CN109504728A - 一种重组ns1蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

一种重组ns1蛋白及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种重组NS1蛋白及其制备方法与应用。本发明将表达重组NS1蛋白的基因工程菌进行诱导表达，然后收集菌体，将菌体与浓度为0.2mol/L的NaHCO3溶液混悬，超声破碎菌体；对超声破碎后的菌体离心，弃上清，收集沉淀；将沉淀用浓度为0.2mol/L的NaHCO3溶液重悬，得到粗提液；在粗提液中加入8mol/L饱和尿素溶液以溶解包涵体，对溶解包涵体后的粗提液进行纯化；然后复性、浓缩，得到重组NS1蛋白。本发明提供的重组NS1蛋白的制备方法操作简便、快捷、成本低廉、适用范围广，制得的蛋白纯度高，产率高。

Description

一种重组NS1蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种重组NS1蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
流行性乙型脑炎(Epidemic encephalitis type B)又称日本乙型脑炎(Japaneseencephalitis，JE)，简称乙脑，是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种虫媒性人兽共患传染病。人和多种动物均可感染该病，以猪群感染最为普遍。猪感染后主要引起非化脓性脑炎，表现为突然发病，体温升高呈稽留热，精神沉郁，嗜睡，或后肢麻痹，个别表现有明显的神经症状。妊娠母猪表现为高热、流产、死胎、木乃伊胎，公猪则表现为睾丸炎。人患该病的最主要特征是患者中枢神经系统受病毒侵害而出现高热、意识障碍、惊厥等一系列症状，少数严重患者智力减退、失语、手脚强直不能活动等。由于其疫区范围较大、危害严重，被世界卫生组织列为需要重点控制的传染病。该病以伊三带喙库蚊(Culex tritaeniorhychus)为主要媒介，因此，库蚊也是其最主要的中间宿主和传染源。流行性乙型脑炎流行有明显的季节性或地方性，在蚊虫滋生的夏、秋季及库蚊活动频繁的地区易流行。目前尚无有效治疗方法，疫苗接种为主要的预防措施。
JEV是单股正链有囊膜的RNA病毒，属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)。病毒颗粒为球形，20面体对称，病毒外层有纤突。其基因组长约11kb，编码3个结构蛋白(C、M、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。NS1蛋白是主要抗原成分之一，为分泌型糖蛋白，含高甘露糖寡糖基团，分子质量约为40ku。NS1蛋白具备可溶性补体结合活性，能诱导机体产生非中和性抗体及宿主免疫反应，诱生非中和性的保护力。现有蛋白表达技术操作复杂，广泛适用性范围比较窄，不同蛋白表达的条件和方法都有所不同。
发明内容
为了克服现有技术的不足与缺点，本发明的首要目的在于提供一种重组NS1蛋白的制备方法，该方法简便、快捷、成本低廉。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的重组NS1蛋白。
本发明的再一目的在于提供上述重组NS1蛋白的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种重组NS1蛋白的制备方法，包含如下步骤：
(1)将表达重组NS1蛋白的基因工程菌进行诱导表达，然后收集菌体，将菌体与浓度为0.2mol/L的NaHCO3溶液混悬，超声破碎菌体；
(2)对超声破碎后的菌体离心，弃上清，收集沉淀；将沉淀用浓度为0.2mol/L的NaHCO3溶液重悬，得到粗提液；
(3)在粗提液中加入8mol/L饱和尿素溶液以溶解包涵体，对溶解包涵体后的粗提液进行纯化；然后复性、浓缩，得到重组NS1蛋白；
步骤(1)中所述的表达重组NS1蛋白的基因工程菌的制备方法，包含如下步骤：
将编码重组NS1蛋白的基因亚克隆到原核表达载体，得到重组载体；将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达重组NS1蛋白的基因工程菌；
所述的原核表达载体优选为pET-42b；
