMEM.
La administración de la vacuna subunitaria puede realizarse concretamente por vía parenteral, preferiblemente por vía subcutánea o intramuscular, o incluso por vía intradérmica, concretamente con ayuda de un aparato de administración sin aguja (chorro a presión).
El experto en la técnica tiene las competencias necesarias para definir con precisión el número de inyecciones y las dosis de cada vacuna que deben usarse para cada protocolo de vacunación.
Estas vacunas comprenden preferiblemente uno o varios adyuvantes.
Para adyuvar las vacunas subunitarias según la invención, pueden usarse concretamente a modo de adyuvante (1) hidróxido de alúmina, saponina (por ejemplo, QuilA), avrídina, DDA, (2) un polímero del ácido acrílico o metacrílico, un polímero de anhídrido maleico y de derivado de alquenilo, o (3) formular la vacuna en forma de una emulsión de agua en aceite, aceite en agua o agua en aceíte en agua.
La emulsión puede ser concretamente a base de aceite de parafina líquido ligero (del tipo de la Farmacopea Europea); aceíte isoprenoide tal como escualano o escualeno; aceíte resultante de la olígomerización de alquenos, en particular de isobuteno o de deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes con grupo alquilo lineal, más particularmente los aceites vegetales, oleato de etilo, di(caprilatolcaprato) de propilenglicol, tri(caprilatolcaprato) de glicerol, dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos o de alcoholes grasos ramificados, en particular ésteres del ácido isoesteárico. El aceite se usa en asociación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes
son preferiblemente tensioactivos no 10nlCOS, en particular, ácidos grasos polioxietilenados (por ejemplo, ácido oleico), ésteres de sorbitano, de manida (por ejemplo oléate de anhidromanitol), de glicerol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico, hidroxiesteárico, eventualmente etoxilados, éteres de alcoholes grasos y de polioles (por ejemplo alcohol oleico), copolímeros en bloque de polioxipropileno-polioxietileno en particular los PluroniC®, concretamente L 121 (véase Hunter et al., 1995, ''rhe Theory and Practical Application of Adjuvants" (Ed. Steward-Tull, D.E.S.) John Wiley and Sons, NY, 51-94; Todd et al., Vaccine, 1997, 15,564-570).
Los polímeros del ácido acrílico o metacrílico se reticulan concretamente mediante polialquenil éteres de azúcares o de polialcoholes. Estos compuestos se conocen con el término carbómero (Pharmeuropa vol. 8, n.o 2, junio de 1996). El experto en la técnica también puede referirse al documento US-A-2 909 462 que describe tales polímeros acrílicos reticulados mediante un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferiblemente no más de 8, sustituyéndose los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener a su vez otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos con la denominación Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son particularmente apropiados. Están reticulados mediante una alil-sacarosa o mediante alilpentaeritritol. Entre ellos, pueden mencionarse los Carbopol® 974P, 934P Y971 P.
Entre los copolímeros de anhídrido maleico y de derivado de alquenilo, se prefieren los EMA® (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maleico y de etileno, lineales o reticulados, por ejemplo reticulados mediante divinil éter. Puede hacerse referencia a J. Fields et al., Nature, 186: 778-780, 4 de junio de 1960.
En cuanto a su estructura, los polímeros de ácido acrllico o metacrílico y los EMA® están formados preferiblemente por motivos de base de la siguiente fórmula:
l' ~.
----c--(C~)x--C-(CH2)y---
I I
COOH . COOH
en la que:
-
R, YR2, idénticos o diferentes, representan H o CH3
-
x =Oó 1, preferiblemente x =1
-
y=1 1 ó 2, con x + y = 2.
Para los EMA®, x = ee y = 2. Para los carbómeros, x = y = 1.
La concentración de polímero en la composición de vacuna final será del 0,01 % al 1,5% p/v, más particularmente del 0,05 a11% plv, preferiblemente del 0,1 al 0,4% p/v.
Según una sAgunda modalidad de la invención, la vacuna comprende un vector de expresión que contiene ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso que codifica para la cápsida y ADNc de la región del genoma del virus aftoso que codifica para la proteasa 3C, de manera que se producen las cápsidas vacías in vivo, en la que el ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso se modifica mediante sustitución del codón que codifica para el aminoácido 179 de SEO ID NO. 38 o del codón que codifica para el aminoácido correspondiente al aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEO ID NO. 38 por un codón que codifica para una cistelna. Preferiblemente, estas cápsidas vacías se obtienen in vivo mediante expresión de los ADNc de las regiones P1 y 3C insertados en un vector de expresión plasmídico o en un vector de expresión viral y colocados bajo el control de un promotor, preferiblemente de un mismo promotor. De manera preferida, el promotor es un promotor fuerte temprano o un promotor tardío de origen viral.
En el caso de los vectores virales, se usa preferiblemente un promotor tardío de origen viral. Los vectores virales son preferiblemente los poxvirus, concretamente el virus vaccinia, los virus de la viruela de las aves (por ejemplo. viruela aviar, viruela del canario), la viruela del mapache, la viruela porcina. la viruela caprina. o incluso los adenovirus replicativos, concretamente el adenovirus porcino, y los virus del herpes. Como promotor tardío de origen viral puede mencionarse concretamente, para los poxvirus, el promotor P11 K del virus vaccinia, P28K del virus vaccinia, P160K ATI del virus de la viruela bovina.
Por definición, un vector de expresión plasmídico (o plásmido) cubre una unidad de transcripción de ADN que comprende una secuencia de polinucleótido que comprende el ADNc que va a expresarse y los elementos necesarios para su expresión in vivo. Se prefiere la forma de plásmido circular, superenrollada o no. La forma lineal también entra dentro del contexto de esta invención.
En el caso de los plásmidos, se usa preferiblemente un promotor fuerte temprano de origen viral o de origen celular y en particular el promotor temprano del citomegalovirus CMV-IE, de origen humano o murino, o incluso eventualmente de otro origen tal como de rata, cobaya. También puede usarse el promotor temprano o tardío del virus SV40 o el promotor L TR del virus del sarcoma de Rous. Como promotor celular, puede mencionarse el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como por ejemplo el promotor de la desmina, o incluso el promotor de la actina.
La conservación y el almacenamiento de las vacunas recombinadas se garantizan preferiblemente mediante congelación o mediante liofilización o en forma líquida.
15 El medio de recuperación (excipiente, vehículo) es preferiblemente una solución salina de NaCI al 0,9% o un tampón fosfato.
La cantidad de vectores virales usada en las vacunas según la presente invención es de aproximadamente al menos 103 ufp. Preferiblemente está comprendida entre aproximadamente 104 ufp y aproximadamente 1010 ufp, por ejemplo aproximadamente 105 ufp y 109 ufp, más particularmente entre aproximadamente 106 ufp y aproximadamente 108 ufp, por dosis.
La cantidad de vectores plasmídicos usada en las vacunas según la presente invención está comprendida entre
25 aproximadamente 1 ""g Y aproximadamente 2 mg, y preferiblemente entre aproxímadamente 50 ""g Y aproximadamente 1 mg, por dosis.
Los volúmenes de dosis pueden estar comprendidos preferiblemente entre 0,2 y 5 mi, preferiblemente entre 1 y 3 mI.
Las vacunas recombinadas según la invención pueden administrarse mediante las diferentes vías de administración habituales y por medio de las técnicas de administración conocidas. Según una modalidad preferida de la invención, las vacunas se formulan para su admínistración por vía intramuscular, subcutánea o con ayuda de un inyector sin aguja por vía intradérmica. En particular para los vectores virales se prefiere la via intramuscular o subcutánea. Para los vectores virales o plasmídicos también puede usarse la vía mucosa (por ejemplo oral, nasal).
Preferiblemente, estas vacunas comprenden uno o varios adyuvantes. Para los vectores virales se usa ventajosamente un polímero del ácido acrílico o metacrílico, o un polímero de anhídrido maleico y de derívado de alquenilo, y en particular los carbómeros, concretamente Carbopol® (estos adyuvantes se describieron anteriormente).
Para los vectores plasmidicos, es ventajoso formularlos mediante adición a modo de adyuvante de lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, de fórmula:
45 en la que R1 es un radical alífático lineal, saturado o insaturado, que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático, que contiene 2 ó 3 átomos de carbono, y X un grupo hidroxilo o amina.
Preferiblemente se trata de DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propanamonio; documento WO-A-96341 09), preferiblemente asociado a un lípido neutro, concretamente DOPE (dioleoil~fosfatídil-etanolamina; Behr J.P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389) para formar DMRIE-DOPE. Preferiblemente, la mezcla de plásmido con este adyuvante se realiza de manera extemporánea y se prefiere, antes de su administración al animal, dejar tiempo a la mezcla así constituida para complejarse, por ejemplo durante un periodo que va de 10 a 60 minutos, concretamente del orden de 30 minutos.
Cuando está presente DOPE, la razón molar de DMRIE:DOPE va preferiblemente de 95:5 a 5:95, y es más particularmente de 1 :1 .
La razón en peso de plásmido:adyuvante, concretamente OMRIE o OMRIE-OOPE, puede ir concretamente de 50:1 a 1: 1 O, en particular de 10: 1 a 1 :5, y preferiblemente de 1:1 a 1:2.
Las vacunas según la invención, adyuvadas o no tal como se describió anteriormente, también pueden adyuvarse mediante una o varias citocinas, añadidas o expresadas in vivo. Preferiblemente, se usa GM-CSF (en inglés, "Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor" (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos): Clark S.C. et al. Science 1987. 230. 1229; Grant S. M. et al. Orugs 1992. 53. 516), lo que puede hacerse mediante la incorporación de proteína GM-CSF directamente en la composición de vacuna o preferiblemente mediante la inserción de la secuencia de nucleótidos que codifica para GM-CSF en un vector de expresión en condiciones que permiten su expresión in vivo, por ejemplo el vector que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para el antígeno de FMOV u otro vector. Como vector de expresión, se prefiere usar un plásmido. La elección de GM-CSF se realiza preferiblemente en función de la especie animal que va a vacunarse; así para animales bovinos se usa el GM-CSF bovino (véase, por ejemplo, Maliszewski et al. Molec. Immunol. 1988. 25. 843-850); para cerdos se trata del GM-CSF porcino (véase, por ejemplo, Inumaru S. y Takamatsu H., Immunol. Cell. Biol. 1995. 75.474-476).
Para la realización de vectores que expresan GM-CSF, las secuencias de GM-CSF están disponibles en Genbank, 021074 para el cerdo, U22385 para el animal bovino y X55991 para el animal ovino.
La presente memoria describe un procedimiento de preparación de una vacuna antiaftosa subunitaria en el que se producen cápsidas vacias de este virus mediante expresión del AONc de la región P1 y mediante expresión del AONc de la región 3C, y se formulan en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario, preferiblemente en presencia de al menos un adyuvante.
La invención también tiene por objeto el uso de cápsidas vacías del virus aftoso producidas in vitro mediante la expresión en células eucariotas, del AONc de la región P1 del genoma del virus aftoso que codifica para la cápsida y del AONc de la región del genoma del virus aftoso que codifica para la proteasa 3C, en el que el AONc de la región P1 del genoma del virus aftoso se modifica mediante sustitución del codón que codifica para el aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEO ID NO. 38, o del codón que codifica para el aminoácido correspondiente al aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEO ID NO. 38 por un codón que codifica para una cisteína, para la preparación de una vacuna antiaftosa subunitaria, que comprende además un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario, preferiblemente en presencia de al menos un adyuvante. Se describe un método de vacunación antiaftosa, que comprende la administración al animal, concretamente los animales de producción, en particular animal bovino, ovino, porcino, caprino, de una vacuna subunitaria según la invención. Anteriormente se describieron modos de administración y dosis.
Las diferentes características descritas anteriormente con respeCto a la vacuna subunitaria según la invención se aplican a estos diferentes objetos.
La memoría describe un procedimiento de preparación de una vacuna antiaftosa recombinada en el que se producen vectores virales o plasmidicos que expresan in vivo la proteína P1 y la proteína 3C en condiciones que conducen a la formación de cápsidas vacías, y se formulan esos vectores en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario, preferiblemente en presencia de al menos un adyuvante.
La invención también tiene por objeto el uso de vectores virales o plasmídicos según la invención, para la preparación de una vacuna antiaftosa recombinada , que comprende además un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario, preferiblemente en presencia de al menos un adyuvante.
Se describe un método de vacunación antiaftosa, que comprende la administración al animal, concretamente los animales de producción, en particular un animal bovino, ovino, porcino, caprino, de una vacuna recombinada según la invención. Anteriormente se describieron modos de administración y dosis.
