CN114262719B

CN114262719B - 副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗制备方法及运用

Info

Publication number: CN114262719B
Application number: CN202111483210.7A
Authority: CN
Inventors: 潘杰; 李晓明; 迟强伟; 王绍君; 丁国伟; 荣雪路; 李甜甜; 魏荣荣; 叶正琴; 李琛; 潘晨; 陈林中日; 陈森
Original assignee: Yangzhou Uni Bio Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Yangzhou Uni Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2041-12-07
Also published as: CN114262719A

Abstract

本发明公开了副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗制备方法及运用，属于兽用生物制品领域。本发明构建了并表达了能够同时预付副鸡嗜血杆菌A、B、C三个血清型的融合蛋白rApg‑ABC。本发明将rApg‑ABC融合蛋白基因连接至pFastBac1载体，转化到DH10Bac感受态细胞后获得重组杆粒。将重组杆粒转染至sf9细胞后培养获得重组杆状病毒，将重组杆状病毒接种悬浮昆虫细胞HF中高效表达抗原蛋白，经过提取纯化、BEI灭活后加入佐剂乳化制成疫苗。所述制备方法简单，能大量制备抗原蛋白，耗时短，表达量高，大大降低生产成本，有利于大规模生产。

Description

副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗制备方法及运用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗制备方法及运用。

背景技术

副鸡嗜血杆菌(Haemophilusparagallinarum，Hpg)，是巴氏杆菌科禽杆菌属(Avibacterium)的一种短小革兰阴性杆菌，为鸡传染性鼻炎(Infectiouscoryza，IC)的病原菌，引起鸡的急性或亚急性呼吸道感染，临床表现为鼻腔、眶下窦和气管上部发炎、流泪、流鼻液、呼吸困难。病鸡打喷嚏、摇头，颜面部单侧或双侧水肿。副鸡嗜血杆菌可造成蛋鸡产蛋量下降，肉鸡肉质下降，生长鸡群发育迟缓受阻和淘汰率增加，对养鸡业造成较大的经济损失，严重影响养鸡业的发展。

鸡传染性鼻炎发病率高，大龄鸡比小鸡易感，死亡率一般不超过20％。鸡传染性鼻炎广泛分布于世界各地，BEACH于1920年首先报道了该病，而1931年DEBLIEKC首次分离到Hpg。我国于1987年首次在北京分离到鸡传染性鼻炎病原，相继在河北、辽宁、山东等地有分离到Hpg的报道。在我国，Hpg发病率为20％～50％，死亡率5％～20％，在并发鸡毒支原体病或其他传染病时会表现出病程延长和死淘率升高。

副鸡嗜血杆菌具有多种血清型，按照玻片凝集试验可将该菌分为A、B、C这3个血清型。按照间接血凝抑制试验可以分为A、B、C 3个血清群9个血清型。目前市场上有二价疫苗、三价疫苗等多种防控鸡传染性鼻炎的疫苗产品，尤其是A、B、C全菌三价疫苗能够对所有血清型的鼻炎提供保护，因而市场容量较大。但由于副鸡禽杆菌属于苛生菌，培养成本较高，而且全菌灭活疫苗中含有大量的菌体蛋白、内毒素、其他毒性物质以及附加物等因素，易造成较为严重的副反应，在接种部位还会形成局灶性坏死斑。

另一方面，对于副鸡嗜血杆菌基因工程亚单位疫苗的研究，目前还是集中在使用大肠杆菌表达系统进行抗原表达的。众所周知，大肠杆菌表达系统表达的抗原，其内毒素的去除工艺较为繁琐，加大了产业化难度及疫苗使用的安全性。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是用于防治鸡传染性鼻炎的全菌疫苗存在成本高、副反应严重的问题，而制备基因工程亚单位疫苗时，使用大肠杆菌表达系统表达得到的抗原需要经过繁琐的纯化工艺、难以产业化且影响疫苗安全性。

[技术方案]

本发明提供一种重组杆状病毒，接种昆虫细胞后，能够高效表达用于预防副鸡嗜血杆菌感染导致的鸡传染性鼻炎的3个血清型融合蛋白rApg-ABC。

所述3个血清型融合蛋白rApg-ABC的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

编码所述3个血清型融合蛋白rApg-ABC的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供一种重组转移载体，是将编码所述3个血清型融合蛋白rApg-ABC的基因与pFastBac I转移载体连接得到的pFastBac-rApg-ABC转移载体。

