CN103861093A - 一种羊棘球蚴亚单位疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羊棘球蚴亚单位疫苗及其制备方法和应用，该疫苗的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.所示，该疫苗可以激发细胞及体液免疫应答，并有效预防羊棘球蚴病的感染，安全性好，为防控羊棘球蚴及人类感染棘球蚴病提供了理想的疫苗。

Description

一种羊棘球蚴亚单位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种羊棘球蚴亚单位疫苗，以及该疫苗的制备方法和应用。

背景技术

棘球蚴病(Echinococosis granulosis)又称包虫病(Hydatidosis)，是一种人兽共患的流行性寄生虫病，是广大牧区所面临的最严重的绦虫病之一，严重影响了畜牧业发展和人类健康。包虫病是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)的中期幼虫棘球蚴(Echinococcus)寄生在哺乳动物脏器所引发。而犬类是主要的终末宿主，在感染细粒棘球蚴后，幼虫在其小肠内发育成熟并产生虫卵。虫卵可随粪便排放及犬的活动污染自身皮毛、牧草、水源等区域。当人及其他哺乳动物接触到虫卵后，虫卵会在小肠内发育称棘球蚴，且该幼虫可进入血管随血液循环而进行转移，最终多寄生于肝、肺等脏器，并形成包囊并引发疾病。目前我国畜牧养殖产业中受到包虫病危害的家畜有11种之多，其主要危害表现为畜产品发育受阻、减产、及脏器废弃等，其中以绵阳及生猪感染情况尤为严重。在高发区，绵阳感染率高于60％，其中肺脏废弃率10－28％、肝脏废弃率8－25％、减产量平均2kg/只。以2009年报道计算，我国畜牧业年直接经济损失达10亿元，且呈现逐年递增状态。对家畜包虫病疫情的防控不彻底，不仅造成畜牧业的大量经济损失，同时也在危害着人类的健康。我国每年人感染包虫病的病例高于50万例，通过手术治疗的病例也超过3000例。以我国新疆地区为代表，人患包虫病的感染率高达31％，手术后复发率高达33％，更有患者为治疗包虫病反复手术而倾家荡产。在治愈的患者中，仍然有38％的治愈着无法恢复劳动能力。

疫苗是防控传染病最有效的手段，但至今仍没有一款用于预防棘球蚴病的产品。因此，急需一种用于预防棘球蚴病的疫苗。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种羊棘球蚴亚单位疫苗，本发明的目的之二在于提供羊棘球蚴亚单位疫苗的制备方法；本发明的目的之三在于提供羊棘球蚴亚单位疫苗的应用。

为实现上述发明目的，提供如下技术方案：

1、一种羊棘球蚴亚单位疫苗，所述疫苗的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述疫苗的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

更优选的，所述疫苗为无佐剂注射剂型疫苗或佐剂注射型疫苗。

最优选的，所述佐剂注射剂型疫苗含3mg/3mL的佐剂和含2500µg/3mL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白，所述佐剂为氢氧化铝或磷酸铝。

所述无佐剂注射剂型疫苗含有浓度为2500µg/3mL氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白。

2、所述疫苗的制备方法，包括如下步骤：构建含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组原核表达载体，然后将重组原核表达载体转化原核表达菌株，经发酵培养后纯化，得羊棘球蚴亚单位疫苗。

优选的，所述原核表达菌株为大肠杆菌BL 21菌株。

优选的，所述发酵培养为将原核表达菌株在37℃条件下震荡培养至对数期，然后将培养液全部接种于种子罐，再在37℃条件下培养至OD值为1.0-1.5时，将培养液接种于二级种子罐培养，最后转移至发酵罐中进行发酵，当菌体OD值达到40时，添加IPTG至终浓度为1mM诱导4-5小时。