步骤(1)中所述的诱导表达的条件优选为加入终浓度为1mmol/L的IPTG 15～20℃诱导表达8～12h；
步骤(1)中所述的诱导表达的条件进一步优选为加入终浓度为1mmol/L的IPTG 16℃诱导表达10h；
步骤(1)中所述的超声破碎的条件优选为工作4～6s停10～18s，超声8～15min；
步骤(1)中所述的超声破碎的条件进一步优选为工作5s停15s，超声10min；
步骤(2)中所述的8mol/L饱和尿素溶液和粗提液中NaHCO3溶液的体积比优选为1：(8～12)；
步骤(2)中所述的8mol/L饱和尿素溶液和粗提液中NaHCO3溶液的体积比进一步优选为1：10；
步骤(3)中所述的纯化的具体操作优选为：
溶解包涵体后的粗提液利用镍亲和层析柱进行纯化，其中，洗脱液为含5～45mmol/L咪唑的缓冲液；
所述的洗脱液优选为含25mmol/L咪唑的缓冲液；
步骤(3)中所述的复性的具体操作优选为：
纯化后的蛋白用去离子水稀释3～10倍，然后用超滤离心管离心超滤；
所述的超滤离心管的截留分子量优选为1KD；
所述的离心的转速优选为5000r/min；
一种重组NS1蛋白，通过上述制备方法制备得到；
所述的重组NS1蛋白在制备疫苗产品中的应用；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供的重组NS1蛋白的制备方法操作简便、快捷、成本低廉、适用范围广。
(2)本发明提供的重组NS1蛋白的制备方法在缓冲液体系等方面进行了优化和探索，该方法对于可溶性蛋白具有非常好的纯化效果，制得的重组NS1蛋白纯度高、产率高。
(3)本发明提供的重组NS1蛋白的制备方法适用于可溶性NS1蛋白，纯化后的蛋白可直接用于蛋白活性测定和结构解析等后续工作。
附图说明
图1是NS1基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；其中，M：DL2000 DNA Marker；1：pET-NS1-F/R引物PCR扩增产物；2：pGEX-NS1-F/R引物PCR扩增产物。
图2是两个质粒双酶切电泳图，其中，M：DNA Marker；1：pET-42b-NS1质粒；2：pET-42b-NS1质粒双酶切；3：pGEX-KG-NS1质粒；4：pGEX-KG-N S1质粒双酶切。
图3是pET-42b-NS1蛋白表达SDS-PAGE凝胶电泳图；其中，M：蛋白质分子质量标准；1：未破碎原菌液；2：破碎后沉淀；3：破碎后上清；4：pET-4 2b空载体。
图4是pGEX-KG-NS1蛋白表达SDS-PAGE凝胶电泳图；其中，M：蛋白质分子质量标准；1：未破碎原菌液；2：破碎后沉淀；3：破碎后上清；4：pG EX-KG空载体。
图5是Western blotting检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)P3株(灭活疫苗株)、大肠杆菌DH5α、BL21感受态细胞及含GS标签的pGEX-KG、含His标签pET-42b均为市购；
PrimeSTAR HSDNAPolymerase、dNTP、T4DNA连接酶均购自宝生物(大连)科技有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；NdeⅠ、XhoⅠ、BamHⅠ、HindⅢ均购自Thermo公司；DNA纯化试剂盒购自Omega公司；DAB显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司；His标签蛋白质纯化试剂盒(包涵体蛋白)购自北京康为世纪生物科技有限公司。
实施例1
(1)引物设计
参考GenBank中流行性乙型脑炎病毒JaOArS982NS1基因序列(登录号：NC001437)，分别设计NS1对pET-42b和pGEX-KG两个载体的特异性引物，引物序列见表1，下划线为加入酶切位点：NdeⅠ/XhoⅠ、BamHⅠ/HindⅢ。引物均由武汉天一辉远生物有限公司合成。
表1引物设计
(2)原核表达载体的构建
