KR102100813B1

KR102100813B1 - C형 간염바이러스 유래 융합 단백질 및 이를 포함하는 진단키트

Info

Publication number: KR102100813B1
Application number: KR1020180136531A
Authority: KR
Inventors: 최동옥; 윤미진; 박상진
Original assignee: 주식회사 보레다바이오텍; 한국화학연구원
Priority date: 2018-11-08
Filing date: 2018-11-08
Publication date: 2020-04-16

Abstract

본 발명은 C형 간염바이러스의 코어 단백질, 비구조 단백질 NS3 및 NS5로 구성된 융합 단백질 및 이를 포함하는 C형 간염바이러스의 감염 진단용 조성물 및 진단키트에 관한 것이다.

Description

C형 간염바이러스 유래 융합 단백질 및 이를 포함하는 진단키트{Fusion protein from hepatitis C virus and diagnosing kit comprising the same}

C형 간염 바이러스(HCV)는 하나의 양성 가닥으로 이루어진 약 1×10⁴개의 염기로 구성된 RNA 바이러스로서, 몇 개의 구조 및 비구조 단백질로 이루어진 하나의 폴리펩타이드를 암호화하고 있다. HCV의 유전자 구조는 플라비 바이러스(Flavivirus)나 페스티 바이러스(Pestivirus)와 유사성을 가지며, 이들 유연관계로 부터 HCV의 폴리펩타이드는 아미노 말단으로부터 핵(core) - 외피1(E1) - 외피2/비구조 1(E2/NS1) - 비구조 2(NS2) - 비구조 3(NS3) - 비구조 4(NS4) - 비구조 5(NS5) 순으로 구성되어 있는 것으로 추정된다.

C형 간염바이러스는 non-A, non-B형 만성간염, 간경변증 및 간암의 가장 중요한 원인으로 알려져 있으며, 우리나라에서도 B형 간염바이러스 다음으로 중요한 간염바이러스로 보고된 바 있다. C형 간염은 전세계적으로 약 1억 7천만 명이 감염되어 있으며, 매년 3백만 명 이상이 새로이 감염되고 있다. 국내에서는 HCV Ab 양성율이 성인 검사자의 0.4~2.1%, 헌혈자의 0.34%이며, HCV 감염의 고위험군인 혈우병환자에서는 42.3%, 혈액투석환자에서는 13.7%로 높은 유병률을 보이는 질환이다. 국내의 경우 최소 1% 이상의 C형 간염바이러스 감염자가 있으며, 실제 B형 간염은 예방백신에 의해 감염자 수가 감소하고 있으나 C형 간염 환자수는 증가하는 추세이다. C형 간염의 특징은 감염자의 70~80%가 만성화되며, 만성 감염자의 20% 이상이 간 경변이나 간암으로 진행되기 때문에 정기적인 검사가 반드시 필요하다.

HCV의 유전자형은 1형부터 6형까지 알려져 있고, 이에 대한 아형은 70개 이상 존재한다. 전 세계적으로 가장 많이 퍼져 있는 유전자형 1b형은 C형 간염바이러스 치료제인 인터페론 (interferon)에 저항성을 가지며, 국내에서는 유전자형 1b와 2a형이 가장 많다. 유전자형 2a와 2b는 일본과 이탈리아 북부에서 많이 유행하며, 유전자형 3은 인도에서 가장 빈번하게 유행하고 유전자형 4는 아프리카 및 중앙아시아에서 유행한다.