优选的，所述纯化为将诱导后的培养液离心收集沉淀，经洗液I重悬后进行破碎，破碎后离心收集沉淀，再用洗液I重悬，并添加曲拉通至体积分数为1%，搅拌2-3h，然后用孔径为0.2µm的中空纤维柱超滤去除可溶性杂质，再进行浓缩，并加入与洗液I体积相等的洗液II，继续搅拌2-3h，继续用孔径为0.2µm中空纤维柱超滤，浓缩后收集沉淀，将沉淀用变性液溶解，37℃搅拌过夜，再用10kD截留分子量的中空纤维柱超滤，至悬液体积减少一半时，缓慢补加等体积的复性液，继续进行超滤浓缩，将浓缩液离心去除杂质，继续用0.45µm的中空纤维柱超滤，向滤出液中添加相当于滤出液2倍体积的变性液，然后超滤并收集滤出液，再用孔径为0.22µm的中空纤维柱超滤，收集滤出液，并向滤出液中添加相当于滤出液2倍体积的变性液后继续超滤收集滤出液，接着用10kD中空纤维柱超滤，超滤至蛋白含量大于30mg/mL。

3、所述疫苗在制备预防羊棘球蚴感染的疫苗中的应用。

本发明中发酵培养基为：蛋白胨 5g/L；酵母提取物2.5g/L；甘油 8g/L；KH₂PO₄ 10.5g/L；(NH₄)₂HPO₄ 6g/L；柠檬酸1.7g/L；MgSO₄ 1.68g/L； ZnSO₄ · 7H₂O 5.25g/L；MnSO₄· 4H₂O 0.5g/L； CaCl₂ 2.0g/L。补料液为：蛋白胨 40g/L；酵母提取物20g/L；微量元素：FeSO₄ · 7H₂O10 g/L；Na₂B₄O₇·10H₂O 0.23g/L；(NH₄)₆Mo₇O₂₄ 0.1g/L。

本发明中，洗液I的各组分及浓度如下：Tris 6.057g/L；EDTA 0.146g/L；NaCL 2.922g/L， DTT 0.77g/L，溶剂为水；洗液II的各组分浓度如下：Tris 6.057g/L；EDTA 0.146g/L；NaCL 2.922g/L；DTT 0.77g/L；尿素 180.18g/L，溶剂为水。变性液：甘氨酸11.25g/L；NaOH 0.5g/L；EDTA 0.37g/L；DTT 0.77g/L；Urea 540g/L，溶剂为水；复性液Tris 6.057g/L；EDTA 0.146g/L；NaCL 2.922g/L，溶剂为水。

本发明的有益效果：本发明涉及一种羊棘球蚴亚单位疫苗，由羊棘球蚴Eg95蛋白组成，也是主要的保护性抗原，可以激发良好双重的细胞及体液免疫应答，经原核表达的Eg95蛋白加入或不加入佐剂制备的注射剂型免疫接种羊群后，可安全、有效预防羊棘球蚴病的感染，为防控羊棘球蚴及人类感染棘球蚴病提供了理想的疫苗。

本发明进行了药效实验，通过注射免疫羊群可产生好的体液免疫与细胞免疫应答及天然免疫与获得性免疫应答以及黏膜免疫应答效果，免疫动物后，没有发现免疫损伤或由疫苗接种而导致的发病迹象，具有安全性；本发明羊棘球蚴亚单位疫苗免疫无免疫背景的羊群两次，进一步通过我国不同地区临床分离的棘球蚴虫卵攻毒，有95%以上的免疫保护效果；用本发明羊棘球蚴亚单位疫苗接种不同地区、种群的羊群，0，21天免疫两次，分别采用肌肉注射、皮下注射免疫，均没有出现由疫苗接种引发的发病现象，具有安全性。

附图说明

图1为Eg95 表达菌种筛选（A: F2代随机挑选10只菌种诱导表达；B: F3代随机挑选10只菌种诱导表达；C: F4代随机挑选10只菌种诱导表达；D: F3随机挑选代10只菌种诱导表达）。

图2为菌种表达稳定性实验（1~4泳道分别为Eg95表达菌株传代10、20、30、40代进行诱导表达鉴定）。

图3为Eg95 纯化鉴定（泳道1：纯化前Eg95；泳道2：纯化后Eg95）。

图4为抗体应答检测结果（实验羊经0、21天两次免疫后14天采外周血检测抗体滴度；其中PBS组、未免疫组（Netative control）无抗体效价；铝佐剂(Aluminum adjuvant)组抗体效价为阴性；疫苗组(Vaccine)抗体效价达到6400）。

