CN102206258A - 甲型副伤寒沙门氏菌NmpC亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲型副伤寒沙门氏菌亚单位疫苗NmpC及其制备方法。该疫苗包括有效剂量的甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白NmpC以及疫苗佐剂。所述外膜蛋白NmpC的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述制备方法是通过体外表达获得外膜蛋白NmpC，再与疫苗佐剂混合获得。本发明生产成本低、目的蛋白产量高，这对于规模化生产NmpC亚单位疫苗及其预防甲型副伤寒沙门氏菌感染具有重要意义。

Description

甲型副伤寒沙门氏菌NmpC亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本文属于生物技术领域，涉及甲型副伤寒沙门氏菌亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

伤寒是一种急性传染病，包括伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)引起的伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门氏菌(Salmonellaparatyphi A，Band C)引起的副伤寒(C 2005)。患者常见的症状有：头痛、厌食、腹痛、便秘或腹泻、干咳、表情淡漠、嗜酸性粒细胞减少或消失，还可能出现咽喉痛、鼻出血、有舌苔等症状。没有获得及时治疗的患者会出现中毒现象，还可能发展到回肠穿孔、肠胃出血、昏迷、昏厥、肺炎、肾炎等。由于甲型副伤寒沙门氏菌临床耐药株以及多重耐药株广泛存在，致使甲型副伤寒暴发流行。因此，甲型副伤寒越来越成为包括中国在内的发展中国家危害人民群众健康的严重传染病之一。

近年来伤寒Vi多糖疫苗取代了传统的伤寒三联疫苗。但是因为甲型副伤寒沙门氏菌是无荚膜的革兰氏阴性菌，所以不能预防该菌引起的副伤寒。甲型副伤寒灭活疫苗由于副反应太大已停止使用，而尚无新的有效疫苗预防副伤寒。人群缺乏免疫力，普遍易感，防治形势十分严峻。为了快速、有效、经济地预防和控制副伤寒的大面积流行，研究有效的甲型副伤寒疫苗已成为控制疫情的当务之急。

甲型副伤寒沙门氏菌，其外膜蛋白在致病和刺激机体免疫应答方面起着非常重要的作用。因此，在研究和开发疫苗中，病原体的表面蛋白成为热点，其中NmpC蛋白引起了人们的关注。NmpC是细菌的孔道蛋白的一种，属于GBP(General Bacterial Porin)家族的一员。nmpC基因在大肠杆菌K-12中是一个沉默基因。当使用突变技术激活nmpC基因后，发现该孔道蛋白是与肽聚糖紧密相连的，表达NmpC蛋白能够引起细菌对一些噬菌体和大肠菌素的敏感度增加。同时，伤寒沙门氏菌孔道蛋白也具有良好的免疫原性，它能够刺激小鼠产生具有杀菌活性的抗孔道蛋白抗体。然而已知的NmpC种类较少，到目前为止，还没有将NmpC蛋白用于制备甲型副伤寒沙门氏菌疫苗的报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种新的甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白NmpC；

本发明的第二个目的在于提供该蛋白在制备甲型副伤寒沙门氏菌亚单位疫苗中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种甲型副伤寒沙门氏菌亚单位疫苗及其制备方法。

本发明甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白NmpC的氨基酸序列如SEQID No.2所示，实验表明，该蛋白具有良好的免疫保护性，可以用于制备预防或治疗甲型副伤寒的药物，尤其是疫苗。此外，由于NmpC具有免疫中和活性，还可以通过制备NmpC的特异性抗体来制备抗体药物。

本发明还提供用于编码NmpC的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因具有相同功能的核苷酸序列。本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞。

本发明还提供制备达甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白NmpC的方法，包括：将编码NmpC的基因克隆至表达载体，转化宿主菌，培养转化子，获得重组的目的蛋白。

所述的表达载体选自质粒pET30a及其适用于大肠杆菌系统的所有pET系列表达载体。

所述的大肠杆菌表达菌株选自E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLys、Origami或Rosetta。

