CN102311957A - 羊包虫可溶性抗原的制备方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备羊包虫可溶性抗原的方法及其产品，其制备方法包括：将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的基因在昆虫生物反应器或毕赤酵母生物反应器中进行表达；收集、纯化所表达的抗原，即得。本发明方法采用家蚕生物反应器或毕赤酵母生物反应器制备羊包虫抗原，其产物是可溶性的，免疫学实验证明其抗原性良好，单位表达量分别比大肠杆菌的量要高10-100倍，动物实验证明其具有很好的减虫效率。本发明方法可以大幅度降低羊包虫抗原的生产成本，简化了以前用大肠杆菌生产抗原的纯化过程，具有安全、高效、成本低等诸多优点。

Description

羊包虫可溶性抗原的制备方法及其产品

技术领域

本发明涉及抗原的制备方法，尤其涉及羊包虫可溶性抗原的制备方法以及由该制备方法所制备得到的产品，属于羊包虫基因工程疫苗领域。

背景技术

绵羊的棘球蚴病俗称包虫病(Hydatidosis，)，又被称为棘球蚴病或囊型包虫病(cystic echinococcosis；CE)。是由棘球属的细粒棘球绦虫(俗称羊包虫)(Echinococcus granulosus)或多房棘球绦虫(E.multilocularis)的幼虫感染绵羊所引起一种人兽共患病。它是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus；Eg)的续绦期幼虫寄生在人体肝、肺等脏器引起的一种严重危害健康的人畜共患寄生虫病，是中国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。患者以儿童和青壮年居多，在人体内生长缓慢，往往在感染后5～10年才出现症状，其主要危害为压迫所寄生的器官、破坏周围组织和毒性作用。一旦棘球蚴囊膜破裂，可引起继发性感染或休克，甚至死亡。

CE呈世界性分布，主要是流行于高原和气候寒冷的牧区和半牧区，在国外主要流行于欧洲的俄罗斯、南斯拉夫、法国、德国和英国，南美洲的阿根廷、巴西、智利，大洋洲的澳大利亚和新西兰，亚洲的中国、蒙古、日本、印度、土耳其、土库曼斯坦、伊拉克等国家，另外在非洲的埃及和摩洛哥等国家也有流行；在我国，细粒棘球绦虫的危害非常严重，现已证实全国有31个省市区存在包虫病感染病例，主要流行于西北的新疆、青海、甘肃、宁夏、西藏以及陕西、山西、河北和四川西部等省区，高发区约占到全国面积的44％(余森海，中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2008年，26(4)：241-44)。

家犬是棘球绦虫病主要的传染源和终宿主，平均感染率为35％。感染的家犬在排出成熟节片及大量虫卵时，污染草地、水源、家居环境，或附着在其毛皮上，食草动物和人均因食入虫卵而被感染。作为中间宿主，人和10余种家畜可被感染，其中人的平均感染率为23.0％、绵羊的平均感染率约为64％、牛55％、猪13％(卫生部，2006-2015年全国重点寄生虫病防治法规，疾控发(2006)107号，2006，3)。据有关报道，我国有100多万包虫病现症患者，受威胁人口约5000万，包虫病畜超过4000万头，每年发病牲畜达800多万头，年经济损失超过10亿元，该病已成为西部牧区群众因病致贫、因病返贫的主要原因。

随着现代社会的发展，人口流动的增加，宠物犬和经济动物狐狸的养殖数量日益增多，导致包虫病蔓延扩散(李文桂，中国人兽共患病学报，2006，22(11)：1070-72)。另外据近年普查，全国有25个省市区有该病的散发病例报道，2005年《全国人体重要寄生虫病现状调查》的结果可知，流行区人群的血清学阳性率为1.06％～32％，人群患病率在0.6％～4.5％之间，绵羊的棘球蚴感染率在3.3％～90％之间，家犬的成虫感染率在7％～71％之间，该病有从牧业区向农业区和城市扩散的趋势，极大地危害着人群的身体健康和畜牧业的发展，CE已成为我国乃至世界的一种危害严重的寄生虫病。

细粒棘球绦虫Eg属于扁形动物门、绦虫纲、多节亚纲、圆叶目、带科、棘球属，它与多房棘球绦虫、少节棘球绦虫和福氏棘球绦虫等是目前已经被学者确认的四种棘球绦虫。它的幼虫称棘球蚴(hydatid cyst)，为圆型或不规则的囊状体，由囊壁、生发囊、原头蚴、囊砂和囊液组成，有的还有子囊和孙囊，囊壁外由宿主的纤维组织包绕。Lightowlers等发现Eg95是一种分子量为24.5kDa的天然六钩蚴抗原。其编码基因全长715bp，其中462bp基因可编码分子量为16.5kDa的含153个氨基酸的蛋白质。氨基酸序列分析发现Eg95蛋白含纤连蛋白III型结构域，与免疫球蛋白超家族、细胞粘附分子、细胞表面受体和糖结合蛋白有部分同源性，在Eg六钩蚴入侵小肠绒毛上皮的过程中起重要作用。Woollard等用肽指纹图分析发现Eg95抗原分子呈线形，含有4个免疫显性区域，分别为2条20和40个氨基酸的序列肽(Peterson SN等，Proc Natl Acad SciUSA，1995，92(25)：11829-11833)。

包虫病的防治已经作为衡量一个国家经济发展水平和文明程度的重要指标，目前我国的寄生虫感染情况不容乐观，只相当于日本和韩国20世纪60年代到80年代的感染水平，与我国目前的社会经济的发展速度大不相适应。常用的防治手段有：

1、健康教育和药物与外科手术治疗

健康教育是预防CE的根本措施，已发CE病例的首选治疗方法仍是外科手术，但对人体损伤较大；对于早期小棘球蚴或难做手术的病例可采用阿苯哒唑或甲苯咪唑等药物进行化疗，临床发现这些药物存在严重的毒副作用，部分患者不能耐受，同时某些化疗患者可产生耐药性，而且在发展中国家效果较差，因此这就需要研究更有效的防治措施。

2细粒棘球绦虫Eg疫苗的疫苗防治

近年来，分子生物学、蛋白组学、细胞学、免疫学等的研究突飞猛进，尤其是分子生物学的快速发展促进了寄生虫免疫应答和免疫诊断的研究，为研制理想的eg疫苗提供了新方法。细粒棘球绦虫Eg疫苗相应的抗原主要有特异性诊断抗原和保护性抗原，其中与诊断有关的抗原主要有天然抗原和重组抗原及合成肽，与保护性相关的抗原主要有寄生虫免疫原和分子疫苗。用于疫苗防治的抗原主要有寄生虫免疫原、基因工程抗原和多肽抗原等。

寄生虫免疫原：主要包括原头蚴、囊液和囊肿膜，六钩蚴或虫卵、成虫或成虫分泌物等。张文宝1999年用细粒棘球绦虫原头蚴匀浆可溶性抗原一次接种犬，孕节抑制率为74.1％，三次接种犬，其孕节抑制率达100％，也取得了相同的结果，这一点在流行病学上具有重要的意义，因为抑制了虫卵的产生也就切断了病原的生活史(张文宝等，中国兽医科技，1999，29(9)：23～24)。经包虫囊液免疫的羊用细粒棘球绦虫卵攻击感染时，羊的包虫囊数明显减少，但感染率则与对照组相似(贾世玉等，中国兽医杂志，1994，20(11)：40-45)。曾用囊液注射和囊肿膜诱发免疫都显示了一定的免疫效果，又用六钩蚴接种绵羊后，用细粒棘球绦虫幼虫卵攻击，结果表明免疫的绵羊都具有了坚强的抵抗力(Heath DD.In“Immunology of Echinococus”，Edited by Thompson，The Biology of Echinococcus and Hydatid Disease.George Allen & UnwiLondon，1986.164-188)。虽然六钩蚴及排泄分泌抗原是免疫防治理想的抗原，但是其工艺化生产相当困难，来源极其有限，很难在免疫防治中大规模使用。Heath用棘球绦虫虫体的冻干粉注射幼犬，与对照组比较后其体内平均虫数大为减少，说明成虫和成虫分泌物抗原均能使犬获得不同程度的保护。

基因工程抗原：主要是指基因工程重组抗原疫苗、核酸疫苗以及多肽疫苗。Fraize M表达了Eg幼虫期的两种抗原EgA31和EgTrp，试验证明了这两种抗原单独使用或混合使用都使小鼠获得了免疫应答(Heath，DD.The use of aRecombinant Antigen to immunize Sheep against Echinococcus granulosus，Procedings of the Intemational Congress of Hydatidology.Beijing，1993，10-13)。1993年首次研制成功抗细粒棘球绦虫虫卵感染的基因工程重组抗原疫苗，命名为Eg95，动物试验使二免后的试验羊获得了95％以上的免疫保护(LightowlersMW等，Parasite Immunol.1996，Sep；18(9)：457-62)，它是棘球蚴病最具有发展前途的疫苗。

多肽抗原是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗。由于多肽疫苗完全是人工合成的，不存在毒力返祖或灭活不完全的问题，特别是对一些还不能通过体外培养方式获得足够抗原量的病原体具有重要意义，多肽疫苗必将成为一种新型疫苗，在未来得到广泛的应用。研究表明位于棘球蚴病重组抗原疫苗Eg95的cDNA克隆5’端的9个核苷酸所编码的多肽片段为宿主保护性抗原表位(贾万忠等，中国兽医寄生虫病[J]，1998，6(4)：49-50)。但合成的Eg95表位的四条肽，分别与白喉类毒素(DT)偶联成偶联肽，加福氏佐剂后免疫小羊，后用Eg活虫灌胃攻击。结果表明，Eg95的4个合成肽具有免疫原性，但不能诱导小羊产生保护性免疫反应。

细粒棘球绦虫的传染途径：

细粒棘球绦虫长仅1.5～6mm由一个头节和3个体节组成。成虫寄生于狗的小肠内，但狼狐、豺等野生动物亦可为其终宿主。虫卵呈圆形有双层胚膜，其形态与带绦虫虫卵相似，对外界抵抗力较强。当虫卵随狗粪便排出体外，污染牧场、畜舍蔬菜、土壤和饮水，被人或羊等其他中间宿主吞食后经胃而入十二指肠。经消化液的作用，六钩蚴脱壳而出钻入肠壁，随血循环进入门静脉系统，幼虫大部被阻于肝脏发育成包虫囊(棘球蚴)；部分可逸出而至肺部或经肺而散布于全身各器官发育为包虫囊。狗吞食含有包虫囊的羊或其他中间宿主的内脏后，原头蚴进入小肠肠壁隐窝内发育为成虫(约经7～8周)而完成其生活史。从其生活史来看，羊是最重要的中间宿主，如果能够阻断细粒棘球绦虫在终宿主犬与中间宿主羊等之间的传染环节，那么人接触感染细粒棘球绦虫的可能性也大大降低，这是最有效的降低人和经济动物感染细粒棘球绦虫的防治方法。

由于家蚕生物反应器和毕赤酵母生物反应器分别具有以下优点和大量的基因工程表达产物的成功表达实例：

家蚕生物反应器与大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统相比具有以下有优点：

A：家蚕杆状病毒载体表达系统表达效率高是区别于其它真核表达系统的明显特征，据报道，在感染细胞中重组蛋白的表达水平最高可达到细胞总蛋白的50％。而且它表达产物具有很高的生物活性和可溶性，其抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似。

B：家蚕杆状病毒能容纳较大的外源基因而不影响其本身的增殖。杆状的衣壳与较大的基因组(约130kb)可容纳较大片段的DNA插入(约10kb)，因此可同时插入多个外源基因，可形成病毒样颗粒(virus-like particle；VLP)，提高疫苗的免疫活性。

C：应用晚晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因，即使重组基因产物对细胞有毒性，也不影响表达水平。