Las diferentes características descritas anteriormente con respecto a las vacunas que usan vectores virales o plasmídicos según la invención se aplican a estos diferentes objetos.
También se describe una vacuna multivalente o una asociación de vacunas que comprende una vacuna según la invención, y al menos otra vacuna contra un virus aftoso de otro tipo (por ejemplo O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3, Asia), de otro subtipo (por ejemplo A10, A12, A24, 01) o de otra variante, preferiblemente según la invención, en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario y preferiblemente con un adyuvante, concretamente uno de los descritos anteriormente.
También se describe una vacuna multivalente o una asociación de vacunas que comprende una vacuna según la ínvención, y al menos una vacuna contra otro patógeno, concretamente el virus de la rabia, en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario y preferiblemente con un adyuvante, concretamente uno de los descritos anteriormente.
La invención tiene por objeto la mejora de la estabilidad frente a la temperatura de las cápsidas vacías de virus aftosos y de las vacunas obtenidas.
La mejora de la estabilidad frente a la temperatura de las cápsidas vacías se garantiza ventajosamente mediante la formación de puentes disulfuro, obteniéndose esta mejora mediante la sustitución de un aminoácido de la secuencia de origen por un aminoácído císteína en la secuencia de polipéptido de una proteína de estructura de la cápsida, la proteína VP2, estando este aminoácido en la posíción 179 en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 38 (figura 3). Como regla general, la posición de este aminoácido es idéntica en los demás virus aftosos (es concretamente el caso de las cepas descritas en los ejemplos). En las secuencias de otros vírus, la posición eventualmente puede ser ligeramente diferente y por ejemplo ser 178 ó 180. La región que comprende este aminoácido corresponde a una hélice alfa . Para identificar o confirmar el aminoácido que va a mutarse, se alinean las secuencias de aminoácidos de esta región con la región correspondiente (por ejemplo del orden de una decena o un poco más (por ejemplo de 10 a 20) de aminoácidos) en la secuencia SEQ ID NO. 38, teniendo en cuenta el hecho de que las secuencias están bien conservadas en cuanto a su estructura entre los diferentes vírus aftosos. Concretamente se ha constatado comparando las secuencias de las cepas 01, A 10, A24, 1\2.2, C1, C3, SAT2, que la región puede escribirse de la siguiente manera:
X1 Gly X3 X4Gly X6 Leu Xa Xg Ser X11 X12 Tyr Met
con
X4 y X11 son Tyr, His o Phe (aminoácidos hidrófobos)
X3, Xa y X12 son Val, Met, lIe, Thr o Ala
X6 es His, Gín, Arg, Lys, Ser o Gly; es el aminoácido que va a mutarse por Cys
X1 es His o Lys (aminoácidos básicos)
Xg es Asp, Glu o Lys (aminoácidos ácido y básico).
El aminoácido que va a mutarse es la histidina situada en la posición 179 del precursor P1 del virus aftoso A10.
Se trata de la serina situada en la posición 179 del precursor P1 del virus aftoso 01.
Se trata de la glicina situada en la posición 179 del precursor P1 del virus aftoso C1.
Se trata de la histidina situada en la posición 179 del precursor P1 del virus aftoso A24.
Por convenio, la metionina correspondiente al codón de iniciación (que no está presente en la secuencia natural y por tanto se añade) se numera como 1.
A nivel de nucleótidos, esto corresponde a sustituir los codones de origen por un codón que c.odifica para la cisteína, es decir un codón TGT o TGC para el ADNc, o UGU o UGC para el ARN.
La presente invención describe las secuencias de nucleótidos, concretamente los ADNc, que incorporan esta modificación. En particular, la invención describe las secuencias de ADNc, y los vectores que las incorporan, que comprenden la secuencia que codifica para VP2 (o VPO), y más particularmente para P1, que incorporan esta modificación, por ejemplo las secuencias de ADNc que codifican para P1-2A o P1-2A-parte de 28, y las secuencias que los incorporan, por ejemplo secuencias que los incorporan con las secuencias que permiten su expresión (promotor, codón ATG, etc.).
La presente invención describe las secuencias de aminoácidos, obtenidas a partir de estas secuencias de nucleótidos, así como las cápsidas vacías y los virus aftosos termoestables (es decir, que tienen una estabilidad térmica mejorada). Comprenden puentes disulfuro que no están presentes en las cápsidas y los virus naturales. En particular, comprenden proteínas VP2 que comprenden una cisteína en lugar de un aminoácido natural, tal como acaba de describirse.
Las vacunas descritas anteriormente se basan en el uso de esta modificación y por tanto las secuencias de ADNc se modifican en consecuencia y las cápsidas vacías obtenidas o bien in vifro o bien in vivo presentan los puentes disulfuro.
Asimismo, todos los demás objetos (métodos, uso, procedimientos) de la invención que se han descrito anteriormente retoman esas características.
Descripción de las figuras
La invención va a describirse ahora más detalladamente con ayuda de modos de realización tomados a modo de
ejemplos no limitativos y haciendo referencia a los dibujos, en los que: Figura 1: gráfico de los títulos de anticuerpos neutralizantes antiaftosos A24 medidos en animales bovinos (expresados en log)
Figura 2: fotografía de los geles obtenidos
Figura 3: secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos correspondiente a P1 (aminoácidos 2 a 737), 2A (aminoácidos 738 a 753), 3C (aminoácidos 913 a 1126) de la cepa A 10 del virus aftoso Listas de las secuencias SEO ID para los constructos de la presente invención SEO ID NO. 1: oligonucleótido JCA305 SEO ID NO. 2: oligonucleótido JCA306 SEO ID NO. 3: oligonucleótido JCA307 SEO ID NO. 4: oligonucleótido JCA308 SEO ID NO. 5: oligonucleótido JCA309 SEO ID NO. 6: oligonucleótido JCA310 SEO ID NO. 7: oligonucleótido JCA311 SEO ID NO. 8: oligonucleótido JCA312 SEO ID NO. 9: oligonucleótido JCA313 SEO ID NO. 10: oligonucleótido JCA314 SEO ID NO. 11 : oligonucleótido JCA315 SEO ID NO. 12: oligonucleótido JCA316 SEO ID NO. 13: oligonucleótido JCA317 SEO ID NO. 14: oligonucleótido JCA318 SEO ID NO. 15: oligonucleótido JCA319 SEO ID NO. 16: oligonucleótido JCA320 SEO ID NO. 17: oligonucleótido JCA321
SEO ID NO. 18: oligonucleótido JCA322 SEO ID NO. 19: oligonucleótido JCA323 SEO ID NO. 20: oligonucleótido JCA324 SEO ID NO. 21 : oligonucleótido JCA325 SEO ID NO. 22: oligonucleótido JCA326 SEO ID NO. 23: oligonucleótido JCA327 SEO ID NO. 24: oligonucleótido JCA328 SEO ID NO. 25: oligonucleótido JCA329 SEO ID NO. 26: oligonucleótido JCA330 SEO ID NO. 27: oligonucleótido JCA331 SEO ID NO. 28: oligonucleótido JCA332 SEO ID NO. 29: oligonucleótido JCA333 SEO ID NO. 30: oligonucleótido JCA334 SEO ID NO. 31: oligonucleótido JCA335 SEO ID NO. 32: oligonucleótido JCA336 SEO ID NO. 33: oligonucleótido JCA337 SEO ID NO. 34: oligonucleótido JCA338 SEO ID NO. 35: oligonucleótido JCA339 SEO ID NO. 36: oligonucleótido JCA340 SEO ID NO. 37 : oligonucleótido JCA341 SEO ID NO. 38: secuencia de aminoácidos correspondiente a P1 (aminoácidos 2 a 737), 2A (aminoácidos 738 a
753), 3C (aminoácidos 913 a 1126) del virus aftoso A10. SEO ID NO. 39: secuencia de nucleótidos correspondiente a P1, 2A, 3C del virus aftoso A 10. SEO ID NO. 40: oligonucleótido JCA142 SEO ID NO. 41: oligonucleótido JCA343 Descripción detallada de la invención Todos los constructos se realizan usando las técnicas convencionales de biología molecular (clonación, digestión
mediante enzimas de restricción, síntesis de un ADN complementario monocatenario, amplificación en cadena mediante polimerasa, elongación de un oligonucleótido mediante una ADN polimerasa...) descritas por Sambrook J. et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edición. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. Nueva York. 1989). Todos los fragmentos de restricción usados para la presente invención, así como los diversos fragmentos de amplificación en cadena mediante polimerasa (= ACP o PCR), se aíslan y purifican usando el kit "Geneclean®" (810101 Inc. La Jolla, CA).
Secuencias de nucleótidos y de polipéptido de virus de la fiebre aftosa están accesibles en la base de datos GenBank, concretamente con los números X00429 para A10, X00871 para 01K, AJ251476 para A24 y AJ133357 para C Spain Olot. Los ejemplos 1 a 14 a continuación describen técnicas convencionales.
Ejemplo 1: Cultivo de cepas de virus aftoso Para su amplificación, se cultivan las cepas de virus aftoso denominadas 01 K (Forss et al., 1984, Nucleic Acids Res., 12(16),6587-6601), A24 (Weddell et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 2618-2622), A10 (Carroll et al., 1984, Nucleic Acids Res., 12(5),2461-2472), C Spain Olot (Toja et al., 1999, Virus Res., 64(2), 161-171) en células BHK-21 (riñón de cria de hámster, accesible en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, "American Type Culture Col/ection") con el número CCL-10). Las células BHK-21 se ponen en cultivo en frascos Falcon de 25 cm 2
con medio Eagle-MEM complementado con el 1 % de extractos de levadura y el 5% de suero de ternero que contiene aproximadamente 100.000 células por mI. Se cultivan las células a +37°C. Después de 3 dias, la capa celular llega a la confluencia. Entonces se sustituye el medio de cultivo por medio Eagle
MEM sin suero pero complementado con el 0,4% de hidro liza do de lactoalbúmina y el 0,3% de peptona (pH 7,4) Y se
añade el virus aftoso a razón de 1 ufp para aproximadamente 20 células. Cuando el efecto citopático (ECP) es completo (generalmente 24 horas tras el comienzo de la puesta en cultivo), se recogen las suspensiones virales, después se aclaran mediante centrifugación y se congelan a -70°C . Generalmente son necesarios de 3 a 4 pases sucesivos para la producción de un lote viral. Se almacena el lote viral a -70°C.
Se reanudan estas operaciones para cada una de las cepas de virus aftoso. Ejemplo 2: Extracción del ARN viral de las cepas de virus aftoso
Se extrae el ARN viral contenido en 100 mi de suspensión viral de la cepa de virus aftoso A24, obtenida en el ejemplo 1, tras la descongelación con las disoluciones del kit "High Pure™ Viral RNA Kit", (n.o de cat. 1 858882, Roche Molecular Biochemicals), siguiendo las instrucciones del proveedor para las etapas de extracción. Se resuspende el sedimento de ARN obtenido al final de la extracción con 10 mi de agua destilada estéril sin ARNasa .
Se extrae el ARN viral de cada una de las cepas de virus aftoso en las mismas condiciones.
Ejemplo 3: Construcción del plásmido de expresión para las cápsidas vacías del virus aftoso A 10
Se sintetiza el AON complementario (AONc) del virus aftoso A10 con el kit "Gene Amp RNA PCR Kit" (n.o de cat. N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, EE.UU.) usando las condiciones facilitadas por el proveedor. Para el primer fragmento, se realiza una reacción de transcripción inversa, seguida por una reacción de amplificación en cadena (reacción "TI-ACP" o "RT-PCR") con 50 ¡.tI de la suspensión de ARN viral del virus aftoso A10 (ejemplo 2) y con los siguientes oligonucleótidos:
JCA305 (37 meros) (SEO ID NO 1)
5' nnGATATCATGGGTGCTGGGCAGTCCAGCCCAGCA 3'
y JCA306 (21 meros) (SEO ID NO 2)
5' nCACGACGAAAGTACTATCC 3'.
Este par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción de EcoRV y de Un codón de iniciación ATG en fase con la secuencia de nucleótidos que codifica para P1.
La síntesis de la primera cadena de AONc se realiza mediante elongación del oligonucleótido JCA306, tras hibridación de este último al molde de ARN.
Las condiciones de sintesis de la primera cadena de AONc son una temperatura de 42°C durante 15 min., después 99°C durante 5 mino y finalmente 4°C durante 5 mino Las condiciones de la reacción de PCR en presencia del par de oligonucleótidos JCA305 y JCA306 son una temperatura de 95°C durante 2 min., después 35 ciclos (95°C durante 1 min., después 62°C durante 1 mino y 72°C durante 2 min.) y finalmente 72°C durante 7 mino para producir un fragmento de 2583 pb.
