CN108707191A - 一种乙型脑炎病毒非结构蛋白ns1截短突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

一种乙型脑炎病毒非结构蛋白ns1截短突变体及其编码基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108707191A
CN108707191A CN201810743444.2A CN201810743444A CN108707191A CN 108707191 A CN108707191 A CN 108707191A CN 201810743444 A CN201810743444 A CN 201810743444A CN 108707191 A CN108707191 A CN 108707191A
Authority
CN
China
Prior art keywords
encoding gene
japanese encephalitis
encephalitis virus
structural protein
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810743444.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108707191B (zh
Inventor
孔令保
徐晶
郭韫丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangxi Agricultural University
Original Assignee
Jiangxi Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangxi Agricultural University filed Critical Jiangxi Agricultural University
Priority to CN201810743444.2A priority Critical patent/CN108707191B/zh
Publication of CN108707191A publication Critical patent/CN108707191A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108707191B publication Critical patent/CN108707191B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • G01N2333/183—Flaviviridae, e.g. pestivirus, mucosal disease virus, bovine viral diarrhoea virus, classical swine fever virus (hog cholera virus) or border disease virus
    • G01N2333/185—Flaviviruses or Group B arboviruses, e.g. yellow fever virus, japanese encephalitis, tick-borne encephalitis, dengue
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及一种乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体及其编码基因和应用，属于病毒技术领域。乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体在原始NS1的基础上删除C端两个强疏水区，得到删除C端63个氨基酸的截短突变体NS1△63基因，克隆至原核表达载体pET‑28a(+)，获得重组表达载体pET28a‑NS1△63，转化大肠杆菌，IPTG诱导，NS1△63在大肠杆菌中能够高效且稳定表达。大肠杆菌表达的NS1△63蛋白纯化和免疫小鼠，ELISA检测免疫小鼠NS1抗血清效价达到1:12150。免疫小鼠的保护力试验表明NS1△63有保护活性。所述NS1△63蛋白可为后期的病毒疫苗及诊断试剂盒的研制奠定基础。

Description

一种乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体及其编码基因 和应用
技术领域
本发明属于病毒技术领域，具体涉及一种乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体及其编码基因和应用。
背景技术
乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)所引起的疾病称为乙型脑炎(简称乙脑)，乙脑是严重威胁人畜健康的一种蚊媒性人兽共患传染病。猪是JEV在自然界最重要的贮存和增殖宿主，JEV感染可引起仔猪脑炎和种猪繁殖障碍，给养猪业造成巨大经济损失。我国是乙脑流行的高发地区，这与我国地域辽阔，各地养猪普遍，人猪关系密切，以及水稻种植面积大，广泛分布有三带喙库蚊等乙脑传播媒介有关。
JEV属于黄病毒科(Flaviviradae)黄病毒属(Flavusivir)，其基因组为单股正链RNA，全长为10976个核苷酸，其中5′和3′端为非编码区，二者之间为JEV RNA编码区，形成一个开放阅读框(ORF)，编码全长为3432个氨基酸的多蛋白前体，该前体蛋白在蛋白酶的作用下被切割为3个结构蛋白：核心蛋白(C)、前膜蛋白(prM)、囊膜蛋白(E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。NS1基因长1245bp，编码蛋白大小约46KDa，在黄病毒属中有较高的同源性。NS1参与病毒复制扩增及释放，可诱导机体产生保护性免疫。但是现有技术公开了全长NS1蛋白在大肠杆菌表达量不高的问题，这就直接影响全长NS1蛋白在临床疫苗的研发和乙型脑炎治疗中的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体及其编码基因和应用，获得在大肠杆菌中稳定高效表达的NS1抗原，可诱导免疫保护力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体，所述非结构蛋白NS1截短突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。