D：借多元表达载体或借几个不同重组病毒共感染，可以同时表达2个或更多个外源蛋白，研究肽链超分子装配以及蛋白寡聚体的结构与功能。

E：杆状病毒对脊椎动物无病原性，家蚕没有与人畜共患的疾病，被认为遗传学上是安全的表达载体。

动物疾病的免疫疫苗和治疗药物的研究和开发随着家蚕生物反应器的成熟也越来越受到重视。如口蹄疫病毒的空衣壳表达、狂犬病的N、P、N-P的联合表达均已获得了我国农业部遗传工程安全生产委员会颁发的商品化生产许可证。

1997年，田鄂等(生物化学与生物物理学报，1997，29(1)：33-38)在家蚕细胞和幼虫中成功表达了日本血吸虫中国大陆株28KD谷胱甘肽S-转移酶基因，在家蚕培养细胞(10⁶个/mL)中的表达产量为0.77mg，在家蚕幼虫中则超过5mg/条蚕。

日本国家动物卫生研究所的研究人员利用家蚕表达体系对猪的细胞因子，包括IL系列、GM-CSF、TNF及其受体、Caspase等进行了系统深入的基础和开发研究，用BmNPV体系生产的宠物(猫和狗)的预防重组IL制剂(Intercat)最近已由日本“TORAY”株式会社生产并投入市场(木村滋，昆虫生物工厂[M]，日本：工业调查会，2000，124-127)。

巴斯德毕赤酵母表达系统具有以下优点：高表达量：由于醇氧化酶基因启动子是强启动子，细胞生长速度很快，所以该表达系统表达的外源蛋白产量很高；高稳定性：外源基因通过质粒整合到基因组上，基因工程菌株遗传稳定性好；胞内表达蛋白的分选和区域化，增加了表达蛋白的稳定性，减少表达产物对宿主菌的毒害作用；高分泌：酿酒酵母中一些分泌信号和先导序列(如α因子)的分子生物学特性已经研究的十分清楚，可用于巴斯德毕赤酵母表达系统，加之它自身的生物学特性，其分泌表达可达10g/L，这在已知的分泌表达系统中十分少见；易放大：巴斯德毕赤酵母容易适应重组蛋白的大规模发酵生产，重组蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达已在1000L发酵罐中实现工业化生产；具有生物活性：作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；便于纯化：表达的外源蛋白可分泌到胞外，分泌的内源蛋白少，外源蛋白分离纯化简便；糖基化程度低：P.pastoris不产生过度的糖基化，且糖基化位点与哺乳类细胞的相同，其所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。成本较低：该酵母菌营养要求低、生长快、培养基廉价，易于进行操作和培养；其高密度发酵技术业已成熟，便于工业化生产。

近年来，已有300多种外源蛋白在该系统中得到表达，如乙肝疫苗及一些来自动植物和微生物的各种酶、膜受体蛋白、抗原和抗体及一些用来研究晶体结构的蛋白等。

虽然羊包虫对阿笨达唑和甲苯咪唑等的苯并咪唑类化合物敏感，但是对于动物来说长期给药无疑在劳力和经济效益上都是不合算的，此外大量的无主犬或其它犬科野生动物的感染和传播，很难从根本上防止羊的感染，因此迫切需要能有一种长期有效的疫苗能防治中间宿主羊，以阻断羊包虫的生活史循环，达到防治的目的。

大量的研究证明源自于羊包虫(E.granulosus)的Eg95基因是目前为止研发的最有效的防止绵羊羊包虫的抗原组分，为了改善Eg95的表达性能，它和源自日本血吸虫的具有谷胱甘肽-S-转移酶活力的蛋白抗原sj26进行联合表达，以期待改善其表达量与表达产物的可信性，然而即使如此sj-GST-eg95的表达产物在大肠杆菌中绝大部分仍以不可溶的包涵体形式存在。在制备疫苗时，仍需要用高浓度尿素溶解，这不仅由于重复的变性复性，不仅导致其抗原性降低而且也大大增加了抗原的生产成本。为了提高其免疫源性还需要用Quil-A作为佐剂，因此，每剂疫苗需要高达50μg的抗原量，导致生产成本居高不下，极大地限制了其推广应用(Lightowlers，Parasitology，2006，S27-S42)，此外，GST虽然是一个很好的免疫佐剂，本身也有很好的增加免疫效果(Scott JC，Parasitol.Int.，2000，49(4)：289-300)，但是源自于日本血吸虫的GST对羊包虫的疫苗效果远远不及源自于羊包虫自身的GST。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种羊包虫可溶性抗原的制备方法，该制备方法采用真核生物表达系统，在昆虫体内或毕赤酵母表达系统进行安全、高效、分泌型的表达羊包虫可溶性的抗原或融合抗原。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种制备羊包虫可溶性抗原的方法，包括：将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID N0：5所示的基因在昆虫生物反应器或毕赤酵母生物反应器中进行表达；收集、纯化所表达的抗原，即得。

优选的，一种制备羊包虫可溶性抗原的方法，包括：(1)将SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的基因分别克隆到杆状病毒运载载体中，获得转移载体；(2)用所获得的转移载体DNA与杆状病毒基因组DNA共转染进昆虫细胞，进行DNA同源重组，经过重组病毒筛选、克隆纯化获得重组杆状病毒；(3)用重组杆状病毒感染昆虫宿主和细胞；培养被感染的昆虫宿主；收获并纯化所表达的抗原，即得。

其中，所述的杆状病毒运载载体的所用表达盒的启动子为多角体蛋白，p10，ie-1等及与增强子组合，优选自pBm034，pBm93，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，pVL1391，pVL 1392，pVL 1393，pVL941，pVL 945，pVL 985，pVTBac，pBm030，pUAC-5或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体，更优选为pBm93。

所述的杆状病毒优选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV或SpltNPV；更优选为家蚕杆状病毒Bm-NPV-ZJ8；

所述的重组杆状病毒优选为以下任意一种：(1)用于表达SEQ ID NO：1基因(羊包虫eg95抗原蛋白)的重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV(eg95)，其微生物保藏号是：CGMCC No.3981；分类命名是：家蚕核型多角体病毒(BombyxMori Nucleopolyhedrovirus)；保藏时间是：2010年7月2日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。(2)用于表达SEQ ID NO：3基因(eg-95和来自于日本血吸虫的sj-GST(谷胱甘肽-S-转移酶)融合的融合蛋白)的重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV(sj-GST-eg95)；其微生物保藏号是：CGMCC No.3959；分类命名是：家蚕核型多角体病毒(Bombyx MoriNucleopolyhedrovirus)；保藏时间是：2010年7月2日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。(3)用于表达SEQ ID NO：5基因(eg-95和来自于羊包虫本身的eg-GST(谷胱甘肽-S-转移酶)融合的融合蛋白)的重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV(eg-GST-eg95)；其微生物保藏号是：CGMCC No.3960；分类命名是：家蚕核型多角体病毒(Bombyx MoriNucleopolyhedrovirus)；保藏时间是：2010年7月2日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述的昆虫宿主选自包括家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyxmandarina)、蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricim)、樟蚕(Dictyoplocajapanica)、樗蚕(Philosamia cynthia pryeri)、柞蚕(Antheraeapernyi)、日本柞蚕(Antheraea yamamai)、野天蚕(Antheraeapolyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropisobliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾(Spodopteralittoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothis virescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)、舞毒蛾(Lymantria dispar)等；更优选为家蚕(Bombyx mori)。

所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体；更优选为：将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种5龄起蚕的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集含各种羊包虫抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆；其中，所述的蛹体为1-2天的早期嫩蛹。

本发明采用基因重组技术，将来源于羊包虫的不同抗原基因组合包括SEQID NO：1(eg95)、SEQ ID NO：3(sj-GST-eg95)或SEQ ID NO：5(eg-GST-eg95)构建到各种由启动子为多角体蛋白，p10，ie-1等及与增强子组合所驱动的杆状病毒表达所用表达盒的杆状病毒表达转移运载载体(如选自pBm034，pBm93，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，pVL1391，pVL 1392，pVL 1393，pVL941，pVL 945，pVL 985，pVTBac，pBm030，pUAC-5)上，使羊包虫不同的抗原基因组合在多角体启动子、p10启动子或别的病毒和真核生物的强启动子控制之下，通过体内或体外(in vivo/in vitro)重组，将羊包虫抗原不同的基因组合通过同源重组或转座子介导整合到杆状病毒的基因组上，通过多轮的筛选和纯化，得到重组病毒。重组病毒可通过经口食下或采用各种手段透过表皮感染1-5龄(最优时间为四或五龄起蚕)的昆虫幼虫或蛹体(最优时间为1-2天的早期嫩蛹)，表达生产各种狂犬病病毒抗原。

本发明中最优选的一个技术方案是：将SEQ ID NO：1(eg95)、SEQ IDNO：3(sj-GST-eg95)或SEQ ID NO：5(eg-GST-eg95)所示的基因插入到运载载体pBm93上，为了在真核生物昆虫中得到可溶性的高效表达，避免昆虫自身的蛋白酶降解表达的融合抗原蛋白，上述SEQ ID NO：5(eg-GST-eg95)或SEQID NO：3(sj-GST-eg95)所示的基因序列中，将在大肠杆菌中表达的pGEX(Lightowlers MW等，Parasite Immunol.1996 Sep；18(9)：457-62)系列载体中的蛋白酶酶切位点通过融合PCR的方法将之去除，再通过体内重组将SEQID NO：1(eg95)、SEQ ID NO：3(sj-GST-eg95)或SEQ ID NO：5(eg-GST-eg95)所示的基因分别通过同源重组转移到家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8的基因组上，敲除掉基因组上的Polyhedrin基因，通过反复多轮的空斑筛选技术和PCR检测技术确证重组病毒的正确性，获得携带羊包虫不同基因组合的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(eg95)、rBmNPV(eg-GST-eg95)、rBmNPV(sj-GST-eg95)。将其感染家蚕细胞系或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，大量繁殖rBmNPV(eg95)、rBmNPV(eg-GST-eg95)、rBmNPV(sj-GST-eg95)。当rBmNPV(eg95)、rBmNPV(eg-GST-eg95)、rBmNPV(sj-GST-eg95)在蚕体内开始复制后，在多角体蛋白基因(polh)启动子控制下eg95、sj-GST-eg95、eg-GST-eg95等开始大量表达，产生相应的羊包虫抗原蛋白，由于发现上述重组病毒在昆虫体内的脂肪体内优先表达，当大量病毒复制和羊包虫抗原蛋白表达后，脂肪体组织和细胞破裂，抗原蛋白随之释放到昆虫的体液中，加之eg95、sj-GST-eg95、eg-GST-eg95这些基因中没有与膜能结合的结构域，因此所得到的蛋白质均为可溶性的抗原蛋白。在感染3-6天(最佳为5天，25度饲养温度)后收集含羊包虫抗原的家蚕幼虫或蛹的体液(或整体匀浆)，每毫升蚕血淋巴可产生2毫克以上的相应的羊包虫抗原，杀灭感染性昆虫病毒和其它可能的微生物后，上述抗原蛋白经过纯化后便得到安全、高效、可溶性的羊包虫抗原，此种家蚕生物反应器生产的可溶性抗原经可用于制备预防羊包虫的疫苗。

另外一种制备羊包虫可溶性抗原的方法，包括：(1)将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的基因分别克隆到毕赤酵母表达载体中，获得表达质粒；(2)先将所获得的表达质粒DNA进行线性化，转化酵母的感受态细胞，在酵母细胞内进行DNA同源重组进行双交换，获得大量的重组酵母，筛选得到最高表达的重组酵母；(2)将所获得的重组酵母进行发酵(经过高密度发酵技术，相应的羊包虫抗原蛋白在信号肽的引导下，分泌到酵母细胞外)收获发酵的上清液，纯化即得所表达和分泌的可溶性羊包虫抗原。