Se digiere este fragmento mediante EcoRV y después mediante Xhol para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRV-Xhol de aproximadamente 2550 pb. Este fragmento se denomina fragmento A.
Para el segundo fragmento, se realiza una reacción de PCR con 50 III de la suspensión de ARN viral del virus aftoso A10 (ejemplo 2) y con los siguientes oligonucleótidos:
JCA307 (21 meros) (SEO ID NO 3)
5' CTGAAGGACCCTACTCCGGGC 3'
y JCA308 (37 meros) (SEO ID NO 4)
5' nnAGATCTTCAAAGCTTTGTTTTGCGCATCACGTG 3'.
Este par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción de BglIl y de un codón de terminación en fase con la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteasa 3C.
La síntesis de la primera cadena de AONc se realiza mediante elongación del oligonucleótido JCA308, tras la hibridación de este último al molde de ARN.
Las condiciones de síntesis de la primera cadena de AONc son una temperatura de 42°C durante 15 min ., después 99°C durante 5 mino y finalmente 4°C durante 5 mino Las condiciones de la reacción de PCR en presencia del par de oligonucleótidos JCA307 y JCA308 son una temperatura de 95°C durante 2 min., después 35 ciclos (95°C durante 1 min ., después 62°C durante 1 mino y 72°C durante 2 min.) y finalmente 72°C durante 7 mino para producir un fragmento de 936 pb.
Se digiere este fragmento mediante BglIl y después mediante Xhol para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa, el fragmento BglII-Xhol de aproximadamente 900 pb. Este fragmento se denomina fragmento B.
Se ligan el fragmento A y el fragmento B con el plásmido de expresión pVR1012 (Hartikka J. et al., 1997, Human Gene Therapy, 7, 1205-1217), previamente digerido mediante BglII y EcoRV, para proporcionar el plásmido pJCA161 (8327 pb). Este plásmido contiene, bajo el control del promotor temprano del citomegalovirus humano o hCMV-IE ("human Cytomegalovirus Immediate Early" , temprano inmediato del citomegalovirus humano), un inserto que codifica para la parte de la poliproteína suficiente para generar proteínas de cápsida que pueden autoensamblarse.
Ejemplo 4: Construcción de plásmidos de expresión para las cápsidas vacías del virus aftoso de los subtipos 01 K, C
Spain Olot y A24 Se sintetizan los ADNc de los virus aftosos de los subtipos 01 K, C Spain Olot y A24 tal como se describió en el ejemplo 3.
Para 01 K, se usa el par de oligonucleótidos:
JCA309 (37 meros) (SEO ID NO 5) 5' TTTTGATATCATGGGGGCTGGACAA TCCAGTCCAGCG 3' y JCA310 (21 mer) (SEO ID NO 6) 5' TTCACGACGAAGGTGCTGTCC 3' durante la primera reacción de PCR para producir un fragmento de 2583 pares de bases (pb), después tras digestión
y aislamiento, un fragmento EcoRV-Xhol de aproximadamente 2550 ¡:>b. Este fragmento se denomina fragmento C. Durante la segunda reacción de PCR, se usa el par de oligonucleótidos: JCA311 (18 meros) (SEO ID NO 7) 5' AAGGACCCTACGCCGGAC 3' y JCA312 (34 meros) (SEO ID NO 8) 5' TTTT AGATCTICMAGCTTGGTTTTGCGCATCAC 3' para producir un fragmento de 930 pb, después tras digestión y aislamiento, un fragmento BgllI-Xhol de
aproximadamente 900 pb. Este fragmento se denomina fragmento D.
Se ligan el fragmento C y el fragmento D con el plásmido de expresión pVR1012, previamente digerido mediante BglIl y EcoRV, para proporcionar el plásmido pJCA162 (8327 pb). Para C Spain Olot, se usa el par de oligonucleótidos: JCA313 (37 meros) (SEO ID NO 9) 5' TTTTGATATCATGGGAGCTGGGCAATCCAGCCCAGCG 3' y JCA314 (23 meros) (SEO ID NO 10) 5' TTCACGACMACGTGCTGTCCAG 3', durante la primera reacción de PCR para producir un fragmento de 2568 pares de bases (pb), después tras digestión
y aislamiento, un fragmento EcoRV-Xhol de aproximadamente 2540 pb. Este fragmento se denomina fragmento E. Durante la segunda reacción de PCR, se usa el par de oligonucleótidos: JCA315 (21 meros) (SEO ID NO 11) 5' AGAGCAACCGCAAGCTGAAGG 3' y JCA316 (34 meros) (SEO ID NO 12) 5' TTTTAGATCTTCMAGCTIGGTITTGCGCATTAC 3', para producir un fragmento de 947 pb, después tras digestión y aislamiento, un fragmento Bgll13-Xhol de
aproximadamente 900 pb. Este fragmento se denomina fragmento F.
Se ligan el fragmento E y el fragmento F con el plásmido de expresión pVR1012, previamente digerido mediante 8gl11 y EcoRV, para proporcionar el plásmido pJCA163 (8312 pb). Para A24, se usa el par de oligonucleótidos: JCA317 (37 meros) (SEQ ID NO 13)
5' TTTTGA TATCATGGGGGCCGGGCAA TCCAGTCCGGCG 3' Y JCA318 (31 meros) (SEQ ID NO 14) 5' TTTTCTCGAGGGGGGCCGGCACGTGMAGAG 3', durante la primera reacción de PCR para producir un fragmento de aproximadamente 2630 pares de bases (pb),
después tras digestión y aislamiento, un fragmento EcoRV-Xhol de aproximadamente 2580 pb. Este fragmento se denomina fragmento G. Durante la segunda reacción de PCR, se usa el par de oligonucleótidos: JCA319 (31 meros) (SEQ ID NO 15) 5' TTTTCTCGAGGGACCGGTGAAGAAGCCTGTC 3' y JCA320 (37 meros) (SEQ ID NO 16)
5' TTTT AGATCTTCAGCGGCGGAACAGCGCTTTGTCCTC 3' para producir un fragmento de aproximadamente 950 pb, después tras digestión y aislamiento, un fragmento 8glll Xhol de aproximadamente 940 pb. Este fragmento se denomina fragmento H.
Se ligan el fragmento G y el fragmento H con el plásmido de expresión pVR1012, previamente digerido mediante 8gll1 y EcoRV, para proporcionar el plásmido pJCA164 (de un tamaño de aproximadamente 8400 pb) . Ejemplo 5: Construcción del plásmido de expresión para A24/A 10 Se sintetiza el ADNc del virus aftoso A24 tal como se describió en el ejemplo 3.
Se realiza una reacción de PCR con 50 l.!! de la suspensión de ARN de virus aftoso A24 (ejemplo 2) y con los siguientes oligonucleótidos: JCA317 (37 meros) (SEQ ID NO 13) Y JCA321 (24 meros) (SEQ ID NO 17) 5' TTTGACCTAACGTCGGAGAAGAAG 3'.
Se produce un fragmento de aproximadamente 2300 pb. A continuación se digiere este fragmento mediante EcoRV y después mediante Hindlll para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRV-Hindlll de aproximadamente 1710. Este fragmento se denomina fragmento
1.
Se digiere el fragmento de 2300 pb mediante Hindlll y después mediante Apal para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa, el fragmento Hindlll-Apal de aproximadamente 550 pb. Este fragmento se denomina fragmento J.
Se digiere el plásmido pJCA161 (ejemplo 3) mediante Apal y después mediante EcoRV para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa, el fragmento Apal-EcoRV de aproximadamente 5960 pb. Este fragmento se denomina fragmento K.
Se ligan los fragmentos 1, J Y K entre sí para proporcionar el plásmido pJCA165 (8333 pb). Este plásmido contiene un inserto que codifica para la parte estructural de la poliproteína A24 y para la parte enzimática de A 10, partes suficientes para generar proteínas de cápsida que pueden autoensamblarse.
Ejemplo 6: Construcción del virus vaccinia recombinado vV1 00 CA 10) Se realiza una reacción de PCR usando el plásmido pJCA161 (ejemplo 3) como molde y los siguientes oligonucleótidos:
JCA322 (37 meros) (SEO ID NO 18):
5' TTTTGAA TTCATGCAGTCCAGCCCAGCAACCGGCTCG 3'
y JCA323 (44 meros) (SEO ID NO 19):
5' TTTTGAA TTCAT AAAAA TCAAAGCTTTGTTTTGCGCATCACGTG 3'
para amplificar un fragmento de aproximadamente 3462 pb.
Este par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción de EcoRI en cada extremo del fragmento de amplificación.
Las condiciones de la reacción de PCR en presencia de este par de oligonucleótidos son una temperatura de 95°C durante 2 min., después 35 ciclos (95°C durante 1 min., después 62°C durante 1 min oy 72°C durante 2 min.) y finalmente 72°C durante 7 mino
Se digiere este fragmento mediante EcoRI para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRIEcoRI de 3448 pb.
Se realiza una reacción de PCR en genoma del virus vaccinia (cepa WR) con el par de oligonucleótidos:
JCA342 (28 meros) SEO ID NO. 40
5' TTTTATCGATICATIGATAGTACCAAAT 3'
JCA343 (20 meros) SEO ID NO. 41
5' ATICTACAGTICTAACATCG 3'.
Las condiciones de PCR son las mismas que anteriormente. Se produce un fragmento de 488 pb. Se digiere este fragmento mediante Clal y EcoRI, para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de 367 pb. A continuación se inserta este último fragmento en el plásmido pGS20 (Mackett et al., J; Virol., 1984, 49, 857-864), previamente digerido mediante Clal y EcoRI. Se linealiza el plásmido así obtenido mediante EcoRI y se inserta en el mismo el fragmento EcoRI-EcoRI de 3448 pb, proporcionando el vector pJCA166.
Ventajosamente, el experto en la técnica también puede emplear el plásmido pvFOHC (Newton et al., en: Vaccines 87, 1987, Chanock et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 12-21) que comprende el promotor P11K del virus vaccinia y dos brazos del gen de TK del virus vaccinia, uno en sentido 5' de ese promotor y el otro en sentido 3' de un sitio de EcoRI.
Pueden usarse sitios de inserción en el virus vaccinia distintos del gen de TK, concretamente por ejemplo el gen de HA, M2L.
Se transfecta el plásmido pJCA166 en células COS (células renales de monos verdes africanos, depositadas ante la Colección Americana de Cultivos Tipo con el número de registro ATCC CRL-1651) infectadas con el virus vaccinia (cepa WR, número ATCC VR-119).
Se cultivan las células COS en placas de Petri en medio de cultivo OMEM ("Dulbecco's Modified Eagles Medium", medio de Eagle modificado por Oulbecco) complementado con el 10% de suero de ternero fetal, glutamina 2 mM, penicilina/estreptomicina 500 Ul/~g/ml, fungizona 12,5 ~g/ml (todos en concentraciones finales), que contiene aproximadamente 100.000 células por mi, a +37°C en atmósfera que contiene el 5% de C02 durante 16 h. Cuando las células llegan al 75% de confluencia, se retira el medio de cultivo. A continuación se infectan las células COS con virus vaccinia (cepa WR) a una multiplicidad de infección (moi) de 3 OICCso/célula, después se incuban las placas durante 1 h. A continuación se lavan los cultivos con medio OMEM .sin suero. Entonces se añaden a cada placa 400 ~I de mezcla de plásmido/Lipofectine/Optimem (8 ~I de Lipofectine, 192 ~I de Optimem y 200 ~I de agua destilada que contiene 8 ~g de plásmido), siendo el plásmido pJCA166. Se incuban las placas a +37°C en atmósfera que contiene el 5% de C02 de 4 a 6 h agitándolas cada 30 mino A continuación se añade a cada placa medio DMEM complementado con el 10% de suero de ternero fetal, y se ponen las placas en incubación a +37°C en atmósfera que contiene el 5% de CO2 durante 16 h.
Entonces pueden recogerse las células, congelarse y almacenarse a -20°C.
La selección de los virus vaccinia recombinados se realiza en cultivos de células humanas 143 TK-(accesibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el número de registro CRL-8303) en placas de 6 cm que contienen 5 mi de medio de cultivo OMEM, incubadas a +37°C en atmósfera que contiene el 5% de C02 durante 16 h.