本发明提供了一种所述乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
本发明提供了一种用于扩增所述编码基因的引物，包括正向引物NS1-F和反向引物NS1△63-R，所述正向引物NS1-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；反向引物NS1△63-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。
本发明提供了一种扩增所述编码基因的方法，包括以下步骤：
(1)提取乙型脑炎病毒的总RNA，逆转录，得到乙型脑炎病毒的cDNA；
(2)以所述乙型脑炎病毒的cDNA为模板，用所述引物进行PCR扩增，得到编码基因。
优选的，所述PCR扩增的反应体系：逆转录产物cDNA 0.4μl，聚合酶0.4μl，上下游引物各0.4μl，10×Buffer缓冲液2μl，2.5mmol/L dNTPs 0.4μl，补ddH2O至20μl。
优选的，所述PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min。
本发明提供一种重组载体，包含所述编码基因。
本发明提供了一种重组菌，所述重组菌包含所述编码基因或所述重组载体。
本发明提供了所述非结构蛋白NS1截短突变体、所述的编码基因、所述的引物、所述的重组载体或所述重组菌在原核体系表达中的应用。
本发明提供所述非结构蛋白NS1截短突变体、所述的编码基因、所述的引物、所述的重组载体或所述重组菌在制备乙型脑炎病毒疫苗或制备检测乙型脑炎病毒试剂盒中的应用。
本发明提供了一种乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体，所述非结构蛋白NS1截短突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。本发明是在原始非结构蛋白NS1的基础上删除C端两个强疏水区，形成的截短突变体NS1△63构建成原核表达载体pET28a-NS1△63，转化大肠杆菌，IPTG诱导，SDS-PAGE和Western blotting分析表明截短突变体NS1△63在大肠杆菌中能够高效且稳定表达；而全长NS1蛋白表达量不高，且不稳定。同时对原核系统表达的重组NS1△63蛋白经Ni柱纯化，免疫BALB/c小鼠2次，3周后，ELISA检测NS1抗血清效价达到1:12150。免疫小鼠的保护力试验表明NS1△63有保护活性。因此，本发明制备的NS1△63蛋白可为后期的疫苗及病毒诊断试剂盒的研制奠定基础。
附图说明
图1为实施例1中NS1蛋白疏水性分析结果图；
图2为实施例2中全长和截短NS1基因扩增产物鉴定；图2-A为JEV感染BHK-21细胞的总RNA电泳图；图2-B为NS1扩增产物鉴定结果；图2-C为NS1△63扩增产物鉴定结果，其中M为DNA marker2000；
图3为实施例3中重组质粒的双酶切鉴定，图3-A为pET28a-NS1△63双酶切的电泳图；图3-B为pET28a-NS1双酶切电泳图；其中M:DNA marker2000；
图4为实施例4中重组蛋白的诱导表达和表达条件优化结果，图4-A和图4-B分别为不同浓度IPTG和诱导时间对NS1△63蛋白表达量的影响，图4-A中，1：未诱导pET28a(+)转化菌株，2：诱导pET28a(+)转化菌株，3：未诱导pET28a-NS1△63转化菌株，4-9：诱导pET28a-NS1△63转化菌株，IPTG浓度分别为0.1,0.3,0.7,1.0,1.3,1.6mM；图4-B中，1：未诱导pET28a(+)转化菌株，2：诱导pET28a(+)转化菌株，3：未诱导pET28a-NS1△63转化菌株，4-9：诱导pET28a-NS1△63转化菌株，时间分别为1h，5h，10h，15，20h，25h；M：蛋白质marker；图4-C为重组NS1△63蛋白的Western blot分析，其中1：未诱导pET28a(+)转化菌株；2：诱导pET28a-NS1△63转化菌株；图4-D为全长NS1蛋白的诱导表达量，其中1：未诱导pET28a-NS1转化菌株，2：诱导pET28a-NS1△63转化菌株；图4-E为重组NS1蛋白的Western blot分析，1：未诱导pET28a(+)转化菌株；2：诱导pET28a-NS1转化菌株；
图5为重组蛋白的表达形式和纯化结果，其中图5-A为重组蛋白的表达形式电泳图，其中M：蛋白质marker，1：未诱导pET28a-NS1△63转化菌株，2：诱导pET28a-NS1△63全菌，3：诱导pET28a-NS1△63上清，4：诱导pET28a-NS1△63沉淀，5：未诱导pET28a(+)转化菌株，6：诱导pET28a(+)转化菌株；图5-B为重组蛋白的纯化结果，其中M：蛋白质marker，1：纯化NS1△63蛋白；
图6为NS1△63蛋白及抗血清的Western blotting分析，图6-A为NS1△63蛋白与感染JEV和未感染JEV BHK-21细胞蛋白裂解物反应的Western blotting图；M：蛋白质marker；1：未感染JEV；2：感染24h JEV；3：感染48h JEV；图6-B：NS1△63蛋白与乙脑病毒感染和未感染小鼠血清反应的Western blotting图，1：未感染JEV小鼠；2：感染JEV小鼠；
图7为NS1△63蛋白免疫小鼠抗体水平分析，图7-A在血清1:15稀释条件下的OD450，图7-B血清不同稀释浓度下的OD450，其中P(实验组OD450)/N(阴性对照组OD450)≥2.1判断为阳性。