本发明提供所述重组杆状病毒的制备方法，是将编码所述3个血清型融合蛋白rApg-ABC的基因，连接至转移载体，将重组转移载体转化感受态细胞，经培养获得重组杆粒，再将重组杆粒转染至昆虫细胞进行培养，从培养物中收获重组杆状病毒。

本发明提供应用所述重组杆状病毒制备重组抗原的方法，是将编码所述3个血清型融合蛋白rApg-ABC的基因，连接至转移载体，将重组转移载体转化感受态细胞，经培养获得重组杆粒，再将重组杆粒转染至昆虫细胞进行培养，从培养物中收获、纯化重组抗原。

本发明提供副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗，包括抗原和疫苗佐剂，所述抗原为灭活的重组抗原。所述灭活可以是BEI灭活、甲醛灭活、β-丙内酯灭活。

所述疫苗中重组蛋白的含量在20～50μg/mL之间。

所述重组抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO：1(含组氨酸标签)。

所述疫苗佐剂为矿物油佐剂。

[有益效果]

本发明将表达重组蛋白的重组杆状病毒rBac-rApg-ABC，接入到昆虫细胞中高效地表达rApg-ABC蛋白，经过离心去除细胞碎片，加入灭活剂灭活后，得到重组抗原，将重组抗原与矿物油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备疫苗的方法，能够有效避免内毒素的问题；同时，真核表达系统由于具有完善的蛋白后修饰功能，所表达的重组抗原的而免疫效果更为优越，在较低量的抗原添加情况下即可达到免疫保护效果。

本发明制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平，提高免疫后抗体的整齐度，保证疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点。

附图说明

图1是SDS-PAGE检测重组杆状病毒表达产物。M：预染蛋白质Marker；1：rApg-ABC；2：对照。

图2是WesternBlot鉴定重组杆状病毒表达产物。M：预染蛋白质Marker；1：rApg-ABC；2：对照。

具体实施方式

实施例1：重组杆状病毒rBac-rApg-ABC的构建

1、设计编码融合蛋白rApg-ABC的基因片段，并提交南京金斯瑞根据昆虫细胞密码子偏好性进行序列优化，并将优化后的序列(SEQ ID NO:2)合成至pFastBac I转移载体上，得到pFastBac-rApg-ABC转移载体。

2、重组杆状病毒构建：

将转移载体pFastBac-rApg-ABC转入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，挑选阳性克隆用M13引物作PCR鉴定。M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13-R：CAGGAAACAGCTATGAC。PCR反应体系为(总体积25μL)：DNA模板0.5μL、M13-F和M13-R各0.5μL、DNA聚合酶12.5μL及无菌水11μL。PCR反应条件为：95℃，5min；95℃30s，65℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳显示，成功扩增出约3000bp的特异性条带，与预期大小相符。将阳性重组杆粒命名为rBacmid-rApg-ABC。

将提纯的重组杆粒rBacmid-rApg-ABC用脂质体转染的方法转染sf9昆虫细胞，具体操作方法参照赛默飞世尔科技(中国)有限公司的cellfectin转染试剂说明书进行，获得f1代重组杆状病毒rBac-rApg-ABC。

实施例2：重组rApg-ABC蛋白的制备

1、重组杆状病毒扩增：将重组杆状病毒rBac-rApg-ABC接种昆虫细胞sf9，27℃培养4天，收集培养物，离心取上清即获得f2代重组杆状病毒。

2、表达蛋白鉴定

(1)将上述f2代重组杆状病毒以MOI＝5～10的接种量接入昆虫细胞sf9，27℃培养4天，收集培养物，离心取上清即获得重组rApg-ABC蛋白。

(2)SDS-PAGE鉴定：将上述上清液进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后，经染色和脱色后发现，大约在66kDa位置有条带，其分子量与理论大小相符，说明表达成功。

(2)WesternBlot鉴定：取SDS-PAGE电泳结束后凝的胶，直接用BIO-LAB转印装置将其转印到NC膜上，转印结束后，按常规方法进行Westernblot鉴定。用辣根过氧化物酶标记的鼠抗HisTag(1μg/ml)作为酶标抗体；最后用TMB显色(碧云天生物技术研究所)。结果表明，在66kDa处出现1条明显的特异性条带，而阴性对照无此特异性反应，进一步说明该重组蛋白重组成功表达。