기존의 연구에서는 핵 구조 유전자로부터 발현되는 핵 단백질 C22-3과 비구조 3 (NS3) 부분인 C33C, 비구조 4 (NS4) 부분인 C200을 혼합한 제2세대 진단시약을 개발하여, HCV 항체에 대한 민감도 및 특이도를 향상시킨 것으로 보고되었다. 이상의 결과는 HCV에 대한 단일 항원만을 사용하는 것보다는 구조 및 비구조 각 부위에 대한 혼합항원을 사용하는 것이 HCV 항체 검출의 민감도 및 특이도를 향상시키고, HCV에 대한 항체의 조기 검출에도 유리하다는 사실을 제시하고 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 C형 간염바이러스의 유전자 구조 중 핵(core), 비구조3 (NS3) 및 비구조5 (NS5) 부위에서 항원성이 확인된 특정된 세 가지의 항원으로 구성된 융합 단백질을 이용하는 경우, 각각의 항원을 혼합하여 사용하는 경우에 비해 양성 검체에 대한 신호 상승효과를 얻을 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 C형 간염바이러스 유래 코어(core), NS3 및 NS5 단백질로 구성된 융합 단백질 및 이를 포함하는 C형 간염바이러스 감염 진단용 조성물 및 진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 C형 간염바이러스 항원 융합 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환 시킨 형질전환체와 이를 이용한 융합 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고, C형 간염바이러스(HCV)로부터 유래된 코어(core), NS3 및 NS5 단백질로 이루어지는 융합 단백질이 제공된다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, C형 간염바이러스(HCV)로부터 유래된 코어(core), NS3 및 NS5 단백질로 이루어지는 융합 단백질 코딩 유전자를 포함하고, 상기 융합 단백질 코딩 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 가지는, 재조합 벡터가 제공된다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 형질전환체가 제공된다.

상기 형질전환체는 E. coli BL21(DE3)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, C형 간염바이러스 유래 융합 단백질의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 융합 단백질을 포함하는 C형 간염바이러스 진단용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 융합 단백질을 포함하는 C형 간염바이러스 항체 진단키트가 제공된다.

본 발명의 C형 간염바이러스(HCV)로부터 유래된 코어(core), NS3 및 NS5 단백질로 이루어지는 융합 단백질은 코어, NS3, NS5 세 가지 항원을 혼합하여 사용하는 경우에 비해 양성 검체에 대한 상승된 신호효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 융합 단백질을 발현시킨 후 친화 크로마토그래피 방법으로 정제하여 SDS-PAGE를 통해 확인한 것으로, Lane 1은 HCV 융합 단백질을 발현시킨 후 세포 파쇄액, Lane 2는 친화 크로마토그래피 레진을 통과한 여과액, Lane 3은 순수하게 정제된 HCV 융합 단백질을 나타낸다.
도 2는 코어, NS3, NS5를 혼합한 항원과 본 발명의 융합 단백질이 고정된 니트로셀룰로오스 막 스트립에 C형 간염바이러스 양성 혈청을 분주하여 밴드 형성을 확인한 것이다. (스트립 1: 분주항원, 금 접합체 모두 혼합항원 사용, 스트립 2: 분주항원-융합 단백질, 금 접합체-혼합항원 사용, 스트립 3: 분주항원, 금 접합체 모두 융합 단백질 사용)
도 3 은 C형 간염바이러스 양성 혈청을 본 발명의 HCV 융합 단백질을 이용하여 제조된 진단키트로 확인한 결과이다.
도 4는 식품의약품 안전처에서 공급받은 Anti-HCV Mixed Titer Performance Panel(MFDS standard, 2015(IVD-14/003))을 본 발명의 HCV 융합 단백질을 이용하여 제조된 진단키트로 확인한 결과이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.

아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명에서 용어, "융합 단백질"은 두 개 이상의 단백질이 인위적으로 연결된 형태의 단백질을 말하며, 본 발명에서는 C형 간염바이러스(HCV)로부터 유래된 코어(core), NS3 및 NS5 단백질이 연결된 형태의 단백질을 의미한다. 이러한 융합 단백질은 재조합 벡터를 제조하고, 이를 숙주세포에 형질 전환시켜 이로부터 발현된 단백질을 분리, 정제하는 과정을 통해 얻어진 것일 수 있다.

상기 융합 단백질은 히스티딘이 표지 된 것일 수 있다.