具体实施方式
本发明提供了一种乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体，所述非结构蛋白NS1截短突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。所述乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体包括352个氨基酸。所述乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体是在乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1的基础上经疏水性分析，删除C端的两个强的疏水区得到。所述乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体的制备方法优选采用本领域所熟知的重组蛋白表达法得到。
本发明提供了一种所述乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。所述编码基因的长度为1056bp。所述编码基因的来源采用普通RT-PCR方法扩增得到。
本发明提供了一种用于扩增所述编码基因的引物，包括正向引物NS1-F和反向引物NS1△63-R，所述正向引物NS1-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；反向引物NS1△63-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。所述引物的来源优选委托基因合成公司完成。
本发明提供了一种扩增所述编码基因的方法，包括以下步骤：
(1)提取乙型脑炎病毒的总RNA，逆转录，得到乙型脑炎病毒的cDNA；
(2)以所述乙型脑炎病毒的cDNA为模板，用所述的编码基因的引物进行PCR扩增，得到编码基因。
本发明提取乙型脑炎病毒的总RNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的病毒的总RNA的提取方法即可。在本发明实施例中，提取总RNA的方法采用试剂盒法进行提取。所述试剂盒为Trizol RNA提取试剂盒购自invitrogen公司。
在本发明中，所述编码基因的引物分别包含BamH I和XhoI酶切位点，以便后续构建重组载体时便于酶切。
在本发明中，所述逆转录优选采用试剂盒法进行。本发明对所述逆转录试剂盒的厂家品牌等没有特殊限定，采用本领域所熟知的逆转录试剂盒即可。在本发明实施例中，所述逆转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司。
在本发明中，所述PCR扩增的反应体系优选如下：逆转录产物cDNA0.4μl，聚合酶0.4μl，上下游引物各0.4μl，10×Buffer缓冲液2μl，2.5mmol/L dNTPs 0.4μl，补ddH2O至20μl。
在本发明中，所述PCR扩增的反应程序优选如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min。
本发明提供一种重组载体，包含所述编码基因。本发明对重组载体的质粒没有特殊限制，采用本领域所熟知的表达质粒即可。在本发明中，所述重组载体的载体种类优选pET-28a(+)质粒。所述编码基因插入pET-28a(+)质粒中BamH I和XhoI的多克隆位点处。
在本发明中，所述重组载体的构建方法，优选将上述扩增得到编码基因和质粒采用BamH I和XhoI酶切，得到的编码基因酶切产物和质粒酶切产物连接，得到重组载体。所述连接的方法采用本领域所熟知的连接方法即可。连接后产物优选导入原核细胞中进行培养，培养菌体进行测序，得到目标基因的菌体为阳性菌体，从阳性菌体中抽提质粒，得到重组载体。
本发明对所述重组载体的宿主的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的原核细胞宿主种类即可。在本发明实施例中，所述原核细胞宿主优选为BL21(DE3)菌株。所述BL21(DE3)菌株的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的商品购买途径即可。
在本发明中，所述重组菌的制备方法，优选将上述构建的重组载体导入宿主细胞中，筛选得到重组菌。所述导入的方法优选采用42℃热激法。所述筛选的方法优选采用菌落PCR法或测序的方法得到。
本发明提供了所述非结构蛋白NS1截短突变体、所述的编码基因、所述的引物、所述的重组载体或所述重组菌在原核体系表达中的应用。
在本发明中，所述原核体系表达的方法，优选包括以下步骤：
将上述制备的重组菌接种到20mL含Kana的LB液体培养基振荡培养过夜；
将过夜培养的菌液转接入400mL含Kana的SOB液体培养基中振荡摇床培养至A600值0.4～0.7时，加入诱导剂IPTG至浓度1mmol/L，18℃诱导培养20h，收集菌体。
所述原核体系表达的方法使重组表达的NS1△63蛋白表达量最高。
在本发明中，所述重组菌诱导表达后，本发明还包括纯化，具体步骤如下：将所述NS1△63诱导表达的菌液经离心收集菌体，冰浴超声破碎后，离心，收集沉淀和上清，SDS-PAGE分析NS1△63蛋白的表达形式，利用Ni柱对NS1△63蛋白进行纯化，-20℃保存备用。
在本发明中，所述超声破碎的参数如下：超声破碎功率300w，破碎至样品澄清无异味。
在本发明中，每次离心采用的参数相同。所述离心的转速为10000g，所述离心的时间优选为15min。所述Ni柱购自QIAGEN公司。
本发明提供所述非结构蛋白NS1截短突变体、所述的编码基因、所述的引物、所述的重组载体或所述重组菌在制备乙型脑炎病毒疫苗或制备检测乙型脑炎病毒试剂盒中的应用。
在本发明中，所述非结构蛋白NS1截短突变体制备乙型脑炎病毒疫苗的方法，包括以下步骤：构建删除NS1蛋白C端两个强疏水区的截短突变体NS1△63的重组表达载体pET28a-NS1△63，转化大肠杆菌，IPTG诱导。SDS-PAGE和Western blotting分析NS1△63在大肠杆菌的表达大肠杆菌表达的NS1△63纯化和免疫小鼠，乙脑病毒强毒株攻击小鼠，分析NS1△63免疫小鼠的免疫保护力。