图5为细胞因子应答检测（实验羊经0、21天两次免疫后14天检测INF-gamma、IL-4阳性T细胞，其中PBS组、未免疫组（Netative control）无阳性T细胞；铝佐剂(Aluminum adjuvant)细胞因子应答为阴性；疫苗组(Vaccine)有高水平阳性T细胞应答）。

具体实施例

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J. 萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例 1 构建羊棘球蚴亚单位疫苗的表达载体

以来自羊棘球蚴Eg95蛋白的核酸序列为模版(Genebank：AY421719.1)，以5’-gctacgtctctctagaatggcattccagttatgtc-3’为上游引物，下划线为 Xba I酶切位点；5’ -ctcgagtcaagtaaggacagcc-3’为下游引物，下划线为Xho I酶切位点，然后进行PCR扩增，PCR扩增条件为94˚C预变性45s；94˚C变性30s、58˚C退火45s、74˚C延伸45s，30个循环；最后74˚C后延伸2min，扩增获得如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，其编码的氨基酸如SEQ ID NO.2所示。获产物用Xba I和Xho I双酶切后连入经同样酶切的pGEX表达载体，获得重组pGEX-Eg95表达载体，所得载体中包含Xba I和Xho I酶切位点。

实施例 2 质粒稳定性鉴定

选用E.coli Bl21细胞为靶细胞，采用热激法将实施例1构建的重组pGEX-Eg95表达载体转化E.coli Bl21感受态细胞，然后筛选稳定高表达EG95蛋白的菌株。具体步骤如下：①在冰上解冻制备好的感受态E.coli Bl21细胞100µL，然后加入制备好的pGEX-Eg95载体1.5µg；②混匀后，冰上放置30min，45˚C水浴90s；③冰上放置3min，添加700µL LB培养基，37˚C活化1h；④将活化好的菌液涂布于Amp浓度为100µg/mL的 LB固体平板中，于37℃倒置培养过夜；⑤随机挑选饱满的单菌落，编号后接种于Amp浓度为100µg/mL的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养，6h后加IPTG至终浓度为1mM诱导表达4h。然后将表达EG95蛋白的菌株划线传代培养40代，每一代随机挑选10个单菌落培养并诱导蛋白表达，其中2~5代的表达结果如图1所示。结果显示，E.coli Bl21细胞5代内筛选到稳定高表达EG95的菌株。检测第10代、20代、30代和40代诱导表达E.coli Bl21细胞的表达情况，结果如图2所示。结果显示，菌株传代40代后任能稳定表达。因此，建立了稳定高表达EG95的E.coli Bl21菌株。进一步建立具有Eg95的三级种子库，经对全面检定符合疫苗生产要求，放置液氮中保存备用。

实施例 3 种子库建立

原始种子库建立：取实施例2制备的种子按接着量为1％接入Amp浓度为100µg/mL的1.5mL LB培养基中，于37℃进行震荡培养至OD₆₀₀达到0.8左右。然后将培养液用划线法接种于Amp浓度为100µg/mL的LB固体平板中，于37℃倒置培养过夜。随机挑选饱满的单菌落，编号后接种于5mL Amp浓度为100µg/mL的LB培养基中，37℃震荡培养。将培养至对数期的种子分别在无菌条件下取0.5mL于无菌EP管中，加等量无菌体积分数为80%的甘油，-20C˚保存备用。将剩余的菌液分别取1.5mL经12000rmp离心收集菌体，按碱裂解法或试剂盒提取质粒DNA。剩余加IPTG至终浓度为1mM诱导表达，并进行蛋白电泳鉴定。将提取的质粒DNA经核酸电泳检测后，分别进行PCR鉴定、双酶切鉴定。将经过核酸电泳检测、蛋白电泳检测、PCR鉴定、双酶切鉴定都成功的种子样品送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。返回的序列于NCBI进行Blast比对，同时与本地保存的序列做比对。

