CN107529534B - 一种副鸡禽杆菌的保护性抗原、及其表达和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及家禽传染病防疫领域，具体涉及一种用于副鸡禽杆菌的保护性抗原、及其表达和应用。该用于副鸡禽杆菌的保护性抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。还公开了表达副鸡禽杆菌的保护性抗原蛋白的表达载体及其构建方法。该表达载体可在食品级的乳酸乳球菌中获得表达。本发明还提供了用于副鸡禽杆菌的保护性抗原的应用，用于制备鸡传染性鼻炎疫苗。该疫苗能够明显增强鸡对A，B，C三种血清型副鸡禽杆菌的抵抗力，其保护效果优于全菌灭活疫苗，可以用来预防不同血清型副鸡禽杆菌引起的鸡传染性鼻炎。

Description

一种副鸡禽杆菌的保护性抗原、及其表达和应用

技术领域

本发明涉及家禽传染病防疫技术领域，具体涉及一种副鸡禽杆菌的保护性抗原、及其表达和应用。

背景技术

鸡传染性鼻炎(Avian infectious coryza)是由副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum，Apg)感染引起的禽类最重要的呼吸疾病之一。发病鸡主要表现为流涕、眼睑肿胀以及溢泪等临床症状。鸡传染性鼻炎可以导致鸡产蛋期延迟、产蛋量降低，从而给养殖户造成重大经济损失。

Apg属于巴氏杆菌科的短小革兰氏阴性杆菌，基本特征为无运动性、菌体呈多形性、其中强毒株带有荚膜。Page等人将Apg分为A、B和C三种血清型，研究表明Apg的三个血清型均有不同程度的致病能力，但三者灭活菌体间不存在型间交叉免疫保护作用，即接种一种血清型的Apg并不能避免另外两种血清型的Apg的感染。

为了预防鸡传染性鼻炎肆虐，目前广泛使用Apg的灭活疫苗，这些疫苗是通过以福尔马林、硫柳汞等为防腐剂灭活Apg而获得的。目前国际上普遍使用的Apg灭活疫苗绝大多数囊括A型和C型。随着大量B型的Apg在国内外陆续发生和流行，国际上已有较大的疫苗公司开始提供包含A、B、C三种血清型的三价灭活疫苗。由于副鸡禽杆菌属于苛生菌，培养成本高导致常规灭活菌苗成本居高不下；此外，副鸡禽杆菌含有脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)等毒素物质，大量接种带来的毒副作用会影响鸡生长与产蛋，同时会导致接种的鸡中形成局灶性的坏死斑。鸡传染性鼻炎灭活疫苗对野外鸡群的预防效果约为70-80％，但在其效力检验中由于环境和评价方法的差异可能会有不同的结果。

为了研发更为安全有效的疫苗，有学者进行遗传重组技术制备重组疫苗的研究。例如，Ryuichi Sakamoto等人通过克隆表达副鸡禽杆菌A型和C型的外膜蛋白，获得重组蛋白可用于分别抵抗鸡传染性鼻炎A型和C型感染的保护性抗原。然而，在设计用于制备疫苗的重组抗原时，由于筛选Apg三种血清型共有且具有中和活性的抗原表位存在一定难度，能同时抵抗副鸡禽杆菌A、B、C三种血清型保护性抗原鲜有报道。另外，大肠杆菌原核表达的重组蛋白含有大量内毒素，重组蛋白用作抗原时必须要有专门的去除工艺与之配套，费时、费力，操作难度大。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供了一种用于副鸡禽杆菌的保护性抗原，利用该抗原制备的疫苗能同时有效预防副鸡禽杆菌的A、B、C三种血清型病原菌感染家禽。本发明的另一个目的是提供副鸡禽杆菌的保护性抗原的表达载体及其表达的重组乳酸乳球菌，其有别于大肠杆菌表达系统，内毒素含量低。本发明的再一目的是提供副鸡禽杆菌的保护性抗原的应用。为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种副鸡禽杆菌的保护性抗原蛋白，所述抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种编码如上所述的保护性抗原蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

一种用于表达副鸡禽杆菌的保护性抗原的表达载体，所述表达载体中插入有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

如上所述的表达载体，优选地，所述表达载体为乳酸乳球菌表达载体。进一步地，所述表达载体为食品级表达载体pNZ8149。

一种用于表达副鸡禽杆菌的保护性抗原的重组菌，所述重组菌含有如上所述的表达载体。

如上所述的重组菌，其原始细胞为食品级乳酸乳球菌。

一种用于表达副鸡禽杆菌的保护性抗原的重组菌的制备方法，包括如下步骤：

(1)、将目的片段La2与质粒PUC-57经双酶切和回收后，进行连接，构建PUC-57-La2载体；其中，所述目的片段La2的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.2所示序列及限制酶NcoI和SacI的酶切位点；

(2)、分别用限制酶NcoI和SacI双酶切所述PUC-57-La2载体及表达载体pNZ8149，回收纯化酶切片段，并用T4 DNA连接酶进行定向连接，连接产物用于电穿孔法转化乳酸乳球菌NZ3900菌株感受态细胞；

(3)、采用Elliker选择培养基对所述步骤(2)转化后的感受态细胞培养，筛选阳性转化菌，鉴定其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，则所述阳性转化菌为制备的用于表达副鸡禽杆菌的保护性抗原的重组菌。

如上所述的制备方法，优选地，所述目的片段La2的获得是通过采用如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对序列对如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为模板进行PCR扩增获得。

如上所述的制备方法，优选地，所述双酶切所用的酶为限制酶NcoI和SacI。

如上所述副鸡禽杆菌的保护性抗原蛋白在抵抗鸡传染性鼻炎中应用。

具体地，所述应用包括采用含有用于表达副鸡禽杆菌的保护性抗原蛋白的L.lactis NZ3900-pNZ8149-La2重组菌进行免疫。进一步地，所述L.lactis NZ3900-pNZ8149-La2重组菌的使用浓度为1×10⁸CFU/ml。

本发明的有益效果为：

本发明所得的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过抗原特性进行实验分析，Western Blotting实验证明本发明所得的重组抗原蛋白具有较强的免疫原性；使用该抗原蛋白免疫试验鸡后能保护试验鸡不受副鸡禽杆菌感染，作为副鸡禽杆菌的保护性抗原蛋白。并通过免疫实验，其实验数据证明，本发明所得的抗原蛋白可对针对多株不同血清型的副鸡禽杆菌产生免疫保护作用，如Hp8、221、0083、BJ、222、668、Modesto等A型、B型和C型Apg菌株，且保护效果优于全菌灭活疫苗。

