BR112021005079A2 - vacina contra o vírus da peste suína africana - Google Patents

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Abstract

VACINA CONTRA O VÍRUS DA PESTE SUÍNA AFRICANA. A invenção é voltada a uma molécula de ácido nucleico recombinante que compreende um cassete de expressão que codifica um poliepítopo que compreende antígenos de células T a partir de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana. A invenção também se refere a uma partícula viral, que compreende a dita molécula de ácido nucleico recombinante, e a uma partícula viral que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana. A invenção refere-se ainda a métodos de estimulação de uma resposta imune em um porco, que compreende a administração da molécula recombinante da invenção e/ou da partícula viral da invenção ao porco em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune.

Description

“VACINA CONTRA O VÍRUS DA PESTE SUÍNA AFRICANA” CAMPO
[0001] A invenção refere-se ao campo dos vírus, mais especificamente, ao campo do Vírus da Peste Suína Africana (VPSA). A invenção refere-se a métodos para a geração de uma vacina que protege contra a infecção com VPSA e ao uso dessa vacina para prevenir ou melhorar a infecção e/ou propagação do Vírus da Peste Suína Africana em porcos.
ANTECEDENTES
[0002] A Peste Suína Africana (PSA) é uma doença viral à qual apenas porcos e javalis selvagens são suscetíveis. Após a infecção inicial, os sintomas podem levar de dois a dez dias para aparecer. Dependendo da patogenicidade do vírus, 30% a 100% dos animais infectados morrem. Os sintomas comuns incluem: perda de apetite, fraqueza, pele vermelha, membranas mucosas oculares inflamadas, vômitos, diarreia com sangue e febre. Além disso, a pele pode ficar azul, áreas da pele podem morrer (manchas pretas) e podem ocorrer hemorragias. Ademais, a doença pode causar abortos espontâneos em porcas prenhas. A morte súbita, sem quaisquer sintomas prévios perceptíveis, também pode ocorrer. Os sintomas da PSA se assemelham aos da peste suína clássica.
[0003] Os porcos podem sobreviver à fase aguda e parecer ter se recuperado, apenas para se tornarem portadores de longo prazo do vírus (de alguns meses a toda a longevidade), e assim excretar o vírus novamente e infectar outros animais.
[0004] O vírus se propaga diretamente de animal para animal e indiretamente por meio de materiais contaminados, tais como fezes, carne de porco e outros produtos derivados de porco, picadas de moscas e carrapatos, especialmente através de uma espécie de carrapato mole, Ornithodoros moubata, no qual o vírus se multiplica. Resíduos de alimentos ou miúdos de porcos infectados também podem conter PSA que contribuem para a propagação do vírus. Tentativas tais como medidas internacionais e vigilância da manutenção nas fazendas de porcos estão sendo feitas para prevenir a propagação maior da doença. Desde 2007, ocorreram vários surtos de PSA na Europa Oriental, China e Rússia. A PSA foi recentemente diagnosticada em uma população de javalis selvagens na Bélgica.
[0005] A PSA é causada por um grande vírus de DNA de fita dupla pertencente à família Asfarviridae. O genoma do DNA mostra variações significativas de comprimento de 160 a 210 kpb, dependendo do isolado. O genoma abrange entre 150 e 167 quadros de leitura aberta, especificando as 54 proteínas estruturais da partícula VPSA e mais de 100 proteínas de infecção [Dixon et al., 2013. Virus Res 173: 3 a 14]. Oito sorogrupos foram identificados até agora, denominados sorogrupos 1 a 8, mas é provável que existam mais. A complexidade e a variabilidade do vírus complicaram a geração de uma vacina que proteja contra infecções por PSA. Várias abordagens diferentes foram usadas, incluindo vacinas inativadas, vacinas de subunidades, vacinas vivas atenuadas e vacinas vivas atenuadas recombinantes [Arias et al.,
2017. Vaccines 5, 35; doi: 10.3390/vaccines5040035].
[0006] Verificou-se que as vacinas inativadas não fornecem proteção, mesmo na presença de adjuvantes [Stone et al., 1967. Am J Vet Res 28: 475 a 481; Blome et al., 2014. Vaccine 32: 3879 a 3882].
[0007] As vacinas de subunidade não forneceram proteção ou forneceram somente proteção parcial. Isso pode ser em parte devido ao grande número de proteínas codificadas (aproximadamente 160) e à dificuldade de selecionar proteínas relevantes. Além disso, a sequência de um grande número de proteínas VPSA não se assemelha a proteínas conhecidas [Dunigan et al., 2006. Virus Research 117: 119 a 132], tornando difícil prever uma função dessas proteínas.
[0008] As vacinas vivas atenuadas são obtidas a partir de cepas virulentas ou de cepas naturalmente pouco virulentas, como OURT88/3 [Boinas et al., 2004. J Gen Virol 85: 2177 a 2187] e NH/68 [Gil et al.,
2008. Arch Virol 153: 1845 a 1854]. Essas vacinas vivas atenuadas frequentemente fornecem até 100% de proteção contra cepas homólogas, mas apenas proteção cruzada parcial contra cepas heterólogas. Além disso, frequentemente induzem efeitos colaterais inaceitáveis, como pneumonia, distúrbios locomotores, focos necróticos, aborto e até morte [Sánchez-Cordón et al., 2018. Vet J 233: 41 a 48; Arias et al., 2017. Vaccines 5, 35; doi:
10.3390/vaccines5040035].
[0009] Os resultados mais promissores foram obtidos recentemente com vacinas vivas atenuadas recombinantes nas quais as deleções de genes, ou combinações de deleções de genes, foram introduzidas para atingir níveis aceitáveis de segurança e eficácia. Foi observada proteção contra certos isolados, embora combinada com níveis variáveis de virulência residual, aparentemente dependendo da cepa individual que foi usada [Sánchez- Cordón et al., 2018. Vet J 233: 41 a 48; Arias et al., 2017. Vaccines 5, 35; doi:
10.3390/vaccines5040035]. A estabilidade genética de longo prazo desses mutantes de deleção não é conhecida, assim como os resultados de um estudo maior em condições de campo.
[0010] Existe, portanto, a necessidade de fornecer uma vacina que seja eficaz e segura e forneça proteção contra a infecção com um grande número de diferentes cepas de VPSA.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011] A invenção, portanto, fornece uma molécula de ácido nucleico recombinante, preferencialmente molécula de DNA recombinante, que compreende um cassete de expressão que codifica um poliepítopo que compreende antígenos de células T de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana, em que os antígenos de células T são separados por espaçadores, preferencialmente por espaçadores de 1 a 10 resíduos de aminoácidos, que contêm sinais para a clivagem do proteassoma. O dito poliepítopo compreende preferencialmente 2 a 50 peptídeos como antígenos de células T. O dito poliepítopo compreende preferencialmente 2 a 50 nonapeptídeos como antígenos de células T, preferencialmente 1 a 13 e 15 a 20 nonapeptídeos como representado na Tabela 1, que são separados por espaçadores de cerca de 1 a 5 resíduos de aminoácidos, preferencialmente 1 a 11 sequências espaçadoras conforme representado na Tabela 2.
[0012] Uma molécula recombinante da invenção pode ainda codificar um epítopo universal de células T. A dita molécula recombinante da invenção pode ainda compreender uma sequência de nucleotídeos para ubiquitina, preferencialmente na extremidade 5’ do terminal do poliepítopo.