其中，步骤(1)中所述的毕赤酵母表达载体优选为分泌型毕赤酵母表达载体，例如。可选自pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1p、YAM7SP6或pGAPZa等分泌型表达载体，更优先是pPIC9；所获得的表达质粒优选为pPIC9(si-GST-eg95)、pPIC9(eg-GST-eg95)或pPIC9(eg95)；

步骤(2)中所述的重组酵母优选为以下任意一种：(1)用于表达SEQ IDNO：1基因(羊包虫eg95抗原蛋白)的重组酵母PC(eg95)，其微生物保藏号是：CGMCC No.3976；分类命名是：巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；保藏时间是：2010年7月2日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。(2)用于表达SEQ ID NO：3基因的重组酵母PC(Si-GST-eg95)，其微生物保藏号是：CGMCC No.3978；分类命名是：巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)；保藏时间是：2010年7月2日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。(3)用于表达SEQ ID NO：5基因的重组酵母PC(eg-GST-eg95)，其微生物保藏号是：CGMCC No.3977；分类命名是：巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；保藏时间是：2010年7月2日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

上述方法中一个整体最优选的一个技术方案是：将SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：5所示的基因分别插入到毕赤酵母的分泌型表达载体pPIC9中，分别得到表达质粒pPIC9(eg95)、pPIC9(sj-GST-eg95)和pPIC9(eg-GST-eg95)；为了在真核生物毕赤酵母中得到可溶性的高效表达，避免宿主毕赤酵母的蛋白酶降解表达的融合抗原蛋白，上述SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5所示的基因中，将在大肠杆菌中表达的pGEX(Lightowlers MW等，Parasite Immunol.1996 Sep；18(9)：457-62)系列载体中的蛋白酶酶切位点通过融合PCR的方法将之去除。将表达质粒pPIC9(eg-GST-eg95)、pPIC9(si-GST-eg95)或pPIC9(eg95)DNA分别用限制性内切酶Bgl II酶切进行线性化处理，证明其酶切完全后，用于电转化酵母细胞。

在毕赤酵母细胞体内，线性化的表达质粒的DNA，通过体内同源重组的双交换或单交换将全长的si-GST-eg95、eg-GST-eg95或eg95基因分别整合到酵母的基因组中，导致毕赤酵母基因组内AOX1基因被表达单元所替换，整合到强启动子PAOX1下游，得分泌性表达重组毕赤酵母pC(eg-GST-eg95)和pC(si-GST-eg95)或pC(eg95)，以获得高效表达；用PCR的方法鉴定出大量重组子；利用甲醇大批量诱导重组的毕赤酵母以在酵母培养基中检测表达目的蛋白Si-GST-eg95、Eg-GST-eg95或eg95，将表达后的菌液进行离心，取上清液用于ELISA检测。以原核表达得到的融合蛋白免疫家兔之后得到的兔血清抗体作为第一抗体，以HRP标记的羊抗兔抗体为第二抗体，以包被液作为空白对照，以未转重组质粒但经过同样诱导的酵母作为阴性对照，各通过筛选1000个以上的重组子，获得高表达、高分泌型的毕赤酵母重组子，在发酵罐中进行高密度发酵，得到可溶性的羊包虫的融合抗原，经初步纯化，可用于制备羊包虫抗体。

本发明方法在家蚕生物反应器和毕赤酵母生物反应器中生产可溶性的羊包虫抗原，表达量是同体积的大肠杆菌生产量的10-100倍，同时改进了融合抗原的基因结构，使得其抗原性得到了极大的提高，加之生产的抗原均为可溶性的，生产中不需要经过高浓度的尿素变性和随之的复性过程，佐剂也不需要用进口的专用佐剂Quil-A，这样抗原的生产和疫苗制备的加工成本得到了极大的下降。由于家蚕已经被我国卫生部批准为食药兼用昆虫，所以将本发明方法所制备的抗原纯化后，安全性极高，可直接制作疫苗免疫动物。

总体而言，本发明方法采用家蚕生物反应器或毕赤酵母生物反应器制备羊包虫抗原，其产物是可溶性的，免疫学实验证明其抗原性良好，单位表达量分别比大肠杆菌的量要高10-100倍，动物实验证明其具有很好的减虫效率。本发明方法可以大幅度降低羊包虫抗原的生产成本，简化了以前用大肠杆菌生产抗原的纯化过程，具有安全、高效、成本低等诸多优点。

附图说明

图1蚕表达基因工程羊包虫抗原sj-GST-eg95蛋白的Western检测。

图2蚕表达基因工程羊包虫抗原eg-GST-eg95蛋白的Western检测。

图3蚕表达基因工程羊包虫EG95抗原表达时相的Western检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1羊包虫Sj-GST-eg95抗原基因(SEQ ID NO：3)在家蚕生物反应器中的可溶性表达及免疫实验

1实验方法

1.1.有关溶液和培养基的配置

溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA。

溶液II：0.2mol/L NaOH，1％SDS(现配现用)。

溶液III：100mL体系，5mol/L醋酸钾80mL，冰乙酸12mL，ddH₂O8mL。

TAE(50×)：242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100mL 0.5mol/LEDTA(pH8.0)，无菌水定容至1000mL。

TER溶液：胰RNAse(RNAse A)溶解于10mM Tris-HCl、15mMNaCl中，配成10mg/mL的储存液-20℃冻存，再用1×TE buf稀释成20μg/mL的工作液4℃保存。

PPt Buffer：异丙醇22mL；5mol/mL KAc 1mL；ddw 2mL。

PEG溶液：称取一定质量的NaCl，配成1.6M的盐溶液，加入一定量的PEG，使其终浓度为13％。

6mol/L NaI：将0.75g Na₂SO₃溶于40mL ddH₂O中，加入45gNaI并搅拌至完全溶解，4℃储存。

玻璃奶(Glassmilk)：将10g(100mg/mL，Sigma S-5631)的Silica溶于100mL PB中，沉淀2h，弃上清，重复该步骤2～3次；2000g离心2min，将沉淀物溶于3mol/L的NaI中，终浓度为100mg/mL，4℃下避光保存。

New Wash洗液：Tris-HCl(pH 7.4)20mmol/L；EDTA 1mmol/L；NaCl100mmol/L；与等体积的无水乙醇配制而成。

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调整pH值到7.0(固体培养基含1.5％琼脂)。

蛋白上样缓冲液(2×)：100mmol/L Tris-HCl(pH6.8)、200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、4％SDS、0.2％溴酚蓝、10％甘油。

30％丙烯酰胺溶液29g：丙烯酰胺，1gN，N′-亚甲叉丙烯酰胺，溶于100mL水，过滤。

考马斯亮蓝染液：0.24g考马斯亮蓝R250溶于90mL甲醇∶水(1∶1，v/v)和10mL冰乙酸中。

脱色液：10％冰乙酸。

1.2.Eg95(Echinococcus granulosus)基因组DNA的提取(朱衡等，真菌学报，1994，13(1)：34-40.)

离心收集患有包虫病的动物的包囊中的包虫，尽量吸干水分，每克菌体材料加入5mL提取液(100mMTris/HCL，pH9.0；40mMEDTA，pH8.0)，振荡使之与菌体充分混均，再加入1mL10％SDS、3mL氯化苄，剧烈振荡，使管内混合物呈乳状。在50℃保温1h，每隔10min振荡一次。然后加入3mL3MNaAc(pH5.2)混均，冰水浴15min，6000rpm 4℃离心15min，取上清，加入等体积异丙醇室温沉淀20min，有絮状沉淀出现。10000rpm室温离心15min，沉淀用70％乙醇洗一次，吹干后溶于适量的TE。

1.3TRIzol法提取RNA

(1)将样品组织放入盛有Trizol(50～100mg组织/1mL)的玻璃匀浆器中匀浆，组织体积不要超过Trizol体积的10％。

(2)将匀浆液在室温下放置5min以使核蛋白质复合体完全裂解。

(3)加入氯仿(0.2mL/1mlLTrizol)，盖紧管盖并漩涡剧烈震荡15sec；室温放置2～15min。

(4)4℃，12000g离心15min。随着离心，混合液被分为三相：处于下层的浅红色酚-氯仿有机相、间相和上层无色水相。RNA存留在水相中，而DNA和蛋白质则存留于间相和有机相中，水相体积约为用于匀浆的Trizol体积的60％。

(5)将水相移入新管，加异丙醇(0.5mL/1mLTrizol)；室温放置5～10min。

(6)4～25℃，12000g离心8min。RNA沉淀(离心前通常看不到)在管壁或管底形成胶状的或白色的小球。

(7)弃上清，用1mL75％乙醇清洗RNA沉淀；然后4～25℃，7500g离心5min。

(8)弃上清，干燥；沉淀重溶于30μLDEPC处理的双蒸水(ddH₂O)或去离子甲酰胺中。-70℃保存备用。若沉淀难溶，可用吸管吹打数次并55～60℃温育10～15min。

1.4引物的设计与合成

参考已发表文献中的引物，并结合国内外已发表和登陆GenBank中的青海羊源的EG95基因：EG95-QH-1、EG95-QH-2和EG95-QH-3，总称为EG95-QH序列(GenBank上的登录号为AY421716、AY421717和AY421718)，设计合成下列的引物来扩增Eg95全基因序列，引物设计如下：

上游引物1：5′-ggaattcatggcattccagttatgtctcat-3′(引入EcoR I酶切位点)

下游引物2：5′-gctgcagatccacaatgagaggtcataca-3′(引入Pst I酶切位点)

根据克隆的EG95全基因序列分析，已得到的外显子以及Eg95基因的特性和序列的保守性，设计如下引物来扩增该基因的开放阅读框(ORF)，引物的序列如下：

上游引物3(F)：5′-ggaattcatggcattccagttatgtctcat-3′；

下游引物4(R)：5′-ggaattctcaagtaaggacaaccactatgc-3′(上、下游引物都引入EcoR I的酶切位点)。

1.5Eg95基因扩增的PCR反应

50μL反应体系                PCR反应程序

10×PCR缓冲液：5μL          95℃  预变性  5min

dNTP(10mM)：1μL             95℃          40sec

模板DNA：0.5μL              58℃          1min

引物1(20pmol/μL)：0.5μL    72℃          1min

引物2(20pmol/μL)：0.5μL    以上三步为一个循环，循环30次

Taq酶：1μL                  72℃延伸10min

ddH₂O：补充至50μL

1.6RT-PCR反应

1.cDNA第一链合成

(1)取2μLRNA(≤1μg)+2μLOligod(T)₂₀V(0.5μg)+13.75μLDEPC处理水；70℃，5min，迅速置冰上5min。

(2)加入5μL5×M-MLV buffer+1.25μL10mM dNTPs+1μLM-MLV-RT(200U)，使终体积为25μL。

(3)混匀后室温放置10min。

(4)42℃反应1h。

(5)70℃2min灭活RTase，-20℃保存备用。

2.PCR反应

50μL反应体系               PCR反应程序

10×PCR缓冲液5μL           95℃  预变性  5min

dNTP(10mM)：1μL            95℃          40sec

模板cDNA：1μL              58℃          1min

引物3(20pmol/μL)：1μL     72℃          50sec

引物4(20pmol/μL)：1μL     以上三步为一个循环，循环30次

Taq酶：1μL                 72℃延伸10min

ddH2O：40μL

PCR扩增结束后，取5.0μL反应产物用1.0％的TAE琼脂糖凝胶中电泳，凝胶中含有0.5μg/mL的溴化乙锭，电泳缓冲液为1×TAE，80-100V，大约10～20min于紫外凝胶成像系统观察片段大小，与标准的DNA Marker比较，进行分析。