本发明通过在乳酸乳球菌表达载体中插入用于编码上述保护性抗原蛋白的外源基因，并将该表达载体转入乳酸乳球菌，实现外源蛋白即保护性抗原蛋白在乳酸乳球菌中的表达。具体采用了表达载体pNZ8149构建的表达副鸡禽杆菌保护性抗原的载体pNZ8149-La2，具有在L.lactis中表达副鸡禽杆菌的保护性抗原蛋白基因的功能。其中，pNZ8149-La2是在具有食品级安全性的载体上构建的表达副鸡禽杆菌疫苗抗原的载体，pNZ8149质粒不含抗生素抗性基因，既在安全性方面具有突出的优势，又具有表达副鸡禽杆菌的保护性抗原蛋白的功能，对副鸡禽杆菌疫苗的制备具有非常大的应用价值。

在本发明的一个实施例中，攻毒实验表明，采用本发明所得的表达抗原蛋白的基因工程乳酸乳球菌重组疫苗L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2免疫的鸡群在A或C型副鸡禽杆菌攻毒后，所有鸡只没有出现鼻炎症状，保护率为100％；在用B型BJ株攻毒后，只有10％的鸡只出现鼻炎症状，保护率为90％；采用全菌灭活疫苗免疫的鸡群在攻毒后7天内有2-3只鸡出现临床症状，保护率为70-80％；而未进行免疫的对照组鸡群在攻毒后全部出现鼻炎症状，保护率为0。免疫组与非免疫组的保护率有极显著差异。实验结果表明该L.lactisNZ3900/pNZ8149-La2重组菌不仅能够表达具有抗原活性的疫苗抗原，而且其安全性高于现有技术中以副鸡禽杆菌灭活菌株为抗原的疫苗株，其保护效果也优于全菌灭活疫苗，可以作为副鸡禽杆菌亚单位疫苗的候选抗原，因而该重组菌株具有独特优势，在副鸡禽杆菌疫苗制备中具有较高的应用价值。

附图说明

图1为表达载体PUC-57-La2的构建示意图。

图2为La2基因PCR扩增产物电泳图。

图3为乳酸乳球菌表达载体pNZ8149-La2的构建示意图。

图4为阳性菌NZ3900/pNZ8149-La2的PCR鉴定电泳图。

图5为NZ3900/pNZ8149-La2重组乳酸乳球菌SDS-PAGE筛选不同诱导剂浓度图。

图6为NZ3900/pNZ8149-La2重组乳酸乳球菌SDS-PAGE筛选不同诱导时间蛋白电泳图。

图7为NZ3900/pNZ8149-La2重组乳酸乳球菌Western blots检测La2蛋白免疫活性图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来说明本发明内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

Lactococcus lactis表达载体pNZ8149本发明的发明人经过深入研究，利用生物信息学软件geneious(Biomatters.Ltd，网址http://www.geneious.com/)，通过对GenBank中副鸡禽杆菌外膜蛋白HMTp210的基因(GenBank:KJ867497.1，全长6117bp)及其编码的蛋白序列(2038个氨基酸残基)进行抗原表位分析。根据预测结果和实验经验，选取免疫原性强的肽段，经过多次序列优化后，确定了抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，对所得的抗原蛋白的抗原特性进行实验分析验证，Western Blotting实验证明本发明所得的重组抗原蛋白具有较强的免疫原性；使用该抗原蛋白免疫试验鸡后能保护试验鸡只不受副鸡禽杆菌感染。

本发明对于制备氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的抗原蛋白的宿主菌及其编码该氨基酸序列的基因序列，通过大量实验进行优化和选择，最后选择了属于革兰氏阳性菌的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，L.lactis)作为表达宿主菌。乳酸乳球菌(Lactococcuslactis，L.lactis)是乳酸菌类的一个菌种，在食品加工中的应用已有悠久的历史，其生长迅速，易于培养，遗传背景和调控机制相对清楚，且食品级的诱导物和宿主菌，不含任何抗生素抗性基因，在安全性方面的优势十分突出，乳酸乳球菌还具有严谨性高，本底表达水平低，诱导效率高，表达产量高，无内毒素等优点。

在大量实验和经验基础上，根据编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基因，人工设计合成适合于乳酸菌表达偏好的核苷酸序列，经过优选适合于乳酸菌表达的优势密码子，确定编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基因如SEQ ID NO.2所示，即副鸡禽杆菌La2基因序列。通过在乳酸乳球菌表达载体中插入该外源基因(SEQ ID NO.2)，并将载体转入乳酸乳球菌，实现外源蛋白在乳酸乳球菌中的表达。

本发明的实验依据包括，体外培养重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2，用乳酸链球菌素(Nisin)诱导外源蛋白表达，并用SDS-PAGE和Western blots方法分析蛋白的表达并鉴定蛋白的免疫活性。结果：SDS-PAGE可以检测到L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2分泌表达副鸡禽杆菌保护性抗原蛋白。通过Western blots分析检测到表达的目的抗原能够与La2蛋白的单克隆抗体发生免疫反应。本发明一实施例中通过实验表明，L.lactisNZ3900/pNZ8149-La2菌株在鸡传染性鼻炎疫苗制备中有应用价值。

下面通过具体实施例来说明本发明，其中，所用试剂和材料及配置可采用如下：

(一)本发明的实施例中使用的细菌菌株和质粒

Lactococcus lactis NZ3900菌株(lacF-，pepN::nisRnisK)购自荷兰NIZO FoodResearch(Kernhemseweg,Netherlands)。采用含150ml/L甘油的GM17培养基于-80℃保存该菌种。

Lactococcus lactis表达载体pNZ8149购自荷兰NIZO Food Research(Kernhemseweg，Netherlands)。PNZ8149含启动子Pnis、lacF基因、多克隆酶切位点、复制子repC和repA及终止子等元件，为食品级安全性表达载体。

(二)本发明实施例中涉及实验所用培养基的配制

(1)LB培养基

LB液体培养基：称取1.0g胰蛋白胨，0.5g酵母浸粉，1.0g氯化钠，溶于100ml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，121℃高压灭菌20min，置4℃保存备用。

LB固体培养基：称取1.0g胰蛋白胨，0.5g酵母浸粉，1.0g氯化钠，1.5g琼脂粉，溶于100ml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，121℃高压灭菌20min，冷却至约50℃时倾注平板备用。

(2)乳酸菌培养基

GM17培养基：称取4.25g M17培养基，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，定容至100ml，121℃高压灭菌20min，冷却后加入乳糖至终浓度为5.0g/L。

