CN107586334B - 一种治疗流感嗜血杆菌感染的血清的制备方法及该血清的应用 - Google Patents
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Abstract
一种治疗流感嗜血杆菌感染的血清的制备方法及该血清的应用，属于生物技术领域。该方法包括：抗原表位融合片段的构建；串联表位融合片段的构建；串联式目的表位基因原核表达；目的重组融合蛋白水解和提纯；多抗原MAP交联肽制备；免疫获得血清。本发明将抗原优势表位融合后并串联后的重组表达蛋白与高分子核心基质交联形成MAP‑rHap‑C4‑GGGS‑Hap‑C150。不仅能保证抗原的免疫原性及其免疫机体后产生抗体的杀菌能力且能提高抗原制备效率，为大量抗体制备提供足够的抗原。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种治疗流感嗜血杆菌感染的血清的制备方法及该血清的应用。
背景技术
流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae，Hi）为寄生于人鼻咽部及上呼吸道的革兰阴性小杆菌，呼吸道为主要入侵门户，可引起全身多部位的感染。局部感染可引起中耳炎、鼻窦炎、会厌炎和皮肤软组织感染等。全身感染可导致肺炎、脑膜炎、心内膜炎、骨髓炎、化脓性骨关节炎、泌尿生殖道感染等。是婴幼儿脑膜炎、肺炎和急性中耳炎等感染性疾病的主要病原体。流感嗜血杆菌可分为荚膜型和无荚膜型，前者可用荚膜抗体分为6个血清型，分别命名为Hia、Hib、Hic、Hid、Hie、Hif；无荚膜型无法用荚膜多糖抗体分型，故称无荚膜型Hi又称为不可分型流感嗜血杆菌（nontypeable H. influenzae，NTHi）。
阻止Hi黏附定植，减少细菌微菌落的形成是防治流感嗜血杆菌感染的关键，已有的研究显示Hap蛋白不仅是位于流感嗜血杆菌外膜的黏附因子，NTHi和THi均有表达，同时还可诱导机体产生具有免疫保护作用的黏膜S-IgA和血清IgG，能阻止NTHi在呼吸道的黏附定植, 减少细菌微菌落的形成，因此Hap 蛋白诱导机体产生的IgG很有希望成为治疗流感嗜血杆菌感染的抑菌或杀菌制剂的成份。有研究利用小鼠 NTHi急性肺部感染模型, 发现重组 Hap蛋白免疫抗 NHTi感染的免疫保护效果。
然而研究发现在流感嗜血杆菌生长过程中，Hap 表达量达到一定程度后，就会启动自体解离，最终导致细菌的分散和在呼吸道内的传播，因此普通的细菌培养不足以获得足够的Hap蛋白，要获得大量Hap蛋白作为抗原制备抗体需进行生物学改造。
另外，分析Genbank公布的Hi菌株hap基因核苷酸序列发现，5’端156 bp和3’端855bp核苷酸及对应的氨基酸序列较为保守，中间区核苷酸和氨基酸序列长短不一且变异较大，因此用hap基因全长表达蛋白缺少良好的同源性。hap基因产物Hap均为膜表面蛋白抗原，蛋白抗原表位（epitope）是抗原分子中决定免疫原性短肽片段，将同源性高的抗原优势表位融合并串联后用基因工程方法进行表达，多抗原肽(multiple antigenic peptide，MAP)是抗原表位与高分子核心基质多聚天冬氨酸-赖氨酸(Poly-Asp-Lys)交联而成的新型复合物，因其能提呈多种表位、提呈作用强、各表位肽之间形成构象表位而提高免疫效果、个别氨基酸突变不影响免疫应答等优点，已成为近年基因工程疫苗研制的新领域。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于涉及提供一种治疗流感嗜血杆菌感染的血清的制备方法及该血清的应用的技术方案。
所述的一种治疗流感嗜血杆菌感染的血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）以流感嗜血杆菌基因组DNA为模板，采用连接引物 PCR 分别扩增带柔性肽结构的hap-C4和hap-C150片段构建流感嗜血杆菌黏附Hap蛋白优势表位融合基因hap-C4-GGGS-hap-C150；
2）以pUCm-T-hap-C4-GGGS-hap-C150为模板，采用引物携带EK序列互补构建hap-C4-GGGS-hap-C150-EK串联表位融合片段；以pUCm-T-8[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK]为模板，扩增获得NdeI-8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]-XhoI片段；
3）以NdeI-8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]-XhoI构建原核表达系统EcoliBL21DE3pET42a-8×[Hap-C4-GGGS- Hap-C150-EK]，原核表达系统Ecoli BL21DE3pET42a -8×[Hap-C4-GGGS- Hap-C150-EK]诱导表达重组融合蛋白8×[rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]，重组融合蛋白8×[rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]水解提纯得到rHap-C4-GGGS-Hap-C150融合表位肽；