1.7玻璃奶纯化回收DNA片段

(1)PCR产物用普通凝胶进行电泳后，切下所需目的大小的DNA条带，放入Eppendorf管中后称重；

(2)加入3倍体积(v/w)的6mol/LNaI溶液，65℃下使凝胶充分溶解；

(3)再加入10μL玻璃奶吸附DNA，混匀后室温下放置5min；10000rpm稍离心，达到转速即可，去上清；

(4)沉淀用New Wash洗液洗涤三次，10000rpm重复离心，前两次达到转速即可，最后一次离心2min，37℃晾干；

(5)用10μL0.1×TE Buffer溶解DNA，离心后取上清，将DNA保存于-20℃备用。凝胶电泳检测回收效果。

1.8PCR产物与克隆载体pGEM-T Easy的连接

连接体系如下：

pGEM-T Easy          0.5μL

pGEM-T Easy缓冲液    1μL

目的DNA              3.5μL

ddH₂O                5.0μL

混匀后，16℃连接过夜，连接产物用于转化DH10B。

1.9连接产物的转化

感受态细胞的小量制备

(1)-20℃冻藏的DH10B甘油菌在LB平板上复苏；

(2)用灭菌牙签挑取单菌落，放入4mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜，取100μL过夜培养物接种到另一4mL LB培养基中，37℃振荡培养2～2.5h，使OD值在0.6左右；

(3)5,000g离心4min收集菌体，将菌体重悬于800μL75mmol/L冷CaCl₂中，冰浴30min，；

(4)5,000g离心4min，弃上清，加入200μL75mmol/L冷CaCl₂，轻轻敲打管壁，使混合均匀，冰上放2h后用于转化。

感受态细胞的大量制备

(1)-70℃冻藏的DH10B甘油菌在LB平板上复苏；

(2)挑取单菌落(直径约2～3mm)，放入4mL LB培养基中(不含Amp)，另外挑一个放入加有Amp的LB培养基中，37℃振荡培养8h；在前者生长后者不生张说明没有污染。前者取1mL接种100mL新鲜的LB液体培养基，37℃振荡培养2～3h；

(3)培养物收集在灭菌的离心管中，5,000r/min 4℃离心5min，将菌体重悬于20～30mL 75mmol/L的预冷CaCl₂溶液中，冰浴30min；

(4)5,000r/min低温离心5min，弃上清，加入10mL含10％甘油的75mmol/L冷CaCl₂溶液，轻轻敲打管壁，使混合均匀，冰上放3～4h后分装小管，-70℃冻存。

连接产物的转化

(1)质粒DNA20～100ng或连接混合物5μL加到100μL上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；

(2)进行热休克(42℃保温2min)，迅速置冰上1～2min，加入1mL已温育至37℃的LB培养基，37℃振荡培养1h，

(3)稍离心，去部分上清后重悬沉淀，涂布于数个含相应抗生素的LB平板上。37℃倒置培养过夜。

1.10重组质粒的鉴定

细胞破碎法快速鉴定：重组后的质粒与原来的质粒分子量有一定差别时可用此法检出重组子(Beuken，et al.，1998)。

(1)分别挑取多个单菌落转化子接种于4mL含80μg/mLAmp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；

(2)取300～500μL菌液于Eppendorf管中，12,000g离心10sec，弃上清，加入30μL缓冲液(6％蔗糖，0.1％溴酚蓝)，再加入20μL酚/氯仿(1∶1)，充分振荡将菌体弹起；

(3)12,000g离心5min，取上清上样电泳，观察结果。

重组质粒的进一步酶切鉴定

(1)质粒DNA的提取

A.取上面快速鉴定后，显示一定差别的质粒对应的菌液1.5mL于Eppendorf管内，5,000g离心5min收集菌体，弃上清；

B.用150μLSol I悬浮沉淀，冰上放置5min；

C.加300μLSol II和50μL氯仿，轻轻倒转混匀后冰浴5min；

D.加450μLSolIII，剧烈混匀后冰浴5-10min；

E.4℃12,000g离心10min，取上清，加450μL异丙醇，混匀后于-20℃放置20min；

F.12,000g离心10min，弃上清，沉淀溶于250μLTER(含20μg/mLRNaseA的TE)中，37℃消化20min；加入350μLPPt沉淀Buffer，混匀后置4℃20min；

G.12,000g离心10min，弃上清，70％乙醇洗一次，真空干燥沉淀，用40μL0.1×TE(pH8.0)溶解，-20℃保存备用。

(2)重组质粒的酶切鉴定后

本发明选用的是pGEM-T Easy克隆载体，该载体最大的优点之一就是在多克隆位点的两端都有一个EcoR I的酶切位点，因此用EcoR I进行单酶切后，即可进行鉴定。

鉴定体系如下：

10×Buffer H 1.5μL   重组质粒2.0μL

EcoRI        0.5μL   ddH₂O    11μL

37℃酶切1～2h，加Marker作为参考标准，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

1.11重组质粒的测序鉴定以及分析

将鉴定为阳性克隆(全长基因和ORF片段分别命名为pGEM-T Easy/Eg95和pGEM-T Easy/eg95)加入含有Amp的LB培养液，220r/min摇培过夜后后，吸取1mL新鲜菌液至无菌的Eppendorf管中，加入少量甘油，以封口膜封好后，到中国农业科学院国家重大工程实验楼测序部进行测序。测序结果用DNAStar、DNAMAN软件对序列进行分析；

(1)eg95基因和pGEX-5X-1片段的获得

将测序鉴定过的克隆有eg95ORF片段的重组质粒pGEM-T Easy/eg95和原核表达载体质粒pGEX-5X-1分别都用EcoR I单酶切，酶切体系如下：

pGEM-T Easy/eg95管：10×buffer          2.0μL

                    EcoR I              0.5μL

                    pGEM-T Easy/eg95    10.0μL

             无菌水        补至总体积20L

pGEX-5X-1管：10×buffer    2.0μL

             EcoR I        0.5μL

             pGEX-5X-1     2.0μL

             无菌水        补至总体积20μL

轻轻混匀，置37℃水浴消化3-4h；目的片段用0.8％琼脂糖凝胶电泳，切下所需的目的片段，用Glassmilk Kit纯化目的片段；载体片段在70℃灭活15min。

(2)eg95基因和pGEX-5X-1片段的连接

用T₄DNA连接酶将胶回收的eg95基因和pGEX-5X-1片段连接。连接体系如下：

eg95基因                    6.0μL

pGEX-5X-1                   2.0μL

T4 DNA Ligase               1.0μL

T4 DNA Ligase Buffer        1.0μL

混匀后离心，16℃连接过夜。

(3)连接产物的转化、鉴定

将上述连接产物转化大肠埃希氏菌DH10B感受态细胞，在含Amp⁺LB琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒。重组质粒EcoR I酶切鉴定，将经酶切鉴定为阳性的重组质粒命名为pGEX-5X-1/sj-GST-eg95。

1.12sj-GST-eg95基因的改造：

融合PCR反应

设计特异性的引物，除去重组原核表达载体pGEX-5X-1/eg95中GST片段和eg95片段中间36碱基的蛋白酶切位点，使eg95紧跟在GST之后，形成融合基因。根据两个片段的序列以及载体的特征，设计如下的引物：

设计特异性的引物，除去重组原核表达载体pGEM-T easy/eg95中GST片段和eg95片段中间36个碱基的蛋白酶切位点。根据序列以及载体pBm93的特征，我们设计如下的引物，上游引物中aat为加入了的Kozak保守序列：

GST F：G AGATCT AATG TCC CCT ATA CTA GGT T(Bgl II)

GST R：ACATAACTGGAATGCCATTTTTGGAGGATGGTCGCC

eg95F：GGCG ACCATCCTCCA A AA ATGGCATTCCAGTTATGT

eg95R：G CTGCAG TCAAGTAAGGACAACCAC(Pst I)

(1)分别利用GST、eg95的上下游引物PCR扩增GST、eg95片段，使得即将用于构建融合片段GST-eg95的GST的3′端和eg95的5′端各自含有了对方5′端、3′端18个碱基。共36个碱基的重复碱基。分别回收两个片段。

(2)融合PCR：

50μL反应体系                     PCR反应程序

10×PCR buffer：5μL              95℃ 预变性 5min

dNTP(10mM)：1μL                  95℃        40sec

模板：GST、eg95回收片段各0.5μL   58℃        1min

Taq酶：1μL                       72℃        1min

ddH₂O：41μL                      以上三步为一个循环，循环30次

混匀，放入PCR仪                   72℃延伸10min

两个模板互为引物，在Taq酶的作用下扩增3～5个循环之后，冰上放置2～3min后，加入引物GST F、eg95R(20pmol/L)各0.5μL，继续把剩余的程序做完。琼脂糖凝胶电泳检测、回收目的条带。

融合片段sj-GST-eg95的回收、克隆以及鉴定方法同上部分。重组质粒命名为pMD 18-T/sj-GST-eg95。

将sj-GST-eg95基因(SEQ ID NO：3)克隆到pET系列大肠杆菌表达载体中，用镍柱纯化法纯化变性的表达蛋白，经质谱分析确认表达的蛋白质正确后，免疫兔子获得抗体，以检测后续的目的蛋白检测。

1.13重组杆状病毒转移载体pBm93(sj-GST-eg95)的构建

(1)pMD 18-T/sj-GST-eg95和杆状病毒转移载体pBm93质粒的双酶切

sj-GST-eg95管：10×buffer            4μL

               Bgl II、EcoR I        各1μL

               pMD 18-T/GST-eg95     10μL

               无菌水                补至总体积40μL

pBm93管：      10×buffer            4μL

               BamH I、EcoR I        各1μL

               pBm93质粒             4μL

               无菌水                补至总体积40μL

按上述体系加好混匀后，在37℃消化2～3h。目的片段电泳后glassmilk法回收；pBm93质粒在70℃在灭活15min，涂Amp⁺LB平板检测酶切是否完全。

(2)sj-GST-eg95与pBm93质粒的连接

在T4DNA连接酶的作用下连接将胶回收的GST-eg95片段和pBm93质粒。连接体系如下：

GST-eg95片段                6μL

pBm93                       2μL

T4 DNA Ligase               1μL

T4 DNA Ligase 10×Buffer    1μL

混匀后离心，16℃连接过夜。

重组质粒的转化与鉴定

将上述连接产物转化大肠埃希氏菌DH10B感受态细胞，在含氨苄青霉素抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒。重组质粒经过双酶切和菌液PCR鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为pBm93(sj-GST-eg95)。

1.14Bm-N细胞的复苏、传代及病毒繁殖

迅速取出液氮中冻存的细胞，置于37℃水浴中，轻轻摇动，待冻存液完全融化后，将之转移入25cm²培养瓶中，并逐滴加入至少5倍体积的新鲜的冷(4℃)的TC-100培养基(含10％FBS，100μg/mL链霉素，50μg/mL青霉素)，让细胞在室温下贴壁1h，再将之置于27℃培养箱中培养2～3h。细胞贴壁后，更换培养基。根据细胞生长状况，进行换液或传代。

待细胞铺满细胞瓶后，倒掉旧培养液，向细胞瓶中加入新鲜培养基，用弯头吸管吹打贴壁细胞，使其脱落，按照1∶2-3的比例(根据细胞密度)将细胞悬浮液转移至新培养瓶中。

家蚕杆状病毒(BmNPV)感染Bm细胞进行传代繁殖。

溶液配方如下：

(1)1×TC-100细胞培养液：按Gibco BRL公司产品说明书进行。将1个包装(1×1L)TC-100粉边搅拌边加到双蒸水中，加0.35g NaHCO₃，用5mol/LNaOH缓慢调pH至6.22，调节渗透压，定容至1L，在消毒滤器中，将培养基通过0.22μm消毒滤膜加压过滤除菌。

(2)1×TC-100完全培养基：1×TC-100细胞培养液补加FBS和抗生素。FBS保存于-20℃，使用前融化，并经56℃水浴保温30min使补体灭活，然后按10％加入上述配制的1×TC-100培养基中。链霉素终浓度为100μg/mL，氨苄青霉素为50μg/mL。