主种子库建立：原始种子样品经过核酸电泳检测、蛋白电泳检测、PCR鉴定、双酶切鉴定、序列比对后，与原始序列相同则为合格种子。将鉴定成功的种子编号相对应的保存样品取出，按接种量为1%接种于50mL Amp浓度为100µg/mL的LB培养基中，37℃度震荡培养至对数期。将培养至对数期的种子加甘油至体积分数为30%，混匀后按1mL/支进行无菌分装，于-80C˚保存，并命名为主种子批。

工作种子库建立：取主种子批种子，37C˚活化后用划线法筛选单菌落，随机挑选饱满的单菌落扩大培养。将培养至对数期的菌液分别在无菌条件下取出0.5mL进行甘油保种，剩余的一部分做质粒提取，并进行核酸电泳检测、PCR鉴定、双酶切鉴定、并测序。另一部分做诱导表达，并进行蛋白电泳检测。将检测合格的样品进行扩大培养，加甘油后进行分装保种。为保证生产批次间稳定，生产时每次取一只工作种子，直接活化后用于生产。

实施例 4 羊棘球蚴 EG95 蛋白工程菌株的高密度发酵

取-80C˚保存的工作种子，按接种量为0.1%接种于1L Amp浓度为100µg/mL的 LB培养基中，37℃震荡培养。培养至对数期时，将培养液全部接种于20L种子罐，用Amp浓度为100µg/mL的LB培养基培养至OD值为1.0-1.5后全部接种于200L二级种子罐。在正式发酵前，1500L发酵罐中灌装900L培养基，并进行在位灭菌。同时按比例分别加入微量元素（各微量元素的加入量如下：MgSO₄ 1.68g/L；ZnSO₄·7H₂O 5.25g/L；MnSO₄· 4H₂O 0.5g/L；CaCl₂ 2.0g/L；FeSO₄· 7H₂O 10 g/L；Na₂B₄O₇·10H₂O 0.23g/L；(NH₄)₆Mo₇O₂₄ 0.1g/L），搅拌均匀后将生长至对数生长期的的二级种子加入发酵罐进行发酵。同时监控pH值、DO值，并控制pH在6.5-8.5之间；DO在 30-50之间，每小时记录一次。通过检测发酵液中OD值来判断菌体生长情况，通过控制溶解氧、搅拌和补料速率，维持恒定的溶解氧，控制减少有机酸的生成。当OD值开始缓慢增加时，通过补加补料液及调节通气量来刺激细菌快速生长。当OD值增加过快、或溶氧下降过快时，通过增加通气量，同时停止添加补料液，以便调节溶解氧浓度到正常值。当菌体OD值达到40左右时，开始添加终浓度为1mM的IPTG进行诱导，诱导时间应在4-5小时内。

实施例 5 羊棘球蚴 EG95 蛋白的纯化

将培养后菌体离心收集并用适量洗液I重悬，通过高压均质机进行破碎。破碎后离心收集沉淀，加入相当于洗液I 体积3-5倍体积的洗液I重悬，并添加曲拉通至体积分数为1％，在温度为4-8℃条件下搅拌2-3小时。用0.2µm孔径的中空纤维柱超滤去除可溶性杂质。当悬液体积浓缩至20L左右时加入与洗液I用量相等的洗液II，继续搅拌2-3h。继续用中空纤维柱超滤，直至悬液体积缩小至20L，然后离心收集沉淀。将沉淀溶解相当于沉淀体积20倍体积变性液，37℃温和搅拌过夜。用10kD截留分子量中空纤维柱超滤，至悬液体积减少一半时，缓慢补加相应体积的复性液，继续进行超滤浓缩。当悬液体积缩小到20-30L，离心机离心去除杂质。连接0.45µm孔径的中空纤维柱进行超滤，收集滤出液，向滤出液中加入相当于滤出液2倍体积的变性液后继续超滤并收集滤出液。将0.45µm滤出液连接0.22µm孔径中空纤维柱进行超滤，收集滤出液，在向滤出液中加入相当于滤出液两倍体积变性液，继续超滤收集滤出液。将0.22µm滤出液连接10kD中空纤维柱，超滤浓缩至目的蛋白含量达到30mg/mL以上。

经纯化后，目的蛋白可达75%以上，并将此液体作为为羊棘球蚴亚单位疫苗原液。疫苗原液的外观为淡黄色澄清液体，pH值为7.0-7.2，通过血平板进行杂菌鉴定结果为阴性，通过半流体和肉汤培养基培养进行支原体鉴定结果为阴性，通过PAGE-SDS电泳检测结果显示目的条带清晰、无其他杂带（图3），采用Reed＆Muench法计算抗血清中和效价均高于1:2800。

实施例 6 羊棘球蚴亚单位疫苗剂型配制

注射剂型配制：分别将纯化的羊棘球蚴疫苗原液不加佐剂，用复性液配制成Eg95浓度为2500µg/3mL的无佐剂注射剂型；分别将纯化的羊棘球蚴疫苗原液加入氢氧化铝或磷酸铝，用复性液配置成Eg95浓度为2500µg/3mL，氢氧化铝或磷酸铝为3mg/3mL的有佐剂注射型疫苗。将以上注射疫苗溶液按3mL/瓶分装于西林瓶，于冷冻干燥设备冻干并封口包装。最终成品为淡黄色疏松固体，并含有50头份50µg/头份的Eg95抗原。放2-8℃备用。

实验例 7 羊棘球蚴亚单位疫苗检定实验

利用实施例6制备的羊棘球蚴亚单位疫苗注射剂型外观见均一，无异味和染菌；通过豚鼠、家兔试验无热原、异常毒性和急性毒性反应；通过3日龄乳鼠脑内接种，以及小羊颈部肌肉注射试验无发病现象；通过Lorry法测定蛋白含量均在剂量范围； ELISA测定DNA含量均在50EU以下；通过SDS-PAGE和WB检测抗原蛋白成分存在；通过免疫Balb/C小鼠1次血清中和抗体效价在3200以上。

实验例 8 羊棘球蚴亚单位疫苗对实验羊群体内的免疫应答效果实验

利用实施例6制备的羊棘球蚴疫苗的注射剂型，并用等量PBS、铝盐为对照组，分别免疫出生一年内、无免疫背景的羊群，按50µg/头份，皮下注射两次（0，21天）；末次免疫后14天采集各组羊群的外周血、分离血清，采集脾淋巴细胞；通过ELISA法测定血清抗体效价在6400以上，采用FFIT法测定中和抗体效价在3200以上，采用ELISPOT仪测定免疫细胞水平，INF-G及IL-4阳性细胞证明TH2/Th1应答平衡（图4和图5）。结果显示，本发明羊棘球蚴亚单位疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且试验组有佐剂组好于无佐剂组，而对照组没有产生双重免疫应答；制备的羊棘球蚴疫苗不管是注射还是滴鼻、饮水剂型均能产生满意的双重免疫应答。

实验例 9 羊棘球蚴亚单位疫苗对实验羊群体内的免疫保护效果实验

利用实施例6制备的羊棘球蚴亚单位疫苗的注射剂型为实验组，并用PBS、铝盐为对照组，分别免疫无免疫背景羊群，其免疫剂量按50µg/头份免疫两次（0，21天），末次免疫后14天，各试验组、对照组用200个/头实验狗体内分离的虫卵喂食攻毒，观察保护效果。结果显示，本发明羊棘球蚴疫苗能产生高水平的保护效果，免疫保护率在90%以上，而其他各对照组保护率为0%。因此，本发明制备的羊棘球蚴疫苗在羊群体内具有高效的免疫保护效果。

实验例 10 羊棘球蚴疫苗的安全性实验

（1）无菌、支原体试验：将实施例6制备的羊棘球蚴亚单位疫苗分别接种硫乙醇酸盐培养基、营养琼脂斜面培养基和改良马丁培养基培养14d，并以无菌生理盐水做阴性对照，培养温度为25℃、35℃。结果显示，羊棘球蚴亚单位疫苗都未见细菌生长。分别将羊棘球蚴亚单位疫苗用半流体和肉汤培养基，37℃初代培养21天，次代培养21天，无菌生理盐水做阴性对照，结果显示羊棘球蚴亚单位疫苗无支原体生长；用DNA染色法将毒种接种Vero细胞培养3天，传代一次，用二苯甲酰胺荧光染料染色。结果显示，羊棘球蚴亚单位疫苗均无支原体生长。

（2）溶血性试验：选取体重为350g左右的豚鼠，采集新鲜豚鼠血1mL，用PBS洗涤3次，再将血细胞体积恢复并稀释10倍。生理盐水稀释羊棘球蚴亚单位疫苗（由实施例6制备），分别为2倍、4倍、8倍，将豚鼠血细胞加入到稀释的待检佐剂中，8小时后，评价血球溶解以目测或者上清浓度检测为准，并在570nm处检测吸光度。结果显示，没有发生血球破裂，无溶血现象。说明羊棘球蚴亚单位疫苗中的成分不能使红细胞裂解。因此，羊棘球蚴亚单位疫苗均无溶血反应。

（3）急性毒性试验： 取实施例6制备的羊棘球蚴亚单位疫苗0.5mL腹腔注射体重为12～18g Balb/C小鼠，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察小鼠的活动状态、体重变化和存活率。结果表明，实验小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓等不良症状，而体重呈现增加，由此证明羊棘球蚴亚单位疫苗在试验的浓度下对动物是安全的，且14天后处死进行大体解剖检查，未见脏器有病理改变。

在体重为8～10kg的Beagle狗体内的急性毒性结果：取实施例6制备的羊棘球蚴亚单位疫苗肌肉注射15mL，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察行为、体重和存活率变化。结果可见，Beagle狗未见毒性反应，行为正常，没有死亡，与对照组狗比较无差异，各狗体重有所增加，并处死大体解剖未见脏器有明显的病理改变。因此，羊棘球蚴亚单位疫苗均无急性毒性反应，使用是安全的。

（4）过敏试验研究：取实施例6制备的羊棘球蚴亚单位疫苗皮下接种体重为250～350g Hartley豚鼠，每个样品接种豚鼠5只，每只接种0.5mL，隔日一次，共3次。第3次注射后21天，耳静脉分别给予相同羊棘球蚴亚单位疫苗0.5mL，并用人血白蛋白和生理盐水以同样的方法分别接种3只豚鼠作为阳性、阴性对照。注射后30分钟及3天观察动物，阳性、阴性对照均成立，羊棘球蚴亚单位疫苗组豚鼠无死亡，且无鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状。因此，羊棘球蚴亚单位疫苗在动物体内均无过敏反应。

（5）兔热源质试验：取预检合格的体重为2～3kg家兔3只固定，30分钟后测量体温，共测2次，间隔30分钟，要求2次温差不大于0.2℃，各家兔2次平均温度在38.6-39.5℃。将实施例6制备的羊棘球蚴亚单位疫苗预热至38℃，于第2次测温后15分钟内，自家兔耳边静脉分别缓缓注入0.5mL/只。注射后每隔30分钟测量体温1次，连测6次。结果显示：羊棘球蚴亚单位疫苗给予家兔个体升温均未超过0.2℃，没有引起家兔的发热反应。因此，制备的羊棘球蚴亚单位疫苗均无热源质。

实验例 11 羊棘球蚴亚单位疫苗稳定性实验

将实施例6制备的羊棘球蚴亚单位疫苗，分别置于2-8℃、室温（20-25℃）、37℃1周、2周、1个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月，取样观察外观、pH值、无菌、免疫动物观察安全性。结果显示：羊棘球蚴亚单位疫苗放置2-8℃24个月内均无变色分层等现象，pH值在7.0-7.2之间无变化，且注射或滴鼻给小鼠或实验猪，均表现正常；羊棘球蚴亚单位疫苗放置室温25℃ 3个月内均有好的稳定性；羊棘球蚴亚单位疫苗放置室温37℃1个月内均有好的稳定性效果。由结果说明，羊棘球蚴亚单位疫苗放置2-8℃，理化性质、生物学性能稳定，有效期至少24个月。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