4）用碳二亚胺法将rHap-C4-GGGS-Hap-C150与Poly-Asp-Lys载体大分子交联，制备出多抗原MAP交联肽MAP- rHap-C4-GGGS-Hap-C150；
5）多抗原MAP交联肽MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150免疫小鼠，获得治疗流感嗜血杆菌感染的血清。
所述的一种治疗流感嗜血杆菌感染的血清的制备方法，其特征在于所述的步骤1）具体为：
a以流感嗜血杆菌基因组DNA为模板，采用连接引物hap-C4-1和hap-C150-1 PCR分别扩增带柔性肽结构的hap-C4和hap-C150片段；连接引物hap-C4-1包括hap-C4-1F和hap-C4-R，所述的hap-C4-1F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的hap-C4-1R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，连接引物hap-C150-1包括hap-C150-1F和hap-C150-1R，所述的hap-C150-1F核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述的hap-C150-1R核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示；
b回收步骤a得到的目的扩增产物，将回收的带柔性肽结构的hap-C4和hap-C150扩增片段等摩尔混合，再进行PCR扩增；
c利用hap-C4下游和hap-C150上游引物中互补的柔性肽序列形成复合模板，加入引物 hap-C4-1F和hap-C150-1R进行PCR扩增，得到hap-C4-GGGS-hap-C150。
所述的一种治疗流感嗜血杆菌感染的血清的制备方法，其特征在于所述的步骤a中PCR反应体系为：PCR总体积100 µL，内含2.5 mol/L各dNTP、250 nmol/L各引物、2.5 UEX-Taq酶、100 ng 各DNA模板和1×PCR缓冲液pH8.3，PCR参数：94ºC 5 min，94ºC 30 S、52ºC 30 S、72ºC 30 S，30个循环，72ºC 5 min；步骤b中PCR反应体系为：PCR总体积100 µL，内含2.5 mol/L各dNTP、2.5 U EX-Taq酶、100 ng 各DNA模板和1×PCR缓冲液pH8.3，PCR参数：94ºC 5 min，94ºC 30 S、52ºC 30 S、72ºC 60 S，10个循环，72ºC 7min；步骤c中加入 hap-C4-1F和hap-C150-1R各250 nmol/L，PCR 参数：94ºC 5 min，94ºC 30 S、52ºC 30 S、72ºC60 S，30个循环，72ºC 7min。
所述的一种治疗流感嗜血杆菌感染的血清的制备方法，其特征在于所述的步骤2）具体为：
a以100ng pUCm-T-hap-C4-GGGS-hap-C150为模板、hap-C4-2F和Hap-C150-2R为引物，扩增5’-端携带肠激酶酶切位点DDDDK编码序列及3’-端携带EK互补序列的hap-C4-GGGS-hap-C150-EK片段，反应体系94℃5 min后94℃30 S、45℃30 S、72℃120 S循环10次，利用hap-C4-2F和Hap-C150-2R引物中EK互补序列形成hap-C4-GGGS-hap-C150-EK串联表位融合片段，1.5%琼脂糖凝胶电泳后用PCR产物回收试剂盒回收目的扩增片段8×[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK],所述的引物 hap-C4-2F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述的引物Hap-C150-2R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
b采用T-A克隆试剂盒将上述目的基因扩增片段克隆至pUCm-T载体中, 转化入E. coli DH5α并用LB 培养基扩增, 构建重组质粒 pUCm-T-8[hap-C4-GGGS- hap-C150-EK]；
c采用含核酸内切酶Nde I位点的hap-C4-3F以及含核酸内切酶XhoI位点的hap-C150-3R引物，以pUCm-T-8[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK]为模板，扩增获得NdeI-8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK] -XhoI片段，所述的引物hap-C150-3R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