①提取JEV P3株RNA，并反转录为cDNA；以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系(25μL)：5×PrimeSTAR Buffer 5μL，PrimeSTAR HSDNAPolymerase 0.3μL，cDNA模板1.2μL，上、下游引物各0.6μL，双蒸水17.3μL；PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后纯化回收，分别得到具有NdeⅠ/XhoⅠ酶切位点和BamHⅠ/HindⅢ酶切位点的PCR产物；其中，图1是NS1基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，由图1可知，NS1基因片段大小为1056bp，与理论大小相符。
②用NdeⅠ和XhoⅠ分别双酶切pET-42b载体及具有NdeⅠ/XhoⅠ酶切位点的PCR产物，用BamHⅠ和HindⅢ分别双酶切pGEX-KG载体及具有NdeⅠ/XhoⅠ酶切位点的PCR产物，酶切产物利用DNA纯化试剂盒纯化回收。将纯化的目的基因与载体用T4连接酶16℃过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板并37℃培养过夜；挑取数个单菌落，37℃摇菌，进行菌液PCR初步鉴定，得到约1000bp的条带，初步判定为阳性克隆；进一步对阳性菌提取质粒后做NdeⅠ/XhoⅠ和BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定，结果均得到了与理论相符的载体和目的基因两条带(图2)，鉴定为阳性克隆质粒pET-42b-NS1与pGEX-KG-NS1；将阳性克隆质粒送武汉天一辉远生物有限公司测序，结果表明，P3株NS1基因全长1056bp，与参考株同源性为99％以上，推测由352个氨基酸构成，且表达框正确，序列如下所示：
ATGGCTTCTCTTGGAGTTGGGCTGTCTGATCAGGAATGGCTTGGTTATTGGCACGGAGCTATTACTGGTTTCAAGAATCCCAGCTTTAGTTATGTCATCAGAATTGATCTTAAGGATTGGAGAAGCTCTGAGCGTGCCATTATGGACATTTTTTCTAAAGATCTACCGGCCATCATTGATGACATTGTAGATTCTGAAAAGGAGATGTTACTCTGCGATCTCAATTATGACTGGAAGGGCAGTCTGAGCATGAAGCTCAAGAATCAGCACAGTCTCGGTCAGGTCCTCTGTGAGGCTGGGGACATCGCCGTCAAACGGCTGTTCCAGTTGAAGCAGCAGAATCACAATCCGGTCTACAGCTGCTTCTCTCAGGCAGAGATAGGAGACACCTATATGCACGTCCATCTGGTGTGCGGAGGAGCGCGTGCTCTGTGAGAGGGTCAAGGCTCATCAGGACGCGACCGTTACCTGTCTGACCTATCGAGACAGGCACAACGAGTCTCACGCTCAGCGCATCGACGCTTCCAGCTTCATCACCAACTATCTCTTGCCGAAGAATAGATCGCTGTGTACCTGGCTGGGTCCAGATATCTGCACTCCGAGCGTAGCTCAGTTTGAGACCAACAAGACCTACATGTGCAGTCACATTGACAGGCAGCCGATCACTCACTATCTCAGGAAGGCTCTCTATGACCGGCTGGTCATGAACAGCGCCGAGGAGACAGGGGAACCTGTCCATAAGGCGGCGCGCTGGAGCGATCTGCCTGAGGTGGGTGAGAACTCGCTGGCTAGACAGAATACAGCCACTAGGCCGACTAAGCTGACGAGAAAGCAACATGTCATGTTAGATACACTGCAGAGATGTCAGGAGGAGTTTATCTGTACCAAGGAAGAGTTAACTATGCTACATCCAGATCTACGGCAATTTCCAGACAACAAGTTTGGGTGGCGACCGTGCTTTCTAAGAAGGCCGGGAAACAAAACACCATCTGTTTCTTTGGTCCGGCAAGTAGCGATAGGGAGACACCTATCGGGCGGGGAGGGATGTGCTCATGA
(3)NS1蛋白表达及鉴定
①取pET-42b-NS1与pGEX-KG-NS1质粒各1μL，分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞，涂板培养，分别得到含有pET-42b-NS1的基因工程菌和含有pGE X-KG-NS1的基因工程菌；