5 Se añade la suspensión de transfección obtenida anteriormente. Tras una incubación de 1 h a +37°C, se añaden 25 ~g de 5-bromodesoxiuridina (BUdR) por mi con el fin de seleccionar los virus vaccinia recombinados TK-. Se prolonga la incubación durante 48 h con el fin de permitir el desarrollo de las células recombinadas. Se realizan 3 ciclos sucesivos de selección/purificación de virus vaccinia recombinados.
lOSe siembran placas de 24 pocillos con células 143 TK-con medio OMEM que contiene 25 I-1g de BUdR por m!. Tras 2 h de incubación a +37°C, se transfieren aproximadamente 10 placas de lisis recuperadas cada una en 2 1-11 de tampón PBS a 10 pocillos. Entonces se incuban las placas durante 48-72 h.
Tras la incubación, se lleva a cabo una reacción de PCR con el sobrenadante de cultivo de cada pocillo usando el
15 protocolo "Gene Releaser" (Cambio) con los oligonucleótidos JCA305 y JCA308. Para los pocillos que se encuentra que son positivos, el virus recombinado experimenta un nuevo ciclo de purificación. Se amplifica el virus recombinado denominado vV100 y se almacena a -70°C o a -20°C .
20 Ejemplo 7: Construcción de virus vaccinia recombinados para los tipos O, C y A Se obtienen los constructos de virus vaccinia recombinados para los tipos O, C y A de los virus aftosos tal como se describió en el ejemplo 6. 25 Para el tipo O: Se realiza la reacción de PCR usando el plásmido pJCA162 (ejemplo 4) como molde y los siguientes oligonucleótidos:
30 JCA324 (37 meros) (SEO ID NO 20): 5' TTTTGAA TTCATGGGGGCTGGACAA TCCAGTCCAGCG 3' y JCA325 (41 meros) (SEO ID NO 21):
5' TTTTGAA TTCAT AAAAA TCAAAGCTTGGTTTTGCGCATCAC 3' para amplificar un fragmento de aproximadamente 3470 pb.
40 Tras digestión y aislamiento, se inserta el fragmento EcoRI-EcoRI de 3448 pb en el plásmido pvFOHC, previamente digerido mediante EcoRI, para proporcionar el plásmido donador pJCA 167. Se realiza la recombinación según la técnica descrita en el ejemplo 6. Se seleccionan placas de lisis positivas
mediante reacción de PCR con los oligonucleótidos JCA309 y JCA312. Se amplifica una placa de lisis y la disolución 45 madre de virus recombinado obtenido se denomina vV101. Para el tipo C: Se realiza la reacción de PCR usando el plásmido pJCA163 (ejemplo 4) como molde y los siguientes 50 oligonucleótidos: JCA326 (37 meros) (SEO ID NO 22): 5' TTTTGAA TTCATGGGAGCTGGGCAA TCCAGCCCAGCG 3'
55 y JCA327 (41 meros) (SEO ID NO 23): 5' TTTTGAA TTCAT AAAAA TCAAAGCTTGGTTTTGCGCA TT AC 3'
60 para amplificar un fragmento de aproximadamente 3460 pb. Tras digestión y aislamiento, se inserta el fragmento EcoRI-EcoRI de 3439 pb en el plásmido pvFOHC, previamente digerido mediante EcoRI, para proporcionar el plásmido donador pJCA168.
re
Se realiza la recombinación según la técnica descrita en el ejemplo 6. Se seleccionan placas de lisis positivas mediante reacción de PCR con los oligonucleótidos JCA313 y JCA316. Se amplifica una placa de lisis y la disolución madre de virus recombinado obtenido se denomina vV102.
Para el tipo A:
Se realiza la reacción de PCR usando el plásmido pJCA164 (ejemplo 4) como molde y los siguientes oligonucleótidos: JCA328 (37 meros) (SEO ID NO 24): 5' TITIGAATICATGGGGGCCGGGCAA TCCAGTCCGGCG 3' y JCA329 (44 meros) (SEO ID NO 25): 5' TITIGAATICATAAAAA TCAGCGGCGGAACAGCGCTITGTCCTC 3' para amplificar un fragmento de aproximadamente 3550 pb. Tras digestión y aislamiento, se inserta el fragmento EcoRI-EcoRI de aproximadamente 3530 pb en el plásmido
pvFOHC, previamente digerido mediante EcoRI, para proporcionar el plásmido donador pJCA169. Se realiza la recombinación según la técnica descrita en el ejemplo 6. Se seleccionan placas de lisis positivas
mediante reacción de PCR con los oligonucleótidos JCA317 y JCA320. Se amplifica una placa de lisis y la disolución madre de virus recombinado obtenido se denomina vV103. Variante para el tipo A: Se realiza la reacción de PCR usando el plásmido pJCA165 (ejemplo 5) como molde y los siguientes
oligonucleótidos: JCA328 (SEO ID NO 24) (37 meros) y JCA325 (SEO ID NO 21) (37 meros) para amplificar un fragmento de aproximadamente 3480 pb. Tras digestión y aislamiento, se inserta el fragmento EcoRI-EcoRI de aproximadamente 3463 pb en el plásmido
pvFOHC, previamente digerido mediante EcoRI, para proporcionar el plásmido donador pJCA170. Se realiza la recombinación según la técnica descrita en el ejemplo 6. Se seleccionan placas de lisis positivas
mediante reacción de PCR con los oligonucleótidos JCA317 y JCA312. Se amplifica una placa de lisis y la disolución madre de virus recombinado obtenido se denomina vV104. Ejemplo 8:1 Construcción de virus vaccinia recombinados para la expresión in vitro (A10) Se digiere el plásmido pJCA161 (ejemplo 3) mediante las enzimas de restricción EcoRV y BgllI. Tras electroforesis
en gel de agarosa, se aisla un fragmento EcoRV-BglIl con un tamaño de aproximadamente 3450 pb. Se hace que este fragmento tenga "extremos romos" mediante tratamiento con la polimerasa Klenow, después se liga en el plásmido pBG200 (Abrams et al., 1995, J. Gen . ViroL, 76, 3089-3098) digiriéndose este último previamente mediante BamHI y se vuelven los extremos romos mediante tratamiento con 'Ia polimerasa Klenow, para proporcionar el plásmido donador pJCA171 .
El plásmido pBG200 comprende el promotor del bacteriófago T7, el terminador de la transcripción de T7 y dos brazos del gen de TK del virus vaccinia, uno en sentido 5' de ese promotor y el otro en sentido 3' del terminador (el experto en la técnica puede inspirarse en Fuerst et al., Molecular and Cellular Biology, 1987, 7, 2538-2544 para la construcción de pBG200). El sitio de inserción de BamHI en el plásmido pBG200 se encuentra entre el promotor y el terminador de T7.
Se realiza la recombinación según la técnica descrita en el ejemplo 6. Se seleccionan placas de lisis positivas mediante reacción de PCR con los oligonucleótidos JCA305 y JCA308. Se amplifica una placa de lisis y la disolución madre de virus recombinado obtenido se denomina vV105.
La conservación de la disolución madre de virus recombinado se realiza a -20°C o -70°C . Ejemplo 9: Construcción de virus vaccinia recombinados para la expresión in vitro de los tipos O, C y A
Se obtienen los constructos de los virus vaccinia recombinados para la expresión in vitro para los tipos O, C y A de los virus aftosos tal como se describió en el ejemplo 8.
Para el tipo O:
Se digiere el plásmido pJCA162 (ejemplo 4) mediante las enzimas de restricción EcoRV y BglIl. Tras aislamiento, se hace que un fragmento EcoRV-BglIl con un tamaño de aproximadamente 3450 pb tenga "extremos romos" mediante tratamiento con la polimerasa Klenow, después se liga en el plásmido pBG200 previamente digerido mediante BamHI y se vuelven los extremos romos mediante tratamiento con la polimerasa Klenow, para proporcionar el plásmido donador pJCA172.
Se amplifica una placa de lisis seleccionada mediante reacción de PCR con los oligonucleótidos JCA309 y JCA312 y la disolución madre de virus recombinado obtenido se denomina vV1 06.
Para el tipo C:
Se digiere el plásmido pJCA163 (ejemplo 4) mediante las enzimas de restricción EcoRVy BglIl. Tras aislamiento, se hace que un fragmento EcoRV-BglIl con un tamaño de aproximadamente 3440 pb tenga los "extremos romos" mediante tratamiento con la polimerasa Klenow, después se liga en el plásmido pBG200 previamente digerido mediante BamHI y se vuelven los extremos romos mediante tratamiento con la polimerasa Klenow, para proporcionar el plásmido donador pJCA 173.
Se amplifica una placa de lisis seleccionada mediante reacción de PCR con los oligonucleótidos JCA313 y JCA316 y la disolución madre de virus recombinado obtenido se denomina vV107.
Para el tipo A:
Se digiere el plásmido pJCA164 (ejemplo 4) mediante las enzimas de restricción EcoRV y BglIl. Tras aislamiento, se hace que un fragmento EcoRV-BgllI con un tamaño de aproximadamente 3520 pb tenga los "extremos romos" mediante tratamiento con la polimerasa Klenow, después se liga en el plásmido pBG200 previamente digerido mediante BamHI y se vuelven los extremos romos mediante tratamiento con la polimerasa Klenow, para proporcionar el plásmido donador pJCA174.
Se amplifica una placa de lisis seleccionada mediante reacción de PCR con los oligonucleótidos JCA317 y JCA320 y la disolución madre de virus recombinado obtenido se denomina vV108.
Variante para el tipo A:
Se digiere el plásmido pJCA165 (ejemplo 5) mediante las enzimas de restricción EcoRV y BglIl. Tras aislamiento, se hace que un fragmento EcoRV-BgllI con un tamaño de aproximadamente 3450 pb tenga los "extremos romos" mediante tratamiento con la polimerasa Klenow, después se liga en el plásmido pBG200 previamente digerido mediante BamHI y se vuelven los extremos romos mediante tratamiento con la polimerasa Klenow, para proporcionar el plásmido donador pJCA175.
Se amplifica una placa de lisis seleccionada mediante reacción de PCR con los oligonucleótidos JCA317 y JCA312 y la disolución madre de virus recombinado obtenido se denomina vV1 09.
Ejemplo 10: Producción y purificación de cápsidas virales vacías
Se ponen células renales de conejo RK13 (accesibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el número de registro CCL-37) en cultivo a 37°C en 20 frascos Falcon de 175 cm 2 con 20 mi de medio DMEM complementado con el 10% de suero de ternero fetal, glutamina 2 mM, penicilina/estreptomicina 500 UI/~g/ml, fungizona 12,5 ~g/ml, cada frasco Falcon contiene aproximadamente 2 107 células en confluencia.
Entonces se añaden los virus vaccinia recombinados vTF7-3 y vV108 (ejemplo 9) cada uno a una multiplicidad de infección (moi) de 10 DICCso/célula en cada frasco Falcon. Se mantiene el cultivo viral a 37°C durante aproximadamente 24 horas hasta la obtención de un efecto citopático del 100%.
El virus vaccinia recombinado vTF7-3 (accesible en la ATCC con el número VR-2153) contiene la ARN polimerasa del bacteriófago T7 bajo el control del promotor p7,5K del virus vaccinia (Fuerst et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8122-8126).
La producción de la ARN polimerasa T7 induce la expresión del inserto bajo el control del promotor T7. Por tanto, se producen el precursor P1 y la proteasa 3C de los virus aftosos y se autoensamblan las cál>sidas vacías.
Se recoge la suspensión viral y después se aclara mediante centrifugación (4.000 revoluciones por minuto (rpm), durante 30 min., a 4°C).
Se resuspende el sedimento en 30 mi de tampón fosfato (fosfato de sodio 40 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 7,6) a OOC, que contiene el 0,5% de Nonidet P40 (Roche, n.o de cat. 1 754 599). Se realiza la lisis celular a OOC sobre hielo durante 20 mino
Se recogen los residuos celulares tras la centrifugación a 10.000 rpm, durante 20 min., a 4°C. Se conserva el sobrenadante a OOC, sobre hielo. Se resuspenden los residuos celulares en 6 mi de tampón fosfato. Se realiza una extracción con cloroformo (a volumen igual). Se deposita la fase acuosa obtenida de esta extracción mezclada con el sobrenadante obtenido anteriormente sobre un lecho de sacarosa al 15% (2 mi) y se centrifuga con un rotor Beeckman SW28 (28.000 rpm, 5 horas, 4°C). Se recupera el sedimento en 1 mi de tampón fosfato y se almacena a 4°C .