GM17培养基平板：称取4.25g GM17培养基，1.5g琼脂粉，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，定容至100ml，121℃高压灭菌20min，冷却至约60℃时加入乳糖至终浓度为5.0g/L，混匀后将培养基倒入培养皿中，制成培养基平板。

GSGM17培养基：称取85.50g蔗糖，12.50g甘氨酸，18.63g M17培养基，溶于400ml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，定容至500ml，高压灭菌。冷却后加入葡萄糖至终浓度为5.0g/L。

GM17MC恢复培养基：称取3.73g M17培养基，0.19g MgCl2，0.02g CaCl₂，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/L Na0H调pH至7.2，定容至100ml，高压灭菌。冷却后加入葡萄糖至终浓度为5.0g/L。

Elliker选择培养基配制方法如下：

(1)4.0g/L溴甲酚紫储藏液：称取0.4g溴甲酚紫，溶于5％的乙醇，用0.1M的NaOH调pH值至8.0,定容至100ml。用无菌0.22μm孔径过滤器过滤除菌，4℃保存备用。

(2)200g/L乳糖储藏液：称20g乳糖，用蒸馏水定容至100ml，用无菌的0.22μm孔径过滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。

(3)取0.50g酵母浸粉(Yeast extract)，2.0g胰蛋白胨(Tryptone)，0.15g无水醋酸钠，0.40g氯化钠(NaCl)，1.5g琼脂粉(Agar)，0.05g抗坏血酸，溶于100ml蒸馈水中，高压灭菌20min。冷却至约60℃时，加入lml 4.0g/L溴甲酚紫储藏液(终浓度为40mg/L)和2.5ml的200g/L乳糖储藏液(终浓度5.0g/L)，倾倒平板，4℃保存备用，三天内使用。

(三)本发明实施例中涉及实验所使用的试剂

M17培养基(青岛海博生物技术有限公司产品)、氯霉素(美国Amresco公司)、T4DNA连接酶和限制性内切酶NcoI、SacI(美国Fermentas公司)、凝胶回收试剂盒(杭州爱思进(AxyGen)生物科技有限公司)、高纯度质粒提取试剂盒和DNA Marker III(北京康为世纪生物科技有限公司)、PCR反应试剂盒和RNA酶(RNaseA)(北京天根生化科技有限公司)、其他常用试剂均为国产分析纯级试剂。

实施例1克隆载体PUC-57-La2的构建

PUC-57-La2克隆载体的构建示意图如图1所示，具体操作步骤如下：

1.1 PCR引物设计与合成

对实施例1中的副鸡禽杆菌La2基因序列，即如SEQ ID NO.2所示，进行全基因合成。并利用生物软件Primer 5.0设计PCR引物，上游引物序列为(SEQ ID No.3)：5'-CATGGCTG GCA CAG AGC GTA AAA ACC AAC TTT-3'；下游引物为(SEQ ID No.4)：5'-TCGAG ATTTGC GGT GGT TGC ACC GCC TTG GGT-3'。在上游引物5'端引入NcoI酶切位点，在下游引物5'端引入SacI酶切位点。目标产物长度为1702bp。引物及副鸡禽杆菌La2基因序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 La2基因的PCR扩增

(1)参照PCR反应试剂盒(北京天根生化科技有限公司)产品说明，配制20ul反应体系：10μmol/L的上游引物lμl，10μmol/L的下游引物lμl，2×Taq PCR Master Mix 10μl，副鸡禽杆菌La2核苷酸模板2μl，加去离子水至20μl。

(2)循环条件：预变性95℃：5min，95℃：1min，56℃：1min，72℃：1min，30个循环，最后72℃延伸10min。

(3)PCR产物分析：取5μl PCR反应产物，于0.1g/L琼脂糖凝胶中电泳，电压为100V/cm，用DNA Marker做分子量标记，电泳20min后，用凝胶图像扫描仪进行分析。

1.3 PUC-57质粒提取

(1)收集振荡培养过夜的含有PUC-57质粒的重组大肠杆菌菌液5mL，取1.5mL菌液于离心管中，室温12 000×g离心1min，弃去上清。重复进行操作。

(2)向离心管内加入250μL Buffer P1，重悬沉淀。

(3)向离心管内加入250μL Buffer P2，轻轻地上下颠倒离心管数次，室温放置2min，至菌体完全裂解，溶液变的黏稠清亮。

(4)向离心管内加入350μL Buffer N3，立刻轻轻地上下颠倒离心管数次，使液体充分混匀，至白色絮状物沉淀出现。室温12 000×g离心10min。

(5)将上清转入带有2mL收集管的吸附柱内，室温12 000×g离1min，弃废液，再将吸附柱放回收集管。

(6)向吸附柱内加入Buffer PB 500μL，室温12 000×g离心1min，弃去废液，再将吸附柱放回收集管。

(7)向吸附柱内加入Buffer PE 750μL，室温12 000×g离心1min，弃去废液，再将吸附柱放回收集管。

(8)空转吸附柱。室温12 000×g离心2min，使DNA吸附柱干燥。

(9)将吸附柱放入一个高压灭菌的1.5mL离心管内，在柱内硅胶膜中心位置加50μL灭菌蒸馏水，避免触及硅胶膜，室温静置4min，室温12 000×g离心1min，弃掉DNA吸附柱，离心管中的液体就是克隆质粒PUC-57。

1.4 La2基因与质粒PUC-57的双酶切与回收

取步骤1.2中PCR扩增得到La2基因，用限制性内切酶SacI和NcoI进行双酶切，并用SacI和NcoI双酶切质粒PUC-57。酶切体系为：SacI 1μl、NcoI 1μl、10×Cutsmart Buffer 2μl、质粒PUC-57或La2基因16μl。37℃酶切0.5h。用凝胶回收试剂盒(杭州爱思进生物科技有限公司)对酶切片段分别进行纯化回收，操作步骤如下：

(1)取50μl双酶切产物在2％(W/V)的琼脂糖凝胶中电泳20min，依据DNA Marker条带的位置，在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，用滤纸将凝胶表面液体吸干，然后装入1.5ml的洁净的1.5ml EP管中，称凝胶重量，根据重量估算凝胶体积(l00mg的凝胶按100μl体积估算)。

(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃水浴，间断混合，直到凝胶完全溶化。

(3)加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。

(4)将步骤(3)的混合液转移至DNA制备管中，12000r/min离心lmin，弃滤液。

(5)将制备管置回2ml离心管，加500μl Buffer Wl,12000r/min离心30s，弃滤液。

(6)将制备管置回2ml离心管，加700μl Buffer W2，12000r/min离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次，12000r/min离心1min。