述的转化用热休克转化，电转化或原生质体转化。

将所述的NmpC基因克隆至质粒pET30a，得到重组表达质粒，然后热休克法转化E.coli BL21(DE3)，经发酵培养、破菌、离心、柱层析纯化得到重组的NmpC重组蛋白。

在分发明的一个实施方案中，采用如下方法制备得到外膜蛋白NmpC：

(1)NmpC目的基因的获得：以甲型副伤寒沙门氏菌50973菌株的基因组作为模板，委托DNA合成公司合成引物NmpC-f和NmpC-r，用于扩增NmpC蛋白基因，并引入Nde I和Xho I酶切位点和6×His标签；

(2)重组表达菌NmpC-pET30a/BL21的构建：PCR得到的NmpC基因片段经双酶切后，与同样经过双酶切的pET30a连接，连接产物通过热休克法转化用CaCl₂制备的E.coli DH5α。鉴定重组正确后，再将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)以用于诱导表达NmpC蛋白；

(3)NmpC蛋白的诱导表达：挑取重组工程菌NmpC-pET30a/BL21单菌落接种到Kan⁺-LB培养液中，用IPTG诱导表达。诱导结束后取适量样品进行SDS-PAGE检测，并用anti-his作为一抗Western blot进行鉴定；

(4)重组工程菌NmpC-pET30a/BL21的大量培养：在1L三角瓶中对重组工程菌进行大量诱导表达。确定目的蛋白的表达形式，并计算目标蛋白的表达率；

(5)NmpC包涵体的制备：采用超声的方式破菌，经离心的方法制得包涵体；

(6)NmpC蛋白的纯化和复性：选择GE公司的Ni亲和预装柱进行纯化。4℃下，采用梯度透析复性的方法对已纯化好变性蛋白复性。

此外，还进一步进行NmpC蛋白的动物免疫来确定NmpC的免疫效果，包括步骤：用NmpC蛋白联合铝佐剂免疫BALB/c小鼠，并采用野生型甲型副伤寒沙门氏菌攻毒小鼠，ELISA方法测血清总IgG抗体及统计候选疫苗的保护率，评价该疫苗的免疫效果。

本发明还提供一种甲型副伤寒沙门氏菌亚单位疫苗，其包括甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白NmpC以及疫苗佐剂，所述疫苗佐剂可以是铝佐剂或弗氏佐剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)针对甲型副伤寒沙门氏菌疫苗的临床试验中，国内外基本上没有单独使用NmpC蛋白的相关报道。本发明使用NmpC作为亚单位疫苗的主要组分，利用大肠杆菌系统获得了高效表达。

(2)基因工程手段构建的重组NmpC蛋白不含较大的融合标签，只含有一个6×His标签便于后期纯化操作。此标签基本上不会影响NmpC蛋白本身的免疫原性。

(3)在大肠杆菌中表达甲型副伤寒沙门氏菌的NmpC蛋白，可以提高蛋白疫苗的表达水平。由于大肠杆菌结构简单、生长快速、易于培养和发酵、生产成本低、目的蛋白产量高，这对于规模化生产及其临床应用具有重要的现实意义。

附图说明

图1是PCR获得目的片段(M：DNA Marker DL2000；1：阴性对照；2：NmpC基因片段)

图2是重组质粒NmpC-pET30a双酶切鉴定(M：DNA Marker DL2000；1：NmpC-pET30a的Nde I和Xho I双酶切)；

图3是SDS-PAGE检测重组NmpC的表达(M：蛋白分子量标准；1：诱导后的pET30a/BL21；2：诱导后的NmpC-pET30a/BL21)；

图4是Western blot检测重组NmpC(M：蛋白分子量标准；1：重组NmpC蛋白)；

图5是SDS-PAGE检测NmpC蛋白的纯化结果(M：蛋白分子量标准；1∶100mM咪唑洗脱峰)；

图6是铝佐剂免疫后不同时间小鼠血清中NmpC蛋白特异性IgG变化曲线。

具体实施方式

下面结合具体附图，用本发明的实施例进一步阐述本发明。但不以此来限制本发明。本发明中的实施例以E.coli BL21(DE3)及其表达载体pET30a进行表达甲型副伤寒沙门氏菌膜蛋白NmpC来说明。大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLys、Origami或Rosetta以及其他大肠杆菌系统的pET系列表达载体也同样适用。