[0013] A invenção fornece ainda uma partícula viral, que compreende a molécula recombinante da invenção. A dita partícula viral pode ainda compreender uma proteína marcadora.
[0014] A invenção fornece ainda um método para estimular uma resposta imune em um porco, que compreende a administração da molécula recombinante da invenção e/ou da partícula viral da invenção. A dita administração é ,preferencialmente, em combinação com uma partícula viral que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionados a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana, ao porco em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune. A dita molécula recombinante é, preferencialmente, administrada por via parenteral, preferencialmente por via intramuscular e/ou intradérmica, preferencialmente por imunização por eletroporação. A dita molécula recombinante e/ou a partícula viral é administrada preferencialmente 2 a 4 vezes, preferencialmente com intervalos de cerca de 2 semanas. É preferido que pelo menos uma das administrações da molécula de ácido nucleico recombinante e/ou da partícula viral seja combinada com a administração de antígenos de células T sintéticos de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana. Pelo menos uma das administrações repetidas da molécula recombinante e/ou da partícula viral é combinada com a administração de uma partícula viral que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionados a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L de Vírus da Peste Suína Africana.
[0015] A invenção fornece ainda uma composição, que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante da invenção e/ou a partícula viral da invenção e um excipiente veterinário aceitável.
[0016] A invenção fornece ainda uma vacina, que compreende uma quantidade imunizante eficaz da composição que compreende a molécula recombinante da invenção e/ou a partícula viral da invenção e um excipiente veterinário aceitável.
[0017] A invenção fornece ainda um método para prevenir ou melhorar a infecção e/ou propagação do Vírus da Peste Suína Africana em porcos, que compreende a administração de uma molécula recombinante da invenção e/ou de uma partícula viral da invenção a pelo menos um porco. A dita administração da molécula recombinante e/ou da partícula viral é preferencialmente combinada com a administração de uma partícula viral que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionados a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana.
[0018] A invenção fornece ainda uma partícula viral que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionados a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana.
[0019] A invenção fornece ainda um conjunto de partículas virais e um kit de partes que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionados a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana.
[0020] A invenção fornece ainda um conjunto de partículas virais que compreende uma partícula viral que compreende a molécula recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e uma ou mais partículas virais que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionados a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana.
[0021] A invenção fornece ainda um kit de partes, que compreende uma partícula viral, que compreende uma molécula recombinante da invenção e uma ou mais partículas virais que compreendem antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionados a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L de Vírus da Peste Suína Africana.
[0022] A invenção fornece ainda um kit de partes que compreende uma partícula viral que compreende uma molécula recombinante da invenção e antígenos de células T sintéticos de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana.
[0023] A invenção fornece ainda uma partícula viral que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, ou o conjunto de partículas virais que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, para uso em um método de proteção de um porco da infecção subsequente com Vírus da Peste Suína Africana.
LEGENDAS DAS FIGURAS FIGURA 1. SEQUÊNCIAS
[0024] 1A. Inserção de molécula de ácido nucleico recombinante, indicando ubiquitina e epítopos de células T.
[0025] 1B. Inserção de ASFDVAC2. Indicadas em negrito estão as sequências de aminoácidos de ubiquitina e antígenos de células T 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 11 e 18, conforme indicado na Tabela 1. Itálico denota as sequências de aminoácidos PADRE e as sequências de ácido nucleico CpG.
[0026] 1C. Sequências de ácido nucleico de MVA-p30+B602L (3.106 pb). São indicados, a partir da extremidade 5’, um sítio
SwaI em maiúsculas, o flanco esquerdo de TK, o promotor MVA 13,5L em negrito e sublinhado, uma sequência Kozak, a sequência de codificação do gene p30 da cepa E75 em negrito, uma sequência com etiqueta FLAG sublinhada, um códon de parada em itálico, as sequências de terminação de mH5 em maiúsculo, as sequências de promotor precoce/tardio de mH5 em negrito e sublinhado, uma sequência Kozak, as sequências de codificação para BA71V-B602L (9RL) em negrito, uma sequência com etiqueta FLAG tripla sublinhada, um códon de parada em itálico, as sequências de terminação de C11R em maiúsculo, o flanco direito de TK e um sítio SwaI em maiúsculo.
[0027] 1D. Sequências de ácido nucleico MVA- p54 + EP402R + K205R (3.309 pb). São indicados, a partir da extremidade 5’, um sítio SwaI em maiúsculo, o flanco esquerdo de TK, o promotor MVA 13,5L em negrito e sublinhado, uma sequência Kozak, a sequência de codificação do gene p54 em negrito, uma sequência com etiqueta FLAG sublinhada, um códon de parada em itálico sequências de terminação de mH5 em maiúsculo, sequências de promotor precoce/tardio de mH5, sequências de codificação para BA71V-B602L (9RL) em negrito, uma sequência com etiqueta FLAG tripla sublinhada, um códon de parada em itálico, sequências de terminação de C11R em maiúsculo, as sequências do promotor LEO em negrito e sublinhado, uma sequência de Kozak, a sequência de codificação do gene BA71V-K205R em negrito, uma sequência com etiqueta FLAG sublinhada, um códon de parada em itálico, sequências de terminação de M2L em maiúsculo, o flanco direito do TK e um sítio SwaI em maiúsculo.
[0028] 1E. Sequências de ácido nucleico MVA- p72 + A104R (2.992 pb). São indicados, a partir da extremidade 5’, um sítio SwaI em maiúsculas, o flanco esquerdo de TK, o promotor MVA 13,5L em negrito e sublinhado, uma sequência Kozak, a sequência de codificação do gene p72 em negrito, uma sequência com etiqueta FLAG sublinhada, um códon de parada em itálico, sequências de terminação de mH5 em maiúsculo, sequências de promotor precoce/tardio de mH5 em negrito e sublinhado, uma sequência de
Kozak, sequências de codificação para BA71V-A140R em negrito, uma sequência com etiqueta FLAG sublinhada, um códon de parada em itálico, sequências de terminação de C11R em maiúsculo, o flanco direito de TK e um sítio SwaI em maiúsculo. FIGURA 2. RESULTADOS DA VACINAÇÃO COM
CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE
[0029] 2A. Curvas de sobrevivência. 2B. Pontuações clínicas por grupo nos dias indicados após o desafio (DPC). As colunas brancas indicam animais que morreram. 2C. ELISPOT resulta de células mononucleares de sangue periférico que foram isoladas de porcos no DPC indicado. As células foram estimuladas com meio, vírus e peptídeos (vacina) conforme indicado. FIGURA 3. RESULTADOS DA VACINAÇÃO COM
CONSTRUTOS VIRAIS
[0030] 3A. Curvas de sobrevivência. 3B. Índices médios de morbidade de porcos em diferentes grupos. 3C. Resposta imune mediada por células de três grupos de tratamento. As células mononucleares do sangue periférico foram isoladas dos porcos nos dias indicados após o desafio (eixo X: DPC). Eixo Y: produção de interferona gama conforme determinado com ELISPOT. As células foram estimuladas com meio (Controle Neg.), vírus (AVP) e peptídeos conforme indicado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DEFINIÇÕES
[0031] Como é usado neste documento, o termo “epítopo de célula T” ou “antígeno de célula T” refere-se a um epítopo que pode ser reconhecido pelo sistema imunológico após o processamento intracelular de um antígeno. Após o processamento, um epítopo de célula T torna-se ligado a pelo menos uma molécula de MHC e é expresso na superfície da célula de apresentação de antígeno como um complexo de peptídeo de MHC. Os epítopos de células T apresentados por moléculas de MHC de classe I têm tipicamente entre 8 e 11 aminoácidos de comprimento, enquanto as moléculas de MHC de classe II podem apresentar peptídeos de cerca de 12 a 25 aminoácidos, preferencialmente cerca de 13 a 17 aminoácidos, de comprimento. Estão disponíveis programas de software que podem prever epítopos de células T potenciais dentro de proteínas com base, por exemplo, em perfis de anfipaticidade de proteínas, temas de sequência, matrizes quantitativas, redes neurais artificiais, máquinas de vetor de suporte, relação de atividade de estrutura quantitativa e simulações de encaixe molecular [Desai e Kulkarni-Kale,
2014. Methods Mol Biol 1184: 333 a 64]. Esses programas incluem IEDB Recursos de Análise, ELISpot (PepScan, Lelystad, Holanda), RANKPEP [Reche et al., 2004. Immunogenetics 56: 405 a 19], nHLAPred [Bhasin e Raghava, 2007. J Biosci 32: 31 a 42] e NetMHC [Lundegaard et al., 2008. Nucleic Acids Res 36: W509-12].