상기 코어, NS3, NS5 유전자는 이들을 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하는 PCR을 통하여 제조할 수 있고, 얻어진 코어, NS3, NS5 핵산을 포함하는 벡터에 작동 가능하게 연결하여 재조합 벡터를 제조할 수 있다. 재조합 벡터는 당업계에 일반적으로 사용되는 GST 유전자를 포함하는 발현 벡터라면 모두 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 대장균을 숙주 세포로 사용하는 경우에는 pGEX 벡터(예, pGEX-2T, pGEX-4T, pGEX-KG 등), 바람직하게는 pET 벡터(pET-21 등)를 사용할 수 있다. 본 발명의 목 적에 따라 재조합 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 인트론, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등의 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터로 형진전환 될 수 있는 숙주세포로는 통상 DNA의 도입 효율과 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주가 사용된다. 예를 들어 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF 9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC40, BMT 10 등의 동물 세포 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 E. coli BL21(DE3)일 수 있다.

재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위해서는 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 전기천공법(electroporation), 원 형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설 페이트, 리포펙타민 매개된 형질전환 방법 등을 예로 들 수 있다.

상기 배양하는 단계에서 배지와 배양조건은 숙주세포에 따라 통상적으로 이용되는 것을 적절하게 선택하여 이용할 수 있으며, 융합 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배양시간 등의 배양 조건을 조절할 수 있다. 배양단계를 거쳐 발현된 융합 단백질은 세포의 여액(lysate)으로부터 분리할 수 있다. 과잉발현이 끝난 형질전환체를 원심분리하여 세포 펠렛(cell pellet)을 수득하고, 파열된 세포벽 또는 세포막이 포함된 배지 성분들을 제거함으로써 세포 여액(cell lysate)을 포함하는 용리액을 얻을 수 있다. 여기에서, 세포 펠렛은 당업계에 잘 알려진 방법, 예컨대 알칼리, 계면활성제 (CHAPS 및 SDS 등), 유기 용매 및 효소 (라이소자임 등)의 사용, 초음파처리(sonication) 및 고압분쇄기(French Press)의 사용, 주기적인 고온, 압력, 냉동 및 해동 사이클의 적용 등에 의하여 파쇄 (lysis)할 수 있다.

또한, 상기 융합 단백질은 정제과정을 거쳐 순수하게 분리될 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질은 히스티딘으로 표지 되어 있어, 히스티딘과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 이용한 친화 크로마토그래피 방법으로 정제될 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 융합 단백질을 포함하는 C형 간염바이러스 진단용 조성물과 항체 진단키트가 제공된다.

본 발명의 진단키트에서 융합 단백질은 고체 지지체 상에 고정된 상태로 이용될 수 있다. 다양한 물질이 고체 지지체로 사용될 수 있으며, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐클로라이드, 실리카겔, 폴리스티렌, 나일론, 활성화된 비드 등을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이러한 진단키트에는 본 발명의 당 분야에서 면역학적 분석에 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 도구 또는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 코어, NS3, NS5 항원 단백질의 발현 및 분리

1-1. HCV 유전자 및 프라이머

C형 간염 바이러스의 유전자는 Sino Biological사에서 pCMV 벡터에 클로닝 되어있는 유전자를 구입하였고, 핵단백질(core), 비구조 단백질 NS3, 비구조 단백질 NS5를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 하기 표 1에 나타낸 것과 같이 디자인하여 준비하였다.

번호	염기서열	Enzyme site	크기
프라이머 1	5'-GTCGACATGAGCACGAATCCTAAACC-3'	SalI	360bp
프라이머 2	5’-AAGCTTACCCAAATTGCGCGACCT-3’	HindIII	360bp
프라이머 3	5’-AAGCTTCCCATCACGGCGTACGCCC-3’	HindIII	810bp
프라이머 4	5’-CTCGAGGCCGTAGGTGGAGTACGT-3'	XhoI	810bp
프라이머 5	5’-CTCGAGTCCGGTTCCTGGCTAAGGG-3’	XhoI	558bp
프라이머 6	5’-CTCGAGCGACCCTACCGGGTATTC-3’	XhoI	558bp

1-2. PCR을 이용한 유전자 증폭

추출한 HCV viral RNA를 2㎕ 취하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)용 tube에 넣고 Gene specific primer와 섞어준 후 65℃에서 10분간 RNA와 primer를 변성시켰다. DTT, dNTP, M-MLV RTase, M-MLV RTase reaction buffer와 잘 섞어준 후 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였으며, 95℃에서 5분간 불활성 시킨 후 반응을 완료하였고, HCV core, NS3, NS5 유전자를 증폭할 수 있는 PCR primer를 설계하여 준비하였다.