(7)将制备管置回2ml离心管中，12000r/min离心1min。

(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加30μl去离子水，室温静置1min。12000r/min离心2min洗脱DNA，将得到的DNA置-20℃保存。

1.5 La2基因与质粒PUC-57的定向连接

将步骤1.4回收的La2基因与PUC-57质粒用T4连接酶于16℃进行连接反应16h。连接反应体系：T4DNA连接酶lμl、PUC-57 3μl、La2 1μl、10×Buffer 1μl。16℃连接反应16h。

1.6 PUC-57重组质粒的转化

(1)将上述1.5中孵育过夜(16h)后的10μL连接产物加入200μL DH5α感受态细胞(购自北京天根生物科技有限公司)中混匀，冰浴30min；

(2)42℃热激90s，迅速置冰浴2min；

(3)加入800μL LB液体培养基混匀后，37℃200rpm振摇培养1h，使细菌恢复正常生长状态；

(4)取100μL菌液涂布于预涂IPTG及X-Gal的Amp筛选平板上，37℃培养12-18小时，挑取白斑菌落，接种于5mL含100μg/mL Amp+LB试管中。

1.7重组质粒DNA的提取

从Amp+/LB固体培养基上挑取白色单菌落，接种于5rnL Amp+/LB液体培养基中，37℃200rpm振摇培养过夜。根据QIAGEN公司QIAprep Spin Miniprep Kit试剂盒说明书提取重组质粒质粒(方法如1.3所述)。

1.8重组质粒的酶切和PCR鉴定

(1)将上述提取的克隆质粒，取1μL作为模板，进行PCR鉴定，反应体系为：

组分La2模板即上述步骤1.7中的克隆质粒1μL，2×Taq PCR Mix 10μL，F(10mmol)1μL，R(10mmol)1μL，ddH₂O 7μL，总体积20μL。

瞬时离心混匀，于PCR仪中扩增。反应条件为：95℃预变性5min后进入PCR循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，取5μL产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察，能扩增出与目的片段大小相符的质粒鉴定为阳性。

(2)将上述步骤1.7中所提取的质粒，用NcoI、SacI双酶切，酶切反应体系如下：

重组质粒DNA 10μL，10×Fast Digest Green Buffer 2μL，Kpn I 1μL，Pst I 1μL，ddH₂O 6μL，总体积20μL。轻轻混匀以上组分，37℃水浴30min，取5μL酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察，能切出目的片段和PUC-57载体大小的质粒鉴定为阳性。

将菌液PCR及双酶切鉴定均为阳性的克隆过夜培养，送生工生物工程股份有限公司测序。用DNAStar软件分析插入目的序列与参考序列的核苷酸和氨基酸同源性及碱基顺序正确性。序列正确的质粒分别命名为PUC-57-La2。

结果如下：

1.副鸡禽杆菌La2的PCR扩增结果

PCR扩增La2基因产物在1％琼脂糖凝胶中的电泳结果显示，PCR扩增产物的长度与预期的长度(1702bp)符合，具体如图2所示，其中，图中1为DNA Marker(bp)，2为以副鸡禽杆菌为模板PCR扩增La2基因的产物，3为阴性对照；证实PCR扩增La2基因成功。

2.阳性转化菌的筛选结果

用PUC-57与La2连接产物热激及冰浴后，加入LB培养基恢复培养1h，取100μL菌液涂布于预涂IPTG及X-Gal的Amp筛选平板上，37℃培养12-18小时，挑取白斑菌落，接种于5mL含100μg/mL Amp+LB试管中，可见培养基上有白色的阳性转化菌落。

3.阳性转化菌的鉴定

挑取LB培养基上的白色菌落接种到LB液体培养基，培养12h后，提取质粒，PCR鉴定结果为扩增产物长度与预期片段长度(1702bp)相符；将质粒交由北京华大基因公司对质粒中La2基因进行测序，结果得到核苷酸序列与SEQ ID NO.2的La2基因序列进行BLAST比对，结果显示二者相同。结果证明从该阳性转化菌中提取的质粒即为所要构建的重组载体，将该表达载体命名为PUC-57-La2，将含有该表达载体的重组菌株命名为：PUC-57-La2。采用含150ml/L甘油的GM17培养基于-80℃保存该菌株。

实施例2表达La2基因重组乳酸乳球菌的构建

乳酸乳球菌表达载体pNZ8149-La2的构建示意图如图3所示，具体操作步骤如下：

2.1提取乳酸乳球菌pNZ8149质粒

从GM17固体培养基上挑取单菌落(Lactococcus lactis表达载体pNZ8149)，接种于5mL GM17液体培养基中，30℃静止培养过夜。根据QIAGEN公司QIAprep Spin MiniprepKit试剂盒说明书提取质粒，步骤同1.4。

2.2克隆载体及表达载体pNZ8149的双酶切及回收

用限制酶NcoI和SacI双酶切实施例1中制备的重组克隆载体即PUC-57-La2重组质粒以及表达载体pNZ8149，酶切体系如下：

PUC-57-La2重组质粒DNA 40μL，10×Fast Digest Green Buffer 7.5μL，SacI 3μL，NcoI 3μL，ddH₂O 21.5μL，总体积75μL。

轻轻混匀以上组分，37℃水浴1h，将75μL酶切产物于1％的琼脂糖凝胶中电泳，并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收酶切产物，l％的琼脂糖凝胶电泳观察回收效果，确证酶切成功。

2.3目的片段La2和表达载体pNZ8149连接

将凝胶回收得到的目的片段La2分别与乳酸乳球菌表达载体pNZ8149的胶回收产物进行连接，连接体系如下：

La2和pNZ8149的摩尔比为4-6:l，轻轻混匀，16℃连接过夜。

10×T4 DNA Ligation Buffer 1μL，T4 DNA连接酶1.5μL，La2 3μL，pNZ8149 4.5μL，总体积10μL。连接产物置于-80℃冰箱中备用。