[0032] Um epítopo de célula T preferido, ou antígeno de célula T, conforme este termo é usado neste pedido, é um epítopo de MHC de classe I, também denominado epítopo de célula T citotóxica, que compreende 8 a 11 resíduos de aminoácidos, preferencialmente cerca de 9 resíduos de aminoácidos.
[0033] Como é usado neste documento, o termo “poliepítopo” refere-se a uma biomolécula, preferencialmente um peptídeo ou proteína, que tem vários epítopos, como epítopos de células T, preferencialmente epítopos de MHC de classe I. Os ditos epítopos individuais são preferencialmente separados por sequências de ligação. As ditas sequências de ligação permitem flexibilidade e podem estar envolvidas no processamento do poliepítopo nos epítopos individuais.
[0034] Como é usado neste documento, o termo “cassete de expressão” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que fornece a expressão de um ou mais quadros de leitura abertos que estão presentes no dito cassete. Um cassete de expressão compreende preferencialmente uma sequência promotora, em pelo menos um quadro de leitura aberto e uma região
3’ não traduzida que compreende preferencialmente um sinal de poliadenilação. Um cassete de expressão pode compreender ainda sequências potenciadoras, um ou mais elementos reguladores pós-transcricionais e/ou uma ou mais sequências íntrons. Para a expressão em células eucarióticas, os ditos elementos reguladores pós-transcricionais e/ou uma ou mais sequências íntrons podem aumentar a exportação nuclear de produtos de transcrição, isto é, um RNA mensageiro, do cassete de expressão para permitir a tradução do RNA no citoplasma. O dito cassete de expressão é preferencialmente otimizado para expressão em porcos.
[0035] Conforme usado neste documento, o termo “peptídeo” refere-se a uma molécula proteica que compreende 2 a 50 resíduos de aminoácidos. Um peptídeo pode estar presente em uma proteína maior, antes do processamento da proteína em peptídeos individuais.
[0036] Conforme usado neste documento, o termo “proteína” refere-se a uma molécula proteica que compreende mais de 50 resíduos de aminoácidos.
[0037] Conforme é usado neste documento, o termo “nonapeptídeo” refere-se a um peptídeo que compreende nove resíduos de aminoácidos.
[0038] Conforme é usado neste documento, o termo “espaçador” refere-se a pequenos peptídeos, preferencialmente 1 a 10 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente 1 a 5 resíduos de aminoácidos, que estão presentes entre os epítopos individuais de um poliepítopo e permitem flexibilidade e processamento dos epítopos pelo proteassoma e apresentação dos epítopos individuais pelo MHC. As sequências de aminoácidos de espaçadores adequados são fornecidas, por exemplo, no documento US20130011424 e em Toes et al., 2001. J Exp Med 194: 1 a 12, que são incorporados neste documento por referência.
[0039] Conforme é usado neste documento, o termo “epítopo universal de células T” refere-se a uma sequência de peptídeo que é ligada e exibida por muitas moléculas de MHC diferentes e, portanto, presume-se que ative o sistema imunológico de muitos indivíduos. O dito epítopo universal de células T é preferencialmente um epítopo de MHC de classe II, também denominado epítopo de célula T auxiliar.
[0040] Conforme é usado neste documento, o termo “sequência de nucleotídeos para ubiquitina” refere-se a uma molécula de nucleotídeo que codifica a ubiquitina. A ubiquitina é uma proteína de 76 aminoácidos cuja sequência é altamente conservada ao longo da evolução de invertebrados a mamíferos. A ubiquitina está envolvida na proteólise não lisossômica dependente de ATP. A dita sequência de nucleotídeos expressa preferencialmente a sequência de aminoácidos N-
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRT LSDYNIQKESTLHLVLRLRG.
[0041] Conforme é usado neste documento, o termo “partícula viral” refere-se a uma partícula viral infecciosa ou partícula semelhante a vírus que é atenuada e não é capaz de se propagar de forma autônoma. O genoma de uma partícula de vírus compreende preferencialmente deleções em genes que são relevantes para a perda da dita partícula de uma célula infectada. A deleção dos ditos genes proporciona espaço para a inserção de genes estranhos que codificam, por exemplo, uma molécula de DNA recombinante, que compreende um cassete de expressão que codifica epítopos de células B e/ou epítopos de células T de acordo com a invenção.
[0042] Conforme é usado neste documento, o termo “porco” refere-se a um animal da família Suidae de ungulados com dedos iguais. O termo porco inclui um porco doméstico e seu ancestral, o javali selvagem euroasiático comum (Sus scrofa), porco barbado de Palawan, porco barbado de Bornéu, porco de Heude ou porco verrugoso vietnamita, porco verrugoso de Visayan, porco verrugoso de Celebes, porco verrugoso de Flores, porco verrugoso de Mindoro, porco verrugoso das Filipinas, porco verrugoso de Java, babirusa e javali.
[0043] Conforme é usado neste documento, o termo “quantidade eficaz” refere-se a um meio de uma quantidade de uma molécula recombinante de acordo com a invenção e/ou uma ou mais partículas virais de acordo com a invenção, que produz um efeito na infecção subsequente de um porco com Vírus da Peste Suína Africana.
MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE
[0044] A invenção fornece uma molécula de ácido nucleico recombinante, que compreende um cassete de expressão que codifica um poliepítopo que compreende antígenos de células T de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana, em que os antígenos de células T são separados por espaçadores, preferencialmente por espaçadores de 1 a 10 resíduos de aminoácidos, que contêm sinais para clivagem de proteassoma.
[0045] A dita molécula de ácido nucleico, preferencialmente RNA ou DNA, é preferencialmente produzida por tecnologias recombinantes, incluindo o uso de polimerases, enzimas de restrição e ligases, como é conhecido por uma pessoa versada. Alternativamente, o dito ácido nucleico é fornecido por síntese de gene artificial, por exemplo, por síntese de oligonucleotídeos parcialmente ou completamente sobrepostos, ou por uma combinação de química orgânica e tecnologias recombinantes, como é conhecido pela pessoa versada. O dito ácido nucleico é preferencialmente otimizado por códons para aumentar a expressão do cassete de expressão que codifica um poliepítopo em um porco vacinado. A otimização adicional pode incluir a remoção de sítios de junção crípticos, remoção de caudas poliA crípticas e/ou remoção de sequências que levam ao enovelamento desfavorável do mRNA. A presença de um íntron flanqueado por sítios de junção pode encorajar a exportação de um núcleo de células infectadas.