②将含有pET-42b-NS1的基因工程菌和含有pGEX-KG-NS1的基因工程菌菌种分别活化后挑取一个单菌落于相应抗性的50mL液体培养基中，37℃摇菌，得到种子液；取1mL种子液加入到相应抗性的100mL液体培养基中37℃培养增菌2h，至OD600为0.8，然后加100μL1M诱导剂IPTG，16℃摇菌表达10h；
③取1mL步骤②诱导表达后的菌液集菌后加200μL浓度为0.2mol/L的NaHCO3溶液重悬，超声破碎(工作5s停15s，超声10min)后离心分离上清与沉淀，加SDS上样缓冲液，煮沸10min备用。按说明书制备SDS-PAGE凝胶，点样，并调电压至120V，电泳1.5～2h。将胶铲下，用考马斯亮蓝染色1h，移出凝胶并回收染液，用脱色液脱色后观察结果并拍照保存。结果显示，NS1与His标签融合表达了大小约40ku的蛋白(图3)，但以包涵体形式表达在沉淀中，上清中含量很低；NS1与GST标签也较好地融合表达了66ku的蛋白(图4)，但是也表达在沉淀中。
④步骤③中制得的沉淀SDS-PAGE电泳后，然后用转膜仪将蛋白转至NC膜上，5wt％脱脂奶粉封闭，His单抗(小鼠，市购)室温孵育2h，TBST洗脱，加1∶2000RHP标记的羊抗鼠抗体室温孵育1h，TBST洗脱后，加DAB显色剂显色，观察显色结果并拍照保存。结果在40ku处出现蛋白印迹(图5)，说明确实进行了融合表达。由于His标签相比GST标签要小的多，对重组蛋白结构的影响较小，而且后期进行标签切除的时候，His标签也要比GST标签容易切除的多，所以本发明选择包含His标签的基因工程菌进行重组NS1蛋白的大量表达。
实施例2大量表达及纯化
(1)将实施例1制得的含有pET-42b-NS1的基因工程菌菌种分别活化后挑取一个单菌落于相应抗性的液体培养基中，37℃摇菌，得到种子液；取种子液接种到相应抗性的液体培养基中37℃培养至OD600为0.8，然后加终浓度为1mM的诱导剂IPTG，16℃摇菌表达10h；取诱导表达后的菌液集菌后加浓度为0.2mol/L的NaHCO3溶液重悬，超声破碎(工作5s停15s，超声10min)；
(2)对超声破碎后的菌体离心，弃上清，收集沉淀；将沉淀用浓度为0.2mol/L的NaHCO3溶液重悬，得到粗提液；
(3)在粗提液中加入8mol/L饱和尿素溶液以溶解包涵体，其中，8mol/L饱和尿素溶液和粗提液中NaHCO3溶液的体积比为1：10；然后利用His标签蛋白质纯化试剂盒(包涵体蛋白)进行蛋白纯化，按说明书进行操作，其中，采用含5、15、25、35、45mmol/L咪唑的洗脱液进行梯度洗脱，收集各个梯度洗脱蛋白；SDS-PAGE电泳检测各洗脱梯度洗脱得到的流穿液的蛋白纯度，检验纯化效果，结果显示，最佳咪唑洗脱浓度为25mmol/L；
(4)将步骤(3)25mmol/L咪唑的洗脱液洗脱得到的流穿液用去离子水稀释5倍，然后用截留分子量为1KD的超滤离心管5000r/min离心超滤，逐渐降低蛋白纯化液中尿素浓度，达到复性效果，然后进一步浓缩，得到重组NS1蛋白，经检测，蛋白纯度为95％，浓度为1.2mg/mL，-80℃保存。
取3μL制得的重组NS1蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳试验及Western blotting鉴定，SDS-PAGE电泳检测结果发现一条约39ku大小的条带，较前期检测结果略小。进一步进行Western blotting检测，结果显示同样大小的条带。
实施例3大量表达及纯化
(1)将实施例1制得的含有pET-42b-NS1的基因工程菌菌种分别活化后挑取一个单菌落于相应抗性的液体培养基中，37℃摇菌，得到种子液；取种子液接种到相应抗性的液体培养基中37℃培养至OD600为0.8，然后加终浓度为1mM的诱导剂IPTG，15℃摇菌表达12h；取诱导表达后的菌液集菌后加浓度为0.2mol/L的NaHCO3溶液重悬，超声破碎(工作4s停10s，超声15min)；
(2)对超声破碎后的菌体离心，弃上清，收集沉淀；将沉淀用浓度为0.2mol/L的NaHCO3溶液重悬，得到粗提液；
(3)在粗提液中加入8mol/L饱和尿素溶液以溶解包涵体，其中，8mol/L饱和尿素溶液和粗提液中NaHCO3溶液的体积比为1：8；然后利用His标签蛋白质纯化试剂盒(包涵体蛋白)进行蛋白纯化，按说明书进行操作，其中，采用含25mmol/L咪唑的洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白；
