CN111398581B - 一种covid-19快速诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种COVID‑19快速诊断试剂盒，包括COVID‑19纤突蛋白抗原胶体金。本发明还公开一种COVID‑19快速诊断试剂盒的制备方法，包括以下步骤：将COVID‑19纤突蛋白进行表达和纯化；制备COVID‑19纤突蛋白抗原胶体金。该试剂盒操作简单，能够快速诊断出患者是否感染COVID‑19，利于疫情的有效控制。

Description

一种COVID-19快速诊断试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及疾病检测领域，具体涉及一种COVID-19快速诊断试剂盒及其制备方法。
背景技术
人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严 重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状 病毒所致疾病没有特异治疗方法。因此对于疾病的预防和早期诊断对于控制新型冠状病毒疫 情蔓延尤为重要。
发明内容
为了提高新型冠状病毒的早期诊断效率，本发明公开一种COVID-19快速诊断试剂盒， 该试剂盒操作简单，能够快速诊断出患者是否感染COVID-19，利于疫情的有效控制。
本发明还公开一种COVID-19快速诊断试剂盒的制备方法。
本发明通过下述技术方案实现：
一种COVID-19快速诊断试剂盒，包括COVID-19纤突蛋白抗原胶体金。
上述一种COVID-19快速诊断试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将COVID-19纤突蛋白进行表达和纯化；
(2)制备COVID-19纤突蛋白抗原胶体金。
其中，COVID-19纤突蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体如下： QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNG TKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCND PFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNID GYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGA AAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTE SIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKL NDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGG NYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYR VVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIA DTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTW RVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR。
步骤(1)中，COVID-19纤突蛋白的表达，包括如下步骤：
(11)全合成编码S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因，将S1基因克隆至真核表达载体， 构成S1-mFc融合基因；
(12)将S1-mFc表达质粒电转到感受态细胞Rosseta，挑取阳性单克隆，扩增后提取质 粒；
(13)使用转染试剂将S1-mFc表达质粒转染到293F细胞中，在无血清培养基中继续培 养；
(14)收集细胞培养基，离心获得上清，分离纯化S1-mFc融合蛋白。
进一步的，步骤(11)中，所述真核表达载体为pMFcIg，S1基因克隆到真核表达载体的IL2分泌信号肽和小鼠Fc标签基因之间，构成S1-mFc融合基因。
步骤(11)中，克隆所采用的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，具体为：CAGTGTGTTAATCTTACAACC，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，具体为：ACGTGCCCGCCGAGGAGAATT。
进一步的，步骤(2)中，COVID-19纤突蛋白抗原胶体金的制备方法为：
(21)以氯金酸溶液、柠檬酸三钠水溶液为原料制备胶体金溶液；
(22)将COVID-19纤突蛋白溶液转入透析袋中，透析过夜；
(23)将透析处理之后的COVID-19纤突重组蛋白加入等体积的胶体金溶液中，静置， 然后加入BSA溶液，充分混匀后离心，弃上清液，胶体金沉淀用保护液再溶解，即制得COVID-19纤突蛋白抗原胶体金。
进一步的，步骤(22)中,COVID-19纤突蛋白溶液的透析方法为：将COVID-19纤突蛋白溶液浓度稀释至1mg/mL后转入透析袋中，2-8℃下用浓度为20mmol/L、pH值为7.0的Tris缓冲液透析过夜。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明一种COVID-19快速诊断试剂盒，该试剂盒操作简单，能够快速诊断出患者是否 感染COVID-19，利于疫情的有效控制。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不 构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明实施例2样本测试显色图；
图2为本发明实施例2样本OD值；
图3为本发明实施例2样本OD值统计图；
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明 作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本 发明的限定。
实施例1
一种COVID-19快速诊断试剂盒，包括COVID-19纤突蛋白抗原胶体金，通过以下方法 制备：
1、COVID-19纤突蛋白进行表达和纯化
1)全合成编码S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因；
2)将S1基因克隆到真核表达载体pMFcIg(ABLINK biotech)的IL2分泌信号肽和小鼠 Fc(mFc，包括hinge-CH2-CH3)标签基因之间，构成S1-mFc融合基因，克隆所采用的正向引物为：CAGTGTGTTAATCTTACAACC，反向引物为：ACGTGCCCGCCGAGGAGAATT；
3)将S1-mFc表达质粒电转到感受态细胞Rosseta，挑取阳性单克隆，扩增后提取质粒；
4)使用293Fectin(thermofisher)转染试剂将S1-mFc表达质粒转染到293F细胞中，在 无血清培养基中继续培养5天，收集细胞培养基，离心获得上清，使用protein Aresin(GE) 分离纯化S1-mFc融合蛋白。
2、纯化S蛋白的验证：用抗S蛋白的双抗体夹心法进行ELISA验证(表1)。
表1 S蛋白双抗夹心法验证
OD450
PBS 0.041
0.1ug/ml S蛋白 0.105
0.5ug/ml S蛋白 0.426
1ug/ml S蛋白 0.848
5ug/ml S蛋白 2.102
3、制备COVID-19纤突蛋白抗原胶体金
1)取质量浓度为0.01％氯金酸水溶液并加热至沸腾，滴加1％柠檬酸三钠水溶液并不断 搅拌，在氯金酸水溶液由金黄色变为紫红色后继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复至原体 积，2-8℃保存待用；
2)将新冠病毒纤突重组蛋白溶液浓度至1mg/mL后转入透析袋中，2-8℃下用浓度为 20mmol/L、pH值为7.0的Tris缓冲液透析过夜；
3)之后在透析处理之后的新冠病毒纤突抗原中加入等体积的胶体金中，2-8℃静置并使 新冠病毒纤突抗原充分与胶体金结合，然后按每10mL胶体金加2mL质量浓度为5％BSA溶 液比例加入BSA溶液，充分混匀后离心0.5-1.5h，弃上清液，胶体金沉淀用保护液再溶解， 即制得COVID-19纤突蛋白抗原胶体金。
实施例2
通过实施例1方法制备的COVID-19纤突蛋白抗原胶体金的临床验证。
取新型冠状病毒肺炎的临床确诊病例8例、疑似样本10例和阴性样本10例进行验证， 验证方法为：
将COVID-19纤突蛋白抗原胶体金加入96孔板中，分别加入上述不同类型的标本100ul， 37度孵育1小时后，洗板，再加入抗人IgG Fc段的酶标二抗，显色剂显色，显色结果如图1， 利用酶标仪测定OD值，结果如图2、3所示。
分析了临床确诊阳性(8例)、疑似样本(10例)和阴性标本(10例)，阳性患者的血清抗S蛋白抗体全部为阳性，疑似标本和阴性标本的吸光度(OD值)显著低于阳性患者，与 临床诊断吻合。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说 明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护 范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川省人民医院
<120> 一种COVID-19快速诊断试剂盒及其制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列(1)
<400> 1
Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr
1 5 10 15
Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser
20 25 30
Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn
35 40 45
Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys
50 55 60
Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala
65 70 75 80
Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr
85 90 95
Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn
100 105 110
Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu
115 120 125
Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe
130 135 140
Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln
145 150 155 160
Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu
165 170 175
Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser
180 185 190
Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser
195 200 205
Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg
210 215 220
Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp
225 230 235 240
Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr
245 250 255
Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile
260 265 270
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys
275 280 285
Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
290 295 300
Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
305 310 315 320
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
325 330 335
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
340 345 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
355 360 365
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
370 375 380
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385 390 395 400
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
405 410 415
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
420 425 430
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
435 440 445
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
450 455 460
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
465 470 475 480
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
485 490 495
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
500 505 510
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
515 520 525
Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys
530 535 540
Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr
545 550 555 560
Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro
565 570 575
Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser
580 585 590
Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro
595 600 605
Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser
610 615 620
Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala
625 630 635 640
Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly
645 650 655
Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg
660 665 670
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(2)
<400> 2
cagtgtgtta atcttacaac c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(3)
<400> 3
acgtgcccgc cgaggagaat t 21