1.15超速离心法制备病毒BmNPV-ZJ8基因组DNA

收集BmNPV-ZJ8病毒感染的细胞培养液或感染的家蚕血淋巴，5000r/min离心10min，除去细胞沉淀，上清25000rpm超速离心1h，用1mL游离病毒抽提液悬浮病毒粒子，加蛋白酶K至终浓度50ug/mL，50℃保温2h。再加入35％的Sarkorsel至终浓度1％，继续于50℃保温2h。分别用等体积的饱和酚、苯酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次，5000rpm离心5min，将上层水相转入新管中，添加1/10体积的3mol/LNaCl(pH 6.5)，2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2h以上，DNA呈絮状沉淀。5000rpm离心10min，用70％乙醇洗沉淀一次，干燥后，用适量TE溶解DNA，4℃保存备用。

1.16共转染

接种约0.5～1×10⁶Bm-N细胞于15cm²培养瓶中，贴壁培养过夜(即细胞密度约为80％)。除去含FBS的培养基，用无血清培养基洗细胞二次，再加1mL无血清培养基。在50μL反应体系中加入线性化的Bm NPV-ZJ8病毒DNA1μg，pBm93(sj-GST-eg95)质粒DNA 2ug，脂质体5uL混合，加水补足体积，轻轻混匀，27℃温育15min，逐滴加入培养瓶中，边加边摇匀。27℃培养4-6h后倾去含转染液的无血清培养基，补加4.5mL无血清培养基并加入500μL的FBS，使其终浓度为10％，封口，27℃培养4-5d，至细胞浮起后，收集上清液用于重组病毒的筛选。

1.17重组病毒的筛选、纯化和扩增

接种适量细胞(平皿底部面积的80％)于35mm小dish中，27℃培养16h至细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清液按10^-3-10^-5作适当稀释后，取1mL稀释液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与等体积经40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，添加X-gal使其终浓度达150μg/mL，沿小dish边缘将胶慢慢倒入，凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养4-7d。显微镜下选取无色重组病毒空斑，超净台内用Tip头挑取重组病毒斑，溶于400μL TC-100培养基中，4℃放置4h使病毒粒子释放出来，取100μL病毒液感染24孔板中的细胞，27℃培养3d后，取150uL感染细胞上清按碱变性法快速制备病毒基因组DNA，进行PC R扩增分析。将能扩增出目的片段的病毒上清液铺斑进行第一次筛选。最终获得含目的基因的重组病毒。分别取100pL重组病毒感染正常生长的Bm-5贴壁细胞，在感染后约5d待细胞浮起后，4℃保存，用以注射。

1.18重组病毒rBmNPV(sj-GST-eg95)的鉴定

提取rBmNPV(sj-GST-eg95)基因组DNA：取重组病毒感染的细胞上清150μL，加入150μL(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μL(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μL的TE溶解DNA。

利用PCR方法分析外源基因整合：参照多角体基因启动子序列在ATG上游40bp处设计一条引物，polh-F：5′-ACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAA-3′，以提取的病毒基因组DNA为模板，以polh-F/G2为引物进行PCR反应。反应条件为：94℃变性5min、94℃1min、59℃1min、72℃1min，30个循环，最后72℃延伸10min。电泳鉴定扩增产物，表明得到了重组病毒rBmNPV(sj-GST-eg95)。

1.19sj-GST-eg95融合基因在家蚕中的表达以及ELISA和Western检测

将重组病毒培养液按10⁵pfu/头注射五龄幼蚕，待家蚕发病后，剪掉足，收集蚕血，-20℃冻存，用ELISA法检测GST-eg95抗原基因在蚕体中的表达情况。注射病毒后的家蚕，待发病时收集蚕血。ELISA方法检测sj-GST-eg95抗原蛋白表达量的高低，包被液作为空白对照，以正常蚕血作为阴性对照，原核表达的GST-eg95蛋白免疫家兔之后的兔血清为第一抗体，HRP标记的羊抗兔抗体为第二抗体。

(1)任意选取了所收蚕血中的24号，用包被液做梯度稀释，从100×(3μL蚕血加到270μL包被液)两倍倍比稀释到204800倍。每个梯度处做双孔检测，各取100μL包被到酶标板上。结果表明找到12800倍为一个较为合适的稀释度，可用以下一步比较不同蚕血中sj-GST-eg95的表达量。

通过ELISA检测家蚕中sj-GST-eg95的表达。结果表明sj-GST-eg95基因在家蚕中得到了高量的表达，在12800倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。表明sj-GST-eg95在家蚕血淋巴中为可溶性表达，检测结果表明其表达量为同样体积的大肠杆菌表达量的30倍以上，达到每毫升2毫克以上。

将含表达有sj-GST-eg95的蚕蛹用预冷的PBS(料液比为1∶5)在匀浆器中研磨后，用400目滤器过滤后，离心去碎片，上清与谷胱甘肽-琼脂糖珠震荡混匀，高速离心去上清，用预冷的PBS洗两次，离心得螯合sj-GST-eg95的谷胱甘肽-琼脂糖珠，用适量的50mmol的Tri盐酸(pH8.0)/5mmol的还原型谷胱甘肽洗脱下螯合的sj-GST-eg95蛋白，得率可达80％以上，证明在家蚕中表达的目的蛋白是可溶的，而且还建立了相应的蚕表达基因工程羊包虫抗原sj-GST-eg95蛋白的纯化方法。

Western检测表明在重组病毒感染后家蚕的血淋巴样品的上清液中可检测到46kD大小的特异性条带(图1)，比大肠杆菌表达的产物明显要大从Western检测表明其抗原蛋白得到了糖基化进一步表明其为可溶性表达。

1.20表达产物的减卵率实验

BALB/C小鼠(SPF)14周龄购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重平均在25-27克左右；羊包虫的细粒棘球幼虫用沙鼠传代法的方法保存和继代(羊包虫的细粒棘球幼虫可按文献所公开的方法分离、保存和继代；李文佳等，免疫学杂志，2007，23(4)：383-389)。用50微克左右的表达抗原sj-GST-eg95混合完全弗氏佐剂以替代Quil-A佐剂肌肉免疫免疫小鼠一次。免疫8周后用保存的细粒棘球蚴原头节进行腹腔注射，接种剂量为每只小鼠100只原头蚴，分别攻击免疫组和非免疫组的小鼠，每组各30头小鼠。

攻击感染20周后，剖杀各组小鼠，以调查不同处理组中每组小鼠的细粒棘球蚴组织，用精密电子称称重，计算成蚴率，计算公式为：

减蚴率(％)＝(1-免疫处理组的细粒棘球蚴组织平均重量/对照组的细粒棘球蚴组织的平均重量)×100％

本发明所制备的疫苗免疫BACB/C小鼠的成蚴率为82％，有明显的保护效果。

实施例2羊包虫Eg-GST-eg95抗原基因(SEQ ID NO：5)在家蚕生物反应器中的可溶性表达及免疫实验

GSTs(EC2.5.1.18)是广泛存在于各种生物体内的由多个基因编码的、具有多种功能的一组同工酶，分子量为23～29KDa。GSTs蛋白作为疫苗除可诱导较强的免疫保护外，还可有效减少成虫数量和产卵数，本实验应用羊包虫自身的eg-GST基因与EG95基因进行融合获得Eg-GST-eg95融合抗原基因，并在家蚕生物反应器中获得可溶性的高表达产品，动物实验表明其有良好的保护效果。

2.1.eg-GST基因的克隆和载体构建及抗体制备

羊包虫RNA的制备，反转录和cDNA模板的制备同实施例1，为了扩增eg-GST基因，根据Genbank中报道的序列设计下列引物，扩增eg-GST基因：

上游引物：g gga tcc aacatggctcccactctggcttact(BamHI)

下游引物：g gaa ttc acagtca ccacgccattttgc(EcoRI)

根据Genbank中报道的序列设计下列引物，扩增eg95基因：

上游引物(F)：ggaattcatggcattccagttatgtctcat(EcoRI)

下游引物(R)：gctgcagtcaagtaaggacaaccactatgc(PstI)

在引物中分别导入所需的酶切位点便于下一步操作。PCR操作、克隆等具体实验见实施例1；分别扩增eg-GST和Eg95片断，先构建pBm93-eg-GST，分别以EcoRI和PstI酶切pBm93-eg-GST和Eg95-T，再将回收得到的Eg95片断连接至pBm93-eg-GST得到pBm93-eg-GST-Eg95质粒。

将eg-GST基因首先克隆到通用载体pMD-easy中，测序并于Eg95融合。

重组病毒的获得、纯化和表达同实施例1。

将eg-GST-Eg95基因克隆到pET系列大肠杆菌表达载体中，用镍柱纯化法纯化变性的表达蛋白，经质谱分析确认表达的蛋白质正确后，免疫兔子获得抗体，以检测后续的目的蛋白检测。

2.2.eg-GST-eg95融合基因在家蚕中的表达以及ELISA和Western检测

将重组病毒培养液按10⁵pfu/头注射五龄幼蚕，待家蚕发病后，剪掉足，收集蚕血，-20℃冻存，用ELISA法检测eg-GST-eg95抗原基因在蚕体中的表达情况。

注射病毒后的家蚕，待发病时收集蚕血。ELISA方法检测eg-GST-eg95抗原蛋白表达量的高低，包被液作为空白对照，以正常蚕血作为阴性对照，原核表达的eg-GST-eg95蛋白免疫家兔之后的兔血清为第一抗体，HRP标记的羊抗兔抗体为第二抗体。

(1)任意选取了所收蚕血中的16号，用包被液做梯度稀释，从100×(3μL蚕血加到270μL包被液)后两倍倍比稀释到204800倍。每个梯度处做双孔检测，各取100μL包被到酶标板上。结果表明找到12800倍为一个较为合适的稀释度，可用以下一步比较不同蚕血中eg-GST-eg95的表达量。

通过ELISA检测家蚕中eg-GST-eg95的表达。结果表明eg-GST-eg95基因在家蚕中得到了高量的表达，在12800倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。表明eg-GST-eg95在家蚕血淋巴中为可溶性表达，检测结果表明其表达量为同样体积的大肠杆菌表达量的50倍左右，达到每毫升蚕血淋巴3毫克以上。

将含表达有eg-GST-eg95的蚕蛹用预冷的PBS(料液比为1∶5)在匀浆器中研磨后，用400目滤器过滤后，离心去碎片，上清与谷胱甘肽-琼脂糖珠震荡混匀，高速离心去上清，用预冷的PBS洗两次，离心得螯合eg-GST-eg95的谷胱甘肽-琼脂糖珠，用适量的50mmol的Tri盐酸(pH8.0)/5mmol的还原型谷胱甘肽洗脱下螯合的eg-GST-eg95蛋白，得率可达80％以上，证明在家蚕中表达的目的蛋白是可溶的，而且还建立了相应的蚕表达基因工程羊包虫抗原eg-GST-eg95蛋白的纯化方法。

Western检测表明在重组病毒感染后家蚕的4个血淋巴样品的上清液中可检测到45kD大小的特异性条带(图2)，比预期的41kD的明显要大，进一步表明其为可溶性表达且得到了糖基化后加工。

2.3.eg-GST-eg95表达产物的减卵率实验

BALB/C小鼠(SPF)14周龄购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重平均在25-27克左右；羊包虫的细粒棘球幼虫由本所用沙鼠传代法保存。用50微克左右的表达抗原eg-GST-eg95混合完全弗氏佐剂以替代Quil-A佐剂肌肉免疫免疫小鼠一次。免疫8周后用保存的细粒棘球蚴原头节进行腹腔注射，接种剂量为每只小鼠100只原头蚴，分别攻击免疫组和非免疫组的小鼠，每组各30头小鼠。