(4)将步骤(3)25mmol/L咪唑的洗脱液洗脱得到的流穿液用去离子水稀释3倍，然后用截留分子量为1KD的超滤离心管5000r/min离心超滤，逐渐降低蛋白纯化液中尿素浓度，达到复性效果，然后进一步浓缩，得到重组NS1蛋白。
实施例4大量表达及纯化
(1)将实施例1制得的含有pET-42b-NS1的基因工程菌菌种分别活化后挑取一个单菌落于相应抗性的液体培养基中，37℃摇菌，得到种子液；取种子液接种到相应抗性的液体培养基中37℃培养至OD600为0.8，然后加终浓度为1mM的诱导剂IPTG，20℃摇菌表达8h；取诱导表达后的菌液集菌后加浓度为0.2mol/L的NaHCO3溶液重悬，超声破碎(工作6s停18s，超声8min)；
(2)对超声破碎后的菌体离心，弃上清，收集沉淀；将沉淀用浓度为0.2mol/L的NaHCO3溶液重悬，得到粗提液；
(3)在粗提液中加入8mol/L饱和尿素溶液以溶解包涵体，其中，8mol/L饱和尿素溶液和粗提液中NaHCO3溶液的体积比为1：12；然后利用His标签蛋白质纯化试剂盒(包涵体蛋白)进行蛋白纯化，按说明书进行操作，其中，采用含25mmol/L咪唑的洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白；
(4)将步骤(3)25mmol/L咪唑的洗脱液洗脱得到的流穿液用去离子水稀释10倍，然后用截留分子量为1KD的超滤离心管5000r/min离心超滤，逐渐降低蛋白纯化液中尿素浓度，达到复性效果，然后进一步浓缩，得到重组NS1蛋白。
对比实施例1
(1)将实施例1制得的含有pET-42b-NS1的基因工程菌菌种分别活化后挑取一个单菌落于相应抗性的液体培养基中，37℃摇菌，得到种子液；取种子液接种到相应抗性的液体培养基中37℃培养至OD600为0.8，然后加终浓度为1mM的诱导剂IPTG，16℃摇菌表达10h；取诱导表达后的菌液集菌后加0.2M磷酸缓冲液(组分Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.0)重悬，超声破碎(工作5s停15s，超声10min)；
(2)对超声破碎后的菌体离心，弃上清，收集沉淀；将沉淀用0.2M磷酸缓冲液(组分Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.0)重悬，得到粗提液；
(3)在粗提液中加入8mol/L饱和尿素溶液以溶解包涵体，其中，8mol/L饱和尿素溶液和粗提液中磷酸缓冲液的体积比为1：10；然后利用His标签蛋白质纯化试剂盒(包涵体蛋白)进行蛋白纯化，按说明书进行操作，其中，采用含25mmol/L咪唑的洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白；
(4)将步骤(3)25mmol/L咪唑的洗脱液洗脱得到的流穿液用去离子水稀释5倍，然后用截留分子量为1KD的超滤离心管5000r/min离心超滤，逐渐降低蛋白纯化液中尿素浓度，达到复性效果，然后进一步浓缩，得到重组NS1蛋白，其中，纯度为75％，浓度为1.03mg/mL。
对比实施例2
(1)将实施例1制得的含有pET-42b-NS1的基因工程菌菌种分别活化后挑取一个单菌落于相应抗性的液体培养基中，37℃摇菌，得到种子液；取种子液接种到相应抗性的液体培养基中37℃培养至OD600为0.8，然后加终浓度为1mM的诱导剂IPTG，16℃摇菌表达10h；取诱导表达后的菌液集菌后加浓度为0.05mol/L的NaHCO3溶液重悬，超声破碎(工作5s停15s，超声10min)；
(2)对超声破碎后的菌体离心，弃上清，收集沉淀；将沉淀用浓度为0.05mol/L的NaHCO3溶液重悬，得到粗提液；
(3)在粗提液中加入8mol/L饱和尿素溶液以溶解包涵体，其中，8mol/L饱和尿素溶液和粗提液中NaHCO3溶液的体积比为1：10；然后利用His标签蛋白质纯化试剂盒(包涵体蛋白)进行蛋白纯化，按说明书进行操作，其中，采用含25mmol/L咪唑的洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白；
(4)将步骤(3)25mmol/L咪唑的洗脱液洗脱得到的流穿液用去离子水稀释5倍，然后用截留分子量为1KD的超滤离心管5000r/min离心超滤，逐渐降低蛋白纯化液中尿素浓度，达到复性效果，然后进一步浓缩，得到重组NS1蛋白，其中，纯度为80％，浓度为1.03mg/mL。