在本发明中，所述非结构蛋白NS1截短突变体可用于制备检测乙型脑炎病毒试剂盒的实验证据，包括以下步骤：NS1△63在大肠杆菌中诱导表达，Ni柱纯化NS1△63，免疫BALB/c小鼠，制备NS1△63抗血清。Western blotting分析显示大肠杆菌表达的NS1△63可与乙脑病毒感染小鼠抗血清发生特异性反应，NS1△63免疫鼠抗血清可与JEV病毒表达的NS1蛋白发生特异性反应。这些结果表明NS1△63可用于检测乙脑病毒抗血清，NS1△63抗血清可用于检测乙脑病毒抗原。因此，NS1△63和NS1△63抗血清可用于制备乙型脑炎病毒检测试剂盒
下面结合实施例对本发明提供的一种乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体及其编码基因和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
材料来源说明
(1)病毒、质粒、菌株和实验动物
JEV SA14-14-2株，JEV P3强毒株，BHK-21细胞，E.coli DH5α，E.coli BL21(DE3)，质粒pET-28a(+)由本实验室保存。3–5周龄雌性BALB/c小鼠购自小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
(2)试剂来源
His-tag抗体和HRP标记的羊抗鼠IgG二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司。各种限制性核酸内切酶，Taq DNA聚合酶，Pyrobest DNA聚合酶和T4DNA连接酶均为宝生物工程(大连)有限公司产品。培养细胞的DMEM和胎牛血清购自GIBCO公司。Trizol RNA提取试剂盒购自invitrogen公司。Ni柱购自QIAGEN公司。小鼠流行性乙型脑炎(JE)抗体(IgG)酶联免疫试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。
实施例1
NS1蛋白的疏水性分析
利用软件Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)分析乙脑病毒NS1蛋白的疏水性。
利用软件Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)分析乙脑病毒NS1蛋白的疏水性。结果如图1，横坐标表示氨基酸残基序列，纵坐标表示氨基酸残基残基的疏水亲水性，纵轴标的值越大则疏水性越强，纵轴标的值越小则亲水性越强。NS1蛋白的N端亲水性较强，但352位氨基酸之后的C端有两个强的疏水区。因此，决定构建全长NS1的表达载体和删除NS1蛋白C端两个强疏水区的截短突变体NS1△63的原核表达载体，比较NS1△63和全长NS1在大肠杆菌的表达水平差异。
实施例2
(1)引物设计及合成
根据JEV SA14-14-2株(AF315119)NS1基因序列设计引物，并由生工合成。引物序列如下：NS1正向引物：5′-CGCGGATCCGACACTGGATGTGCC-3′；全长NS1反向引物：5′-CCGCTCGAGAGCGGCGACTAGCA-3′；NS1△63反向引物：5’-CCGCTCGAGAGCATCAACCCGTGATC-3’。正反向引物分别引入BamH Ⅰ和XhoI酶切位点(下划线部分)。
(2)细胞及病毒培养
BHK-21细胞用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养，铺满密度约80％时接种乙脑病毒SA14-14-2株，约80％细胞出现病变时，收获细胞，提取总蛋白或总RNA。
(3)全长及截短NS1基因的扩增
Trizol RNA提取试剂盒提取JEV RNA，分别使用全长及截短NS1基因的反向引物，逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，PCR扩增NS1和NS1△63基因。反应体系：逆转录产物cDNA 0.4μl，聚合酶0.4μl，上下游引物各0.4μl，10×Buffer缓冲液2μl，2.5mmol/L dNTPs 0.4μl，补ddH2O至20μl。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环。
结果见图2。全长和截短NS1基因扩增产物鉴定，图2-A是JEV感染BHK-21细胞的总RNA；图2-B是NS1扩增产物鉴定电泳图；图2-C是NS1△63扩增产物鉴定电泳图，M:DNAmarker2000。
用Trizol提取JEV感染BHK-21细胞的总RNA(图2-A)，逆转录合成cDNA，以其为模板，PCR扩增NS1和NS1△63基因片段。1％琼脂糖凝胶电泳分析，可见约为1245bp(图2-B)和1056bp(图2-C)的特异条带，大小分别与NS1和NS1△63理论值相符。
实施例3
重组表达质粒的构建
将实施例2得到的PCR扩增的全长及截短NS1基因片段经XhoI和BamH Ⅰ双酶切后，分别与经同样酶酶切的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定，并送生工测序。测序正确的质粒分别命名为pET28a-NS1和pET28a-NS1△63，转化E.coli BL21(DE3)。
NS1和NS1△63基因的原核表达重组质粒pET28a-NS1和pET28a-NS1△63经BamHⅠ和XhoI酶切可得到预期大小的NS1(图3-A)和NS1△63片段(图3-B)，送往生工测序，BLAST比对序列正确无误，表明重组质粒构建成功。
实施例4
重组蛋白的表达及表达条件优化