[0046] Em uma modalidade, a dita molécula de ácido nucleico é RNA, incluindo RNA não modificado, RNA modificado e, preferencialmente, RNA autorreplicante. O dito RNA autorreplicante pode ser baseado em sistemas virais para amplificação da molécula de RNA, tais como derivados de alfavírus, flavivírus, rabdovírus, vírus do sarampo e/ou flavivírus. O dito RNA pode ser complexado ou condensado com moléculas, tais como nanopartículas, polietilenimina, lipídios catiônicos, incluindo lipídios catiônicos sintéticos, tais como cloreto de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), lipofectamina e SAINT®, e/ou quitosanas.
[0047] O cassete de expressão compreende preferencialmente meios para altos níveis de expressão, como promotores fortes, por exemplo de origem viral (por exemplo, citomegalovírus humano) ou promotores derivados de genes que são altamente expressos em uma célula, como uma célula de porco (Running Deer e Allison, 2004. Biotechnol Prog 20: 880 a 889; Patente US Nº: 5888809).
[0048] É fornecida ainda uma célula hospedeira que compreende uma molécula de ácido nucleico recombinante, que compreende um cassete de expressão de acordo com a invenção. A dita célula hospedeira pode ser cultivada ou armazenada para futura produção de uma molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a invenção. A dita célula é preferencialmente uma célula bacteriana, por exemplo Escherichia coli.
[0049] O ácido nucleico é preferencialmente solubilizado, por exemplo em uma solução tamponada como PBS, antes da administração a um porco. A administração compreende preferencialmente entre 1 μg e 1 mg de ácido nucleico no total por animal.
[0050] A dita molécula de ácido nucleico recombinante, que compreende um cassete de expressão que codifica um poliepítopo expressa 2 a 50 antígenos de células T, preferencialmente 5 a 30 antígenos de células T, mais preferencialmente cerca de 20 antígenos de células T, como 18 antígenos de células T, 19 antígenos de células T, 20 antígenos de células T e 21 antígenos de células T, de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana. Antígenos de células T adequados são preferencialmente previstos usando programas de software disponíveis. Os antígenos de células T preferidos têm afinidade de aglutinação de classe I do complexo de histocompatibilidade principal (MHC). Um programa de software preferido que está incluído na análise de antígenos de células T adequados é denominado NetMHC [Andreatta e Nielsen, 2016. Bioinformatics 32: 511 a 7], que se baseia em redes neurais artificiais que permitem inserções e deleções no alinhamento. É capaz de aprender o perfil de comprimento de diferentes moléculas de MHC. É preferido que os autopeptídeos não sejam selecionados como antígenos de células T adequados, uma vez que estes podem causar doenças autoimunes.
[0051] Os ditos 2 a 50 antígenos de células T são peptídeos de 6 a 15 resíduos de aminoácidos, preferencialmente 8 e 11 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente cerca de 9 resíduos de aminoácidos, que são separados por espaçadores, preferencialmente por espaçadores de 1 a 10 resíduos de aminoácidos, que contêm sinais para clivagem de proteassoma. Os antígenos de células T preferidos são derivados das proteínas do Vírus da Peste Suína Africana MGF_505-7R, NP1450L, G1340L, B385R, G1211R, E423R, NP1450L, MGF_5059R, E301R, C717R, EP424R, F778R, CP530R, R298L, CP2475L, O174L, MGF_360-2L, NP1450L, M1249L, e/ou MGF_360-1l.
[0052] Antígenos de células T preferidos são selecionados a partir dos peptídeos indicados na Tabela 1. TABELA 1. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE
ANTÍGENOS DE CÉLULAS T PREFERIDOS
[0053] Uma molécula de ácido nucleico recombinante preferida compreendendo um cassete de expressão de acordo com a invenção codifica preferencialmente os peptídeos 1 a 20 da Tabela 1, mais preferencialmente os peptídeos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, mais preferencialmente, a partir da extremidade N do terminal, nesta ordem, os peptídeos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 11, 18.
[0054] Os ditos espaçadores têm, preferencialmente, cerca de 1 a 5 resíduos de aminoácidos, incluindo 2 resíduos de aminoácidos, 3 resíduos de aminoácidos e 4 resíduos de aminoácidos. Espaçadores preferidos incluem peptídeos indicados na Tabela 2. TABELA 2. SEQUÊNCIAS ESPAÇADORAS
[0055] Uma molécula de ácido nucleico recombinante preferida que compreende um cassete de expressão de acordo com a invenção, codifica preferencialmente um epítopo universal de célula T. O dito epítopo universal de células T está preferencialmente localizado na frente dos epítopos de células T do Vírus da Peste Suína Africana, portanto N-terminal para esses epítopos de células T. Exemplos de tais epítopos universais de células T são fornecidos em Khatun et al., 2017. Chemistry 23: 4233 a 4254. Um epítopo universal de células T preferido é fornecido por um epítopo pan DR não natural denominado PADRE, tendo a sequência de aminoácidos aKXVAAWTLKAAaZC, em que X denota L-ciclo-hexilalanina e Z denota ácido aminocaproico (Alexander et al., 2000. J Immunol 164: 1625 a 1633). Para fins de expressão, um derivado que possui a sequência AKFVAAWTLKAAAARY é preferencialmente usado.
[0056] Uma molécula de ácido nucleico recombinante preferida, que compreende um cassete de expressão de acordo com a invenção, preferencialmente compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica a ubiquitina, preferencialmente na extremidade 5’ do terminal do poliepítopo. A fusão de ubiquitina com o poliepítopo que compreende antígenos de células T aumenta o direcionamento para o proteassoma, resultando em processamento aprimorado do poliepítopo e respostas de células T aumentadas.
[0057] Uma molécula de ácido nucleico recombinante preferida compreende a sequência de nucleotídeos representada na Figura 1B.
PARTÍCULAS VIRAIS
[0058] A invenção fornece ainda uma partícula viral que compreende uma molécula de ácido nucleico recombinante, que compreende um cassete de expressão que codifica um poliepítopo que compreende antígenos de células T de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana de acordo com a invenção.
[0059] A invenção fornece ainda uma partícula viral que compreende uma molécula de ácido nucleico recombinante que expressa antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana. Os ditos antígenos de células B são preferencialmente selecionados a partir das proteínas p30, p54, p72, EP402R (pEP402R), A104R (pA104R) e/ou B602L (pB602L) do Vírus da Peste Suína Africana. Uma pessoa versada na técnica entenderá que o termo “proteína EP402R” refere-se a pEP402R; o termo “proteína A104R” refere-se a pA104R; e o termo “proteína B602L” refere-se a pB602L. Os ditos antígenos de células B compreendem preferencialmente uma sequência de aminoácidos das proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente compreendem sequências de aminoácidos substancialmente completas das proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana. Exemplos de tais sequências de aminoácidos são fornecidos pelo número de acesso UniProt P34204 (P30_ASFB7) para a fosfoproteína p30 de cepa Badajoz 1971; número de acesso UniProt Q65194 para a proteína de envelope p54 de cepa Badajoz 1971; número de acesso UniProt P22776 para a proteína de cápside principal p70 de cepa Badajoz 1971; número de acesso UniProt Q89501 para o homólogo CD2 EP402R de cepa Badajoz 1971; número de acesso UniProt P68742 para proteína A104R tipo histona viral de cepa Badajoz 1971; e número de acesso UniProt Q65169 para a proteína B602L de cepa Badajoz
1971.