2.4乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞的制备

具体步骤如下：

(1)第一天从培养板上挑取单克隆菌体，即Lactococcus lactis NZ3900菌株接种于5mL液体GSGM17培养基中，30℃静止过夜培养；

(2)第二天将过夜培养的5mL菌体加入50mL GSGM17培养基中，30℃静止过夜培养；

(3)第三天将过夜培养的50mL菌体转400mL GSGM17培养基中，30℃静止培养至OD600为0.3左右(大约3h)；

(4)将菌液6000g，4℃离心20min，收集菌体；

(5)用冰冷的400mL的洗液I(0.5M蔗糖，10％甘油)洗涤一次，6000g，4℃离心20min，收集菌体；

(6)用冰冷的200mL的洗液II(0.5M蔗糖，10％甘油，50mM EDTA)重悬菌体，冰上静置15min，6000g，4℃离心20min，收集菌体；

(7)再用冰冷的洗液I(0.5M蔗糖，10％甘油)100mL重悬菌体，6500g，4℃离心20min，收集菌体，得乳酸乳球菌NZ3900感受态；

(8)用4mL冰冷的洗液I(0.5M蔗糖，10％甘油)悬浮菌体，分装入预先冰浴的1.5mLEP管中，每管100μL储存于-80℃。

2.5连接产物电转化入乳酸乳球菌NZ3900

(1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞(NZ3900)，置于冰上解冻，吸取10μL连接产物加入感受态细胞，混匀后，置于冰上5min；

(2)将混合液加入冰冷的2mm电击转化杯中，轻轻敲击电击杯以确保混合液位于电击杯底部并没有气泡；

(3)用滤纸擦干电击杯外的冷凝水，放入电击仪；

(4)调节电击仪，使脉冲为25μF、电压2000V、电阻200Ω，进行电击；

(5)电击结束后，迅速加入1mL冰冷的GM17-MC恢复培养基，混匀后转入1.5mL的EP管中冰浴5min，30℃静止培养1h；

(6)吸取100μL恢复培养的菌液接种于Elliker选择培养基，30℃静止培养2d，挑取黄色菌落进行鉴定。

2.6阳性克隆子pNZ8149-cfrA/NZ3900的筛选鉴定

(1)从过夜培养的Ellike选择培养基上挑取黄色阳性菌落，加入5mL GM17液体培养基，30℃静止培养；进行菌液PCR鉴定，PCR步骤同前。

(2)根据QIAGEN公司QIAprep Spin Miniprep Kit试剂盒说明书提取质粒，具体步骤同前，将上述所提取的质粒，用NcoI、SacI双酶切，酶切体系及条件同前。

(3)将菌液PCR及双酶切鉴定均为阳性的克隆，送生工生物工程股份有限公司测序。序列正确的质粒命名为pNZ8149-La2，相应的重组乳酸乳球菌分别命名为pNZ8149-La2/NZ3900。

结果如下：

1.La2的基因PCR扩增结果

用PUC-57-La2 DNA为模板，PCR扩增La2基因，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析的结果显示，扩增基因片段长度与预期长度(1702bp)相符。

2.阳性转化菌的筛选

用PUC-57-La2双酶切与pNZ8149双酶切连接后为PNZ-8149-La2转化L.lactisNZ3900感受态细胞后，在Elliker选择培养基上，于30℃，5％CO₂培养箱静置培养12～14h，可见黄色的阳性转化菌落。

3.阳性转化菌的鉴定

挑取黄色菌落接种至GM17液体培养基中，培养12h，用质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒，以提取的质粒为模板，用前述La2基因扩增引物进行PCR鉴定，结果显示，PCR扩增产物的长度与预期相符，具体如图4所示，其中，1为Maker，2-5为疑似阳性克隆菌，6为阳性对照，7为阴性对照。将PCR鉴定为阳性的质粒NcoI及SacI双酶切，双酶切片段长度分别为2.548kb和1.7kb，均与预期长度一致。

4.阳性转化菌的测序鉴定

将酶切鉴定为阳性的质粒送交北京华大基因公司进行测序，La2的测序结果与SEQID.2上La2基因序列进行BLAST比对，基因序列相同。结果表明，从阳性重组菌中提取的质粒即为所要构建的副鸡禽杆菌La2基因的L.lactis表达载体，将该表达载体命名为：pNZ8149-La2，将含有该表达载体的重组L.lactis菌株命名为：L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2。采用含150ml/L甘油的GM17培养基于-80℃保存该菌株。

实施例3菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2的诱导表达

3.l La2蛋白的诱导剂浓度筛选

(1)在培养菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2的GM17培养基平板上用接种环刮取单菌落接种于l0 ml GM17液体培养基，于30℃、5％CO₂培养箱，静置培养12h。

(2)取2ml菌液加入到50ml GM17液体培养基，于30℃、5％CO₂培养箱，静置培养至菌液OD至0.3-0.5时，加入诱导剂Nisin(Sigma公司)至终浓度分别为0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，60ng/ml，诱导培养4h，同时取诱导前作为阴性对照。

(3)同时用L.lactisNZ3900/pNZ8149作为诱导表达实验的阴性对照。

3.2 La2蛋白的诱导时间筛选

(1)在培养菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2的GM17培养基平板上用接种环刮取单菌落接种于l0 ml GM17液体培养基，于30℃、5％CO₂培养箱，静置培养12h。

(2)取2ml菌液加入到50ml GM17液体培养基，于30℃、5％CO₂培养箱，静置培养至菌液OD至0.3-0.5时，加入诱导剂Nisin(Sigma公司)至终浓度为20ng/ml，分别诱导培养1h，2h，3h，4h，5h，同时取诱导前作为阴性对照。

(3)同时用L.lactisNZ3900/pNZ8149作为诱导表达实验的阴性对照。

3.3菌体总蛋白样品的收集

(1)诱导4h后，取30ml菌液于4℃、8000r/min离心5min，弃上清，留取菌体沉淀；

(2)加PBS 30ml悬浮菌体，8000r/min、4℃离心5min，弃上清；

(3)加PBS 3ml重悬菌体，超声，工作2S，停3S，共30min。

(4)吸取80μl超声后菌液，加入20μl 5×SDS Loading Buffer，混匀，煮沸10min，于-20℃贮存备用。

3.4重组菌株诱导产物的SDS-PAGE分析

(1)制胶：SDS-PAGE凝胶配制方法如表1所示：

表1 SDS-PAGE凝胶配制方法

12％的分离胶配制：将各成分加入后迅速混合，加入制胶板中，上面加纯化水。然后，再配制5％浓缩胶：将表中相关各成分加入后迅速混合，加入制胶板的分离胶的上面(先将分离胶上面的纯化水倒干净)，灌满后插入加样梳。待浓缩胶凝固后，取下梳子。

(2)取煮好蛋白样品20μL上样，以蛋白质标准分子量为参考，在12％SDS-PAGE上进行电泳分析。待积层胶凝固后，取下梳子；将凝胶固定于电泳装置上，加入足够量的Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入各样品；电泳电压120V，电流在20-40mA范围内，电泳1h，至溴酚蓝泳出胶底面，终止电泳；

(3)电泳结束后，小心取下胶，放入考马斯亮蓝染液染色30min，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min。