합성된 cDNA를 PCR의 Template로 사용하여 forward primer, reverse primer, dNTP, Taq polymerase, PCR reaction buffer와 함께 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 다음과 같다. 94℃에서 5분간 변성한 후 94℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분간 반응을 37회 동안 반복하였으며, 마지막 72℃에서 5분간 합성시킨 후 반응을 종료하였다. 증폭된 core, NS3, NS5 유전자를 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였다.

HCV 융합 단백질을 유전자는 핵단백질 유전자를 pET21 벡터에 먼저 삽입하고 삽입이 확인된 유전자에 NS3 유전자를 다시 삽입하였다. NS3 유전자의 삽입이 확인된 핵단백질 유전자에 NS5 유전자를 삽입후에 삽입을 확인한 후 시퀀싱까지 분석하여 pET21벡터에 core, NS3, NS5 유전자가 차례대로 삽입된 것을 최종 확인하였다.

1-3. 유전자의 클로닝 및 플라스미드 DNA 분리

형질 전환된 대장균을 암피실린(Ampicillin)이 포함된 LB배지에 접종하여 37℃ 배양기에서 진탕 배양하였다. 플리스미드 DNA 추출은 Plasmid Extraction kit를 이용하였다. 배양액을 상온에서 4,000rpm으로 10분간 원심분리한 다음 세포 침전물만 회수하고 Resuspesion을 첨가한 다음 세포 침전물을 재현탁한 후에 Lysis buffer 를 첨가하고 상온에서 5분간 방치하였다. Neutralization buffer를 첨가하여 상온에서 방치한 후 13,000rpm으로 원심 분리하여 상층액을 바인딩 컬럼튜브로 옮겼다. 이를 상온에서 13,000rpm으로 원심분리한 다음 추출액을 제거하였다. 여기에 에탄올을 분주하여 원심분리한 다음 바인딩 컬럼만을 새로운 튜브로 옮겼다. 여기에 elution buffer를 분주하여 상온에서 방치한 후 원심 분리하여 여과액을 새로운 마이크로 튜브로 옮겨 플라스미드를 분리하였다.

1-4. 형질전환

HCV 융합 단백질 유전자와 단백질 발현 벡터 pET21이 ligation된 clone을 확인한 후 HCV 융합 단백질 재조합 유전자 plasmid DNA를 순수 정제하였으며, 정제된 HCV 융합 단백질 재조합 DNA는 단백질의 과잉발현을 유도하기 위해 재조합 단백질 발현을 위한 수용 균주인 BL21(DE3)에 형질 전환하였다.

형질전환은 BL21(DE3) competent cell을 녹인 후 HCV 융합 단백질 재조합 DNA 1ul를 BL21(DE3) cell에 넣고 잘 섞어준 후 얼음속에서 30분간 방치하였다. 42℃로 맞춰진 Heat Block에 cell을 넣고 90초간 열 충격을 준 후 꺼내어 cell을 항생제 Ampicillin이 포함된 LB 평판배지에 도말하여 37℃ 배양기에서 16시간 이상 배양하였다.

1-5. 단백질의 발현

생성된 단일 colony를 항생제가 들어간 LB 배지에 접종하여 배양한 후 LB 배지에서 충분히 자란 배양액을 새로운 LB 배지에 1%가 되도록 접종하여 배양한 후 HCV 융합 단백질이 BL21(DE3) 균주에서 발현되는 것을 유도하기 위해 cell이 O.D 600의 값이 0.6 수준으로 자랐을 때 IPTG(최종 농도 0.25mM)를 첨가하고 25℃ 배양기에서 3시간 동안 추가 배양하여 HCV 융합 단백질의 과잉발현을 유도하였다.