将重组质粒pET28a-NS1或pET28a-NS1△63转化到BL21(DE3)菌株，接种到20mL含Kana的LB液体培养基中,37℃摇床培养过夜后，转入400mL含Kana的SOB液体培养基中，37℃摇床培养2～4hr至A600值0.6左右，加入诱导剂IPTG至浓度1mM，37℃或18℃诱导5h，10h，15h，20h，25h，收集菌体，SDS-PAGE分析，确定最佳诱导时间。为了确定最佳诱导剂浓度，加入不同浓度诱导剂IPTG(0,0.4,0.7,1.0,1.3,1.6mM)，18℃诱导20h，收集菌体，SDS-PAGE分析，确定最佳诱导时间。
在37℃温度下，采用不同IPTG浓度(0.6mM,0.8mM和1.0mM)和诱导时间(3h,4h,5h,6h和7h)表达全长及截短NS1，SDS-PAGE分析未见有与预测大小相符的目的蛋白诱导表达(图略)。在18℃温度下，SDS-PAGE分析发现NS1△63获得明显的诱导表达，IPTG浓度1mM，诱导时间20h，NS1△63蛋白表达量最高(图4-A和4-B)，NS1△63蛋白表达量占总蛋白的比例大于70％。使用His tag抗体对全长NS1表达产物进行Western blotting鉴定，证实NS1△63转化菌株表达了目的蛋白(图4-C)。但是，在18℃温度下，SDS-PAGE分析发现与预测大小相符的全长NS1蛋白仅仅有较低的诱导表达(图4-D)，而且转化菌株的全长NS1表达也很不稳定。使用His tag抗体对全长NS1表达产物进行Western blotting鉴定(图4-E)，证实全长NS1转化菌株表达了目的蛋白。
实施例5
NS1△63蛋白的表达形式和纯化
NS1△63诱导表达的菌液经离心收集菌体，冰浴超声破碎后，离心，收集沉淀和上清，SDS-PAGE分析NS1△63蛋白的表达形式。利用Ni柱对NS1△63蛋白进行纯化，-20℃保存备用。
SDS-PAGE分析显示，NS1△63蛋白以包涵体形式表达(图5)。重组NS1△63蛋白Ni柱纯化，获得与预期大小吻合的约46kD的NS1△63蛋白带。
实施例6
Western blotting分析
纯化的重组蛋白或JEV蛋白SDS-PAGE后，湿法电泳转移至PVDF膜上，5％的脱脂牛奶常温封闭孵育1h，TBST洗涤3次，以鼠抗His-tag一抗、NS1△63免疫小鼠抗血清或者乙脑病毒免疫小鼠抗血清孵育过夜，TBST洗涤3次，10min/次，以HRP标记的山羊抗鼠IgG(1:5000)为二抗，TBST洗涤3次，10min/次，使用化学发光法ECL显色。
Western blotting实验分析NS1△63蛋白免疫鼠的抗血清与JEV表达的NS1病毒蛋白是否发生特异性反应。JEV病毒NS1基因除了编码产生NS1蛋白，也编码产生一个在NS1的C端增加52个氨基酸的NS1’蛋白。Western blotting结果显示NS1△63抗血清可与JEV NS1和NS1’蛋白反应(图6)，表明大肠杆菌表达的NS1△63蛋白具备免疫原性。
实施例7
重组蛋白免疫小鼠及小鼠血清抗体效价的检测
每组8只3-5周龄雌性BALB/c鼠，分别将PBS和溶于100μl灭菌PBS溶液的纯化NS1△63蛋白皮下免疫鼠，50μg/只，初次免疫后，间隔1周加强免疫1次，初次免疫21天后采集兔颈动脉血，分离血清，使用流行性乙型脑炎抗体(IgG)酶联免疫试剂盒分析血清抗体效价。
使用流行性乙型脑炎抗体(IgG)酶联免疫试剂盒分析PBS组、NS1△63蛋白免疫组、SA14-14-2疫苗免疫组的小鼠血清NS1△63抗体滴度。结果表明：初次免疫后的第21天，NS1△63蛋白组和SA14-14-2疫苗组抗体水平与PBS对照组有显著统计学差异(图7-A和图7-B)。NS1△63蛋白组和SA14-14-2疫苗组抗体水平能达到1:12150(图7-B)。
实施例8
小鼠免疫保护力试验
NS1△63蛋白皮下免疫3-5周龄雌性BALB/c鼠，50μg/只，免疫2次。在第二次免疫后1周，腹腔注射100μl乙脑病毒(P3强毒株，TCID50＝10-6)，0.25ml/只。进行病毒攻击并连续观察21天，检查免疫鼠的生存状况。SA14-14-2疫苗株免疫的鼠作为阳性对照，PBS免疫的鼠作为阴性对照。每组8只3-5周龄雌性BALB/c鼠。
注射3h后，小鼠均有运动减少、精神不佳等症状。24h后，NS1△63实验组小鼠和SA14-14-2疫苗组小鼠状态开始好转，能正常饮食，PBS组开始出现小鼠死亡。21天后，PBS组则全部死亡。NS1△63实验组和SA14-14-2疫苗组无小鼠死亡。
表1小鼠免疫保护实验
实验组 生存数/总数
NS1△63组 8/8
PBS组 0/8
SA14-14-2疫苗组 8/8
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江西农业大学
<120> 一种乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体及其编码基因和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Thr Gly Cys Ala Ile Asp Ile Thr Arg Lys Glu Met Arg Cys Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ile Phe Val His Asn Asp Val Glu Ala Trp Val Asp Arg Tyr
20 25 30
Lys Tyr Leu Pro Glu Thr Pro Arg Ser Leu Ala Lys Ile Val His Lys
35 40 45
Ala His Lys Glu Gly Val Cys Gly Val Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu
50 55 60
His Gln Met Trp Glu Ala Val Arg Asp Glu Leu Asn Val Leu Leu Lys
65 70 75 80
Glu Asn Ala Val Asp Leu Ser Val Val Val Asn Lys Pro Val Gly Arg
85 90 95
Tyr Arg Ser Ala Pro Lys Arg Leu Ser Met Thr Gln Glu Lys Phe Glu