Se resuspende el sedimento, después se trata con 20 ,.d de ARNasa (10 mg/ml) sobre hielo durante 10 mino Entonces se añaden 10 l.!! de Nonidet P40 a110% y se deja el conjunto 10 mino sobre hielo. Entonces se lleva a cabo una extracción con cloroformo a volumen igual con la suspensión. Se recupera la fase acuosa (1 mi) y se deposita sobre un gradiente de sacarosa del 15-45% (aproximadamente 12 mi) y se centrifuga con un rotor Beeckman SW40
(40.000 rpm, 5 horas, 12°C o 18.000 rpm, 16 horas, 12°C).
A continuación se divide el gradiente en 14 fracciones de 0,8 mi. Se mide la absorbancia a una longitud de onda de 220 nm. Se recogen las fracciones correspondientes al pico de absorbancia. Estas fracciones contienen las cápsidas virales vacías A24. Se verifica la especificidad de las proteínas recogidas mediante inmunotransferencia de tipo Western. Se obtienen las cápsidas virales vacías de los subtipos 01K, A10, C Spain Olot y A24/A10 procediendo de la manera idéntica a lo que se describe en este ejemplo, sustituyendo respectivamente los virus vaccinia recombinados vV108 por vV106 (ejemplo 9), vV105 (ejemplo 8), vV107 (ejemplo 9) y vV109 (ejemplo 9).
Se conservan las fracciones proteicas así obtenidas a 4°C antes de su uso en vacunas.
Ejemplo 11: Producción de vacunas de subunidades
Se formulan 13,2 mi de las fracciones del gradiente de sacarosa que contienen en total 165 ¡.tg de cápsidas vacías de virus aftoso, obtenidas en el ejemplo 10, con 14,01 mi de DMEM con 27,5 mi de hidróxido de aluminio (AI(OH)3) al 1,5% Y con 0,29 mi de saponina. .
A continuación se dístribuyen los 55 mi así obtenidos en dos matraces, 30 mi en el primero y 25 mi en el segundo. Una dosis de 5 mi comprende 15 ¡.tg de cápsidas virales vacías con 360 unidades hemolíticas de saponina.
Se determina la cantidad de partículas vacías mediante espectrofotometría midiendo la adsorción a 220 nm usando como patrón una disolución de albúmina bovina (BSA).
Ejemplo 12: Producción de vacunas recombinadas
Para la preparación de vacunas, los virus vaccinia recombinados vV100 a vV105 (ejemplos 6 y 7) pueden adyuvarse con disoluciones de carbómero. El carbómero preferido es el CarbopolTM 974P fabricado por BF Goodrich, Ohio, EE.UU. (peso molecular de aproximadamente 3.000.000).
Inicialmente se prepara una disolución madre al 1,5% de CarbopolTM 974P en agua destilada que contiene cloruro de sodio 1 gIl. Entonces se usa esta disolución madre para la elaboración de una disolución a 4 mg/ml de CarbopolTM 974P en agua fisiológica. Se mezcla la disolución madre con el volumen adecuado de agua fisiológica, o bien en una única etapa o bien en varias etapas sucesivas, se ajusta el valor del pH en cada etapa con una disolución de hidróxido de sodio 1 N (o incluso más concentrada) con el fin de obtener un valor final de pH de 7,3
7,4.
Puede usarse la disolución de CarbopolTM 974P lista para usarse asi obtenida para recuperar virus recombinados liofilizados o para diluir disoluciones madre concentradas de virus recombinados. Por ejemplo, para obtener una suspensión viral que contiene 108 ufp por dosis de 1 mi, se diluye una disolución madre viral de manera que se obtiene un título de 108.3 ufp/ml, después se diluye a partes iguales con dicha disolución de CarbopolTM 974P lisla para usarse a 4 mg/ml.
Ejemplo 13: Producción de vacunas de ADN
Se concentra una disolución de ADN que contiene uno o varios plásmidos pJCA161 a pJCA165 (ejemplos 3 y 4) mediante precipitación etanólica tal como se describe en Sambrook et al (1989). Se recupera el sedimento de ADN mediante una disolución de NaCI al 0,9% de manera que se obtiene una concentración de 1 mg/ml. Se prepara una disolución de DMRIE-DOPE a 0,75 mM recuperando un liofilizado de DMRIE-DOPE con un volumen adaptado de H20 estéril (DMRIE o N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propanamonio (documento WO-A9634109); DOPE o dioleoil-fosfatidil-etanolamina (Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389».
Se realiza la formación de los complejos de ADN plasmidico-lípido mediante dilución a partes iguales de la
5 disolución de DMRIE-DOPE 0,75 mM con la disolución de ADN a 1 mg/ml en NaCI al 0,9%. Se introduce progresivamente la disolución de ADN con ayuda de una aguja estéril 26G a lo largo de la pared del matraz que contiene la disolución de lípido catiónico de manera que se evite la formación de espuma. Se procede a una agitación suave desde que se mezclan las dos disoluciones. Se obtiene al final una composición que comprende DMRIE-DOPE 0,375 mM y plásmido 500 !-Ig/ml.
10 Es deseable que el conjunto de las disoluciones usadas esté a temperatura ambiente para el conjunto de las operaciones descritas anteriormente. Se deja que tenga lugar la complejación de ADN/DMRIE-DOPE a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de proceder a la inmunización de los animales.
15 Ejemplo 14: Control en animales bovinos
Se administra la vacuna contra el virus aftoso A24, obtenida en el ejemplo 11 a partir de cápsidas virales vacías expresadas por vV1 09, a un grupo de 6 animales bovinos.
20 Se realiza la inyección por vía subcutánea, a ambos lados del cuello, frente a las paletillas. Los primeros 5 animales reciben una dosis de 5 mi (2 X 2,5 mi), el 6° animal recibe 4 mi (2 X 2,0 mi). Se tatúa "UC10" en la oreja a este 6° animal. Se le administra una segunda inyección por vía subcutánea en cada lado del cuello a cada animal 31 días tras la primovacunación (4 mi para los primeros 5 animales (2 X 2,0 mi) y 0,5 mi (2 X 0,25 mi) para el 6° animal).
25 Se realizan extracciones de sangre en los animales vacunados en DO (día de la primovacunación), D6, D13, D20, D31, D38, D42, D52 e inmediatamente antes de su sacrificio.
Se exponen todos los animales vacunados y 2 anímales control no vacunados por vía intradermolingual (10 X 0,10 mi por lengua) con virus aftosos A24 a un titulo de 104.4 dosis infecciosas/mi (título en células tiroideas de 30 animal bovino). La exposición tuvo lugar 42 días tras la primovacunación.
Se realiza diariamente para cada anímal un seguimiento de las temperaturas (tabla 2) y de los signos de fiebre aftosa (tabla 1) a nível de la lengua, de la boca y de las patas. Se realiza un seguimiento de los títulos de anticuerpos neutralizantes anti-virus aftoso A24 (figura 1).
35 Tabla 1: Seguimiento de los signos clínicos de fiebre aftosa en los animales bovinos tras exposición virulenta
Animal/día tras la exposición
O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Vacunado UC6
TO 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO ND T1 4FO TO 4FO ND TO 4FO
Vacunado UC7
TO 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO ND T1 4FO TO 4FO ND TO 4FO
Vacunado UC8
TO 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO ND T1 4FO TO 4FO ND TO 4FO
Vacunado UC9
TO 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO ND T1 4FO TO 4FO ND TO 4FO
Vacunado UC10
TO 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO ND T1 4FO TO 4FO ND TO 4FO
Vacunado UC11
TO 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO T1 4FO ND T1 4FO TO 4FO ND TO 4FO
Control UC79
TO 4FO T1 4FO T2 4FO T2 4FO T2 4FO T2 4F+ T2 4F+ T2 4F+ T2 4F+ T2 4F+ T2 4F+
Control UC80
TO 4FO T1 4FO T2 4FO T2 4FO T2 4FO T2 4F+ T2 4F+ T2 4F+ T2 4F+ T2 4F+ T2 4F+
Significados de los códigos: TO: lengua sana, ningún signo de replicación viral, ningún resto en los puntos de inyección T1: lengua sana, ningún signo de replicación viral, únicamente traumatismos en los puntos de inyección T2: presencia de lesiones primarias en la lengua T3: presencia de lesiones primarias y secundarias en la lengua o en otras regiones de la boca 4FO: ningún signo de fiebre aftosa a nivel de las 4 patas 4F+: presencia de vesiculas en las 4 patas ND: no se realiza examen clínico
Estos resultados muestran que todos los animales vacunados están protegidos contra una infección por el virus aftoso A24, incluso localmente a nivel de los puntos de inyección. El animal bovino UC10 que recibió una inyección de refuerzo más débil que los otros también está protegido. Por el contrario, los animales control sensibles a la
5 infección por el virus desarrollan la enfermedad de manera visible en la boca a partir del segundo día tras la exposición y en las patas a partir del quinto día tras la exposición.
Tabla 2: seguimiento de las temperaturas (en OC) de los animales bovinos tras la exposición virulenta
Animal I día tras la exposición
O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Vacunado UC6
38,6 38,6 38,2 37,9 38,2 38,6 38,5 38,7 38,5 39,1 39,1
Vacunado UC7
38,7 38,5 38,4 38,2 38,3 38,2 38,3 38,5 38,6 38,4 38,0
Vacunado UC8
38,3 39,0 38,3 38,5 38,6 38,6 38,5 38,3 38,2 38,0 38,6
Vacunado UC9
38,8 38,7 39,0 38,6 38,4 38,5 38,3 38,4 38,6 38,8 39,0
Vacunado UC10
39,3 38,8 38,9 38,6 38,6 38,7 38,8 39,0 38,7 39,2 39,1
Vacunado UC11
38,6 38,8 38,4 38,3 38,3 38,0 38,2 38,0 38,3 38,7 38,8
Control UC79
39,0 40,7 41,0 39,5 39,6 38,8 38,4 38,6 38,4 38,6 38,8
Control UC80
39,1 39,8 40,6 39,9 39,4 38,9 38,6 38,5 38,9 38,8 38,6
Estos resultados muestran que los animales bovinos vacunados no presentan hipertermia, incluso el animal bovino UC10 que recibió una inyección de refuerzo más débil que los otros. Por el contrario, los animales bovinos control presentan una hipertermia cuyo máximo aparece dos días tras la exposición, y después un retorno a temperaturas
15 corporales normales. .
La figura 1 muestra que los animales bovinos vacunados desarrollan una fuerte respuesta de anticuerpos neutralizantes anti-virus aftoso A24 con un primer pico a aproximadamente 13 días tras la primovacunación. Tras la inyección de refuerzo, se observa una fuerte respuesta de anticuerpos neutralizantes. Esto también se observa en el
20 animal bovino UC10 que recibió una inyección de refuerzo más débil que los otros. Tras la exposición, el titulo de anticuerpos no aumenta, lo que indica que el virus FDMV A24 no se replica lo suficiente como para estimular la respuesta de anticuerpos.
En conclusión, la vacuna contra la fiebre aftosa A24 realizada a partir de cápsidas virales vacías obtenidas a partir
25 de vectores de expresión recombinados de virus vaccinia induce una respuesta inmunitaria primaria y secundaria en los animales bovinos. Tras la exposición, estos animales bovinos están totalmente protegidos contra la fiebre aftosa y contra una replicación viral.
Ejemplo 15: Mutagénesis en el constructo A10
Se realiza una mutagénesis dirigida en el constructo A10 por medio de oligonucleótidos y de reacciones de PCR con el objetivo de sustituir el codón que codifica para la histidina 179 (posición en la poliproteína codificada por el plásmido pJCA161, ejemplo 3; numerándose como 1 la metionina de iniciación) por un codón que codifica para una cisteína.
Se realiza una reacción de PCR usando el plásmido pJCA161 como molde y los siguientes oligonucleótidos:
JCA309 (37 meros) (SEO ID NO 5)
40 Y JCA330 (27 meros) (SEO ID NO 26):
5' TGAGTCCACCAGGCACCCGMGACACC 3'
para amplificar un fragmento de 559 pb. Este fragmento se denomina fragmento L.
45 Las condiciones del premier ciclo de la reacción de PCR son 95°C durante 2 min., después 62°C durante 2 mino y 72°C durante 3 mino
Las condiciones de los 35 ciclos siguientes de la reacción de PCR son las mismas que las descritas en el ejemplo 6.
Se realiza una segunda reacción de PCR usando el plásmido pJCA161 como molde y los siguientes oligonucleótidos:
JCA331 (27 meros) (SEO ID NO 27):
5' GGTGTCTTCGGGTGCCTGGTGGACTCA 3'
y JCA332 (36 meros) (SEO ID NO 28): 5' AAAGTCTTTGCCGGCGCTAGCCGACACT AACAAGGT 3'
para amplificar un fragmento de 1020 pb. Este fragmento se denomina fragmento M.