3、重组rApg-ABC蛋白的大量表达

将鉴定正确的f2代重组杆状病毒以MOI＝1～10的接毒量接种悬浮昆虫细胞HF细胞大量培养，离心收集培养液上清，即获得含有大量的重组rApg-ABC蛋白。

4、重组rApg-ABC蛋白的纯化：蛋白纯化采用常规Ni亲和层析进行纯化，具体实验操作参照千纯生物科技有限公司Ni-NTA Purose 6Fast Flow填料说明书。纯化后蛋白浓度为200μg/ml。

实施例3副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗的制备

取实施例2中获得的rApg-ABC重组蛋白，加入佐剂进行乳化，混匀，4℃保存。疫苗具体配比见表1。

表1副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗成分配比

注：※代表每ml疫苗中的蛋白浓度。

实施例4副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗疫原性试验

随机抽取150只(42日龄)SPF鸡，分为5组，30只/组，分别免疫疫苗1、疫苗2和疫苗3(剂量为0.5ml/只)，对照疫苗组(印度尼西亚美迪安有限公司，剂量为0.5ml/只)以及PBS对照组(剂量为0.5ml/只)。接种疫苗当天记为免疫第1天，在免疫的第28天，分别使用A型菌(Hpg-8，6.7*10⁹CFU/ml)、B型菌(Hpg-yb，8.0*10⁹CFU/ml)、C型菌(Hpg-668，5*10⁹CFU/ml)进行攻毒，攻毒方式为眶下窦注射活菌，剂量为A型菌1.3*10⁹CFU、B型菌1.6*10⁹CFU、C型菌1.0*10⁹CFU。连续观察7d。

记录试验鸡的临床发病情况，包括流鼻涕，眼睑肿，溢泪等。评价重组亚单位疫苗的免疫保护力，结果参见表2。

表2副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗免疫保护结果

从表1列出了A型Hpg-8株、B型Hpg-yb株和C型Hpg-668株的攻毒实验结果分析。首先，从非免疫攻菌组(即空白对照组)来看，三个血清型攻菌后，实验动物发病率均为100％，这一点说明实验成立，实验结果可信。

疫苗1(蛋白含量添加最低的一组，10μg/ml)三个血清型强菌的攻毒保护率均在90％以上，较市售对照疫苗有显著的优势。另外两组亚单位疫苗(疫苗2和疫苗3)由于蛋白添加量足够，其对三个血清型强菌的免疫保护效率均为100％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州优邦生物药品有限公司

<120> 副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗制备方法及运用

<130> BAA211521B

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 640

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met His His His His His His Asp Gln Asn Asp Pro Thr Gly Asn Gln

1 5 10 15

Gly Gln Lys Val Glu Leu Gly Asn Ala Ile Thr Leu Ser Ala Thr Asn

20 25 30

Gln Trp Ala Asn Asn Gly Val Asn Tyr Lys Thr Asn Asn Leu Thr Thr

35 40 45

Tyr Asn Ser Gln Asn Gly Thr Ile Leu Phe Gly Met Arg Glu Asp Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gln Ile Thr Ala Gly Thr Tyr Asn Thr Thr Gly Asp Ala

65 70 75 80

Asn Asn Lys Asn Gln Leu Asn Asn Thr Leu Gln Gln Thr Thr Leu Glu

85 90 95

Ala Thr Gly Ile Thr Ser Ser Val Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gly Phe