100 105 110
Met Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Ile Leu Phe Ala Pro Glu Leu
115 120 125
Ala Asn Ser Thr Phe Val Val Asp Gly Pro Glu Thr Lys Glu Cys Pro
130 135 140
Asp Glu His Arg Ala Trp Asn Ser Met Gln Ile Glu Asp Phe Gly Phe
145 150 155 160
Gly Ile Thr Ser Thr Arg Val Trp Leu Lys Ile Arg Glu Glu Ser Thr
165 170 175
Asp Glu Cys Asp Gly Ala Ile Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly His Val
180 185 190
Ala Val His Ser Asp Leu Ser Tyr Trp Ile Glu Ser Arg Tyr Asn Asp
195 200 205
Thr Trp Lys Leu Glu Arg Ala Val Phe Gly Glu Val Lys Ser Cys Thr
210 215 220
Trp Pro Glu Thr His Thr Leu Trp Gly Asp Asp Val Glu Glu Ser Glu
225 230 235 240
Leu Ile Ile Pro His Thr Ile Ala Gly Pro Lys Ser Lys His Asn Arg
245 250 255
Arg Glu Gly Tyr Lys Thr Gln Asn Gln Gly Pro Trp Asp Glu Asn Gly
260 265 270
Ile Val Leu Asp Phe Asp Tyr Cys Pro Gly Thr Lys Val Thr Ile Thr
275 280 285
Glu Asp Cys Ser Lys Arg Gly Pro Ser Val Arg Thr Thr Thr Asp Ser
290 295 300
Gly Lys Leu Ile Thr Asp Trp Cys Cys Arg Ser Cys Ser Leu Pro Pro
305 310 315 320
Leu Arg Phe Arg Thr Glu Asn Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg
325 330 335
Pro Val Arg His Asp Glu Thr Thr Leu Val Arg Ser Arg Val Asp Ala
340 345 350
<210> 3
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacactggat gtgccattga catcacaaga aaagagatga gatgtggaag tggcatcttc 60
gtgcacaacg acgtggaagc ctgggtggat aggtataaat atttgccaga aacgcccaga 120
tccctagcga agatcgtcca caaagcgcac aaggaaggcg tgtgcggagt cagatctgtc 180
actagactgg agcaccaaat gtgggaagcc gtaagggacg aattgaacgt cctgctcaaa 240
gagaatgcag tggacctcag tgtggttgtg aacaagcccg tgggaagata tcgctcagcc 300
cctaaacgcc tatccatgac gcaagagaag tttgaaatgg gctggaaagc atggggaaaa 360
agcatcctct ttgccccgga attggctaac tccacatttg tcgtagatgg acctgagaca 420
aaggaatgcc ctgatgagca cagagcttgg aacagcatgc aaatcgaaga cttcggcttt 480
ggcatcacat caacccgtgt gtggctgaaa attagagagg agagcactga cgagtgtgat 540
ggagcgatca taggcacggc tgtcaaagga catgtggcag tccatagtga cttgtcgtac 600
tggattgaga gtcgctacaa cgacacatgg aaacttgaga gggcagtctt tggagaggtc 660
aaatcttgca cttggccaga gacacacacc ctttggggag atgatgttga ggaaagtgaa 720
ctcatcattc cgcacaccat agccggacca aaaagcaagc acaatcggag ggaagggtat 780
aagacacaaa accagggacc ttgggatgag aatggcatag tcttggactt tgattattgc 840
ccagggacaa aagtcaccat tacagaggat tgtagcaaga gaggcccttc ggtcagaacc 900
actactgaca gtggaaagtt gatcactgac tggtgctgtc gcagttgctc ccttccgccc 960
ctacgattcc ggacagaaaa tggctgctgg tacggaatgg aaatcagacc tgttaggcat 1020
gatgaaacaa cactcgtcag atcacgggtt gatgct 1056
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcggatccg acactggatg tgcc 24