所述的一种治疗流感嗜血杆菌感染的血清的制备方法，其特征在于所述的步骤4）具体为：将Poly-Asp-Lys和rHap-C4-GGGS-Hap-C150按1：20的比例分别溶于0.01mol／L PBS中，每毫克蛋白加入3 mg水溶性二环己基碳二亚胺室温250 r／min搅拌16 h进行交联；反应产物中加入终浓度为11 %的NaCl，4℃中边搅拌边缓慢加入-20℃预冷的无水乙醇，直至出现蛋白沉淀；10 000 r／min 4℃离心15 min，取沉淀溶于PBS中，按上法再次用NaCl-乙醇沉淀，4℃离心后收集交联后MAP产物并将其命名为MAP-rHap-C4-GGGS- Hap-C150。
所述的血清在制备治疗流感嗜血杆菌感染药物中的应用。
本发明将抗原优势表位融合后并串联后的重组表达蛋白与高分子核心基质交联形成MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150。不仅能保证抗原的免疫原性及其免疫机体后产生抗体的杀菌能力且能提高抗原制备效率，为大量抗体制备提供足够的抗原。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例
材料与方法
菌株、血清和主要试剂来源
不可分型流感嗜血杆菌标准菌株ATCC49247（NTHi）、荚膜型流感嗜血杆菌标准菌株ATCC9327（Hia）、ATCC 9334（Hib）、ATCC 9007（Hic）、ATCC 9332（Hid）、ATCC 8142（Hie）和ATCC 9833（Hif）由浙江大学医学院病原生物学系提供。清洁级青紫兰品系家兔，3～4 周龄，清洁级BALB／c小鼠小鼠，雌性，6～8 周龄，体重 （18±1）g均由杭州医学院动物实验中心提供。本研究符合杭州医学院实验动物伦理委员会所制定的伦理学标准。各Hi菌株用哥伦比亚血琼脂平板（bioMérieux）37ºC传代培养。
抗原表位融合片段的构建和克隆
采用细菌基因组DNA提取试剂盒（Axygen）提取ATCC49247株基因组DNA，紫外分光光度法测定其浓度和纯度。以流感嗜血杆菌基因组DNA模板，采用连接引物 PCR 分别扩增带柔性肽结构的hap-C4和hap-C150片段，上下游引物见表1 中hap-C4-1和hap-C150-1，接引物hap-C4-1包括hap-C4-1F和hap-C4-R，所述的hap-C4-1F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的hap-C4-1R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，连接引物hap-C150-1包括hap-C150-1F和hap-C150-1R，所述的hap-C150-1F核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述的hap-C150-1R核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。PCR总体积100 µL，内含2.5 mol/L各dNTP、250nmol/L各引物、2.5 U EX-Taq酶、100 ng 各DNA模板和1×PCR缓冲液pH8.3。PCR参数：94ºC5 min；94ºC 30 S、52ºC 30 S、72ºC 30 S，30个循环；72ºC 5 min。小量 DNA3S 柱快速离心纯化试剂盒（BioColor）回收目的扩增产物, 分光光度法测定其 DNA 浓度。将回收的带柔性肽结构的hap-C4和hap-C150扩增片段等摩尔混合（DNA 总量<500 ng）, 除不加引物外，其余反应成分及含量与上述 PCR 相同，反应参数：94ºC 5 min；94ºC 30 S、52ºC 30 S、72ºC 60 S，10个循环；72ºC 7min。利用hap-C4下游和hap-C150上游引物中互补的柔性肽序列形成复合模板，然后加入 hap-C4-1F和hap-C150-1R各250 nmol/L，PCR 参数：94ºC 5 min；94ºC 30 S、52ºC 30 S、72ºC 60 S，30个循环；72ºC 7min；采用溴乙锭预染的2.5%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，目的扩增片段预期大小为156bp（hap-C4 72bp+GGGS 12bp+ hap-C150 72bp）。采用T-A克隆试剂盒(BioColor)将上述目的基因扩增片段克隆至pUCm-T载体中, 转化入E. coli DH5α并用LB 培养基扩增, 小量碱变性法提取重组质粒, 委托Invitrogen 公司测定重组质粒 pUCm-T-hap-C4-GGGS- hap-C150中插入片段的序列。