과잉발현이 끝난 BL21(DE3) cell을 원심분리로 수확하였으며 수확한 cell을 lysis buffer로 현탁하고, 초음파 파쇄를 통하여 분해한 후 세포 추출물을 원심 분리하여 상층액을 취하여 수용성 단백질을 분리하였으며, 상층액을 취하고 남은 pellet을 다시 8M Urea가 포함된 lysis buffer로 pellet이 모두 풀어질 때까지 충분히 풀어준 후 원심 분리하여 상층액을 얻어 불용성 단백질을 분리하였다.

HCV 융합 단백질 과잉발현 유도 후의 수용성 단백질, 불용성 단백질을 각각 5배로 농축된 SDS sample loading buffer와 혼합하여 끓는 물에 5분간 끓인 후 샘플을 SDS-PAGE로 전기 영동을 한 후 Coomassie Blue 염색하여 HCV 융합 단백질이 약68kDa의 크기로 발현된 것을 확인하였다(도 1).

Lane 1: HCV 융합 단백질 발현 후 세포 파쇄액

Lane 2: 친화 크로마토그래피 레진을 통과한 여과액

Lane 3: 순수 정제된 HCV 융합 단백질

1-6. 단백질의 정제

HCV 융합 단백질을 순수하게 분리를 하기 위해 친화 크로마토그래피를 실시하였다. 친화 크로마토그래피는 Ni-NTA column을 사용하였다. 먼저 Ni-NTA column을 완충액으로 충분히 세척하여 평형화 시킨 후 Nickel column에 과잉발현이 끝나고 파쇄하여 얻은 HCV 융합 단백질의 수용성 용액을 흘려 보내 column에 HCV 융합 단백질이 흡착되도록 하였다. 20mM imidazole이 포함된 세척액을 충분히 흘려 보내 HCV 융합 단백질 이외의 비 특이 단백질을 column에서 제거했다. 다시 완충액으로 평형화 시킨 후 250mM imidazole이 포함된 용출액을 흘려 보내 column에 흡착되어 있는 HCV 융합 단백질을 용출 시켰다. HCV 융합 단백질을 SDS-PAGE 전기 영동 후 Coomassie Blue 염색하여 확인하였다.

실시예 2. 정제된 항원 단백질의 ELISA를 이용한 진단 연구

정제된 HCV 융합 단백질을 1㎍/㎕가 되도록 탄산염완충용액 (pH9.6)에 희석하여 마이크로플레이트에 코팅한 후 18시간동안 반응시켰다. Tween20이 포함된 인산완충용액으로 3회 세척한 후 0.5% casein 100㎕를 웰에 넣어 37℃에서 2시간 블로킹하였다. 1차 항체는 환자혈청을 희석하여 100㎕를 사용하였으며, 2차 항체는 퍼옥시타아제가 부착된 염소의 항 인간 항체를 1:5000의 비율로 희석하여 100ul를 넣었다. 3회 세척 후 TMB 용액을 100㎕ 넣고 차광하여 실온에서 15분간 반응 후 1N 황산을 50㎕ 넣어 반응을 정지시키고 마이크로 엘라이저 리더기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 C형 간염 바이러스 양성이 확인된 양성혈청 21개에 대하여 ELISA 테스트를 진행한 결과 core, NS3, NS5 세가지의 각각의 항원을 혼합하여 사용한 것보다 core-NS3-NS5를 하나의 융합 단백질로 만들어 정제한 융합 단백질을 사용한 ELISA에서 대부분의 검체에서 향상된 신호를 나타냈다. 이를 통해, 혼합항원보다 융합 단백질을 사용하는 경우 양성 검체에 대한 신호 상승효과를 얻을 수 있음을 확인하였다.