在本实施例中，仅以铝佐剂为例，来说明本发明重组蛋白的免疫过程，但并不局限于该佐剂，弗氏佐剂也在实施例的范围之内。

实施例1：甲型副伤寒沙门氏菌膜蛋白NmpC的制备

1、甲型副伤寒沙门氏菌膜蛋白NmpC基因的获得

以甲型副伤寒沙门氏菌50973菌株(来源于：中国医学细菌保藏管理中心)的基因组作为模板，委托DNA合成公司合成上下游引物

NmpC-f：5’-GGGAATTCCATATGGCCGAGGTATATAACAAAGACG-3’；

NmpC-r：5’-CCGCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAACTGGTAGTTCAGACCA-3’。

其中，NmpC-f、NmpC-r用于扩增NmpC蛋白基因，并引入NdeI和Xho I酶切位点和6×His标签。使用Taq plus酶进行PCR扩增：94℃10min预变性；30个循环(94℃30s，52℃30s，72℃1min)；72℃7min。用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。

2、重组表达载体NmpC-pET30a的构建

NmpC基因纯化后分别用Nde I和Xho I于37℃酶切3小时，回收纯化片段，与纯化的表达载体pET30a双酶切产物用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，连接产物通过热休克法转化用CaCl₂制备的E.coli DH5α，涂布Kan⁺-LB平板，37℃培养16小时，挑取数个单菌落接种Kan⁺-LB培养液，37℃振荡培养12小时，碱裂解法抽提质粒，Nde I和Xho I双酶切质粒鉴定含有预期大小的NmpC基因，并且通过专业DNA测序公司测序结果序列正确。构建正确的重组质粒采用上述方法再次转化E.coli BL21(DE3)用于诱导表达NmpC蛋白。

3、NmpC蛋白的诱导表达

分别挑取重组工程菌NmpC-pET30a/BL21单菌落接种到Kan⁺-LB培养液中，37℃震荡培养过夜，第二天按1％分别接种到新鲜Kan⁺-LB培养液中，37℃震荡培养至OD₆₀₀约为0.8时，分别加入0.5mmol IPTG在37℃诱导表达4小时。诱导结束后取适量样品进行SDS-PAGE检测，并用anti-his作为一抗Western blot鉴定。结果表明：NmpC蛋白的表观分子量是39.3KDa，与理论计算值基本一致。

4、重组工程菌NmpC-pET30a/BL21大量培养

控制菌液OD600值约为0.8时，加入1mmol/L IPTG，温度37℃，培养4小时。目标蛋白的表达率超过全菌蛋白的40％，以包涵体表达形式。

5、NmpC包涵体的制备

诱导后的菌液6000rpm离心10min，菌沉淀以Tris缓冲液(0.02mol/L Tris-Cl)重悬，冰水浴超声破菌(破菌功率100W，工作5s，暂停10s，100次)。超声后液体经12000g离心后，所得12000g离心沉淀即为NmpC包涵体。