串联表位融合片段的构建及鉴定 以100ng pUCm-T-hap-C4-GGGS-hap-C150为模板、hap-C4-2F和Hap-C150-2R为引物，引物hap-C4-2F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，引物Hap-C150-2R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，扩增5’-端携带肠激酶（enterokinase，EK）酶切位点（DDDDK）编码序列及3’-端携带EK互补序列的hap-C4-GGGS-hap-C150-EK片段，反应体系94℃5 min后94℃30 S、45℃30 S、72℃120 S循环10次，利用hap-C4-2F和Hap-C150-2R引物中EK互补序列形成hap-C4-GGGS-hap-C150-EK串联表位融合片段，1.5%琼脂糖凝胶电泳后用PCR产物回收试剂盒(TaKaRa)回收大小为1488 bp的8×[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK])目的扩增片段，紫外线分光光度法测定其浓度。采用T-A克隆试剂盒（BioColor）将上述目的基因扩增片段克隆至pUCm-T载体中, 转化入E. coli DH5α并用LB 培养基扩增, 小量碱变性法提取重组质粒, 委托 Invitrogen 公司测定重组质粒 pUCm-T-8[hap-C4-GGGS- hap-C150-EK]中插入片段的序列。采用含核酸内切酶Nde I位点的hap-C4-3F以及含核酸内切酶XhoI位点的hap-C150-3R引物．以pUCm-T-8[hap-C4-GGGS- hap-C150-EK]为模板，扩增获得NdeI-8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK] -XhoI片段，按上法获得T-A克隆并测序。
串联式目的表位基因原核表达及鉴定 采用质粒提取试剂盒（Sigma）)分别提取在E.coli DH5α中扩增的pUCm-T-NaeI-8[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK]-XhoI和表达载体pET42a（Novagen），分光光度法测定其浓度。各质粒用Nde I和Xho I（TaKaRa）双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离后用DNA凝胶回收试剂盒（AxyPrep）回收NdeI-8×[Hap-C4-GGGS- Hap-C150-EK] -XhoI片段片段和线性化pET42a，在T4DNA连接酶（TaKaRa）作用下形成重组表达载体，转化入E coliBL21 DE3（Novagen）形成原核表达系统Ecoli BL21DE3pET42a-8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]。该菌接种于含100 µg卡那霉素的BL培养液中，1.0 mmoL／L IPTG（Sigma）及30℃、37℃条件下诱导目的重组融合蛋白8×[rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]表达。采用SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统检测其表达量，Ni-NTA亲和层析柱提纯目的重组融合蛋白，紫外分光光度法测定提纯蛋白的浓度。
表 1 PCR引物序列及扩增产物
目的重组融合蛋白水解和提纯
目的重组融合蛋白8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]肠激酶酶切反应体系如下：0.5 U／ml重组牛肠激酶（Sigma）、1mg／ml目的重组融合蛋白、1×酶切反应缓冲液（50mmoL／LNaCI、20 mmol／L Tris-HCI、2 mmoL／LCaCl2，pH7．4），25℃反应12 h后Tricine-SDS-PAGE观察酶切效果。首先用二碳酸二叔丁酯（Sigma）保护rHap-C4-GGGS-Hap-C150氨基，采用Sephadex G-25柱分离rHap-C4-GGGS- Hap-C150融合表位肽，洗脱液为0.01mol／L PBS（pH7.4）。回收融合表位肽用PEGl0000（Sigma）浓缩，紫外分光光度法测定蛋白浓度。
rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK与Poly-Asp-Lys交联
将Poly-Asp-Lys和rHap-C4-GGGS-Hap-C150按1：20的比例分别溶于0.01mol／LPBS（pH7.4），每毫克蛋白加入3 mg水溶性二环己基碳二亚胺（DCC，Sigma）室温250 r／min搅拌16 h进行交联。反应产物中加入终浓度为11 %的NaCl，4℃中边搅拌边缓慢加入-20℃预冷的无水乙醇，直至出现蛋白沉淀。10 000 r／min 4℃离心15 min，取沉淀溶于PBS中，按上法再次用NaCl-乙醇沉淀，4℃离心后收集交联后MAP产物并将其命名为MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150，紫外分光光度法测定蛋白浓度。
MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150的抗原性鉴定
MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150用PBS-吐温（PBST）分别1:50、1:100、1:200、1:400和1:800五个梯度稀释包被 ELISA板，每个梯度做3个重复，每孔加100µL，空载体总蛋白作阴性对照， 4℃过夜．PBST 洗 3 遍，每孔加入 200µL封闭液（PBST+1% BSA），37℃封闭 2 h后，同上洗板 3 次，加入 100µL全菌兔抗血清（PBST 1∶500 稀释），37℃作用 2 h．洗板 3次，加入HRP 标记的羊抗兔IgG（PBST1∶6 000 稀释），37℃作用 2 h，洗板 3 次，加100µl底物TMB（四甲基联苯胺），15min后以100µl 1mol/L的H2SO4终止反应，酶标仪450nm读数。