对比实施例3
(1)将实施例1制得的含有pET-42b-NS1的基因工程菌菌种分别活化后挑取一个单菌落于相应抗性的液体培养基中，37℃摇菌，得到种子液；取种子液接种到相应抗性的液体培养基中37℃培养至OD600为0.8，然后加终浓度为1mM的诱导剂IPTG，16℃摇菌表达10h；取诱导表达后的菌液集菌后加浓度为0.5mol/L的NaHCO3溶液重悬，超声破碎(工作5s停15s，超声10min)；
(2)对超声破碎后的菌体离心，弃上清，收集沉淀；将沉淀用浓度为0.5mol/L的NaHCO3溶液重悬，得到粗提液；
(3)在粗提液中加入8mol/L饱和尿素溶液以溶解包涵体，其中，8mol/L饱和尿素溶液和粗提液中NaHCO3溶液的体积比为1：10；然后利用His标签蛋白质纯化试剂盒(包涵体蛋白)进行蛋白纯化，按说明书进行操作，其中，采用含25mmol/L咪唑的洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白；
(4)将步骤(3)25mmol/L咪唑的洗脱液洗脱得到的流穿液用去离子水稀释5倍，然后用截留分子量为1KD的超滤离心管5000r/min离心超滤，逐渐降低蛋白纯化液中尿素浓度，达到复性效果，然后进一步浓缩，得到重组NS1蛋白。其中，纯度为70％，浓度为1.11mg/mL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 一种重组NS1蛋白及其制备方法与应用
<130> 1
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物pET-NS1-F
<400> 1
ggaattccat atggacactg gatgtgccat tg 32
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物pET-NS1-R
<400> 2
ccgctcgaga gcatcaacct gtgatctaac 30
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物pGEX-NS1-F
<400> 3
cgggatccga cactggatgt gccattg 27
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物pGEX-NS1-R
<400> 4
cccaagctta gcatcaacct gtgatctaac 30
<210> 5
<211> 1056
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NS1基因全长
<400> 5
atggcttctc ttggagttgg gctgtctgat caggaatggc ttggttattg gcacggagct 60
attactggtt tcaagaatcc cagctttagt tatgtcatca gaattgatct taaggattgg 120
agaagctctg agcgtgccat tatggacatt ttttctaaag atctaccggc catcattgat 180
gacattgtag attctgaaaa ggagatgtta ctctgcgatc tcaattatga ctggaagggc 240
agtctgagca tgaagctcaa gaatcagcac agtctcggtc aggtcctctg tgaggctggg 300
gacatcgccg tcaaacggct gttccagttg aagcagcaga atcacaatcc ggtctacagc 360
tgcttctctc aggcagagat aggagacacc tatatgcacg tccatctggt gtgcggagga 420
gcgcgtgctc tgtgagaggg tcaaggctca tcaggacgcg accgttacct gtctgaccta 480
tcgagacagg cacaacgagt ctcacgctca gcgcatcgac gcttccagct tcatcaccaa 540
ctatctcttg ccgaagaata gatcgctgtg tacctggctg ggtccagata tctgcactcc 600