<110> 重庆澳龙生物制品有限公司

<120> 一种羊棘球蚴亚单位疫苗及其制备方法和应用

<160> 2

<210> 1

<211> 471

<212> DNA

<213> 羊棘球蚴EG95蛋白基因序列

<220>

<223>

<400> 1

atggcattcc agttatgtct cattctgttt gcgacttcag ttttggctca ggaatacaaa 60

ggaatgggcg tagagacaag gacaacagag actccgctcc gtaaacactt caacttgact 120

cctgtgggtt ctcagggcat tcgcttaagt tgggaagtcc aacacttgtc tgacctcaaa 180

ggaacagata tttctctaaa agcggtgaat ccttctgacc cgttagtcta caaaagacaa 240

actgcaaaat tctcagatgg acaactcact atcggcgaac tgaagccccc cacattatac 300

aaaatgactg tggaagcagt gaaagcgaaa aagaccattt tgggattcac cgtagacatt 360

gagacaccgc gcgccggcag gaaggaaagc actgtaatga ctagtggatc cgccttaaca 420

tccgcaatcg ctggttttgt attcagctgc atagtggctg tccttacttg a 471

<210> 2

<211> 156

<212> PRT

<213> 羊棘球蚴EG95蛋白氨基酸序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Ala Phe Gln Leu Cys Leu Ile Leu Phe Ala Thr Ser Val Leu

1 5 10 15

Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu

20 25 30

Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln

35 40 45

Gly Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys

50 55 60

Gly Thr Asp Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu

65 70 75

Val Tyr Lys Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr

80 85 90

Ile Gly Glu Leu Lys Pro Pro Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu

95 100 105

Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile

110 115 120

Glu Thr Pro Arg Ala Gly Arg Lys Glu Ser Thr Val Met Thr Ser

125 130 135

Gly Ser Ala Leu Thr Ser Ala Ile Ala Gly Phe Val Phe Ser Cys

140 145 150

Ile Val Ala Val Leu Thr

155 156

Claims (10)

1.一种羊棘球蚴亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗为无佐剂注射剂型疫苗或佐剂注射型疫苗。

4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述佐剂注射剂型疫苗含3mg/3mL的佐剂和含2500µg/3mL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白，所述佐剂为氢氧化铝或磷酸铝。

5.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述无佐剂注射剂型疫苗含有浓度为2500µg/3mL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白。

6.权利要求1-5任一项所述疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：构建含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组原核表达载体，然后将重组原核表达载体转化原核表达菌株，经发酵培养后纯化，得羊棘球蚴亚单位疫苗。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述原核表达菌株为大肠杆菌BL 21菌株。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述发酵培养为将原核表达菌株在37℃条件下震荡培养至对数期，然后将培养液全部接种于种子罐，再在37℃条件下培养至OD值为1.0-1.5时，将培养液接种于二级种子罐培养，最后转移至发酵罐中进行发酵，当菌体OD值达到40时，添加IPTG至终浓度为1mM诱导4-5小时。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述纯化为将诱导后的培养液离心收集沉淀，经洗液I重悬后进行破碎，破碎后离心收集沉淀，再用洗液I重悬，并添加曲拉通至体积分数为1%，搅拌2-3h，然后用孔径为0.2µm的中空纤维柱超滤去除可溶性杂质，再进行浓缩，并加入与洗液I体积相等的洗液II，继续搅拌2-3h，继续用孔径为0.2µm中空纤维柱超滤，浓缩后收集沉淀，将沉淀用变性液溶解，37℃搅拌过夜，再用10kD截留分子量的中空纤维柱超滤，至悬液体积减少一半时，缓慢补加等体积的复性液，继续进行超滤浓缩，将浓缩液离心去除杂质，继续用0.45µm的中空纤维柱进行超滤，向滤出液中添加相当于滤出液2倍体积的变性液，然后超滤并收集滤出液，再用孔径为0.22µm的中空纤维柱超滤，收集滤出液，并向滤出液中添加相当于滤出液2倍体积的变性液后继续超滤收集滤出液，接着用10kD中空纤维柱超滤，超滤至蛋白含量大于30mg/mL。

10.权利要求1-5任一项所述疫苗在制备预防羊棘球蚴感染的疫苗中的应用。

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