[0060] Os ditos antígenos de células B são preferencialmente expressos usando cassetes de expressão em tandem, por exemplo, para expressão de p30 e B602L; p72 e A104R) e/ou p54 e EP402R, ou cassetes de expressão triplos, por exemplo, para expressão de p54 e EP402R e K205R) cassetes de expressão. Os construtos de DNA que codificam os antígenos de células B podem ser geradas sinteticamente, por exemplo, obtidas de GenScript, como é conhecido por uma pessoa versada. As regiões de codificação do antígeno de células B são preferencialmente clonadas com diferentes promotores MVA e sequências de terminação da transcrição para conduzir a expressão desses genes. Além disso, os ditos antígenos de células B são preferencialmente fornecidos com uma etiqueta de sequência para permitir a detecção da expressão de proteína. As etiquetas adequadas incluem uma etiqueta 6xHis, domínio c-myc (EQKLISEEDL), identificador de hemaglutinina (YPYDVPDYA), proteína de aglutinação à maltose, glutationa-S-transferase, proteína de aglutinação à maltose, peptídeode de etiqueta FLAG, peptídeo aceitador de biotina, peptídeo de aglutinação à estreptavidina e peptídeo de aglutinação à calmodulina, conforme apresentado em Chatterjee, 2006. Cur Opin Biotech 17, 353 a 358. Uma etiqueta FLAG é uma etiqueta preferida. A dita etiqueta está preferencialmente presente no terminal C de um antígeno de célula B.
[0061] Partículas virais que podem ser usadas como vetores para a transmissão das ditas moléculas de ácido nucleico recombinante, preferencialmente moléculas de DNA, incluem partículas com base em vírus adenoassociado, lentivírus, por exemplo, um vetor baseado em retrovírus, conforme baseado em Vírus da Leucemia Murina de Moloney, Vírus Formador de Foco de Baço, Vírus do Sarcoma Mieloproliferativo, Vírus de Células-Tronco Murinas ou gama retrovirus SFG (Rivière et al., 1995. PNAS 92: 6733 a 6737), adenovírus, vírus do herpes simples, poxvírus, tal como Vacina Ankara Modificada (MVA; Mackowiak et al., 1999. Adv Vet Med 41: 571 a 583; Cottingham et al., 2008. PLoS One 20: e1638) ou poxvírus canário, arenavírus, vírus do sarampo, vírus da doença de Newcastle [Kortekaas et al., 2010. Vaccine 28: 2271 a 2276) e/ou Bunyavírus, como o vírus da febre de Rift Valley (Wichgers Schreur et al., 2014. J Virol 88: 10883 a 10893).
[0062] Uma partícula de vírus preferida é baseada em poxvírus. A dita partícula de vírus é preferencialmente uma partícula baseada em Vacina Ankara Modificada (MVA), tal como descrito em Cottingham et al., 2008. PLoS One 20: e1638). Um cassete de expressão preferido em MVA compreende a sequência do promotor MVA 13,5, conforme descrito em, por exemplo, US20150299267. O cassete de expressão é preferencialmente inserido no gene TK do vetor de vacina MVA (varíola atenuada) por meio de recombinação de Cromossomo Artificial Bacteriano (BAC) de acordo com procedimentos conhecidos por um versado na técnica.
[0063] A dita partícula de vírus é preferencialmente produzida em uma célula eucariótica. A dita célula eucariótica é preferencialmente uma célula que pode ser facilmente infectada e/ou transfectada usando métodos padrões conhecidos da pessoa versada, tais como, por exemplo, células de levedura e células de fibroblastos de frango. A dita célula eucariótica é preferencialmente uma célula de inseto ou uma célula de mamífero. As células de inseto adequadas compreendem, por exemplo, células de Spodoptera frugiperda ovarianas, tais como Sf9 e Sf21, células de Drosophila Schneider 2 e células de Aedes albopictus C6/36. Células de mamífero adequadas compreendem, por exemplo, células de rim de hamster bebê, células de rim embrionário humano, como células HEK293 e HEK293FTM de estilo livre (ThermoFisher Scientific), células VERO, células MDCK, células CHO, células HeLa e PER.C6 (Fallaux, FJ et al 1998. Hum Gene Ther 9: 1909 a 1917). As células preferidas são células de rim embrionárias humanas, tais como células HEK293 e HEK293FTM de estilo livre.
[0064] Em uma modalidade, a dita partícula viral compreende ainda uma proteína marcadora. A dita proteína marcadora permite a identificação de porcos que receberam uma partícula de vírus de acordo com a invenção. A dita proteína marcadora permite discriminar um porco vacinado de um porco que está infectado com VPSA de tipo selvagem. A dita proteína marcadora é preferencialmente uma proteína fluorescente, beta-glucuronidase, beta-galactosidase, luciferase de Gaussia, luciferase de Renilla e/ou fosfatase alcalina segregada. Será entendido por um versado na técnica que a sequência de codificação para a dita proteína marcadora está presente no genoma de uma partícula de vírus de acordo com a invenção, de modo que a proteína marcadora seja expressa em células que receberam uma partícula de vírus da invenção.
[0065] A invenção fornece ainda um conjunto de partículas virais que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana.
[0066] A invenção fornece ainda um conjunto de partículas virais que compreende uma partícula viral que compreende a molécula recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e uma ou mais partículas virais que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionados a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana.
[0067] A invenção fornece ainda um kit de partes, que compreende partículas virais que compreendem antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana.
[0068] Os ditos antígenos de células B são preferencialmente selecionados a partir das proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana. Os ditos antígenos de células B compreendem preferencialmente uma sequência de aminoácidos das proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente compreendem sequências de aminoácidos substancialmente completas das proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana. Exemplos de tais sequências de aminoácidos são fornecidos pelo número de acesso UniProt P34204 (P30_ASFB7) para a fosfoproteína p30 de cepa Badajoz 1971; número de acesso UniProt Q65194 para a proteína de envelope p54 de cepa Badajoz 1971; número de acesso UniProt P22776 para a proteína de capsídeo principal p70 de cepa Badajoz 1971; número de acesso UniProt Q89501 para o homólogo CD2 EP402R de cepa Badajoz 1971; número de acesso UniProt P68742 para proteína A104R tipo histona viral de cepa Badajoz 1971; e número de acesso UniProt Q65169 para a proteína B602L de cepa Badajoz 1971.
[0069] A invenção fornece ainda um kit de partes, que compreende uma partícula viral, que compreende a molécula recombinante que compreende um cassete de expressão que codifica um poliepítopo que compreende antígenos de células T de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana de acordo com a invenção e uma ou mais partículas virais que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionados a partir das proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana de acordo com a invenção.
[0070] A invenção fornece ainda um kit de partes que compreende uma partícula viral, que compreende a molécula recombinante que compreende um cassete de expressão que codifica um poliepítopo que compreende antígenos de células T de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana de acordo com a invenção e antígenos de células T sintéticos de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana.
MÉTODOS DE ESTIMULAÇÃO DE UMA RESPOSTA IMUNE EM UM PORCO
[0071] A invenção fornece um método para estimular uma resposta imune em um porco, que compreende a administração da molécula recombinante da invenção, e/ou uma partícula viral da invenção ao porco em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune.