ProMedDx	Gender	Age	core, NS3, NS5 항원을 각각 혼합하여 코팅	core-NS3-NS5 융합 단백질을 코팅
Number	Gender	Age	core, NS3, NS5 항원을 각각 혼합하여 코팅	core-NS3-NS5 융합 단백질을 코팅
10242730	F	40	1.789	1.99
10463630	F	62	2.089	2.442
10463632	M	47	1.994	2.244
10650602	M	42	2.605	2.571
10650627	M	49	2.296	2.399
10822722	M	46	1.896	2.192
10822725	M	51	2.267	2.516
10822807	M	46	2.545	2.571
11048887	M	41	2.045	2.293
11048897	M	26	2.362	2.739
11049033	M	64	2.457	2.385
11049161	M	56	2.26	2.249
11486305	M	46	2.501	2.727
11486320	M	52	2.197	2.319
11486359	M	39	1.821	2.047
11486373	M	53	2.3	2.642
11486387	F	42	1.978	2.509
11486407	M	54	2.614	2.595
11486458	M	33	1.642	2.013
11486470	M	50	1.484	1.888
11486478	M	52	2.635	2.622

실시예 3. 정제된 항원 단백질의 신속 진단 방법을 이용한 진단 연구

3-1. HCV 항체 진단을 위한 멤브레인 제조

상기 실시예 1에서 제조한 HCV 융합 단백질을 1 ㎎/㎖ 농도로 희석하여 분주기를 이용하여 1㎕/cm의 농도로 니트로셀룰로오즈 막의 검체선에 분주하고, 염소 항-닭 IgY를 대조선에 분주한 후 건조기에서 밤새 건조시켰다.

3-2. 검사선 항원- 금입자 접합체 제조

HCV 융합 단백질을 0.1 ㎎/㎖ 농도로 하여 금입자와 30분간 실온에서 반응시켰다. 이 반응액에 소 혈청 알부민을 1% 되도록 넣어준 후 원심분리를 하여 상등액을 버리고 침전물을 소 혈청 알부민이 1% 들어있는 인산완충용액으로 녹여내어 항원-금 입자 접합체를 제조하였다.

3-3. 대조선 항원-금 입자 접합체 제조

닭 IgY 항원을 0.1 ㎎/㎖ 농도로 하여 금입자와 30분간 실온에서 반응시켰다. 이 반응액에 소 혈청 알부민을 1% 되도록 넣어준 후 원심분리를 하여 상등액을 버리고 침전물을 소 혈청 알부민이 1% 들어있는 인산완충용액으로 녹여내어 항원-금 입자 접합체를 제조하였다.

3-4. 진단키트 제조

진단키트의 제조에 필요한 샘플패드, 항원-금 입자 접합체 패드, 니트로셀룰로오즈 막, 흡습 패드 등을 준비하였다. 상기의 샘플패드, 항원-금 입자 접합체 패드, 니트로셀룰로오즈 막, 흡습 패드는 서로 겹치게끔 하나의 스트립으로 만들어 플라스틱 카세트에 고정하였다.

3-5. C형 간염 환자의 혈청에 대한 진단 실험

먼저, 분주항원, 금 접합체 모두 혼합항원 사용한 스트립 1, 분주항원은 융합 단백질, 금 접합체는 혼합항원을 사용한 스트립 2, 분주항원, 금 접합체 모두 융합 단백질을 사용한 스트립 3을 준비하였다. C형 간염 양성 환자의 혈청10㎕를 검체 희석액 90㎕에 잘 섞어준 후 상기 스트립 1 내지 3에 각각 흘려 주고, 밴드 형성을 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 core, NS3, NS5 세가지의 각각의 항원을 혼합하여 사용한 것보다 core-NS3-NS5를 하나의 융합 단백질을 사용한 스트립에서 ELISA 테스트 결과와 마찬가지로 더 진한 신호를 확인할 수 있었다.

다음으로, 하기 표 3에 기재된 혈청10㎕를 검체 희석액 90㎕에 잘 섞어준 후 상기 실시예 3-4에서 제조된 키트의 카세트의 홀에 넣어주고, 밴드 형성을 확인하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 ore, NS3, NS5 세가지의 각각의 항원을 혼합하여 사용한 것보다 core-NS3-NS5를 하나의 융합 단백질을 사용한 키트에서 ELISA 테스트 결과와 마찬가지로 더 진한 신호를 확인할 수 있었다.