6、NmpC蛋白的纯化和复性

选择GE公司的Ni亲和预装柱对包涵体进行纯化。包涵体用变性液(0.02mol/L Tris-Cl，8M尿素，0.02mol/L咪唑，pH8.0)变性，然后用洗涤缓冲液(0.02mol/L Tris-Cl，8M尿素，0.02mol/L咪唑，pH8.0)洗涤杂蛋白，最后再使用洗脱缓冲液(0.02mol/L Tris-Cl，8M尿素，0.1mol/L咪唑，pH8.0)洗脱目的蛋白，SDS-PAGE检测，纯化蛋白纯度超过90％；纯化后的蛋白采用梯度透析的方法进行复性，4℃下，分别在不同浓度的尿素透析液(0.02mol/L Tris-Cl，8M-6M-4M-2M-0M尿素，pH8.0)中静置透析，每个梯度保持12h，最后再透到缓冲液(0.02mol/L Tris-Cl，pH8.0)中。

实施例2：NmpC蛋白的动物免疫实验

1、动物免疫

BALB/c小鼠分成3组，每组20只，其中10只采血，10只攻毒。采用肌肉注射的方式，分别在0，2，4周进行免疫。A组为健康小鼠；B组使用铝佐剂；C组使用NmpC蛋白+铝佐剂。免疫剂量为每只小鼠0.2ml，含有抗原10μg铝佐剂0.2mg。在每次免疫后10天，进行血清采集。第一，二次采用眼角静脉丛采血，第三次采用摘眼球采血。使用ELISA方法测血清总IgG抗体，并用SPSS软件分析各组数据的组间差异性。结果表明：小鼠抗NmpC蛋白的IgG抗体效价很高。

2、攻毒保护实验

将同批次饲养注射了铝佐剂的BALB/c小鼠40只分为4组，每组10只。用生理盐水将培养好的甲型副伤寒沙门氏菌50973洗下，混匀后，比浊确定菌浓度。而后用浓度分别为60，30，15，7.5亿/ml四个浓度的菌液攻毒，每只小鼠0.5ml，腹腔注射。三天后记录小鼠的死亡情况，确定最小绝对致死量。

表1病原菌在Balb/C小鼠感染模型中最小绝对致死量的确定

注：以死亡率达到100％的最小菌浓度为最小绝对致死量

由表1可知，以30亿/ml菌液浓度进行攻毒时小鼠全部死亡，因此确定30亿/ml菌液浓度为最小绝对致死量。在最后一次免疫后10天，以最小绝对致死量剂量，对实验组进行攻毒实验，三天后记录小鼠的死亡情况，确定蛋白NmpC的保护率。

表2病原菌对免疫过的Balb/C小鼠攻毒实验结果

注：病原菌以最小绝对致死量(30亿/ml)对Balb/C小鼠进行攻毒

从表2可以看出，攻毒后，空白对照及佐剂组小鼠全部死亡，NmpC蛋白死亡3只，免疫保护率为70％。

动物实验结果表明，NmpC重组融合蛋白具有良好的免疫原性。后期攻毒实验则证明该融合蛋白具有良好的免疫保护力。

Claims (10)

1.一种甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白NmpC，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.编码权利要求1所述外膜蛋白NmpC的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.权利要求1所述外膜蛋白NmpC在制备预防或治疗甲型副伤寒疫苗中的应用。

5.甲型副伤寒沙门氏菌NmpC亚单位疫苗，其包括有效剂量的权利要求1所述的外膜蛋白NmpC以及疫苗佐剂。

6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗佐剂为铝佐剂或费氏佐剂。

7.一种制备权利要求1所述外膜蛋白NmpC的方法，其包括步骤：将权利要求2所述的基因克隆至表达载体，转化宿主菌，培养转化子，获得重组的目的蛋白。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLys、Origami或Rosetta，所述表达载体为适用于在所述宿主菌表达系统中的表达载体。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于包括如下步骤：将所述的NmpC基因克隆至质粒pET30a，得到重组表达质粒，然后热休克法转化E.coli BL21(DE3)，经发酵培养、破菌、离心、柱层析纯化得到重组的NmpC重组蛋白。

10.一种制备权利要求5所述疫苗的方法，其包括将采用权利要求7～9所述的方法制备外膜蛋白NmpC，并将其与适量免疫佐剂混合。

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