[0072] A invenção fornece um método para estimular uma resposta imune em um porco, que compreende a administração da molécula recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e/ou da partícula viral da reivindicação 6 ou 7, em combinação com uma partícula viral que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionado a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana, para o porco em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune.
[0073] A molécula recombinante da invenção e/ou uma partícula viral da invenção preferencialmente é fornecida em uma composição, preferencialmente uma composição farmacêutica.
[0074] A molécula de ácido nucleico recombinante e/ou partícula de vírus pode ser administrada a um porco por qualquer método conhecido por um versado na técnica, incluindo injeção, emplastros para difusão passiva tópica ou iontoforese, eletroporação, microporação térmica, pulverizadores nasais, inalação respiratória superior e pulmonar de aerossol, sonoporação, produtos químicos, e abrasão mecânica e entrega cinética/balística [Weniger et al., 2018. Vaccine 36: 427 a 437].
[0075] Preferencialmente, uma molécula de ácido nucleico recombinante e/ou partícula de vírus é/são administrada(s) por via parenteral, tal como por injeção. A molécula de ácido nucleico recombinante e/ou partícula viral de acordo com a invenção é preferencialmente formulada com carreadores, adjuvantes ou veículos convencionais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis. O termo parenteral, conforme utilizado neste documento, inclui injeção subcutânea, intracutânea ou intradérmica, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrassinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraniana ou técnicas de infusão.
[0076] A molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a invenção é mais preferencialmente administrada por eletroporação, mais preferencialmente por eletroporação intramuscular/intradérmica, a porcos. A eletroporação pode ser realizada usando, por exemplo, um arranjo de eletrodos que consiste em um arranjo de agulha de trocar galvanizado com ouro de 0,43 mm de diâmetro a um espaçamento de 1,5 mm (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA) que é pressionado para baixo na bolha de pele feita por entrega de Mantoux de formulação de plasmídeo de 50 μl e aplicação de pulsos de 100 ms de 25 V; um gerador de pulso portátil (CUY21 EDIT; Nepa Gene, Ichikawa, Japão) e eletrodos de pinça (6 pulsos de 10 ms com corrente de saída 300 a 600 mA); um gerador de pulsos BTX ECM 830 com o eletrodo redondo de microemplastro sem agulha montado em um manípulo (Modelo MP 35) (Genetronics, San Diego, CA) e aplicando seis pulsos de onda quadrada a 60, 70 ou 80 V, respectivamente, com duração do pulso de 60 ms, intervalo de pulso de 200 ms e reversão da polaridade após três pulsos.
[0077] Um outro método preferido emprega a administração intramuscular na coxa direita em dois locais com cerca de três cm de distância em um volume de 0,25 ml por local de injeção. Imediatamente após a injeção, um procedimento de eletroporação in vivo usando um Cliniporator (IGEA) pode ser aplicado com eletrodos de agulha linear/hexagonal no local das injeções. O espaço entre as agulhas é preferencialmente de cerca de 2 cm e o eletroporador é preferencialmente ajustado para 100V. Uma corrente de 50 V/cm é usada para manter uma amperagem média de 0,6 A. Dois a vinte pulsos,
preferencialmente cinco a dez pulsos, preferencialmente cerca de oito pulsos, de cerca de 5 a 50 milissegundos, preferencialmente cerca de 20 milissegundos são aplicados com intervalos de 50 a 500 milissegundos, preferencialmente cerca de 200 milissegundos.
[0078] A dita administração é preferencialmente repetida, preferencialmente 1 a 3 vezes de modo que a molécula recombinante e/ou a partícula viral seja administrada um total de 2 a 4 vezes. A administração repetida é preferencialmente realizada com intervalos de cerca de 2 semanas.
[0079] A resposta imune protetora pode exigir imunidade celular e sorológica. Portanto, em um método preferido de estimulação de uma resposta imune em um porco, pelo menos uma das administrações da molécula recombinante e/ou da partícula viral é combinada com a administração de peptídeos sintéticos que compreende antígenos de células T de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente 2 a 50 peptídeos, mais preferencialmente cerca de 10 a 30 peptídeos, como cerca de 20 peptídeos, como 18 peptídeos, 19 peptídeos, 20 peptídeos e 21 peptídeos.
[0080] Os ditos peptídeos que compreendem antígenos de células T são, preferencialmente, peptídeos de 6 a 15 resíduos de aminoácidos, preferencialmente 8 e 11 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente cerca de 9 resíduos de aminoácidos. Os peptídeos preferidos são selecionados a partir dos peptídeos indicados na Tabela 1.
[0081] Os ditos peptídeos são administrados preferencialmente por via parenteral, tal como por injeção, mais preferencialmente por injeção intramuscular.
[0082] Em um método preferido de estimulação de uma resposta imune em um porco, pelo menos uma das administrações da molécula recombinante e/ou a partícula viral é combinada com a administração de uma partícula viral que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionados das proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana.
[0083] A quantidade de uma partícula viral da invenção que é administrada a um porco está, em geral, na faixa de 1.000 a
1.000.000.000 de partículas de vírus infecciosas por animal. A quantidade de partículas infecciosas pode ser determinada usando técnicas padrões conhecidas pelas pessoas versadas, como, por exemplo, uma curva de resposta à dose.
[0084] A invenção fornece ainda uma composição, preferencialmente uma composição veterinária aceitável, que compreende a molécula recombinante e/ou a partícula viral da invenção e um excipiente veterinário aceitável.
[0085] A dita composição é preferencialmente uma suspensão aquosa ou oleaginosa. Esta suspensão pode ser formulada de acordo com técnicas conhecidas na técnica usando agentes dispersantes ou umectantes (tais como, por exemplo, Tween 80) e agentes de suspensão. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão manitol, água, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito, qualquer óleo fixo suave pode ser empregado incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Os ácidos graxos, como o ácido oleico e seus derivados glicerídeos, são úteis na preparação de uma composição adequada, assim como os óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, como o azeite ou o óleo de rícino, especialmente em suas versões polioxietiladas. Estas soluções ou suspensões em óleo também podem conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, ou um álcool semelhante, conforme descrito na Farmacopeia Helvética.
[0086] A invenção fornece ainda uma vacina que compreende uma quantidade imunizante eficaz da composição que compreende a molécula recombinante e/ou a partícula viral da invenção e um excipiente veterinário aceitável. A dita vacina preferencialmente compreende ainda uma partícula viral que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína
Africana, preferencialmente selecionados a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana.
[0087] Uma composição que compreende uma partícula viral da invenção preferencialmente compreende ainda adjuvantes incluindo citocinas, tais como interferon-gama, sequências de ácido nucleico imunoestimulantes, tais como oligonucleotídeos CpG, lipossomas, partículas semelhantes a vírus, tensoativos, tais como hexadecilamina, poliânions, tais como pirano e sulfato de dextrano.
[0088] Um adjuvante preferido é ISCOM, conforme descrito no pedido de patente internacional WO2002026255A1. A tecnologia ISCOM tem várias vantagens sobre outros adjuvantes. Os ISCOMs estimulam as respostas imunes humorais e mediadas por células. Os ISCOMs são adjuvantes altamente eficientes, permitindo uma redução adicional das quantidades de um produto inativado ou parte do mesmo de acordo com a invenção. Um ISCOM preferido é o ISCOM Matrix-M.