Claims (3)

1.一种COVID-19快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，包括COVID-19纤突蛋白抗原胶体金，制备方法包括以下步骤：
(1)将COVID-19纤突蛋白进行表达和纯化；
(2)制备COVID-19纤突蛋白抗原胶体金；
步骤(1)中，COVID-19纤突蛋白的表达，包括如下步骤：
(11)全合成编码S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因，将S1基因克隆至真核表达载体，构成S1-mFc融合基因；
(12)将S1-mFc表达质粒电转到感受态大肠杆菌，挑取阳性单克隆，扩增后提取质粒；
(13)使用转染试剂将S1-mFc表达质粒转染到293F细胞中，在无血清培养基中继续培养；
(14)收集细胞培养基，离心获得上清，分离纯化S1-mFc融合蛋白；
步骤(11)中，所述真核表达载体为pMFcIg，S1基因克隆到真核表达载体的IL2分泌信号肽和小鼠Fc标签基因之间，构成S1-mFc融合基因；
步骤(11)中，克隆所采用的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的一种COVID-19快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，COVID-19纤突蛋白抗原胶体金的制备方法为：
(21)以氯金酸溶液、柠檬酸三钠水溶液为原料制备胶体金溶液；
(22)将COVID-19纤突蛋白溶液转入透析袋中，透析过夜；
(23)将透析处理之后的COVID-19纤突重组蛋白加入等体积的胶体金溶液中，静置，然后加入BSA溶液，充分混匀后离心，弃上清液，胶体金沉淀用保护液再溶解，即制得COVID-19纤突蛋白抗原胶体金。
3.根据权利要求2所述的一种COVID-19快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(22)中,COVID-19纤突蛋白溶液的透析方法为：将COVID-19纤突蛋白溶液浓度稀释至1mg/mL后转入透析袋中，2-8℃下用浓度为20mmol/L、pH值为7.0的Tris缓冲液透析过夜。
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