免疫原性检测
采用1：500稀释的兔抗全菌lgG为一抗、1：3000稀释的HRP标记羊抗兔lgG（ImmunoResearch）为二抗，采用Western blot检测MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150的免疫原性。
MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150抗体制备
24只雌性清洁级BALB／c小鼠平均分为两组，1.5%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，一组每只鼻腔逐滴滴入100µL含30µg MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150的 PBS 溶液，另一组每只鼻腔逐滴滴入100µL PBS溶液作为对照。第一次免疫用Al(OH)3完全佐剂，第二次和第三次免疫用Al(OH)3不完全佐剂。每 2 周注射一次，最后一次免疫后 2 周取小鼠静脉血，离心分离血清-20℃冰箱内保存。动物试验均在杭州医学院动物实验中心进行。
小鼠血清抗体效价检测
ELISA 检测小鼠血清 IgG 滴度，PBS稀释MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150至1µg／mL的浓度，每孔100µl包被酶标板，20℃~25℃隔夜包被（18~20 h），以200µl PBS 洗涤4次后，100µl PBS 1%BSA封闭，室温放置1 h，洗涤4次后，加100µl小鼠免疫血清（1:100开始对倍稀释），以同样处理注射PBS溶液小鼠血清为阴性对照。37℃反应 1 h；加入100µl 1:6000稀释的HRP标记羊抗鼠lgG（Immuno Research）为二抗，室温放置1 h，洗涤3次后加100µl底物TMB（四甲基联苯胺），15min后以100µl 1mol/L的H2SO4终止反应，酶标仪450nm读数。
补体的制备
青紫兰品系家兔，清洁级，3~4 周龄。先采少量血并分离血清测试补体的自然杀菌抗体活性，无自然杀菌抗体活性或杀菌率低于30%者可大量采血。将5份以上的血清混合，分装成每份5-8 ml，放-20℃冰箱内保存4周，为避免补体偏转现象的发生，一般应用不稀释的原血清。
补体自然杀菌率的检测
取96孔反应板一块，标记补体和灭活补体各2孔。加生理盐水50µL／孔，将补体和灭活补体分别加入孔内，25µL／孔，然后加入菌液25µL／孔。充分混合后于37℃，5% CO 2条件下孵育30 min。反应结束，取各孔中合物25µL滴加于巧克力平板，倾斜平板使液体自然流下，置37℃，5% CO2条件下孵育过夜。分别计数补体和灭活补体菌落数，按下式求出补体自然杀菌率：
补体自然杀菌率（%）＝（1－补体对照菌数 ／ 灭活补体对照菌数）×100％
菌液制备
菌种划线接种于巧克力平板上，于 37℃，5% CO 2 条件下培养过夜，菌苔用稀释缓冲液稀释，并调整浓度至约1×105CFU／ ml，置 4℃保存备用。
血清杀菌活性测定
96孔反应板每孔内加25µL 稀释缓冲液，第l孔加25µL待测血清，吹吸5次后取25µL加至第2孔，再吹吸5次后取出25µL至第3孔，如此连续倍比稀释至最后一孔。每孔内加25µL乳兔补体，于37℃，5% CO 2条件下孵育15 min；加25µL菌液（菌液浓度为105CFU/ml）和25µL稀释缓冲液，37℃，5% CO2 条件下孵育60 min；取25µL滴加于巧克力平板，倾斜平板使液体自然流下，37℃，5% CO2条件下孵育过夜；次日计数活菌。实验中设不加血清对照（包括加灭活补体和未灭活补体的对照）。以未灭活补体对照为参考，计算杀菌率。
杀菌率（％）＝（1－血清组菌落数／补体对照菌落数）×100％
杀菌率为 50％时血清的稀释度的倒数即为体外血清抗体的杀菌滴度。计算几何平均滴度（Geometric Mean Titer，GMT）。
结果
抗原表位融合和融合片段串联结果
PCR 分别扩增带柔性肽结构的hap-C4和hap-C150优势表位编码基因融合电泳结果显示获得预期大小融合片段（156bp）。融合片段T-A克隆后测序结果与预期完全符合。采用连接引物PCR构建含EK接头的8×[Hap-C4-GGGS- Hap-C150-EK]DNA片段，产物电泳后切胶回收1488 bp的8×[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK]的扩增产物，T-A克隆后测序结果与预期完全相符。
串联式目的表位基因原核表达及鉴定
1.0 mmoL／L IPTG（Sigma）诱导Ecoli BL21DE3pET42a-8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK] 表达目的重组融合蛋白8×[rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]表达，表达量达细菌总蛋白的30％，提纯后仅见单一的蛋白条带。