(4)取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。

(5)将脱色后的胶进行扫描，留照片。

结果如下：

1.最佳诱导剂浓度筛选

SDS-PAGE分析结果：在经诱导的L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2菌株培养液样品中，在预期位置出现了阳性反应带(La2分子量为56KD)，对照菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149菌体蛋白和诱导前样品的电泳图谱中均无相应条带，且随诱导剂Nisin浓度增加，目的条带呈增加趋势，最大到20ng/ml，而后目的条带随诱导剂浓度增加呈下降趋势，说明最佳诱导剂浓度为20ng/ml；具体如图5所示，其中，M为Maker，1为宿主菌PNZ8149，2为诱导前，3为0ng/μl，4为1ng/μl，5为5ng/μl，6为10ng/μl，7为20ng/μl，8为40ng/μl，9为60ng/μl。

2.最佳诱导时间筛选

SDS-PAGE分析结果：如图6所示，其中，M为Maker，1为宿主菌PNZ8149，2为诱导前，3为诱导1h，4为诱导2h，5为诱导3h，6为诱导4h，7为诱导5h。表明，在经诱导的L.lactisNZ3900/pNZ8149-La2菌株培养液样品中，在预期位置出现了阳性反应带(La2分子量为56KD)，对照菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149菌体蛋白和诱导前样品的电泳图谱中均无相应条带，且随诱导时间增加，目的条带呈增加趋势，超过诱导4h后，条带减弱。说明最佳诱导时间为4h。

实施例4菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2蛋白的表达及鉴定

4.1菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2蛋白活性检测

操作步骤如下：

1.SDS-PAGE电泳：用实施例3所述方法制备L.lactis NZ3900/pNZ8149、L.lactisNZ3900/pNZ8149-La2菌体蛋白，并进行SDS-PAGE分析。

2.转膜：SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶切成所需大小，把硝酸纤维素膜(北京索莱宝科技有限公司)和厚滤纸剪成与凝胶相同大小，将硝酸纤维素膜在甲醇中浸润15s；在Bio-Rad电转仪中依次叠放厚滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜和厚滤纸；25V，转膜30min。

3.封闭：转膜后，用PBS漂洗硝酸纤维素膜一次，然后将硝酸纤维素膜置于封闭液(含5％脱脂奶粉的PBS)中，室温缓慢摇动封闭2h，封闭后，用PBS洗涤3次，每次漂洗5min。

4.一抗反应：取针对La2的单克隆抗体(可采用常规方法制备获得)用封闭液1:2000稀释，硝酸纤维素膜置于稀释后的La2单克隆抗体，37℃孵育lh。用TBST漂洗3次，每次持续5min。

5.二抗反应：在硝酸纤维素膜上加入用含1％g/L脱脂奶粉的PBS稀释过的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37℃lh，用TBST溶液漂洗3次，每次5min。

6.显色：将硝酸纤维素膜放入平皿中，用DBA显色试剂盒(北京康为世纪科技有限公司)进行显色，参照产品说明书，步骤为：取lml反应液入到1.5ml离心管中，再向离心管中加入50μl试剂A，B，C，混匀后，将混合液滴加在硝酸纤维素膜上，显色l～5min，显色后把膜放入到去离子水中浸泡，终止反应。

4.2结果如下：

Western blots分析结果：在经诱导的L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2菌株培养液上清样品中，在预期位置出现了阳性反应带(La2分子量为56KD)，在L.lactisNZ3900/pNZ8149-La2菌体蛋白样品电泳图谱的相应位置也出现了阳性反应带。对照菌株L.lactisNZ3900/pNZ8149菌体蛋白和L.lactisNZ3900/pNZ8149-La2诱导前的电泳图谱中均无相应条带。结果如图7所示，其中，M为M为Maker，1为宿主菌PNZ8149，2为诱导前，3为诱导1h，4为诱导2h，5为诱导3h，6为诱导4h，7为诱导5h。结果表明，菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2在诱导剂作用下能分泌表达副鸡禽杆菌La2蛋白，且表达的La2蛋白具有免疫活性。

实施例5菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2对SPF鸡免疫效力试验

5.1重组乳酸乳球菌L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2疫苗制备及免疫方法

1.1疫苗的制备

重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2疫苗的制备：将实施例3制备的重组菌L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2在浓度为20ng/ml的诱导剂Nisin，37℃诱导4h后，用GM17液体培养基稀释到1×10⁸CFU/ml(OD600＝1.0)，用甲醛灭活(3‰)24h～48h，然后与MONTANIDE^TM ISA 71 VG佐剂(SEPPIC公司产品)按3:7重量比(30％重量的抗原，70％重量的佐剂)混合乳化(操作方法见SEPPIC公司产品使用方法介绍)。所制备的疫苗命名为v-La2。

全菌灭活疫苗制备：分别将A、B、C型副鸡禽杆菌Hp8株、BJ株和668株菌经纯培养后，挑取单个菌落8～10个，涂于TSA平板上(含10％灭活牛血清)。37℃培养16h～18h后，用灭菌的0.01mol/L PBS将平板上的菌苔洗下，稀释至7.5×10⁹cfu/ml，用甲醛灭活(3‰)4h～48h，然后等体积混合。混合菌液与10号工业白油(杭州炼油厂)佐剂按1：1体积混合，胶体磨乳化，分装备用。

1.2免疫方法

42日龄SPF试验鸡90只，分为v-La2疫苗组、常规三价灭活疫苗组和PBS对照组。重组v-La2疫苗组、常规三价灭活疫苗组和PBS对照组各30只。疫苗组试验鸡采用胸部肌肉注射的途径，0.5ml/只，分别用v-La2疫苗组和常规三价灭活疫苗接种免疫；对照组试验鸡接种PBS，0.5ml/只。4周后相同剂量、相同途径加强免疫。

1.3免疫鸡攻毒试验

对加强免疫4周后的试验鸡全部进行攻毒试验。各试验组内再分别用A型(Hp8株)，B型(BJ株)和C型(668株)Apg进行攻毒，每组10只，眶下窦接种，剂量依次是A型Hp8株5×10⁵CFU，B型BJ株2×10⁵CFU，C型668株5×10⁵CFU。连续观察一周，记录试验鸡的临床发病情况，包括流鼻涕，眼睑肿，溢泪等。评价重组亚单位疫苗的免疫保护力，结果参见表2。