攻击感染20周后，剖杀各组小鼠，以调查不同处理组中每组小鼠的细粒棘球蚴组织，用精密电子称称重，计算成蚴率，计算公式为：

减蚴率(％)＝(1-免疫处理组的细粒棘球蚴组织平均重量/对照组的细粒棘球蚴组织的平均重量)×100％

所制备的疫苗免疫BACB/C小鼠的减蚴率为95.6％。具有明显的保护效果。

实施例3羊包虫EG95抗原基因(SEQ ID NO：1)在家蚕生物反应器中的可溶性表达及免疫实验

多年来，国内外学者为了能有效控制该病，在研制疫苗方面做了大量的工作，取得了很大进展。早期的工作主要是对寄生虫免疫原的研究，虽证实羊包虫整体研磨后及其排泄分泌抗原作为疫苗接种都能获得较好的免疫预防效果，但病原生活史复杂，来源有限，难于批量生产，因而在实际工作中受到限制。近年来，免疫学、生物化学和分子生物学飞速发展，Lightowlers等发现在这个羊包虫及其排泄分泌抗原作为疫苗的主要保护性抗原为EG95蛋白(Lightowlers MW，et al.，Int.J.Parasitol.1999，29，531～534)。然而在用基因工程技术在表达eg95基因时碰到了巨大的困难，Lightowlers不得不借助日本血吸虫的谷胱甘肽(GST)基因一起作为融合蛋白来进行表达，其实日本血吸虫的谷胱甘肽在羊包虫的免疫保护中是非必需的，因此能够用eg95基因能进行高效表达的话，对羊包虫的基因工程疫苗生产是个巨大的突破。

本实施例应用羊包虫自身的eg-95基因在家蚕生物反应器中进行高效表达，并在家蚕生物反应器中获得可溶性的高表达产品，动物实验表明其有最好的保护效果。

3.1.eg95基因的克隆和载体构建

羊包虫RNA的制备，反转录和cDNA模板的制备同实施例1，为了扩增eg95基因，根据前面克隆和测序所得的eg95基因的序列设计下列引物，扩增eg95基因：

上游引物(F)：gagatctattatggcattccagttatgtctcat(BglII)

下游引物(R)：gctgcagtcaagtaaggacaaccactatgc(PstI)

将其克隆到T-easy载体，通过测序证明所得的序列正确无误。

在引物中分别导入所需的酶切位点便于下一步操作。PCR操作。克隆等具体实验见实施例1。

分用BamHI和PstI先分别酶解pBm93载体，再分别以Bgl II和PstI酶切含eg95基因的T载体，分离得eg95基因片段，由于BglII和BamHI为同尾酶，因此再将回收得到的Eg95片断连接至用BamHI和PstI酶解的pBm93载体得到pBm93-Eg95转移质粒。先将eg95基因首先克隆到通用载体pMD-easy中，测序正确后克隆于pBm93载体。重组病毒的获得、纯化和表达同实施例1。

3.2.eg95融合基因在家蚕中的表达以及ELISA和Western检测

将重组病毒培养液按105pfu/头注射五龄幼蚕，待家蚕发病后，剪掉足，收集蚕血，-20℃冻存，用ELISA法检测eg95抗原基因在蚕体中的表达情况。

注射病毒后的家蚕，待发病时收集蚕血。ELISA方法检测EG95抗原蛋白表达量的高低，包被液作为空白对照，以正常蚕血作为阴性对照，原核表达的eg-GST-eg95蛋白免疫家兔之后的兔血清为第一抗体，HRP标记的羊抗兔抗体为第二抗体。

(1)任意选取了所收蚕血中的18号，用包被液做梯度稀释，从100×(3μL蚕血加到270μL包被液)两倍倍比稀释到204800倍。每个梯度处做双孔检测，各取100μL包被到酶标板上。结果表明找到25600倍为一个较为合适的稀释度，可用以下一步比较不同蚕血中EG95的表达量。

通过ELISA检测家蚕中EG95的表达。结果表明EG95基因在家蚕中得到了高量的表达，在25600倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。表明EG95在家蚕血淋巴中为可溶性表达，检测结果表明其表达量为同样体积的大肠杆菌表达量的60-100倍左右，达到每毫升4毫克以上。

将含有表达EG95的蚕蛹用预冷的PBS(料液比为1∶5)在匀浆器中研磨后，用400目滤器过滤后，离心去碎片，上清过用实施例2中制备的抗体标记的亲和层析柱，上清过柱后先行保留，用预冷的PBS洗柱子两次，按标准的抗原抗体洗脱步骤进行EG95的纯化，得率可达60％以上，证明在家蚕中表达的目的蛋白EG95是可溶的，而且还建立了相应的蚕表达基因工程羊包虫EG95抗原的纯化方法。

Western检测表明在重组病毒感染后家蚕的血淋巴样品的上清液中，在表达的早期可检测到16kD的条带，随着表达时间推延，16kD的条带越来越少，18kD糖基化的条带越来越多，至感染后108小时，完全是糖基化的18kD大小的特异性条带(图3)，进一步表明其为可溶性表达且得到了糖基化。

3.3.EG95表达产物的减卵率实验

BALB/C小鼠(SPF)14周龄购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重平均在25-27克左右；羊包虫的细粒棘球幼虫由本所用沙鼠传代法保存。用10微克左右的表达抗原EG95混合完全弗氏佐剂以替代Quil-A佐剂肌肉免疫免疫小鼠一次，或用50微克等量的未经纯化的家蚕表达的EG95抗原溶于500微升PBS灌注小鼠。免疫8周后用保存的细粒棘球蚴原头节进行腹腔注射，接种剂量为每只小鼠100只原头蚴，分别攻击肌肉注射免疫组、口服灌注组和非免疫组的小鼠，每组各30头小鼠。

攻击感染20周后，剖杀各组小鼠，以调查不同处理组中每组小鼠的细粒棘球蚴组织，用精密电子称称重，计算成蚴率，计算公式为：

减蚴率(％)＝(1-免疫处理组的细粒棘球蚴组织平均重量/对照组的细粒棘球蚴组织的平均重量)×100％

本实验所制备的疫苗肌肉注射免疫BACB/C小鼠的减蚴率为99.1％，口服灌注组的减蚴率为97.3％，两者基本上未见有明显的细粒棘球蚴组织。均具有最佳的保护效果。

实施例4羊包虫抗原基因(SEQ ID NO：3)在真核生物毕赤酵母中的可溶性表达及免疫实验

一、SEQ ID NO：3基因的克隆和载体构建

1、引物设计

设计特异性的引物，除去重组原核表达载体pGEX-5X-1/eg95中GST片段和eg95片段中间36碱基的蛋白酶切位点，使eg95紧跟在GST之后，形成融合基因。根据两个片段的序列以及载体的特征，设计如下的引物：

GST F：G GAATTC ATG TCC CCT ATA CTA GGTT(EcoR I)

GST R：ACATAACTGGAATGCCATTTTTGGAGGATGGTCGCC

eg95F：GGCG ACCATCCTCCA A AA ATGGCATTCCAGTTATGT

eg95R：G GCGGCC GC TCAAGTAAGGACAACCAC(Not I)

分别以pGEX-5X-1(贾如等，生物技术通报2008第5期，171-175)和实施例1的pGEM-T easy/eg95为模板，经各自的引物PCR扩增后，sj-GST与eg95均扩增出与目的大小一致的条带(分别应该是654bp和471bp)，与预测的结果一致。Sj-GST-eg95融合扩增之后，得到目的大小约1134bp的片段，回收后检测大小也大约为1134bp。

2、sj-GST与eg95融合PCR反应

(1)分别利用GST、eg95的上下游引物PCR扩增GST、eg95片段，使得即将用于构建融合片段GST-eg95的GST的3’端和eg95的5’端各自含有了对方5’端、3’端18个碱基。共36个碱基的重复碱基。分别回收两个片段。

(2)融合PCR：

50μL反应体系                   PCR反应程序

10×PCR buffer：5μL            95℃预变性 5min

dNTP(10mM)：1μL                95℃       40sec

模板：GST、eg95回收片段各0.5μL 58℃       1min

Taq酶：1μL                     72℃       1min

ddH₂O：41μL                    以上三步为一个循环，循环30次

混匀，放入PCR仪                 72℃延伸10min

两个模板互为引物，在Taq酶的作用下扩增3～5个循环之后，冰上放置2～3min后，加入引物GST F、eg95R(20pmol/μL)各0.5μL，继续把剩余的程序做完。琼脂糖凝胶电泳检测、回收目的条带。

Sj-GST-eg95融合片断回收后，连接到克隆载体pGEM-T easy上，得到重组载体pGEM-T easy/sj-GST-eg95，经EcoR I酶切鉴定，得到预期大小的片段，表明sj-GST-eg95的融合片段成功地连到pGEM-T easy上，将克隆到的融合片段sj-GST-eg95送去测序，测序结果表明eg95正确地接在了sj-GST后面，中间的蛋白酶切位点被融合掉，而且引入的酶切位点正确，这样就可以避免重组蛋白在真核细胞中表达时被其内部的蛋白酶消化掉。sj-GST-eg95片段的序列测定表明融合片段基因全长为1134bp，翻译377个氨基酸。可以用于下面的表达质粒的构建。

3、真核生物毕赤酵母重组表达载体pPIC9/sj-GST-eg95的构建

用EcoR I、Not I对毕赤酵母表达载体pPIC9进行双酶切处理，将带有EcoR I、Not I的sj-GST-eg95的融合片段连于毕赤酵母表达载体pPIC9上，构建重组表达质粒pPIC9/sj-GST-eg95。

酵母表达质粒pPIC9经EcoR I、Not I双酶切，70℃灭活15min；重组质粒pGEM-T easy/sj-GST-eg95经EcoR I、Not I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳后回收sj-GST-eg95的片段；在T4连接酶的作用下构建重组表达质粒pPIC9/sj-GST-eg95。用EcoR I、BamH I双酶切鉴定，因为BamH I位于GST-eg95的3’段，故应该切下1000bp左右目的大小的片段结果表明连接正确。

二、羊包虫可溶性抗原基因sj-GST-eg95在真核生物毕赤酵母中的表达

1、质粒DNA的线性化处理

大量提取重组表达质粒，取10ug用2～3倍过量的Bgl II作线性化处理，电泳检测酶切是否完全。酚/氯仿，氯仿各抽提一次，乙醇沉淀，70％乙醇洗两次，无菌水溶解，-20℃保存备用。

2、酵母感受态的制备

(1)将毕赤酵母菌种GS115接种到含5mL YPD液体培养基的100mL三角瓶中，28-30℃摇床过夜培养。

(2)将过夜培养物按1/100-5/100的接种量转接到含500mL YPD液体培养基的1000mL三角瓶中培养至OD₆₀₀＝1.3-1.5。

(3)4℃、5000r/m离心5min，收集菌体。

(4)用500mL冰预冷的去离子水轻柔重悬沉淀，4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。

(5)用250mL冰预冷的去离子水轻柔重悬沉淀，4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。

(6)用20mL冰预冷的1mol/L山梨醇轻柔重悬沉淀，4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。

(7)用1mL预冷的1mol/L山梨醇轻柔重悬沉淀，按每管80μL分装成备用的毕赤酵母感受态细胞，保存于-70℃。

3、酵母细胞的转化和重组子的获得

(1)将80μL已制备好的感受态细胞与10μL已制备好的线性化待转化质粒DNA混合，并将其转至0.2cm电转化杯中；

(2)将装有混合液的转化杯冰浴5分钟；

(3)调整好基因导入仪的参数(置于毕赤酵母档)，电击一次，电压2000V，时间一般应约为5ms；

(4)立即往转化杯中加入1mL预冷的1mol/L山梨醇溶液，混匀，并将其转至灭过菌的离心管中；

(5)将混合液涂于RDB板上，每个RDB板上约涂200μL～600μL的混合液；

(6)将RDB板置于30℃培养箱中培养2～3d，直到长出菌落为止。

按下述方法筛选含目的基因的转化子：

(1)用灭过菌的牙签从长有转化子的RDB板上挑取单菌落，按照编号点到MM上，再点到相应编号的MD平板上，每个平板上一般点100个单菌落；

(2)将点有转化子的MM、MD平板置于30℃培养箱中培养1～2d，至菌落长出。

阳性转化子应在MM平板上不生长或生长缓慢，而在MD平板上能正常生长。

重组表达质粒pPIC9(sj-GST-eg95)电转化酵母细胞，经诱导后的菌液按煮-冻-煮方法处理之后，用PCR的方法鉴定重组子，阳性重组子扩增出目的大小的片段，表明重组质粒确实转酵母细胞中去了。