重组抗原表位酶切、交联回收效率
纯化后8×[rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]经肠激酶作用水解成rHap-C4-GGGS-Hap-C150，浓缩后rHap-C4-GGGS-Hap-C150蛋白浓度为2.0 mg／ml。rHap-C4-GGGS-Hap-C150蛋白与PoIy-Asp-Lys交联率为90.0%。
MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150蛋白抗原性鉴定
以全菌兔抗血清为一抗，ELISA 检测重组蛋白的抗原性,结果MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150可以在1:200滴度下被全菌制备抗体识别，提示所选择的抗原表位肽在大肠杆菌中串连融合表达能够折叠成类似天然蛋白位于流感嗜血杆菌表面的空间构象，具有较好的抗原性。
免疫原性检测结果
Western blot结果显示， MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150能识别兔抗全菌lgG并与之结合。
抗体效价
以MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150为包被抗原ELISA 检测12份小鼠血清 IgG 滴度1：6400、1：12800、1：25600、1：51600和1：102400分别有1份、3份、2份、4份和2份。
血清杀菌活性检测结果
杀菌率为 50％时血清的稀释度的倒数即为体外杀菌抗体的滴度。12份小鼠血清IgG 对流感嗜血杆菌Hia、Hib、Hic、Hid、Hie、Hif和NTHi 的杀菌活性见表2，7株标准菌株对12份小鼠血清杀菌滴度的几何平均数（GMT）分别为42.71、60.41、38.05、53.81、42.71、50.80、57.02，用多样本之间方差分析不同菌株间杀菌滴度GMT无统计学差异（F值=1.407，P=0.2229>0.05）。用多组样本与一组样本比较的方差分析荚膜型（包括Hia、Hib、Hic、Hid、Hie、Hif）与无荚膜型（NTHi）间杀菌滴度，结果荚膜型与无荚膜型间杀菌滴度GMT无统计学差异（F值=1.407，P=0.2229>0.05）。
表2 12份小鼠血清对7种血清型Hi的杀菌活性见表
*：CI（Confidence Interval），95％可信区间
总结
根据噬菌体展示技术鉴定和鳞选出流感嗜血杆菌Hap蛋白优势T与B联合表位Hap-C4和Hap-C150，采用柔性肽连接引物PCR构建含肠激酶（EK）位点的串联式Hap-C4和Hap-C150优势表位肽的原核重组表达系统，高效表达的串联目的重组融合蛋白为8×[rEK-Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK] 经EK水解后用Sephadex G-25柱分离片段，采用碳二亚胺法将rHap-C4-GGGS-Hap-C150与Poly-Asp-Lys载体分子交联，制备出多抗原MAP交联肽（MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150）。ELISA检测结果发现MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150能被全菌制备抗体（多克隆抗体）识别，MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150具有良好的抗原性。采用1：500稀释的兔抗全菌lgG为一抗Western blot检测MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150免疫原性，结果显示MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150能识别兔抗全菌lgG并与之结合。MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150免疫小鼠获得血清及其IgG，ELISA 检测12份小鼠血清 IgG 滴度1：6400～1：102400不等。采用血清杀菌力试验检测体外血清抗体杀菌滴度，计算几何平均滴度（GMT），12份小鼠血清对7株流感嗜血杆菌标准菌株杀菌滴度的几何平均数（GMT）分别为42.71、60.41、38.05、53.81、42.71、50.80、57.02，提示小鼠血清滴度在38.05～60.41间都有很好的杀菌力。用多样本之间方差分析不同菌株间杀菌率滴度GMT，不同菌株间杀菌滴度GMT无统计学差异（F值=1.407，P =0.2229>0.05）。用多组样本与一组样本比较的方差分析荚膜型（Hia、Hib、Hic、Hid、Hie、Hif）与无荚膜型（NTHi）间杀菌滴度GMT比较无统计学差异（F值=1.407，P=0.2229 >0.05）。
结论