ProMedDx Number	Gender	Age	HCV		HCV Viral Load
ProMedDx Number	Gender	Age	Result	Method	Result	Method
10242730	F	40	Reactive	Ortho v3.0 ELISA	206008	Roche PCR
10463630	F	62	Reactive	Dignosis	2112890	bDNA ULTRAQUANT
10463632	M	47	Reactive	Dignosis	422060	bDNA ULTRAQUANT
10650602	M	42	Reactive	Abbott EIA	217133	Chiron bDNA 3.0
10650627	M	49	Reactive	Abbott EIA	724127	Chiron bDNA 3.0
10822722	M	46	Reactive	Abbott EIA	383832	bDNA 3.0
10822725	M	51	Reactive	Abbott EIA	242058	bDNA 3.0
10822807	M	46	Reactive	Abbott EIA	271324	bDNA 3.0
11048887	M	41	Reactive	Abbott EIA	258000	bDNA 3.0
11048897	M	26	Reactive	Abbott EIA	307000	bDNA 3.0
11049033	M	64	Reactive	Abbott EIA	642000	bDNA 3.0
11049161	M	56	Reactive	Abbott EIA	1660000	bDNA 3.0
11486305	M	46	Reactive	Abbott EIA	828714	bDNA 3.0
11486320	M	52	Reactive	Abbott EIA	340373	bDNA 3.0
11486359	M	39	Reactive	Abbott EIA	105680	bDNA 3.0
11486373	M	53	Reactive	Abbott EIA	157407	bDNA 3.0
11486387	F	42	Reactive	Abbott EIA	270336	bDNA 3.0
11486407	M	54	Reactive	Abbott EIA	429716	bDNA 3.0
11486458	M	33	Reactive	Abbott EIA	126681	bDNA 3.0
11486470	M	50	Reactive	Abbott EIA	390367	bDNA 3.0
11486478	M	52	Reactive	Abbott EIA	655951	bDNA 3.0

마지막으로, 식품의약품안전처에서 공급받은 Anti-HCV Mixed Titer Performance Panel(MFDS standard, 2015(IVD-14/003))에 대해, 상기 실시예 3-4에서 제조된 진단키트로 밴드 형성을 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 19개의 양성 검체는 모두 양성반응, 2개의 음성 검체는 모두 음성반응을 보인 것을 확인할 수 있었다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