4、羊包虫sj-GST-eg95在毕赤酵母中的表达检测

(1)按编号挑取MD平板上的单克隆接种于装有5mL BMGY培养基的20mL离心管中，30℃、250-280rpm摇床培养2～3d；

(2)将摇床培养2～3d的培养液3000g离心15min，取沉淀(尽量将上清除尽)，再往沉淀中加入4mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，重新在30℃、250～280rpm诱导培养；

(3)诱导培养48h后，每管取出200μL菌液，3000g离心5min，取上清，用于进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，对上清进行初步酶活性检测，对那些筛选出有酶活性的，进行进一步的诱导表达；

(4)为补偿甲醇的挥发损失，在筛选出有酶活性的菌液中加入100μL10×甲醇溶液，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，以后每隔12h取样一次，并补加甲醇，直至96h(4d)，筛选出几株表达量高的准备上发酵罐，进行发酵工艺研究。

按下述方法进行发酵罐水平的重组酵母的高细胞密度发酵

重组酵母的高细胞密度发酵流程：

5％诱导菌体接种Basal Salts培养基

发酵过程分为四个阶段：

(1)菌株培养阶段：发酵培养基10×Basal Salts接种前首先加入28％氨水使培养基的pH达到5.0(氨水同时也作为菌株生长的氮源)，再按每升培养基加4.37mL的量加入PTM1。5-10％接种种子液，通气搅拌培养18-24h，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧量由100％逐渐降低。当碳源消耗完后溶氧量会再度升高，当溶氧升高至80％以上时，开始碳源饲喂阶段。

(2)碳源饲喂阶段：流加25％葡萄糖(每升中含12mL PTM1)，流加量为36mL/h/L，培养4h。调整通气量使溶氧量始终大于20％。

(3)碳源-甲醇混合饲喂阶段：流加25％葡萄糖∶甲醇(8∶1)培养4h，流加量为9mL/h/L，控制溶氧量始终大于20％。

(4)诱导表达阶段：加入诱导剂甲醇(每升中含12mL PTM1)，使甲醇终浓度维持在0.3％，溶氧量始终大于20％。在诱导过程中每隔12h取样一次测定表达的乳糖酶的活性。

利用甲醇大批量诱导毕赤酵母表达目的蛋白sj-GST-eg95，将表达后的菌液进行离心，取上清液用于ELISA检测。以原核表达得到的融合蛋白免疫家兔之后得到的兔血清抗体作为第一抗体，以HRP标记的羊抗兔抗体为第二抗体，以包被液作为空白对照，以未转重组质粒但经过同样诱导的酵母作为阴性对照，以大肠杆菌表达的样品做阳性对照。筛选了大概300个重组子，这里只列出一批检测到的吸光值较高的实验结果，总共94个菌株，每个样品都做双孔检测，阴性和空白对照统一做5000倍稀释后做ELISA检测，通过酶标仪(492nm处)检测酶标板上各孔的吸光值的大小。最高的重组子经高密度发酵所得的表达量为同样体积的大肠杆菌表达量的10倍左右.

5、毕赤酵母生产的羊包虫可溶性抗原基因sj-GST-eg95和实验动物的减蚴实验

高密度发酵产物经2000g离心10分种去掉酵母后，用Millipore10KD的截流膜包浓缩脱盐后，过阴离子凝胶柱纯化后，得初步可溶的表达产物sj-GST-eg95蛋白，经ELISA定量后用50微克的表达蛋白，混合完全弗氏佐剂以替代Quil-A佐剂肌肉免疫免疫小鼠一次。实验所用的BALB/C小鼠(SPF)14周龄购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重平均在25-27克左右；羊包虫的细粒棘球幼虫由本所用沙鼠传代法保存。用15微克左右的毕赤酵母表达的抗原sj-GST-eg95混合完全弗氏佐剂以替代Quil-A佐剂肌肉免疫免疫小鼠一次。免疫8周后用保存的细粒棘球蚴原头节进行腹腔注射，接种剂量为每只小鼠100只原头蚴，分别攻击免疫组和非免疫组的小鼠，每组各30头小鼠。

攻击感染20周后，剖杀各组小鼠，以调查不同处理组中每组小鼠的细粒棘球蚴组织，用精密电子称称重，计算减蚴率，计算公式为：

减蚴率(％)＝(1-免疫处理组的细粒棘球蚴组织平均重量/对照组的细粒棘球蚴组织的平均重量)×100％

疫苗免疫BACB/C小鼠的减蚴率为84.7％。具有明显的保护效果。

实施例5羊包虫Eg-GST-eg95抗原基因(SEQ ID NO：5)在真核生物毕赤酵母中的可溶性表达及免疫实验

一、毕赤酵母表达载体pPIC9-eg-GST-Eg95的构建

以实施例2中的质粒pBm93(eg-GST-Eg95)质粒为模板设计上下游引物：

上游引物：g gcggccgc g atggctcccactctggcttact(NotI)

下游引物：g gcggccgc tcaagtaaggacaaccactatgc(NotI)

经过PCR扩增后导入NotI位点，扩增产物克隆入T载体，经测序证明没有发生突变并正确导入了所需的NotI位点，pPIC9载体经NotI酶切，T载体中的eg-GST-Eg95基因同样经NotI酶解后，经连接、转化、筛选、基因插入方向的鉴定得正确的毕赤酵母表达载体pPIC9(eg-GST-Eg95)。

二、羊包虫可溶性抗原基因eg-GST-Eg95在真核生物毕赤酵母中的表达

1、质粒DNA的线性化处理

大量提取重组表达质粒，取10ug用2～3倍过量的Bgl II作线性化处理，电泳检测酶切是否完全。酚/氯仿，氯仿各抽提一次，乙醇沉淀，70％乙醇洗两次，无菌水溶解，-20℃保存备用。

2、酵母感受态的制备

(1)将毕赤酵母菌种GS115接种到含5mL YPD液体培养基的100mL三角瓶中，28-30℃摇床过夜培养。

(2)将过夜培养物按1/100-5/100的接种量转接到含500mL YPD液体培养基的1000mL三角瓶中培养至OD₆₀₀＝1.3-1.5。

(3)4℃、5000r/m离心5min，收集菌体。

(4)用500mL冰预冷的去离子水轻柔重悬沉淀，4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。

(5)用250mL冰预冷的去离子水轻柔重悬沉淀，4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。

(6)用20mL冰预冷的1mol/L山梨醇轻柔重悬沉淀，4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。

(7)用1mL预冷的1mol/L山梨醇轻柔重悬沉淀，按每管80μL分装成备用的毕赤酵母感受态细胞，保存于-70℃。

3、酵母细胞的转化和重组子的获得

(1)将80μL已制备好的感受态细胞与10μL已制备好的线性化待转化质粒DNA混合，并将其转至0.2cm电转化杯中；

(2)将装有混合液的转化杯冰浴5分钟；

(3)调整好基因导入仪的参数(置于毕赤酵母档)，电击一次，电压2000V，时间一般应约为5ms；

(4)立即往转化杯中加入1mL预冷的1mol/L山梨醇溶液，混匀，并将其转至灭过菌的离心管中；

(5)将混合液涂于RDB板上，每个RDB板上约涂200μL～600μL的混合液；

(6)将RDB板置于30℃培养箱中培养2～3d，直到长出菌落为止。

按下述方法筛选含目的基因的转化子：

(1)用灭过菌的牙签从长有转化子的RDB板上挑取单菌落，按照编号点到MM上，再点到相应编号的MD平板上，每个平板上一般点100个单菌落；

(2)将点有转化子的MM、MD平板置于30℃培养箱中培养1～2d，至菌落长出。

阳性转化子应在MM平板上不生长或生长缓慢，而在MD平板上能正常生长。

重组表达质粒pPIC9(eg-GST-Eg95)电转化酵母细胞，经诱导后的菌液按煮-冻-煮方法处理之后，用PCR的方法鉴定重组子，阳性重组子扩增出目的大小的片段，表明重组质粒确实转酵母细胞中去了。

4、羊包虫eg-GST-Eg95在毕赤酵母中的表达检测

(1)按编号挑取MD平板上的单克隆接种于装有5mL BMGY培养基的20mL离心管中，30℃、250-280rpm摇床培养2～3d；

(2)将摇床培养2～3d的培养液3000g离心15min，取沉淀(尽量将上清除尽)，再往沉淀中加入4mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，重新在30℃、250～280rpm诱导培养；

(3)诱导培养48h后，每管取出200μL菌液，3000g离心5min，取上清，用于进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，对上清进行初步酶活性检测，对那些筛选出有酶活性的，进行进一步的诱导表达；

(4)为补偿甲醇的挥发损失，在筛选出有酶活性的菌液中加入100μL10×甲醇溶液，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，以后每隔12h取样一次，并补加甲醇，直至96h(4d)，筛选出几株表达量高的准备上发酵罐，进行发酵工艺研究。

按下述方法进行发酵罐水平的重组酵母的高细胞密度发酵

重组酵母的高细胞密度发酵流程：

5％诱导菌体接种Basal Salts培养基

发酵过程分为四个阶段：

(1)菌株培养阶段：发酵培养基10×Basal Salts接种前首先加入28％氨水使培养基的pH达到5.0(氨水同时也作为菌株生长的氮源)，再按每升培养基加4.37mL的量加入PTM1。5-10％接种种子液，通气搅拌培养18-24h，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧量由100％逐渐降低。当碳源消耗完后溶氧量会再度升高，当溶氧升高至80％以上时，开始碳源饲喂阶段。

(2)碳源饲喂阶段：流加25％葡萄糖(每升中含12mL PTM1)，流加量为36mL/h/L，培养4h。调整通气量使溶氧量始终大于20％。

(3)碳源-甲醇混合饲喂阶段：流加25％葡萄糖∶甲醇(8∶1)培养4h，流加量为9mL/h/L，控制溶氧量始终大于20％。

(4)诱导表达阶段：加入诱导剂甲醇(每升中含12mL PTM1)，使甲醇终浓度维持在0.3％，溶氧量始终大于20％。在诱导过程中每隔12h取样一次测定表达的乳糖酶的活性。

利用甲醇大批量诱导毕赤酵母表达目的蛋白eg-GST-Eg95，将表达后的菌液进行离心，取上清液用于ELISA检测。以原核表达得到的融合蛋白免疫家兔之后得到的兔血清抗体作为第一抗体，以HRP标记的羊抗兔抗体为第二抗体，以包被液作为空白对照，以未转重组质粒但经过同样诱导的酵母作为阴性对照，以大肠杆菌表达的样品做阳性对照。筛选了大概400个重组子，这里只列出一批检测到的吸光值较高的实验结果，总共107个菌株，每个样品都做双孔检测，阴性和空白对照统一做5000倍稀释后做ELISA检测，通过酶标仪(492nm处)检测酶标板上各孔的吸光值的大小。最高的重组子经高密度发酵所得的表达量为同样体积的大肠杆菌表达量的12倍左右.