流感嗜血杆菌黏附因子Hap蛋白Hap-C4和Hap-C150融合重组表达系统构建减少了单个表位表达所需的表达次数，提高了重组蛋白rHap-C4-GGGS-Hap-C150表达效率，融合优势表位串联表达提高了重组蛋白rHap-C4-GGGS-Hap-C150一次性表达量，MAP与rHap-C4-GGGS-Hap-C150 MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150免疫小鼠制备的血清能产生高滴度IgG ，MAP交联提高了rHap-C4-GGGS-Hap-C150免疫效果。高滴度IgG血清具有有效杀菌功能且对荚膜型与无荚膜型流感嗜血杆菌杀菌滴度无差异（>0.05）。MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150具有免疫制备有效杀菌功能的血清用于治疗流感嗜血杆菌感染。
序列表
<110> 杭州医学院
<120> 一种治疗流感嗜血杆菌感染的血清的制备方法及该血清的应用
<130> 1
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(primer)
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<212> DNA
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Claims (6)
1.一种治疗流感嗜血杆菌感染的血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）以不可分型流感嗜血杆菌标准菌株ATCC49247的DNA为模板，采用连接引物 PCR 分别扩增带柔性肽结构的hap-C4和hap-C150片段构建流感嗜血杆菌黏附Hap蛋白优势表位融合基因hap-C4-GGGS-hap-C150；连接引物包括hap-C4-1和hap-C150-1，连接引物hap-C4-1包括hap-C4-1F和hap-C4-1R，所述的hap-C4-1F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的hap-C4-1R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，连接引物hap-C150-1包括hap-C150-1F和hap-C150-1R，所述的hap-C150-1F核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述的hap-C150-1R核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
2）以pUCm-T-hap-C4-GGGS-hap-C150为模板，采用引物携带EK序列互补构建hap-C4-GGGS-hap-C150-EK串联表位融合片段，hap-C4-2F和Hap-C150-2R为引物，引物hap-C4-2F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，引物Hap-C150-2R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；采用含核酸内切酶Nde I位点的hap-C4-3F以及含核酸内切酶XhoI位点的hap-C150-3R引物，所述的hap-C4-3F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述的hap-C150-3R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，以pUCm-T-8×[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK]为模板，扩增获得NdeI-8×[Hap-C4-GGGS- Hap-C150-EK]-XhoI片段；
3）以NdeI-8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]–XhoI构建原核表达系统EcoliBL21DE3pET42a-8×[Hap-C4-GGGS- Hap-C150-EK]，原核表达系统Ecoli BL21DE3pET42a -8×[Hap-C4-GGGS- Hap-C150-EK]诱导表达重组融合蛋白8×[rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]，重组融合蛋白8×[rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]水解提纯得到rHap-C4-GGGS-Hap-C150融合表位肽；
4）用碳二亚胺法将rHap-C4-GGGS-Hap-C150与Poly-Asp-Lys载体大分子交联，制备出多抗原MAP交联肽MAP- rHap-C4-GGGS-Hap-C150；
5）多抗原MAP交联肽MAP- rHap-C4-GGGS-Hap-C150免疫小鼠，获得治疗流感嗜血杆菌感染的血清。
2.如权利要求1所述的一种治疗流感嗜血杆菌感染的血清的制备方法，其特征在于所述的步骤1）具体为：