100 105 110

Ser Leu Gly Ala Asp Ser Val Thr Phe Ser Lys Gly Gly Ala Gly Thr

115 120 125

Val Lys Leu Ser Gly Val Ser Asp Ala Thr Ala Asp Thr Asp Ala Ala

130 135 140

Thr Leu Lys Gln Val Lys Glu Tyr Arg Thr Thr Leu Val Gly Asp Asn

145 150 155 160

Asp Ile Thr Ala Ala Asp Arg Ser Gly Gly Thr Ser Asn Gly Ile Thr

165 170 175

Tyr Asn Leu Ser Leu Asn Lys Gly Thr Val Ser Ala Thr Glu Glu Lys

180 185 190

Val Val Ser Gly Lys Thr Val Tyr Glu Ala Ile Arg Asn Ala Ile Thr

195 200 205

Gly Asn Ile Phe Thr Ile Gly Leu Asp Asp Thr Thr Leu Asn Lys Ile

210 215 220

Asn Asn Pro Ala Asp Gln Asp Leu Ser Asn Leu Ser Glu Gly Lys Ser

225 230 235 240

Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Leu Met Lys Asp Ile

245 250 255

Glu Gly Val Asn Ser Ile Thr Phe Asp Lys Ser Gly Gln Asp Leu Asn

260 265 270

Gln Val Thr Gly Arg Met Ser Ser Ala Gly Leu Thr Phe Lys Lys Gly

275 280 285

Asp Thr Thr Asn Gly Ser Thr Thr Thr Phe Ala Glu Asp Gly Leu Thr

290 295 300

Ile Asp Ser Thr Thr Asn Ser Ala Gln Thr Asn Leu Val Lys Val Ser

305 310 315 320

Arg Asp Gly Phe Ser Val Lys Asn Gly Ser Asp Glu Ser Lys Leu Ala

325 330 335

Ser Thr Lys Leu Ser Ile Gly Ala Glu Asn Ala Glu His Val Glu Val

340 345 350

Thr Lys Ser Gly Ile Ala Leu Lys Ala Asp Asn Thr Ser Asp Lys Ser

355 360 365

Ser Ile Thr Leu Ala Gln Asp Ala Ile Thr Leu Ala Gly Asn Ala Thr

370 375 380

Gly Thr Ala Ile Lys Leu Thr Gly Val Ala Asp Gly Asn Ile Thr Val

385 390 395 400

Asn Ser Lys Asp Ala Val Asn Gly Gly Gln Leu Arg Thr Leu Leu Gly

405 410 415

Val Asp Ser Gly Ala Lys Ile Gly Gly Thr Glu Lys Thr Thr Ile Ser

420 425 430

Glu Ala Ile Ser Asp Val Lys Gln Ala Leu Thr Asp Ala Thr Leu Ala

435 440 445

Tyr Lys Ala Asp Asn Lys Asn Gly Lys Thr Val Lys Leu Thr Asp Gly

450 455 460

Leu Asn Phe Thr Ser Thr Thr Asn Ile Asp Ala Ser Val Glu Asp Asn

465 470 475 480

Gly Val Val Lys Phe Thr Leu Lys Asp Lys Leu Thr Gly Leu Lys Thr

485 490 495

Ile Ala Thr Glu Ser Leu Asn Ala Ser Gln Asn Ile Ile Ala Gly Gly

500 505 510

Thr Val Thr Val Gly Gly Glu Thr Glu Gly Ile Val Leu Thr Lys Ser

515 520 525

Gly Ser Gly Asn Asp Arg Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly Asn Ala

530 535 540

Ala Thr Asp Gly Ile Lys Val Ser Gly Val Lys Ala Gly Thr Ala Asp

545 550 555 560

Thr Asp Ala Val Asn Lys Gly Gln Leu Asp Lys Leu Phe Lys Ala Ile

565 570 575

Asn Asp Ala Leu Gly Thr Thr Asp Leu Ala Val Thr Lys Asn Pro Asn

580 585 590

Gln Thr Ser Ile Phe Asn Pro Ile Asn Gly Thr Ala Pro Thr Thr Phe

595 600 605

Lys Asp Ala Val Asp Lys Leu Thr Thr Ala Val Asn Thr Gly Trp Gly

610 615 620

Ser Lys Val Gly Ile Leu Ala Thr Gly Ile His His His His His His

625 630 635 640

<210> 2

<211> 1923

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcatcatc atcatcatca tgatcagaac gatccgaccg gcaaccaggg ccagaaagtg 60