<110> Bore Da Biotech <120> Fusion protein from hepatitis C virus and diagnosing kit comprising the same <130> APC-2018-0559 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 580 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 1 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Leu Pro Ile Thr Ala Tyr Ala 115 120 125 Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly 130 135 140 Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val 165 170 175 Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val 180 185 190 Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala 195 200 205 Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp 210 215 220 Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg 225 230 235 240 Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu 245 250 255 Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val 260 265 270 Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val 275 280 285 Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val 290 295 300 Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Val Val Pro Gln Ser Phe Gln Val 305 310 315 320 Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro 325 330 335 Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser 340 345 350 Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly 355 360 365 Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser 370 375 380 Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Leu Glu Ser Gly Ser Trp Leu Arg 385 390 395 400 Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu Ser Asp Phe Lys Thr Trp 405 410 415 Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Gln Leu Pro Gly Ile Pro Phe Val Ser 420 425 430 Cys Gln Arg Gly Tyr Lys Gly Val Trp Arg Gly Asp Gly Ile Met His 435 440 445 Thr Arg Cys His Cys Gly Ala Glu Ile Thr Gly His Val Lys Asn Gly 450 455 460 Thr Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr Cys Arg Asn Met Trp Ser Gly 465 470 475 480 Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro Leu Pro 485 490 495 Ala Pro Asn Tyr Thr Phe Ala Leu Trp Arg Val Ser Ala Glu Glu Tyr 500 505 510 Val Glu Ile Arg Gln Val Gly Asp Phe His Tyr Val Thr Gly Met Thr 515 520 525 Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln Val Pro Ser Pro Glu Phe Phe 530 535 540 Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe Ala Pro Pro Cys Lys 545 550 555 560 Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val Gly Leu His Glu Tyr 565 570 575 Pro Val Gly Ser 580 <210> 2 <211> 1728 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 2 atgagcacga atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg tcgcccacag 60 gacgtcaagt tcccgggtgg cggtcagatc gttggtggag tttacttgtt gccgcgcagg 120 ggccctagat tgggtgtgcg cgcgacgagg aagacttccg agcggtcgca acctagaggt 180 agacgtcagc ctatccccaa ggcacgtcgg cccgagggca ggacctgggc tcagcccggg 240 tacccttggc ccctctatgg caatgagggc tgcgggtggg cgggatggct cctgtctccc 300 cgtggctctc ggcctagctg gggccccaca gacccccggc gtaggtcgcg caatttgggt 360 cccatcacgg cgtacgccca gcagacaagg ggcctcctag ggtgcataat caccagccta 420 actggccggg acaaaaacca agtggagggt gaggtccaga ttgtgtcaac tgctgcccaa 480 accttcctgg caacgtgcat caatggggtg tgctggactg tctaccacgg ggccggaacg 540 aggaccatcg cgtcacccaa gggtcctgtc atccagatgt ataccaatgt agaccaagac 600 cttgtgggct ggcccgctcc gcaaggtagc cgctcattga caccctgcac ttgcggctcc 660 tcggaccttt acctggtaac gaggcacgcc gatgtcattc ccgtgcgccg gcggggtgat 720 agcaggggca gcctgctgtc gccccggccc atttcctact tgaaaggctc ctcggggggt 780 ccgctgttgt gccccgcggg gcacgccgtg ggtatattta gggccgcggt gtgcacccgt 840 ggagtggcta aggcggtgga ctttatccct gtggagaacc tagagacaac catgaggtcc 900 ccggtgttca cggataactc ctctccacca gtagtgcccc agagcttcca ggtggctcac 960 ctccatgctc ccacaggcag cggcaaaagc accaaggtcc cggctgcata tgcagctcag 1020 ggctataagg tgctagtact caacccctct gttgctgcaa cactgggctt tggtgcttac 1080 atgtccaagg ctcatgggat cgatcctaac atcaggaccg gggtgagaac aattaccact 1140 ggcagcccca tcacgtactc cacctacggc tccggttcct ggctaaggga catctgggac 1200 tggatatgcg aggtgttgag cgactttaag acctggctaa aagctaagct catgccacag 1260 ctgcctggga tcccctttgt gtcctgccag cgcgggtata agggggtctg gcgaggggac 1320 ggcatcatgc acactcgctg ccactgtgga gctgagatca ctggacatgt caaaaacggg 1380 acgatgagga tcgtcggtcc taggacctgc aggaacatgt ggagtgggac cttccccatt 1440 aatgcctaca ccacgggccc ctgtaccccc cttcctgcgc cgaactacac gttcgcgcta 1500 tggagggtgt ctgcagagga atacgtggag ataaggcagg tgggggactt ccactacgtg 1560 acgggtatga ctactgacaa tcttaaatgc ccgtgccagg tcccatcgcc cgaatttttc 1620 acagaattgg acggggtgcg cctacatagg tttgcgcccc cctgcaagcc cttgctgcgg 1680 gaggaggtat catttagagt aggactccac gaatacccgg tagggtcg 1728

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, C형 간염바이러스(HCV)로부터 유래된 코어(core), NS3 및 NS5 단백질로 이루어지는 융합 단백질.
C형 간염바이러스(HCV)로부터 유래된 코어(core), NS3 및 NS5 단백질로 이루어지는 융합 단백질 코딩 유전자를 포함하고,
상기 융합 단백질 코딩 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지는, 재조합 벡터.
제2항의 재조합 벡터로 형질 전환된 형질전환체.
제3항에 있어서,
상기 형질전환체는 E. coli BL21(DE3)인, 형질전환체.
제3항 또는 제4항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, C형 간염바이러스 유래 융합단백질의 제조방법.
제1항의 융합 단백질을 포함하는 C형 간염바이러스 진단용 조성물.
제1항의 융합 단백질을 포함하는 C형 간염바이러스 항체 진단키트.