表2不同疫苗免疫鸡对Apg菌株攻毒的保护效果

注：攻毒剂量A型Hp8株5×10⁵CFU，B型BJ株2×10⁵CFU，C型668株5×10⁵CFU。

*表示重组活疫苗免疫组(v-La2)获得免疫保护的试验鸡数与非免疫空白对照组比较，差异显著。

表2列出了A型Hp8株、B型BJ株和C型668株的攻毒实验结果。实验时，采用本发明的乳酸乳球菌重组菌制备的疫苗(v-La2)免疫试验鸡，2次免疫后用A，B，C三个血清型的Apg强毒攻击，非免疫对照组所有试验鸡陆续发病。乳酸乳球菌重组疫苗免疫组攻毒后只有1只试验鸡表现出鼻炎症状，保护率为90％～100％；全菌三价灭活疫苗免疫组在攻毒后3天内各有2-3只鸡出现临床症状，保护率为70％-80％；而非免疫对照组所有试验鸡都表现出严重的鼻炎症状。

利用A型221株、0083株，B型222株和C型Modesto株的Apg进行攻毒实验的结果与Hp8株、BJ株和668株的攻毒实验结果相似，L.lactis NZ3900/pNZ8149-La2实验组的保护率为90％～100％。由此可见，采用本发明提供的重组乳酸乳球菌制备的疫苗免疫效果显著，能够同时有效预防鸡感染A、B、C三个血清型的Apg。

此外，重组乳酸乳球菌活疫苗(v-La2)的保护率优于全菌三价灭活疫苗的保护效果，与非免疫组相比，有极显著差异。乳酸乳球菌遗传背景和调控机制相对清楚，且食品级的诱导物和宿主菌，不含任何抗生素抗性基因；作为革兰氏阳性菌，其内毒素含量较革兰氏阴性细菌低很多。在安全性方面的优势十分突出。乳酸乳球菌严谨性高，本底表达水平低，诱导效率高，表达产量高，少内毒素；从制备成本上说，培养基便宜，容易纯化等特点，也低于常规灭活菌苗。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

[0001] 序列表

[0002] <110>北京市农林科学院

[0003] <120>一种副鸡禽杆菌的保护性抗原、及其表达和应用

[0004] <160>4

[0005] <170>SIPOSequenceListing 1.0

[0006] <210>1

[0007] <211>564

[0008] <212>PRT

[0009] <213>保护性抗原蛋白(protective antigent)

[0010] <400>1

[0011] Leu Ala Gln Ser Val Lys Thr Asn Phe Gly Gly Asn Ala Asn LeuAla

[0012] 1 5 10 15

[0013] Thr Asp Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Ile Gly Gly Thr Gly GlnAsp

[0014] 20 25 30

[0015] Thr Ile His Asp Ala Ile Asn Asn Val Leu Thr Lys Leu Ile SerLeu

[0016] 35 40 45

[0017] Ser Ala Thr Glu Glu Glu Glu Val Val Ser Gly Glu Ala Val TyrAsp

[0018] 50 55 60

[0019] Ala Leu Lys Gly Ala Lys Pro Thr Val Ser Ala Glu Ala Asn LysGly

[0020] 65 70 75 80

[0021] Ile Thr Gly Leu Val Asp Val Val Lys Lys Ala Asn Ser Pro IleThr

[0022] 85 90 95

[0023] Val Glu Pro Ser Thr Asp Asn Asn Lys Lys Lys Thr Phe Thr ValGly

[0024] 100 105 110

[0025] Leu Met Lys Asp Ile Glu Gly Val Asn Ser Ile Thr Phe Asp LysSer

[0026] 115 120 125

[0027] Gly Gln Asp Leu Asn Gln Val Thr Gly Arg Met Ser Ser Ala GlyLeu

[0028] 130 135 140

[0029] Thr Phe Lys Lys Gly Asp Thr Thr Asn Gly Ser Thr Thr Thr PheAla

[0030] 145 150 155 160

[0031] Glu Asp Gly Leu Thr Ile Asp Ser Thr Thr Asn Ser Ala Gln ThrAsn

[0032] 165 170 175

[0033] Leu Val Lys Val Ser Arg Asp Gly Phe Ser Val Lys Asn Gly SerAsp

[0034] 180 185 190

[0035] Glu Ser Lys Leu Ala Ser Thr Lys Leu Ser Ile Gly Ala Glu AsnAla

[0036] 195 200 205

[0037] Glu His Val Glu Val Thr Lys Ser Gly Ile Ala Leu Lys Ala AspAsn

[0038] 210 215 220

[0039] Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Leu Ala Gln Asp Ala Ile ThrLeu

[0040] 225 230 235 240

[0041] Ala Gly Asn Ala Thr Gly Thr Ala Ile Lys Leu Thr Gly Val AlaAsp

[0042] 245 250 255

[0043] Gly Asn Ile Thr Val Asn Ser Lys Asp Ala Val Asn Gly Gly GlnLeu

[0044] 260 265 270

[0045] Arg Thr Leu Leu Gly Val Asp Ser Gly Ala Lys Ile Gly Gly ThrGlu

[0046] 275 280 285

[0047] Lys Thr Thr Ile Ser Glu Ala Ile Ser Asp Val Lys Gln Ala LeuThr

[0048] 290 295 300

[0049] Asp Ala Thr Leu Ala Tyr Lys Ala Asp Asn Lys Asn Gly Lys ThrVal

[0050] 305 310 315 320

[0051] Lys Leu Thr Asp Gly Leu Asn Phe Thr Ser Thr Thr Asn Ile AspAla

[0052] 325 330 335

[0053] Ser Val Glu Asp Asn Gly Val Val Lys Phe Thr Leu Lys Asp LysLeu

[0054] 340 345 350

[0055] Thr Gly Leu Lys Thr Ile Ala Thr Glu Ser Leu Asn Ala Ser GlnAsn

[0056] 355 360 365

[0057] Ile Ile Ala Gly Gly Thr Val Thr Val Gly Gly Glu Thr Glu GlyIle

[0058] 370 375 380

[0059] Val Leu Thr Lys Ser Gly Ser Gly Asn Asp Arg Thr Leu Ser LeuSer

[0060] 385 390 395 400

[0061] Gly Ala Gly Asn Ala Ala Thr Asp Gly Ile Lys Val Ser Gly ValLys

[0062] 405 410 415

[0063] Ala Gly Thr Ala Asp Thr Asp Ala Val Asn Lys Gly Gln Leu AspLys

[0064] 420 425 430

[0065] Leu Phe Lys Ala Ile Asn Asp Ala Leu Gly Thr Thr Asp Leu AlaVal

[0066] 435 440 445

[0067] Thr Lys Asn Pro Asn Gln Thr Ser Ile Phe Asn Pro Ile Asn GlyThr

[0068] 450 455 460

[0069] Ala Pro Thr Thr Phe Lys Asp Ala Val Asp Lys Leu Thr Thr AlaVal

[0070] 465 470 475 480

[0071] Asn Thr Gly Trp Gly Ser Lys Val Gly Ile Leu Ala Thr Gly IleAsp

[0072] 485 490 495

[0073] Gly Ile Asp Ala Gly Asn Lys Lys Ile Ser Asn Val Ala Asp GlyAsp

[0074] 500 505 510

[0075] Ile Ser Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Thr Gly Arg Gln Leu TyrAla