Las condiciones de la reacción de PCR son las mismas que las descritas en el ejemplo 6.
lOSe realiza una tercera reacción de PCR usando los fragmentos L y M como molde, y los oligonucleótidos JCA309 .(SEO ID NO 5) Y JCA332 (SEO ID NO 28) para amplificar un fragmento de 1552 pb. Las condiciones de la reacción de PCR son las mismas que las descritas en el ejemplo 6.
A continuación se digiere este fragmento con ayuda de EcoRV y de Nhel, para aislar, tras electroforesis en gel de 15 agarosa, el fragmento EcoRV-Nhel de 1527 pb. Este fragmento se denomina fragmento N.
Se digiere el plásmido pJCA161 mediante Nhel y después mediante EcoRV para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa, el fragmento Nhel-EcoRV de aproximadamente 6800 pb. Se ligan este fragmento y el fragmento N entre si para proporcionar el plásmido pJCA 176 (8327 pb). Este plásmido contiene un inserto que codifica para la parte de la 20 poliproteína A10 suficiente para generar proteinas de cápsida mutadas termoestables que pueden autoensamblarse.
Se usa el plásmido pJCA176 para la construcción de un virus vaccinia recombinado según el ejemplo 8, obteniéndose el fragmento EcoRV-BgllI en este caso a partir del plásmido pJCA 176 y no a partir del plásmido pJCA161. El virus recombinado así obtenido se denomina vV11 O.
Ejemplo 16: Mutagénesis en el constructo 01 K Se realiza una mutagénesis dirigida en el constructo 01 K por medio de oligonucleótidos y de reacciones de PCR tal como se describió en el ejemplo 15, con el objetivo de sustituir el codón que codifica para la serina 179 (posición en
30 la políproteína codificada por el plásmido pJCA162, ejemplo 4; numerándose como 1 la metionina de iniciación) por un codón que codifica para una cisteína. Se realiza una reacción de PCR usando el plásmido pJCA 162 como molde y los siguientes oligonucleótidos:
35 JCA305 (37 meros) (SEO ID NO 1) Y JCA333 (27 meros) (SEO ID NO 29): 5' CGAGTCAGTCAGGCAGCCGTAGACACC 3'
para amplificar un fragmento de 559 pb. Este fragmento se denomina fragmento O.
Se realiza una segunda reacción de PCR usando el plásmido pJCA162 como molde y los siguientes oligonuc\eótidos:
JCA334 (27 meros) (SEO ID NO 30): 5' GGTGTCTACGGCTGCCTGACTGACTCG 3'
50 y JCA335 (36 meros) (SEO ID NO 31): 5' AGACGTCCGTGTGTTGGCGCCTCTGGATCTGTGTTT 3' para amplificar un fragmento de 1147 pb. Este fragmento se denomina fragmento P. Se realiza una tercera reacción
55 de PCR usando los fragmentos Oy P como molde, y los oligonucleótidos JCA305 (SEO ID NO 1) Y JCA335 (SEO ID
NO 31) para amplificar un fragmento de 1679 pb. A continuación se digiere este fragmento con ayuda de EcoRV y de Narl, para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRV-Narl de 1654 pb. Este fragmento se denomina fragmento O.
Se digiere el plásmido pJCA 162 mediante Narl y después mediante EcoRV para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa, el fragmento Narl-EcoRV de aproximadamente 6670 pb. Se ligan este fragmento y el fragmento O entre sí para proporcionar el plásmido pJCA177 (8327 pb). Este plásmido contiene un inserto que codifica para la parte de la poliproteína 01 K suficiente para generar proteínas de cápsida mutadas termoestables que pueden
65 autoensamblarse.
Se usa el plásmido pJCA177 para la construcción de un virus vaccmla recombinado según el ejemplo 9, obteniéndose el fragmento EcoRV-BgllI en este caso a partir del plásmido pJCA177 y no a partir del plásmido pJCA 162. El virus recombinado así obtenido se denomina vV111.
Ejemplo 17: Mutagénesis en el constructo C Spain Olot Se realiza una mutagénesis dirigida en el constructo C Spain Olot por medio de oligonucleótidos y de reacciones de PCR tal como se describió en el ejemplo 15, con el objetivo de sustituir el codón que codifica para la glicina 179
(posición en la poliproteina codificada por el plásmido pJCA163, ejemplo 4; numerándose como 1 la metionina de iniciación) por un codón que codifica para una cisteina. Se realiza una reacción de PCR usando el plásmido pJCA163 como molde y los siguientes oligonucleótidos: JCA313 (37 meros) (SEO ID NO 9) Y JCA336 (27 meros) (SEO ID NO 32): 5' TGACTIGACGAGGCACCCGT AAACACC 3' para amplificar un fragmento de 559 pb. Este fragmento se denomina fragmento R. Se realiza una segunda reacción de PCR usando el plásmido pJCA163 como molde y los siguientes
oligonucleótidos: JCA337 (27 meros) (SEO ID NO 33): 5' GGTGTITACGGGTGCCTCGTCMGTCA 3' y JCA338 (36 meros) (SEO ID NO 34): 5' GTAGTACTGGGCCMGCCGGCCMGTAGGTGTITGA 3' para amplificar un fragmento de 681 pb. Este fragmento se denomina fragmento S. Se realiza una tercera reacción de PCR usando los fragmentos R y S como molde, y los oligonucleótidos JCA313
(SEO ID NO 9) Y JCA338 (SEO ID NO 34) para amplificar un fragmento de 1213 pb.
A continuación se digiere este fragmento mediante EcoRV y Nael, para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRV-Nael de aproximadamente 1190 pb. Este fragmento se denomina fragmento T. Se digiere el plásmido pJCA163 mediante Nael y después mediante EcoRV para aislar, tras electroforesis en gel de
agarosa, el fragmento Nael-EcoRV de aproximadamente 7120 pb. Se ligan este fragmento y el fragmento T entre sí para proporcionar el plásmido pJCA178 (8312 pb). El plásmido pJCA178 contiene un inserto que codifica para la parte de la poliproteína C Spain Olot suficiente para generar proteínas de cápsida mutadas termoestables que pueden autoensamblarse.
Se usa el plásmido pJCA178 para la construcción de un virus vaccinia recombinado según el ejemplo 9, obteniéndose el fragmento EcoRV-BglII en este caso a partir del plásmioo pJCA 178 y no a partir del plásmido pJCA163. El virus recombinado así obtenido se denomina vV112.
Ejemplo 18: Mutagénesis en el constructo A24 Se realiza una mutagénesis dirigida en el constructo A24 por medio de oligonucleótidos y de reacciones de PCR tal como se describió en el ejemplo 15, con el objetivo de sustituir el codón que codifica para la histidina 179 (posición
en la poliproteína codificada por el plásmido pJCA 164, ejemplo 4; numerándose como 1 la metionina de iniciación) por un codón que codifica para una cisteina. Se realiza una reacción de PCR usando el plásmido pJCA164 como molde y los siguientes oligonucleótidos: JCA317 (37 meros) (SEO ID NO 13) Y JCA339 (27 meros) (SEO ID NO 35): 5' CGAGTCCACCMGCATCCAAAGACACC 3' para amplificar un fragmento de 559 pb. Este fragmento se denomina fragmento U.
Se realiza una segunda reacción de PCR usando el plásmido pJCA164 como molde y los siguientes oligonucleótidos:
JCA340 (27 meros) (SEO ID NO 36):
5' GGTGTCTTTGGATGCTTGGTGGACTCG 3'
y JCA341 (36 meros) (SEO ID NO 37):
5' CCCAGGGTAGTT AGTCCT AGGCGGGTTGT ACACCTT 3'
para amplificar un fragmento de 507 pb. Este fragmento se denomina fragmento V. Se realiza una tercera reacción de PCR usando los fragmentos U y V como molde, y los oligonucleótidos JCA317 (SEO ID NO 13) Y JCA341 (SEO ID NO 37) para amplificar un fragmento de 1039 pb.
A continuación se digiere este fragmento mediante EcoRV y 81nl, para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRV-Blnl de aproximadamente 1014 pb. Este fragmento se denomina fragmento W.
Se digiere el plásmido pJCA 164 mediante Blnl y después mediante EcoRV para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa, el fragmento Blnl-EcoRV de aproximadamente 7360 pb. Se ligan este fragmento y el fragmento W entre si para proporcionar el plásmido pJCA179 (con un tamaño de aproximadamente 8400 pb). Este plásmido contiene un inserto que codifica para la parte de la poliproteína A24 suficiente para generar proteínas de cápsida mutadas termoestables que pueden autoensamblarse. .
Se usa el plásmido pJCA 179 para la construcción de un virus vaccinia recombinado según el ejemplo 9, obteniéndose el fragmento EcoRV-8gll1 en este caso a partir del plásmido pJCA179 y no a partir del plásmido pJCA164. El virus recombinado así obtenido se denomina vV113.
Ejemplo 19: Producción y purificación de cápsidas virales vacías termoestables
Se obtienen las cápsidas virales vacias modificadas de los subtipos A 10, 01 K, C Spain Olot y A24 procediendo de manera idéntica a lo que se describe en el ejemplo 10, sustituyendo los virus vaccinia recombinados vV108 respectivamente por vV110 (ejemplo 15), vV111 (ejemplo 16), vV112 (ejemplo 17) y vV113 (ejemplo 18).
Ejemplo 20: Control de termoestabilidad
Se preparan 10 tubos que contienen cápsidas virales vacías modificadas (ejemplo 19) de virus aftoso A10 y se cuantifican. Cada tubo contiene 0,8 Ilg de cápsidas en 0,5 mi de tampón fosfato a pH 7,6.
Se colocan estos 10 tubos en un baño maría a 50°C durante 1 hora. A continuación se enfrían. Se deposita cada muestra de cápsidas en un gradiente de sacarosa (al 15-35%) y se centrifuga durante 2,5 horas a 12°C (40.000 rpm con un rotor Beeckman SW40). Entonces se divide cada gradiente obtenido en 12 fracciones de 1 mI.
Se precipitan 0,5 mi de cada fracción en presencia de 1 mi de etanol absoluto a -20°C durante 16 horas.
Se recoge el sedimento, se seca, se resuspende en un tampón de carga (Maniatis el al., 1982, en : "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, EE.UU.) Y se deposita sobre un gel de electroforesis SOS-PAGE con el 10% de acrilamida. Se revelan las bandas de las proteínas tras la transferencia mediante un anticuerpo policlonal de cobaya anti-140S A10 que reacciona esencialmente con la proteina VP1 .
Las cápsidas vacías migran en el gradiente a nivel de las fracciones 7 y 8 mientras que las cápsidas vacías degradadas permanecen cerca del vértice del gradiente a nivel de la fracción 11.
La inmunotransferencia tipo Western (figura 2) muestra que las cápsidas vacías correspondientes al mutante siempre están ensambladas después de 1 h a 50°C (gel A) mientras que las cápsidas vacías no mutadas se degradan, al no haber resistido el tratamiento térmico (gel B) tal como puede esperarse.
Ejemplo 21: Producción de vacunas de subunidades que contienen cápsidas vacías termoestables de vírus aftoso
Se obtienen las vacunas que contienen cápsidas virales vacías modificadas de los subtipos 01 K, A10, C Spain Olot y A24 de virus aftoso procediendo de manera similar a lo que se describe en el ejemplo 11 , sustituyendo las cápsidas virales vacías no modificadas por las cápsidas virales vacías modificadas (ejemplo 19).
LISTA DE SECUENCIAS
< 110> MERIAL
<120> Vacunas anti-fiebre aftosa
<130> Pseudoparticulas de FMDV
<140>
<141>
<160> 41
<170> Patentln ver. 2.1
<210> 1
<211>37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 1
ttttgatatc atgggtgctg ggcagtccag cccagca
37
<210> 2
<211>21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido.