[0089] Outro adjuvante preferido é BLP. BLPs são veículos de entrega de vacinas autoadjuvantes, derivados de bactérias Lactococcus lactis inativadas. L. lactis é uma bactéria segura comumente utilizada na indústria de alimentos, como para a produção de queijos e bebidas probióticas. Os BLPs são produzidos por um tratamento simples com ácido quente, resultando em uma matriz em forma de célula robusta que consiste predominantemente em uma superfície de peptidoglicano. O dito peptidoglicano compreende preferencialmente o domínio de aglutinação do peptidoglicano do terminal C LysM da hidrolase AcmA da parede celular de Lactococcus lactis como descrito no documento WO 2010/033031. Esta superfície induz uma imunidade de longa duração necessária para proteção contra patógenos causadores de doenças. A natureza não viva das partículas BLP permite uma dosagem precisa sem risco de disseminação.
[0090] Os BLPs também fornecem uma estrutura principal segura e versátil que pode ser eficientemente carregada com antígenos específicos de escolha, por exemplo, uma ou mais partículas virais da invenção que compreende antígenos de células T e/ou antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana. O carregamento completo de BLPs com antígenos é obtido usando uma tecnologia de acoplamento não covalente, conforme descrito em WO2010/033031. Esta tecnologia permite a mistura simples da fusão do antígeno com os BLPs, resultando assim em uma aglutinação robusta e imediata do antígeno à superfície das partículas. Os BLPs cobertos com antígenos resultantes são preferencialmente fornecidos a um porco através das camadas da mucosa do nariz (pulverizador) ou da boca (cápsula), sem a necessidade de uma injeção.
[0091] A invenção fornece ainda um método para prevenir ou melhorar a infecção e/ou propagação do Vírus da Peste Suína Africana em porcos, que compreende a administração da molécula recombinante que compreende um cassete de expressão que codifica um poliepítopo que compreende antígenos de células T de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana, e/ou uma partícula viral que compreende a dita molécula recombinante, para pelo menos um porco. A dita administração da molécula recombinante e/ou a partícula viral é preferencialmente combinada com a administração de uma partícula viral que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionados a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana.
[0092] O dito método fornece proteção contra uma infecção subsequente com um Vírus da Peste Suína Africana de tipo selvagem virulento. A proteção é definida como sobrevivência e ausência de manifestações clínicas da doença, e uma redução da propagação subsequente do vírus selvagem por qualquer via de transmissão, incluindo propagação horizontal e vertical. O tempo para o início da proteção e a proteção de longa duração fazem parte da eficácia de uma vacina. Além disso, a ampla proteção contra diferentes espécies de vírus ou serotipos também faz parte da eficácia de uma vacina de acordo com a invenção.
[0093] A invenção fornece ainda uma partícula viral que compreende antígenos de células T, que compreende preferencialmente um cassete de expressão que codifica um poliepítopo que compreende antígenos de células T de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana, ou antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, ou um conjunto de vírus partículas compreendendo antígenos de células T e antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, para uso em um método de proteção de um porco de infecção subsequente com o Vírus da Peste Suína Africana.
[0094] A invenção fornece ainda um kit de partes que compreende partículas virais que compreende antígenos de células T, preferencialmente que compreende um cassete de expressão que codifica um poliepítopo que compreende antígenos de células T de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana e antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, para uso em um método de proteção de um porco da infecção subsequente com o Vírus da Peste Suína Africana.
[0095] Para fins de clareza e uma descrição concisa, as características são descritas neste documento como parte das mesmas ou separadas modalidades, no entanto, será apreciado que o escopo da invenção pode incluir modalidades com combinações de todas ou algumas das características descritas.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: VACINAÇÃO DE DNA COM BASE NA
EXPRESSÃO DE EPÍTOPOS DE CÉLULAS T DE VPSA MÉTODO
[0096] Com base nas sequências completas do genoma de isolados de PSA conhecidos e na sequência do genoma do porco, o programa de predição de epítopo NetMHCpan foi usado para fornecer uma lista de epítopos de células T que são independentes da cepa do vírus ou da raça do porco (consultar Tabela 1). Os dezenove epítopos de células T classificados no topo foram usados para gerar uma vacina de DNA sintético de poliepítopo. A sequência de DNA codificou 19 epítopos nonapeptídicos, separados por espaçadores de 3 a 5 aminoácidos que contêm sinais para clivagem do proteassoma e processamento posterior (consultar Figura 1A). O epítopo 14 não foi usado porque provavelmente interferiria no processamento correto. Também foi incluída uma assim chamada sequência de epítopo universal de células T PADRE para este propósito (consultar Figura 1B). A fim de aumentar a degradação proteassomal, a sequência de nucleotídeos da ubiquitina foi adicionada na extremidade 5’ do terminal do gene sintético. Isto leva a uma degradação mais eficiente pelo proteassoma e uma apresentação melhorada dos epítopos às células T hospedeiras. Finalmente, uma sequência adjuvante CpG foi adicionada ao 3’UTR do gene sintético. Uma versão otimizada de códons do gene sintético foi quimicamente sintetizada pela GenScript Corporation e clonada atrás do promotor CMV no plasmídeo pCVI (um derivado de pCI-neo [Promega] obtido por deleção de um fragmento de restrição ClaI) usando os locais de restrição NheI e NotI. O plasmídeo resultante foi denominado pCVI- ASFDVAC2.
[0097] Três grupos de 6 porcos cada foram usados para um estudo de desafio de vacinação. Os animais do grupo 1 foram vacinados três vezes com pCVI-ASFDVAC2. Os animais do grupo 2 também foram vacinados três vezes, mas simultaneamente à 3ª vacinação de DNA receberam também um reforço com uma mistura de nonapeptídeos sintéticos correspondentes aos epítopos de células T do gene sintético. Os animais do grupo de controle (grupo 3) foram vacinados três vezes com o plasmídeo vazio pCVI. Os porcos foram vacinados com intervalos de 2 semanas. A vacina foi aplicada intramuscular/intradérmica por imunoeletroporação usando um dispositivo cliniporator (IGEA Clinical Biophysics, Carpi, Itália). Os pulsos elétricos gerados pelo aparelho de eletroporação melhoram a absorção de DNA pelo tecido circundante. Os peptídeos foram aplicados por vacinação intramuscular. Duas semanas após a vacinação final, os porcos foram desafiados com a cepa VPSA Netherlands '86 (Wageningen Bioveterinary Research, Holanda; ver Terpstra e Wensvoort, 1986. Tijdschrift voor diergeneeskunde 111: 389 a 392). A cepa foi cultivada em macrófagos alveolares porcinos. Os porcos infectados foram acompanhados por mais de 2 semanas para sintomas clínicos. Os níveis de vírus no sangue foram determinados por meio de PCR. As respostas de anticorpos foram examinadas por ELISA usando o vírus inteiro como antígeno. Os níveis de células secretoras de IFN-y foram determinados por ELISPOT após estimulação in vitro com vírus ou o coquetel de vinte nonapeptídeos.