a以流感嗜血杆菌基因组DNA为模板，采用连接引物hap-C4-1和hap-C150-1 PCR 分别扩增带柔性肽结构的hap-C4和hap-C150片段；连接引物hap-C4-1包括hap-C4-1F和hap-C4-1R，所述的hap-C4-1F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的hap-C4-1R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，连接引物hap-C150-1包括hap-C150-1F和hap-C150-1R，所述的hap-C150-1F核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述的hap-C150-1R核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
b回收步骤a得到的目的扩增产物，将回收的带柔性肽结构的hap-C4和hap-C150扩增片段等摩尔混合，再进行PCR扩增；
c利用hap-C4下游和hap-C150上游引物中互补的柔性肽序列形成复合模板，加入引物hap-C4-1F和hap-C150-1R进行PCR扩增，得到hap-C4-GGGS-hap-C150。
3.如权利要求2所述的一种治疗流感嗜血杆菌感染的血清的制备方法，其特征在于所述的步骤a 中PCR反应体系为：PCR总体积100 µL，内含2.5 mol/L各dNTP、250 nmol/L各引物、2.5 U EX-Taq酶、100 ng 各DNA模板和1×PCR缓冲液pH8.3，PCR参数：94ºC 5 min，94ºC30 S、52ºC 30 S、72ºC 30 S，30个循环，72ºC 5 min；步骤b中PCR反应体系为：PCR总体积100 µL，内含2.5 mol/L各dNTP、2.5 U EX-Taq酶、100 ng 各DNA模板和1×PCR缓冲液pH8.3，PCR参数：94ºC 5 min，94ºC 30 S、52ºC 30 S、72ºC 60 S，10个循环，72ºC 7min；步骤c中加入 hap-C4-1F和hap-C150-1R各250 nmol/L，PCR 参数：94ºC 5 min，94ºC 30 S、52ºC 30 S、72ºC 60 S，30个循环，72ºC 7min。
4.如权利要求1所述的一种治疗流感嗜血杆菌感染的血清的制备方法，其特征在于所述的步骤2）具体为：
a以100ng pUCm-T-hap-C4-GGGS-hap-C150为模板、hap-C4-2F和Hap-C150-2R为引物，扩增5’-端携带肠激酶酶切位点DDDDK编码序列及3’-端携带EK互补序列的hap-C4-GGGS-hap-C150-EK片段，反应体系94℃5 min后94℃30 S、45℃30 S、72℃120 S循环10次，利用hap-C4-2F和Hap-C150-2R引物中EK互补序列形成hap-C4-GGGS-hap-C150-EK串联表位融合片段，1.5%琼脂糖凝胶电泳后用PCR产物回收试剂盒回收目的扩增片段8×[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK],所述的引物 hap-C4-2F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述的引物Hap-C150-2R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
b采用T-A克隆试剂盒将上述目的基因扩增片段克隆至pUCm-T载体中, 转化入E. coliDH5α并用LB 培养基扩增, 构建重组质粒 pUCm-T-8×[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK]；
c采用含核酸内切酶Nde I位点的hap-C4-3F以及含核酸内切酶XhoI位点的hap-C150-3R引物，以pUCm-T-8×[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK]为模板，扩增获得NdeI-8×[Hap-C4-GGGS- Hap-C150-EK] -XhoI片段，所述的引物hap-C150-3R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
5.如权利要求1所述的一种治疗流感嗜血杆菌感染的血清的制备方法，其特征在于所述的步骤4）具体为：将Poly-Asp-Lys和rHap-C4-GGGS-Hap-C150按1：20的比例分别溶于0.01mol／L PBS中，每毫克蛋白加入3 mg水溶性二环己基碳二亚胺室温250 r／min搅拌16 h进行交联；反应产物中加入终浓度为1l %的NaCl，4℃中边搅拌边缓慢加入-20℃预冷的无水乙醇，直至出现蛋白沉淀；10 000 r／min 4℃离心15 min，取沉淀溶于PBS中，按上法再次用NaCl-乙醇沉淀，4℃离心后收集交联后MAP产物并将其命名为MAP-rHap-C4-GGGS- Hap-C150。
6.如权利要求1制备得到的血清在制备治疗流感嗜血杆菌感染药物中的应用。
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