<400> 2
ttcacgacga aagtactatc c
21
<210> 3
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 3
ctgaaggacc ctactccggg c
21
<210> 4
<211>37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuer.cia artificial: oligonucleótido
<400> 4
ttttagatct tcaaagcttt gttttgcgca tcacgtg
37
<210> 5
<211>37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 5
ttttgatatc atgggggctg gacaatccag tccagcg
37
<210> 6
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 6
ttcacgacga aggtgctgtc c
21
<210> 7
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 7
aaggacccta cgccggac
18
<210> 8
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 8
ttttagatct tcaaagcttg gttttgcgca tcac
34
<210> 9
<211>37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 9
ttttgatatc atgggagctg ggcaatccag cccagcg
37
<210> 10
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 10
ttcacgacaa acgtgctgtc cag
23
<210> 11
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 11
agagcaaccg caagctgaag 9
21
<210> 12
<211>34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 12
ttttagatct tcaaagcttg gttttgcgca ttac
34
<210> 13
<211>37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 13
ttttgatatc atgggggccg ggcaatccag tccggcg
37
<210> 14
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 14
ttttctegag gggggccggc acgtgaaaga 9
31
<210> 15
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 15
ttttctcgag ggaccggtga agaagcctgt c
31
<210> 16
<211>37
<212 ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
28
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 16 ttttagatct tcagcggcgg aacagcgctt tgtcctc 37
<210> 17
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 17 tttgacctaa cgtcggagaa gaag 24
<210> 18
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido*
<400> 18 ttttgaattc atgcagtcca gcccagcaac cggctcg 37
<210> 19
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 19' ttttgaattc ataaaaatca aagctttgtt ttgcgcatca cgtg 44
<210> 20 <211>37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 20
ttttgaattc atgggggctg gacaatccag tccagcg
37
<210> 21
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 21
ttttgaattc ataaaaatca aagcttggtt ttgcgcatca c
41
<210> 22
<211>37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 22
ttttgaattc atgggagctg ggcaatccag cccagcg
37
<210> 23
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 23
ttttgaattc ataaaaatca aagcttggtt ttgcgcatta c
41
<210> 24
<211>37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 24
ttttgaattc atgggggccg ggcaatccag tccggcg 37
<210> 25
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 25 ttttgaattc ataaaaatca gcggcggaac agcgctttgt cctc 44
<210> 26
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 26 tgagtccacc aggcacccga agacacc 27
<210> 27
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 27 ggtgtcttcg ggtgcctggt ggactca 27
<210> 28
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 28 aaagtctttg ccggcgctag ccgacactaa caaggt 36
31
<210> 29
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 29
cgagtcagtc aggcagccgt agacacc
27
<210> 30
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 30
ggtgtctacg gctgcctgac tgactcg
27
<210> 31
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 31
agacgtccgt gtgttggcgc ctctggatct gtgttt
36
<210> 32
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 32
tgacttgacg aggcacccgt aaacacc
27
<210> 33
111111 J 1 I¡ ~ Il ulll" 11 111 1If!i .....
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 33 ggtgtttacg ggtgcctcgt aaagtca
<210> 34
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 34 gtagtactgg gccaagccgg ccaagtaggt gtttga
<210> 35
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 35 cgagtccacc aagcatccaa agacacc
<210> 36 <211>27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 36 ggtgtctttg gatgcttggt ggactcg
<210> 37
<211> 36
~ IIU 11 u " ¡'111 "~ 11, 1 '!JI.
<212> ADN
5
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
10
<400> 37
cccagggtag ttagtcctag gcgggttgta cacctt
36
15
<210> 38 <211> 1148
<212> PRT
20
<213> Virus de la glosopeda
<400> 38
Met Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn GIn Ser ~ 5 10 15
Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Ty.r Tyr Met Gln Gln Tyr Gln 20 25 30
ABn Ser Met Ser Thr Gln Leu Gly ASp Asn Thr Ile Ser Gly Gly Ser 3S 40 45
Asn Glu GJ.y Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr Bis Thr Thr ASn Thr Gln 50 55 60
ABn ABn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Tbr Gly Leu ÓS 70 75 80
Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu GIu Thr Thr Leu Leu 85 90 9S
Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly Bis Thr Thr Ser Thr Thr 100 105 110
Gln Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ser Thr Glu Glu Asp Bis 115 120 125
val Ala Gly Pro ABn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg val Val Gln Ala 130 135 140
Glu Arg,Pbe Phe Lys Lys Phe Leu Phe Asp Trp Thr Thr Asp Lys Pro 145 150 155 160
Pbe Gly Tyr Leu Thr Lys Leu Glu Leu Pro Thr Asp Ris Bis Gly Val 165 170 175
Phe Gly Bis Leu Val Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp 180 185 190
Val Glu Val Ser Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu 195 200 205
Val Ala Met Val Pro Glu Trp Lys Ala Pbe Asp Thr Arg Glu Lys Tyr 210 215 220
Gln Leu Thr Leu Phe Pro Bis Gln Phe lle Ser Pro Arg Tu Asn Met 225 230 235 240
Thr Ala Bis 11e 'I'hr Val Pro Tyr Leu Gly Val As~ Arg Tyr Asp Gln 245 250 255
bllllll••••I~III~lhlll~lbl ll. ...
Tyr Lys Lys Ris Lys Pro Trp Tbr Leu Val Val Met Val Leu Ser Pro 260 265 270
Leu 'l'hr Val Ser ABn Thr Ala Ala Pro Gln 11e Lys Val Tyr Ala Asn 275 280 285
Ite Ala Pro Thr Tyr Val Bis Val Ala Gly Glu LeuPro Ser Lys Q~u 290 295 300
Gly Ile Phe Pro Val Ala cys Ala ASp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Tbr 305 310 315 320
Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp PrO Val Tyr Gly Lys Val Tyr ABn Pro 325 330 335
Pro Lys Thr Asn Tyr Pro Gly Arg phe Thr Asn Leu Leu Asp Val Ala 340 345 350
Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu Arg Phe Asp Asp Gly Lys Pro 'I'yr Val 355 360 365
Val 'l'h:r Arg Ala Asp Asp Thr IArg LeU Leu Ala Lys Phe Asp Val Ser 370 375 380
Leu Ala Ala Lys Bis Met Ser Asn Tbr Tyr Leu Ser Gly ;t1e Ala Gln 3B5 390 395 400
Tyr Tyr ~Gln Tyr Ser Gly Thr Ile Asn Leu Bis Pbe Met phe Thr 405 410 415
Gly Ser Thr Asp Ser Lys Ala Arg Tyr Met Val Ala Tyr I1e Pro Pro 420 425 430
Gly Val Glu Thr Pro Pro Asp Thr Pro Glu Glu Ala Ala Ris cys Ila 435 '40 445
Ris Ala Glu Trp Asp Tu CUy Leu Asn Ser Lys Pbe Tbr' Pbe Ser Ile 450 455 460
Pro Tyr Val Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr 'I.'hr. Ala Ser Asp Thr Ala 465 470 475 480
Glu Thr Thr Asn Val Gln Gly Trp Val cys Val Tyr Gln Ile Thr Bis . 485 490 495
Gly Lys Ala Glu ASn.Asp Thr Leu Leu Val Ser Ala Ser Ala Gly Lys 500 SOS 510
Asp Phe Glu Leu Ar9 Leu Pro Ile Asp Pro Arg Thr Gln Thr Thr Thr 515 520 525
'1'hr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr 'l'br Tbr Val Glu Aso Tyr Gly' 530 535 540
Gly Asp Thr Gln Val Gln Arg Arg Bis Bis Thr Asp Val Gly Pbe Ile
545 550 5S5 560
Mee Asp Arg Phe Val Lys Ile Asn Ser Leu Ser Pro Tu Bis Val Ile 565 570 575
Asp Leu Met Gln Thr ltls Ll's Ris GIl' -ne Val Gly Ala Íaeu Leu Arg
580 58S 5.90
Ala Ala Thr Tyz Tyr J?he Ser Asp Leu Glu Ile Val Val Arg His Asp 595 600 605
Gly Asn Leu Tb..r 'l'rp Val Pro Asl1 GIl' Ala Pro GIu Ala Ala Leu Ser 610 615_ 620
ABn '1'hr Ser Asn Pro Thr Ala 'l'yr Mn Lys Ala Pro Phe Thr Arg Leu 625 630 -635 640
Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro !lis Arg Val Leu Ala 'l'hr Val '1:yr Asp 645 650 655
Gly Thr ~ Lys Tyr Ser Ala Ser Asp Ser Arg Ser Gly Asp Leu Gly 660 665 670
Ser ne Ala Ala Arg Val Ala Thr Gln Leu Pro Ala Ser Phe MU 'l'yr 675 680 685
Gly Ala :rle Gln Ala Gln Ala 1le Kia Glu Leu Leu Val Arg Met Lys 690 695 700
J\rg Ala Glu Leu Tyr Cye Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile Lys Val 'l'hr 70S 710 715 720
Ser Gln Asp Arg 'l'yr Lye GIn Lys Ile Ile Ala Pro Ala Ll's Gln Leu 725 730 735
Leu Asn Phe Asp Leu Leu Ly.s Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Leu 740 745 150
Gly Pro Phe Phe Phe Ala Asp Val Arg ~er Asn Pbe Ser Lys LeU Val 755 760 765
ABp Thr lle ABn Gln Met Gln Glu Asp Met Ser Thr Lys Bis Gll' Pro 770 775 7eO
Asp Phe Asn Arg Leu Val Ser Ala Phe Glu Glu Leu Ala Tu Gly Val 785 790 795 800
Lys Ala Ile Arg Thr Gly Leu Asp Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Ll's Leu 80S 810 Bl5
Ile Lys Leu Leu Ser Arg Leu Ser Cya Met Ala ,Ala Val-Ala Ala Arg 820 825 830
Ser Lys Asp Pro Val Leu Val Ala tle Met Leu Ala Asp Thr Gly ~eu 835 840 845
Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Arg Ala Lys Leu Pro GIn Gln Glu aso 855 860
Gly Pro 'l)n:' Ala Gly Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys 865 870 875 880
Val Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly Pro '1'yr Glu Gly Pro Val Lys BBS 890 895
Lys Pro Val Ala :t.éu Lys Val Lys Ala Arg Asn Leu Ile Val Thr Glu
900 . 905 910 . Ser Gly Ala Pro Pro Tbr Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly Asn Thr
915 920 925 Lys Pro Val Glu Leu Asn Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala 11e Cys Cys
930 . 935 940
Ala Thr Gly Val Phe Gly Tbr Ala Tyr Leu Val Pro Arg Bis Leu Phe 945 950 955 960
Ala Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Met 'l'hr Asp 965 970 975
Ser Asp Tyr Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys Arg Thr Gly 980 985 . 990
His Ala Leu Arg Arg Gly Thr Bis Trp Leu Leu Bis Arg Gly Asn Cys 995 1000 1005
Val Arg Asp 11e Thr Lys Bis Phe Arg Asp Thr Ala Arg Met Lys Lys 1010 1015 ~020
Gly 'l'hr Pro Val Val Gly Val Val Asn Asn Ala Asp Val Gly Arg Leu 1025 1030 1035 1040
11e phe Ser Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys Asp 11e Val Val Cys Met 1045 1050 3.055
Asp Gly Asp Thr Met Pro Gly Leu Phe Ala Tyr Lys Ala Ala Thr Arg 1060 1065 1070
Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Val Leu Ala Lys Asp' Gly Ala Asp ~ 1075 10aO 1085
Phe 1le Val Gly Thr Bis Ser Ala Gly Gly Aso Gly Val Gly Tyr Cys 1090 1095 3.100
s~r eys Val Ser Arg Ser Met Leu Gln Lys Met Lys Ala Bis val Asp 1105 1110 1115 . 1120
Pro Glu Pro Bis Bis Glu Gly Leu Ile Val Asp Tbr Arg Asp Val Glu 1125 1130 1135
Glu Arg Val His Val Met Arg Lys Thr Lys Leu * 1140 1145
<210> 39 5 <211> 3444
<212> ADN
<213> Virus de la glosopeda
<400> 39
atgggtgctg ggcagtccag cecagcaaee ggctcgcaga aecagtctgg eaacactgge 60
agcataatta aeaactacta catgeagcaa taeeagaaet etatgagcae aeagcttggt 120
gacaatacea teagtggagg eteeaacgag ggetecacgg aeaeaactte aacaeacaea 180
aceaaeaccc aaaacaacga ctggttttea aaacttgcca gttcggcttt taccggtctg 240
ttcggtgcac ttctcgccga eaagaagacg gaagagacta cgettctgga agaccgcatc 300
ctcactaccc gcaacgggca caccacttcg accacccagt cgagtgtggg agtcacgtat 360