gagcgtagct cagtttgaga ccaacaagac ctacatgtgc agtcacattg acaggcagcc 660
gatcactcac tatctcagga aggctctcta tgaccggctg gtcatgaaca gcgccgagga 720
gacaggggaa cctgtccata aggcggcgcg ctggagcgat ctgcctgagg tgggtgagaa 780
ctcgctggct agacagaata cagccactag gccgactaag ctgacgagaa agcaacatgt 840
catgttagat acactgcaga gatgtcagga ggagtttatc tgtaccaagg aagagttaac 900
tatgctacat ccagatctac ggcaatttcc agacaacaag tttgggtggc gaccgtgctt 960
tctaagaagg ccgggaaaca aaacaccatc tgtttctttg gtccggcaag tagcgatagg 1020
gagacaccta tcgggcgggg agggatgtgc tcatga 1056

Claims (10)

1.一种重组NS1蛋白的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)将表达重组NS1蛋白的基因工程菌进行诱导表达，然后收集菌体，将菌体与浓度为0.2mol/L的NaHCO3溶液混悬，超声破碎菌体；
(2)对超声破碎后的菌体离心，弃上清，收集沉淀；将沉淀用浓度为0.2mol/L的NaHCO3溶液重悬，得到粗提液；
(3)在粗提液中加入8mol/L饱和尿素溶液以溶解包涵体，对溶解包涵体后的粗提液进行纯化；然后复性、浓缩，得到重组NS1蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组NS1蛋白的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的表达重组NS1蛋白的基因工程菌的制备方法，包含如下步骤：
将编码重组NS1蛋白的基因亚克隆到原核表达载体，得到重组载体；将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达重组NS1蛋白的基因工程菌。
3.根据权利要求1所述的重组NS1蛋白的制备方法，其特征在于：
所述的原核表达载体为pET-42b。
4.根据权利要求1所述的重组NS1蛋白的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的诱导表达的条件为加入终浓度为1mmol/L的IPTG 15～20℃诱导表达8～12h。
5.根据权利要求1所述的重组NS1蛋白的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的超声破碎的条件为工作4～6s停10～18s，超声8～15min。
6.根据权利要求1所述的重组NS1蛋白的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的8mol/L饱和尿素溶液和粗提液中NaHCO3溶液的体积比为1：(8～12)。
7.根据权利要求6所述的重组NS1蛋白的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的8mol/L饱和尿素溶液和粗提液中NaHCO3溶液的体积比为1：10。
8.根据权利要求1所述的重组NS1蛋白的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的纯化的具体操作为：
溶解包涵体后的粗提液利用镍亲和层析柱进行纯化，其中，洗脱液为含5～45mmol/L咪唑的缓冲液。
9.根据权利要求1所述的重组NS1蛋白的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的浓缩复性的具体操作为：
纯化后的蛋白用去离子水稀释3～10倍，然后用超滤离心管离心超滤；
所述的超滤离心管的截留分子量为1KD。
10.一种重组NS1蛋白，其特征在于通过权利要求1～9任一项所述的制备方法制备得到。
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