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgctcgaga gcatcaaccc gtgatc 26

Claims (10)

1.一种乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体，其特征在于，所述非结构蛋白NS1截短突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。
2.一种权利要求1所述乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1截短突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
3.一种用于扩增权利要求2所述编码基因的引物，其特征在于，包括正向引物NS1-F和反向引物NS1△63-R，所述正向引物NS1-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；反向引物NS1△63-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。
4.一种扩增权利要求2所述编码基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取乙型脑炎病毒总RNA，逆转录，得到乙型脑炎病毒的cDNA；
(2)以所述乙型脑炎病毒的cDNA为模板，用权利要求3所述引物进行PCR扩增，得到编码基因。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系：逆转录产物cDNA0.4μl，聚合酶0.4μl，上下游引物各0.4μl，10×Buffer缓冲液2μl，2.5mmol/L dNTPs 0.4μl，补ddH2O至20μl。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min。
7.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述编码基因。
8.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包含权利要求2所述编码基因或权利要求7所述重组载体。
9.权利要求1所述非结构蛋白NS1截短突变体、权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的引物、权利要求7所述的重组载体或权利要求9所述重组菌在原核体系表达中的应用。
10.权利要求1所述非结构蛋白NS1截短突变体、权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的引物、权利要求7所述的重组载体或权利要求9所述重组菌在制备乙型脑炎病毒疫苗或制备检测乙型脑炎病毒试剂盒中的应用。
CN201810743444.2A 2018-07-09 2018-07-09 一种乙型脑炎病毒非结构蛋白ns1截短突变体及其编码基因和应用 Active CN108707191B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810743444.2A CN108707191B (zh) 2018-07-09 2018-07-09 一种乙型脑炎病毒非结构蛋白ns1截短突变体及其编码基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810743444.2A CN108707191B (zh) 2018-07-09 2018-07-09 一种乙型脑炎病毒非结构蛋白ns1截短突变体及其编码基因和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108707191A true CN108707191A (zh) 2018-10-26
CN108707191B CN108707191B (zh) 2020-08-25

Family

ID=63874936

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810743444.2A Active CN108707191B (zh) 2018-07-09 2018-07-09 一种乙型脑炎病毒非结构蛋白ns1截短突变体及其编码基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108707191B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109504728A (zh) * 2018-11-22 2019-03-22 佛山科学技术学院 一种重组ns1蛋白及其制备方法与应用
CN110840908A (zh) * 2019-10-17 2020-02-28 浙江农林大学 lncRNA NONSUST0067151在抑制乙脑病毒增殖中的应用
CN111018970A (zh) * 2019-12-27 2020-04-17 中牧实业股份有限公司 一种猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清及其制备方法
CN112979826A (zh) * 2021-03-03 2021-06-18 华中农业大学 一种乙型脑炎病毒纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103328647B (zh) * 2010-09-21 2016-05-04 廖经伦 黄病毒重组体及其应用
WO2017144173A1 (en) * 2016-02-22 2017-08-31 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag An immunoassay for the diagnosis of viral infections