gaactgggca acgcgattac cctgagcgcg accaaccagt gggcgaacaa cggcgtgaac 120

tataaaacca acaacctgac cacctataac agccagaacg gcaccattct gtttggcatg 180

cgcgaagatc cgagcgtgaa acagattacc gcgggcacct ataacaccac cggcgatgcg 240

aacaacaaaa accagctgaa caacaccctg cagcagacca ccctggaagc gaccggcatt 300

accagcagcg tgggcagcac caactatgcg ggctttagcc tgggcgcgga tagcgtgacc 360

tttagcaaag gcggcgcggg caccgtgaaa ctgagcggcg tgagcgatgc gaccgcggat 420

accgatgcgg cgaccctgaa acaggtgaaa gaatatcgca ccaccctggt gggcgataac 480

gatattaccg cggcggatcg cagcggcggc accagcaacg gcattaccta taacctgagc 540

ctgaacaaag gcaccgtgag cgcgaccgaa gaaaaagtgg tgagcggcaa aaccgtgtat 600

gaagcgattc gcaacgcgat taccggcaac atttttacca ttggcctgga tgataccacc 660

ctgaacaaaa ttaacaaccc ggcggatcag gatctgagca acctgagcga aggcaaaagc 720

agcggcagcg gcagcgaaag caaaagcacc ggcctgatga aagatattga aggcgtgaac 780

agcattacct ttgataaaag cggccaggat ctgaaccagg tgaccggccg catgagcagc 840

gcgggcctga cctttaaaaa aggcgatacc accaacggca gcaccaccac ctttgcggaa 900

gatggcctga ccattgatag caccaccaac agcgcgcaga ccaacctggt gaaagtgagc 960

cgcgatggct ttagcgtgaa aaacggcagc gatgaaagca aactggcgag caccaaactg 1020

agcattggcg cggaaaacgc ggaacatgtg gaagtgacca aaagcggcat tgcgctgaaa 1080

gcggataaca ccagcgataa aagcagcatt accctggcgc aggatgcgat taccctggcg 1140

ggcaacgcga ccggcaccgc gattaaactg accggcgtgg cggatggcaa cattaccgtg 1200

aacagcaaag atgcggtgaa cggcggccag ctgcgcaccc tgctgggcgt ggatagcggc 1260

gcgaaaattg gcggcaccga aaaaaccacc attagcgaag cgattagcga tgtgaaacag 1320

gcgctgaccg atgcgaccct ggcgtataaa gcggataaca aaaacggcaa aaccgtgaaa 1380

ctgaccgatg gcctgaactt taccagcacc accaacattg atgcgagcgt ggaagataac 1440

ggcgtggtga aatttaccct gaaagataaa ctgaccggcc tgaaaaccat tgcgaccgaa 1500

agcctgaacg cgagccagaa cattattgcg ggcggcaccg tgaccgtggg cggcgaaacc 1560

gaaggcattg tgctgaccaa aagcggcagc ggcaacgatc gcaccctgag cctgagcggc 1620

gcgggcaacg cggcgaccga tggcattaaa gtgagcggcg tgaaagcggg caccgcggat 1680

accgatgcgg tgaacaaagg ccagctggat aaactgttta aagcgattaa cgatgcgctg 1740

ggcaccaccg atctggcggt gaccaaaaac ccgaaccaga ccagcatttt taacccgatt 1800

aacggcaccg cgccgaccac ctttaaagat gcggtggata aactgaccac cgcggtgaac 1860

accggctggg gcagcaaagt gggcattctg gcgaccggca ttcatcatca tcatcatcat 1920

taa 1923

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caggaaacag ctatgac 17

Claims

1.一种重组转移载体，其特征在于，是将编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的3个血清型融合蛋白rApg-ABC的基因与pFastBac I转移载体连接得到的；编码所述3个血清型融合蛋白rApg-ABC的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种重组杆状病毒，其特征在于，是将权利要求1所述重组转移载体转化感受态细胞，经培养获得重组杆粒，再将重组杆粒转染至昆虫细胞进行培养，从培养物中收获重组杆状病毒。

3.应用权利要求2所述重组杆状病毒制备重组抗原的方法，其特征在于，是将权利要求1或2所述重组转移载体转化感受态细胞，经培养获得重组杆粒，再将重组杆粒转染至昆虫细胞进行培养，从培养物中收获、纯化重组抗原。

4.应用权利要求3所述方法制备得到的重组抗原。

5.根据权利要求4所述的重组抗原，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

6.副鸡嗜血杆菌三价基因工程亚单位疫苗，其特征在于，包括权利要求4或5所述的重组抗原和疫苗佐剂。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述抗原为灭活的重组抗原。

8.根据权利要求6或7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中重组蛋白的含量在20～50μg/mL之间。

9.根据权利要求6或7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗佐剂为矿物油佐剂。

10.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗佐剂为矿物油佐剂。