5、毕赤酵母生产羊包虫可溶性抗原基因eg-GST-Eg95和实验动物的减蚴实验

高密度发酵产物经2000g离心10分种去掉酵母后，用Millipore10KD的截流膜包浓缩脱盐后，过阴离子凝胶柱纯化后，得初步可溶的表达产物eg-GST-Eg95蛋白，经ELISA定量后用50微克的表达蛋白，混合完全弗氏佐剂以替代Quil-A佐剂肌肉免疫免疫小鼠一次。实验所用的BALB/C小鼠(SPF)14周龄购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重平均在25-27克左右；羊包虫的细粒棘球幼虫由本所用沙鼠传代法保存。用15微克左右的毕赤酵母表达的抗原sj-GST-eg95混合完全弗氏佐剂以替代Quil-A佐剂肌肉免疫免疫小鼠一次。免疫8周后用保存的细粒棘球蚴原头节进行腹腔注射，接种剂量为每只小鼠100只原头蚴，分别攻击免疫组和非免疫组的小鼠，每组各30头小鼠。

攻击感染20周后，剖杀各组小鼠，以调查不同处理组中每组小鼠的细粒棘球蚴组织，用精密电子称称重，计算减蚴率，计算公式为：

减蚴率(％)＝(1-免疫处理组的细粒棘球蚴组织平均重量/对照组的细粒棘球蚴组织的平均重量)×100％

本实验所制备的疫苗免疫BACB/C小鼠的减蚴率为87.3％。具有明显的保护效果。

实施例6羊包虫EG95抗原基因在真核生物毕赤酵母中的可溶性表达及免疫实验

一、毕赤酵母表达载体pPIC9-Eg95的构建

以实施例2中的质粒pBm93(eg-GST-Eg95)质粒为模板设计上下游引物：

上游引物(F)：ggaa ttc atg gcattccagttatgtctcat(EcoR I)

下游引物：ggcggccgc tcaagtaaggacaaccactatgc(NotI)

经过PCR扩增后导入EcoR I和NotI位点，扩增产物克隆入T载体，经测序证明没有发生突变并正确导入了所需的EcoR I和NotI位点，pPIC9载体经EcoR I和NotI酶切，T载体中的Eg95基因同样经EcoR I和NotI酶解后，经连接、转化、筛选、酶切鉴定得正确的毕赤酵母表达载体pPIC9(Eg95)。

二、羊包虫可溶性抗原基因Eg95在真核生物毕赤酵母中的表达

1、质粒DNA的线性化处理

大量提取重组表达质粒，取10ug用2～3倍过量的Bgl II作线性化处理，电泳检测酶切是否完全。酚/氯仿，氯仿各抽提一次，乙醇沉淀，70％乙醇洗两次，无菌水溶解，-20℃保存备用。

2、酵母感受态的制备

(1)将毕赤酵母菌种GS115接种到含5mL YPD液体培养基的100mL三角瓶中，28-30℃摇床过夜培养。

(2)将过夜培养物按1/100-5/100的接种量转接到含500mL YPD液体培养基的1000mL三角瓶中培养至OD₆₀₀＝1.3-1.5。

(3)4℃、5000r/m离心5min，收集菌体。

(4)用500mL冰预冷的去离子水轻柔重悬沉淀，4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。

(5)用250mL冰预冷的去离子水轻柔重悬沉淀，4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。

(6)用20mL冰预冷的1mol/L山梨醇轻柔重悬沉淀，4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。

(7)用1mL预冷的1mol/L山梨醇轻柔重悬沉淀，按每管80μL分装成备用的毕赤酵母感受态细胞，保存于-70℃。

3、酵母细胞的转化和重组子的获得

(1)将80μL已制备好的感受态细胞与10μL已制备好的线性化待转化质粒DNA混合，并将其转至0.2cm电转化杯中；

(2)将装有混合液的转化杯冰浴5分钟；

(3)调整好基因导入仪的参数(置于毕赤酵母档)，电击一次，电压2000V，时间一般应约为5ms；

(4)立即往转化杯中加入1mL预冷的1mol/L山梨醇溶液，混匀，并将其转至灭过菌的离心管中；

(5)将混合液涂于RDB板上，每个RDB板上约涂200μL～600μL的混合液；

(6)将RDB板置于30℃培养箱中培养2～3d，直到长出菌落为止。

按下述方法筛选含目的基因的转化子：

(1)用灭过菌的牙签从长有转化子的RDB板上挑取单菌落，按照编号点到MM上，再点到相应编号的MD平板上，每个平板上一般点100个单菌落；

(2)将点有转化子的MM、MD平板置于30℃培养箱中培养1～2d，至菌落长出。

阳性转化子应在MM平板上不生长或生长缓慢，而在MD平板上能正常生长。

重组表达质粒pPIC9(Eg95)DNA电转化酵母细胞，经诱导后的菌液按煮-冻-煮方法处理之后，用PCR的方法鉴定重组子，阳性重组子扩增出目的大小的片段，表明重组质粒确实转酵母细胞中去了。

4、羊包虫Eg95在毕赤酵母中的表达检测

(1)按编号挑取MD平板上的单克隆接种于装有5mL BMGY培养基的20mL离心管中，30℃、250-280rpm摇床培养2～3d；

(2)将摇床培养2～3d的培养液3000g离心15min，取沉淀(尽量将上清除尽)，再往沉淀中加入4mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，重新在30℃、250～280rpm诱导培养；

(3)诱导培养48h后，每管取出200μL菌液，3000g离心5min，取上清，用于进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，对上清进行初步酶活性检测，对那些筛选出有酶活性的，进行进一步的诱导表达；

(4)为补偿甲醇的挥发损失，在筛选出有酶活性的菌液中加入100μL10×甲醇溶液，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，以后每隔12h取样一次，并补加甲醇，直至96h(4d)，筛选出几株表达量高的准备上发酵罐，进行发酵工艺研究。

按下述方法进行发酵罐水平的重组酵母的高细胞密度发酵

重组酵母的高细胞密度发酵流程：

5％诱导菌体接种Basal Salts培养基

发酵过程分为四个阶段：

(1)菌株培养阶段：发酵培养基10×Basal Salts接种前首先加入28％氨水使培养基的pH达到5.0(氨水同时也作为菌株生长的氮源)，再按每升培养基加4.37mL的量加入PTM1。5-10％接种种子液，通气搅拌培养18-24h，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧量由100％逐渐降低。当碳源消耗完后溶氧量会再度升高，当溶氧升高至80％以上时，开始碳源饲喂阶段。

(2)碳源饲喂阶段：流加25％葡萄糖(每升中含12mL PTM1)，流加量为36mL/h/L，培养4h。调整通气量使溶氧量始终大于20％。

(3)碳源-甲醇混合饲喂阶段：流加25％葡萄糖∶甲醇(8∶1)培养4h，流加量为9mL/h/L，控制溶氧量始终大于20％。

(4)诱导表达阶段：加入诱导剂甲醇(每升中含12mL PTM1)，使甲醇终浓度维持在0.3％，溶氧量始终大于20％。在诱导过程中每隔12h取样一次测定表达的乳糖酶的活性。

利用甲醇大批量诱导毕赤酵母表达目的蛋白Eg95，将表达后的菌液进行离心，取上清液用于ELISA检测。以原核表达得到的融合蛋白免疫家兔之后得到的兔血清抗体作为第一抗体，以HRP标记的羊抗兔抗体为第二抗体，以包被液作为空白对照，以未转重组质粒但经过同样诱导的酵母作为阴性对照，以大肠杆菌表达的样品做阳性对照。筛选了大概400个重组子，这里只列出一批检测到的吸光值较高的实验结果，总共208个菌株，每个样品都做双孔检测，阴性和空白对照统一做5000倍稀释后做ELISA检测，通过酶标仪(492nm处)检测酶标板上各孔的吸光值的大小。最高的重组子经高密度发酵所得的表达量为同样体积的大肠杆菌表达量的5倍左右。

5、毕赤酵母生产的羊包虫可溶性抗原基因Eg95和实验动物的减蚴实验

高密度发酵产物经2000g离心10分种去掉酵母后，用Millipore10KD的截流膜包浓缩脱盐后，过阴离子凝胶柱纯化后，得初步可溶的表达产物Eg95蛋白，经ELISA定量后用12微克的表达蛋白，混合完全弗氏佐剂以替代Quil-A佐剂肌肉免疫免疫小鼠一次。实验所用的BALB/C小鼠(SPF)14周龄购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重平均在25-27克左右；羊包虫的细粒棘球幼虫由本所用沙鼠传代法保存。用50微克左右的毕赤酵母表达的抗原Eg95混合完全弗氏佐剂以替代Quil-A佐剂肌肉免疫免疫小鼠一次。免疫8周后用保存的细粒棘球蚴原头节进行腹腔注射，接种剂量为每只小鼠100只原头蚴，分别攻击免疫组和非免疫组的小鼠，每组各30头小鼠。

攻击感染20周后，剖杀各组小鼠，以调查不同处理组中每组小鼠的细粒棘球蚴组织，用精密电子称称重，计算减蚴率，计算公式为：

减蚴率(％)＝(1-免疫处理组的细粒棘球蚴组织平均重量/对照组的细粒棘球蚴组织的平均重量)×100％

本实验所制备的疫苗免疫BACB/C小鼠的减蚴率为93.4％，具有明显的保护效果。

Claims (12)

1.一种制备羊包虫可溶性抗原的方法，包括：将SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：5所示的基因在昆虫生物反应器或毕赤酵母生物反应器中进行表达；收集、纯化所表达的抗原，即得。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：将SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：5所示的基因在昆虫生物反应器中进行表达包括以下步骤：(1)将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的基因分别克隆到杆状病毒运载载体中，获得转移载体；(2)用所获得的转移载体DNA与杆状病毒基因组DNA共转染进昆虫细胞，进行DNA同源重组，经过重组病毒筛选、克隆纯化获得重组杆状病毒；(3)用重组杆状病毒感染昆虫宿主和细胞；培养被感染的昆虫宿主；(4)收集、纯化所表达的抗原，即得。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的杆状病毒运载载体选自pBm034，pBm93，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，pVL1391，pVL 1392，pVL 1393，pVL941，pVL 945，pVL 985，pVTBac，pBm030或pUAC-5；优选为pBm93。

4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的杆状病毒选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV或SpltNPV；优选的，所述的杆状病毒为家蚕杆状病毒Bm-NPV-ZJ8。

5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的重组杆状病毒选自以下任意一种：(1)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV(eg95)，其微生物保藏号是：CGMCC No.3981；(2)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV(sj-GST-eg95)；其微生物保藏号是：CGMCC No.3959；(3)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV(eg-GST-eg95)；其微生物保藏号是：CGMCC No.3960。

6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的昆虫宿主包括家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyx mandarina)、蓖麻蚕(Philosamia cynthiaricim)、樟蚕(Dictyoploca japanica)、樗蚕(Philosamia cynthiapryeri)、柞蚕(Antheraea pernyi)、日本柞蚕(Antheraea yamamai)、野天蚕(Antheraea polyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothisassulta)、烟草夜蛾(Heliothis virescens)、东方粘虫(Pseudaletiaseparata)或舞毒蛾(Lymantria dispar)。

7.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体；优选的：将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种5龄起蚕的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集含各种羊包虫抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆；其中，所述的蛹体为1-2天的早期嫩蛹。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：将SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：5所示的基因在毕赤酵母生物反应器中进行表达包括以下步骤：(1)将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的基因分别克隆到毕赤酵母表达载体中，获得表达质粒；(2)先将所获得的表达质粒DNA进行线性化，转化酵母的感受态细胞，在酵母细胞内进行DNA同源重组进行双交换，获得大量的重组酵母，筛选得到最高表达的重组酵母；(3)将所获得的重组酵母进行发酵收获发酵的上清液，纯化即得。

9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：其中，步骤(1)中所述的毕赤酵母表达载体为分泌型毕赤酵母表达载体，优选自pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1p、YAM7SP6或pGAPZa。

10.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的重组酵母选自以下任意一种：(1)重组酵母PC(eg95)，其微生物保藏号是：CGMCCNo.3976；(2)重组酵母PC(Si-GST-eg95)，其微生物保藏号是：CGMCCNo.3978；(3)重组酵母PC(eg-GST-eg95)，其微生物保藏号是：CGMCCNo.3977。

11.由权利要求1-10任何一项方法所制备得到的羊包虫抗原。

12.权利要求11所述的羊包虫抗原在制备防制包虫病的生物制剂中的用途。

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