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103328647B (zh) * 2010-09-21 2016-05-04 廖经伦 黄病毒重组体及其应用
WO2017144173A1 (en) * 2016-02-22 2017-08-31 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag An immunoassay for the diagnosis of viral infections

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WUFANG FAN 等: "Membrane Association and Secretion of the Japanese Encephalitis Virus NS1 Protein from Cells Expressing NS1 cDNA", 《VIROLOGY》 *
沈红霞 等: "猪日本乙型脑炎病毒NS1基因的表达和抗体制备", 《浙江农林大学学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109504728A (zh) * 2018-11-22 2019-03-22 佛山科学技术学院 一种重组ns1蛋白及其制备方法与应用
CN110840908A (zh) * 2019-10-17 2020-02-28 浙江农林大学 lncRNA NONSUST0067151在抑制乙脑病毒增殖中的应用
CN111018970A (zh) * 2019-12-27 2020-04-17 中牧实业股份有限公司 一种猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清及其制备方法
CN112979826A (zh) * 2021-03-03 2021-06-18 华中农业大学 一种乙型脑炎病毒纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用
CN112979826B (zh) * 2021-03-03 2022-04-08 华中农业大学 一种乙型脑炎病毒纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108707191B (zh) 2020-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108707191A (zh) 一种乙型脑炎病毒非结构蛋白ns1截短突变体及其编码基因和应用
US9579375B2 (en) Chimeric poly peptides and the therapeutic use thereof against a Flaviviridae infection
CN110317278B (zh) Svv和fmdv的融合蛋白及其编码基因、表达载体、细胞系、工程菌和疫苗与应用
CN109182380B (zh) 杆状病毒表达的猪瘟e2亚单位疫苗的制备方法及应用
CN109651488A (zh) 猪丁型冠状病毒重组n蛋白及其多克隆抗体的制备方法
CN102757942A (zh) A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用
JPH03504336A (ja) 組換えポックスウイルス及び連鎖球菌ｍタンパク質ワクチン
CN112921005B (zh) 一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒vp2蛋白单克隆抗体和应用
CN103861093A (zh) 一种羊棘球蚴亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN109021115A (zh) 一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗
CN104293740B (zh) 表面展示sars双价抗原的重组杆状病毒及其制备方法和应用
CN107936123A (zh) 一种猪传染性胃肠炎病毒融合蛋白及其制备方法和应用
CN102337248B (zh) 表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组BHK细胞系及其应用
CN104292338A (zh) 含sars病毒n抗原的重组蛋白及展示n蛋白的杆状病毒
CN104560780B (zh) 产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体及其应用
KR101635673B1 (ko) Ａ형 간염 바이러스 백신 소재 단백질 ｖｐ1-3ｎ 및 백신 조성물
CN105267989A (zh) 一种新型水溶性免疫佐剂棘球蚴疫苗
CN109943576A (zh) 一种嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒及其应用
CN105267988A (zh) 一种新型cpg dna免疫佐剂棘球蚴疫苗
CN112661818A (zh) 一种犬猫细小病毒vp2350-420蛋白及其制备方法与应用
CN104152477A (zh) 日本血吸虫重组抗原SjPDI及其制备方法和应用
CN107814833A (zh) 刺激隐核虫重组蛋白质疫苗及制备方法和应用
TW201236693A (en) Method of inducing antibody in birds by the OmpA of Riemerella anatipestifer and the Riemerella anatipestifer vaccine
CN113861277A (zh) 一种牛轮状病毒重组vp8蛋白与应用
CN107827986B (zh) 猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant