CN115806600B

CN115806600B - 一种鸡滑液囊支原体蛋白GrpE及其制备方法、作为亚单位疫苗的应用

Info

Publication number: CN115806600B
Application number: CN202211216482.5A
Authority: CN
Inventors: 石火英; 张桂华; 韩乐嘉宝; 李�权
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2024-04-05
Anticipated expiration: 2042-09-30
Also published as: CN115806600A

Abstract

本发明公开了一种鸡滑液囊支原体蛋白GrpE及其制备方法、作为亚单位疫苗的应用。所述鸡滑液囊支原体蛋白GrpE具有如NO:1所示的氨基酸序列。利用原核表达方法制备得到该重组蛋白，包括，基因根据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，重组表达载体pET28a‑GrpE的构建和重组蛋白原核表达；利用Western blot检测鸡滑液囊支原体蛋白GrpE，以及使用动物实验评估其免疫保护力。结果发现鸡滑液囊支原体蛋白GrpE可以显著减轻鸡滑液囊支原体引起的临床症状和细菌定植。本发明筛选到的对鸡滑液囊支原体具有免疫保护作用的GrpE蛋白，具有作为研制鸡滑液囊支原体亚单位疫苗的潜力。

Description

一种鸡滑液囊支原体蛋白GrpE及其制备方法、作为亚单位疫苗的应用

技术领域

本发明涉及一种鸡滑液囊支原体蛋白GrpE及其制备方法、作为亚单位疫苗的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae, MS）是一种主要的禽类病原体，可在家禽中引起一系列急性或慢性疾病，如滑膜炎和气囊炎，以及生长迟缓。已被世界动物卫生组织（OIE）列为必须上报的疾病，虽然它不会直接导致家禽死亡，但可能与其他禽类病原体混合感染从而引起更严重的疾病和严重的经济损失。

目前控制鸡滑液囊支原体的策略主要包括净化病原体、使用抗生素和疫苗免疫。针对日益严重的鸡滑液囊支原体感染问题，传统的抗生素和化学药剂已难以满足生产的需要，减毒活疫苗和灭活疫苗也存在缺陷。设计开发新型疫苗如亚单位疫苗是目前研究的热点。目前还没有商品化的鸡滑液囊支原体亚单位疫苗。

GrpE是DnaK（HSP70）的核苷酸交换因子和辅助因子，在热休克和缺氧等压力下，在解脲酶的存活中起重要作用。热休克蛋白（HSP）是在正常和应激条件下执行基本细胞功能的分子伴侣，可以成为宿主免疫系统的目标。其中HSP70被哺乳动物的先天性和适应性免疫反应识别为抗原，并显示出有效的佐剂活性。GrpE与DnaK在相等的水平上表达，并在蛋白质合成，折叠，运输和降解中起作用。目前还没有关于鸡滑液囊支原体GrpE蛋白的报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中所存在问题，提供一种鸡滑液囊支原体蛋白GrpE及其制备方法、作为亚单位疫苗的应用，提供的具有免疫保护作用的鸡滑液囊支原体GrpE蛋白，利用原核表达系统对其表达纯化，体内试验证明鸡滑液囊支原体GrpE蛋白具有很好的免疫原性和免疫保护作用，是鸡滑液囊支原体亚单位疫苗的候选。本发明为鸡滑液囊支原体疫苗平台提供了一种有前景的策略，具有较大的市场应用潜力和潜在的经济效益。

本发明的目的是这样实现的：一种具有免疫保护作用的鸡滑液囊支原体蛋白GrpE，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述鸡滑液囊支原体蛋白grpE基因如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其长度为891bp，其突变后的序列如SEQ ID NO.2所示。

一种鸡滑液囊支原体蛋白GrpE的制备方法，使用的原核表达的方法制备，使用的原核表达载体为pET28a。表达蛋白的工程菌为BL21（Rosetta），用于原核表达GrpE蛋白的菌株命名为BL21（pET28a-GrpE）。原核表达时使用诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），诱导培养时间为4h，诱导剂使用终浓度为0.5 mmol/L。

诱导4h后通过8000 rpm/min 转速离心10min收集BL21（pET28a-GrpE）菌体，使用PBS（KCl 0 .2g，NaCl 8g，Na₂HPO₄ 1 .44g，KH₂PO₄ 0 .24g，1000mL ddH₂O，pH 7.6）重悬菌体。

使用超声破碎仪破碎PBS重悬的菌体，在4℃条件下9000 rpm/min转速离心10min收集上清，命名为纯化前样品，将沉淀用与上清同体积的PBS重悬备用，命名为沉淀样品。

具体步骤如下：

（1）向亲和层析柱中加入5mL Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料(购自金斯瑞公司)；

（2）向亲和层析柱中加入12mL ddH₂O洗涤；

（3）将纯化前样品经0.45 μm孔径滤器过滤后加入亲和层析柱，收集流穿液；

（4）加入平衡缓冲液(60 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)平衡柱子；

（5）加入50mL洗涤缓冲液(60 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole, pH8.0)洗去杂蛋白，收集洗杂液；

（6）加入12mL 洗脱缓冲液(60 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 500 mM imidazole,pH 8.0)洗脱目的蛋白，分管收集洗脱液，共收集6管；

（7）将纯化前样品、流穿液、洗杂液、洗脱液各取20 μL分别加入5μL上样缓冲液煮沸10min；

（8）配置12％SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将步骤（7）中处理好的四种样品分别加入孔中进行电泳电泳完成后，取下凝胶经考马斯亮蓝染色过夜后脱色，鉴定GrpE是否已经存在于洗脱液中；

（9）将含有目的蛋白的洗脱液通过10 kDa超滤管进行透析与浓缩，将缓冲液置换为PBS，获得溶解于PBS中的GrpE蛋白悬液。

使用Western blot 鉴定GrpE蛋白表达的正确性。

一种鸡滑液囊支原体蛋白GrpE作为亚单位疫苗的应用，所述蛋白GrpE亚单位疫苗使用佐剂MontanideTM ISA 206 VG等体积乳化。

所述蛋白GrpE亚单位疫苗每只鸡蛋白用量为100 μg，并通过腿部肌肉注射途径免疫。

本发明方法先进科学，通过本发明，公开了一种具有免疫保护作用的鸡滑液囊支原体蛋白GrpE。所述鸡滑液囊支原体蛋白GrpE具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。利用原核表达方法制备得到该重组蛋白，基因根据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，重组表达载体pET28a-GrpE的构建和重组蛋白原核表达；利用Western blot检测鸡滑液囊支原体蛋白GrpE，以及使用动物实验评估其免疫保护力。结果发现鸡滑液囊支原体蛋白GrpE可以显著减轻鸡滑液囊支原体引起的临床症状和细菌定植。本发明筛选到的对鸡滑液囊支原体具有免疫保护作用的GrpE蛋白，具有作为研制鸡滑液囊支原体亚单位疫苗的潜力。

附图说明

图1为BL21(pET28a-GrpE)的菌液PCR鉴定。

图2为GrpE蛋白表达SDS-PAGE鉴定。

图 3为GrpE蛋白纯化SDS-PAGE鉴定；

其中，泳道1：纯化前样品；泳道2：纯化流穿液样品泳道3：纯化洗涤液样品；泳道4-10：纯化洗脱液样品。

图 4为GrpE蛋白Western blot鉴定。

图5为滑液囊支原体攻毒后对动物生长性能监测。

图6为滑液囊支原体攻毒后引起临床症状观察（* p < 0.05）。

图7为鸡咽喉中鸡滑液囊支原体拷贝数的检测（*** p < 0.001）。

图8为鸡咽喉中活细菌载量的检测（** 0.05 < p < 0.01）。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。

实施例1：鸡滑液囊支原体grpE基因克隆与原核表达；

对grpE基因进行大肠杆菌码子优化序列，并将一处终止密码子TGA替换为TGG，序列见SEQ ID NO.2，将优化后的基因使用同源重组方法插入表达载体pET28a形成重组表达质粒pET28a-GrpE。随后将质粒转化至工程菌大肠杆菌BL21中，挑取克隆株，通过PCR和测序鉴定，鉴定正确克隆株为阳性克隆株，命名为BL21(pET28a-GrpE)。PCR结果如图1所示，pET28a通用T7引物（F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3', R: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'）扩增出符合预期大小的片段，约1200bp，证实成功获得BL21(pET28a-GrpE)菌株。

鉴定GrpE蛋白是否表达，步骤如下：

（1）将所得的重组大肠杆菌BL21(pET28a-GrpE)和BL21(pET28a)在100 mL LB液体培养基中培养至OD₆₀₀为0.7时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM，在37℃摇床上诱导表达4小时。

（2）菌液通过8000 rpm/min转速离心10min收集BL21（pET28a-GrpE）菌体，使用16mL PBS (配方：KCl 0 .2g，NaCl 8g，Na₂HPO₄ 1 .44g，KH₂PO₄ 0 .24g，1000mL蒸馏水，pH7.6)重悬菌体。

（3）使用超声破碎仪破碎菌体后，在4℃条件下9000 rpm/min转速离心10min收集上清，将沉淀用16 mL PBS重悬备用。

（4）将步骤（3）中获得的上清和沉淀重悬液取各20 μL分别加入5μL上样缓冲液(1MTris-HCl(pH6 .8)1mL，200mM DDT 0 .31g，4％SDS 0 .4g，0 .2％溴酚蓝0 .02g，20％甘油2mL，7mL超纯水)混匀，在100℃沸水中煮沸10min。用12％SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否表达。结果如图2所示，在约37 kDa处，在上清和沉淀中均出现目的条带，而BL21(pET28a)泳道没有此条带。

实施例2：鸡滑液囊支原体GrpE蛋白纯化；

使用High-Affinity Ni-NTA Resin进一步对实施例1中破碎后的获得的上清样品进行纯化，具体方法如下：

（2）向亲和层析柱中加入12mL ddH₂O洗涤；

（3）将实施例1中破碎后的获得的上清样品经0.45 μm孔径滤器过滤后加入亲和层析柱，收集流穿液；

（5）加入50mL 洗涤缓冲液(60 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole, pH8.0)洗去杂蛋白，收集洗杂液；

（8）配置12％SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将步骤（7）中处理好的四种样品加入孔中进行电泳电泳完成后，取下凝胶经考马斯亮蓝染色过夜后脱色，鉴定GrpE是否已经存在于洗脱液中。结果显示洗脱液中存在纯度较高的GrpE蛋白，大小为37kDa (图3)；

实施例3：鸡滑液囊支原体GrpE蛋白鉴定；

将实施例2中获得的纯化蛋白进一步通过Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白溶解于样品缓冲液中，并进行电泳。使用微型透析器（Bio-Rad）将蛋白质电转移到硝化纤维素膜上。将膜在4℃的封闭缓冲液中培养过夜，用PBST洗涤后，以His-Tag为一抗、HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，其中一抗稀释度为1:5000，二抗稀释度为1:5000，使用增强化学发光（ECL）底物检测信号，进一步验证了鸡滑液囊支原体蛋白GrpE表达正确（图4）。

实施例4：鸡滑液囊支原体GrpE蛋白亚单位疫苗免疫保护效力测定；

将18只1日龄SPF鸡随机分成三组，即鸡滑液囊支原体GrpE蛋白免疫组，PBS免疫对照组和空白对照组，每组6只。鸡滑液囊支原体GrpE蛋白免疫组，每鸡腿部肌肉注射100 μg鸡滑液囊支原体GrpE蛋白 (蛋白与佐剂MontanideTM ISA 206 VG等体积乳化)，2周后和3周后分别使用上述方法加强免疫；同时，PBS免疫组，每只SPF鸡注射等体积PBS(MontanideTM ISA 206 VG等体积乳化)。最后一次免疫后一周对GrpE蛋白免疫组和PBS免疫对照组进行鸡滑液囊支原体感染，攻毒剂量为9×10⁷CCU/只，采用气管注射和爪垫注射方式。空白对照组不做任何处理。

攻毒后每四天进行一次体重测定，如图5所示，GrpE蛋白组与空白对照组平均体重从攻毒后7 d开始高于PBS免疫攻毒组，虽然差异不显著，但说明GrpE蛋白免疫可以减轻鸡滑液囊支原体感染所引起的生长迟缓。攻毒后21d鸡进行安乐死，解剖后观察鸡气囊病变，并根据病变进行评分，评分标准为：气囊完好0分；气囊轻度混浊1分；气囊增厚，小干酪样渗出物聚集2分；气囊明显增厚，透明度下降，单一气囊有大量干酪样渗出物聚集3分；气囊明显增厚，透明度下降，2个或以上气囊有大量干酪样渗出物聚集4分。结果如图6所示，GrpE蛋白免疫攻毒组与空白对照气囊完好，PBS免疫攻毒组气囊明显增厚有干酪样渗出物聚集。通过综合评分，GrpE蛋白免疫攻毒组气囊病变评分显著低于PBS免疫攻毒组。结果说明GrpE蛋白免疫可以减轻鸡滑液囊支原体感染引起的气囊炎症反应。

为了评估鸡免疫后攻毒菌在鸡气管中的载量，分别在攻毒后第11 d和第21 d采集咽喉棉拭子于含青霉素的无菌PBS中，通过绝对荧光定量PCR进行支原体载量检测。使用引物如下：P1, 5’-ATTGCTTGTGCTAGCGTTTATCC-3’; P2, 5’- ATTTGGTGGCGCTAAATTAACC-3’。设定定阴性对照并用阳性质粒模板pT-MS 10倍倍比稀释作为模板，绘制标准曲线，根据样品Ct值和标准曲线计算出相应的拷贝数。根据样品Ct值和标准曲线计算对应DNA拷贝数，结果如图7所示，在感染鸡滑液囊支原体第11 d和21 d 时GrpE蛋白免疫组的鸡气管中的细菌极显著低于PBS组。表明GrpE蛋白免疫可以降低气管中鸡滑液囊支原体的载量。

为了进一步评估鸡免疫后攻毒菌在鸡气管中的活菌定植能力，在攻毒后第21d采集咽喉棉拭子于800 μL含青霉素的无菌PBS中，4℃静置24h后涡旋震荡，0.45 μM过滤器过滤至鸡滑液囊支原体培养基中并进行10倍倍比稀释进行支原体培养。结果如图8所示，与PBS组相比，在21 d时GrpE蛋白免疫组的鸡气管中鸡滑液囊支原体的滴度显著降低。表明GrpE蛋白免疫具有可以降低气管中鸡滑液囊支原体定植。

SEQ ID NO.1

ATGAAAGAAAACATTCTTAAAAGACATAAATTTAACCTAAAAAATGGTGATGTTGTAACTTCATCTTTAAAATGTTATGCAAGTGATAATCTCTTAGAAAAATATTCAAAAGATATAAAACTAGAAATTGGAAAAGATGAATTTTTAAAAGGCTTTGACAATTTATTAATTAACCATTTAAAAAAATTTGGCTTAAAAAAAGATTTCTACATTTTAGTTAAGCCTAATGGCGCTAATTTAGAAGATGATAGCTTGCAAAATCAAAGCTTAAAATTTGAATTTAGTAACTTCAAAGTTGAATCTAAAGATAAGCAGCCTGAAGAAGCTAAAAAAACTTGTAAAAACGAAGAAAAGCTTAAAGAATTAACTGAAAAAATTGCAAAGCTAGAACAAAACTTAGCCATGGAGCAATACAAAAATATAACCGAGCAAATGACTTTTAAAAATAAAGTCAAAGAACTAGAAGCTTCGCTAAGTGAAAAACTTCAAAGCGCATTAGAAGAAAAAACTAAGCATTTAGAATCTCAATTTGAAGATAGCAAAAAATTTGTGCTTCAAAAATTCTTAAATGCTTTAATGGATCCATTTAATAATTTTGTAATGGCAACTAATGCCGGTAAAAATTCAGATAATGAAATTGTTAAAAATTACTGCTATGGATTTGATATTGTTAAAAAACAATTCATCGACGCTTTAGAGAGAAATTCAGCAAATATAATTGATCCTGAATTAAATTCAAAATTTGATGCAAATTGGATGCAAATAATTGATACTCAAGAAGATGCATCAAAAGAAGACGAAACAATTTTAAGAGTGGCTAGGCTAGGAATAAGCCTAAATAACAGGCTTATAACTCCAGCGCAAGTAGTTGTTGTTAAGAATAAAAAATAA

SEQ ID NO.2

ATGAAGGAAAATATTCTGAAGCGCCATAAATTTAACCTGAAAAATGGCGATGTGGTTACCAGTAGTCTGAAATGCTATGCCAGTGATAATCTGCTGGAAAAATATAGCAAAGATATCAAACTGGAGATCGGTAAAGATGAATTTCTGAAAGGCTTTGATAACCTGCTGATTAATCATCTGAAAAAATTCGGTCTGAAGAAAGATTTTTATATTCTGGTTAAGCCGAACGGCGCAAATCTGGAAGATGATAGTCTGCAGAATCAGAGCCTGAAATTTGAATTTAGTAACTTTAAGGTGGAGAGTAAAGATAAGCAACCGGAAGAAGCCAAAAAAACCTGTAAAAATGAAGAAAAGCTGAAGGAACTGACCGAAAAAATTGCAAAACTGGAGCAAAATCTGGCCATGGAGCAATATAAAAATATTACCGAGCAAATGACCTTCAAAAATAAAGTGAAAGAGCTGGAAGCCAGCCTGAGCGAAAAACTGCAGAGCGCCCTGGAAGAAAAAACCAAGCATCTGGAAAGCCAGTTTGAAGATAGTAAAAAATTCGTTCTGCAGAAATTCCTGAATGCACTGATGGACCCTTTTAATAATTTTGTGATGGCAACCAATGCAGGCAAAAATAGCGATAATGAAATTGTTAAGAACTACTGTTACGGTTTTGATATTGTTAAGAAGCAGTTTATCGACGCACTGGAACGCAATAGTGCAAATATTATTGATCCGGAACTGAATAGCAAATTTGATGCAAATTGGATGCAGATTATCGATACCCAGGAAGATGCAAGCAAAGAAGATGAAACCATTCTGCGCGTTGCCCGCCTGGGCATTAGCCTGAATAATCGTCTGATTACCCCGGCCCAAGTGGTTGTGGTTAAAAATAAAAAATAA

SEQ ID NO.3

MKENILKRHKFNLKNGDVVTSSLKCYASDNLLEKYSKDIKLEIGKDEFLKGFDNLLINHLKKFGLKKDFYILVKPNGANLEDDSLQNQSLKFEFSNFKVESKDKQPEEAKKTCKNEEKLKELTEKIAKLEQNLAMEQYKNITEQMTFKNKVKELEASLSEKLQSALEEKTKHLESQFEDSKKFVLQKFLNALMDPFNNFVMATNAGKNSDNEIVKNYCYGFDIVKKQFIDALERNSANIIDPELNSKFDANWMQIIDTQEDASKEDETILRVARLGISLNNRLITPAQVVVVKNKK

Claims

1.一种具有免疫保护作用的鸡滑液囊支原体蛋白GrpE作为亚单位疫苗的应用，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；具有免疫保护作用的鸡滑液囊支原体蛋白GrpE制备使用的是原核表达的方法制备，使用的原核表达载体为pET28a；表达蛋白的工程菌为BL21（Rosetta）；

应用时，所述蛋白GrpE亚单位疫苗使用佐剂MontanideTM ISA 206 VG等体积乳化。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，原核表达时使用诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），诱导培养时间为4h，诱导剂使用终浓度为0.5 mmol/L。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，诱导4h后通过8000 rpm/min 转速离心10min收集菌体，使用PBS重悬菌体，其中，PBS包括KCl 0 .2g、NaCl 8g、Na₂HPO₄1 .44g、KH₂PO₄ 0 .24g、1000mL ddH₂O，PBS的pH为 7.6。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，使用超声破碎仪破碎PBS重悬的菌体，在4℃条件下9000 rpm/min转速离心10min收集上清，命名为纯化前样品，将沉淀用与上清同体积的PBS重悬备用，命名为沉淀样品。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具有免疫保护作用的鸡滑液囊支原体蛋白GrpE制备，具体步骤如下：

（1）向亲和层析柱中加入5mL Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料；

（2）向亲和层析柱中加入12mL ddH₂O洗涤；

（4）加入平衡缓冲液平衡柱子；其中，平衡缓冲液含有60 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、10mM imidazole，pH 为8.0；

（5）加入50mL洗涤缓冲液洗去杂蛋白，收集洗杂液；其中，洗涤缓冲液60 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、50 mM imidazole，pH为 8.0；

（6）加入12mL 洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，分管收集洗脱液，共收集6管；其中，洗脱缓冲液为60 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、500 mM imidazole，pH为 8.0；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料购自金斯瑞公司；

使用Western blot 鉴定GrpE蛋白表达的正确性。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白GrpE亚单位疫苗每只鸡蛋白用量为100 μg，并通过腿部肌肉注射途径免疫。