[0076] 515 520 525

[0077] Leu Met Gln Lys Gly Ile Arg Val Tyr Gly Asp Glu Val Ser ProThr

[0078] 530 535 540

[0079] Lys Thr Gln Thr Thr Ala Pro Thr Ala Ser Ser Thr Gln Gly GlyAla

[0080] 545 550 555 560

[0081] Thr Thr Ala Asn

[0082] <210>2

[0083] <211>1692

[0084] <212>DNA

[0085] <213>人工序列(Artificial Sequence)

[0086] <400>2

[0087] ctggcacaga gcgtaaaaac caactttggc ggcaatgcaa atctggcaaccgacggtacc 60

[0088] atcaccttta ccaacattgg cggtaccggt caggatacca ttcacgacgcgatcaacaac 120

[0089] gttctgacca aactgattag cctgagcgca accgaagaag aagaagttgttagcggcgaa 180

[0090] gctgtttatg acgcactgaa aggcgcaaaa ccgaccgtta gcgcagaagcgaacaaaggc 240

[0091] attaccggtc tggttgacgt cgttaaaaaa gcgaacagtc cgattaccgttgaaccgagt 300

[0092] accgacaaca acaagaagaa gaccttcacc gtcggtctga tgaaggatatcgaaggcgtc 360

[0093] aacagcatca ccttcgacaa aagcggtcag gatctgaacc aggttaccggtcgtatgagt 420

[0094] tctgcaggtc tgacctttaa gaaaggcgat accaccaacg gtagtaccaccacctttgca 480

[0095] gaagacggtc tgaccattga tagcaccacc aatagcgcac agaccaatctggtcaaagtt 540

[0096] agccgtgacg gctttagcgt taaaaacggt agcgacgaaa gcaaactggcaagcaccaaa 600

[0097] ctgagcattg gcgcagaaaa cgcagaacac gttgaggtta ccaaaagcggcattgcgctg 660

[0098] aaagcggata acaccagcga caaaagcagc attaccctgg cacaagacgcaattaccctg 720

[0099] gcaggtaacg caaccggtac cgcaattaaa ctgaccggcg ttgcagacggtaatattacc 780

[0100] gtaaacagca aagacgcagt taacggcggt caactgcgta ccctgctgggcgtagattca 840

[0101] ggcgcaaaaa ttggcggcac cgaaaaaacc accatcagcg aagcgatcagcgacgttaaa 900

[0102] caggcactga ccgacgcaac cctggcatat aaagcggaca acaagaacggcaaaaccgtc 960

[0103] aaactgaccg acggtctgaa ctttaccagt accaccaaca tcgacgcgagcgttgaagat 1020

[0104] aacggcgtcg tcaagttcac cctgaaagac aaactgaccg gcctgaaaaccattgcaacc 1080

[0105] gaaagcctga acgcaagcca gaatatcatt gcgggtggta ccgtaaccgttggcggcgaa 1140

[0106] accgaaggta ttgtcctgac caaaagcggt agcggtaacg atcgtaccctgtctctgtct 1200

[0107] ggtgcaggta acgcagcaac cgacggtatt aaagttagcg gcgttaaagcaggtaccgca 1260

[0108] gataccgacg cagttaataa aggccagctg gataagctgt tcaaagcgattaacgacgcc 1320

[0109] ctgggtacca ccgatctggc agttaccaaa aacccgaacc agaccagcatcttcaatccg 1380

[0110] attaacggta ccgcaccgac cacctttaaa gatgcggttg ataaactgaccaccgcagtt 1440

[0111] aacaccggtt ggggtagtaa agttggcatt ctggcaaccg gtattgacggtattgacgca 1500

[0112] ggcaacaaga aaatcagcaa cgttgcggac ggcgatatta gtccgacctcaggcgacgtt 1560

[0113] gttaccggtc gtcaactgta cgcactgatg cagaaaggca ttcgcgtttacggcgacgaa 1620

[0114] gttagtccga ccaaaaccca aaccaccgca ccgaccgcaa gtagtacccaaggcggtgca 1680

[0115] accaccgcaa at 1692

[0116] <210>3

[0117] <211>32

[0118] <212>DNA

[0119] <213>人工序列(Artificial Sequence)

[0120] <400>3

[0121] catggctggc acagagcgta aaaaccaact tt 32

[0122] <210>4

[0123] <211>32

[0124] <212>DNA

[0125] <213>人工序列(Artificial Sequence)

[0126] <400>4

[0127] tcgagatttg cggtggttgc accgccttgg gt 32

Claims (9)

1.一种用于副鸡禽杆菌的保护性抗原蛋白，其特征在于，所述抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码如权利要求1所述的保护性抗原蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种用于表达副鸡禽杆菌的保护性抗原的表达载体，其特征在于，所述表达载体中插入有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为乳酸乳球菌表达载体。

5.一种用于表达副鸡禽杆菌的保护性抗原的重组菌，其特征在于，所述重组菌含有如权利要求3或4所述的表达载体。

6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的原始细胞为食品级乳酸乳球菌。

7.一种用于表达副鸡禽杆菌的保护性抗原的重组菌的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)、将目的片段La2与质粒PUC-57经双酶切和回收后，进行连接，构建PUC-57-La2载体；其中，所述目的片段La2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示序列，在其上游和下游分别具有NcoI和SacI的酶切位点；

(2)、分别用限制酶NcoI和SacI双酶切所述PUC-57-La2载体及表达载体pNZ8149，回收纯化酶切片段，并用T4 DNA连接酶进行定向连接，连接产物用于电穿孔法转化乳酸乳球菌NZ3900菌株感受态细胞；

(3)、采用Elliker选择培养基对所述步骤(2)转化后的感受态细胞培养，筛选阳性转化菌，鉴定阳性转化菌标度的副鸡禽杆菌的保护性抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，则所述阳性转化菌为制备的用于表达副鸡禽杆菌的保护性抗原的重组菌。

8.如权利要求1所述的副鸡禽杆菌的保护性抗原蛋白在制备鸡传染性鼻炎疫苗中应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用含有用于表达副鸡禽杆菌的保护性抗原蛋白的L.lactis NZ3900-pNZ8149-La2重组菌进行免疫。

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