gggtactcca ctgaggaaga tcacgttgct gggcccaaca catcgggctt agagacgcgg 420 gtggtgcagg cagagagatt tttcaagaag tttctgtttg actggacaac ggaeaaacct 480 tttggatact tgacaaaact ggagcttccc accgatcacc acggtgtett cgggcacctg 540 gtggaetcat atgcatatat gaggaacggc tgggatgttg. aggtatctgc cgtcggcaac 600 eagttcaacg gcgggtgcct tctggtggcc atggtgccag agtggaaggc atttgacaca 660 egtgaaaaat accagcttac ccttttccca caccagttta ttagccccag aactaacatg 720 actgcccaca tcacggtacc gtatcttggt.gtgaaoaggt acgatcagta oaagaaacao 780 aaaccttgga cactggttgt catggtacta tcacccctc& oggtcagcaa cactgccgcc 840 ccacaaatca aggtctacgc caacattgcc ccaacctacg ttcacgtggc tggagagctt 900 ccctcgaaag aggggatttt cccagttgca tgcgcagacg gttacggagg actggtgaca 960 acagacccga aaacagctga ccctgtttac ggtaaggtgt ataacccgcc caagaccaac 1D20 taccccgggc gctttacaaa cctattggac gtggccgaag catgtcccac ctttcttcgt 1080 ttcgacgatg ggaaaccgta cgtcgttacg cgggcagacg acacccgtct tttggccaag 1140 tttgatgtct cccttgccgc aaaacacatg tccaacacat aectatcagg gattgcacag 1200 tactacacac agtactctgg taetateaac ctgcacttca .tgttcacagg etccactgac 1260 tcaaaagecc gctacatggt ggcttacatc ccgcctgggg tggagaegec gecggaeaca 1320 cctgaagaag ctgctcactg cattcacgct gagtgggaca caggactgaa ctceaaattc 1380 accttttcaa tccettaegt gtctgccgcg gattacgcgt ataccgcatc tgatacggca 1440 gagacaacea atgtacaggg atgggtctgt gtttaecaaa ttacacacgg gaaggctgaa 1S00 aatgacacct tgttagtgtc ggctagcgce ggcaaagact ttgagttgcg cctcccaatt 1560 gacceccgga caeaaaccac taetaetggg gagtccgeag aecctgteac caeeaccgtg 1620 gagaactacg gcggtgatac acaagtccag agaegtcaee acacggacgt cggettcatt 1680 atggaccgat ttgtgaagat aaaeagcctg agccccacac atgtcattga cetcatgcaa 1740 aceeacaaac acgggatcgt gggtgcgtta ctgcgtgcag ccacgtacta cttctccgac 1800 ttggagattg ttgtgcggca cgatggtaat ctgaectggg tg'cecaacgg tgcccccgag 1860 .gcagccetgt caaacaccag caaccccact gcctaeaaca Bggcaccgtt eacgagactt 1920 gctctccctt acactgogce aeaccgcgtg ttggcaactg tgtaegaegg gacaaacaag 1980 tactccgcaa gcgattcgag atcaggcgac ctggggtcea tcgcggcgcg agtcgcgaca 2040 caacttcctg ettcctttaa ctaeggtgca atecaggcac aggccatcca cgagcttctc 2100 gtgcgcatga aacgggccga gctctactgt cecaggccac ttctagcaat aaaggtgact 2160 tcgcaagaca 9gtacaagca aaagattatt gcgcccgcaa aacagctgtt gaactttgac 2220 ctacttaagt tggegggtga cgttgagtce aaccttgggc ccttcttctt cgctgacgtt 2280 aggteaaact tttegaagct ggtagacacc ateaatcaga tgcaggagga catgtccaca 2340 aaacacggac ccgactttaa ccggttggtg tcegcttttg aggaattggc cactggggtt 2400 aaagctatca gaaccggtct cgatgaggcc aaaccctggt acaagctcat caagctccta 2460 agcegtctgt cgtgcatggc cgctgtggca·gcacggtcca aggacecagt ccttgtggcc 2520 atcatgctgg ccgacaccgg tctcgagcgt cagaaacctc taaaagtgag agccaagctc 2580 ccacagcagg agggacccta cgctggcccg atggagagacagaa~ccgct gaaagtaaaa 2640 gtaaaagccc cggtcgttaa ggaaggacct tacgagggac cggtgaagaa gcctgtcgct 2700 ttgaaagtga aagetaggaa cttgattgte actgagagtg gtgccccaec gaccgaettg 2760 cagaagatgg tcatgggcaa cacaaagcct gttgagctta acctcgacgg gaagacagta 2820 gccatctgct gtgctactgg agtgttcggc actgcttacc tcgtgectcg tcaccttttc 2880 gcagagaagt atgacaagat tatgttggac ggcagagcca tgacagacag tgattacaga 2940 gtgtttgagt tcgagattaa agttaaaagg acaggacatg ctctcagacg cggcactcat 3000 tggttgcttc accgtgggaa ctgcgtgaga gacatcacga aacactttcg tgatacagca 3060 agaatgaaga aaggcacccc cgtegttggt gttgtcaaea acgccgatgt tgggagactg 3120 attttctctg gtgaggccct tacetacaag gacattgtag tgtg~atgga tggagacacc 3180 atgcccggcc tctttgccta caaagecgcc accagggctg gctactgtgg aggagcegtt 3240 cttgccaagg acggggctga cacattcatc gtcggcactc actctgcagg tggcaatgga 3300 gttggatact gctcatgcgt tteeaggtcc atgcttcaaa agatgaagge tcacgtcgac 3360 cctgaaccge accacgaggg gttgattgtt gataecagag atgtggaaga gcgcgtccac 3420 gtgatgagea aaacaaagct ttga
<210> 40 <211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 4028 ttttatcgat tcattgatag taccaaat 28
<210> 41
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 4120 attctacagt tctaacatcc 20

Claims (32)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, caracterizada porque comprende una cantidad eficaz de antígeno que consiste en cápsidas vacías del virus aftoso, obtenidas in vitro mediante la expresión en células eucariotas, del ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso que codifica para la cápsida y del ADNc de la región del genoma del virus aftoso que codifica para la proteasa 3C, comprendiendo la vacuna además un vehículo o excipiente farmacéutica mente aceptable desde el punto de vista veterinario, en la que el ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso se modifica mediante sustitución del codón que codifica para el aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEO ID NO: 38, o del codón que codifica para el aminoácido correspondiente al aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEO ID NO: 38 por un codón que codifica para una cisteína.
  2. 2.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 1, caracterizada porque el ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso se modifica mediante sustitución del codón que codifica para el aminoácido X6 de la secuencia X1 Gly X3 X4 Gly X6 Leu Xa X9 Ser X11 X12 Tyr Met en la que
    -X4y X11 son Tyr, His o Phe, -X3, Xe y X12 son Val, Met, lIe, Thr o Ala, -X6 es His, Gln, Arg, Lys, Ser o Gly, -X1 es His o Lys -X9 es Asp, Glu o Lys; por un codón que codifica para una cisteína.
  3. 3.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque las cápsidas vacías del virus aftoso comprenden las proteínas VPO, VP1 y VP3.
  4. 4.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el ADNc que codifica para P1 también codifica para la totalidad o una parte de 2A.
  5. 5.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 4, caracterizada porque el ADNc también codifica para una parte de 28.
  6. 6.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el ADNc que codifica para 3C también codifica para la totalidad o una parte de las proteínas 38, para una parte no funcional de 3D, o a la vez para la totalidad o una parte de las proteínas 38 y para una parte no funcional de 3D.
  7. 7.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivil1dicaciones 1 a 6, caracterizada porque las cápsidas vacías están en forma de subunidades obtenidas mediante expresión del ADNc en células eucariotas, mediante un vector de expresión in vitro, bajo el control de un promotor inducible o de un promotor tardío de origen viral.
  8. 8.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 7, caracterizada porque el promotor es el promotor del bacteriófago T7 y las cápsidas vacías en forma de subunidades se obtienen mediante expresión del ADNc en presencia de la expresión de polimerasa T7.
  9. 9.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el vector de expresión es el virus vaccinia.
  10. 10.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque se formula en un medio que permite la conservación de las cápsidas vacías del tipo DMEM.
  11. 11.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque comprende además un adyuvante.
  12. 12.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 11, caracterizada porque comprende dicha vacuna a modo de adyuvante hidroxilo de alúmina, saponina, avridina, ODA, un polímero del ácido acrílico o metacrílico, un polímero de anhídrido maleico y de derivado de alquenilo, o GM-CSF, o formulándose dicha vacuna en forma de una emulsión de agua en aceite, aceite en agua o agua en aceite en agua.
  13. 13.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 12, caracterizada porque el adyuvante comprende un carbómero.
  14. 14.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, caracterizada porque comprende un vector de expresión que contiene ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso que codifica para la cápsidél y ADNc de la región del genoma del virus aftoso que codifica para la proteasa 3C, de manera que se produce in vivo una cantidad eficaz de antígeno que consiste en cápsidas vacías del virus aftoso, comprendiendo la vacuna además un vehículo o excipiente farmacéutica mente aceptable desde el punto de vista veterinario, en la que el ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso se modifica mediante sustitución del codón que codifica para el aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38, o del codón que codifica para el aminoácido correspondiente al aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEQ NO: 38 por un codón que codifica para una cisteína.
  15. 15.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 14, caracterizada porque el ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso se modifica mediante sustitución del codón que codifica para el aminoácido X6 de la secuencia X1 Gly X3 X4 Gly Xe Leu Xa Xg Ser X11 X12 Tyr Met en la que
    -
    X4 Y X11 son Tyr, His o Phe,
    -
    X3, Xa y X12 son Val, Met, lIe, Thr o Ala,
    -
    X6 es His, Gln, Arg, Lys, Ser o Gly,
    -
    X1 es His o Lys
    -
    X9 es Asp, Glu o Lys;
    por un codón que codifica para una cisteína.
  16. 16.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 14 ó 15, caracterizada porque las cápsidas vacias del virus aftoso comprenden las proteínas VPO, VP1 y VP3.
  17. 17.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizada porque el ADNc que codifica para P1 también codifica para la totalidad o una parte de 2A.
  18. 18.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 17, caracterizada porque el ADNc también codifica para una parte de 28.
  19. 19.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, caracterizada porque el ADNc que codifica para 3C también codifica para la totalidad o una parte de las proteínas 38, para una parte no funcional de 3D, o a la vez para la totalidad o una parte de las proteínas 38 y para una parte no funcional de 3D.
  20. 20.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 19, caracterizada porque el vector de expresión es un vector viral elegido de los poxvirus o los adenovirus replicativos.
  21. 21.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 20, caracterizada porque el vector de expresión es un poxvirus y el ADNc se coloca bajo el control de un promotor. tardío de origen viral elegido de P11 K del virus vaccinia, P28K del virus vaccinia y P160K ATI del virus de la viruela bovina.
  22. 22.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, caracterizada porque el vector de expresión es un vector plasmídico y el ADNc se coloca bajo el control de un promotor elegido del grupo que consiste en el promotor temprano del virus SV40, el promotor L TR del virus de sarcoma de Rous y un promotor de un gen del citoesqueleto.
  23. 23.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22, caracterizada porque comprende además un adyuvante.
  24. 24.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 23, comprendiendo dicha vacuna comprende un vector plasmídico y caracterizada porque el adyuvante comprende un lípido catiónico que contiene una sal de amonio cuaternario de fórmula
    R10CH2CH(OR1)CH2N+(CH3)2(R2lX
    en la que R1 es un radical alifático lineal, saturado o insaturado, que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que contiene 2 ó 3 átomos de carbono, y X es un grupo hidroxilo o amina.
  25. 25.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 24, caracterizada porque el adyuvante comprende DMRIE.
  26. 26.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 25, caracterizada porque el DMRIE está asociado a DOPE para formar DMRIE-DOPE.
  27. 27.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 23, caracterizada porque comprende un vector viral y en la que el adyuvante comprende un polímero del ácido acrílico o metacrílico o un polímero de anhídrido maleico y de derivado de alquenilo.
  28. 28.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 23, caracterizada porque el adyuvante contiene GMCSF.
  29. 29.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 23, caracterizada porque el adyuvante contiene un vector que expresa GM-CSF in vivo.
  30. 30.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizada porque está dicha vacuna destinada a administrarse a un animal bovino.
  31. 31.
    Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizada porque se usa en un método de vacunación de un animal bovino.
  32. 32.
    Uso de cápsidas vacías del virus aftoso, obtenidas in vitro mediante la expresión en células eucariotas del ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso que codifica para la cápsida y del ADNc de la región del genoma del virus aftoso codifica para la proteasa 3C, para la fabricación de una vacuna contra la fiebre aftosa destinada a administrarse a un animal bovino, caracterizado porque el ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso se modifica mediante sustitución del codón que codifica para el aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38, o del codón que codifica para el aminoácido correspondiente al aminoácido 179 de .Ia secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38 por un codón que codifica para una cisteina.
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