RESULTADOS
[0098] A infecção por desafio do grupo de controle não vacinado (grupo 3) resultou em 40% de sobrevivência. A vacinação resultou em cerca de 83% de sobrevivência nos grupos 1 e 2 (consultar Figura 2A). Os porcos do grupo 2 apresentaram pontuações clínicas totais significativamente mais baixas do que os porcos dos outros grupos (Figura 2B). Os porcos neste grupo também tiveram uma resposta significativa de células secretoras de IFN-y contra o coquetel de nonapeptídeos desde o dia 42 após a primeira vacinação (p.v.) (dia 0 do desafio [p.c.]) até o final do experimento (consultar Figura 2C). Os porcos do grupo 2 apresentaram uma resposta significativa das células secretoras de IFN-y contra o coquetel de nonapeptídeos a partir do dia 49 p.v. (dia 7 p.c.). Nenhuma resposta das células secretoras de IFN-y contra o coquetel de nonapeptídeos foi observada no grupo de controle. Todos os grupos mostraram uma resposta significativa de células secretoras de IFN-y contra o vírus no dia 56 p.v. (dia 14 p.c.). Não houve diferenças significativas nos níveis de DNA viral no sangue entre os grupos. Nenhuma diferença significativa foi observada nos níveis de porcentagem de bloqueio do ELISA de anticorpo PSA. EXEMPLO 2: VACINAÇÃO USANDO VETORES MVA
QUE EXPRESSAM EPÍTOPOS DE CÉLULAS T E B DE VPSA MÉTODO
[0099] Com base nos resultados promissores da vacina de DNA de poliepítopo, o gene ASFDVAC2 sintético foi fornecido com a sequência do promotor MVA 13,5 e inserido no gene TK do vetor de vacina MVA (varíola atenuada) por meio de recombinação BAC de acordo com procedimentos publicados (Cottingham, 2012. Methods Mol Biol 890: 37 a 57). O vírus resultante foi denominado MVA-VAC2. A inserção de MVA-VAC2 compreende, a partir da extremidade 5’, um flanco esquerdo de TK, o promotor MVA 13,5L, uma sequência Kozak, o gene ASFDVAC2 sintético, sequências de terminação de mH5 e o flanco direito de TK.
[0100] Além disso, a recombinação BAC foi usada para inserir os genes que codificam seis antígenos de células B de VPSA principais bem conhecidos (p30, p54, p72, EP402R, A104R e B602L) no vetor MVA usando tandem (p30 + B602L; p72 + A104R) ou cassetes de expressão de gene triplos (p54 + EP402R + K205R) (MVA-p30/B602L, MVA-p72/A104R e MVA-p54/EP402R/K205R, respectivamente. Para este fim, foram gerados construtos de DNA sintético (GenScript) e as regiões de codificação de proteínas foram fornecidas com diferentes promotores MVA e sequências de terminação da transcrição para conduzir a expressão destes genes. Ademais, a fim de permitir a detecção da expressão da proteína, cada uma das regiões de codificação da proteína foi fornecida com uma sequência de etiqueta FLAG do terminal C.
[0101] Três grupos de 10 porcos cada foram usados para um experimento de desafio de vacinação. Os animais do grupo 1 foram vacinados duas vezes por via intramuscular usando 10^8 TCID50 MVA- VAC2. Os animais do grupo 2 foram vacinados duas vezes com uma combinação de todos os 4 MVA recombinantes que expressam epítopos de células T e epítopos de células B (10^8 TCID50 cada). Os animais não vacinados do grupo 3 serviram como controles. Duas semanas após a segunda vacinação, os animais foram desafiados com a cepa VPSA Netherlands '86.
RESULTADOS
[0102] A infecção por desafio de animais não vacinados (grupo 3) resultou em 0% de sobrevivência (consultar Figura 3A). Notavelmente, 9 em cada 10 porcos que foram vacinados com a combinação de todos os 4 MVA recombinantes (grupo 2) sobreviveram e mostraram apenas morbidade leve por apenas alguns dias. Nos animais do grupo 1, que foram vacinados apenas com MVA-VAC2, 4 porcos sobreviveram. Os animais deste grupo apresentaram mais morbidade e por um período de tempo mais longo, quando comparados aos animais do grupo 2 (consultar Figura 3B). Estes resultados correspondem bem com a imunidade mediada por células (CMI) medida com a resposta das células secretoras de IFN-y contra o coquetel de epítopos nonapeptídeos de células T ou antígeno de VPSA completo (Figura 3C).
CONCLUSÃO
[0103] Neste estudo, resultados promissores para o desenvolvimento de uma vacina de VPSA foram obtidos usando uma vacina de combinação consistindo em vírus vetor MVA que expressam células T de VPSA, bem como epítopos de células B. A vacina combinada forneceu proteção contra mortalidade e doença clínica após o desafio.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Molécula de ácido nucleico recombinante, preferencialmente molécula de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende um cassete de expressão que codifica um poliepítopo que compreende antígenos de células T a partir de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana, em que os antígenos de células T são separados por espaçadores, preferencialmente por espaçadores de 1 a 10 resíduos de aminoácidos, que contêm sinais para a clivagem do proteassoma.
2. Molécula recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o poliepítopo codificado compreende 2 a 50 peptídeos como antígenos de células T.
3. Molécula recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o poliepítopo codificado compreende 2 a 50 nonapeptídeos como antígenos de células T, preferencialmente 1 a 13 e 15 a 20 nonapeptídeos como representado na Tabela 1, que são separados por espaçadores de cerca de 1 a 5 resíduos de aminoácidos, preferencialmente 1 a 11 sequências espaçadoras como representado na Tabela 2.
4. Molécula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que codifica ainda um epítopo universal de células T.
5. Molécula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma sequência de nucleotídeos para ubiquitina, preferencialmente na extremidade 5’ do terminal do poliepítopo, em que a dita molécula recombinante preferencialmente compreende a sequência de nucleotídeos representada na Figura 1B.
6. Partícula viral caracterizada pelo fato de que compreende a molécula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7. Partícula viral, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma proteína marcadora.
8. Método para estimular uma resposta imune em um porco caracterizado pelo fato de que compreende a administração da molécula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e/ou da partícula viral, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em combinação com uma partícula viral que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionado a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana, para o porco em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a molécula recombinante e/ou a partícula viral é administrada por via parenteral.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a molécula recombinante e/ou a partícula viral é administrada 2 a 4 vezes, preferencialmente com intervalos de cerca de 2 semanas, e pelo menos uma das administrações da molécula recombinante e/ou da partícula viral é combinada com a administração de uma partícula viral que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionados a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das administrações da molécula recombinante e/ou da partícula viral é combinada com a administração de antígenos sintéticos de células T a partir de proteínas do Vírus da Peste Suína Africana.
12. Método para prevenir ou melhorar a infecção e/ou propagação do Vírus da Peste Suína Africana em porcos caracterizado pelo fato de que compreende a administração da molécula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e/ou da partícula viral, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, a pelo menos um porco, em que a dita administração da molécula recombinante e/ou da partícula viral é combinada com a administração de uma partícula viral que compreende antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionados a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana.
13. Conjunto de partículas virais caracterizado pelo fato de que compreende uma partícula viral que compreende a molécula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e uma ou mais partículas virais que compreendem antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionados a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana.
14. Kit de partes caracterizado pelo fato de que compreende uma partícula viral, que compreende a molécula recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e uma ou mais partículas virais que compreendem antígenos de células B do Vírus da Peste Suína Africana, preferencialmente selecionados a partir de proteínas p30, p54, p72, EP402R, A104R e/ou B602L do Vírus da Peste Suína Africana.
15. Conjunto de partículas virais, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método de proteção de um porco da infecção subsequente com o Vírus da Peste Suína Africana.
16. Kit de partes, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método de proteção de um porco da infecção subsequente com o Vírus da Peste Suína Africana.
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